JP2894782B2 - アンフェタミン様分析対象物の検出のための蛍光偏光イムノアッセイ法およびそれに用いるアッセイキット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、尿のような試料中のアンフェタミン様薬物
の検出のための試薬および方法に関する。さらに詳しく
は、本発明は、試料中のアンフェタミン様薬物の存在ま
たは量を決定するための蛍光偏光イムノアッセイ法、該
方法に試薬として使用する新規なトレーサー化合物、お
よび該方法に使用する抗体を産生させるための免疫原化
合物に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題） アンフェタミン様薬物は、中枢神経系興奮作用を有す
る交感神経興奮性のフェネチルアミン誘導体である。こ
れらの薬物は、肥満症、マルコレプシー、および低血圧
の治療に用いられている。しかしながら、これらの薬物
を過剰に使用することは、耐性および身体的な依存症を
引き起こすし、さらにこれらの薬物は興奮作用を有する
ための一般に濫用されている。非常に多量のアンフェタ
ミン様薬物を摂取したときにしばしば伴う生理学的な兆
候としては、血圧の上昇、瞳孔の拡散、高熱、痙攣、お
よび急性のアンフェタミン精神病が挙げられる。

アンフェタミン様薬物の検出または定量のために最も
しばしば用いられる生物学的流体は尿である。しかしな
がら、血清、血漿または唾液などの他の生物学的流体も
また試料として用いることができる。過去において、ア
ンフェタミンは、薄層クロマトグラフィー（TLC）、ガ
スクロマトグラフィー（GC）、および高速液体クロマト
グラフィー（HPLC）を含む多くの方法によって検出され
てきた。これらの方法は、一般に該薬物の試料からの複
雑な化学的抽出を含むものであるが、これは高度の熟練
者と長いアッセイ時間を要する込み入った手順である。

分析対象物を検出するためのガスクロマトグラフィー
（GC）や薄層クロマトグラフィー（TLC）や高速液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）のような化学的方法に代わる
好ましい方法は、結合アッセイである。抗原および抗体
を検出するための結合アッセイは、これらの物質を特徴
付ける免疫学的反応性に依存する。一般に、これらのア
ッセイは一括してイムノアッセイと呼ばれる。

イムノアッセイ法は、高等生物において該生物にとっ
て病原性であるかまたは異物である抗原の存在に応答し
て抗体が産生されるという免疫系の機構を利用したもの
である。特定の抗原に応答して該抗原に反応性の１種ま
たは２種以上の抗体が産生されることにより高度に特異
的な反応機構が得られ、この機構を生物学的試料中の特
定の抗原の存在または濃度をインビトロで決定するのに
用いることができる。

分析対象物を測定するための競合結合イムノアッセイ
は、試料中の該分析対象物と標識試薬（トレーサー）と
の両方に特異的な結合成分（たとえば抗体）上の限られ
た数の結合部位に対して、該分析対象物と該トレーサー
との間で競合が起こることに基づいている。一般に、試
料中の分析対象物の濃度が抗体に結合するトレーサーの
量を決定する。トレーサー／抗体複合体の量を定量的に
測定することができ、これは試料中の分析対象物の量に
反比例する。

蛍光偏光法は、競合結合イムノアッセイにおいて生成
したトレーサー／抗体複合体の量の測定手段を提供す
る。蛍光偏光法は、直線偏光により励起されたときに蛍
光標識試薬が急速に回転し、その回転するトレーサーに
よって放射される蛍光がその急速な回転のために部分的
に脱偏光されるという原理に基づいている。その結果、
トレーサーは、その回転度とは逆の関係にある偏光の度
合を有する蛍光を放射する、すなわち、回転が大きくな
るほど放射光の偏光は小さくなる（あるいは放射光の脱
偏光が大きくなる）。回転のスピードと脱偏光の程度
は、トレーサーが重い分子に結合しているとき、たとえ
ば比較的重い抗体分子に結合しているときには減少す
る。蛍光トレーサー／抗体複合体を含む反応混合物を直
線偏光で励起させた場合、複合体中の蛍光団は急速に回
転が抑えられているので放射光は一般に偏光したままで
ある。「遊離の」トレーサーが直線偏光により励起され
た場合は、その回転はトレーサー／抗体複合体のものよ
りもはるかに速く、それゆえ放射光の脱偏光は増加す
る。

既知濃度の分析対象物を含有する標準調製物を未知濃
度の分析対象物を含有する試料と比較することにより、
蛍光偏光法は、競合結合アッセイにおいて生成したトレ
ーサー／抗体複合体の量を測定するための定量手段を提
供する。この方法は、現在、アボット・ラボラトリーズ
より市販のTDxセラピューティック・ドラッグ・モニタ
リング・システム（TDx Therapeutic Drug Monitoring
System）（米国特許第4,269,511号および同第4,420,568
号各明細書に記載）および同社より市販のIMxおよびADx
自動装置に採用されている。

上記米国特許第4,269,511号および同第4,420,568号各
明細書に開示されているように、蛍光偏光イムノアッセ
イ（FPIA）においてトレーサーは抗体への結合に対して
分析対象物と競合しなければならないので、トレーサー
は分析対象物に特異的な抗体により認識され得るよう
に、分析対象物に充分似た分子構造を有していなければ
ならない。この理由により、トレーサーはまた、その実
質部分が分析対象物と同じ空間的および極性的構成を有
し、抗体上の結合部位に対して分析対象物と競合し得る
１または２以上の抗原決定基を定める蛍光標識した分析
対象物類似体として言及される。

特定のアンフェタミン様化合物の検出または定量のた
めの正確で信頼性のおけるイムノアッセイを行うために
は、抗体の交差反応性、すなわち所望の分析対象物以外
の化合物の認識を最小にする必要がある。米国特許出願
第010,355号（1985年２月３日出願）および同第265,361
号（1988年10月28日出願）各明細書には、フェネチルア
ミンの交差反応性を排除しながら試料中のアンフェタミ
ンおよびメタンフェタミンの定量を行うためのアッセイ
試薬およびFPIA法が開示されている。

しかしながら、現在のところ、広範囲のアンフェタミ
ン様薬物について試料をスクリーニングすることの可能
な蛍光偏光イムノアッセイ法は開示されていない。従っ
て、アンフェタミン様薬物の存在および量の両方を同時
に検出するために正確で高感度のFPIAを行うためのアッ
セイ法および試薬を開発する必要性が存在する。

（課題を解決するための手段） 本発明は、一般式： ［式中、R¹およびR²はそれぞれＨ、OHおよびCH₃よりな
る群から選ばれた基；R⁴はH;R³およびR⁵は、R³がCONH〜
担体物質でR⁵がＨ、OHおよびCH₃よりなる群から選ばれ
た基であるか、またはR³がＨ、OHおよびCH₃よりなる群
から選ばれた基でR⁵がCOHN〜担体物質、CH₂CONH〜担体
物質、CH₂CH₂CONH〜担体物質またはCH₂CH＝CHCONH〜担
体物質である］で示される免疫原化合物； 一般式： ［式中、R¹′、R²′、R³′、R⁴′およびR⁵′はＨ、OHお
よびCH₃よりなる群から選ばれた基であり、ただし
R¹′、R²′、R³′、R⁴′およびR⁵′のうち少なくとも一
つは一般式:MF1（式中、F1は蛍光物質、Ｍは０〜15個の
炭素原子およびヘテロ原子からなり６個末端のヘテロ原
子を含む直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和結合基で
あって、２個以上のヘテロ原子が連続して結合すること
はなく該分枝は炭素原子上でのみ生じ、該ヘテロ原子は
窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ケイ素原子およびリン
原子よりなる群から選ばれた原子であるもの）］で示さ
れるトレーサー化合物； 試料中の１種または２種以上のアンフェタミン様分析対
象物の存在または量を決定する方法であって、 （ａ）該試料を上記トレーサー化合物、および該分析対
象物および該トレーサー化合物を認識し結合することの
できる抗体と接触させて、（ｉ）該抗体への該分析対象
物の結合または（ii）該抗体への該トレーサー化合物の
結合がそれぞれ（ｉ）該抗体への該トレーサー化合物の
結合または（ii）該抗体への該分析対象物の結合を抑制
するようにし、 （ｂ）得られた試験溶液に平面偏光を通して蛍光偏光応
答を得、ついで （ｃ）蛍光偏光応答を検出して試料中のアンフェタミン
様分析対象物の存在または量を決定する ことを特徴とする方法；および 試料中の１種または２種以上のアンフェタミン様分析対
象物の存在または量を決定するためのアッセイキットで
あって、上記トレーサー化合物、および該アンフェタミ
ン様分析対象物および該トレーサー化合物を特異的に認
識することのできる抗体からなることを特徴とするアッ
セイキットを提供するものである。

本発明はまず、蛍光偏光イムノアッセイ法を用いた、
試料中のアンフェタミン様化合物の検出または定量法に
関する。本発明の方法は、 （ａ）１種または２種以上のアンフェタミン様化合物を
含有すると思われる試料を蛍光標識トレーサー、および
該アンフェタミン様化合物および該トレーサーを認識し
結合することのできる抗体と接触させて、（ｉ）該抗体
への該アンフェタミン様化合物の結合または（ii）該抗
体への該トレーサーの結合がそれぞれ（ｉ）該抗体への
該トレーサーの結合または（ii）該抗体への該アンフェ
タミン様化合物の結合を抑制するようにし、 （ｂ）得られた試験溶液に平面偏光を通して蛍光偏光応
答を得、ついで （ｃ）蛍光偏光応答を検出して試料中のアンフェタミン
様分析対象物の存在または量を決定する工程からなる。

本発明はさらに、そのような方法に試薬として用いる
トレーサー化合物、およびそのような方法に試薬として
用いる抗体を産生させるための免疫原化合物にも関す
る。本発明はまた、アンフェタミン様化合物のアッセイ
に使用する試薬のキットにも関する。

本発明の免疫原化合物は、一般に、上記一般式（Ｉ）
で示される化合物である。式（Ｉ）において、R¹および
R²はそれぞれＨ、OHおよびCH₃よりなる群から選ばれた
基；R⁴はH;R³およびR⁵は、R³がCONH〜担体物質でR⁵が
Ｈ、OHおよびCH₃よりなる群から選ばれた基であるか、
またはR³がＨ、OHおよびCH₃よりなる群から選ばれた基
でR⁵がCONH〜担体物質、CH₂CONH〜担体物質、CH₂CH₂CON
H〜担体物質またはCH₂CH＝CHCONH〜担体物質である 本発明のトレーサー化合物は、上記一般式（Ｉ′）で
示される化合物である。式（Ｉ′）において、R¹′、
R²′、R³′、R⁴′およびR⁵′はＨ、OHまたはCH₃であ
り、ただしR¹′、R²′、R³′、R⁴′およびR⁵′の少なく
とも一つは一般式:MF1（式中、F1は蛍光物質、Ｍは結合
基である）で示される基である。

