CN111989570A - 针对分析物荧光检测的样品澄清和背景荧光减少 - Google Patents
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Abstract
处理样品用于进行荧光分析的方法和试剂。处理方法包括通过向含核黄素的样品中添加核黄素结合蛋白、辐照含核黄素的样品或其组合处理所述样品以减少核黄素依赖性自发荧光。处理方法还包括在不去除分析物的情况下通过凝结、沉淀和/或以其他方式去除干扰荧光分析的蛋白质和其他组分来澄清样品。荧光分析方法包括荧光偏振分析(FPA)和其他。提供了适于执行所披露的方法的试剂。
Description
技术领域
本发明涉及针对分析物荧光检测澄清和/或减少样品中的背景荧光，例如通过使用荧光偏振测定(FPA)或其他基于荧光的测定(FBA)。
背景技术
基于荧光的测定(例如荧光偏振测定(FPA))以及其他通常用于检测样品中的分析物。但是，对于某些类型的样品(例如乳样品、蛋黄样品和其他)，基于荧光的测定并不可靠。这些类型的样品中含有大量的核黄素，核黄素导致高度的背景自发荧光。自发荧光会歪曲结果，使基于荧光的测定不可靠。这些类型的样品还具有大量的蛋白质和其他组分，这些蛋白质和其他组分会使样品对光不透明，从而抵抗荧光分析。本领域中需要用于处理含有核黄素和/或其他组分的样品以使其适于基于荧光的测定的方法和试剂。
发明内容
本发明的一个方面涉及处理和测试包含分析物的样品的方法。在一些版本中所述方法包括处理样品以减少样品中核黄素依赖性的自发荧光、向样品中添加示踪剂、以及检测来自样品中的示踪剂的荧光。处理样品以减少核黄素依赖性荧光可包括向样品中添加核黄素结合蛋白、辐照样品或其组合。优选在添加到样品中的核黄素结合蛋白存在下进行检测。检测到的荧光可指示样品中分析物的量。
一些版本还包括澄清样品。以保持样品中分析物的方式进行澄清。在一些版本中，澄清包括使样品中的酪蛋白凝结并从样品中去除凝结的酪蛋白。凝结可包括将足以凝结酪蛋白的量的凝乳酵素加入样品中。在一些版本中，澄清包括从样品中去除脂质。澄清可包括离心样品、过滤样品或其组合。在一些版本中的过滤是用孔径为约0.1μm至约10μm的过滤器进行。
在优选的版本中，澄清包括向样品中添加非水性极性溶剂。非水性极性溶剂可包含醇。优选将非水性极性溶剂以足以将分析物保持在样品中的量添加至样品，例如在分离步骤期间。在一些版本中，非水性极性溶剂以约10％v/v至约50％v/v的最终浓度添加到样品中。优选在离心和/或过滤样品之前将非水性极性溶剂添加到样品中。
在一些版本中，样品包含乳制品。乳制品可包含乳清。
在一些版本中，分析物是疏水性分析物。在一些版本中，分析物是孕酮。在一些版本中，分析物包含抗体或抗原。
在一些版本中，示踪剂包含结合部分和荧光部分。结合部分可以包含分析物的标准品或分析物的配体。
在一些版本中，将分析物和示踪剂竞争结合的配体添加到样品中。在检测样品中来自示踪剂的荧光之前添加配体。在一些版本中，检测包括检测平面偏振光。
通过以下结合附图对本发明的优选实施例的详细描述，本发明的目的和优点将变得更加充分。
附图说明
图1示出了通过荧光团使平面偏振光消偏振，所述荧光团在其荧光寿命期间经历了测量分子旋转，这是荧光偏振测定(FPA)中的基本现象。
图2示出了示例性FPA装置的示意图。
图3示出了孕烯醇酮转化为孕酮。
图4示出了在凝结剂处理之前的乳样品。
图5示出了在凝结和离心处理之后的乳样品。
图6-10说明了5头奶牛(奶牛#1至#5)中每头奶牛的生殖(发情)周期。在图6-10中的每个中，X轴显示了生殖周期的天数，Y轴显示了生殖周期中如FPA检测到的以ΔmP值的孕酮水平。
图6示出了奶牛#1的生殖周期。孕酮FPA测试显示第22天孕酮水平下降。#1奶牛在第25天进入发情。
图7示出了奶牛#2的生殖周期。孕酮FPA测试显示第19天孕酮水平下降。#2奶牛在第21天进入发情。
图8示出了奶牛#3的生殖周期。孕酮FPA测试显示整个实验期间孕酮水平较高，得出可能妊娠的结论。
图9示出了奶牛#4的生殖周期。孕酮FPA测试显示第19天孕酮水平下降。#4奶牛在第21天进入发情。
图10示出了奶牛#5的生殖周期。孕酮FPA测试显示第21天孕酮水平下降。#5奶牛在第23天进入发情。
具体实施方式
本发明的一方面包括处理样品以减少来自样品的核黄素依赖性自发荧光。“核黄素依赖性自发荧光”是指由于存在核黄素而从样品发出的荧光。处理可包括向样品中添加核黄素结合蛋白、辐照样品或其组合。
本发明中使用的样品可以是包含分析物的任何类型的样品。样品可以是合成样品或天然样品。样品可以掺有分析物或天然包含分析物。样品可包含体液或从其纯化的组分。体液可以来自动物体或植物体。体液的示例性类型包括细胞内液和细胞外液，例如血管内液(血液、血浆、血清)、间质液、淋巴液(有时包括在间质液中)、跨细胞液、和植物渗出物。示例性的体液包括羊水、房水、玻璃状液、胆汁、血液、母乳脑脊液、耳垢、乳糜、chime、内淋巴液、周围淋巴液、血浆、渗出物、粪便(例如腹泻)、女性射出液体、胃酸、胃液、淋巴液、黏液(包括鼻腔引流和痰)、心包液、腹膜液、胸水、脓、发炎性分泌物、唾液、皮脂(皮油)、浆液、血清、***、***垢、痰涎、滑液、汗、泪、尿、***分泌物、以及呕吐物、等等。
核黄素结合蛋白(RBP)(在本领域中也称为RfBP或RFBP)是磷酸糖蛋白，其主要生理功能是储存核黄素。RBP可以在家禽血浆/血清、蛋清、蛋黄以及某些哺乳动物的血浆/血清中找到。适用于本发明的示例性RBP是得自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),圣路易斯(St.Louis),密苏里州(MO)的鸡蛋白的RBP(目录号R5258)。适用于本发明的另一示例性RBP是Hamazume等人1984年描述的RBP。该RBP含有219个氨基酸，所述氨基酸具有包括糖基化和磷酸化的几种翻译后修饰。示例性RBP的功能变体、直系同源和同系物也是合适的。由于pH 6和pH 9之间的配体结合，高达80％的核黄素荧光被淬灭，所以RBP-核黄素复合物缺乏游离核黄素的特征荧光。核黄素的结合发生在配体结合域中的疏水裂缝处，在这里维生素的异咯嗪环在Tyr 75和Trp 156的平行平面之间堆叠。这种几何形状和其他色氨酸的接近性解释了核黄素与蛋白质结合时观察到的荧光淬灭。RBP具有5-15μg核黄素/mg蛋白质的结合能力。
为了结合样品中存在的核黄素，RBP优选以apo形式(即，无结合的核黄素)添加。
优选将RBP以样品中存在的核黄素量(以质量为单位)的约0.1-100,000倍(例如样品中存在的核黄素量的约1-10,000倍或5-5,000倍)的量(以质量为单位)加入样品中。高于和低于这些优选量的量也是可接受的。
对于乳清样品，优选以约10-100,000μg/ml样品的量添加RBP，例如约100-10,000μg/ml样品、约500-2,000μg/ml的样品、或约1,000μg/ml样品。高于和低于这些优选量的量也是可接受的。
RBP与样品中的核黄素的结合淬灭核黄素的荧光。因此，尽管可以在样品的荧光分析之前去除RBP，但是在优选版本中，RBP没有被去除以省略处理步骤。
对于使用辐照以减少核黄素依赖性自发荧光，优选将样品暴露于可见光足够长时间以减少自发荧光。时间范围从一分钟或更短到一天或更长时间。示例性的时间范围包括约1分钟至约60分钟或约15分钟至约45分钟。发现蓝色光谱(455-485nm)中的光在减少核黄素依赖性自发荧光方面最有效。因此，本发明的优选版本使用该光谱中的光辐照样品。用于辐照的光优选排除UV光。用于辐照的光可以包括或排除绿色光谱(500-550nm)、黄色光谱(570-590nm)、和/或红色光谱(625nm)中的光。
澄清可用于制备用于荧光分析的样品，尤其是包含乳制品的样品。如本文所用，“乳制品”是指全乳或由其衍生或纯化的任何产品，包括脱脂乳，复原乳，炼乳等。“乳清”是指酪蛋白，优选脂质已经被去除的乳制品。可以通过使乳中的酪蛋白凝结并将凝结的酪蛋白优选连同其中脂质一起去除，来产生乳清。凝结可以包括以足以凝结酪蛋白的量将凝乳酵素加入样品前体中。如本文所用，“凝乳酵素(rennet)”是指能够凝结酪蛋白的任何酶组合物。大量的凝乳酵素是本领域已知的。
