JP2002502037A - 生体試料におけるフコシル化タンパク質の測定のためのイムノアッセイおよび試験キット - Google Patents
生体試料におけるフコシル化タンパク質の測定のためのイムノアッセイおよび試験キットInfo
- Publication number
- JP2002502037A JP2002502037A JP2000529612A JP2000529612A JP2002502037A JP 2002502037 A JP2002502037 A JP 2002502037A JP 2000529612 A JP2000529612 A JP 2000529612A JP 2000529612 A JP2000529612 A JP 2000529612A JP 2002502037 A JP2002502037 A JP 2002502037A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lectin
- protein
- fuc
- labeled
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57469—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving tumor associated glycolinkage, i.e. TAG
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57476—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncofetal proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、生体試料中のフコシル化タンパク質（fucタンパク質）の量を測定するためのサンドイッチイムノアッセイ、および関連する一連の試薬に関する。好適な実施形態においては、本発明は、肝細胞癌(HCC)を頻繁に見られる癌形態として初期に識別する上で重要な、フコシル化α-フェトプロテイン(AFP)を測定するためのイムノアッセイに関する。該イムノアッセイは、ユーレックス ユーロペウス(Ulex europaeus)凝集素(UEA)、ロータス テトラゴノロバス(Lotus tetragonolobus)凝集素(LTA)、およびアングイラ アングイラ(Anguilla anguilla)凝集素(AAA)の群から選択されるレクチンを用いることを特徴とする。
Description
【０００１】 本発明は生体試料中のフコシル化タンパク質（fucタンパク質）の量を測定す るためのサンドイッチイムノアッセイおよび関連した一連の試薬に関する。好適
な実施形態においては、本発明は、頻繁に見られる癌形態として肝細胞癌(HCC) を初期に識別する上で重要な、フコシル化α-フェトプロテイン(AFP)の測定のた
めのイムノアッセイに関する。
な実施形態においては、本発明は、頻繁に見られる癌形態として肝細胞癌(HCC) を初期に識別する上で重要な、フコシル化α-フェトプロテイン(AFP)の測定のた
めのイムノアッセイに関する。
【０００２】 糖タンパク質の、異常に増加したフコシル化は、腫瘍の診断に重要な役割を果
たす。これは、糖タンパク質のオリゴ糖側鎖におけるそのような形態のグリコシ
ル化が、腫瘍に関連するものとしてますます認識されてきているためである。し
たがって、例えばAoyagi, Q.ら, Biochim. Biophys. Acta 830, 217-223 (1985)
、およびAoyagi, Yら, Cancer 61, 769-774 (1988)、またはWu, J.T., Ann. Cli
n. Lab. Sci. 20, 98-105 (1990)では、異常なAFPのフコシル化は肝細胞癌に特 異的であることが記載されている。
たす。これは、糖タンパク質のオリゴ糖側鎖におけるそのような形態のグリコシ
ル化が、腫瘍に関連するものとしてますます認識されてきているためである。し
たがって、例えばAoyagi, Q.ら, Biochim. Biophys. Acta 830, 217-223 (1985)
、およびAoyagi, Yら, Cancer 61, 769-774 (1988)、またはWu, J.T., Ann. Cli
n. Lab. Sci. 20, 98-105 (1990)では、異常なAFPのフコシル化は肝細胞癌に特 異的であることが記載されている。
【０００３】 さらに、フコシル化タンパク質の量を測定することは、組換え法において作製
され、特に経過の制御において治療薬として用いられる糖タンパク質を評価する
上でも利用できるであろう。
され、特に経過の制御において治療薬として用いられる糖タンパク質を評価する
上でも利用できるであろう。
【０００４】 アフィニティー電気泳動およびイムノアフィニティー電気泳動、またほとんど
の場合続いての抗体コーティングメンブレン上へのブロッティングを用いて、異
常にフコシル化したタンパク質を検出することは周知である(Taketa K., J. Chr
omatogr. 569, 229-241 (1991))。またアフィニティークロマトグラフィー法も 用いられる。しかしながら、これらの方法は臨床的実務における使用には適して
いない。
の場合続いての抗体コーティングメンブレン上へのブロッティングを用いて、異
常にフコシル化したタンパク質を検出することは周知である(Taketa K., J. Chr
omatogr. 569, 229-241 (1991))。またアフィニティークロマトグラフィー法も 用いられる。しかしながら、これらの方法は臨床的実務における使用には適して
いない。
【０００５】 フコシル化AFPと非フコシル化AFPを識別するためのものとして、文献にはレク
チンであるコンカナバリンA(ConA)、レンズ クリナリス(Lens culinaris)レクチ
ンA(LCA)およびファセオラス バルガリス(Phaseolus vulgaris)赤血球凝集素E(P