アンフェタミン様薬物の例としては、フェネチルアミ
ンに構造上および薬理学上で関連し、アンフェタミンの
作用に種々の程度を類似する作用を有する物質の誘導体
および異性体が挙げられる。アンフェタミン様薬物は、
その治療用途に基づいて少なくとも５つの主要なクラ
ス、すなわち（Ｉ）交感神経興奮剤（たとえば、アンフ
ェタミンおよびメタンフェタミンなど）、（２）食欲抑
制剤（たとえば、フェンテルミンおよびフェンフルラミ
ンなど）、（３）抗欝剤（たとえば、トラニルシプロミ
ンなど）、（４）欝血除去剤（たとえば、エフェドリン
およびフェニルプロパノラミンなど）および（５）メト
キシ幻覚剤（たとえば、3,4−メチレンジオキシアンフ
ェタミンおよびＮ−エチル−3,4−メチレンジオキシア
ンフェタミンなど）に分類される。

本発明はまた、そのように濫用される可能性のある薬
物の検出、および医師の処方によらないで入手できるダ
イエット製品および感冒軽減製剤（cold relief produc
ts）の過剰投与を決定することのできる試薬および半定
量的アッセイ法をも提供する。本発明の試薬は、アンフ
ェタミン様薬物のアッセイ、すなわち広範囲のアンフェ
タミン様薬物についての試料のスクリーニングが可能と
なるように意図的に交差反応性にしてある。本発明の試
薬はまた、他の薬物のためのトレーサーおよび抗体と組
合わせて用いて、複数の濫用物質のための多分析対象物
アッセイ法を提供することもできる。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

定義 本明細書において「抗原決定基」とは、抗原と抗体と
の間の結合に代表されるような特異的結合反応に関与す
る抗原の領域をいう。本質において、免疫学的特異性に
基づいて抗原、従って抗体を互いに識別することのでき
るものが抗原決定基である。

本明細書において「分析対象物」とは、それに対して
抗体のような結合成分が得られるかまたは生成すること
のできる分子という。本発明の分析対象物は、一般に、
下記一般式： （式中、R¹はＨまたはOH、R²、R³、R⁴およびR⁵はそれぞ
れ独立してＨ、CH₃、C₂H₅またはベンジル基、R⁶およびR
⁷はそれぞれ独立して水素原子、塩素原子、メチル基、
水酸基またはメトキシ基であるかまたは一緒になってメ
チレンジオキシ架橋を生成する）で示されるフェネチル
アミン誘導体である。所定の分析対象物は、抗原すなわ
ち免疫原を生成することのできるハプテンである。「ハ
プテン」とは、一般に低分子量からなるタンパク質不含
の化合物であり、それ自身は抗体の産生を引き起こすこ
とはないが、免疫原性担体と結合したときに免疫応答を
引き起こす。

本明細書において「分析対象物類似体」とは、所定の
分析対象物１または２以上の抗原決定部位と実質的に同
じ空間的および極性的構成を含む分子をいう。このよう
に抗原決定基が重複していることにより、分析対象物特
異的結合成分（抗体など）上の結合部位に対して分析対
象物類似体が試料中の分析対象物と競合することが可能
となる。加えて、分析対象物類似体は、分析対象物と同
一ではないが分析対象物特異的結合成分への結合に必要
な抗原決定基を保持しているように修飾することができ
る。すなわち、分析対象物類似体が適当な抗体決定基を
実質的に重複させていることで充分なのである。それゆ
え、分析対象物類似体は、該分析対象物類似体が分析対
象物の抗体決定基を実質的に重複させていることによっ
て特異的結合成分が該実質的に重複した抗原決定基を認
識し結合することができる限り、分析対象物のものとは
異なる化学基、アミノ酸またはヌクレオチドを含有して
いてもよいし、さらに分析対象物のものよりも少ない化
学基、アミノ酸またはヌクレオチドを含有していてもよ
い。

本明細書において「免疫原」とは、免疫応答を引き起
こすことのできる物質、すなわち、それを投与した宿主
動物において抗体の産生を引き起こすことのできる物質
をいう。本発明における免疫原は、とりわけ、抗原性を
付与する担体に結合した分析対象物または分析対象物類
似体をいう。

本明細書において「担体」とは、抗原性を付与するこ
とのできる物質をいう。担体は、不完全な抗原であって
ハプテンに結合させたときに初めて完全な抗原となるも
のでもよいが、一般にはそれ自身が抗原性である。担体
物質は天然物質または合成物質のいずれであってもよい
が、抗原または部分抗原でなければならず、結合を可能
にする１または２以上の官能基を有していなければなら
ない。たとえば、担体物質は、タンパク質、糖タンパク
質、核タンパク質、ポリペプチド、多糖、リポ多糖また
はポリアミノ酸であってよい。明らかに不完全な抗原の
例は、ポリペプチド、グルカゴンである。そのような天
然タンパク質担体の具体例としては、ウシ血清アルブミ
ン（BSA）、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白
アルブミン、ウシγ−グロブリン、チロキシン結合グロ
ブリンおよびヒト免疫γ−グロブリンが挙げられる。合
成担体の例としては、ポリアミノ酸、ポリリジンが挙げ
られる。実際いは、単一の担体に複数のハプテン残基が
結合していてよい。立体妨害のため、その最大数は担体
物質上の反応性結合基の数により決定されるであろう。

本明細書において「トレーサー」とは、蛍光物質に結
合した分析対象物または分析対象物類似体をいう。蛍光
物質とは、トレーサー試薬の検出可能な成分である。

本発明の方法に従い、１種または２種以上の所定の分
析対象物を含有すると思われる試料を、トレーサー、お
よび該分析対象物および該トレーサーに特異的な抗体と
混合する。試料中の分析対象物は、抗体上の限られた数
の結合部位に対してトレーサーと競合し、その結果、分
析対象物／抗体複合体およびトレーサー／抗体複合体を
生成する。トレーサーと抗体の濃度を一定のレベルに保
つことにより、生成したトレーサー／抗体複合体に対す
る分析対象物／抗体複合体の比は、試料中の分析対象物
の量に正比例することになる。

上記混合物を偏光で励起され遊離のトレーサーおよび
トレーサー／抗体複合体から放射される蛍光の偏光を測
定することにより、試料中の分析対象物の量を定量的に
決定することができる。抗体と複合体を形成していない
トレーサーは、吸収し蛍光を再放射するのに必要な時間
よりも短い時間自由に回転できる。その結果、再放射さ
れた光は相対的に無秩序に配向しており、抗体と複合体
を形成していないトレーサーの蛍光偏光は低い。特異的
抗体と複合体を形成すると、トレーサーは抗体分子の回
転度を示し、これは比較的小さなトレーサー分子の回転
度よりも遅いため再放射光の偏光が増加する。それゆ
え、抗体部位への結合について分析対象物がトレーサー
と競合するときには、トレーサー／抗体複合体から観察
される蛍光偏光は、トレーサーの蛍光偏光とトレーサー
／抗体複合体の蛍光偏光との間のいずれかの値である。
試料が高濃度の分析対象物を含んでいるときは、観察さ
れる偏光値は遊離トレーサーの偏光値に近くなる、すな
わち低くなる。試料が低濃度の分析対象物を含んでいる
ときは、偏光値は結合トレーサーの偏光値に近くなる、
すなわち高くなる。イムノアッセイの反応混合物を垂直
偏光ついで水平偏光で順番に励起させ、放射光の垂直成
分のみを分析することにより、反応混合物の蛍光偏光を
正確に決定することができる。決定しようとする分析対
象物の濃度と偏光との正確な関係は、既知濃度の検量体
の偏光値を測定することにより確立される。分析対象物
の濃度は、この方法で作成した標準曲線から外挿するこ
とができる。

本発明によるイムノアッセイは均一アッセイであり、
最終の偏光の読み取りを結合トレーサーを遊離のトレー
サーから分離せずに溶液から行うアッセイである。この
ことは、読み取りを行う前に結合トレーサーを遊離のト
レーサーから分離しなければならない不均一イムノアッ
セイに比べて明らかな利点である。

試薬 分析対象物および分析対象物類似体は、アッセイのた
めのトレーサー試薬、並びに抗体を産生させるのに用い
る免疫原のための基本的な鋳型を提供する。分析対象物
または分析対象物類似体は、担体と結合して免疫原を、
検出可能な標識と結合してトレーサーを生成する。

本発明において、抗体を産生させるのに用いる免疫原
およびトレーサー試薬の両方とも、上記分析対象物と類
似の下記一般式により表すことができる。

一般に、R¹およびR²はそれぞれＨ、OHおよびCH₃より
なる群から選ばれた基；R⁴はH;R³およびR⁵は、R³がCONH
〜担体物質でR⁵がＨ、OHおよびCH₃よりなる群から選ば
れた基であるか、またはR³がＨ、OHおよびCH₃よりなる
群から選ばれた基でR⁵がCOHN〜担体物質、CH₂CONH〜担
体物質、CH₂CH₂CONH〜担体物質またはCH₂CH＝CHCONH〜
担体物質である。この場合の構造は、アッセイに用いる
抗体を産生させるための免疫原を表す。R¹、R²、R³、R⁴
およびR⁵はＨ、OHおよびCH₃よりなる群から選ばれた基
であり、そのうち少なくとも一つが蛍光物質であるか蛍
光物質を含むときは、この構造はトレーサーを表す。

本発明のFPIAの目的とするところは、抗体試薬に対し
てトレーサー試薬と試料中に存在するかもしれないアン
フェタミン様薬物との間に競合を起こさせることにあ
る。この目的を達成するために、免疫原およびトレーサ
ーの構造に関して種々の変化を許容することができる。

1.抗体： 本発明に用いる抗体は、下記免疫原の一つに対して宿
主動物中で応答を引き起こすことにより調製する。免疫
原は、分析対象物または分析対象物類似体に結合した担
体からなる。この担体は分析対象物または分析対象物類
似体に抗原性を付与する巨大分子であって、トレーサー
との複数のアンフェタミン様薬物の両方に特異的な抗体
を産生することができる。この免疫原を投与し、当業者
に公知の方法に従って適当な抗体を選択する。本明細書
で詳細に述べた実験ではウサギとヒツジを面記宿主とし
て用いたが、該免疫原に対して抗体を産生することので
きるあらゆるインビボまたはインビトロの宿主を使用す
ることが可能であることが理解されなければならない。
得られた抗体は、試料中のアンフェタミン様薬物および
トレーサーの分析対象物成分または分析対象物類似成分
に結合する。

（ａ）免疫原の構造： 免疫原は、広範囲のフェネチルアミン誘導体から調製
することができる。本発明の新規な免疫原化合物は、上
記の一般的構造を有する。一般的には、ポリアミノ酸か
ら担体をフェネチルアミン誘導体のR³またはR⁵のいずれ
かの結合基により結合される。本発明の好ましい態様に
おいては、免疫原は、下記一般式により表される。

