ES2316520T3 - Metodo y conjunto para detectar, o determinar, la 3,4-metilenodioximetanfetamina. - Google Patents
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Abstract
Un inmunógeno de la siguiente fórmula estructural: **ver fórmula** en la cual el agente reticulante comprende -R-X-, siendo R un primer grupo bivalente y siendo X un segundo grupo bivalente y en la cual W1 es un material portador que confiere antigenicidad.
Description
Método y conjunto para detectar, o determinar,
la 3,4-metilenodioximetanfetamina.
La presente invención se relaciona con un método
y conjunto para detectar, o determinar, MDMA (3,4-
metilenodioximetanfetamina) y sus análogos metilenodioxi.
Por "detección" se entiende el análisis
cualitativo de la presencia o ausencia de una sustancia.
Por "determinación" se entiende el análisis
cuantitativo de la cantidad de una sustancia.
Por "análogos metilenodioxi" se entiende
los derivados N-(mono- o di-) alquilados (por ejemplo,
N-metilado o N-etilado) de la
metilenodioxianfetamina (MDA).
La presente invención describe la conjugación de
novedosos derivados de hapteno de MDMA, estando los haptenos unidos
covalentemente a un material portador que confiere antigenicidad o a
un agente marcador, con el fin de producir inmunógenos o conjugados
de la presente invención, respectivamente. La presente invención
también describe como los anticuerpos generados para estos
inmunógenos se emplean en el desarrollo de un ensayo específico que
se puede utilizar para detectar, o determinar, MDMA o sus análogos
metilenodioxi en fluidos biológicos.
El método y conjunto de la presente invención
tienen la intención de ser altamente específicos para MDMA pero
reaccionarán en cruz con los análogos metilenodioxi tales como
3,4-metilenodioxietilanfetamina (MDEA). El método y
conjunto de la presente invención tienen la intención de no
reaccionar en cruz significantemente con la anfetamina y
metanfetamina relacionadas estructuralmente.
Las estructuras de MDMA, MDEA y MDA se exponen a
continuación:
La MDMA y sus análogos metilenodioxi son drogas
psicoactivas de las cuales se abusa con más frecuencia. El
metabolito principal de MDMA es MDA. Sin embargo, 65% de MDMA se
excreta sin cambios en la orina. Los compuestos utilizados más
frecuentemente de los diversos productos clandestinos son la
3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA, 1), también
conocida como Éxtasis, la
3,4-metilenodioxietilanfetamina (MDEA, 2), también
conocidos como Eve, y la
3,4-metilenodioxianfetamina (MDA, 3). Estos
compuestos ejercen sus efectos principalmente en el sistema de la
serotonina y, en una menor medida, en el sistema de la dopamina. La
popularidad de los derivados de la metilenodioxianfetamina, se
puede atribuir a sus efectos psicotrópicos.
Aunque MDMA, MDEA y MDA generalmente se
consideran como drogas recreacionales relativamente seguras, se ha
hecho cada vez más evidente que su uso se puede asociar con muchos
efectos adversos y complicaciones, algunas de las cuales pueden
conducir a un desenlace fatal. Adicionalmente, se ha encontrado que
MDMA y MDA dañan las neuronas de la serotonina en todos los
animales de experimentación probados hasta hoy, y existen
preocupaciones más serias de que los usuarios de estas drogas,
están en riesgo de neurotoxicidad de la serotonina, especialmente
después del uso repetido de altas dosis de la droga.
Hasta la fecha, la determinación de MDMA y sus
análogos metilenodioxi en fluidos biológicos se han basado
principalmente en espectrometría de masas acoplada a cromatografía
de gases (GC-MS), y HPLC. Estos métodos
cromatográficos proporcionan excelente sensibilidad y selectividad
pero requieren una derivatización de la MDMA y sus análogos
metilenodioxi. Estos métodos son, además, demasiado costosos y
demandan mucho tiempo, para su uso como herramientas de
detección.
Las reacciones de enlace específico, tales como
interacciones anticuerpo-antígeno, han sido
utilizadas extensamente en inmunoensayos para detectar una variedad
de sustancias presentes en los fluidos biológicos.
De esta manera, por ejemplo, los
radioinmunoensayos se podrían utilizar para la determinación de la
cantidad de MDMA y sus análogos metilenodioxi. Los
radioinmunoensayos son muy sensibles, pero requieren trazadores de
radionúclidos, por ejemplo ^{125}I y ^{3}H, y en algunos casos,
una etapa de extracción preliminar. No existen RIAs conocidos para
MDMA y sus análogos metilenodioxi.
Los ensayos de inmunoabsorción con enzimas
ligadas (ELISAs) son una alternativa no-radioactiva,
que se conoce para la determinación cualitativa y
semi-cuantitativa de diversos derivados de la
anfetamina. Sin embargo, alguien de habilidad apreciará que los
derivados de la anfetamina carecen del anillo metilenodioxi de la
MDMA. De esta manera, por ejemplo, EP 0 399 184 A2 (Abbott
Laboratories) describe los reactivos, métodos y conjuntos para la
detección y determinación de derivados de la anfetamina por
inmunoensayo por polarización de fluorescencia. EP 0 399 184 A2
prepara haptenos, inmunógenos y anticuerpos de diversas anfetaminas,
todos los cuales carecen del anillo metilenodioxi de la MDMA. El
ejemplo 20 de EP 0 399 184 A2 confirma que estos reactivos muestran
menos del 30% de reacción cruzada, calculada como concentración
encontrada sobre la concentración añadida, para MDMA, MDEA y MDA
(ver Tabla 2)). Adicionalmente,
EP-A-820984 describe la preparación
de haptenos, inmunógenos y anticuerpos para la anfetamina y la
metanfetamina, los haptenos de los cuales todos carecen del anillo
metilenodioxi de la MDMA. Actualmente, los haptenos de
EP-A-820984 se derivatizan a través
del anillo fenil sin fundir de la anfetamina, mientras que, por el
contrario, MDMA y sus análogos metilenodioxi contienen un anillo
metoxilenodioxi fundido al anillo fenil.