HA-E)を用いたレクチン酵素イムノアッセイも記載されている(Yasufumi Suzuki ら, Ann. Clin. Biochem. 27, 121-128 (1990); Noriaki Kinoshitaら, Clinica
Chimica Acta 179, 143-152 (1989))。しかしながら、上記のレクチンを用いた
レクチン酵素イムノアッセイは、フコシル化タンパク質の定量的測定に用いられ
る臨床的試験に適した、特異性および感度に関する要求性を満たさないことがわ
かっている。さらに、ConAおよびLCAレクチンを用いた結果は再現性が乏しいこ とが分かっている。
チンであるコンカナバリンA(ConA)、レンズ クリナリス(Lens culinaris)レクチ
ンA(LCA)およびファセオラス バルガリス(Phaseolus vulgaris)赤血球凝集素E(P
HA-E)を用いたレクチン酵素イムノアッセイも記載されている(Yasufumi Suzuki ら, Ann. Clin. Biochem. 27, 121-128 (1990); Noriaki Kinoshitaら, Clinica
Chimica Acta 179, 143-152 (1989))。しかしながら、上記のレクチンを用いた
レクチン酵素イムノアッセイは、フコシル化タンパク質の定量的測定に用いられ
る臨床的試験に適した、特異性および感度に関する要求性を満たさないことがわ
かっている。さらに、ConAおよびLCAレクチンを用いた結果は再現性が乏しいこ とが分かっている。
【０００６】 したがって十分な感度があり、特異的かつ再現性があって問題なく臨床的実務
に適用できる、フコシル化タンパク質の検出方法を提供することが本発明の目的
であった。検出方法は操作が容易で、また臨床部門でのルーティンな試験に適し
ているべきである。特に、肝臓の診断における腫瘍マーカーであるフコシル化α
-フェトプロテインの検出方法を提供することが本発明の目的である。
に適用できる、フコシル化タンパク質の検出方法を提供することが本発明の目的
であった。検出方法は操作が容易で、また臨床部門でのルーティンな試験に適し
ているべきである。特に、肝臓の診断における腫瘍マーカーであるフコシル化α
-フェトプロテインの検出方法を提供することが本発明の目的である。
【０００７】 本発明の目的は、特許請求の範囲に特定される通りに達成される。生体試料中
のフコシル化タンパク質の量を測定するための、本発明のイムノアッセイは、以
下のa)、b)を特徴とする。a) 固定化抗fuc（フコシル化）タンパク質抗体また は固定化抗fucタンパク質抗体フラグメントを生体試料と共にインキュベートし 、fucタンパク質-抗体複合体を形成させる。b) fucタンパク質-抗体複合体およ
び従ってフコシル化タンパク質の量を本質的に公知の方法で測定するために適切
な標識を有する、ユーレックス ユーロペウス(Ulex europaeus)凝集素(UEA)、ロ
ータス テトラゴノロバス(Lotus tetragonolobus)凝集素(LTA)、およびアングイ
ラ アングイラ(Anguilla anguilla)凝集素(AAA)の群から選択されるレクチンを 加える。またはb) 上記の群から選択される非標識化レクチンを加え、fucタン パク質-抗体複合体は、上記レクチンに対する標識化抗レクチン抗体を用いて本 質的に公知の方法で検出する。本発明によるアッセイを、選択されたレクチンUE
A、LTA、AAAと共に用いることによって、ConA、LCAおよびPHA-Eマーカーレクチ ンを用いた文献に記載のアッセイと比べて、感度および特異性をはるかに改善で
きることが明らかになった。
のフコシル化タンパク質の量を測定するための、本発明のイムノアッセイは、以
下のa)、b)を特徴とする。a) 固定化抗fuc（フコシル化）タンパク質抗体また は固定化抗fucタンパク質抗体フラグメントを生体試料と共にインキュベートし 、fucタンパク質-抗体複合体を形成させる。b) fucタンパク質-抗体複合体およ
び従ってフコシル化タンパク質の量を本質的に公知の方法で測定するために適切
な標識を有する、ユーレックス ユーロペウス(Ulex europaeus)凝集素(UEA)、ロ
ータス テトラゴノロバス(Lotus tetragonolobus)凝集素(LTA)、およびアングイ
ラ アングイラ(Anguilla anguilla)凝集素(AAA)の群から選択されるレクチンを 加える。またはb) 上記の群から選択される非標識化レクチンを加え、fucタン パク質-抗体複合体は、上記レクチンに対する標識化抗レクチン抗体を用いて本 質的に公知の方法で検出する。本発明によるアッセイを、選択されたレクチンUE
A、LTA、AAAと共に用いることによって、ConA、LCAおよびPHA-Eマーカーレクチ ンを用いた文献に記載のアッセイと比べて、感度および特異性をはるかに改善で
きることが明らかになった。
【０００８】 好適な実施形態においては、本発明によるサンドイッチイムノアッセイにおい
てUEAはレクチンとして使用する。ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗 体の両方とも、固相上の捕獲抗体として用いることができる。
てUEAはレクチンとして使用する。ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗 体の両方とも、固相上の捕獲抗体として用いることができる。
【０００９】 ある実施形態においては、固定化した抗fucタンパク質抗体をUEA、LTA、AAAか
ら選択されるアクセプター標識化レクチンと共に加え、さらに次にレクチンのア
クセプターに結合する標識化レセプターと共にインキュベートするという方法に
て、サンドイッチイムノアッセイを行う。この場合の検出はレセプター上のマー
カーによってなされる。ハプテンすなわち低分子量のリガンドはレクチンを標識
するためのアクセプターとして用いることができ、好ましくはビオチンが使われ
る。したがって標識化アビジン、ストレプトアビジンまたはそれらの誘導体は、
好適な実施形態においてレセプターとして用いられる。ハプテンがアクセプター