重要的是在澄清方法中不破坏或去除分析物。由于某些分析物可能包含抗体或其他蛋白质，因此重要的是澄清中使用的凝乳酵素和使用凝乳酵素的条件(例如，凝乳酵素处理的时间和温度)不破坏这些蛋白质。发现来自三平根毛霉(Rhizomucor mihei)的微生物凝乳酵素能够凝结酪蛋白而不破坏抗体或其他蛋白质分析物。三平根毛霉凝乳酵素含有毛霉菌胃蛋白酶(mucorpepsin)，而且与动物凝乳酵素不同，不含其他蛋白酶(例如胃蛋白酶和凝乳酶)。因此，来自三平根毛霉的凝乳酵素可适合用于本发明中以检测抗体和其他蛋白质分析物。可以另外地或替代地使用其他非动物性凝乳酵素，包括微生物凝乳酵素，例如来自微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)和寄生隐丛赤壳菌(Cryphonectria parasitica)的微生物凝乳酵素，或植物性凝乳酵素，例如来自菜蓟属(Cynara)的(蓟)菜蓟凝乳酵素。可以另外地或替代地使用动物凝乳酵素。
澄清方法可以包括凝乳酵素孵育步骤。凝乳酵素孵育步骤优选包括在第一温度下在凝乳酵素存在时将样品孵育第一时间段。当分析物是蛋白质时，选择第一温度和第一时间段以消化样品中的酪蛋白而不破坏样品中的蛋白质分析物。示例性的第一温度是约10℃至约37℃，例如约15℃至约30℃或约20℃至约25℃的温度。示例性的第一时间段是从约10秒至约60分钟的时间段，例如从约30秒至约30分钟、约30秒至约20分钟、约1分钟至约10分钟或约1分钟至约5分钟。允许高于和低于这些示例值的温度和时间段。
在一些版本中，澄清可以任选地包括凝乳酵素孵育步骤之后的第二孵育步骤。第二孵育步骤可包括在第二温度下孵育样品第二时间段。选择第二温度和第二时间段以充分澄清样品。第二孵育步骤中的第二温度优选为低于第一孵育步骤中的第一温度的温度。示例性第二温度是约0℃至约10℃，例如约2℃至约8℃或约4℃的温度。示例性第二时间段是约30秒至约60分钟的时间段，例如约2分钟至约30分钟或约15分钟。允许高于和低于这些示例值的温度和时间段。
在某些版本中，凝乳酵素孵育步骤可能很短，例如不到一分钟。在一些版本中，将诸如凝乳酵素、醇和/或缓冲液的试剂在第一温度下例如室温(20℃)添加至样品。然后可以将样品立即置于第二较低温度的环境中，例如设置在例如4℃的冰箱中。样品在从第一温度冷却到第二温度的最初1分钟左右的剩余温度下足以使凝乳酵素起作用。随着样品冷却形成沉淀。
澄清优选包括分离步骤。如果澄清包括酪蛋白凝结，则在凝结之后进行分离步骤。如果澄清包括第二孵育步骤，则在第二孵育步骤之后执行分离步骤。分离步骤优选包括从样品中去除酪蛋白凝结剂和/或其他样品组分，例如脂质。优选通过离心、过滤或其他方法去除凝结剂。可以用孔径为约0.05μm至约20μm，例如约0.1μm至约10μm的过滤器进行过滤。如本文所用，“孔径”是指过滤器过滤出具有指定尺寸或更大直径的颗粒的能力。例如，孔径为0.2μm的过滤器将从过滤流中过滤出直径为0.2μm或更大的颗粒。过滤器可以是注射器式过滤器、真空过滤器或任何其他类型的过滤器，并且可以由任何材料(陶瓷、聚合物、天然纤维等)制成。
重要的是在澄清方法中不去除分析物。例如，发现在澄清方法过程中疏水性分析物(如孕酮)与凝结的酪蛋白一起被去除，从而阻止了其下游检测。还发现在澄清方法过程中向样品中添加非水性溶剂可以阻止样品中分析物的损失。因此，用于制备用于疏水性分析物的下游检测的样品的优选的澄清方法包括在分离步骤之前添加非水性溶剂。
非水性溶剂可以是有机溶剂或无机溶剂。非水性溶剂可以是非极性溶剂或极性溶剂。极性溶剂可以是非质子极性溶剂或质子极性溶剂。质子极性溶剂可以是醇。
有机溶剂的非限制性实例包括乙酸、丙酮、乙腈、苯、1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、叔丁醇、四氯化碳、氯苯、氯仿、环己烷、1,2-二氯乙烷、二甘醇、二***、二甘醇二甲醚(二乙二醇二甲基醚)1,2-二甲氧基-乙烷(甘醇二甲醚，DME)二甲基-甲酰胺(DMF)二甲亚砜(DMSO)、1,4-二噁烷、乙醇、乙酸乙酯、乙二醇、甘油、庚烷、六甲基磷酰胺(HMPA)、六甲基亚磷酸三酰胺(HMPT)、己烷、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE)、亚甲基氯、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、硝基甲烷、戊烷、石油醚(石脑油(ligroine))、1-丙醇、2-丙醇、吡啶、四氢呋喃(THF)、甲苯、三乙胺、邻二甲苯、和间二甲苯。
无机溶剂的非限制性实例包括氨、液态二氧化硫、磺酰氯、氯氟磺酰、磷酰氯、四氧化二氮、三氯化锑、五氟化溴、氟化氢、纯硫酸和其他无机酸。
非极性溶剂的非限制性实例包括戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯、1,4-二噁烷、氯仿、二***和二氯甲烷(DCM)。
极性溶剂的非限制性实例包括四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、二甲亚砜(DMSO)、硝基甲烷、碳酸丙烯酯、氨、甲酸、正丁醇、叔丁醇、异丙醇(IPA)、正丙醇、乙醇、甲醇和乙酸。
非质子极性溶剂的非限制性实例包括四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、二甲亚砜(DMSO)、硝基甲烷和碳酸丙二酯。
质子极性溶剂的非限制性实例包括氨、甲酸、正丁醇、叔丁醇、异丙醇(IPA)、正丙醇、乙醇、甲醇和乙酸。
醇的非限制性实例包括叔戊醇、苄醇、1,4-丁二醇、1,2,4-丁三醇、丁醇、2-丁醇、正丁醇、叔丁醇、变性醇、二甘醇、乙醇、乙二醇、2-乙基己醇、糠醇、丙三醇、异丁醇、异丙醇、甲醇、2-(2-甲氧基乙氧基)乙醇、2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、2-戊醇、1,3-丙二醇、1-丙醇和丙二醇。
可以以约1％v/v至约70％v/v，例如约5％v/v至约60％v/v、约10％v/v至约50％v/v、约20％v/v至约40％v/v、或约33％v/v的最终浓度将非水性溶剂加入样品中。高于和低于这些值的量都是可以接受的。
如本文所用，“疏水的”是指在室温(20℃)下在蒸馏水中的平均溶解度小于1mg/ml的化合物，例如在室温下在蒸馏水中的平均溶解度小于100μg/ml的化合物。本发明的澄清方法可以与含有分析物的样品一起使用，所述分析物在室温下在蒸馏水中的平均溶解度小于1mg/ml，或者在室温下在蒸馏水中的平均溶解度小于100μg/ml。例如，本发明的澄清方法可以与含有孕酮或作为分析物的其他疏水性化合物的样品一起使用。孕酮在室温下在蒸馏水中的平均溶解度为16.8μg/ml。
本发明的澄清方法可以与作为分析物的任何类固醇激素使用。合适的类固醇激素包括皮质类固醇、性类固醇。合适的类固醇激素包括天然类固醇激素和合成类固醇激素。类固醇激素的非限制性实例包括睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、二氢睾酮、醛固酮、***、***、雌酮、雌三醇、皮质醇、骨化三醇(1,25-二羟基维生素D3)、骨化二醇(25-羟基维生素D3)、阿氯米松、强的松、***、去炎松、可的松、氟氢可地松、双氢速甾醇、氧雄龙、羟勃龙、睾酮、诺龙、己烯雌酚(DES)、***、炔诺酮、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸环丙孕酮、米非司酮、和孕三烯酮、等等。
澄清方法还可以与本文所述的任何其他分析物或其他分析物类型等一起使用。
通常，本发明的分析物包括有机分子、无机分子、生物大分子(例如，蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸)、生物单体(氨基酸、脂肪酸、单糖、核苷酸)、合成的小分子和其组合等。分析物可以是抗体、抗原、激素、营养素、毒素或具有任何其他类型功能的任何其他类型的分子。如本文所用，“抗原”是指与抗体特异性结合的任何分子。抗原的特定子集是在宿主生物体中诱导免疫应答(产生抗体)的分子。分析物可以是病原体的抗原。