Los ensayos de inmunoabsorción con enzimas
ligadas (ELISAs) son una alternativa no-radioactiva,
los cuales se conocen para la determinación genérica de anfetaminas
como una clase. Específicamente, ambos Emit (Registered Trade Mark)
II Plus Monoclonal (supplied by Syva Company) y Cedia (Registered
Trade Mark) DAU (supplied by Microgenetics/Roche) son EIAs para las
anfetaminas. Las reacciones cruzadas respectivas son del 69% para
MDMA (Cedia) cuando se compara con 100% para
D-metanfetamina y 14.3% para MDMA cuando se compara
con 100% para D, L-metanfetamina (Emit).
Los ensayos de inmunoabsorción con enzimas
ligadas (ELISAs) también se conocen para la determinación
cualitativa y semi-cuantitativa de MDMA y sus
análogos metilenodioxi.
Los inmunoensayos de MDMA disponibles
anteriormente de Cozart Bioscience Limited (45 Milton Park,
Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RU, United Kingdom) son simplemente
pruebas de detección, que requieren confirmación por qué Cozart
indica como preferido un método químico alternativo "más
específico" de cromatografía de gases/espectrometría de masas
(GC-MS). De esta manera, el Cozart methamphetamine
EIA (disponible en Octubre, 2001 - actualmente recogido) mostró
significante reacción cruzada, cuando se compara con 100% para
metanfetamina, contra MDMA (758-1250%), MDEA
(50-100%) y
N-metil-1-(3,4-metilenodioxifenil)-2-butamina
(MBDB) (150-200%), mientras que el Cozart MDMA EIA
(disponible en Octubre, 2001 - actualmente recogido) mostró
significante reacción cruzada, cuando se compara con 100% para
MDMA, con D-metanfetamina (52-80%) y
DL-MBDB (10.4-20%). Estos dos
ensayos Cozart actualmente han sido reemplazados por un conjunto de
metanfetamina Cozart único, el cual muestra una reacción cruzada
del 43-49% para MDMA, cuando se compara con 100%
para la metan-
fetamina.
fetamina.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los datos de la reacción cruzada para los
diversos ensayos mencionados anteriormente, se han vuelto a
calcular, relativo al 100% para MDMA y estos datos se presentan
esquemáticamente en la siguiente tabla:
Es un objeto de la invención superar algunos o
todos los inconvenientes del oficio previo, o proporcionar una
alternativa a estos.
Es un objeto de una modalidad preferida de la
invención proporcionar un método y un conjunto para detectar, o
determinar la cantidad de, MDMA y sus análogos metilenodioxi.
El objetivo de la presente invención es superar
los problemas de falta de especificidad asociados con inmunoensayos
conocidos para MDMA, preparando un anticuerpo altamente específico a
MDMA y sus análogos metilenodioxi, que no presentan reacción
cruzada significantemente con d-anfetamina y
(+)-metanfetamina. Por "no significantemente"
se entiende (para cada una de d-anfetamina y
(+)-metanfetamina) una reacción cruzada de menos de
aproximadamente 7.5%, preferiblemente menos de aproximadamente 5%,
más preferiblemente menos de aproximadamente 1%, aún más
preferiblemente menos de aproximadamente 0.5%, más preferiblemente
menos de aproximadamente 0.25%, cuando se compara con 100% para
MDMA. Con el fin de lograr tal especificidad, los haptenos descritos
en la presente invención se generan por una derivatización en la
posición-N de MDMA.
Es otro objeto de una modalidad preferida de la
presente invención desarrollar anticuerpos capaces de unirse con,
como un epitope estructural, el intacto anillo metilenodioxi de MDMA
y los análogos metilenodioxi.
La invención describe un hapteno en el cual el
hidrógeno unido al N de MDMA se reemplaza por (en otras palabras,
se derivatiza con) un agente reticulante.
\newpage
En un primer aspecto, la invención proporciona
un inmunógeno de la siguiente fórmula estructural:
en la cual R es un primer grupo
bivalente y X es un segundo grupo bivalente (o ligador W_{1}), y
en la cual W_{1} es un material portador que confiere
antigenicidad. Preferiblemente, el material portador es una
proteína, un fragmento de proteína, un polipéptido sintético o un
polipéptido
semi-sintético.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un conjugado de la siguiente fórmula estructural:
en la cual R es un primer grupo
bivalente y X es un segundo grupo bivalente (o ligador W_{2}), y
en la cual W_{2} es un detectable agente marcador detectable.