［式中、R¹およびR²はそれぞれＨ、OHおよびCH₃より
なる群から選ばれた基；R⁴はH;R³およびR⁵は、R³がCONH
〜担体物質でR⁵がＨ、OHおよびCH₃よりなる群から選ば
れた基であるか、またはR³がＨ、OHおよびCH₃よりなる
群から選ばれた基でR⁵がCONH〜担体物質、CH₂CONH〜担
体物質、CH₂CH₂CONH〜担体物質またはCH₂CH＝CHCONH〜
担体物質である］。

すなわち、免疫原の例としては、R⁵がCONH〜ポリアミ
ノ酸、CH₂CONH〜ポリアミノ酸、CH₂CHCONH〜ポリアミノ
酸またはCH₂CH＝CHCONH〜ポリアミノ酸を含むもの；ま
たはR³がCONH〜ポリアミノ酸を含むものが挙げられる。
最も好ましい免疫原は、下記式で示されるＮ−カルボキ
シメチル−d,1−アンフェタミン〜ウシ血清アルブミン
（BSA）である。

この免疫原は、抗体応答を最もよく引き起こすので好
ましい。上記式において、R²とR³、R⁴とR⁵は相互に置き
換えが可能であることが理解されなければならない。こ
の好ましい形態にはポリアミノ酸担体としてBSAを用い
ているが、上記のように種々の担体を用いることができ
ることが理解されなければならない。

（ｂ）免疫原の合成： 本発明の免疫原において、カルボキシル基含有フェネ
チルアミンハプテンとタンパク質担体上のアミノ基との
間に、当業者に知られた種々の方法を用いて化学結合を
生成することができる。フェネチルアミンハプテンのカ
ルボン酸残基をまず脱離基試薬（たとえばＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド、１−ヒドロキシベンズトリアゾー
ル、ｐ−ニトフェノールなど）と反応させることにより
アミド結合が生成される。ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド、ジイソプロピルカルボジイミドなどの活性化試薬
を用いることができる。ついで、このフェネチルアミン
ハプテンの活性体をタンパク質担体を含む緩衝溶液と反
応させる。

フェネチルアミンハンプテンがカルボキシル基ととも
に第一級アミノ基または第二級アミノ基を含んでいる場
合は、ハプテン同士の反応を防ぐために活性化および結
合反応の間にアミン保護基を使用する必要がある。一般
に、ハプテン上のアミンは、対応するＮ−トリフルオロ
アセトラミド、Ｎ−tert−ブチルオキシカルビニルウレ
タン（Ｎ−ｔ−BOCウレタン）、Ｎ、カルボベンジルオ
キシウレタンまたは同様の構造を生成することによって
保護する。上記のようにしてタンパク質担体への結合反
応が完了したら、免疫原の構造を他の仕方で変えること
のない試薬を用いてアミン保護基を除くことができる。
そのような試薬および方法は当業者には一般に知られて
おり、その例としては、たとえば弱（または強）酸水溶
液または酸無水物、弱（または強）塩基水溶液または塩
基無水物、水素化ホウ素ナトリウムは水素化シアノホウ
素ナトリウムなどの水素化物含有試薬、および接触水素
化が挙げれる。ハプテンと担体を結合する種々の方法は
また、米国特許第3,996,344号および同第4,016,146号各
明細書に開示されている（該公報は参照のため本明細書
中に引用する）。

2.トレーサー： （ａ）トレーサーの構造： 本発明の免疫原と同様に、本発明のトレーサーもまた
多くの変化形が可能である。トレーサーは広範囲のフェ
ネチルアミン誘導体から構造することができる。本発明
の新規なトレーサーは上記と同じ基本構造を有するが、
蛍光物質がR¹〜R⁵のいずれか一つで直接または結合基を
介してフェネチルアミン誘導体に結合している。本発明
の好ましい態様において、一般にトレーサーは下記一般
式で示される構造を有する。

［式中、R¹′、R²′、R³′、R⁴′およびR⁵′はＨ、OHま
たはCH₃よりなる群から選ばれた基であり、ただし
R¹′、R²′、R³′、R⁴′およびR⁵′のうち少なくとも一
つは一般式:MF1（式中、Ｍは上記と同じ、F1は蛍光物質
である］ トレーサーの例としては、R⁵′が、 CO−F1、 CH₂−F1、 CONH−F1、 CONHCH₂−F1 （CH₂）nCHNH₂−F1（式中、ｎは１または２）、 CH（CH₃）CONHCH₂−F1、 CH₂CON（CH₂CH₃）CH₂−F1、 CH₂CON（CH₂CH₂CH₂CH₃）CH₂−F1、 （CH₂）nNHCO−F1（式中、ｎは１、２または３）、 CH₂CONHCH₂CH₂NHCO−F1 を含むが、R³′が CONHCH₂−F1、 CONHCH₂CH₂NHCO−F1 を含むか、R²′が （CH₂）nCONHCH₂−F1（式中、ｎは１または２） （CH₂）nNHCO−F1（式中、ｎは１、２または３） を含むか、またはR¹′が OCH₂CONHCH₂−F1 を含む構造が含まれる。

最も好ましいトレーサーは、下記式で示されるＮ−ア
セタミドメチルフルオレセン−d,1−アンフェタミン〜F
1である。

上記式においても、R²′とR³′、R⁴′とR⁵′は相互に
置き換えが可能であることが理解されなければならな
い。

分析対象物または分析対象物類似体を標識してトレー
サーを生成するための蛍光物質の選択は、有利なことに
柔軟性に富んでおり、主として実施者の好みによる。蛍
光標識はその大きさに従って理想的に選択されること、
すなわち、分子が大きいほど一層急速に回転することが
でき、FPIAトレーサー成分として一層有効であることが
容易に理解されるであろう。本発明においては、好まし
い蛍光標識はフルオレセインおよびフルオレセイン誘導
体である。これらの化合物は適当な波長の偏光で励起さ
せたときに蛍光応答を得ることができ、そのため蛍光偏
光測定が可能となる。たとえば、下記フルオレセイン化
合物または誘導体のいずれをも用いることができる。

フルオレセインアミン； カルボキシフルオレセイン； α−ヨードアセトアミドフルオレセイン； アミノメチルフルオレセイン； 2,4−ジクロロ−1,3,5−トリアジン−２−イルアミノフ
ルオレセイン； ４−クロロ−６−メトキシ−1,3,5−トリアジン−２−
イルアミノフルオレセイン；および フルオレセインイソシアネート。

特に好ましい蛍光物質は、アミノメチルフルオレセイ
ン、Ｎ−アルキルアミノメチルフルオレセンおよびカル
ボキシフルオレセインである。

フルオレセインは、環境の酸濃度（pH）に依存して２
つの交変体で存在する。開環（酸）形では、フルオレセ
イン分子（またはフロオレセイン残基を含む化合物）
は、約４ナノ秒の励起状態寿命の後に青色の光を吸収し
緑色の蛍光を放出することができる。開環形と閉環形が
共存する場合には、pHレベルを調節することにより開環
形と閉環形の分子の相対濃度を容易に変えることができ
る。一般に本発明のトレーサーはナトリウム塩、カリウ
ム塩、アンモニウム塩などの生物学的に許容し得る塩と
して溶液中で調製されるので、本発明のトレーサーは開
環形の螢光形で存在することができる。存在する特定の
塩は、pHレベルの調節に用いたバッファーに依存するで
あろう。たとえば、リン酸ナトリウムバッファーの存在
下では、本発明のトレーサーは一般に開環形のナトリウ
ム塩として存在するであろう。

本明細書にいう「フルオレセイン」なる語は、個々の
化合物としてかまたは一層大きな複合体の成分としてか
にかかわらず、蛍光との関連以外では特定の分子として
存在するならば開環形と閉環形の両方を含む。蛍光を生
じるためには開環形であることが必要である。

本発明に従って調製した特定のトレーサーからは、以
下の実施例でも示すように驚くほど良好なアッセイが得
られることがわかった。本発明に従ってアッセイするこ
とのできる分析対象物の濃度は、一般に約10^-2〜約10
^-13Ｍの範囲、より普通には約10^-4〜約10^-10Ｍの範囲で
ある。濃度の高い分析対象物は、もとの試料を希釈した
アッセイすることができる。試料中の分析対象物の濃度
範囲が試薬（すなわちトレーサーおよび抗体）の濃度範
囲を決定するので、個々の試薬の濃度はアッセイの感度
が最適となるように経験的に決定されるであろう。当業
者であればトレーサーおよび抗体の適当な濃度範囲を知
ることができる。

（ａ）トレーサーの合成： 本発明のトレーサーは、アミノまたはカルボキシル結
合基のいずれかを有するフェネチルアミンハプテンに蛍
光物質を結合させることにより調製する。末端カルボキ
シル基を有するフェネチルアミンハプテンは、まず該ハ
プテンのカルボン酸残基を活性化することによりアミノ
末端フルオレセイン誘導体に結合させることができる。
活性化は、1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミドなど
の活性化試薬を用い、ハプテンをＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド、１−ヒドロキシベンズトリアゾール、ｐ−ニ
トロフェノールなどの脱離基試薬と反応させることによ
り行うことができる。ついで、活性化ハプテンをフルオ
レセイン誘導体の塩基性ジメチルホルムアミド溶液と反
応させる。N,N′−ジスクシンイミジルカーボネートや
２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３′−ス
ルホネートなどの他の活性化基を用いることもできる。

末端アミンを有するフェネチルアミンハプテンは、ア
セトニトリルかまたはジメチルホルムアミド中でN,N′
−ジクスシンイミジルカーボネートと反応させることに
より、高度に反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイミドウ
レタンに変換することができる。ついで、ハプテンウレ
タンをジメチルホルムアミドの塩基溶液中でフルオレセ
イン残基を混合することにより、アミノ末端フルオレセ
イン誘導体への尿素結合を行う。アミノ基含有ハプテン
はまた、ジメチルホムアミドのような溶媒を用いてＮ−
ヒドロキシスクシンイミドで活性化した５−カルボキシ
フルオレセインかまたは６−カルボキシフルオレセイン
に結合することができる。

結合にあずかるカルボン酸またはアミンに加えてハプ
テンが第一級アミノ基または第二級アミノ基を含んでい
る場合は、ハプテン同士の反応を防ぐために活性化およ
び結合反応の間にアミノ保護基を使用する必要がある。
このことは、当業者に知られた種々の方法を用いて行う
ことができる。たとえば、ハプテン上のアミンは、対応
するＮ−トリフルオロアセトアミド、Ｎ−tert−ブチル
オキシカルボニルウレタン、Ｎ−カルボベンジルオキシ
ウレタンまたは同様の構造を生成することによって保護
することができる。上記のようにしてフルオレセイン誘
導体への結合反応が完了したら、トレーサーの構造を他
の仕方で変えることのない試薬を用いてアミン保護基を
除くことができる。そのような試薬および方法として
は、弱（または強）酸水溶液または酸無水物、弱（また
は強）塩基水溶液または塩基無水物、水素化ホウ素ナト
リウムや水素シアノホウ素ナトリウムなどの水素化物含
有試薬、および接触水素化が挙げられる。