如上所述适当处理的样品可用于任何基于荧光的测定。“基于荧光的测定”是指涉及检测从样品发射的荧光的任何测定。实例包括荧光显微镜、荧光寿命成像显微镜(FILM)、荧光免疫测定(ELFIA)、荧光微板测定、荧光共振能量转移或Forster共振能量转移(FRET)、荧光生物传感(荧光葡萄糖生物传感器)、荧光各向异性(FA)、荧光偏振测定(FPA)等。
FPA和其他基于荧光的方法涉及在样品中添加示踪剂。如本文所用，“示踪剂”与“分析物示踪剂”同义使用，并且是指能够结合分析物或与分析物竞争结合共同配体的任何荧光化合物。示踪剂的添加可以通过直接与分析物结合或经由多种测定形式与分析物竞争结合配体来表明样品中分析物的存在。直接与分析物结合的示踪剂在本文中称为“直接示踪剂”。与分析物竞争结合共同配体的示踪剂在本文中称为“间接示踪剂”。本文使用的“配体”是指给定化合物的任何结合伴侣。分析物和间接示踪剂竞争结合的配体在本文中称为“竞争配体”。
示踪剂可包含结合部分和荧光部分。结合部分是示踪剂与分析物或配体结合的部分。荧光部分是示踪剂发荧光的部分。荧光部分可以化学缀合至结合部分，或者在蛋白质示踪剂的情况下，可以表达为与结合部分的融合蛋白。
直接结合至分析物的结合部分在本文中称为“直接结合部分”。示例性的直接结合部分可以包括抗体(针对例如，抗原分析物)、抗原(针对例如，抗体分析物)和被配置为与分析物结合的适体。与分析物竞争结合竞争配体的结合部分在本文中称为“竞争性部分”。示例性竞争性部分包括分析物的标准品(例如，分析物的合成版本或纯化版本)和被配置为结合竞争配体的适体，等等。
荧光部分可以包含任何荧光团。“荧光团”是指可以在光激发后重新发光的任何化学化合物。荧光团可以包括荧光蛋白或非蛋白荧光团。荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)等。非蛋白荧光团的实例包括氧杂蒽衍生物，例如荧光素、若丹明，俄勒冈绿(Oregon green)、曙红和德克萨斯红(Texas red)；花菁衍生物，例如花菁、吲哚碳菁(indocarbocyanine)、氧杂碳菁(oxacarbocyanine)、硫代碳菁(thiacarbocyanine)和部花菁(merocyanine)；方酸衍生物和环取代方酸，例如Seta、SeTau和Square染料；萘衍生物，例如丹酰和氟硅酸钠(prodan)衍生物；香豆素衍生物；噁二唑衍生物，例如吡啶基噁唑，硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑；蒽衍生物，例如蒽醌(DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙)；芘衍生物，如级联蓝；噁嗪衍生物，例如尼罗红，尼罗蓝，甲酚紫和噁嗪170；吖啶衍生物，例如二氨基吖啶、吖啶橙、amd吖啶黄；芳基次甲基衍生物，如金胺、结晶紫和孔雀石绿；和四吡咯衍生物，例如卟吩、酞菁和胆红素。
一些基于荧光的测定包括添加没有竞争配体的示踪剂。这些测定通常采用直接示踪剂。一些基于荧光的测定包括添加示踪剂和竞争配体。这些测定通常采用间接示踪剂。在以下实例中描述了使用直接示踪剂或间接示踪剂与竞争配体组合的示例性基于荧光的测定。
将示踪剂或示踪剂和竞争配体添加到样品中后，检测从示踪剂发出的荧光。检测来自样品中的示踪剂的荧光可以使用多种测定形式中的任何一种来指示样品中分析物的量。取决于测定形式，检测到的荧光的振幅、荧光的波长和/或荧光的偏振可以指示样品中分析物的量。例如，在某些测定中，未结合的示踪剂可以被洗涤或去除，并且检测到的荧光的振幅可以指示样品中分析物的量。在诸如FRET的测定中，荧光的波长可以指示样品中分析物的量。在诸如FPA的测定中，荧光的偏振可指示样品中分析物的量。在以下实例中讨论了采用FPA的各种示例性测定。“分析物的量”可以指样品中存在的分析物的量的定量指示或定性指示。在一些版本中，“分析物的量”可以仅指示样品中分析物的存在或不存在。
一些荧光团对pH敏感。因此，在检测之前，本发明的一些方法包括将样品缓冲至合适的pH以从荧光团发射荧光。为了使用荧光素作为荧光团，例如，优选将样品缓冲以具有pH约6.5至约8.5。
除了本文描述的方法之外，本发明的其他方面包括本文描述的任何试剂或试剂的组合，无论是单独提供还是作为试剂盒而组合提供。
例如，本发明的试剂盒可包括阴性对照、阳性对照、示踪剂、样品稀释剂、RBP、凝乳酵素、澄清添加剂或其任何组合。阴性对照优选包括缺乏分析物的物质。阳性对照优选包括含有分析物标准品的物质。阴性对照和阳性对照优选由相同的物质构成，除了存在或不存在分析物。样品稀释剂可以是适合于将样品缓冲至合适的pH值以使荧光团发荧光的缓冲液。取决于下游应用，澄清添加剂可包含凝乳酵素。阴性对照、阳性对照、示踪剂、RBP、凝乳酵素中的任何均可以固体(冻干粉或干粉等)或液体形式(以溶剂等)提供。试剂盒可包括用于根据本文提供的方法使用的使用说明书。
无论是否明确描述，本文所述的要素和方法步骤都可以以任何组合使用。
除非另有说明或在进行所引用的组合的上下文中明显相反地暗示，否则本文所使用的方法步骤的所有组合可以以任何顺序执行。
除非上下文明确指示其他含义，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”、“所述”包括复数指示物。
无论是否具体披露，本文所使用的数值范围旨在包括该范围内包含的每个数字和数字子集。此外，这些数值范围应被解释为针对该范围内的任何数字或数字子集的权利要求提供了支持。例如，从1到10的披露应该解释为支持2至8、3至7、5至6、1至9、3.6至4.6、3.5至9.9等范围。
本文引用的所有专利、专利公开和经过同行评审的出版物(参考文献)均通过引用明确地并入，就好像每个单独的参考文献被具体地且单独地指示通过引用并入一样。在本披露与所并入的参考文献之间发生冲突的情况下，以本披露为准。
应当理解，本发明不限于本文示出和描述的部分的特定构造和布置，而且包括落入权利要求范围内的其修改形式。
实例
实例1荧光偏振
荧光偏振原理
荧光偏振涉及通过激发的荧光分子来测量发射光的偏振。它用于提供有关分子大小和能量的信息。分子越大，发射光的偏振越高。
图1示出了显示荧光偏振的示意图。当荧光分子(荧光团)吸收偏振光束时，会发射出消偏振光。在仅几纳秒(10-9秒)的光吸收期间，分子将进入“激发态”，此后它将发出不同波长的光。该时期称为“荧光寿命”，其定义为激发光子的吸收与通过荧光发射光子之间的时期。溶液中的颗粒具有运动，这称为布朗运动。在荧光寿命的几纳秒内，当小至荧光团(如荧光素)的颗粒旋转时，这会改变接收到的偏振光的平面。如果分子与显著更大尺寸的受体(如抗体)结合，则荧光团使偏振光消偏振的能力将大大降低，因为增加的抗体分子质量(示踪剂+抗体)将在荧光寿命期间大大降低分子旋转。这意味着原始平面偏振光的更少消偏振。
偏振测定是均匀的；不需要分离游离的和结合的配体。不需要放射性同位素。荧光偏振测定是可重现的，且是不费力自动化的。除了使用不同种类的荧光团(包括合成荧光团)外，这使荧光偏振测定的费用也比以前便宜。
荧光偏振仪通常测量在两个平面上发射的荧光：平行和垂直于入射的激发光。这允许测量在荧光寿命期间能够转动90度的分子的数量，以及评估分子大小的变化。如下面进一步详细讨论的，在公式中使用每个平面中的荧光量来计算偏振单位(mP)。每个平面中的荧光强度以相对荧光单位(RFU)测量，该单位代表光子计数或光强度。因为荧光偏振取决于样品中发射光的精确测量，所以重要的是样品在光学上是中性的，并且因此没有颗粒和背景。颗粒会使光消偏振，并导致错误的测量结果。本发明的方法极大地提高了用于荧光偏振测定的样品的澄清度。
竞争性荧光偏振测定
荧光偏振测定(FPA)的一个类型是竞争性荧光偏振测定(cFPA)。在该测定平台中，主要包括三个组分：
1)未知量的分析物；
2)已知量的示踪剂(与分析物相同但用荧光团标记的化合物)；以及
3)针对示踪剂/分析物的已知量的抗体(例如单克隆抗体)。
竞争性测定的原理是样品中的分析物分子与示踪剂竞争结合抗体。在低浓度的分析物的情况下，大多数或全部示踪剂都与单克隆抗体结合，导致高偏振。在高浓度的分析物的情况下，示踪剂保持未结合状态，导致低偏振。偏振反向地取决于分析物的浓度。参见例如美国专利号6,812,036，其作为cFPA的实例通过引用以其全文并入本文。
