JP2887765B2 - ポリアルキレングリコール残基を含む対称ビペプチド、その製造方法およびプロテアーゼの検定における使用 - Google Patents

ポリアルキレングリコール残基を含む対称ビペプチド、その製造方法およびプロテアーゼの検定における使用

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、新規な工業的生産物である、下記式Ｉのビ
ペプチド化合物に関する。更に本発明はビペプチド化合
物の製造方法、およびプロテアーゼおよびペプチダーゼ
からなる群に属する酵素の検定の分野における、とりわ
けクラスE.C.3.4.4〔1973年、アムステルダムのElsevie
r Scientific Publishing Company発行の“Enzyme Nome
nclature"（酵素命名法）に定義されているように、現
在では新規なクラスの“E.C.3.4.21"である〕に属する
酵素のような酵素の定量的検定の分野における基質とし
ての使用に関する。
従来技術 上述したクラスに属する酵素は、タンパク質またはぺ
プチド骨格のアミド結合をArg、Lys、OrnおよびHis残基
のカルボキシル基において開裂する物質として知られて
いる。この開裂機構は当該分野において良く知られてお
り、下記する従来技術の文献に詳細に例示されている。
上記クラスに属する酵素のための現在用いられている
基質は、本質的にトリ−またはテトラペプチド化合物で
あり、そのＮ−末端がベンゾイル、ベンジルオキシカル
ボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカ
ルボニル、トシル、アセチルなどのようなブロッキング
基によって一般的に置換されており、かつそのＣ−末端
が、放射性基または開裂の前または（好ましくは）開裂
後に着色または蛍光を付与することができる、特にｐ−
トロアニリン基のような基であるアミノ化された基によ
ってアミド化されている。
この関係については、文献としてFR−Ａ−2,546,16
3、FR−Ａ−2,372,798、EPA−0,004,256、US−Ａ−4,50
8,644、US−Ａ−4,448,715、FR−Ａ−2,471,411、FR−
Ａ−2,317,280およびFR−Ａ−２−459,226を挙げること
ができる。
従来技術において知られているペプチド誘導体は水に
対する親和性がほとんどないことが見出されている。こ
のペプチド誘導体は水への溶解性または分散性が低く、
従って使用しえるようにするには有機溶媒の添加が時と
して必要である。混合溶媒からなる系は、一般的には生
物的媒体と相溶性がほとんどない。混合溶媒系は、基質
の活性低下、または、ある場合には、検定が望まれてい
る酵素の劣化をもたらす。更に、これら基質の水への低
親和性酵素検定法の感度低下の原因となる。
上記したFR−Ａ−2,546,163は酵素基質の水への溶解
性を改善するための特殊な溶液を開示しており、ここで
はペプチドはＮ−末端にポリヒドロキシカルボニル基を
有している。
また、EP−Ａ−0,002,190は、アルキル基によってモ
ノエーテル化されたポリエチレングリコール残基からな
るポリペプチド化合物（第８頁、第６〜８行参照）、す
なわち下記式の生成物を開示しており、 Me-PEG600-CO-(CH2)2-CO-Val-Arg-Val-pNA （第10頁第35行参照）、ここでPEG600は約600オーダー
の分子量を有するポリエチレングリコール残基を示して
いる。
最後に、EP−Ａ−0,280,160はＮ−末端がメトキシマ
ロニル基のようなアルコキシカルボニルアルキレンカル
ボニル基を含むジペプチド基質を開示している。
本発明による溶液 本発明によれば、新規な特殊溶液が提案され、この溶
液はそのＮ−末端がカルボニル結合、COを介して２価の
ポリアルキレングリコール基にそれぞれ結合している二
つのアミノ酸またはペプチド鎖からなる化合物を使用す
る点で一方ではFR−Ａ−2,546,163の提案と、他方ではE
P−Ａ−0,025,190の提示と夫々異なる。
より詳細には、この新規な特殊の溶液は、ポリエチレ
ングリコールおよびポリプロピレングリコールからなる
基に属するポリアルキレングリコール基の選択をベース
とするものであり、ポリアルキレングリコール基は二つ
のモノアミノ酸または三つのペプチド鎖に結合してお
り、ポリアルキレングリコール残基の各Ｏ−末端がCO基
を介してモノ酸またはペプチド鎖のＮ−末端に結合し、
酵素検定の感度に必要な水への溶解性または分散性が与
えられている。ポリアルキレングリコール残基が二つの
鎖に結合している事実が検定の感度を増大している。
本発明の主題 本発明によれば、ポリアルキレングリコール残基に結
合したアミノ酸残基を含むアミノ酸およびペプチドから
なる基に属する新規化合物が提案され、この化合物は、
従来技術において知られているペプチドと、特に酵素基
質として構造的に異なり、下記からなる群から選択され
る。
（ｉ）下記式の対称的アミノ酸およびペプチド ここでＱは下記式のポリエチレングリコールおよびポ
リプロピレングリコールから選ばれたポリアルキレング
リコール残基である。
-O[CH(X)CH2O]n- ここでＸはＨまたはMeであり、ｎは１より大きいか、
または１に等しい整数である。
Ｂは単一結合、モノアミノ酸残基または２〜９のモノ
アミノ酸残基からなるペプチド鎖である。
Ａは側鎖に塩基性基を含むα−アミノ酸残基からなる
群から選ばれた塩基性モノアミノ酸残基である。そし
て、Ｒは酵素物質が確認または検定されることを可能に
するためのラベル化手段である。
略記号 便利のために、本明細書の記述に下記の略記号を用い
る。
本発明の詳細な記述 基Ｑはポリアルキレングリコール（PAG）残基であ
る。ＱはＸ＝Ｈのときポリエチレングリコール（PEG）
残基を、Ｘ＝Meのときポリプロピレングリコール（PP
G）残基を含む。基Ｑにおいて、各Ｏ−末端は二つのモ
ノアミノ酸またはペプチド鎖の一つのＮ−末端にカルボ
ニル基によって結合している。有利的には、PAG残基は
約60から約1000の間の平均分子量を有し、好ましくは20
0〜600の間の平均分子量を有する。Ｑはポリプロピレン
グリコール（PAG）残基であるより好ましくはポリエチ