3.アッセイ： 本発明の新規なトレーサーおよび抗体は、アンフェタ
ミン様薬物の蛍光偏光アッセイにおいて優れた結果をも
たらす。本発明のアッセイは、迅速な半定量的蛍光偏光
スクリーニングアッセイを提供するものであり、試料中
の１種または２種以上のアンフェタミン様薬物またはそ
の代謝産物の存在を示すことができる。

本発明のアッセイは、下記の一般手順に従って行う。

（１）容量を測定した、１種または２種以上のアンフェ
タミン様薬物を含有しているかまたは含有していると思
われる標準試料または試験用試料を試験管に入れる。

（２）既知の濃度のトレーサーを試験管に加える。

（３）上記免疫原を用いて産生させた既知の濃度の分析
対象物特異的抗体を試験管に加える。

（４）反応混合物を室温でインキュベート、限られた数
の抗体決定基に対してトレーサーと分析対象物との間で
競合を起こさせ、トレーサー／抗体複合体および分析対
象物／抗体複合体を生成させる。ついで （５）蛍光偏光法によりトレーサー／抗体複合体の量を
測定して試料中に分析対象物の存在または量を決定す
る。

本発明の原理は手作業で行うアッセイにも適用できる
が、自動性能を有するTDxシステムを用いれば、アッセ
イを行いデータを解釈するための技法上の時間が最小と
なる。その結果は、「ミリ偏光単位（millipolarizatio
n units）」、「スパン（span）」（ミリ偏光単位に
て）および「相対強度」により定量化することができ
る。ミリ偏光単位を測定すると、試料中のアンフェタミ
ン様物質が存在せず最大量のトレーサーが抗体に結合し
たときの最大の偏光が示される。正味のミリ偏光単位が
大きくなるほど、トレーサーの抗体への結合が大きくな
る。本発明の目的のためには、約200〜約280の正味のミ
リ偏光値が好ましい。約225〜約250の範囲の値がより好
ましい。約240の値が最も好ましい。

スパンは、抗体に結合したトレーサーの量が最大のと
きと最小のときの正味のミリ偏光の差異を示す。スパン
が大きいほどデータの数値分析はよくなる。本発明の目
的のためには、約80〜約150の範囲のスパンが好まし
い。約85〜約100の範囲の値がより好ましい。

強度は、バックグラウンドの螢光を越えるトレーサー
の螢光シグナルの強さまたは大きさの測定単位である。
それゆえ、強度が高いほど一層正確な測定が得られる。
強度は、垂直偏光強度と水平偏光強度を２倍したものと
の合計として決定される。強度は、トレーサーおよび他
のアッセイ変量の濃度に依存して、バックグラウンドノ
イズの約３倍から約60倍のシグナルの範囲である。本発
明の目的のためには、バックグラウンドノイズの約13倍
から約50倍の強度が好ましい。

本発明の方法を行うときのpHは、トレーサーのフルオ
レセイン残基が開環形で存在することのできるのに充分
なものでなければならない。pH範囲は、約３〜約12、よ
り普通には約５〜約10、最も好ましくは約６〜約８であ
る。このpHをアッセイ手順中に達成し維持するために種
々のバッファーを用いることができる。代表的なバッフ
ァーとしては、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、
炭酸バッファー、トリス、バルビタールなどを挙げられ
る。特定のバッファーを使用することは本発明にとって
重要ではないが、トリスおよびリン酸バッファーが好ま
しい。バッファーのカチオン部分が一般に溶液中のトレ
ーサーのカチオン部分を決定するであろう。

加えて、所定の分析対象物への試薬の結合や螢光シグ
ナルの検出を妨害する物質を除くために、１種または２
種以上のアッセイ試薬中にある種の物質を用いることが
できる。たとえば、試料中のリボフラビンの存在による
螢光妨害を防ぐために、リボフラビン結合タンパク質
（RBP）をアッセイ中に用いることができる。リボフラ
ビン、すなわちビタミンB₂は、多くの食品および市販の
ビタミン補強剤の共通成分である。リボフラビンは尿中
に***され、フルオレセインと同様の螢光スペクトルを
示す。リボフラビンの通常の摂取では尿中に痕跡量以上
のリボフラビンを生じることはないが、所定の分析対象
物の検出を妨害しようとする意図を有する被験者により
過剰量のリボフラビンが摂取された場合の尿試料を用い
た試験結果は歪められたものとなる。

つぎに、実施例に基づき本発明をさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。なお、
実施例１〜７は免疫原の合成を、実施例８〜18はトレー
サーの合成を、実施例19〜20はアンフェタミン様物質の
螢光偏光イムノアッセイをそれぞれ説明する。

実施例１ Ｎ−カルボキシメチル−d,1−アンフェタミン〜BSA免疫
原の合成： d,1−アンフェタミン硫酸塩（500mg、1.36ミリモル）
を蒸留水（20ml）中に溶解し、1NNaOHを加えてpHを13に
調節した。この塩基性溶液をクロロホルム（20ml）で４
回抽出した。抽出物を集めて無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、有機溶媒を蒸発させて透明な油状物を得た。残渣を
クロロホルム（20ml）中に再溶解しブロモ酢酸エチル
（331μｌ、2.99ミリモル）を加えた後、この溶液を24
時間加熱還流した。トリエチルアミン（378μｌ、2.72
ミリモル）を加え、この溶液をさらに２時間還流した。
この溶液を酢酸エチル（30ml）で希釈し、水（100ml）
で３回洗浄し、ついで誘起抽出物を集めて無水硫酸ナト
リウムで乾燥することによって反応生成物を単離した。
真空下で溶媒を蒸発させてＮ−カルボエトキシメチル−
d,1−アンフェタミン（509mg）を無色の油状物として得
た。

Ｎ−カルボエトキシメチル−d,1−アンフェタミン（3
13mg、1.41ミリモル）を無水テトラヒドロフラン（2.0m
l）中に溶解した。ついで、ジ−tert−ブチルジカーボ
ネート（328μｌ、2.12ミリモル）および４−N,N−ジメ
チルアミノピリジン（2.0mg）を加えて反応混合物を生
成させた。この反応混合物をトリエチルアミン（217μ
ｌ、1.56ミリモル）のジメチルホルムアミド（2.0ml）
中の溶液で処理し、室温で６時間攪拌した。この溶液を
酢酸エチル（20ml）で希釈し、水（100ml）で５回洗浄
し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて反応生成
物を単離した。真空下で溶媒を蒸発させてＮ−tert−ブ
トキシカルボニル−Ｎ−カルボエトキシメチル−d,1−
アンフェタミン（400mg）を無色の油状物として得た。

Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｎ−カルボエトキシ
メチル−d,1−アンフェタミン（381mg、1.18モリモル）
を、メタノール（6.0ml）と10％水酸化ナトリウム水溶
液（4.0ml）の溶液中に溶解した。室温で３時間攪拌し
た後、この塩基性溶液をクロロホルム（20ml）で３回洗
浄した。1N HClを用いて水相をpH3に調節し、クロロホ
ルム（15ml）で３回抽出し、ついで無水硫酸ナトリウム
で乾燥させた。真空下で溶媒を除いてＮ−tert−ブトキ
シカルボニル−Ｎ−カルボキシメチル−d,1−アンフェ
タミン（170mg）を無色の抽状物として得た。

Ｎ−tert−ブトキシカルビニル−Ｎ−カルボキシメチ
ル−d,1−アンフェタミン（24mg、0.083ミリモル）を無
水ジメチルホルムアミド（400μｌ）中に溶解し、つい
でＮ−ヒドロキシスクシンイミド（10mg、0.092ミリモ
ル）とジシクロヘキシルカルボジイミド（19mg、0.092
ミリモル）の混合物で処理した。室温で６時間攪拌した
後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（10mg、0.092ミリ
モル）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（19mg、
0.092ミリモル）をさらに加え、この懸濁液をさらに３
時間攪拌した。この攪拌が終わった時点で懸濁液を濾過
し、メタノール（400μｌ）含有0.1Nリン酸バッファー
（3.6ml、pH8.0）中のBSA（141mg）の攪拌溶液に滴下し
た。室温で18時間攪拌した後、得られた懸濁液を濾過
し、蒸留水に対して充分に透析した。このタンパク質溶
液を凍結乾燥して白色粉末（131mg）を得た。ついで、
この乾燥免疫原をクロロホルム（10ml）中に懸濁し、無
水トリフルオロ酢酸（10ml）を加えることにより、ハプ
テン残基からtert−ブトキシカルボニル基を除いた。得
られた透明な溶液を室温で５分間攪拌し、ついで真空蒸
発して透明な油状残渣を得た。pHを１に上げるのに充分
な量の1N NaOHを加え、この溶液を蒸留水に対して充分
に透析した。このタンパク質溶液を凍結乾燥してＮ−カ
ルボキシメチル−d,1−アンフェタミン免疫原（202mg）
を白色の綿毛状の固体として得た。

実施例２ Ｎ−カルボニル−フェンテルミン〜BSA免疫原の合成： 無水アセトニトリル（5.0ml）中に溶解したフェンテ
ルミン塩酸塩（100mg、0.54ミリモル）を、同溶媒（10m
l）中に溶解したジスクシンイミジルカーボネート（276
mg、1.08ミリモル）の攪拌溶液に15分間かけて滴下し
た。室温で３時間攪拌した後、真空下で溶媒を除去し、
残記をクロロホルム中に集めた。この残渣を、水（20m
l）、1H HCl（20ml）、水（20ml）、飽和重炭酸ナトリ
ウム溶液（20ml）および食塩水（20ml）で２回洗浄し
た。有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶
媒を蒸発させてフェンテルミン−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドウレタン（110mg）を得た。

ジメチルホルムアミドとテトラヒドロフランとの1:1
溶液（400μｌ）中に溶解したフェンテルミン−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドウレタン（20mg、0.07ミリモ
ル）を、リン酸バッファー（10ml、pH8.2）中に溶解し
たウシ血清アルブミン（119mg）に加えた。室温で一夜
攪拌した後、この溶液をリン酸バッファー、ついで蒸留
水に対して充分に透析した。このタンパク質溶液を凍結
乾燥して、表記免疫原（110mg）を白色綿毛状の固体と
して得た。

実施例３ α−メチル−d,1−フェニルアラニン〜BSA免疫原の合
成： α−メチル−d,1−フェニルアラニン（100mg、0.56ミ
リモル）のピリジン中の攪拌懸濁液に、無水トリフルオ
ロ酢酸（1.0ml、7.08ミリモル）を０℃にて滴下した。
固体は徐々に溶解し、溶液を淡黄色になった。さらに20
分間攪拌した後、冷却浴を除き、攪拌をさらに１時間続
けた。ついで、この溶液を氷上に注ぎ、2N HCl（10ml）
で酸性にし、酢酸エチル（15ml）で抽出した。有機相を
集めて食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。真
空蒸発させてＮ−トリフルオロアセチル−α−メチル−
d,1−フェニルアラニン（150mg）を得た。