荧光偏振测定测量和结果
在荧光偏振中，进行两次测量。参考图2，用第一偏振滤光器2(偏振滤光器A)使光1(例如485nm)偏振。然后，它撞击样品4并引起与入射光平行定向的示踪分子的荧光。然后它们发射出例如约525nm的光子。光子穿过第二偏振滤光器5(偏振滤光器B)，该滤光器定向平行于第一滤光器2并撞击对光子计数的光子计数器6。该读数称为“平行”或“竖直”(V)读数。
然后，LCD光阀2将光线1的偏振切换90度，并使样品4中的示踪剂分子的荧光垂直于偏振滤光器2,5(偏振器A和B)。这些分子将由于布朗运动而转动，与第二偏振滤光器(偏振器B)平行的535-nm光子将通过光子计数器6。该读数称为“垂直”或“水平”(H)读数。如果发荧光的示踪剂分子具有大量能量并快速转动，则其中的许多分子将转动90度，这将导致竖直(V)和水平(H)位置的读数相似。
应用公式来计算在两个平面中计数的光子比率。该比率的单位是任意的，称为毫-P或mP。该公式为：
mP＝(V-H)/(V+H)*1000
将校正因子应用于水平读数，该水平因子用于标准化不同仪器之间的读数。这称为“G因子”。具有校正因子的公式如下：
Mp＝(V-H*G)/(V+H*G)*1000
在获取上面概述的V和H荧光团读数之前，先获取样品的V和H空白读数，然后分别从V和H荧光团读数中减去。在典型流程中，在将荧光示踪剂添加到混合物中之前获取空白读数。表1中示出了使用本发明的方法进行这些测量的结果的实例。
表1.FPA读数实例
如果空白读数比表1所示的读数高50-100倍，例如约1,000,000，那么荧光团的任何读数都将被巨大的背景遮盖。这将产生不可靠的mP结果。本发明的至少一方面通过减少核黄素荧光消除了样品背景的影响。
实例2：使用荧光偏振技术检测乳样品中的孕酮水平
概要
孕酮是调节哺乳动物生殖周期的最重要激素之一。孕酮水平可能是发情的指标，因此也可能是妊娠以及某些病理学的指标。先前已经进行了多次尝试来创建用于检测牛的乳样品中的孕酮水平以帮助畜群生殖性能的测定或方法。这些先前的尝试仅部分有效，因为所有测定均难以执行且不准确。不准确的主要原因之一是孕酮分子的疏水性，这需要溶剂来提取并将孕酮保持在溶液中。由于相同的原因，该分子抵抗结合许多先前测定中使用的固相，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和侧向流动测定。
本实例描述了一种荧光偏振法，用于检测奶牛的乳样品中的孕酮。该测定是均相的，不需要固相，并且可以在存在溶剂的情况下成功完成。较早尝试(Hong等人，2002)开发在乳中基于荧光偏振的测定，由于以下三个原因，导致方法灵敏度不足。第一个原因是乳样品的pH值可变，这导致测定中使用的荧光团淬灭。第二个也是更重要的原因是由于核黄素的高浓度导致乳样品的高自然荧光(背景)。第三个原因是酪蛋白分子对光的散射和乳样品的不透明性。
本文描述的示例性方法解决了所有上述障碍，并在测量孕酮浓度时产生了准确的结果。该方法使用非水性极性溶剂(例如醇)提取并保持孕酮在溶液中，使用通过乳凝结酶产生的乳清澄清乳样品，并通过例如离心和/或过滤分离，通过使用核黄素结合蛋白或将样品暴露于强光源下来淬灭背景荧光，并使用强缓冲液稳定乳的pH。降低背景荧光允许使用高浓度的样品，这导致非常高的灵敏度。所产生的灵敏度足以可靠地检测孕酮的生理浓度。
背景
当今的奶牛场承受着越来越高的保持高生产率的压力。美国的奶牛产乳量从2007年的每头奶牛20,204升增加到2016年的每头奶牛22,775升(USDA数据)。同时，产犊后第一次授精后妊娠的奶牛比例从19世纪50年代的50％下降到如今的仅33％。这种下降的原因是高产乳，这会对动物的新陈代谢产生压力，从而降低其生殖能力。许多动物没有发情迹象(安静发情)，因此很难确定最佳授精时间。现在比以往任何时候都需要技术来帮助农民做出这些决定。
理想的技术应该是可以在现场(奶牛旁边)进行并且可以产生准确且可重复的结果的简单测试。
作为周期调节剂的孕酮
类固醇激素孕酮(P4)在与建立和保持动物妊娠有关的生殖事件中起关键作用。它的主要作用是调节发情周期。
奶牛的平均发情周期长度约为21天，但发情周期可以在17到24天之间变化，并且仍被认为是正常的。发情周期的长度测量为两次连续发情或发情期之间的时间。雌性在发情周期中发生的生理和激素变化为发情(性接受期)、***(卵子释放)和着床(受精卵与子宫的附着)准备生殖道。
在周期的第一天，奶牛处于发情并且准备受精。此时奶牛的孕酮水平低，并且***水平高。在***的作用下，子宫颈会轻微扩张，并且***的粘性会降低，从而使***更容易渗透。
在接下来的五天内，黄体的大小和孕酮分泌能力均迅速增长。颗粒细胞和鞘细胞，现在称为黄体，继续迅速***，并从分泌***的细胞转变为分泌孕酮的细胞。孕酮刺激子宫产生子宫乳，从而滋养受精卵或胚胎。
从第6天到第16天，黄体继续发育并在第10天到第12天达到其最大生长和功能。成熟的黄体产生的孕酮的循环水平很高，并抑制******激增的发展。
从第16天到第19天，如果动物不怀孕，由于子宫分泌***素F2a，黄体开始退化或死亡。血流中的孕酮水平迅速下降。
在第19-20天，由迅速生长的卵泡产生的***水平上升，这刺激了生殖道为静立发情做好准备。
孕酮分子的化学结构和特征
孕酮是类固醇激素。类固醇是一组属于脂质类别的天然或合成的脂溶性有机化合物并且特征是四个稠环(共17个碳原子)的分子核心：三个六碳环和一个五碳环稠合在一起。类固醇的类型取决于三维构型以及其他侧链和环的类型。孕酮是一种类型的孕激素，是性类固醇的一个子集，雄激素和***是其他主要的性类固醇。
孕酮含有酮和氧化的官能团，以及两个甲基分支。像所有类固醇激素一样，孕酮是疏水的。这主要是由于不存在极性官能团。
像所有其他类固醇激素一样，孕酮是由孕烯醇酮(一种胆固醇的衍生物)合成。此转换以两个步骤发生。3-羟基基团转化为酮基，并且双键从C-5移至C-4。见图3。
使用荧光偏振技术检测乳中孕酮的优势
有效的畜牧生产需要准确的早期妊娠检测。妊娠诊断是大多数奶牛场生殖计划的重要组成部分。找到空怀奶牛是妊娠诊断中最重要的方面。妊娠奶牛不需要进一步的生殖关注。
早期妊娠诊断的主要优势是能够更快地找到空怀奶牛，并使这些奶牛重新进入当前的农场生产***。农场中的发情检测越差，考虑早期妊娠诊断就越重要。畜群健康检查之间的时间间隔也影响早期妊娠诊断的优势。尽早鉴定未妊娠的牛非常重要，因为对这些未妊娠的牛进行不同的处理提供妊娠测试的经济利益。
本文所述的简单而快速的孕酮测试可用于检测乳中的低孕酮水平，并且从而鉴定在人工授精后未能妊娠的奶牛。这样可以减少奶牛的空怀期，并避免失去一个或多个发情周期。
作为荧光偏振技术的样品的乳
从奶牛的处理方面，本文所述基于乳的妊娠测试的使用减少了强加给动物的压力量。乳样品可以在室内采集，而无需对员工进行特殊培训。与基于血液的妊娠测试相比，采集这些样品不需要使用针来收集样品。
由于可以在室内采集样品，因此无需将奶牛关起来，从而消除了奶牛休息和进食时间方面的任何其他干扰。本文所述的基于乳的测试提供了一种确认妊娠的非侵入性方式，同时消除了其他妊娠诊断方法的额外人工需求。
此外，乳制品生产商可以在考虑应采集乳样品进行妊娠检测的时间范围和频率的情况下制定适用于其个体操作的规程。
但是，作为样品的乳由于其自发荧光，先前已经在基于荧光的测定中引起了问题。自发荧光降低了信噪比，这在区分低浓度分析物(如孕酮)的微弱信号与背景荧光方面产生了问题。核黄素，也称为维生素B2，是乳清自发荧光的主要原因。乳中核黄素的浓度范围为每升0.6至3.42mg。在像乳这样的水性溶液中，当暴露于可见光和紫外线下时，所有形式都是不稳定的。
孕酮检测方面的挑战
孕酮分子是疏水性分子(高度不溶于水)，因此，在简单的实验室环境中很难检测到。
ELISA测试取决于将分析物固定在固相上并洗去未结合的底物。为了固定化，使用高度特异性的单克隆抗体。在诸如孕酮的疏水性分子的情况下，固定化方法可能在分子与固相间接结合的阶段失败，或者在去除不需要的底物期间洗掉分子。以受过较少培训的技术人员的水平，此方法通常会导致孕酮水平的检测不准确。从历史上看，这已导致对孕酮测定的信心丧失。先前发表的论文表明对于检测孕酮，FPA测定缺乏一致性并且灵敏度低。参见Varriale等人2015和Hong等人2002。