レングリコール（PEG）残基である。便利かつ統一のた
めに、式Ｉにおいてｎ＝１の場合にも“ポリアルキレン
グリコール残基”および“ポリエチレングリコール残
基”の表現を以後用いることにする。
上記したように、基Ａは塩基性α−モノアミノ酸の残
基である。この残基は、７よりも大きなpHを有するモノ
アミノ酸、すなわち一つの酸基COOHおよびα−位におけ
る塩基性基に加えて少くとも一つの塩基性側鎖を有する
モノアミノ酸から導かれる。好適なα−アミノ酸の中で
Dbu、Arg、Lys、HinおよびOrn残基について詳細に記述
する。好ましい残基Ａはα−Ｌ−アミノ酸残基であり、
とりわけＬ−Arg、Ｌ−LysおよびＬ−Ornが好ましく、
本発明にとって最も価値のある残基はＬ−Argである。
上で示したように、基Ｂは単一結合、モノアミノ酸残
基または２〜９のアミノ酸を含むペプチド鎖である。基
Ｂ中に存在するアミノ酸はいづれのタイプであっても良
く、特に天然産または合成アミノ酸である。とりわけ、
Ｂがモノアミノ酸残基の場合には、この残基は不斉炭素
原子に欠ける残基（とりわけAib、Cle、Cly、MeGlyおよ
び4Abuのような）かまたは不斉炭素原子を含みＬまたは
Ｄ配置を有する残基、夫々が不斉炭素原子に欠けるアミ
ノ酸であるかまたは不斉炭素原子を含みＬ配置を有する
アミノ酸である他のアミノ酸残基またはペプチド鎖の残
基である。
Ｂがモノアミノ酸残基であるとき、この残基は７より
も小さい、または７に等しいpHを有する天然産または合
成アミノ酸から、または７よりも大きいpHを有するが適
切に置換されており、その結果、塩基性特性が本質的に
ブロックされていてpHが７より小さいかまたは７に等し
いアミノ酸から導かれる。
従ってＢは下記を含む。
１）単一の塩基性基を含む天然産または合成アミノ酸残
基、 ２）単一の塩基性基および一以上の酸基を含み、各酸側
鎖基を特にアミドまたはエステルの形状でブロックする
ことができる天然産または合成アミノ酸残基、および ３）単一の酸基および一以上の塩基性基を含み、各塩基
性側鎖基は適切に置換されていて、その結果、その塩基
性特性が本質的にブロックされ消出している天然産また
は合成アミノ酸。
もちろん、上述したアミノ酸残基は上記略記号の部分
に詳細にリストされているが、エーテルまたはエステル
保護基によって適宜ブロックすることができるヒドロキ
シル（OH）またはチオール（SH）側鎖基を含むことがで
きる。下記するアミノ酸から導かれた残基は、特にＢと
して好適である。
−特に−Ala、β−Ala、Cys、Gln、4Hyp、3Hyp、Leu、M
et、Nle、Nva、Phe、Pro、MeGly、Ser、TyrおよびValの
ような、いわゆる“中性”の非塩基性天然アミノ酸で、
4Hyp、3Hyp、Ser、ThrおよびTyrのOH側鎖基はエーテル
またはエステル保護基によって保護されていてもいなく
ても良く、CysのSH側鎖基はチオエーテルまたはチオエ
ステル保護基によって保護されていてもいなくても良
い。
−特にAsp、β−Asp、Gluおよびγ−Gluのような酸性天
然産アミノ酸であり、酸側鎖基は遊離しているか、また
はアミドまたはエステル、特にベンジルまたはｔ−ブチ
ルエステルの形で保護されている。
−塩基性側鎖基またはペプチド結合の部分を形成しない
塩基性側鎖基群がAdoc、Aoc、Boc、Cbo、Foc、Fmoc、Ib
oc、Ｚ、Ｚ（ｐ−Cl）およびＺ（ｐ−OMe）等のよう
な、実際に塩基性特性を消失させる適切な塩基によって
保護されており、前記アミノ酸残基が特にCbo基によっ
て適切にブロックされている、とりわけArg、Lys、His
およびOrn残基である本来は塩基性の天然アミノ酸。
−特にACC、AHX、Aib、ATC、AZe、Abu、4Abu、CHA、CH
G、CHT（ここでOH側鎖基は、適切であるならばエーテル
またはエステルの形に保護されている）、Cle、Phg、Pi
pおよびPyrのような、いわゆる“中性”非塩基性合成ア
ミノ酸、および −各塩基性側鎖基が塩基性特性を実質的に消失させる適
切な基、特にDbu残基によって保護され、塩基性側鎖基
がCboのような基によってブロックされている当初は塩
基性の合成アミノ酸。
合成アミノ酸残基の中で下記するものが好適である： （ｉ）アミノ酸およびカルボキシル基が（上記したCle
基のように）同一環の炭素原子上に位置するかまたは二
つの異なる環の炭素原子上に位置する脂環式アミノ酸残
基、および （ii）とりわけｏ−、ｍ−、およびｐ−アミノベンゾイ
ル残基のような芳香族アミノ酸残基およびとりわけｐ−
アミノベンジルカルボニルおよびｍ−アミノベンジルカ
ルボニルのようなアルアルキルアミノ酸残基。
有利には本発明によれば、Ｂのモノアミノ酸残基は、
ACC、Aib、Ala、ATC、Asp、Aze、But、CHA、CHG、Cle、
Glu、Gly、4Hyp、3Hyp、Ile、Leu、Met、Nle、Nva、Ph
e、Pip、Pro、MeGly、Ser、Tbr、TyrまたはValのような
α−アミノ酸残基、β−Ala、CHT、4Hyp、3Hyp、Ser、T
hrまたはTyrのような残基でOH側鎖基がエーテルまたは
エステルの形で保護されているβ−アミノ酸残基、また
はカルボン酸側鎖基のOH基がOR3、NH2、NHR4またはNR4R
5によって置換されており、R3はC1〜C4アルキル（好ま
しくはMe、Et、iBu、Bu）、C1〜C4ヒドロキシアルキル
（好ましくCH2CH2OH）、C3〜C6シクロアルキル（シクロ
プロピル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルのよう
な）、またはω−アミノアルキル〔ここでアルキル部分
はC2〜C4であり、アミノ基はモノアルキル化（NHR4）、
ジアルキル化（NR4R5）または環中に含まれていても良
い（NR4R5＝ヘテロ環基）〕であり、R4およびR5は同一
かまたは異なり、夫々C1〜C4アルキル基であり、R4およ
びR5は共に窒素原子と結合して、ピロリジノ、ピペリジ
ノ、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペラジノ、４−