として用いられる場合には、ハプテン特異的抗体はレセプターとして利用される
であろう。
ら選択されるアクセプター標識化レクチンと共に加え、さらに次にレクチンのア
クセプターに結合する標識化レセプターと共にインキュベートするという方法に
て、サンドイッチイムノアッセイを行う。この場合の検出はレセプター上のマー
カーによってなされる。ハプテンすなわち低分子量のリガンドはレクチンを標識
するためのアクセプターとして用いることができ、好ましくはビオチンが使われ
る。したがって標識化アビジン、ストレプトアビジンまたはそれらの誘導体は、
好適な実施形態においてレセプターとして用いられる。ハプテンがアクセプター
として用いられる場合には、ハプテン特異的抗体はレセプターとして利用される
であろう。
【００１０】 本発明に従って、酵素、色素、放射性同位元素、金属コロイド、キレート試薬
、またはスピンマーカーをレセプターマーカーとして用いる。好適には、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ(POD)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、
ウレアーゼ、またはグルコースオキシダーゼ等の酵素をレセプターマーカーとし
て使用し、酵素の基質反応によってfucタンパク質-抗体複合体の量を測定する。
本発明により、PODは特に好適な実施形態において標識化のために用いられ、ま た該基質反応は、例えばH2O2／テトラメチルベンジジンなどの色素基質を用いて
行う。本発明および当業者にとって周知のことに従えば、多様な色素基質、化学
発光または蛍光を用いて、非常に様々な酵素に対する基質反応を検出することも
可能である。
、またはスピンマーカーをレセプターマーカーとして用いる。好適には、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ(POD)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、
ウレアーゼ、またはグルコースオキシダーゼ等の酵素をレセプターマーカーとし
て使用し、酵素の基質反応によってfucタンパク質-抗体複合体の量を測定する。
本発明により、PODは特に好適な実施形態において標識化のために用いられ、ま た該基質反応は、例えばH2O2／テトラメチルベンジジンなどの色素基質を用いて
行う。本発明および当業者にとって周知のことに従えば、多様な色素基質、化学
発光または蛍光を用いて、非常に様々な酵素に対する基質反応を検出することも
可能である。
【００１１】 したがって、特に好適な実施形態においては、本発明によるイムノアッセイは
酵素イムノアッセイとして行われる。しかしあるいは、レセプターはまた、放射
性同位元素（例えば125I）、蛍光マーカー（例えばFITC)、金属コロイド（例え ば、金）、キレート試薬（例えばDTTA）、ポリヌクレオチド、またはスピンマー
カー（例えばPROXYL）によっても標識され得る。
酵素イムノアッセイとして行われる。しかしあるいは、レセプターはまた、放射
性同位元素（例えば125I）、蛍光マーカー（例えばFITC)、金属コロイド（例え ば、金）、キレート試薬（例えばDTTA）、ポリヌクレオチド、またはスピンマー
カー（例えばPROXYL）によっても標識され得る。
【００１２】 また本発明により、アクセプターによって標識されたレクチンおよびレセプタ
ーを予め形成した複合体の形態で抗原-抗体複合体へ加えることにより、上記の 改変アッセイにおいて処理工程を１つ省略することができる。
ーを予め形成した複合体の形態で抗原-抗体複合体へ加えることにより、上記の 改変アッセイにおいて処理工程を１つ省略することができる。
【００１３】 本発明の別の実施形態において、イムノアッセイは直接アッセイとしても行わ
れ得る。この場合、本発明のレクチンそのものがマーカーを有する。この場合も
同様に、該アッセイは酵素イムノアッセイとして行うことが好ましい。
れ得る。この場合、本発明のレクチンそのものがマーカーを有する。この場合も
同様に、該アッセイは酵素イムノアッセイとして行うことが好ましい。
【００１４】 本発明による第３の改変アッセイにおいては、非標識化レクチンを用い、その
検出は標識化抗レクチン抗体を用いて行う。この場合、UEA、LTA、AAAに対する ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体またはそれらのフラグメントは両
方とも用いられる。この場合も同様に、該アッセイは酵素イムノアッセイとして
行うことが好ましい。
検出は標識化抗レクチン抗体を用いて行う。この場合、UEA、LTA、AAAに対する ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体またはそれらのフラグメントは両
方とも用いられる。この場合も同様に、該アッセイは酵素イムノアッセイとして
行うことが好ましい。
【００１５】 本発明の意味するところにおいて、フコシル化タンパク質を含み得る任意のヒ
トまたは動物の体液が、生体試料であると理解される。例えばこれは、血液、血
漿、血清、尿、組識液、リンパ液、胃液、腹水、または唾液であり得る。本発明
の方法を用いれば、α-フェトプロテイン等のフコシル化タンパク質、遺伝子工 学的に製造したもしくは生物材料から単離したフコシル化医薬用タンパク質、ま
たは接着タンパク質（例えばCD22）を検出することができる。
トまたは動物の体液が、生体試料であると理解される。例えばこれは、血液、血
漿、血清、尿、組識液、リンパ液、胃液、腹水、または唾液であり得る。本発明
の方法を用いれば、α-フェトプロテイン等のフコシル化タンパク質、遺伝子工 学的に製造したもしくは生物材料から単離したフコシル化医薬用タンパク質、ま
たは接着タンパク質（例えばCD22）を検出することができる。
【００１６】 本発明のアッセイは、肝臓疾患の特異的診断に特に適していることが分かった
。HCC患者のフコース特異的AFPの含有量は有意に増加するので（図１を参照のこ