用于澄清和孕酮提取的乳的处理
在进行FPA之前，要对乳样品进行处理以产生乳清(乳浆)。含有三平根毛霉凝乳酵素酶的缓冲液可用作该方法的动物凝乳酵素替代品。三平根毛霉酶在不同温度下非常稳定，并且在本文提供的示例性温度和时间段内不降解乳中的抗体或其他蛋白质分析物。用三平根毛霉酶进行处理使乳中的酪蛋白凝结，然后可以去除凝结的酪蛋白以产生乳清。乳清是透明的，适合用于用基于荧光的测定进行测试。
在本实例中，含有三平根毛霉凝乳酵素酶的示例性缓冲液称为“澄清乳缓冲液(ClearMilk Buffer)”。澄清乳缓冲液是pH 5.8的磷酸盐缓冲液盐水(PBS)，其中三平根毛霉凝乳酵素酶的含量为750IMCU/ml(国际乳凝结单位/毫升)。
对于分析物，例如孕酮或其他疏水性分析物，澄清方法中非水性溶剂的存在对于将分析物保持在乳清中并防止其与凝结的酪蛋白或脂质分离是重要的。非水性溶剂可包括非水性极性溶剂。非水性极性溶剂可包含醇。所述醇可包含乙醇。
为了产生用于检测孕酮的乳清，将乙醇添加到乳中至最终浓度为约33％v/v。将澄清乳缓冲液以约1:16(澄清乳缓冲液:乳/醇混合物)的体积比添加到乳/醇混合物中。然后将得到的混合物(图4)在指定的温度下孵育指定的时间长度，并牢固的酪蛋白凝块形成。然后将混合物在微量离心机中以约10,000x g离心5分钟。此方法将混合物分为三层(图5)：(1)底部的酪蛋白凝块；(2)中间的澄清的乳清；和(3)顶部有薄脂质层。或者，将混合物通过过滤注射器过滤以产生乳清。然后将所得的乳清用于检测孕酮。如下文进一步详细描述，醇的存在对于保持孕酮在乳清中而不是在例如，酪蛋白层或脂质层中是重要的。
乳样品的pH值变化及其对测试结果的影响
奶牛的新鲜乳的pH通常在6.5至6.7之间(略酸性)。乳的pH值会随着时间变化。随着乳发酵，它变得更酸性，pH降低。这是由于乳中的细菌将乳糖转化为乳酸而发生。在奶牛患有乳腺炎的情况下，乳的pH值较高(更碱性)。pH的这些差异对于FPA非常重要，因为pH影响荧光团(示踪剂)荧光。酸性或碱性pH值会降低(淬灭)荧光团的荧光强度，从而使大部分活性分子无法检测到。荧光素的理想pH约为7.5。强缓冲液可用于补偿不同乳样品中的pH变化，这对于避免结果变化性很重要。示例性缓冲液是具有1M Tris pH 7.7(具有0.1％(v/v)EDTA)，其可以缓冲液:乳清体积比约为2.3:1使用。
孕酮示踪剂制备
本文描述的用于检测孕酮的示例性FPA测定是竞争性FPA(cFPA)测定。使用由Hong等人，2002描述的程序来制备用于此测定的经荧光标记的孕酮示踪剂。孕酮-3-(0-羧甲基-肟)(P-3CMO)的羧基与荧光素酰胺标记(FAM)的胺基团偶联，得到稳定的酰胺基团。使用薄层色谱(TLC)(使用以体积比4:1(溶剂:示踪剂)的CHCl3:CH3OH作为溶剂)纯化孕酮示踪剂。使用单克隆抗体测试孕酮示踪剂的功能性。孕酮示踪剂的浓度设置为与在0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中的1nM荧光素的荧光强度匹配。在参考
(埃利公司(EllieLLC)，沃基肖(Waukesha)，威斯康星州)200仪器上，在1ml样品稀释剂中的十微升孕酮示踪剂的强度约为100,000相对荧光单位(RFU)。由于荧光是以相对荧光单位描述的，因此使用同一台仪器检查示踪剂和乳清样品的荧光强度以确定浓度。在80％(v/v)DMSO加20％(v/v)0.01M PBS(pH 7.3)中制备即用型孕酮示踪剂。
单克隆抗体
针对孕酮的单克隆抗体(货号MBS633645)购自Mybiosource公司(Mybiosource,Inc.)(圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)。该抗体的免疫原是小鼠中的孕酮-11a-半琥珀酸酯。该抗体可用于识别所有物种的孕酮。它表现出与下列类固醇的最小交叉反应性：17a-羟基孕酮(0.8％)；3b-羟基娠-5-烯-20-酮(<0.1％)；20a-二氢孕酮(0.1％)；睾酮(<0.1％)；17b-***(<0.1％)；和皮质醇(<0.1％)。抗体的同种型是IgG1,k。抗体的克隆号为0.N.521。
通过核黄素的光降解减少背景
光辐照源的发射特性在核黄素的光降解中起重要作用。暴露后仅30分钟内，乳中的核黄素会被阳光破坏约30％。在黑暗中，核黄素稳定并在指定条件下长时间保持不变。在干燥形式下，核黄素受光的影响很小，而在溶液形式下，它在需氧和厌氧条件下会通过各种反应迅速降解为各种光产物。UV和可见光谱负责核黄素的光降解，但是当核黄素暴露于UV时，产生大量光产物，并且背景不会下降。只有可见光谱降解核黄素，还有高荧光背景。核黄素光降解涉及的反应包括光还原、光加成和光脱烷基化作用。在开发中的光降解方法中，使用了不同的光源。这些范围从LED二极管到氙气灯。结果与来源无关(例如在低背景荧光下核黄素降解)，唯一的区别是完成该过程所需的时间。
光降解的示例性方法如下进行。将不同量的乳清在1.5ml微量离心管中用缓冲液稀释，并置于室内进行光照处理。在此过程中，抗体和其他分子(如孕酮)在溶液中保持稳定，而乳清中乳白蛋白和乳球蛋白沉淀。光处理后，将样品在微量离心机中离心。所得的上清液可用于任何类型的荧光偏振测定。完整程序如下所述：
1.在
(埃利公司，沃基肖，威斯康星州)200仪器上，在80％DMSO，20％0.01M PBS pH 7.3中准备即用型孕酮示踪剂，荧光强度约为108,000RFU；
2.在0.01M PBS pH 7.3中准备稀释度为1:130(体积:体积)的即用型抗孕酮抗体；
3.通过将萃取中使用的一份溶剂(99.9％醇)和9份样品稀释剂(1M Tris缓冲液pH7.7和0.1％EDTA)混合，制备对照稀释剂；
4.混合一小部分测试样品作为阴性对照；
5.将1.5ml乳作为阴性对照转移到三个微量离心管中；
6.将1ml乳样品转移到微量离心管中；
7.在具有样品的微量离心管中加入500μl溶剂(99.9％醇)；
8.在含有对照和样品的所有试管中加入60μl澄清乳缓冲液；
9.充分混合；
10.在室温下孵育10分钟；
11.在+4℃下孵育15分钟；
12.将对照和样品以10,000x g离心5分钟；
13.在新的微量离心管中混合400μl样品和对照以及1000μl 1M Tris缓冲液pH7.7(具有0.1％EDTA)；
14.在光处理室中孵育样品和对照30分钟；
15.在微量离心机中以10,000x g离心样品和对照5分钟；
16.将1ml上清液转移到硼硅酸盐玻璃管中；
17.在含有对照和样品的所有试管中加入10μl抗体；
18.充分混合；
19.在室温下孵育5分钟；
20.读取空白；
21.在含有对照和样品的所有试管中加入10μl孕酮示踪剂；
22.充分混合；
23.孵育15分钟；
24.读取孕酮示踪剂并获得mP值；
25.计算ΔmP值。
表2显示了不同波长的光对样品自发荧光的影响。用荧光计以相对荧光单位(RFU)测量用不同波长的光处理过的样品的背景荧光。如所示，蓝色光谱中的可见光在减少样品背景荧光方面最有效。因此，在进一步的实验中，我们使用了基于具有亮光谱的LED的强光源，该强光源在蓝色光谱中具有峰值波长。
表2.不同光波长对样品背景自发荧光的影响。
使用核黄素结合蛋白(RBP)减少背景荧光
为了测试RBP对淬灭乳清中自发荧光的作用，在缓冲液中稀释不同量的乳清并添加RBP。足以淬灭自发荧光的RBP浓度取决于测试中所用乳清的量。完全清除1ml乳清中的核黄素荧光所需的最低RBP量为八百五十微克。RBP和核黄素之间的反应几乎是瞬时的，并且该样品能够用于任何类型的FPA测定。
表3显示了光降解和RBP处理之间在降低含乳清样品中的自发荧光方面的比较。
表3.光降解和RBP处理之间在降低含乳清样品中的核黄素自发荧光方面的比较。
RBP处理和光降解的效果对于减少自发荧光相当。在这方面，RBP处理由于其简单和节省时间是优选的方法。但是，本文所述的采用RBP处理的任何实施例可以使用光降解代替RBP处理。
孕酮掺加样品的初步测试