（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ、４−メチルピペ
ラジノ、４−（４−クロロフェニル）ピペラジノおよび
ヘキサメチレンイミノ基から成る群から選ばれたＮ−ヘ
テロ環基を形成することができるAspまたはGln残基であ
る。
従って、モノアミノ酸残基Ｂは不斉炭素原子を欠くAi
b、β−Ala、Cle、Cly、MeGlyおよび4Abuのようなアミ
ノ酸残基および不斉炭素原子を含むアミノ酸残基を含
む。
Ｂに存在するアミノ酸のみが一つの不斉炭素原子を含
むときには、このアミノ酸の残基は好ましくはＬ配置を
有し、式ＩのＢがＤ配置を有するモノアミノ酸残基であ
るトリペプチドは、体験によれば一般に基質として活性
がおとる。
体験は一般に基質として活性がおとる。
モノアミノ酸基Ｂは、好ましくは以下からなる群から
選ばれる。
（ii）OH側鎖基がエステルまたはエーテル基の形で保護
されているＬ−CHT、Ｌ−4Hyp、Ｌ−3Hyp、Ｌ−Ser、Ｌ
−ThrおよびＬ−Tyr残基、 （iii）塩基性側鎖基が適切な基で置換されて側鎖基の
塩基特性が実質的に除去されており、その適切な基が酸
基、とりわけCboから導かれるＬ−Arg、Ｌ−Lys、Ｌ−H
is、Ｌ−OrnおよびＬ−Dbu残基、および （iv）カルボキシル酸側鎖基がエステル化またはアミド
化されているＬ−AspまたはＬ−Glu残基。
Ｂが、２〜９のアミノ酸残基を含むペプチド基の場合
には、そのペプチド鎖の夫々のアミノ酸は、基Ｂがモノ
アミノ酸である上記リストのアミノ酸残基から選択され
る。
好ましくは、Ｂを構成するペプチド鎖は、この場合に
はα−アミノ酸残基のみを含む。
カルボニル結合を介して基Ｑと結合するペプチドのＮ
−末端を含むアミノ酸は、また好ましくは、下記からな
る群から選ばれるα−アミノ酸である。
（ｉ）Aib、CleおよびGlyのような、不斉炭素原子に欠
けるα−アミノ酸残基、および （ii）不斉炭素原子を含有し、ＤまたはＬ配置を有する
α−アミノ酸残基、 好ましくは（ａ）Aib、CleまたはGlyまたは（ｂ）Ｌ
配置を有する一つ以上のα−アミノ酸残基である他のア
ミノ酸残基またはそのペプチド鎖の残基。
更に、Ｂがペプチド鎖であるとき、このペプチド鎖は
有利には二つまたは三つのアミノ酸を含む。すなわち、
式Ｉの化合物はビス（トリペプチド）またはビス（テト
ラペプチド）である。
更にまた、Ｂが２〜３のアミノ酸残基を含むペプチド
鎖であるときには、２の位置におけるアミノ酸残基、す
なわちＢ−ＡのＮ末端を含むアミノ酸残基に直接結合す
るアミノ酸残基は、AspまたはGluであることが、とりわ
け推賞され、止血に含まれるファクターXaの決定の分野
において特に有用である式Ｉの化合物を形成するため
に、もしも適切であるならば、上述したようにAspまた
はGlu残基の夫々のカルボキシル側鎖基をエステル化ま
たはアミド化することが可能である。
ラベル化手段Ｒは生物学的および微生物学的アッセイ
（検定）の分野において良く知られており、この点に関
しては上記した従来技術、特にUS−Ａ−4,448,715特許
明細書を参照することができる。このラベル化手段は、
（ｉ）色の変化をもたらす、（ii）蛍光をもたらす、ま
たは（iii）少くとも一つの放射性元素（たとえば14Cま
たは3H放射性同位元素でラベル化されたアニリノまたは
ベンジルアミノ基）を含むアミノ化された基NH−Ｒ′か
らなる群から好ましくは選ばれる。
酵素反応の間またはその後に、増幅して検出すること
ができる（たとえば、与えられた波長における光学密度
の測定によって、または放射能の測定によって）信号を
与えるいづれのアミノ基NH−Ｒ′も本発明の目的に好適
である。酵素による加水分解における開裂によって得ら
れた生成物Ｈ−Ｒの量は、使用した酵素量に比例する。
このＨ−Ｒの量は、測光、分光測光、蛍光分光測光また
は電気化学によって測定することができる。
本発明により推賞されるＲは発色基、代表的にはニト
ロフェニルアミノ基（ここでフェニル基はCOOH、Ｆ、C
l、Br、CH3、OCH3、CN、CF3および／またはSO3Hで置換
されていても良い）、または蛍光発生基、代表的にはナ
フチルアミノ基（ここでナフチル基はOCH3、COOH、SO3H
またはCH3で置換されていても良い）、および４−メチ
ルクマリル−７−アミノ、４−トリフルオロメチルクマ
リル−７−アミノおよび類似基である。
本発明において好適な発色および蛍光発生アミノ基の
中で、とりわけ下記の基を挙げることができる:p−ニト
ロアニリノ（略記号pNA）、２−カルボキシ−４−ニト
ロアニリノおよび３−カルボキシ−４−ニトロアニリ
ノ、２−ハロゲノ−４−ニトロアニリノおよび３−ハロ
ゲノ−４−ニトロアニリノ（ここでハロゲンはＦ、Clま
たはBrである）、２−メトキシ−５−メチル−４−ニト
ロアニリノ、２−ヒドロキシスルホニル−４−ニトロア
ニリノ、４−フリフルオロメチル−２−ニトロアニリ
ノ、４−フリフルオロメチル−３−ニトロアニリノ、４
−シアノ−２−ニトロアニリノ、ナフチル−２−アミ
ノ、４−ヒドロキシスルホニルナフチル−１−アミノ、
キノリルアミノ、ニトロキノリルアミノなど。
本発明によれば好ましい基Ｒは発色基、すなわち一方
では、一般に上述したタンパク分解酵素の定量的決定に
好適であり、とりわけファクターXa、プロテインＣおよ
び／またはプラズミンの決定に好適であるpNAであり、
他方ではpNAのフェニル環が２または３の位置で置換さ
れている類似の基であり、この基は下記の式（II）を有
する。
（II）式中、Ｙ′はBr、Cl、Ｆ、CF3、COOH、COOW、C
ONH2、CONHW、CONW2、CONH(CH2)mNMe2、OHまたはOWであ
り、ＷはC3〜C6アルキル、C6〜C10アリール、C7〜C11ア
ラルキルまたはC3〜C8脂環基であり、ｍは１〜10の整数
である。
pNA基のフェニル環が置換されている式IIのかかる基
は、特にEP−Ａ−0,110,306号明細書に記述されてい
る。
本発明における付加塩は、本質的には式Ｉの化合物と
鉱酸または有機酸との反応によって得られた酸付加塩で
ある。
本発明の実施の最上の方法は、基質として、下記から
成る群から選択された対称的ビペプチド化合物を用いる
ことからなる。
（ｉ）下記式の化合物。