と）、血清中のフコシル化α-フェトプロテイン(AFP)の量を測定することにより
、肝細胞癌(HCC)の存在する可能性について信頼性のある報告をすることができ る。
。HCC患者のフコース特異的AFPの含有量は有意に増加するので（図１を参照のこ
と）、血清中のフコシル化α-フェトプロテイン(AFP)の量を測定することにより
、肝細胞癌(HCC)の存在する可能性について信頼性のある報告をすることができ る。
【００１７】 特に好適な実施形態においては、本発明によるAFPアッセイには、マウス、ウ サギもしくはニワトリ由来のポリクロナール抗体またはそれらのフラグメントを
、固相上の捕獲抗体として含む。ビオチン化UEAを抗原-抗体複合体へ加え、該fu
cタンパク質-抗体複合体を、アビジン、改変アビジンまたはストレプトアビジン
のPODコンジュゲートを用いて検出する。
、固相上の捕獲抗体として含む。ビオチン化UEAを抗原-抗体複合体へ加え、該fu
cタンパク質-抗体複合体を、アビジン、改変アビジンまたはストレプトアビジン
のPODコンジュゲートを用いて検出する。
【００１８】 したがって、肝臓腫瘍疾患が疑われる場合、本発明による技術上の解決策によ
って、例えば従来の酵素イムノアッセイを用いて、全AFP含有量と同時にフコシ ル化AFPの含有量を測定する（例えばマイクロタイタープレート上で）ことが可 能になる。例えば、これらの両方のアッセイの構成は、以下に例示したようなも
のであり得る。 全AFPに対するアッセイ： １．生物種１（例えばマウス、ウサギ、ニワトリ）に由来する固定化した抗AFP 抗体または抗体フラグメント。 ２．AFP標準希釈物または患者由来の希釈血清。 ３．生物種２（例えばマウス、ウサギ、ニワトリ）に由来する酵素標識した抗AF
P抗体または抗体フラグメント。例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ(POD)または
アルカリホスファターゼ(AP)などの酵素。 ４．基質反応。 フコシル化AFPに対するアッセイ： １．生物種１（例えばマウス、ウサギ、ニワトリ）に由来する固定化した抗AFP 抗体または抗体フラグメント。 ２．患者由来の希釈血清。 ３．UEA、LTA、およびAAAから選択される標識化レクチン（例えばビオチン化UEA
）。 ４．標識特異的酵素コンジュゲート（例えばアビジン／ストレプトアビジン-POD
コンジュゲートまたは複合体）。 ５．基質反応。
って、例えば従来の酵素イムノアッセイを用いて、全AFP含有量と同時にフコシ ル化AFPの含有量を測定する（例えばマイクロタイタープレート上で）ことが可 能になる。例えば、これらの両方のアッセイの構成は、以下に例示したようなも
のであり得る。 全AFPに対するアッセイ： １．生物種１（例えばマウス、ウサギ、ニワトリ）に由来する固定化した抗AFP 抗体または抗体フラグメント。 ２．AFP標準希釈物または患者由来の希釈血清。 ３．生物種２（例えばマウス、ウサギ、ニワトリ）に由来する酵素標識した抗AF
P抗体または抗体フラグメント。例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ(POD)または
アルカリホスファターゼ(AP)などの酵素。 ４．基質反応。 フコシル化AFPに対するアッセイ： １．生物種１（例えばマウス、ウサギ、ニワトリ）に由来する固定化した抗AFP 抗体または抗体フラグメント。 ２．患者由来の希釈血清。 ３．UEA、LTA、およびAAAから選択される標識化レクチン（例えばビオチン化UEA
）。 ４．標識特異的酵素コンジュゲート（例えばアビジン／ストレプトアビジン-POD
コンジュゲートまたは複合体）。 ５．基質反応。
【００１９】 測定方法に加えて、本発明は、特許請求の範囲に特定するような関連した一連
の試薬をも意図している。
の試薬をも意図している。
【００２０】実施例 実施例１ a) 抗ヒトAFP-IgG-F(ab)2フラグメントの調製 aa) 抗血清の単離 ウサギを臍帯血由来の高純度のヒトAFPを用いて免疫化する。凝集した後、抗 血清を免疫感作動物の血液から遠心分離によって分離する。ab) 全IgG画分の単離 該血清をAFP-セファロース上に載せる。非結合血清タンパク質はTRIS緩衝化生
理食塩水(TBS)によって洗い流される。続いて１M Tris-HCl,pH7.5によって中性 化された0.2M グリシン-HClバッファー,pH2.5を用いて、抗AFP-IgGを溶出させ、
Centricon-30kDカートリッジを用いて濃縮し、50mM酢酸バッファー,pH4.0、0.5M
NaCl、0.02% NaN3に対して再緩衝化した。ac) ペプシンを用いた抗体のフラグメント化 酵素とIgGの比率をE:P=1:50であるように調製し、これを37℃で４時間インキ ュベートする。該反応を１M Tris-HCl,pH7.5を用いて終結させる。次いで抗AFP-
F(ab)2フラグメントを、ab)に記載したようにAFPカラム上でのイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーを用いて単離し、濃縮し、TBSに対して透析し、４℃で 保存する。b) 全AFP測定のためのイムノアッセイ マイクロタイタープレートのウェルを、重炭酸バッファー(pH8.5〜9.5)中 F(a
b)2 10μg/ml溶液からの吸着により、抗ヒトAFP-IgG（F(ab)2フラグメント、ウ サギ）でコーティングする。タンパク質の非特異的吸着は、不活性タンパク質溶
液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中のウシ血清アルブミン）を用いて プラスチック表面をブロックすることによって低減される。ヒトAFPの標準希釈 系列（２〜300ng/mlの濃度範囲）のいずれか、または患者血清を遠心分離したも
のの1:5〜1:10の希釈サンプルを、上記方法でコーティングしたウェル中に入れ る。非結合物質を洗い流し、次いで抗ヒトAFP-IgG-PODコンジュゲートの適切な 希釈物を用いてインキュベートする。非結合物質を洗い流し、次にH2O2／テトラ
メチルベンジジンを用いて基質反応を開始し、一定の時間の後、硫酸を用いて終