Preferiblemente, el agente marcador se selecciona de una enzima,
una sustancia luminescente, una sustancia radioactiva, o una mezcla
de estos. Más preferiblemente, el agente marcador es una enzima,
preferiblemente una peroxidasa, más preferiblemente peroxidasa de
rábano picante (HRP). Alternativa o adicionalmente, la sustancia
luminescente puede ser un material bioluminescente, un
quimioiluminescente o un
fluorescente.
En la primera y segunda modalidades, el agente
reticulante es -R-X-.
Preferiblemente, R comprende:
-Za-Yb
en la cual Z es una fracción
alquileno sustituida o no sustituida, de cadena lineal o ramificada,
saturada o insaturada o un arileno sustituido o no sustituido,
preferiblemente una fracción fenileno; Y es una fracción alquileno
sustituida o no sustituida, de cadena lineal o ramificada, saturada
o insaturada; a es 0 o 1 y b es 0 o 1, con la condición que a y b
no puedan ambos ser 0. En otras palabras, uno de Z y Y o,
alternativamente, ambos de Z y Y deben estar presentes en R. Más
preferiblemente, b es 0, a es 1 y Z es una fracción alquileno
C_{1-6}, sustituida o no sustituida, de cadena
lineal o ramificada, saturada o
insaturada.
Más preferiblemente, Z es una fracción alquileno
C_{3-4} no sustituida, de cadena lineal,
saturada.
Ventajosamente, X, antes de la reacción con
W_{1} o W_{2}, se selecciona de un ácido carboxílico o un éster
de este, una amina, una maleimida, un ácido halocarboxílico o un
éster de este, un ácido tiocarboxílico o un éster de este, un
aldehido, un piridilditio o una fracción vinilsulfona.
Más ventajosamente, X, antes de la reacción con
W_{1} o W_{2}, se selecciona de un ácido carboxílico (-COOH),
una amina (-NH_{2}) y un tiocarboxilato éster
(-S-CO-CH_{3}).
En otro aspecto, la presente invención considera
los anticuerpos cultivados contra el inmunógeno del primer aspecto
de la presente invención, siendo los anticuerpos capaces de unirse
con al menos un epitope estructural de MDMA, preferiblemente con el
epitope estructural del anillo metilenodioxi intacto. Los
anticuerpos tienen especificidad por MDMA y otros análogos
metilenodioxi. Los anticuerpos deberían tener una reacción cruzada
de menos del 10%, preferiblemente menos del 5%, más preferiblemente
menos del 1%, más preferiblemente menos del 0.5% para la anfetamina
y la metanfetamina relacionadas estructuralmente. Preferiblemente,
los anticuerpos se fijan en un sustrato de refuerzo.
Preferiblemente, los anticuerpos son policlonales. Como alternativa,
los anticuerpos son monoclonales.
La invención además proporciona un proceso de
preparación de los anticuerpos, el proceso que comprende, las
etapas de inmunización de un animal, preferiblemente un animal
vertebrado, más preferiblemente un animal mamífero, mediante la
administración repetida de un inmunógeno de acuerdo con el primer
aspecto de la presente invención, y la recolección del suero
resultante a partir del animal inmunizado. Preferiblemente, el
proceso además comprende la fijación de dichos anticuerpos del
suero a un sustrato de refuerzo, preferiblemente a un soporte
sólido, más preferiblemente un soporte sólido de poliestireno. Los
anticuerpos preparados de acuerdo con este proceso son
policlonales.
En aún otro aspecto, la presente invención
comprende un método para detectar o determinar la MDMA y sus
análogos metilenodioxi en una muestra, método que comprende el
contacto de la muestra con el conjugado de la presente invención, o
una mezcla de este, y con los anticuerpos de la presente invención,
o una mezcla de estos; la detección, o determinación de la cantidad
del, conjugado unido; y la deducción a partir de una curva de
calibración de la presencia de, o la cantidad de, MDMA y sus
análogos metilenodioxi en la muestra.
En otro aspecto, la invención incluye un
conjunto para detectar o determinar la MDMA y sus análogos
metilenodioxi, el conjunto incluye el conjugado de la presente
invención, o una mezcla de estos y los anticuerpos de la presente
invención, o una mezcla de estos. El conjunto opcionalmente puede
incluir instrucciones para el uso de dichos conjugados y dichos
anticuerpos para detectar o determinar la MDMA y sus análogos
metilenodioxi en una muestra.
Preferiblemente, la muestra es una solución, tal
como un fluido biológico. Más preferiblemente, la muestra es suero
u orina. Más preferiblemente, la muestra es una solución a partir de
un paciente humano.
En el método y conjunto de la presente
invención, se prefiere que los ligadores en cruz respectivos (del
inmunógeno y el conjugado) sean diferentes.
En otro aspecto, la presente invención involucra
el uso de los conjugados de acuerdo con la presente invención, o
una mezcla de estos, con los anticuerpos de acuerdo con la presente
invención, o una mezcla de estos, para detectar o determinar la
MDMA y sus análogos metilenodioxi en muestras de prueba tales como
fluidos biológicos.