pNA−Arg−Ｂ−CO−Ｏ［CH2CH2O］ｎ−CO−Ｂ−Arg−pN
A （Ia） ここで、Ｂは単一結合;Aib、CleまたはGly残基、また
はＬ配置を有するモノアミノ酸残基；またはカルボニル
結合COに結合するペプチド鎖のＮ−末端を含むアミノ酸
残基がAib、CleまたはGlyまたはＬまたはＤ配置を有
し、他のアミノ酸残基または残基群がAib、CleまたはGl
yまたはＬ配置を有するジ−またはトリ−ペプチド残基
である。
ｎは、１より大きいか、または１に等しい整数で基O
[CH2CH2O]nの平均分子量は約60と約600の間、好ましく
は200と400との間である。
（ii）式ｉの化合物の付加塩。
本発明を実施するための最上の方法のわく内の、実際
的見地から、一方では基O[CH2CH2O]nの平均分子量はほ
ぼ200〜400であるべきであり、すなわち基O[CH2CH2O]n
は200〜400の分子量を有するPEG化合物から導かれるべ
きであり、他方では、基Ｂはジ−またはトリ−ペプチド
基であるべきである。限定を意図するものではなく、本
発明によるいくつかのペプチド化合物を下記表１に示す
が、最も有益なものは、とりわけ下記である。
（ａ）PEG200(CO-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA)2， （ｂ）PEG600(CO-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA)2， （ｃ）PEG200(CO-D-Gly(OBzl)-L-Pro-L-Arg-pNA)2， （ｄ）PEG200(CO-D-Nle-L-CHA-L-Arg-pNA)2， （ｅ）PEG200(CO-D-Leu-Gly-L-Arg-pNA)2， （ｆ）PEG200(CO-D-CHA-Gly-L-Arg-pNA)2， （ｇ）PEG300(CO-D-Leu-Gly-L-Arg-pNA)2， （ｈ）PEG400(CO-D-Leu-Gly-L-Arg-pNA)2， （ｉ）PEG200(CO-D-Nle-Gly-L-Arg-pNA)2，および （ｊ）上記のものの付加塩。
従来知られている基質のように、本発明による式Ｉま
たはIaの対称化合物およびこれら化合物の付加塩は、酵
素による加水分解において、Ｈ−Ｒ量は試料中に存在す
る酵素量に比例する。他方、本発明による化合物は従来
知られている基質とは異なる酵素による加水分解速度を
有する。
本発明によれば、式Ｉの化合物は慣習的反応機構の適
用による、それ自体知られている方法で製造することが
できる。ここで推賞する方法は、下記式（IV）のアミノ
酸またはペプチド化合物を、下記式（Ｖ）のポリアルキ
レングリコールジハロゲノホルメートと下記の反応によ
って反応させることからなる。
式（IV）において、Ｂ、ＡおよびＲは上記したとおり
定義され、式（Ｖ）において、Halはハロゲン原子、と
りわけ、Ｆ、ClまたはBr、好ましくはClであり、Ｑは上
記したとおり定義される。
式IVおよびＶで示される原料化合物は、当業者に良く
知られている慣習的方法によって得られる。とりわけ、
Ｂが単一結合の場合には、化合物IVはペプチド合成の慣
例的方法の一つによって得られる。
有利には、２モルのIVを１〜1.3モル（好ましくは１
〜1.1モル）のＶと不活性溶媒（特にDMFまたはTHF）中
で０〜40℃の間の温度で少なくとも0.25時間、反応媒体
のための補助溶媒としても役立つプロトン受容体、とり
わけEt3NまたはDIEAのような第３級アミンの存在下で反
応せしめる。化学量論的条件に関して過剰の第３級アミ
ンとりわけ第３級アミン／化合物IVが1.7/1〜2.6/1、好
ましくは2/1〜3.1/1のモル比で用いることが好ましい。
式Ｉのトリペプチド化合物およびこれらの付加塩は止
血に含まれる酵素の決定に有用である。特に、それらは
ファクターXa、プラスミンまたはスロンビン（thrombi
n）のための特殊な基質を構成する。これらの酵素を決
定するための推賞される方法は、式Ｉのトリペプチドま
たはその付加塩の１種の与えられた量を（ほぼ10mg/ml
の濃度で）、緩衝等張溶液のような適切な水性液媒体中
で目的とする酵素を含む試料（もしも適切ならば希釈し
て）と少なくとも0.5時間、室温〜40℃の間の温度、特
に37℃で接触せしめる。
止血に含まれる酵素に対するトリペプチドの活性は、
本発明によればEP−Ａ−0,280,160に記述されたような
慣習的な方法（第14頁参照）で決定され、加水分解率が
時間による光学密度の変化（Δ0D/分）によって査定さ
れる。得られた結果を後述する表２にまとめた。この表
２では、参照生成物（CP1〜CP3）の活性を便利のために
100％とした。
本発明の更に他の利点および特徴は以下に述べる製法
実施例および比較試験の結果からより明らかに理解でき
るであろう。もちろん、これらのデータは全体として何
の限定を意味するものではなく、説明のために提供する
ものである。
製法Ｉ PEG200(D-Leu-Gly-L-Arg-pNA)2・2AcOHの製造。
（実施例５） ａ）Ｚ−Ｌ−Arg−pNA.HCl 344g（１モル）のＺ−Ｌ−Arg−OH.HClを無水のHMPT
（新たに蒸留し、モノキュラーシーブ上で乾燥した）に
室温で溶解し、次いで139ml（１モル）のEt3Nを攪拌下
に室温で加えた。得られた溶液に328g（２モル）のｐ−
ニトロフェニルイソシアネートを加えた。得られた反応
媒体を室温で24時間攪拌し、次いで減圧下に蒸発させ、
残渣を最少量のAcOHに溶解し、AcOEtでうすめた。得ら
れた溶液を次いで少量の0.5M NaHCO3溶液で連続して３
回、KHSO4の50g/l溶液で３回、次いでNaClのほぼ飽和水
で数回抽出した。次いで有機層を無水硫酸ナトリウムで
乾燥した。濾過後（Na2SO4の除去）に、溶媒を蒸発除去
し、蒸留残渣をAcOEt/MeOMe混合物（3/7 v/v）から再結
晶して白色粉末状の目的とする生成物の350gを得た。
M.p.＝融点128−130℃ 分析（シリカゲルによる薄層クロマトグラフィ） Rf＝0.5、AcOEt/ピリジン/AcOH/H2O（20/4.5/3/1 v/v） Rf＝0.69、CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1 v/v） ｂ）Ｈ−Ｌ−Arg−pNA.2HBr 100g（0.215モル）のＺ−Ｌ−Arg−pNA.HClをガラス