使用掺加不同浓度的孕酮标准品(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)P0130-25G)的无孕酮样品来测试用cFPA对乳清中孕酮的检测。乳清是在无醇溶剂的情况下从明显发情的奶牛的乳样品中制备。然后通过放射免疫测定(RIA)测试该乳清液中的孕酮，这显示样品中的孕酮水平达不到检测水平(0.19ng/ml)。然后在乳清中掺加2、4、6、8和10ng/ml的孕酮。测试的完整程序如下所述。
1.在
(埃利公司，沃基肖，威斯康星州)200仪器上，在80％DMSO，20％0.01M PBS pH 7.3中准备即用型孕酮示踪剂，荧光强度约为108,000RFU；
2.在0.01M PBS pH 7.3(含有浓度为28.5mg/ml的核黄素结合蛋白)中准备稀释度为1:130(体积:体积)的即用型抗孕酮抗体；
3.将1ml乳样品转移到6个微量离心管中；
4.在含有样品的所有试管中加入60μl澄清乳缓冲液；
5.充分混合；
6.在+4℃下孵育15分钟；
7.将样品以10,000x g离心5分钟；
8.乳将分为三层：
·在顶部的脂质层；
·中间的乳清；
·在底部的酪蛋白；
9.将每个管的中间层的300ul乳清转移到硼硅酸盐玻璃管中；
10.添加700ul样品稀释液；
11.将10ul的2ng/10μl、4ng/10μl、6ng/10μl、8ng/10μl或10ng/10μl孕酮溶液(溶解在DMSO中的孕酮)掺加入硼硅酸盐玻璃管中
12.充分混合；
13.在含有样品的所有试管中加入10μl抗体；
14.充分混合；
15.在室温下孵育5分钟；
16.读取空白；
17.在含有样品的所有试管中加入10μl孕酮示踪剂；
18.充分混合；
19.孵育5分钟；
20.读取孕酮示踪剂并获得mP值；
21.计算ΔmP值。
孕酮FPA测定在检测极低浓度的孕酮(例如，低至1ng/ml)方面显示出很高的灵敏度。如表4所示，它也显示出极低浓度的分析物之间的大偏振差异。
表4.竞争性孕酮FPA测定在检测乳中低孕酮浓度时的高灵敏度。
| 孕酮量ng/ml | 以mP值的FPA结果 |
| 0 | 273 |
| 2 | 200 |
| 4 | 173 |
| 6 | 160 |
| 8 | 148 |
| 10 | 142 |
孕酮FPA测试结果
测试了使用cFPA对现场乳样品的乳清中的孕酮的检测。本实验选择了五只不同年龄和生殖史的西门塔尔奶牛。该实验总共持续了33天。观察并检查所有奶牛的发情迹象、发情中卵泡的存在以及在周期的黄体阶段期间黄体的存在。使用PGF2α将奶牛1、2、3引入发情，而奶牛4和5自然进入周期。仅奶牛3被人工授精。所有其他奶牛都在不进行授精的情况下通过了整个周期。
奶牛的特征如下。奶牛1的年龄为四岁，具有延长的发情周期和明显发情，无生殖障碍。奶牛2的年龄为两岁半，具有安静发情。奶牛3的年龄为十二岁，具有低受胎率，原因是产犊期间子宫右角受伤。在该实验中对奶牛3进行了授精。奶牛4的年龄为6岁，具有正常的周期和发情迹象。奶牛5的年龄为16岁，具有延长的发情周期和正常发情迹象。使用竞争性孕酮FPA测定来测量孕酮水平，并以ΔmP单位记录结果。ΔmP使用以下公式计算：
ΔmP＝平均阴性对照mP值-样品mP值
测试程序如下：
1.在
(埃利公司，沃基肖，威斯康星州)200仪器上，在80％DMSO，20％0.01M PBS pH 7.3中准备即用型孕酮示踪剂，荧光强度约为108,000RFU；
2.在0.01M PBS pH 7.3(含有浓度为28.5mg/ml的核黄素结合蛋白)中准备稀释度为1:130(体积:体积)的即用型抗孕酮抗体；
3.通过将萃取中使用的一份溶剂(99.9％醇)和9份样品稀释剂(1M Tris缓冲液pH7.7和0.1％EDTA)混合，制备对照稀释剂；
4.混合一小部分测试样品作为阴性对照；
5.将1.5ml乳作为阴性对照转移到三个微量离心管中；
6.将1ml乳样品转移到微量离心管中；
7.在具有样品的微量离心管中加入500μl溶剂(99.9％醇)；
8.在含有对照和样品的所有试管中加入60μl澄清乳缓冲液；
9.充分混合；
10.在室温下孵育10分钟；
11.在+4℃下孵育15分钟；
12.将对照和样品以10,000x g离心5分钟；
13.在新的微量离心管中混合400μl样品和对照以及1000μl 1M Tris缓冲液pH7.7(具有0.1％EDTA)；
14.在光处理室中孵育样品和对照30分钟；
15.在微量离心机中以10,000x g离心样品和对照5分钟；
16.将1ml上清液转移到硼硅酸盐玻璃管中；
17.在含有对照和样品的所有试管中加入10μl抗体；
18.充分混合；
19.在室温下孵育5分钟；
20.读取空白；
21.在含有对照和样品的所有试管中加入10μl孕酮示踪剂；
22.充分混合；
23.孵育15分钟；
24.读取孕酮示踪剂并获得mP值；
25.计算ΔmP值。
结果在图6-10中显示。检测到的孕酮水平能够准确地表征未妊娠奶牛的发情周期。
非水性溶剂在乳澄清过程中保持乳清中孕酮的益处
测试了在乳澄清过程中非水性溶剂(例如乙醇)的存在对保持乳清中孕酮的重要性。如上文所述，在有乙醇和没有乙醇的情况下，对来自妊娠奶牛的乳样品进行澄清，并测试所得的乳清中是否存在孕酮。通过兽医检查确认每头奶牛的妊娠。结果在表5中显示。
表5.在有乙醇和没有乙醇的情况下对孕酮的FPA检测
如表5所示，在制备过程中缺乏乙醇的样品显示出与阴性对照相似的结果，表明在这些样品中在澄清过程中孕酮未与乳清分离。放射免疫测定(RIA)结果证实，孕酮最初存在于乳样品中。因此，乙醇或其他非水性溶剂对于保持乳清中的孕酮以用于下游检测是重要的。
乳凝结过程中孵育时间和温度的影响
本实验的目的是比较两种酪蛋白凝结方案用于孕酮FPA测定。两种方案之间的差异包括添加澄清乳缓冲液后的孵育时间和温度。
在该实验中使用了两个乳样品。1号样品来自发情奶牛。奶牛的发情状态通过现场兽医临床检查证实。2号样品来自妊娠奶牛。奶牛的妊娠状态通过现场兽医临床检查证实。
凝结方案1
1.处理前将样品充分混合；
2.将1.5ml乳样品添加到四个微量离心管中作为对照；
3.向微量离心管中加入1ml乳样品作为样品；
4.在样品管中加入0.5ml无水乙醇；
5.充分混合；
6.将40μl澄清乳缓冲液添加到所有对照管和样品管中；
7.立即充分混合；
8.在2-8℃下孵育15分钟；
9.以10,000x g(13,000rpm)离心5分钟；
10.乳将分为三层：
·在顶部的脂质层；
·中间的乳清；
·在底部的酪蛋白；
11.使用乳清进行FPA测定。
凝结方案2
1.处理前将样品充分混合；
2.将1.5ml乳样品添加到四个微量离心管中作为对照；
3.向微量离心管中加入1ml乳样品作为样品；
4.在样品管中加入0.5ml无水乙醇；
5.充分混合；
6.将40μl澄清乳缓冲液添加到所有对照管和样品管中；
7.立即充分混合；
8.在室温下孵育5分钟；
9.以10,000x g(13,000rpm)离心5分钟；
10.乳将分为三层：
·在顶部的脂质层；
·中间的乳清；
·在底部的酪蛋白；
11.使用乳清进行FPA测定。
FPA分析-两种样品处理方案的测试程序均相同：
1.小心地将300μl的对照和样品乳清吸移到试管中；
2.将700μl样品稀释液添加到所有对照管和样品管中；
3.使用前三个对照管作为阴性对照；
4.将10μl 1μg/ml孕酮溶液加到第四个对照管中作为阳性对照；
5.充分混合含有对照和样品的所有试管；
6.向含有样品和对照的所有试管中加入在0.01M PBS pH 7.3(含有浓度为28.5mg/ml的核黄素结合蛋白)中的10μl抗孕酮抗体(1:130(vol:vol))；
7.充分混合；
8.在室温下孵育5分钟；
9.获得样品和对照的空白读数；
10.向含有样品和对照的所有试管中加入10μl孕酮示踪剂(在
(埃利公司，沃基肖，威斯康星州)200仪器上，在80％DMSO，20％0.01M PBS pH 7.3中的即用型孕酮示踪剂，荧光强度约为108,000RFU)；
11.充分混合；
12.在室温下孵育5分钟；
13.获得所有样品和对照的mP读数；
14.计算ΔmP值。
结果在表6中显示。
表6.不同的样品处理方案下的FPA孕酮(PG)检测。
进行类似的实验，其中根据凝结方案2处理样品，除了在添加澄清乳缓冲液并混合后仅孵育1分钟。孕酮FPA结果与上述孵育时间为5分钟的结果相似。