Los derivados de hapteno
N-(3'-carboxipropil) MDMA (compuesto 7),
N-(4'-aminobutil) MDMA (compuesto 9) y
N-(3-acetiltiopropil) MDMA (compuesto 10) se
preparan como se esquematiza en la Figura-1. Primero
es la preparación de la
3,4-metilenodioximetanfetamina (compuesto 1) a
partir del ácido 3,4-(metilenodioxi) fenilacético (compuesto 4) en
dos etapas: reacción del compuesto 4 con anhídrido acético/piridina
y la posterior hidrólisis del intermedio con HCl concentrado en
etanol con reflujo, proporciona el 3,4-(metilenodioxi) fenilacetona
(compuesto 5). La reacción del compuesto 5 con metilamina
clorhidrato en metanol en la presencia de trietilamina y
cianoborohidruro de sodio, proporciona la MDMA (compuesto 1) con
una buena producción. Los haptenos 7, 9 y 10 se obtienen a partir
del compuesto 1 como sigue:
La reacción del compuesto 1 con
etil-4-bromobutirato en acetonitrilo
con reflujo en la presencia de yoduro de potasio catalítico, da el
éster-compuesto 6. El hapteno 7,
N-(3'-carboxipropil) MDMA, se obtiene después de la
saponificación del compuesto 6, mediante hidróxido de potasio en
tetrahidrofurano (THF)/agua.
La reacción del compuesto 1 con
(N-(4-bromobutil)ftalimida en etanol con
reflujo, seguido por la hidrólisis del grupo ftalimida mediante
hidrato de hidrazina en metanol con reflujo, proporciona el hapteno
N-(4'-aminobutil) MDMA (compuesto 9).
El hapteno 10 [N-(3 -acetiltiopropil) MDMA] se
prepara por reacción de MDMA (compuesto 1) con yodopropiltioacetato
en etanol con reflujo.
Aunque los haptenos de MDMA proporcionan
epítopes estructurales definidos (el anillo metilenodioxi intacto),
no son por ellos mismos inmunogénicos y por consiguiente es
necesario que se conjuguen con el material portador, para producir
una respuesta inmunogénica cuando se inyecta en un animal huésped.
Los apropiados materiales portadores incluyen proteínas tales como
albúminas, proteínas del suero por ejemplo, globulinas, proteínas
de lentes oculares y lipoproteínas. Los portadores de proteínas
ilustrativos incluyen albúmina de suero de bovino, ovoalbúmina,
globulina gamma de bovino, globulina de enlace de tiroxina,
hemocianina de lapa californiana (KLH) etc. Como alternativa, se
pueden emplear los poli (aminoácidos) sintéticos que tienen un
número suficiente de grupos amina disponibles tales como lisina,
como muchos otros materiales poliméricos sintéticos o naturales que
llevan grupos funcionales reactivos. En particular, carbohidratos,
levaduras o polisacáridos se pueden conjugar con el hapteno para
producir un inmunógeno.
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Cada hapteno también puede estar unido
covalentemente a un agente marcador tal como una enzima (por
ejemplo, peroxidasa de rábano picante), una sustancia que tiene
propiedades fluorescentes o un nivel radioactivo para producir
conjugados (o reactivos de detección) para utilizar en los
inmunoensayos. La sustancia fluorescente puede ser, por ejemplo, un
residuo monovalente de fluoresceína o un derivado de esta.
Con el fin de confirmar que la conjugación
adecuada del hapteno con el material portador ha sido lograda,
antes de la inmunización, cada inmunógeno se evalúa utilizando
espectrometría de masas con desorción láser UV de matriz
asistida/ionización tiempo de escape (MALDI-TOF MS).
En el caso del material portador preferido, albúmina de suero de
bovino, se prefiere, un mínimo de 6 moléculas de hapteno por
molécula portadora.
En la preparación de conjugados o inmunógenos
con haptenos donde un grupo tiol esta presente tal como, por
ejemplo, grupos hapteno 10, maleimida, halo, piridilditio o
vinilsulfona se debe primero introducir con el agente marcador o
material portador, respectivamente, utilizando ligadores
heterobifuncionales tales como, pero no se limitan a: éster
N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)succinimida
(GMBS); succinimidil
4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
(SMCC);
(m-maleimidobenzoil)-N-hidroxisuccinimida
(MBS); succinimidil
4-(p-maleimidofenil)butirato (SMPB);
N-succinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato
(SIAB); bromoacetilglicina N-hidroxisuccinimida;
N-succinimidil
3-(2-piridilditio)propionato (SPDP);
vinilsulfona (Pierce Chemical Company, USA). El agente marcador o
material portador, modificado de esta manera, luego se puede
conjugar vía el grupo tiol presente en el hapteno, tal como hapteno
10. Para los haptenos sin un grupo tiol presente, tales como los
haptenos 7 y 9, la conjugación se realiza sin la modificación
anterior del agente marcador o material portador, según sea
apropiado, utilizando métodos de conjugación estándar tales como
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC) o un anhídrido mezclado. Específicamente, el hapteno 7 se
conjuga con, por ejemplo, HRP por EDC y el hapteno 9 por
metaperiodato de sodio, seguido por la reducción de la base de
Schiff con cianoborohidruro de sodio.
Con el fin de generar antisuero policlonal, el
inmunógeno se mezcla con Adyuvante de Freund y la mezcla se inyecta
en un animal huésped, tal como un conejo, ovejas, ratón, conejillo
de Indias o caballo. Inyecciones adicionales (refuerzos) se
hicieron y el suero se muestreo para la evaluación del título del
anticuerpo. Cuando el título óptimo se ha alcanzado, el animal
huésped, entonces se desangra, para producir un volumen apropiado
de antisuero específico. El grado de purificación del anticuerpo
requerido depende de la intención de la aplicación. Para muchos
propósitos, no hay ningún requisito en absoluto para la
purificación, sin embargo, en otros casos, tales como donde el
anticuerpo se ha inmovilizado sobre un soporte sólido, las etapas de
purificación se pueden tomar para extraer el material indeseado y
eliminar el enlace no específico.