／テフロン装置中に仕込んだ。800mlの氷酢酸、200mlの
アニソールおよびHBrの氷酢酸溶液1000mlを不活性雰囲
気下（窒素流）で連続的に加えた。反応を窒素雰囲気
下、室温で１時間続行した。この時間の経過後に、反応
中に均一になった反応混合物を20lのエーテル（MeOMeま
たはEtOEt）中に沈澱させた。デカンテーション後に、
上清を放棄し、沈澱をエーテルで数回洗浄した。沈澱を
濾過によって集め、減圧下にKOHで24時間乾燥して目的
とする生成物94.2g（収率96％）を得た。
分析（シリカゲルによる薄膜クロマトグラフィ） Rf＝0.04、AcOEt/ピリジン/AcOH/H2O（20/4.5/3/1.5 v/
v） Rf＝0.38、BuOH/AcOH/H2O（3/1/1 v/v）。
ｃ）Boc−Gly−Ｌ−Arg−pNA.HBr 1g（2.19モル）のＨ−Ｌ−Arg−pNA.2HBrを10mlのDMF
に溶解し、次いで0.854ml（6.57ミリモル）のDIEAを加
えた。他の容器で、384mg（2.19ミリモル）のBoc−Gly
−OHをDMF5mlに溶解した溶液を0.285mlのDIEAで中和し
た。このようにして得られた二つの溶液を混合し、得ら
れた媒体に970mgのBopを加え、室温に保持した。また、
反応中を通して少量のDIEAを加えてpHを７と８の間の値
に保った。１時間後、反応が完結した後に、反応媒体を
減圧下に蒸発乾固した。蒸発残渣をAcOEt/MeOH混合物に
溶解し、NaHCO3の0.5モル水溶液で抽出した。有機層を
硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に濃縮し、次いでエー
テル（MeOMeまたはEtOEt）中に沈澱させて、目的生成物
の874mg（収率75％）を得た。
分析（シリカゲルによる薄膜クロマトグラフィ）： Rf＝0.53、CHCl3/MeOH/AcOH（10/3/1 v/v）。
ｄ）Ｈ−Gly−Ｌ−Arg−pNA.2H−TFA 874mg（1.64ミリモル）のBoc−Gly−Arg−pNA.HBrを
反応容器中に仕込み、次いで6.6mlのCH2Cl2および6.6ml
のＨ−TFAを連続して加えた。室温下0.25時間の反応時
間の後、反応混合物を直接エーテル中に沈澱させた。薄
片状の白色沈澱が形成され、これを濾過分離し、乾燥し
て目的生成物の910mg（収率96％）を得た。
分析（シリカゲルによる薄膜クロマトグラフィ）： Rf＝0.09、CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1 v/v）。
ｅ）Boc−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA.H−TFA 製法Icに従って（ｉ）910mg（1.57ミリモル）のＨ−G
ly−Ｌ−Arg−pNA.2H−TFA、（ii）363mg（1.57ミリモ
ル）のBoc−Ｄ−Leu−OH、（iii）1.2mlのDIEAおよび
（iv）695mg（1.57ミリモル）のBopから成る反応混合物
をDMF中で反応させ、反応混合物を攪拌下に２時間、室
温に保持した。減圧下に蒸発乾固させた後に、蒸発残渣
をCHCl3/MeOH/AcOH（比率20/3/1〜10/3/1 v/v）を溶出
剤として用いるシリカゲルによるクロマトグラフィ分析
にかけた。捕集した均一溶出分を冷却し、溶出液を蒸発
させた。凍結乾燥によって目的生成物の785mg（収率80
％）を純粋な状態で得た。
分析（シリカゲルによる薄層クロマトグラフィ）： Rf＝0.33、CHCl3/MeOH/AcOH（10/3/1 v/v）。
ｆ）Ｈ−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA.2H−TFA 製法Ieによって得られ785mg（1.25ミリモル）のBoc−
Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA.H−TFAを5mlのCH2Cl2およ
び5mlのＨ−TFAと室温で反応させた。0.25時間の後、反
応混合物を直接エーテル中で沈澱させ、白色沈澱を得
た。この沈澱を濾別し、エーテルで洗浄し、乾燥した。
目的とする生成物の779mg（収率90％）を捕集した。
分析（シリカゲルによる薄層クロマトグラフィ）： Rf＝0.2、CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1 v/v）。
ｇ）PEG200(D-Leu-Gly-L-Arg-pNA)2・2AcOH 15mlのDMFおよび0.345ml（2.47ミリモル）のEt3Nを上
記のようにして得られたＨ−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−p
NA.2H−TFAの779mg（1.12ミリモル）に加えた。得られ
た混合物を攪拌下に氷で冷却した。182mg（0.563ミリモ
ル）のPEG200のジクロロホルメート〔下記の製剤方法VI
IIによって得られたものであり、構造式Cl-CO-O(CH2CH2
O)n-CO-Clを有し、ここでｎはO(CH2CH2O)nの部分の分子
量が約200の値を有するような値である〕のDMF5ml溶液
を次いで滴々添加した。得られた反応混合物を次いで徐
々に２時間かけて室温にまで温めた。濾過によって形成
されたトリエチルアンモニウム塩を除去し、濾液を蒸発
させた。蒸発残渣を、MeOH/H2O混合物（3/2 v/v）を溶
出剤に用いてイオン交換樹脂〔アンバーライト（AMBERL
ITE:登録商標）IRA4015〕によるクロマトグラフにかけ
た。得られた均一な溶出留分を冷却した。蒸発後に凍結
乾燥して目的生成物の460mg（収率63％）を得た。
分析（シリカゲルによる薄層クロマトグラフィ）： Rf＝0.34、CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1 v/v）。
製法II PEG300(D-Leu-Gly-L-Arg-pNA)2・2AcOHの製造。