結させる。吸着は450nmで測定する。患者血清中のAFPの含有量は標準希釈系列を
用いて決定する。
理食塩水(TBS)によって洗い流される。続いて１M Tris-HCl,pH7.5によって中性 化された0.2M グリシン-HClバッファー,pH2.5を用いて、抗AFP-IgGを溶出させ、
Centricon-30kDカートリッジを用いて濃縮し、50mM酢酸バッファー,pH4.0、0.5M
NaCl、0.02% NaN3に対して再緩衝化した。ac) ペプシンを用いた抗体のフラグメント化 酵素とIgGの比率をE:P=1:50であるように調製し、これを37℃で４時間インキ ュベートする。該反応を１M Tris-HCl,pH7.5を用いて終結させる。次いで抗AFP-
F(ab)2フラグメントを、ab)に記載したようにAFPカラム上でのイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーを用いて単離し、濃縮し、TBSに対して透析し、４℃で 保存する。b) 全AFP測定のためのイムノアッセイ マイクロタイタープレートのウェルを、重炭酸バッファー(pH8.5〜9.5)中 F(a
b)2 10μg/ml溶液からの吸着により、抗ヒトAFP-IgG（F(ab)2フラグメント、ウ サギ）でコーティングする。タンパク質の非特異的吸着は、不活性タンパク質溶
液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中のウシ血清アルブミン）を用いて プラスチック表面をブロックすることによって低減される。ヒトAFPの標準希釈 系列（２〜300ng/mlの濃度範囲）のいずれか、または患者血清を遠心分離したも
のの1:5〜1:10の希釈サンプルを、上記方法でコーティングしたウェル中に入れ る。非結合物質を洗い流し、次いで抗ヒトAFP-IgG-PODコンジュゲートの適切な 希釈物を用いてインキュベートする。非結合物質を洗い流し、次にH2O2／テトラ
メチルベンジジンを用いて基質反応を開始し、一定の時間の後、硫酸を用いて終
結させる。吸着は450nmで測定する。患者血清中のAFPの含有量は標準希釈系列を
用いて決定する。
【００２１】実施例２ fuc-AFP測定のための本発明のイムノアッセイ マイクロタイタープレートのウェルを、重炭酸バッファー(pH8.5〜9.5)中 F(a
b)2 10μg/ml溶液からの吸着により、実施例1aと同様に、抗ヒトAFP-IgG（F(ab) 2 フラグメント、ウサギ）でコーティングして調製する。タンパク質の非特異的 吸着は、不活性タンパク質溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中のウ シ血清アルブミン）を用いてプラスチック表面をブロックすることによって低減
される。患者血清を遠心分離したものの1:5〜1:10の希釈サンプルを、上記方法 でコーティングしたウェル中に入れる。非結合物質を洗い流し、次いでビオチン
化ユーレックス ユーロペウスレクチン(bio-UEA)の適切な希釈物を用いてインキ
ュベートする。非結合物質を洗い流し、次にアシルアビジン-ビオチン化POD複合
体(AbP)の適切な希釈物を用いてインキュベートする。非結合物質を洗い流し、 次にH2O2／テトラメチルベンジジンを用いて基質反応を開始し、一定の時間の後
、硫酸を用いて終結させる。吸着は450nmで測定する。
b)2 10μg/ml溶液からの吸着により、実施例1aと同様に、抗ヒトAFP-IgG（F(ab) 2 フラグメント、ウサギ）でコーティングして調製する。タンパク質の非特異的 吸着は、不活性タンパク質溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中のウ シ血清アルブミン）を用いてプラスチック表面をブロックすることによって低減
される。患者血清を遠心分離したものの1:5〜1:10の希釈サンプルを、上記方法 でコーティングしたウェル中に入れる。非結合物質を洗い流し、次いでビオチン
化ユーレックス ユーロペウスレクチン(bio-UEA)の適切な希釈物を用いてインキ
ュベートする。非結合物質を洗い流し、次にアシルアビジン-ビオチン化POD複合
体(AbP)の適切な希釈物を用いてインキュベートする。非結合物質を洗い流し、 次にH2O2／テトラメチルベンジジンを用いて基質反応を開始し、一定の時間の後
、硫酸を用いて終結させる。吸着は450nmで測定する。
【００２２】実施例３ 様々な被験者に対する実施例１および２の結果を例示する（図２）。明らかに
示されている通り、全AFP含有量はUEA反応性AFPの含有量とは相関せず、そのた めAFP値が増大している場合に増加した量のフコシル化AFPが実際に存在している
かどうかについての判定は、本発明による試験を用いることによってのみ、行う
ことができる。
示されている通り、全AFP含有量はUEA反応性AFPの含有量とは相関せず、そのた めAFP値が増大している場合に増加した量のフコシル化AFPが実際に存在している
かどうかについての判定は、本発明による試験を用いることによってのみ、行う
ことができる。
【図１】 患者血清サンプル中のフコシル化AFPの含有量を示す。 対照−健康な被験者、SLE−全身性エリテマトーデス、AIH−自己免疫性肝炎
、PBS−多核性胆汁性肝硬変、HCC−肝細胞癌
、PBS−多核性胆汁性肝硬変、HCC−肝細胞癌
【図２】 様々なHCC患者血清における全AFPおよびフコシル化AFPの含有量の比較を示す 。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月２１日（２０００．３．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
Claims (16)
- 【請求項１】 生体試料中のフコシル化タンパク質（fucタンパク質）の量 を測定するための、以下のa)〜b)を特徴とするイムノアッセイ。 a) 固定化抗fucタンパク質抗体または固定化抗fucタンパク質抗体断片を生体試
料と共にインキュベートして、fucタンパク質-抗体複合体を形成する工程、およ