Los anticuerpos específicos de la presente
invención son útiles como reactivos en inmunoensayos para la
detección, o para la determinación, de MDMA y los análogos
metilenodioxi en fluidos biológicos.
La espectrometría de masas
MALDI-TOF se llevó a cabo utilizando un
espectrómetro de masas de desorción láser Voyager STR
Biospectrometry Research Station acoplado con extracción de retardo.
Una alícuota de cada muestra que se analiza, se diluyó en 0.1% de
ácido trifluoroacético acuoso (TFA) para crear soluciones de 1 mg/ml
de muestra. Las alícuotas (1 \mul) se analizaron utilizando una
matriz de ácido Sinapínico y se utilizó albúmina de suero de bovino
(Fluka) como un calibrante externo. La Figura 3 de los dibujos
acompañantes muestra el análisis para el material portador BSA.
Como se puede apreciar, una señal principal se presentó, lo cual
indica una masa protonada media para esta muestra de m/z 66,115. La
señales observadas a m/z 33,038 y 132,558 son consistentes con el
principal componente observado en una forma de doble carga y forma
de dímero, respectivamente. Otras señales se observaron incluyendo
aquel en m/z 13,505.
En los siguientes Ejemplos, los porcentajes se
deben tomar como porcentajes (volumen/volumen), a menos que se
especifique de otra manera.
El ácido (3,4-Metilenedioxi)
fenilacético (compuesto 4) (15 g, 0.0832 mol) se disolvió en
anhídrido acético (73.5 ml) y piridina (33.75 ml) y la mezcla se
sometió a reflujo por 16 horas. Después del enfriamiento, los
solventes se retiraron con vacío (la temperatura se debería mantener
tan baja como sea posible) y el residuo se trató con etanol seco
(58.5 ml), se adicionó HCl concentrado (5.63 ml) y la mezcla se
sometió a reflujo por 2 horas.
Se adicionó agua (150 ml) y se extrajo con
diclorometano (3 x 150 ml). Los extractos orgánicos combinados se
secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y el solvente se
eliminó. El residuo se purificó por cromatografía de columna
(Silica gel, 10%-20% acetato de etilo en hexano) para dar 11.25 g
(77% de producción) de (3,4-metilenodioxi)
fenilacetona (compuesto 5) como un aceite de color naranja.
FT-IR (película, nítida):
1711.67 cm^{-1} (Figura 5).
\global\parskip1.000000\baselineskip
El compuesto 5 (4 g, 0.022 mol) se disolvió en
metanol (100 ml) y a esta solución en agitación se le adicionó,
metilamina clorhidrato (15.16 g, 0.22 mol) y trietilamina (6.76 ml,
0.049 mol). Se le adicionó cianoborohidruro de sodio (1.41 g, 0.022
mol) en metanol (10 ml) en una porción y la mezcla de reacción, se
agitó a temperatura ambiente durante la noche.
Los solventes se retiraron con vacío, agua (50
ml) seguido por la adición de HCl 1 N (50 ml) y la mezcla se lavó
con dietil éter (100 ml). La fase acuosa se basificó a pH
12-13 con NaOH 2N y se extrajo con acetato de etilo
(3 x 100 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre
sulfato de sodio, se filtraron y el solvente se eliminó para
proporcionar, la base libre de MDMA cruda (compuesto 1) como un
aceite de color marrón con una buena producción.
El producto crudo obtenido se utilizó sin una
purificación adicional.
FT-IR (película, nítida): 3172,
2779.3, 2715.4, 1246.7 y 1037.9 cm^{-1} (Figura 6).
El compuesto 1 crudo (2.4 g) se trató con
acetonitrilo seco. Se adicionó etil 4-bromobutirato
(2.426 g, 0.12 mol) seguido por el yoduro de potasio (200 mg) y la
mezcla resultante se sometió a reflujo por 4-5
horas. Después del enfriamiento, la solución se filtró y el
solvente se eliminó con vacío.
La purificación del producto crudo obtenido por
cromatografía sobre silica gel (5% de metanol en cloroformo)
suministró 1.356 g de un aceite de color naranja pálido de éster
6.
FT-IR (película, nítida):
2645.15, 1728.45, 1490.6, 1253.0 y 1036.7 cm^{-1} (Figura 7).
El éster 6 (1.356 g) se trató con
tetrahidrofurano (10 ml) y agua (10 ml), se adicionó hidróxido de
potasio (0.371 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta
que la TLC (5% metanol (MeOH)/cloroformo) indicó que la reacción se
completó.
La mezcla se neutralizó, por la adición de HCl 1
N y se redujo a sequedad con vacío. El residuo se trató con etanol
(20 ml) y el material inorgánico insoluble se filtró completamente.
El solvente se eliminó con vacío y el residuo se recristalizó a
partir de acetonitrilo para dar 0.529 g de hapteno 7 como una espuma
de color blanco.
FT-IR(KBr): 3405.63,
1574.53 (br), 1253.22 y 1039.2 cm^{-1} (Figura 8).
Punto de fusión (acetonitrilo):
37-40ºC.