（実施例８） PEG200ジクロロホルメートの代りにPEG300ジクロロホ
ルメートを用いた以外は製法Igに示した方法に従って、
目的とする生成物を得た。
製法III PEG400(D-Leu-Gly-L-Arg-pNA)2・2AcOHの製造。
（実施例９） PEG200ジクロロホルメートの代りにPEG400ジクロロホ
ルメートを用いた以外は製法Igに示した方法に従って目
的とする生成物を得た。
製法IV PEG200(D-Nle-Gly-L-Arg-pNA)2・2AcOHの製造。
（実施例10） 式Boc−Ｄ−Leu−OHのアミノ酸を製法Ieにおいて式Bo
c−Ｄ−Nle−OHに代えた以外は製法Ｉに示した方法によ
って目的生成物を得た。
製法Ｖ PEG200(D-Nle-CHA-L-Arg-pNA)2・2AcOHの製造。
（実施例５） 式Boc−Gly−OHを製法Icにおいて式Boc−Ｌ−CHA−OH
に代え、製法IeにおいてBoc−Ｄ−Leu−OHを式Boc−Ｄ
−Nle−OHのアミノ酸に代えた以外は製法Ｉに示した方
法によって目的とする生成物を得た。
製法VI PEG200(D-Gly-Pro-L-Arg-pNA)2・2AcOHの製造。
（実施例２） ａ）Ｚ−Ｌ−Arg−pNA.HCl 100g（0.724モル）のＨ−pNAを0.5lのピリジンに溶解
した。攪拌した混合物を−20℃に冷却した。あらかじめ
−20℃に冷却した64ml（0.724ミリモル）のPCl3を滴々
添加し、反応混合物を−20℃に１時間保った。223gのＺ
−Ｌ−Arg−OHを次いで加え、温度を−20℃に１時間保
持し、次いで反応混合物を室温まであたため、12時間保
持した。得られた反応混合物を10lの氷水中に移し、上
清の沈澱物を濾別し、AcOH/AcOEt混合物に溶解し、Na24
CO3の0.5モル水溶液、KHSO4の50g/lに水溶液、次いでNa
Clでほぼ飽和した水で連続的に（３回）洗浄した。有機
層をNaHSO3で乾燥し、次いで蒸発させ濃縮した。得られ
た濃縮物をCHCl3/MeOH/AcOH系（比率:20/3/1〜5/3/1 v/
v）を用いるシリカカラムによるクロマトグラフィにか
けた。均一な溶出液を冷却し、蒸発させ、エーテル中に
沈澱させて222gの目的生成物（収率:66％）を得た。
M.p.＝128−130℃ 分析（シリカゲルによる薄層クロマトグラフィ）： Rf＝0.76、CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1 v/v）。
Rf＝0.2、CHCl3/MeOH/AcOH（20/3/1 v/v）。
ｂ）Ｈ−Ｌ−Arg−pNA.2HBr 製法Ibに示した操作に従った。
ｃ）Boc−Gly−Ｌ−Pro−OH 1.4ml（11ミリモル）のＮ−メチルホルホリンを50ml
のDMF中の1.15g（10ミリモル）のプロリンに加えた。混
合物を氷浴で冷却し、次いで3.06g（10ミリモル）のBoc
−Gly−OSuを加え、少量のＮ−メチルホルホリン（この
物質はプロトン受容体として用いた）を連続的に加える
ことによって反応の間中（14時間）、pHを６と７の間に
調整した。DMFを蒸発除去し、蒸発残渣をAcOEtに溶解さ
せた。石油エーテル中に沈澱させた後、次いで濾過する
ことによって目的とする生成物を集めた。
分析（シリカゲルによる薄層クロマトグラフィ）： Rf＝0.53、BuOH/AcOH/H2O（3/1/1 v/v）； Rf＝0.42、/AcOEt/ピリジン/AcOH/H2O（20/4.5/3/1.5
v/v）。
ｄ）Boc−Gly−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA.HBr 1.35mlのEt3Nを25mlのDMF中の4g（8.8ミリモル）のＨ
−Ｌ−Arg−pNA.2NBrに加えた。混合物を氷浴で冷却
し、次いで2.38gのジペプチドBoc−Gly−Ｌ−Pro−OH、
2.67g（17.5ミリモル）のHOBTおよび2.7g（約3.15ミリ
モル）のDCCIを連続して加え、Et3Nの添加によってpHを
６と７の間に調整した。反応媒体を室温で12時間攪拌し
た。次いで濾過し（形成されたDCHUの除去のため）、濾
液を減圧下に蒸発させた。EtOEtで沈澱させて白色沈澱
を得、これを最少量のCHCl3/MeOH/AcOH（8/3/1 v/v）に
溶解させた。得られた溶液を同一の溶媒系を用いてシリ
カゲルによるクロマトグラフィにかけた。得られた均一
な溶出液を回収し蒸発させた凍結乾燥して目的生成物の
4.7g（収率85％）を得た。
分析（シリカゲルによる薄層クロマトグラフィ）： Rf＝0.64、BuOH/AcOH/H2O（3/1/1 v/v）； Rf＝0.76、CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1 v/v）。
ｅ）Ｈ−Gly−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA.2H−TFA Boc−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA.H−TFAを4.7gをBo
c−Gly−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA.HBrに代えた以外は製
剤Ifに示した操作に従い、エーテルへの沈澱後に目的生
成物の5gを得た。
分析（シリカゲルによる薄層クロマトグラフィ）： Rf＝0.12、CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1 v/v）。
ｆ）PEG200(Gly-L-Pno-L-Arg-pNA)2・2AcOH Ｈ−Gly−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA.2H−TFAから出発し
て製法Ifに記述した操作に従って目的生成物を得た。
製法VII PEG200（Ｄ−Glu（OBzl）−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pN
A）２.2AcOH（実施例４）の製造。