这些实验表明，无需在4℃左右延长孵育时间，在室温下短至1-5分钟的孵育时间是可以接受的。
凝结的乳的离心相比于过滤
该实验的目的是针对乳澄清比较离心和过滤。
在该实验中使用了两个乳样品。1号样品来自发情奶牛。奶牛的发情状态通过现场兽医临床检查证实。2号样品来自妊娠奶牛。奶牛的妊娠状态通过现场兽医临床检查证实。
使用离心制备样品
1.处理前将样品充分混合；
2.向微量离心管中加入1ml乳样品；
3.在样品管中加入0.5ml无水乙醇；
4.充分混合；
5.向样品管中加入40ul澄清乳缓冲液；
6.立即充分混合；
7.在室温下孵育5分钟；
8.以10,000x g(13,000rpm)离心5分钟；
9.乳将分为三层：
·在顶部的脂质层；
·中间的乳清；
·在底部的酪蛋白；
10.使用乳清进行FPA测定。
使用过滤制备样品
1.处理前将样品充分混合；
2.将少量脱脂棉放入20ml锁注射器中，然后将其按到底；
3.向注射器中加入3ml乳清作为样品；
4.向含有样品的注射器中加入1.5ml无水乙醇，并剧烈振荡；
5.向含有样品的注射器中加入5滴澄清乳缓冲液并轻轻振荡；
6.将注射器在室温下直立放置，使乳凝结(5-15分钟)；
7.在注射器上安装0.22-μm，25-mm的聚醚砜注射器过滤器；
8.将乳推过注射器并过滤，并且获得清澈的乳清。
FPA分析-两种样品处理方案的测试程序均相同：
1.小心吸取300μl乳清样品到试管中；
2.将700μl样品稀释液添加到所有样品管中；
3.充分混合所有样品管；
4.向含有样品的所有试管中加入在0.01M PBS pH 7.3(含有浓度为28.5mg/ml的核黄素结合蛋白)中的10μl抗孕酮抗体(1:130(vol:vol))；
5.充分混合；
6.在室温下孵育5分钟；
7.获得样品的空白读数；
8.向含有样品和对照的所有试管中加入10μl孕酮示踪剂(在
(埃利公司，沃基肖，威斯康星州)200仪器上，在80％DMSO，20％0.01M PBS pH 7.3中的即用型孕酮示踪剂，荧光强度约为108,000RFU)；
9.充分混合；
10.在室温下孵育5分钟；
11.获得所有样品的mP读数；
12.计算ΔmP值。
结果在表7中显示。
表7.通过离心制备的乳清相比于通过过滤制备的乳清中的孕酮(PG)的FPA检测。
使用0.1-μm、0.45-μm、0.7-μm和组合0.45/0.22-μm过滤器进行了类似的实验，并且表明所有类型的过滤都是可以接受的。为了避免过滤过程中注射器柱塞产生过度阻力，优选使用0.7-μm过滤器。过滤足以从样品中去除凝结的酪蛋白和脂质，同时保持样品中的孕酮，以便使用FPA检测样品中的孕酮。
这些实验表明，在制备用于FPA的乳清中，可以使用过滤代替离心。
实例3：在流产布鲁氏菌的抗体检测中使用RBP降低背景荧光
背景
此实例表明，RBP可以在FPA的情况下降低背景荧光，从而确定单个或成批乳样品中针对布鲁氏菌属的物种(包括产生光滑菌落的物种(山羊布鲁氏菌(B.melitensis)、流产布鲁氏菌(B.abortus)和猪布鲁氏菌(B.Suis)-Rev.sci.tech.[科学技术综述],OIE1982))的抗体的存在。抗体的存在表明目前或最近受到布鲁氏菌感染。
本文所述的示例性诊断测试使用从与荧光素缀合的流产布鲁氏菌细菌中提取的O-多糖(OPS)作为示踪剂。参见Nielsen等人.1996；Nielsen等人.2000；和Nielsen等人.2001。荧光偏振仪用于测量OPS缀合物发射的光的偏振态。当不存在抗体时，偏振低。当抗体与示踪剂结合时偏振增加。
示例性FPA布鲁氏菌抗体检测试剂盒
示例性FPA布鲁氏菌抗体检测试剂盒如下：
阴性对照是溶解在0.01M PBS pH 7.2中的核黄素结合蛋白。阳性对照是来自APHA科学公司(APHA Scientific)(新楂(New Haw)，阿德利斯通(Addlestone)，萨里(Surrey)，英国)的多克隆抗流产布鲁氏菌抗体血清(RAB1003)。样品稀释液为1M Tris pH 7.7，含0.1％(v/v)EDTA。示踪剂是流产布鲁氏菌OPS-荧光素缀合物。澄清乳缓冲液是pH 5.8的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，具有750IMCU/ml三平根毛霉凝乳酵素。所有组分可以包含小于0.1％的叠氮化钠。
使用FPA检测布鲁氏菌抗体的材料，除了示例性试剂盒中材料外，还包括：FP仪器、10x 75mm硼硅酸盐玻璃试管、能达到10,000x g的微量离心机、1.5ml微量离心管、涡旋器、移液器和移液器吸头、以及蒸馏水或去离子水。
偏振读数受温度影响。测试中使用的所有试剂应与被测样品处于同一温度下。建议将所有试剂和样品置于室温下。
使用示例性FPA布鲁氏菌抗体检测试剂盒进行RBP处理和FPA检测布鲁氏菌抗体的方法
以下描述了使用上述材料的示例性RBP处理方法，该方法用于使用FPA使用
(埃利公司，沃基肖，威斯康星州)200仪器检测乳中的布鲁氏菌抗体。
脱脂乳样品：
有两种使乳样品脱脂的方法：
1.将2x 1.5ml的相同乳样品加入两个微量离心管中，并以约10,000x g的速度运行5分钟。脂质层将分离在顶部。小心收集脂质表面以下的层。
2.向注射器中添加10-50ml乳，并将其竖直放置过夜。脂质将分离在顶部。从注射器中射出脱脂乳。
澄清样品：
1.将1ml脱脂乳样品添加到两个单独的微量离心管中；
2.添加60μl澄清乳缓冲液，并通过摇动试管轻轻混合；
3.在室温下孵育10分钟，直到乳开始结块；
4.在每个微量离心管的凝块顶部缓慢加入300μl样品稀释液；
5.在微量离心机中以10,000x g离心10分钟。
制备对照：
1.吸取1ml样品稀释液到四个试管中，并向每个试管中加入1ml DI或蒸馏水；
2.使用前三个试管作为阴性对照；
3.将40μl阳性对照添加到第四个试管中，并充分混合。
运行测试：
1.从两个微量离心管中吸取1ml乳清到试管中，总体积为2ml；
2.向含有对照和样品的所有试管中加入20μl阴性对照(RBP，以85mg/ml的浓度溶于0.01M PBS pH 7.2中)；
3.充分混合；
4.在室温下孵育5分钟；
5.获得对照和样品的空白读数；
6.在含有对照和样品的所有试管中加入15μl示踪剂；
7.充分混合；
8.在室温下孵育30分钟；
9.获得对照和样品的mP读数。
测试验证：
阴性对照的读数应在70至90mP之间。阳性对照的读数应在120至250mP之间。如果阴性控制超出范围，则将仪器调整为以80±5mP读取平均阴性对照。视仪器而定，无需重新测试样品即可完成此操作。
结果与解释：
通过从样品mP中减去平均阴性对照mP来计算每个样品的ΔmP值。
ΔmP＝(样品mP-平均阴性对照mP)
根据以下参数解释测试结果：
成批乳样品：
阴性 阳性
≤10 >10
单个乳样品：
阴性 阳性
≤40 >40
使用示例性FPA布鲁氏菌抗体检测试剂盒进行光处理和FPA检测布鲁氏菌抗体的方法
以下描述了使用上述材料的示例性光处理方法，该方法用于使用FPA使用
(埃利公司，沃基肖，威斯康星州)200仪器检测乳中的布鲁氏菌抗体。
脱脂乳样品：
有两种使乳样品脱脂的方法：
1.将2ml乳加入微量离心管中，并且以约10,000x g的速度运行5分钟。脂质层将分离在顶部。小心收集脂质表面以下的层。
2.向注射器中添加5-50ml乳，并将其竖直放置过夜。脂质将分离在顶部。从注射器中射出脱脂乳。
澄清样品：
1.将1.5ml脱脂乳样品加入微量离心管中；
2.添加60μl澄清乳缓冲液并摇动试管轻轻混合；
3.在室温下孵育10分钟，直到乳开始结块；
4.在微量离心机中以10,000x g离心5分钟；
5.乳将分为三层：
·在顶部的脂质层；
·中间的乳清；
·在底部的酪蛋白；
6.吸取1ml乳清在新的微量离心管中，添加300μl样品稀释液，充分混合，并且将其置于光处理室的架子中；
7.孵育45分钟；
8.将试管以10,000x g离心5分钟；
9.将试管转移到架子上，并且等待样品在室温下稳定30分钟；
10.小心地将1ml上清液吸移到硼硅酸盐玻璃管中。
制备对照：
1.吸取500μl样品稀释液到四个试管中，并向每个试管中加入500μl DI或蒸馏水；
2.使用前三个试管作为阴性对照；