MDMA 1 cruda (2.35 g) se trató con etanol
absoluto (20 ml), se adicionó
N-(4-bromobutil)ftalimida (3.14 g, 0.0128
mol) y la mezcla resultante se sometió a reflujo por
4-5 horas. Después del enfriamiento a temperatura
ambiente, el solvente se eliminó con vacío y el residuo se sometió
a cromatografía sobre silica gel, utilizando 10% de metanol en
cloroformo, para dar 2.013 g del compuesto 8 como un aceite de color
marrón claro.
FT-IR (película, nítida):
2633.0, 1709.2, 1398, 1252 y 1039.1 cm^{-1} (Figura 9).
El Compuesto 8 a partir del
Ejemplo-5 (2.013 g, 0.005 mol) se trató con metanol
seco (50 ml) y se le adicionó hidrato de hidrazina (0.246 g). La
mezcla se sometió a reflujo por 2 horas, después de esto, se
adicionaron otros 0.138 g de hidrato de hidrazina y se continúo el
reflujo por otras 2 horas. La mezcla luego se enfrió a temperatura
ambiente y los solventes se eliminaron con vacío para suministrar un
aceite de color marrón.
\newpage
El aceite se trató con la mínima cantidad de
agua y se trató con aproximadamente 10 ml de HCl 1 N (pH
4-5). El precipitado se filtró completamente y el
filtrado se basificó a pH 12-13 con NaOH 6 N y se
extrajo con diclorometano (4 x 50 ml). Los extractos orgánicos
combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y el
solvente se eliminó para suministrar, la base libre como aceite de
color marrón pálido.
El aceite se trató con HCl 2 N gaseoso en dietil
éter (20 ml) y se agitó por 1-2 horas. El
precipitado se recolectó, se lavó con dietil éter frío y se secó
para dar 0.877 g de N-(4'-aminobutil)MDMA
clorhidrato (hapteno 9) como un sólido de color
blanco-crema.
FT-IR (KBr): 3377.66, 2792.44,
1489.3 y 1038.97 cm^{-1} (Figura 10).
Punto de fusión: 232-234ºC.
MDMA 1 cruda (2.98 g, 0.0154 mol) se trató con
etanol absoluto (50 ml), se adicionó yodopropiltioacetato (5.65 g,
0.023 mols) y la mezcla resultante se sometió a reflujo por 16
horas. La mezcla luego se enfrío a temperatura ambiente y el etanol
se eliminó con vacío. La mezcla oscura cruda obtenida se purificó
por cromatografía (silica gel; 10% metanol en cloroformo) para dar
2.2 g de N-(acetiltiopropil) MDMA (hapteno 10), como un aceite de
color amarillo claro.
FT-IR (película, nítida):
2931.1, 2675.7, 1689.2, 1252.8, 1038.7 y 735.8 cm^{-1} (Figura
11).
A una solución de hapteno 7 (100 mg, 0.36 mmol)
en 1 ml de DMF anhidra se le adicionó
N-hidroxisuccinamida (49.7 mg, 0.43 mmol) y
N,N-diciclohexilcarbodimida (88.9 mg, 0.43 mmol) y
la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El
precipitado blanco de urea formada se filtró completamente y el
filtrado se adicionó gota a gota a una solución de BSA (200 mg) en
10 ml de solución reguladora de fosfato 0.05 M, pH 8.5. La mezcla
luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La solución
se dializó contra agua destilada por 20 horas (3 cambios) y se
liofilizó.
Por MALDI-TOF (ver Figura 4 de
los dibujos acompañantes), una señal principal se presentó en el
inmunógeno 7 lo que indica una masa protonada media en mz 68,118.
Las señales observadas a 34,006 y 136,475 son consistentes con el
componente principal observado en las formas de dímeros y cargada
doblemente, respectivamente. Estos datos sugieren que una media de
7.2 moléculas de hapteno se han conjugado por molécula de BSA.
10 mg de EDC clorhidrato se disolvió en 800
\mul de agua e inmediatamente se adicionó a una solución de 2 mg
de hapteno 7 en 200 \mul de DMF. Después de mezclar, esta solución
se adicionó a HRP (20 mg) en 1 ml de agua. Inmediatamente se
adicionó N-hidroxisulfo-succinimida
(5 mg) y la mezcla de reacción se incubó, con agitación, durante la
noche a temperatura ambiente. El exceso derivado se eliminó por
desalación con columnas de 2 PD-10 (Pharmacia
Biotech) en serie, pre-equilibrada con solución
reguladora de fosfato salina, pH 7.2 (PBS). El
hapteno-HRP conjugado entonces se dializó durante
la noche contra 10L de PBS a 4ºC.
1 ml de una solución de 21 mg/ml de peryodato de
sodio se adicionó lentamente con HRP (20 mg) en 1 ml de agua. La
solución resultante se agitó por 20 minutos a temperatura ambiente,
en la oscuridad, y se dializó contra solución reguladora de acetato
1 mM, pH 4.5, durante la noche a 4ºC, en la oscuridad. El Hapteno 9
(2 mg) se disolvió en 200 \mul de DMF se adicionó lentamente a la
enzima activada y la mezcla de reacción se incubó, con agitación,
por 2 horas a temperatura ambiente, en la oscuridad. El exceso
derivado se eliminó por desalización con columnas de 2
PD-10 (Pharmacia Biotech) en serie,
pre-equilibradas con solución reguladora de fosfato
salina, pH 7.2 (PBS). El hapteno-HRP conjugado
entonces se dializó durante la noche contra 10L de PBS a 4ºC, en la
oscuridad.