ジシクロヘキシルカルボジイミド（19mg、0.092ミリ
モル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（11mg、0.092
ミリモル）およびＮ−トリフルオロアセチル−α−メチ
ル−フェニルアラニン（23mg、0.083ミリモル）を無水
ジメチルホルムアミド（500μｌ）中に溶解した。この
反応混合物を室温で３時間攪拌した。この不透明な懸濁
液を濾過し、ついで0.1Nリン酸バッファー（3.6ml、pH
8）中に溶解したBSA（141mg）の攪拌溶液に滴下した。
室温で18時間攪拌した後、この懸濁液を蒸留水に対して
充分に透析し、凍結乾燥して白色の綿毛状の粉末（135m
g）を得た。このタンパク質をメタノール（9.0ml）、ピ
ペリジン（3.0ml）および飽和重炭酸ナトリウム水溶液
（1.0ml）の溶液中に溶解することにより、Ｎ−トリフ
ルオロアセチル保護基を除いた。水で容量を30mlに調節
た。室温で６時間放置した後、この溶液を蒸留水に対し
て充分に透析し、凍結乾燥して表記免疫原（104mg）を
白色の綿毛状粉末として得た。

実施例４ Ｎ−カルボキシメチル−フェニルプロパノールアミン〜
BSA免疫原の合成： フェニルプロパノールアミン（6.78g、44.9ミリモ
ル）ヲロロホルム（40ml）中に溶解し、還流した。ブロ
モ酢酸エチル（5.97g、53.8ミリモル）を滴下し、得ら
れた懸濁液をさらに30分間還流した。トリエチルアミン
（6.87ml、49.3ミリモル）を加えて生成物の塩を溶解し
た。全部で７時間加熱した後、溶媒を真空下で除いて油
状結晶残渣を得た。この残渣を酢酸エチル（50ml）とHC
l溶液（20ml、pH1）との間に分配した。水相を取り、1N
NaOHでpH7に調節し、クロロホルム（20ml）で３回抽出
した。有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒
を除いてＮ−カルボエトキシメチル−フェニルプロパノ
ールアミン（7.19g）を無色の油状物として得た。

Ｎ−カルボエトキシメチル−フェニルプロパノールア
ミン（2.57g、10.8ミリモル）およびジ−tert−ブチル
ジカーボネート（2.01g、13.0ミリモル）を無水テトラ
ヒドロフラン（20ml）中に溶解した。ついで、トリエチ
ルアミン（2.73ml、19.6ミリモル）および４−N,N−ジ
メチルアミノピリジン（20mg）を加えた。室温で３時間
攪拌した後、さらに500μｌのジ−tert−ブチルジカー
ボネート（3.2ミリモル）を加え、攪拌をさらに１時間
続けた。この溶液を真空濃縮し、酢酸エチル（30ml）中
に溶解し、水（20ml）で４回洗浄し、硫酸ナトリウムで
乾燥した。溶媒を除去して粗製の生成物（4.1g）を得
た。この生成物をシリカゲルカラム上のクロマトグラフ
ィーにかけて、Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｎ−カ
ルボエトキシメチル−フェニルプロパノールアミンのジ
アステレオマー混合物（3.3g）を得た。

Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｎ−カルボエトキシ
メチル−フェニルプロパノールアミン（1.78g、5.30ミ
リモル）を、テトラヒドロフラン（20ml）、メタノール
（20ml）および10％水酸化ナトリウム水溶液（20ml）か
らなる溶液中に溶解した。攪拌を３時間続け、ついでこ
の淡黄色の溶液を水（50ml）で希釈し、クロロホルム
（30ml）で３回抽出した。この水溶液を2N HClでpH4に
調節し、ついでクロロホルム（20ml）で抽出した。有機
抽出物を集めて硫酸ナトリウムで乾燥し、真空蒸発して
Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｎ−カルボキシメチル
−フェニルプロパノールアミン（0.96g）を白色の泡と
して得た。

Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｎ−カルボキシメチ
ル−フェニルプロパノールアミン（73mg、0.24ミリモ
ル）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（97mg、0.47ミ
リモル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（54mg、
0.47ミリモル）を、室温にて無水ジメチルホルムアミド
（1.5ml）中に溶解し、室温にて３時間攪拌した。得ら
れた懸濁液を濾過し、0.1Mリン酸バッファー（7.2ml、p
H8）中に溶解したBSA（401mg）の攪拌溶液に滴下した。
一夜攪拌した後、この溶液を水（10ml）で希釈し、蒸留
水に対して充分に透析した。凍結乾燥して白色の綿毛状
の粉末（395mg）を得た。このタンパク質を塩化メチレ
ンとトリフルオロ酢酸との1:1溶液（50ml）中に溶解す
ることにより、ｔ−BOC保護基を除いた。この透明な溶
液を室温で５分間攪拌した後、溶媒を真空除去し、得ら
れた油状残渣を重炭酸ナトリウムの４％水溶液（30ml）
中に溶解した。この塩基性溶液を蒸留水に対して充分に
透析し、凍結乾燥してＮ−カルボキシメチル−フェニル
プロパノールアミン免疫原（357mg）を得た。

実施例５ Ｎ−メチル−d,1−フェニルアラニン〜BSA免疫原の合
成： Ｎ−BOC−Ｎ−メチル−d,1−フェニルアラニン（49m
g、0.176ミリモル）をジメチルホルムアミド（0.50ml）
中に溶解した。この溶液にN,N′−ジスクシンイミジル
カーボネート（54mg、0.211ミリモル）を加え、この反
応混合物を窒素雰囲気下で２時間攪拌した。ついで、こ
の反応混合物を、リン酸バッファー（6.3ml、0.1M、pH
7.5）と1,4−ジオキサン（2.3ml）中に溶解したBSA（30
0mg、0.0044ミリモル）の溶液に滴下した。６時間攪拌
した後、この反応混合物を蒸留水に対して透析し、つい
で凍結乾燥した。生成物の収量は、Ｎ−BOC−Ｎ−メチ
ル−d,1−フェニルアラニン〜BSA（258mg）であった。

Ｎ−BOC−Ｎ−メチル−d,1−フェニルアラニン〜BSA
（230mg）を塩化メチレン（15ml）中に部分的に溶解し
た。トリフルオロ酢酸（15ml）を加え、この反応混合物
を５分間攪拌した。溶媒を真空除去し、得られた残渣を
リン酸バッファー（40ml、0.1M、pH7.5）中に再溶解
し、反応混合物を蒸留水に対して充分に透析した。凍結
乾燥後の生成物の収量は、表記免疫原（182mg）であっ
た。

実施例６ d,1−フェニルアラニン〜BSAの合成： Ｎ−BOC−１−フェニルアラニン（23.5mg、0.0886ミ
リモル）とＮ−BOC−ｄ−フェニルアラニン（23.5mg、
0.0886ミリモル）とをジメチルホルムアミド（0.50ml）
中で混合し、実施例５（Ｎ−メチル−d,1−フェニルア
ラニン〜BSA）に記載した手順に実質的に従ってBSA（30
0mg、0.0044ミリモル）に結合させた。生成物の収量
は、Ｎ−BOC−ｄ−フェニルアラニン〜BSA（198mg）で
あった。

実施例５（Ｎ−メチル−d,1−フェニルアラニン〜BS
A）に記載した手順に実質的に従い、Ｎ−BOC−d,1−フ
ェニルアラニン〜BSA（170mg）をトリフルオロ酢酸／塩
化メチレンと反応させた。生成物の収量は、免疫原（13
5mg）であった。

実施例７ １−カルボキシメトキシ−フェンテルミン〜BSA免疫原
の合成： ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（2g、2
2.4ミリモル）をジメチルホルムアミド（20ml）中に溶
解した。トリエチルアミン（5.6ml、40.3ミリモル）お
よびジ−tert−ブチルジカーボネート（5.38g、24.7ミ
リモル）を加え、この反応混合物を窒素雰囲気下で16時
間攪拌した。溶媒を真空除去し、得られた粗製の生成物
をシリカゲルカラム上で酢酸エチルで溶出して精製し
た。生成物の収量は、3.98gであった。

得られたＮ−BOC−２−アミノ−２−メチル−１−プ
ロパノール（3.69g、19.5ミリモル）を塩化メチレン（7
4ml）中に溶解し、塩化メチレン（89ml）中のデス−マ
ーチンパーヨーディナン（Dess−Martin periodinane）
［10.75g、25.35ミリモル；アルドリッチ・ケミカル・
カンパニー（Aldrich Chemical Company）、ミルウォー
キー、WI］の攪拌懸濁液に加えた。窒素雰囲気下で20分
間攪拌した後、この反応混合物をジエチルエーテル（37
0ml）で希釈し、水酸化ナトリウム（148ml、1.3M）中に
注ぎ、10分間攪拌した。水酸化ナトリウム水溶液層を分
離し、廃棄した。残った有機溶液を水酸化ナトリウム
（148ml、1.3M）および水（185ml）で順番に洗浄した。
硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を真空除去してＮ−
BOC−２−アミノ−２−メチル−１−プロパナール（3.2
1g）を得た。

Ｎ−BOC−２−アミノ−２−メチル−１−プロパナー
ル（1g、5.34ミリモル）を新たに蒸留したテトラヒドロ
フラン（10ml）中に溶解し、−78℃に冷却した。フェニ
ルリチウム（6.5ml、11.75ミリモル）を加え、この溶液
を−78℃で10分間攪拌した。ついで、酢酸でpHを４に調
節した。この反応混合物を氷水（200ml）中に注ぎ、ジ
エチルエーテル（200ml）ですばやく抽出した。有機抽
出物を水（２×200ml）で洗浄し、硫酸マグネシウムで
乾燥した。ついで溶媒を真空で除去した。粗製の生成物
をシリカゲルカラム上で酢酸エチル／ヘキサン（20/8
0）で溶出して精製した。生成物の収量は、Ｎ−BOC−１
−ヒドロキシ−フェンテルミン（956mg）であった。

水素化ナトリウム（288mg、60％、7.20ミリモル）を
ヘキサンで洗浄し、ジメチルホルムアミド（4.5ml）中
に攪拌懸濁し、０℃に冷却した。Ｎ−BOC−１−ヒドロ
キシ−フェンテルミン（919mlg、3.46ミリモル）をジメ
チルホルムアミド（2.0ml）中に溶解し、上記水素化ナ
トリウム懸濁液に加え、この反応混合物を窒素雰囲気
下、０℃にて20分間攪拌した。この時点でブロモ酢酸エ
チル（0.479ml、4.32ミリモル）を加え、この反応混合
物を窒素雰囲気下、０℃にて45分間攪拌した。ついで、
この反応溶液を酢酸エチル（50ml）で希釈し、酢酸でpH
5に調節し、濾過した。濾液の溶媒を真空除去し、得ら
れた粗製の生成物をシリカゲルカラム上で酢酸エチル／
ヘキサン（20/80）で溶出して精製した。生成物の収量
は、Ｎ−BOC−１−カルボエトキシメトキシ−フェンテ
ルミン（145mg）であった。