び b) fucタンパク質-抗体複合体の量、および従ってフコシル化タンパク質の量を
本質的に公知の方法で測定するための適切な標識を有している、ユーレックス ユーロペウス(Ulex europaeus)凝集素(UEA)、ロータス テトラゴノロバス(Lotus
tetragonolobus)凝集素(LTA)、およびアングイラ アングイラ(Anguilla anguil
la)凝集素(AAA)の群から選択されるレクチンを加える工程、または b) ユーレックス ユーロペウス凝集素(UEA)、ロータス テトラゴノロバス凝集 素(LTA)、およびアングイラ アングイラ凝集素(AAA)の群から選択される非標識 化レクチンを加え、さらに上記のレクチンまたはそれらの断片に対する標識化抗
レクチン抗体を用いて、本質的に公知の方法で、前記fucタンパク質-抗体複合体
を検出する工程。 - 【請求項２】 b)が、請求項１に記載のレクチンであってアクセプターによ
り標識されたものを、レクチンのアクセプターと結合する標識化レセプターと共
にインキュベートし、さらにfucタンパク質-抗体複合体の量、従ってフコシル化
タンパク質の量をレセプター上のマーカーによって通常方法で測定する工程であ
ることを特徴とする、請求項１記載のイムノアッセイ。 - 【請求項３】 b)における、fucタンパク質-抗体複合体の量の測定をレクチ
ン上のマーカーによって行うことができるように標識したレクチンを加える工程
によって、フコシル化タンパク質の量を直接的に測定することを特徴とする請求
項１記載のイムノアッセイ。 - 【請求項４】 フコシル化α-フェトプロテイン(AFP)の量を測定することを
特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のイムノアッセイ。 - 【請求項５】 ハプテンすなわち低分子量リガンドをアクセプターとして用
いて標識されているレクチンを使用することを特徴とする、請求項２記載のイム
ノアッセイ。 - 【請求項６】 前記レクチンがビオチンをアクセプターとして用いて標識さ
れており、またアビジン、ストレプトアビジン、またはそれらの誘導体がレセプ
ターとして用いられることを特徴とする、請求項２または５に記載のイムノアッ
セイ。 - 【請求項７】 前記レクチンがハプテンにより標識され、またハプテン特異
的抗体がレセプターとして用いられることを特徴とする、請求項２または５に記
載のイムノアッセイ。 - 【請求項８】 酵素、色素、放射性同位元素、金属コロイド、キレート試薬
、ヌクレオチド、またはスピンマーカーをレセプターマーカーとして用いること
を特徴とする、請求項２または５〜７のいずれか１項に記載のイムノアッセイ。 - 【請求項９】 酵素、色素、放射性同位元素、金属コロイド、キレート試薬
、ヌクレオチド、またはスピンマーカーをレクチンマーカーとして用いることを
特徴とする、請求項３に記載のイムノアッセイ。 - 【請求項１０】 酵素、色素、放射性同位元素、金属コロイド、キレート試
薬、ヌクレオチド、またはスピンマーカーを抗レクチン抗体のマーカーとして用
いることを特徴とする、請求項１に記載のイムノアッセイ。 - 【請求項１１】 生体試料中のフコシル化タンパク質（fucタンパク質）の 量を測定するための試験キットであって、ユーレックス ユーロペウス凝集素(UE
A)、ロータス テトラゴノロバス凝集素(LTA)、およびアングイラ アングイラ凝 集素(AAA)の群から選択される標識化または非標識化レクチンを含む、該試験キ ット。 - 【請求項１２】 前記キットが、抗fucタンパク質抗体または抗fucタンパク
質抗体断片を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の試験キット。 - 【請求項１３】 前記キットが、アクセプターで標識されたレクチン、およ
びレクチンのアクセプターと結合する標識化レセプターを含み、それらは任意に
は予め形成された複合体として存在していてもよいことを特徴とする、請求項１
１または１２に記載の試験キット。 - 【請求項１４】 前記キットが、アクセプター標識化レクチンとしてビオチ
ン化UEAを含むことを特徴とする、請求項１３記載の試験キット。 - 【請求項１５】 前記キットが、非標識化レクチンおよび該レクチンに対す
る標識化抗レクチン抗体を含むことを特徴とする、請求項１１または１２に記載
の試験キット。 - 【請求項１６】 フコシル化α-フェトプロテイン(AFP)の量を測定するため
の、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の試験キット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998106185 DE19806185C2 (de) | 1998-02-02 | 1998-02-02 | Immunoassay und Testkit zur Bestimmung von fucosyliertem Protein in einer biologischen Probe |
| DE19806185.4 | 1998-02-02 | ||
| PCT/EP1999/000639 WO1999039209A1 (de) | 1998-02-02 | 1999-02-01 | Immunoassay und testkit zur bestimmung von fucosyliertem protein in einer biologischen probe |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002502037A true JP2002502037A (ja) | 2002-01-22 |
Family
ID=7857793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000529612A Pending JP2002502037A (ja) | 1998-02-02 | 1999-02-01 | 生体試料におけるフコシル化タンパク質の測定のためのイムノアッセイおよび試験キット |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1053476A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002502037A (ja) |