A una solución de HRP (1 g) en solución
reguladora de borato 0.1 M (pH 8.5, 45 ml), protegida de la luz y
fría a 0ºC, se le adicionó gota a gota
N-succinimidil bromoacetilglicina (0.375 mg, 0.13
mmol) en DMF (5 ml). Durante la adición, el pH se mantuvo a 8.
Después de completar la adición, el pH de la solución se estabilizó
a 8 y la solución se agitó en la oscuridad a 0ºC por 1 hora. La
solución se neutralizó a pH 7 y se dializó durante la noche a 4ºC
contra agua destilada una vez y PBS, pH 7.2, otra vez.
10 mg de Hapteno 10 se disolvieron en 0.5 ml de
una solución de carbonato de potasio 0.12 M (80% metanol/20% agua).
La solución resultante se dejo por 10 minutos en la oscuridad a
temperatura ambiente. 1 ml de solución reguladora de fosfato 50 mM,
pH 7, se adicionó a la solución para detener la reacción y el pH se
ajustó a 7.0 - 7.5, mediante la adición de HCl 0.1 M. 300 ml de
esta solución se adicionó gota a gota a una solución de
bromoacetilglicina HRP modificada (20 mg en 1 ml de agua) y la
mezcla se agitó en la oscuridad durante la noche a 4ºC. El
hapteno-HRP conjugado obtenido se purificó
utilizando dos columnas PD10 (Pharmacia Biotech), se eluyó con PBS,
pH 7.2, y se dializó durante la noche contra agua a 4ºC.
Una solución acuosa del inmunógeno preparado en
el Ejemplo 8 se formuló con Adyuvante Completo de Freund (FCA) para
formar una emulsión que consiste de 2 mg/ml de inmunógeno en 50%
(v/v) FCA. Dos ovejas se inmunizaron con esta emulsión, 0.25 ml se
le inyectan vía subcutánea a cada uno de 4 sitios en el flanco de
cada animal. Las posteriores inmunizaciones (refuerzos) contenían 1
mg/ml de inmunógeno emulsificado en 50% (v/v) Adyuvante Incompleto
de Freund (FIA) y se administraron de la misma manera, en intervalos
mensuales por 1 año. El muestreo de la sangre tuvo lugar a los 7 a
14 días después de cada refuerzo. Cada muestra se procesó para
producir el antisuero que además se purificó por precipitación de
ácido caprílico y sulfato de amonio para producir una fracción de
inmunoglobulina G (IgG). La fracción IgG se evaluó por ensayo en
placa de microtitulación competitivo, como se describe abajo.
Los pozos de una placa de microtitulación de
poliestireno de 96 pozos de enlace mejorado, se cubrieron con la
fracción IgG del antisuero cultivado con el Inmunógeno 7 (Ejemplo
8), diluido en Tris 10 mM, pH 8.5 (125 \mul/pozo). La dilución de
cubierta del anticuerpo apropiado se determinó utilizando técnicas
chequerboard de ELISA estándar. La placa se incubó por 2 horas a
37ºC, se lavó 4 veces con solución salina estandarizada Tris que
contiene Tween 20 (TBST) y se deja seca. Las soluciones estándar de
MDMA se prepararon en TBST a 0, 1, 10, 50, 100, 250, 500 y 1000
ng/ml y 25 \mul de cada una se adicionaron a los pozos apropiados
(Figura 2). Los conjugados (reactivos de detección)- hapteno
7-HRP (Ejemplo 9) y hapteno 10-HRP
(Ejemplo 12) - se diluyeron en solución reguladora Tris, pH 7.2,
que contiene EDTA, D-manitol, sacarosa, timerosal y
BSA, siendo las diluciones apropiadas determinadas por técnicas
chequerboard de ELISA estándar, y 100 \mul de cada una se
adicionaron a los pozos apropiados (Figura 2). La placa se incubó a
37ºC por 2 horas. El exceso de conjugado sin unir se eliminó,
lavando 6 veces durante un periodo de 10 minutos con TBST.
125 \mul de solución del sustrato de
tetrametilbenzidina (TMB) se adicionó a cada pozo de la placa, que
luego se incubó por 15 a 20 minutos en la oscuridad a temperatura
ambiente. La reacción se terminó por la adición de 125 \mul de
H_{2}SO_{4} 0.2 M a cada pozo. La absorbancia, luego se
determinó a 450 nm utilizando un lector de placa de
microtitulación. Los datos generados en cada ensayo se presentan en
la Tabla 1 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de determinar la especificidad de los
ELISAs competitivos MDMA, soluciones estándar de potenciales
reactivo cruzado MDEA, MDA, d-anfetamina,
(+)-metanfetamina, (+)-efedrina,
(-)-efedrina, (+)-pseudoefedrina,
(-)-pseudoefedrina y 1-anfetamina se
prepararon en TBST a 0, 500, 1000, 5000, 10000, 25000, 50000 y
100000 ng/ml. Empleando cada serie de estándares en los ELISAs
competitivos MDMA, las curvas de calibración se generaron y estas
se utilizaron para determinar la reacción cruzada de los
inmunoensayos con estas drogas. Los resultados de este estudio se
presentan en la Tabla 2, siendo la reacción cruzada calculada de
acuerdo con la siguiente fór-
mula:
mula:
%CR =
IC50_{MDMA}/IC50_{CR} \ X \
100
Donde %CR es el porcentaje de reacción cruzada,
IC_{50}MDMA es la concentración de MDMA que causa 50% de
desplazamiento de la señal e IC_{50}CR es la concentración de
reactivos cruzados potenciales, para los cuales se evalúa %CR, que
causa el 50% del desplazamiento de la señal.