Ｎ−BOC−１−カルボエトキシメトキシ−フェンテル
ミン（145mg、0.413ミリモル）をメタノール（1.5ml）
中に溶解し、０℃に冷却し、水酸化ナトリウム（0.825m
l、1M、0.825ミリモル）を加えた。０℃で40分間攪拌し
た後、0.1M塩酸でpH5に調節し、溶媒を真空除去した。
得られた白色固体を酢酸エチル（10.0ml）でトリチュレ
ートし、濾過した。濾液の溶媒を真空除去してＮ−BOC
−１−カルボキシメトキシ−フェンテルミン（110mlg）
を得た。

Ｎ−BOC−１−カルボキシメトキシ−フェンテルミン
（62.0mg、0.192ミリモル）をジメチルホルムアミド
（0.50ml）中に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（26mg、0.230ミリモル）および1,3−ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（47mg、0.230ミリモル）を加え、こ
の反応混合物を窒素雰囲気下で17時間攪拌した。つい
で、この反応混合物を濾過し、0.1Mリン酸バッファー
（5.4ml、pH7.6）とｐ−ジオキサン（3.6ml）中に溶解
したBSA（326mg、0.0048ミリモル）の溶液に滴下した。
６時間攪拌した後、この反応混合物を蒸留水に対して充
分に透析し、凍結乾燥してＮ−BOC−１−カルボキシメ
トキシ−フェンテルミン〜BSA（166mg）を得た。

実施例５（Ｎ−メチル−d,1−フェニルアラニン〜BS
A）に記載した手順に実質的に従い、Ｎ−BOC−１−カル
ボキシメトキシ−フェンテルミン〜BSA（80mg）をトリ
フルオロ酢酸／塩化メチレンと反応させた。生成物の収
量は、表記免疫原（76mg）であった。

実施例８ Ｎ−アセタミドメチルフロオレセイン−d,1−アンフェ
タミントレーサーの合成： Ｎ−BOC−Ｎ−酢酸−d,1−アンフェタミン（30mg、0.
102ミリモル）をジメチルホルムアミド（0.400ml）中に
溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（14mg、0.12
3ミリモル）、ついで1,3−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（25mg、0.123ミリモル）を加え、この反応溶液を
窒素雰囲気下で16時間攪拌した。ついで、この溶液を、
アミノメチルフルオレセイン塩酸塩（41mg、0.102ミリ
モル、トリエチルアミンでpHを９に調整）を入れたフラ
スコ中に濾過し、この溶液を窒素雰囲気下で１時間攪拌
した。溶媒を真空下で除去し、得られた粗製の生成物
を、２つの1.0mmC18逆相プレパラティブ薄層クロマトグ
ラフィープレート上で水／メタノール／酢酸（30/70/0.
4）で溶出して精製した。精製した生成物の収量は、Ｎ
−BOC−Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−d,1−ア
ンフェタミン（34mg）であった。

Ｎ−BOC−Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−d,1
−アンフェタミン（34mg、0.0534ミリモル）を塩化メチ
レン（0.50ml）中に溶解した。トリフルオロ酢酸（0.50
ml）を加え、５分間攪拌した後、溶媒を真空除去した。
得られた残渣を塩化メチレン（約10ml）中に再溶解し、
トリエチルアミンでpHを９に調節した。溶媒を再に真空
除去し、得られた粗製の生成物を、２つの1.0mmC18逆相
プレパラティブ薄層クロマトグラフィープレート上で水
／メタノール／酢酸（30/70/0.4）で溶出して精製し
た。精製した生成物の収量は、Ｎ−アセタミドメチルフ
ルオレセイン−d,1−アンフェタミントレーサー（26m
g）であった。

実施例９ ５−カルボシキフルオレセインフェンテルミンアミドお
よび６−カルボキシフルオレセインフェンテルミンアミ
ドトレーサーの合成： フェンテルミン塩酸塩（50mg、0.27ミリモル）をジメ
チルホルムアミド（.0ml）中に溶解した。この溶液の室
温で攪拌しながらトリエチルアミン（27mg）を加え、つ
いで５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル（172mg、0.27ミリモル）を加え
た。得られたオレンジ色の溶液を室温、暗所にて18時間
攪拌した。溶液を真空除去し、５−カルボキシフルオレ
セインフェンテルミンアミドトレーサーをプレパラティ
ブ薄層クロマトグラフィーにより単離した。

５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルの代わりに６−カルボキシフルオレ
セイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用い
た他は同様にして、６−カルボキシフルオレセインフェ
ンテルミンアミドトレーサーを得た。

実施例10 アミノメチルフルオレセイン−フェンテルミン尿素トレ
ーサーの合成： 実施例２に記載の手順に実質的に従い、フェンテルミ
ン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドウレタンを調製し
た。フェンテルミン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドウ
レタン（50mg、0.17ミリモル）およびアミノメチルフル
オレセイン塩酸塩（69mg、0.19ミリモル）を無水ジメチ
ルホルムアミド（1.0ml、トリエチルアミン（17mg）を
含有）中に溶解した。室温で２時間攪拌した後、得られ
たトレーサー生成物を、溶離液として水／メタノール
（8/2）を用いた逆相プレパラティブ薄層クロマトグラ
フィーにより単離した。アミノメチルフルオレセイン−
フェンテルミン尿素トレーサーの収量は28gであった。

実施例11 Ｎ−（２−アミノエチル）−d,1−アンフェタミン５−
および６−カルボキシフルオレセインアミドトレーサー
の合成： ２−ブロモ−１−フェニルプロパン（1.11g、5.58ミ
リモル）およびエチレンジアミン（9.55g、159ミリモ
ル）を混合し、18時間還流した。過剰のエチレンジアミ
ンを高真空下で除き、得られた残渣を0.1N NaOH（50m
l）とベンゼン（100ml）との間に分配した。有機相を水
（50ml）で３回洗浄し、ベンゼン層を硫酸マグネシウム
で乾燥し、蒸発させてＮ−（２−アミノエチル）−d,1
−アンフェタミン（0.50g）を無色油状物として得た。

Ｎ−（２−アミノエチル）−d,1−アンフェタミン（2
7mg、0.15ミリモル）および５−カルボキシフルオレセ
インＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと６−カル
ボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルとの1:1混合物（72mg、0.15ミリモル）をジメチ
ルホルムアミド（1.0ml、トルエチルアミン（21μｌ）
を含有）中で混合した。室温で18時間攪拌した後、溶媒
を真空除去し、容離液としてメタノール／水／トリフル
オロ酢酸（40/59/1）を用いた逆相プレパラティブ薄層
クロマトグラフィーにより表記トレーサーを単離した。

実施例12 Ｎ−（３−アミノプロピル）−d,1−アンフェタミン５
−カルボキシフルオレセインアミドトレーサーの合成： ２−ブロモ−１−フェニルプロパン（1.24g、6.23ミ
リモル）およびプロピレンジアミン（15.0ml、180ミリ
モル）を無水エタノール（120ml）中で混合し、18時間
還流した。過剰のプロピレンジアミンを高真空下で除
き、得られた残渣を濾過して不溶の塩を除き、4N NaOH
（10ml）とベンゼン（50ml）との間に分配した。有機相
を水（5ml）で２回洗浄し、ベンゼン層を硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、蒸発させてＮ−（３−アミノプロピル）
−d,1−アンフェタミンを無色油状物として得た。

Ｎ−（３−アシノプロピル）−d,1−アンフェタミン
（35mg、0.12ミリモル）および５−カルボキシフルオレ
セインＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（55mg、
0.12ミリモル）を無水のジメチルホルムアミド（600μ
ｌ）中に溶解した。室温で18間攪拌した後、溶媒を高真
空下で除去し、溶離液としてエタノール／水（80/20）
を用いた逆相プラパラティブ薄層クロマトグラフィーに
より表記トレーサーを単離した。

実施例13 Ｎ−メチル−d,1−フェニルアラニン−エチレンジアミ
ン−５−カルボキシフルオレセインアミドトレーサーの
合成： Ｎ−メチル−１−フェニルアラニン（300mg、1.68ミ
リモル）およびＮ−メチル−ｄ−フェニルアラニン（30
0mg、1.68ミリモル）をジメチルホルムアミド（6.0ml）
中で混合した。トリエチルアミン（0.84ml、6.04ミリモ
ル）およびジ−tert−ブチルカーボネート（0.846ml、
3.69ミリモル）を加え、この反応混合物を窒素雰囲気下
で18時間攪拌した。ついで反応混合物を濾過し、溶媒を
真空除去してＮ−BOC−Ｎ−メチル−d,1−フェニルアラ
ニン（1.1g）を淡黄色の油状物（いくらかのジメチルホ
ルムアミドは依然存在している）として得た。

得られたＮ−BOC−Ｎ−メチル−d,1−フェニルアラニ
ン（50mg、0.179ミリモル）をジメチルホルムアミド
（0.50ml）中に溶解した。N,N′−ジスクシンイミジル
カーボネート（55mg、0.215ミリモル）を加え、この反
応混合物を窒素雰囲気下で２時間攪拌した。ついで、こ
の反応混合物の小アリコート（0.156ml、0.056ミリモ
ル）を、ジメチルホルムアミド（0.50ml）中に溶解した
Ｎ−５−カルボキシフルオレセイン−エチレンジアミン
（24mg、0.056ミリモル）の溶液に加えた。トリエチル
アミンを用いてpHを９に調節し、この反応混合物を窒素
雰囲気下で30分間攪拌した。溶媒を真空除去し、得られ
た生成物を1.0mmシリカゲルプレパラティブ薄層クロマ
トグラフィープレート上で酢酸エチル／メタノール（80
/20）で溶出することにより単離した。生成物の収量
は、Ｎ−BOC−Ｎ−メチル−d,1−フェニルアラニン−エ
チレンジアミン−５−カルボキシフルオレセイン（19m
g）であった。

実施例８（Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−d,
1−アンフェタミントレーサー）に記載した手順に実質
的に従い、上記生成物（19mg、0.028ミリモル）をトリ
フルオロ酢酸／塩化メチレンと反応させた。生成物の収
量は、表記トレーサー（14mg）であった。

実施例14 Ｎ−メチル−d,1−フェニルアラニン−アミノメチルフ
ルオレセイントレーサーの合成： Ｎ−BOC−Ｎ−メチル−d,1−フェニルアラニン（50m
g、0.179ミリモル）をジメチルホルムアミド（0.50ml）
中に溶解した。N,N′−ジスクシンイミジルカーボネー
ト（55mg、0.215ミリモル）を加え、この反応混合物を
窒素雰囲気下で２時間攪拌した。ついで、この反応混合
物の小アリコート（0.300ml、0.108ミリモル）を、ジメ
チルホルムアミド（0.20ml）中に溶解したアミノメチル
フルオレセイン塩酸塩（35mg、0.088ミリモル）の溶液
に加えた。トリエチルアミンを用いてpHを９に調節し、
この反応混合物を窒素雰囲気下で60分間攪拌した。溶媒
を真空除去し、得られた生成物を1.0mmシリカゲルプレ
パラティブ薄層クロマトグラフィープレート上で酢酸エ
チル／メタノール（80/20）で溶出することにより単離
した。生成物の収量は、Ｎ−BOC−Ｎ−メチル−d,1−フ
ェニルアラニン−アミノメチルフルオレセイン（27mg）
であった。