| DE (1) | DE19806185C2 (ja) |
| WO (1) | WO1999039209A1 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008541060A (ja) * | 2005-05-05 | 2008-11-20 | フィラデルフィア ヘルス アンド エデュケーション コーポレーション ディー／ビー／エー ドレクセル ユニバーシティー カレッジ オブ メディシン | タンパク質のグリコシル化の評価による肝臓病変の診断 |
| JP2014527179A (ja) * | 2011-09-16 | 2014-10-09 | シスビオ バイオアッセイズ | 抗体のグリコシル化の測定方法 |
| US9110078B2 (en) | 2008-04-04 | 2015-08-18 | Drexel University | Diagnosis of liver pathology through assessment of anti-gal IgG glycosylation |
| JP2016038375A (ja) * | 2014-08-05 | 2016-03-22 | ベイジン ユウアン ホスピタル、キャピタル メディカル ユニバーシティＢｅｉｊｉｎｇ Ｙｏｕａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｃａｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | 化学発光タンパク質チップ測定方法及びそれに用いられる試薬キット |
| WO2017131022A1 (ja) * | 2016-01-27 | 2017-08-03 | 株式会社Ｊ－オイルミルズ | 糖タンパク質の検出方法 |
| JP2017214348A (ja) * | 2016-05-31 | 2017-12-07 | シスメックス株式会社 | 糖ペプチドと反応するモノクローナル抗体およびその用途 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7273925B1 (en) | 1998-12-15 | 2007-09-25 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for regulating lectin complement pathway associated complement activation |
| EP1204419A1 (en) * | 1999-08-13 | 2002-05-15 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Inhibitors of the lectin complement pathway (lcp) and their use |
| US8524453B2 (en) | 2006-02-10 | 2013-09-03 | The Brigham And Woman's Hospital, Inc. | Lectin complement pathway assays and related compositions and methods |
| CN100588942C (zh) * | 2006-09-13 | 2010-02-10 | 北京热景生物技术有限公司 | 检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该离心柱的试剂盒 |
| JP7002190B2 (ja) * | 2016-10-24 | 2022-02-04 | シスメックス株式会社 | 糖ペプチドと反応するモノクローナル抗体およびその用途 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60214737A (ja) * | 1984-04-06 | 1985-10-28 | Nippon Koutai Kenkyusho:Kk | 糖鎖関連抗原の製造法 |
| JPH06100604B2 (ja) * | 1985-06-06 | 1994-12-12 | 和光純薬工業株式会社 | α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法 |
| DK626488D0 (da) * | 1988-11-10 | 1988-11-10 | Torben Falck Oerntoft | Fremgangsmaade til udtagning af en sekretproeve via en legemsaabning og til praeparation af proeven med henblik paa kvantitativ bestemmelse af molekylaere strukturer og enzymaktivitet i proeven samt proeveudtagningsindretning til brug derved |
| EP0399464A3 (en) * | 1989-05-24 | 1992-03-25 | Eiji Ishikawa | Assay method for a substance with a specific sugar chain |
| WO1997031107A2 (en) * | 1996-02-20 | 1997-08-28 | Coles John G | Human serum lectin - induced apoptosis and method for detecting apoptosis |
-
1998