Es evidente a partir de los resultados que los
ensayos de MDMA muestran niveles altos de reacción cruzada con
MDEA, niveles bajos de reacción cruzada con MDA y muy bajos niveles
de reacción cruzada con d-anfetamina y
(+)-metanfetamina. Por consiguiente, los ELISAs
competitivos MDMA son altamente específicos para MDMA y otros
análogos metilenodioxi.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet EP 0399184 A2 [0012] [0012] [0012]
\bullet EP 820984 A [0012] [0012].
Claims (14)
1. Un inmunógeno de la siguiente fórmula
estructural:
en la cual el agente reticulante
comprende -R-X-, siendo R un primer grupo bivalente
y siendo X un segundo grupo bivalente y en la cual W_{1} es un
material portador que confiere
antigenicidad.
2. Un conjugado de la siguiente fórmula
estructural:
en la cual el agente reticulante
comprende -R-X-, siendo R un primer grupo bivalente
y siendo X un segundo grupo bivalente y en la cual W_{2} es un
agente marcador que es
detectable.
3. Un inmunógeno o un conjugado de acuerdo con
la Reivindicación 1 o 2, en la cual R comprende:
-Z_{a}-Y_{b}-
en la cual Z es una fracción
alquileno sustituida o no sustituida, de cadena lineal o ramificada,
saturada o insaturada o un arileno sustituido o no sustituido,
preferiblemente la fracción, fenileno; Y es una fracción alquileno
sustituida o no sustituida, de cadena lineal o ramificada, saturada
o insaturada; a es 0 o 1 y b es 0 o 1, con la condición que a y b
no puedan ambos ser
0.
4. Un inmunógeno o un conjugado de acuerdo con
la Reivindicación 3, en la cual b es 0, a es 1 y Z es una fracción
alquileno C_{1-6}, sustituida o no sustituida, de
cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada.
5. Un inmunógeno o un conjugado de acuerdo con
la Reivindicación 3 o 4, en el cual Z es una fracción alquileno
C_{3-4} no sustituida, de cadena lineal,
saturada.
6. Un inmunógeno o un conjugado de acuerdo con
cualquiera de las Reivindicaciones 1-5, en la cual X
se selecciona de un fracción de un ácido carboxílico o un éster de
este, una amina, una maleimida, un ácido halocarboxílico o un éster
de este, un ácido tiocarboxílico o un éster de este, un aldehido, un
piridilditio o una vinilsulfona.
7. Un inmunógeno o un conjugado de acuerdo con
la Reivindicación 6, en el cual X se selecciona de un ácido
carboxílico (-COOH), una amina (-NH_{2}) y un tiocarboxilato éster
(-S-CO-CH_{3}).
8. Un inmunógeno de acuerdo con cualquiera de
las Reivindicaciones 1 y 3 a 7, en el cual el material portador es
una proteína, un fragmento de proteína, un polipéptido sintético o
un polipéptido semi-sintético.
9. Anticuerpos cultivados contra el inmunógeno
de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 y 3 a 8, siendo
los anticuerpos capaces de unirse con al menos un epitope
estructural de la 3,4-metilenodioximetanfetamina,
preferiblemente con el epitope estructural metilenodioxi y que
tienen especificidad por MDMA y otro análogos metilenodioxi.
10. Un proceso de preparación de anticuerpos de
acuerdo con la Reivindicación 9, proceso que comprende las etapas
de inmunización de un animal no-humano,
preferiblemente un animal vertebrado, más preferiblemente un animal
mamífero, mediante la administración repetida de un inmunógeno de
acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 y 3 a 8, y la
recolección del suero resultante a partir del animal
inmunizado.
11. Un conjugado de acuerdo con cualquiera de
las Reivindicaciones 2 a 7, en el cual el agente marcador se
selecciona de una enzima, una sustancia luminescente, una sustancia
radioactiva, o una mezcla de estas.
12. Un método para detectar o determinar MDMA y
sus análogos metilenodioxi en una muestra, el método que comprende
el contacto de la muestra con el conjugado de acuerdo con cualquiera
de las Reivindicaciones 2 a 7 o 11, o una mezcla de estos, y con
los anticuerpos de acuerdo con la Reivindicación 9, o una mezcla de
estos; la detección, o determinación de la cantidad de, conjugado
unido; y la deducción, a partir de una curva de calibración, de la
presencia de, o la cantidad de, MDMA y sus análogos metilenodioxi en
la muestra.
13. Un conjunto para detectar o determinar MDMA
y sus análogos metilenodioxi, el conjunto incluye el conjugado de
acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 7 o 11, o una
mezcla de estos y los anticuerpos de acuerdo con la Reivindicación
9 o una mezcla de estos.
14. Uso de los conjugados de acuerdo con
cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 7 o 11, o una mezcla de
estos, con los anticuerpos de acuerdo con la Reivindicación 9, o
una mezcla de estos, para detectar o determinar MDMA y sus análogos
metilenodioxi en muestras de prueba tales como fluidos
biológicos.
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