Boc−Gly−OSuを製法VIcにおいてBoc−Ｄ−Glu（OBz
l）−OSuに代えた以外は製剤VIに示した操作に従って目
的とする生成物を得た。
製法VIII PEG200ジクロロホルメートの製造。
1g（５ミリモル）のPEG200およびTHFに溶解した1.4ml
（10ミリモル）のEt3Nを、−30℃に保持され、常にジオ
ールに対して大過剰に存在するホスゲンを収容した反応
容器中に滴下濾斗から滴下添加した。反応混合物を−30
℃で２時間攪拌し、次いで室温にまであたためた。過剰
のホスゲンを窒素流で全て除去し、このホスゲンを除去
するために、この操作を数時間続けた。得られた反応混
合物を次いで減圧下に蒸発させて粘ちょうな液状の目的
生成物の1.59g（収率98％）を得た。
分析（赤外スペクトル） -3300cm-1にアルコール吸収帯が消失； −1776および1152cm-1にクロロホルメート吸収帯が出
現。他のPEGsのジクロロホルメートもまたこの方法によ
って得られた。
比較試験 活性を共に、100％に等しいとされた本発明の生成物
と標準物質の等モル投与によって行なわれた比較試験の
結果を下記表２にまとめた。
表２の結果は、実施例２〜実施例４および実施例６〜
実施例９の本発明による化合物は参考物質CP3よりもプ
ラスミンに対してより鋭敏であること、および実施例５
の生成物は参考物質CP1よりもトロンビンに対してより
鋭敏であることを示している。更に、実施例６の生成物
は試料中にプラスミン禁止剤が導入されたときにファク
ターXaの決定に用いることができる。
最後に、止血に含まれる酵素、特にプラスミンの決定
のためアッセイ・キットが本発明によれば推賞され、こ
のキットは本発明による式Ｉの化合物およびそれらの付
加塩からなる群から選ばれた少なくとも１種のペプチド
を含み、もしも適切であるならば、酵素およびかん衝液
媒体の標準試料を含む。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アミノ酸およびポリアルキレングリコール
    残基に結合したアミノ酸残基を含むペプチドの族に属す
    る化合物であり、該化合物は下記からなる群から選ばれ
    る。 （ｉ）対称的アミノ酸および下記式（Ｉ）の対称的ペプ
    チド ここで、 Ｑは下記式のポリエチレングリコールおよびポリプロピ
    レングリコール残基であり、 -O[CH(X)CH2O]n- ここでＸはＨまたはMeであり、ｎは１以上の整数であ
    り、Ｂは単一結合、モノアミノ酸残基または２〜９のモ
    ノアミノ酸残基からなるペプチド鎖であり、Ａは側鎖に
    塩基性基を含むα−アミノ酸残基からなる群から選ばれ
    た塩基性モノアミノ酸残基であり、 Ｒは確認されるべき、またはアッセイされるべき酵素物
    質を顕出させることが可能なラベル化手段である； および （ii）（ｉ）に示した化合物の付加塩。
  2. 【請求項２】Ｑが60〜1000の平均分子量を有する式-O[C
    H2CH2O]n-のポリエチレングリコール残基である請求の
    範囲１記載の化合物。
  3. 【請求項３】Ｑが200〜800の平均分子量を有する式-O[C
    H2CH2O]n-のポリエチレングリコール残基である請求の
    範囲１記載の化合物。
  4. 【請求項４】Ｂが下記のアミノ酸から導かれた残基から
    なる群から選ばれたモノアミノ酸残基である請求の範囲
    １記載の化合物。 −Ala、β−Ale、Cys、Gln、4Hyp、3Hyp、Leu、Met、Nl
    e、Nva、Phe、Pro、MeGly、Ser、TyrおよびValのよう
    な、いわゆる“中性”の非塩基性天然産アミノ産であ
    り、4Hyp、3Hyp、Ser、ThrおよびTyr残基のOH側鎖基は
    エーテルまたはエステル保護基に保護されていてもいな
    くても良く、かつCys残基のSH側鎖基はチオエーテルま
    たはチオエステル保護基によって保護されていてもいな
    くても良い； −Asp、β−Asp、Gluおよびγ−Gluのような酸性天然ア
    ミノ酸であり、酸側鎖基は遊離状態か、またはアミドま
    たはエステル、ベンジルまたはｔ−ブチルエステルの形
    にブロックされている。 −塩基性側鎖基またはペプチド結合の部分を形成しない
    側鎖基が塩基性特徴を実質的に排除するBoc、Cbo、Ado
    c、Aoc、Fmoc、Foc、Iboc、Ｚ、Ｚ（ｐ−Cl）およびＺ
    （ｐ−OMe）のような適切な酸基によってブロックされ
    ている初めは塩基性の天然アミノ酸であり、該アミノ酸
    残基は該適切な酸基の一つによって適切にブロックされ
    ているArg、Lys、HisおよびOrn残基である。 −ACC、AHX、Aib、ATC、Aze、Abu、4Abu、CHA、CHG、CH
    T（ここでOH側鎖基は、もし適切ならばエーテルまたは
    エステルの形に保護されている）、Cle、Phg、Pigおよ
    びPyrのような、いわゆる“中性”の非塩基性合成アミ
    ノ酸；および −各塩基性側鎖基が塩基性特徴を実質的に排除する適切
    な基、Dbu残基によって保護されている初めは塩基性の
    合成アミノ酸であり、塩基性側鎖基がBoc、Cbo、Adoc、
    Aoc、Fmoc、Foc、Iboc、Ｚ、Ｚ（ｐ−Cl）およびＺ（ｐ
    −OMe）のような基によってブロックされている。
  5. 【請求項５】ＢはOH側鎖基がエーテルまたはエステルの
    形で保護されているACC、Aib、Ala、ATC、Asp、Aze、Bu
    t、CHA、CHG、Cle、Glu、Gly、4Hyp、3Hyp、Ile、Leu、
    Met、Nle、Nva、Phe、Pip、Pro、MeGly、Ser、Thr、Ty
    r、Val、β−Ala、CHT、4Hyp、3Hyp、Ser、ThrまたはTy
    r残基、またはカルボン酸側鎖のOH基がOR3、NH2、NHR4
    またはNR4R5によって置換されているAspまたはGlu残基
    であり、ここでR3はC1〜C4アルキル（好ましくはMe、E
    t、iBu、C1〜C4ヒドロキシアルキル（好ましくはCH2CH2