3.将40μl阳性对照添加到第四个试管中，并充分混合；
4.在室温下孵育5分钟。
运行测试：
1.获得对照和样品的空白读数；
2.在含有对照和样品的所有试管中加入10μl示踪剂；
3.充分混合；
4.在室温下孵育3-5分钟；
5.获得对照和样品的mP读数。
使用FPA检测经RBP处理和未经RBP处理的乳清样品中的流产布鲁氏菌抗体
以下结果表明，乳样品的RBP处理可以减少乳样品中的背景荧光，以使用FPA检测布鲁氏菌抗体。
首先进行了初步研究以确定RBP对背景荧光的影响。我们测量了未经处理乳清和经RBP处理的乳清的空白荧光，以去除核黄素背景。在未经处理的样品情况下，我们仅使用在缓冲液中稀释的20μl样品。我们在未经处理的样品中使用此量，因为使用1ml时的荧光强度超过1,000,000RFU(相对荧光单位)，这可能会导致仪器读数过度。对于平行荧光，使用20μl未经处理样品的读数为125,067RFU。相比之下，在经处理的样品中，我们使用了与850μgRBP组合的全体积1ml乳清。对于平行荧光，在这种情况下的荧光强度仅为59,138RFU。使用RBP处理情况下背景荧光的减少意味着与未经RBP处理的样品相比，我们可以将反应中的分析物浓度提高100倍。这不仅极大地影响了测定的灵敏度，而且极大地影响了特异性和一致性。
接下来，我们对经RBP处理的乳清与未经RBP处理的乳清液进行了灵敏度测试。我们使用FPA以测试每1ml乳清用850μg RBP处理的乳清样品(B1004样品)中的流产布鲁氏菌抗体和未经RBP处理过的样品(B1001样品)中的流产布鲁氏菌抗体。在B1001样品中仅使用了20μl乳清，相比之下在B1004样品中使用了1ml乳清。向样品中掺入不同量的兔多克隆抗流产布鲁氏菌抗体血清(RAB1003)。该血清用作评估用于USDA计划中成批乳测试的乳测试试剂盒的标准品。结果示于表8和9中。
表8.未经RBP处理的乳清样品的FPA结果
表9.经RBP处理的乳清样品的FPA结果。
如表9所示，使用10ΔmP的截断值，稀释度为1:600在B1004样品情况下轻松达到阳性状态，而B1001样品情况下仅以1:50稀释度才可以(ΔmP＝样品mP-平均NC mP)。
接下来，我们对经RBP处理的乳清进行了灵敏度测试。表10显示了对阴性乳样品的三个批次(第1-3批)进行多日FPA测试的结果。在每个测试中使用一毫升乳清。样品之间的差异很小，并且没有检测到假阳性。我们还使用2ml乳清液进行了相同的测试。这在特异性和增加的敏感性方面显示出相似的结果。
表10.对缺乏布鲁氏菌抗体的乳清进行的FPB分析。
实例4：使用FPA检测经RBP处理样品中的布鲁氏菌抗原
背景
通常需要检测可疑的牛、绵羊、山羊等的乳中的布鲁氏菌抗原。乳是最好的样品，因为布鲁氏菌存在于乳中，但不存在于血清中。在本实例中，我们在乳中掺加了灭活的布鲁氏菌细胞，然后使用FPA测试了乳中的布鲁氏菌抗原。
程序
1.在乳样品中添加最终浓度为1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml和1μg/ml的灭活的布鲁氏菌细菌；
2.将1ml经掺加的乳样品和一个阴性样品(作为阴性对照)转移到1.5ml微量离心管中；
3.添加60μl pH 5.8的澄清乳缓冲液PBS(具有750IMCU/ml的三平根毛霉凝乳酵素)，并充分混合；
4.孵育约10分钟，直到乳开始结块；
5.在乳凝块顶部添加300μl 1M Tris pH 7.7和0.1％EDTA。
6.在微量离心机中将样品以约10,000x g的速度离心5分钟；
7.将样品中的1ml乳清转移到硼硅酸盐玻璃管中；
8.向含有对照和样品的所有试管中添加20μl布鲁氏菌阳性对照血清(来自布鲁氏菌病参考单位(利物浦，英国)的兔多克隆抗流产布鲁氏菌抗体血清(RAB))；
9.向含有对照和样品的所有试管中加入10μl核黄素结合蛋白(RBP)(85mg/ml)；
10.充分混合；
11.孵育5分钟；
12.读取空白；
13.向含有对照和样品的所有试管中加入10μl布鲁氏菌示踪剂(流产布鲁氏菌OPS-荧光素缀合物)；
14.充分混合；
15.孵育3-5分钟；
16.获得mP值；
17.计算ΔmP值(ΔmP＝阴性对照mP-经掺加的样品mP)。
结果
如表11所示，我们能够在乳样品中检测到低至10mg/ml的布鲁氏菌。
表11.流产布鲁氏菌抗原的检测。
*ΔmP＝平均阴性乳中PC mP-经掺加的奶mP
Claims (23)
1.一种处理和测试包含分析物的样品的方法，所述方法包括：
处理所述样品以减少所述样品中的核黄素依赖性自发荧光，其中所述处理包括向所述样品中添加核黄素结合蛋白、辐照所述样品或其组合；
向所述样品中添加示踪剂；并且
检测来自所述样品中所述示踪剂的荧光，其中检测到的荧光指示所述样品中分析物的量。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述处理包括向所述样品中添加核黄素结合蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其中在添加到所述样品中的核黄素结合蛋白存在下进行所述检测。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述处理包括辐照所述样品。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括澄清所述样品，同时将所述分析物保持在所述样品中。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述澄清包括使所述样品中的酪蛋白凝结并从所述样品中去除凝结的酪蛋白。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述凝结包括将足以凝结所述酪蛋白的量的凝乳酵素加入所述样品中。
8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述澄清包括从所述样品中去除脂质。
9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述澄清还包括向所述样品中加入非水性极性溶剂。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述非水性极性溶剂包含醇。
11.如权利要求9-10中任一项所述的方法，其中将所述非水性极性溶剂以足以使所述分析物保持在所述样品中的量加入所述样品中。
12.如权利要求9-11中任一项所述的方法，其中将所述非水性极性溶剂以约10％v/v至约50％v/v的最终浓度加入所述样品中。
13.如权利要求5-12中任一项所述的方法，其中所述澄清包括离心所述样品。
14.如权利要求5-13中任一项所述的方法，其中所述澄清包括过滤所述样品。
15.如权利要求14所述的方法，其中用孔径为约0.1μm至约10μm的过滤器进行所述过滤。
16.如权利要求1-15所述的方法，其中所述样品包含乳制品。
17.如权利要求1-16所述的方法，其中所述样品包含乳清。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述分析物是疏水性分析物。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述分析物是孕酮。
20.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述分析物包含抗体或抗原。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述示踪剂包含结合部分和荧光部分，其中所述结合部分包含所述分析物的标准品或所述分析物的配体。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，所述方法还包括，在所述检测之前，将所述分析物和所述示踪剂竞争结合的配体加入所述样品中。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述检测包括检测平面偏振光。
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