実施例８（Ｎ−アセタミドメチルフロオレセイン−d,
1−アンフェタミントレーサー）に記載した手順に実質
的に従い、Ｎ−BOC−Ｎ−メチル−d,1−フェニルアラニ
ン−アミノメチルフルオレセイン（23mg、0.037ミリモ
ル）をトリフルオロ酢酸／塩化メチレンと反応させた。
生成物の収量は、表記トレーサー（14mg）であった。

実施例15 d,1−フェニルアラニン−アミノメチルフルオレセイン
トレーサーの合成： Ｎ−BOC−１−フェニルアラニン（10mg、0.0375ミリ
モル）およびＮ−BOC−ｄ−フェニルアラニン（10mg、
0.0375ミリモル）をジメチルホルムアミド（0.20ml）中
で混合した。２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウ
ム−３′−スルホネート（19mg、0.075ミリモル）、つ
いでトリエチルアミン（0.010ml、0.075ミリモル）を加
え、この反応混合物を窒素雰囲気下で30分間攪拌した。
ついで、この反応混合物を、ジメチルホルムアミド（0.
20ml）中に溶解したアミノメチルフルオレセイン塩酸塩
（10mg、0.025ミリモル）とトリエチルアミン（0.005m
l、0.036ミリモル）の溶液に加えた。窒素雰囲気下で18
時間攪拌した後、溶媒を真空除去し、得られた生成物を
1.0mmC18逆相プレパラティブ薄層クロマトグラフィープ
レート上で水／メタノール／酢酸（30/70/0.4）で溶出
することにより単離した。生成物の収量は、Ｎ−BOC−
d,1−フェニルアラニン−アミノメチルフルオレセイン
（9.5mg）であった。

実施例８（Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−d,
1−アンフェタミントレーサー）に記載した手順で実質
的に従い、上記生成物（9.5mg、0.0156ミリモル）をト
リフルオロ酢酸／塩化メチレンと反応させた。生成物の
収量は、表記トレーサー（6.0mg）であった。

実施例16 Ｎ−カルボキシエチル−アンフェタミン−アミノメチル
フルオレセイントレーサーの合成： フェニルアセトン（100mg、0.745ミリモル）を無水メ
タノール（2.0ml）中に溶解した。β−アラニン（398m
g、4.47ミリモル）、ついで水素化シアノホウ素ナトリ
ウム（94mg、1.49ミリモル）を加えた。窒素雰囲気下で
18時間攪拌した後、この反応混合物を濾過し、濾液の溶
媒を真空除去した。得られた粗製の生成物を、４つの1.
0mmC18逆相プレパラティブ薄層クロマトグラフィープレ
ート上で水／メタノール／酢酸（40/60/0.4）で溶出す
ることにより精製した。得られた物質を酢酸エチル（20
ml）中に溶解し、1.0M重炭酸ナトリウム（３×20ml）で
抽出した。水性抽出物を集め、1.0M塩酸でpHを４に調節
し、溶媒を真空除去した。ついで、得られた結晶性固体
を酢酸エチル（50ml）で２回トリチュレートし、濾過し
た。濾液を集め、溶媒を真空除去してＮ−カルボキシエ
チル−アンフェタミン（93mg）を得た。

Ｎ−カルボキシエチル−アンフェタミン（93mg、0.44
9ミリモル）をジメチルホルムアミド（1.0ml）中に溶解
した。トリエチルアミン（0.113ml、0.808ミリモル）、
ついでジ−tert−ブチルジカーボネート（108mg、0.493
ミリモル）を加えた。窒素雰囲気下で３時間攪拌した
後、溶媒を真空除去し、得られた粗製の生成物を、２つ
の1.0mmC18逆相プレパラティブ薄層クロマトグラフィー
プレート上で水／メタノール／酢酸（30/70/0.4）で溶
出することにより精製した。生成物の収量は、Ｎ−BOC
−Ｎ−カルボキシエチル−アンフェタミン（3.3mg）で
あった。

Ｎ−BOC−Ｎ−カルボキシエチル−アンフェタミン
（3.3mg、0.107ミリモル）をジメチルホルムアミド（0.
80ml）中に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（15mg、0.129ミリモル）、ついで1,3−ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（27mg、0.129ミリモル）を加えた。
窒素雰囲気下で19時間攪拌した後、この反応混合物を、
アミノメチルフルオレセイン塩酸塩（43mg、0.107ミリ
モル）を入れたフラスコ中に濾過した。トリエチルアミ
ンでpHを９に調節し、この溶液を窒素雰囲気下で24時
間、暗所にて攪拌した。溶媒を真空除去し、得られた粗
製の生成物を、２つの1.0mmC18逆相プレパラティブ薄層
クロマトグラフィープレート上で水／メタノール／酢酸
（30/70/0.4）で溶出することにより精製した。生成物
の収量は、Ｎ−BOC−Ｎ−カルボキシエチル−アンフェ
タミン−アミノメチルフルオレセイン（26mg）であっ
た。

実施例８（Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−d,
1−アンフェタミントレーサー）に記載した手順に実質
的に従い、Ｎ−BOC−Ｎ−カルボキシエチル−アンフェ
タミン−アミノメチルフルオレセイン（20mg、0.031ミ
リモル）をトリフルオロ酢酸／塩化メチレンと反応させ
た。生成物の収量は、表記トレーサー（14mg）であっ
た。

実施例17 Ｎ−カルボキシメチル−アンフェタミン−エチルアミノ
メチルフルオレセイントレーサーの合成： 実施例16（Ｎ−BOC−Ｎ−カルボキシエチル−アンフ
ェタミン−アミノメチルフルオレセイントレーサー）に
記載した手順に実質的に従い、Ｎ−BOC−Ｎ−カルボキ
シエチル−アンフェタミン（21mg、0.0716ミリモル）を
Ｎ−エチル−アミノメチルフルオレセイン（33mg、0.07
16ミリモル）に結合させた。生成物の収量は、Ｎ−BOC
−Ｎ−カルボキシメチル−アンフェタミン−エチルアミ
ノメチルフルオレセイン（31mg）であった。

実施例８（Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−d,
1−アンフェタミントレーサー）に記載した手順に実質
的に従い、Ｎ−BOC−Ｎ−カルボキシメチル−アンフェ
タミン−エチルアミノメチルフルオレセイン（21mg、0.
030ミリモル）をトリフルオロ酢酸／塩化メチレンと反
応させた。生成物の収量は、表記トレーサー（15mg）で
あった。

実施例18 Ｎ−カルボキシメチル−アンフェタミン−ブチルアミノ
メチルフルオレセイントレーサーの合成： 実施例15（Ｎ−BOC−d,1−フェニルアラニン−アミノ
メチルフルオレセイントレーサー）に記載した手順に実
質的に従い、Ｎ−BOC−Ｎ−カルボキシメチル−アンフ
ェタミン（16mg、0.0545ミリモル）をＮ−ブチル−アミ
ノメチルフルオレセイン（27mg、0.0545ミリモル）に結
合させた。生成物の収量は、Ｎ−BOC−Ｎ−カルボキシ
メチル−アンフェタミン−ブチルアミノメチルフルオレ
セイン（28mg）であった。

実施例８（Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−d,
1−アンフェタミントレーサー）に記載した手順に実質
的に従い、Ｎ−BOC−Ｎ−カルボキシメチル−アンフェ
タミン−ブチルアミノメチルフルオレセイン（20mg、0.
029ミリモル）をトリフルオロ酢酸／塩化メチレンと反
応させた。生成物の収量は、表記トレーサー（12mg）で
あった。

アンフェタミン様物質蛍光偏光イムノアッセイ 上記のように、本発明のFPIA試薬は、トレーサー、お
よびアンフェタミン様分析対象物に特異的な抗体からな
る。加えて、従来用いられているアッセイ溶液、たとえ
ば希釈バッファー、d,1−アンフェタミンカリブレータ
ーおよびd,1−アンフェタミンコントロールを調製す
る。これら試薬の代表的な溶液は、アボット・ラボラト
リーズ（アボットパーク、イリノイ）からアッセイ「キ
ット」として市販されている。

TDx,IMxまたはADxシステム（アボット・ラボラトリー
ズ、アボットパーク、イリノイより市販）で行うべく、
好ましいアッセイ手順を設計した。そのような装置を用
いると、前処理から最終の読み取りにいたるまで完全に
自動化される。しかしながら、主動のアッセイを行うこ
ともできる。いずれの場合も、バックグラウンドの読み
取りを行う前に試料を希釈バッファー中の前処理溶液と
混合することができる。ついで、トレーサーを試料溶液
に加え、ついで抗体を加える。インキュベーションした
後、蛍光偏光を読み取る。

自動化アッセイにおいては、各カリブレーター、コン
トロールまたは試料の蛍光偏光値を測定し、装置の出力
テープ上にプリントされる。装置はまた、非線型回帰分
析により、各カリブレーターの濃度に対しその偏光をプ
ロットすることにより標準曲線を作成する。検量曲線か
ら各コントロールまたは試料の濃度が読み取られ、出力
テープ上にプリントされる。

実施例19 リボフラビン蛍光妨害の除去 リボフラビンによる蛍光妨害はアッセイの結果を不正
確にする。それゆえ、試料にリボフラビン結合タンパク
質を加えることにより、リボフラビンによる妨害の可能
性を除くことが有利である。試料をリボフラビン結合タ
ンパク質で前処理することによる利点は、下記第１表に
まとめてある。第１表において、２番目と３番目のカラ
ムは、それぞれ、トレーサーを未処理の尿試料および前
処理して（5mg/mlのリボフラビン結合タンパク質）リボ
フラビンを含まない尿試料に加える前に得られた蛍光強
度の測定値を示すものでり、４番目と５番目のカラム
は、それぞれ、トレーサーを未処理の尿試料および前処
理してリボフラビンを含まない尿試料に加えた後の偏光
の測定値を示すものである。前処理溶液は、0.1Mトリス
バッファー（pH7.5）、0.01％ウシγ−グロブリン、0.1
％アジ化ナトリウムおよび5mg/mlのリボフラビシ結合タ
ンパク質からなっていた。

第１表の２番目と３番目のカラムを比較すれば、リボ
フラビン結合タンパク質で試料を前処理することにより
試料のバックグランド強度が減少することがわかる。第
１表の４番目と５番目のカラムを比較すれば、アッセイ
に先立って試料をそのように前処理することによりリボ
フラビンによる蛍光妨害が減少することがわかる。