    OH）、C3〜C6シクロアルキル（シクロプロピル、シクロ
    ペンチルまたはシクロヘキシルのような）またはω−ア
    ミノアルキル〔ここでアルキル部分はC2〜C4であり、ア
    ミノ基はモノアルキル化（NHR4）、ジアルキル化（NR4R
    5）されていても良いし、または環中に含まれていても
    良い（NR4R5＝ヘテロ環基）〕であり、かつR4およびR5
    は同一または異なり、夫々がC1〜C4アルキル基であり、
    R4およびR5は窒素原子に夫々が結合してピロリジノ、ピ
    ペリジノ、モノホリノ、チオモルホリノ、ピペラジノ、
    ４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ、４−メチル
    ピペラジノ、４−（４−クロロフェニル）ピペラジノお
    よびヘキサメチレンイミノ基からなる群から選ばれるＮ
    −ヘテロ環基を形成することが可能である請求の範囲１
    記載の化合物。
  6. 【請求項６】Ｂが下記からなる群から選ばれる請求の範
    囲１記載の化合物。 （ii）OH側鎖基がエステルまたはエーテル基の形で保護
    されているＬ−CHT、Ｌ−4Hyp、Ｌ−3Hyp、Ｌ−Ser、Ｌ
    −ThrおよびＬ−Tyr残基、 （iii）塩基性側鎖基が適切な基によって置換されて該
    側鎖基の塩基特性が実質的に消失しており、前記適切な
    基が酸基、特に、Boc、Cbo、Adoc、Aoc、Fmoc、Foc、Ib
    oc、Ｚ、Ｚ（ｐ−Cl）およびＺ（ｐ−OMe）から導かれ
    るＬ−Arg、Ｌ−Lys、Ｌ−His、Ｌ−OrnおよびＬ−Dbu
    残基。 （iv）カルボン酸側鎖基がエステル化またはアミド化さ
    れているＬ−AspまたはＬ−Glu残基。
  7. 【請求項７】Ｂがペプチド残基であり、カルボニル架橋
    を介して群Ｑに結合している該ペプチド残基のＮ末端を
    含むアミノ酸が下記から成る群から選ばれたα−アミノ
    酸残基である請求の範囲１記載の化合物。 （ｉ）Aib、CleおよびGlyのような、不斉炭素原子を欠
    くα−アミノ酸残基、および （ii）不斉炭素原子を含み、かつＤまたはＬ配置を有す
    るα−アミノ酸残基、他のアミノ酸残基、または（ａ）
    Aib、CleまたはGly、または（ｂ） Ｌ−配置を有するα−アミノ酸であるペプチド鎖Ｂの残
    基。
  8. 【請求項８】Ｂがペプチドまたはトリペプチド残基であ
    る請求の範囲１または７記載の化合物。
  9. 【請求項９】下記からなる群から選ばれた対称的ビペプ
    チドである請求の範囲１記載の化合物。 （ｉ）下記式の化合物。 pNA−Arg−Ｂ−CO−O[CH2CH2O]m−CO−Ｂ−Arg−pNA（I
    a） ここで、Ｂは単一結合;Aib、CleまたはGly残基、または
    Ｌ配置を有するモノアミノ酸残基：またはカルボニル架
    橋COに結合したペプチド鎖のＮ末端を含むアミノ酸残基
    がAib、Cle、GlyまたはＬまたはＤ配置を有するα−ア
    ミノ酸、他のアミノ酸残基または前記ペプチド鎖の残基
    が一つ以上のAib、CleまたはGly残基またはＬ−配置を
    有するα−アミノ酸残基であり、およびｎは１以上で基
    O[CH2CH2O]nの平均分子量が約60と600の間であるような
    整数；および （ii）これら化合物の付加塩。
  10. 【請求項１０】下記からなる群から選ばれた請求の範囲
    １記載の化合物。 （ａ）PEG200(CO-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA)2， （ｂ）PEG600(CO-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA)2， （ｃ）PEG200(CO-D-Gly(OBzl)-L-Pro-L-Arg-pNA)2， （ｄ）PEG200(CO-D-Nle-L-CHA-L-Arg-pNA)2， （ｅ）PEG200(CO-D-Leu-Gly-L-Arg-pNA)2， （ｆ）PEG200(CO-D-CHA-Gly-L-Arg-pNA)2， （ｇ）PEG300(CO-D-Leu-Gly-L-Arg-pNA)2， （ｈ）PEG400(CO-D-Leu-Gly-L-Arg-pNA)2， （ｉ）PEG200(CO-D-Nle-Gly-L-Arg-pNA)2，および （ｊ）上記の付加塩。
  11. 【請求項１１】請求の範囲１記載の式Ｉの化合物または
    その付加塩の一種の与えられた量を水性生物学的媒体中
    で酵素を含む試料と接触させて止血中に含まれる該酵素
    を決定する方法。
  12. 【請求項１２】請求の範囲１記載の式Ｉの化合物または
    その付加塩の一種の与えられた量を水性生物学的媒体中
    で該酵素を含む試料と少なくとも0.25時間、15〜40℃の
    間の温度で接触させる請求の範囲11記載の方法。
  13. 【請求項１３】請求の範囲１記載の式Ｉの化合物および
    その付加塩の製造方法であり、該方法はアミノ酸または
    下記式（IV）のペプチド化合物を 下記式（Ｖ）のポリアルキレングリコールジハロゲノホ
    ルメートと反応させることからなる。 ここでＢ、ＡおよびＲは上記請求の範囲１に定義されて
    いるとおりであり、Halはハロゲン原子、特にＦ、Clま
    たはBr、好ましくはClであり、Ｑは上記請求の範囲１に
    定義されているとおりである。
  14. 【請求項１４】２モルのIVを１〜1.3モルのＶと不活性
    溶媒中で０〜40℃の温度でプロトン受容体としての第３
    級アミンの存在下、第３級アミン／化合物IVのモル比1.
    7〜3.6/1で反応させる請求の範囲13記載の方法。
  15. 【請求項１５】請求の範囲１記載の式Ｉの化合物および
    その付加塩からなる群から選ばれた少なくとも１種の化
    合物からなる止血中に含まれる酵素の決定のためのアッ
    セイ・キット。
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