実施例20 FPIA特異性： 本発明のアッセイシステムは、アンフェタミン、メタ
ンフェタミン、フェニルプロパノールアミン、エフェド
リン、偽エフェドリンおよびフェンテルミンなどのアン
フェタミン様薬剤を検出するのに適している。種々のア
ンフェタミン様薬物の交差反応性を試験した。アッセイ
は、既知量の供試化合物を薬物不含の正常ヒト尿試料に
加え、TDx装置でアンフェタミン様薬物をアッセイする
ことにより行った。交差反応性（％）は、100×（観察
された被験化合物の濃度／添加した被験化合物の濃度）
で表される。得られた結果を下記第２表に示す。これら
のデータは、本発明のアッセイシステムおよび試薬が、
刺激または毒性作用を示す濃度のアンフェタミン様薬物
を検出するのに充分な交差反応性を有することを示して
いる。それと同時に、ある種の食品に一般にみられるフ
ェネチルアミン様物質、たとえばトリプタミンやチラミ
ンなどの濃度は容易に検出されず、それゆえ妨害の問題
は起こらない。

好ましい自動アンフェタミン様薬物アッセイにおいて
下記試薬を用いた。

（１）リボフラビン結合タンパク質を含む上記前処理溶
液； （２）0.01％ウシγ−グロブリンおよび0.1％アジ化ナ
トリウムを含む0.1Mトリスバッファー（pH7.5）中のト
レーサー（0.36μg/ml、上記実施例８で調製）； （３）アンフェタミン免疫原（上記実施例１で調製）に
対して産生したヒツジ抗血清からなり、0.1Mトリスバッ
ファー（pH7.5）（0.01％ウシγ−グロブリン、0.1％ア
ジ化ナトリウム0.4％BSAおよび２％エチレングリコール
を含有）中に希釈した抗体； （４）0.45％NaCl中に50％ジメチルスルホキシドからな
る洗浄溶液； （５）0.1Nリン酸ナトリウム（pH7.5）、0.01％ウシγ
−グロブリンおよび0.1％アジ化ナトリウムからなる希
釈バッファー； （６）d,1−アンフェタミン（0.00μg/ml、0.50μg/m
l、100μg/ml、2.00μg/ml、4.00μg/mlおよび6.00μg/
ml）を含み、0.1％アジ化ナトリウムで保存したプール
化正常ヒト尿からなるカリブレータ；および （７）d,1−アンフェタミン（0.75μg/mlおよび5.00μg
/ml）を含み、0.1％アジ化ナトリウムで保存したプール
化正常ヒト尿からなるコントロール。

偏光蛍光測定は、すべてTDxセラピューティック・ド
ラッグ・モニタリング・システムを用いて行い、アッセ
イは下記プロトコールに従った。

（１）25μｌの標準試料または未知試料を前希釈ウエル
中に入れ、充分な量の希釈バッファーを加えて容量を50
0μｌまで増加させた。

（２）前希釈ウエルからの試料（80μｌ）、前処理溶液
（12.5μｌ）および希釈バッファー（容量を1.0mlまで
増加させるのに充分な量）をピペットでキュベットに加
え、バックグラウンド強度を読み取った。

（３）ついで前希釈ウエルからの試料（80μｌ）、前処
理溶液（12.5μｌ）、およびトレーサーおよび抗体（各
25μｌ）をキュベットに入れ、充分な量の希釈バッファ
ーを加えて容量を2.0mlに増加させた。

（４）この反応混合物をインキュベートした。

（５）混合物の最終の偏光蛍光強度からバックグラウン
ドの偏光蛍光強度を差し引くことにより、トレーサーの
抗体への結合による蛍光偏光を得た。

（６）未知の試料の偏光値を、既知のアンフェタミン含
量のガリブレーターを用いて作成した標準曲線と比較し
た。

「キャリーオーバー（carryover）」、すなわち、TDx
装置のプローブへの試料および試薬の付着を最小にする
ために、洗浄溶液を用いて該プローブを濯いだ。キャリ
ーオーバーは、正常ヒト尿中のアンフェタミン溶液（14
00μg/ml）、ついで薬物不含の正常ヒト尿試料をアッセ
イすることにより決定した。キャリーオーバー（％）
は、100×（薬物不含尿中でのアンフェタミンの測定濃
度／アンフェタミン溶液の濃度）で示される。キャリー
オーバー（％）は、0.02％以下と測定された。許容し得
るキャリーオーバー（％）は、0.05％未満であった。

本発明の概念の多くは他のタイプの結合アッセイにも
同様に適用できることが当業者には理解されるであろ
う。上記態様は、あくまで例示を示すものに過ぎず、本
発明を限定することを意図するものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シンシア・マーサ・モリナ アメリカ合衆国イリノイ 60015、ディ アフィールド、スプリングフィールド・ アベニュー 1058番 (72)発明者 チャールズ・アーサー・フレンジ アメリカ合衆国イリノイ 60046、レイ ク・ビラ、フェアビュー・レーン 37338番 (72)発明者 パトリック・エフ・ジョナス アメリカ合衆国イリノイ 60085、ウォ ークガン、アレクサンダー・コート 1608番 (56)参考文献 特開 平２−69196（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−216459（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/542 G01N 33/531

Claims (17)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式： ［式中、R¹およびR²はそれぞれＨ、OHおよびCH₃よりな
   る群から選ばれた基；R⁴はH;R³およびR⁵は、R³がCONH〜
   担体物質でR⁵がＨ、OHおよびCH₃よりなる群から選ばれ
   た基であるか、またはR³がＨ、OHおよびCH₃よりなる群
   から選ばれた基でR⁵がCONH〜担体物質、CH₂CONH〜担体
   物質、CH₂CH₂CONH〜担体物質またはCH₂CH＝CHCONH〜担
   体物質である］で示される免疫原化合物。
2. 【請求項２】該担体に複数のハプテン残基が連結した請
   求項（１）に記載の免疫原化合物。
3. 【請求項３】式： で示されるＮ−カルボキシメチル−d,1−アンフェタミ
   ン〜ウシ血清アルブミン（BSA）である請求項（１）に
   記載の免疫原化合物。
4. 【請求項４】一般式： ［式中、R¹′、R²′、R³′、R⁴′およびR⁵′はＨ、OHお
   よびCH₃よりなる群から選ばれた基であり、ただし
   R¹′、R²′、R³′、R⁴′およびR⁵′のうち少なくとも一
   つは一般式:MF1（式中、F1は蛍光物質、Ｍは０〜15個の
   炭素原子およびヘテロ原子からなり６個未満のヘテロ原
   子を含む直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和結合基で
   あって、２個以上のヘテロ原子が連続して結合すること
   はなく該分枝は炭素原子上でのみ生じ、該ヘテロ原子は
   窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ケイ素原子およびリン
   原子よりなる群から選ばれた原子であるもの）］で示さ
   れるトレーサー化合物。
5. 【請求項５】R⁵′が、CO−F1、CH₂−F1、CONH−F1、CON
   HCH₂−F1、（CH₂）nCONHCH₂−F1（式中、ｎは１または
   ２）、CH（CH₃）CONHCH₂−F1、CH₂CON（CH₂CH₃）CH₂−F
   1、CH₂CON（CH₂CH₂CH₂CH₃）CH₂−F1、（CH₂）nNHCO−F1
   （式中、ｎは１、２または３）およびCH₂CONHCH₂CH₂NHC
   O−F1（式中、F1は前記と同じ）よりなる群から選ばれ
   た基である請求項（４）に記載のトレーサー化合物。
6. 【請求項６】R³′が、CONHCH₂−F1およびCONHCH₂CH₂NHC
   O−F1（式中、F1は前記と同じ）よりなる群から選ばれ
   た基である請求項（４）に記載のトレーサー化合物。
7. 【請求項７】R²′が、（CH₂）nCONHCH₂−F1（式中、ｎ
   は１または２、F1は前記と同じ）および（CH₂）nNHCO−
   F1（式中、ｎは１、２または３、F1は前記と同じ）より
   なる群から選ばれた基である請求項（４）に記載のトレ
   ーサー化合物。
8. 【請求項８】R¹′が、OCH₂CONHCH₂−F1（式中、F1は前
   記と同じ）である請求項（４）に記載のトレーサー化合
   物。
9. 【請求項９】R¹′、R²′およびR⁴′がＨであり、R³′が
   CH₃であり、R⁵′がMF1（式中、F1はフルオレセインまた
   はフルオレセイン誘導体、Ｍは０〜15個の炭素原子およ
   びヘテロ原子からなり６個未満のヘテロ原子を含む直鎖
   または分枝鎖の飽和または不飽和結合基であって、２個
   以上のヘテロ原子が連続して結合することはなく該分枝
   は炭素原子上でのみ生じ、該ヘテロ原子は窒素原子およ
   び酸素原子よりなる群から選ばれた原子であるもの）で
   ある請求項（４）に記載のトレーサー化合物。
10. 【請求項１０】式： （式中、F1は前記と同じ）で示されるＮ−アセタミドメ
    チルフルオレセイン−d,1−アンフェタミン〜F1である
    請求項（９）に記載のトレーサー化合物。
11. 【請求項１１】試料中の１種または２種以上のアンフェ
    タミン様分析対象物の存在または量を決定する方法であ
    って、 （ａ）該試料を請求項（４）に記載のトレーサー化合
    物、および該分析対象物および該トレーサー化合物を認
    識し結合することのできる抗体と接触させて、（ｉ）該
    抗体への該分析対象物の結合または（ii）該抗体への該
    トレーサー化合物の結合がそれぞれ（ｉ）該抗体への該
    トレーサー化合物の結合または（ii）該抗体への該分析
    対象物の結合を抑制するようにし、 （ｂ）得られた試験溶液に平面偏光を通して蛍光偏光応
    答を得、ついで （ｃ）該蛍光偏光応答を検出して試料中のアンフェタミ
    ン様分析対象物の存在または量を決定する ことを特徴とする方法。
12. 【請求項１２】抗体が請求項（１）に記載の免疫原化合
    物によって産生されたものである請求項（11）に記載の
    方法。
13. 【請求項１３】トレーサー化合物が請求項（10）に記載
    のトレーサー化合物であり、抗体が請求項（３）に記載
    の免疫原化合物により産生されたものである請求項（1
    2）に記載の方法。
14. 【請求項１４】工程（ｂ）の前にリボフラビン結合タン
    パク質を加え、リボフラビンによる妨害を減少させるの
    に充分な量で存在させる請求項（11）に記載の方法。
15. 【請求項１５】試料中の１種または２種以上のアンフェ
    タミン様分析対象物の存在または量を決定するためのア
    ッセイキットであって、請求項（４）に記載のトレーサ
    ー化合物、および該アンフェタミン様分析対象物および
    該トレーサー化合物を特異的に認識することのできる抗
    体からなることを特徴とするアッセイキット。
16. 【請求項１６】抗体が請求項（１）に記載の免疫原化合
    物により産生されたものである請求項（15）に記載のア
    ッセイキット。
17. 【請求項１７】リボフラビンによる妨害を減少させるの
    に充分な量のリボフラビン結合タンパク質をさらに含む
    請求項（15）に記載のアッセイキット。