- 1998-02-02 DE DE1998106185 patent/DE19806185C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-02-01 EP EP99904839A patent/EP1053476A1/de not_active Withdrawn
- 1999-02-01 WO PCT/EP1999/000639 patent/WO1999039209A1/de not_active Application Discontinuation
- 1999-02-01 JP JP2000529612A patent/JP2002502037A/ja active Pending
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016040548A (ja) * | 2005-05-05 | 2016-03-24 | ドレクセル ユニバーシティ | タンパク質のグリコシル化の評価による肝臓病変の診断 |
| JP2013156266A (ja) * | 2005-05-05 | 2013-08-15 | Philadelphia Health & Education Corp Dba Drexel Univ College Of Medicine | タンパク質のグリコシル化の評価による肝臓病変の診断 |
| JP2015092167A (ja) * | 2005-05-05 | 2015-05-14 | フィラデルフィア ヘルス アンド エデュケーション コーポレーションディー／ビー／エー ドレクセル ユニバーシティー カレッジ オブ メディシン | タンパク質のグリコシル化の評価による肝臓病変の診断 |
| JP2008541060A (ja) * | 2005-05-05 | 2008-11-20 | フィラデルフィア ヘルス アンド エデュケーション コーポレーション ディー／ビー／エー ドレクセル ユニバーシティー カレッジ オブ メディシン | タンパク質のグリコシル化の評価による肝臓病変の診断 |
| JP2018013496A (ja) * | 2005-05-05 | 2018-01-25 | ドレクセル ユニバーシティ | タンパク質のグリコシル化の評価による肝臓病変の診断 |
| US10082512B2 (en) | 2005-05-05 | 2018-09-25 | Drexel University | Diagnosis of liver pathology through assessment of protein glycosylation |
| US10823740B2 (en) | 2005-05-05 | 2020-11-03 | Drexel University | Diagnosis of liver pathology through assessment of protein glycosylation |
| US9110078B2 (en) | 2008-04-04 | 2015-08-18 | Drexel University | Diagnosis of liver pathology through assessment of anti-gal IgG glycosylation |
| US10180436B2 (en) | 2008-04-04 | 2019-01-15 | Drexel University | Diagnosis of liver pathology through assessment of anti-gal IgG glycosylation |
| JP2014527179A (ja) * | 2011-09-16 | 2014-10-09 | シスビオ バイオアッセイズ | 抗体のグリコシル化の測定方法 |
| JP2016038375A (ja) * | 2014-08-05 | 2016-03-22 | ベイジン ユウアン ホスピタル、キャピタル メディカル ユニバーシティＢｅｉｊｉｎｇ Ｙｏｕａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｃａｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | 化学発光タンパク質チップ測定方法及びそれに用いられる試薬キット |
| WO2017131022A1 (ja) * | 2016-01-27 | 2017-08-03 | 株式会社Ｊ－オイルミルズ | 糖タンパク質の検出方法 |
| JP2017214348A (ja) * | 2016-05-31 | 2017-12-07 | シスメックス株式会社 | 糖ペプチドと反応するモノクローナル抗体およびその用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19806185C2 (de) | 1999-11-18 |
| EP1053476A1 (de) | 2000-11-22 |
| WO1999039209A1 (de) | 1999-08-05 |
| DE19806185A1 (de) | 1999-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Porstmann et al. | Enzyme immunoassay techniques an overview | |
| Kato et al. | Enzyme-linked immunoassay: Conjugation of the Fab′ fragment of rabbit IgG with β-d-galactosidase from E. coli and its use for immunoassay | |
| Yorde et al. | Competitive enzyme-liked immunoassay with use of soluble enzyme/antibody immune complexes for labeling. I. Measurement of human choriogonadotropin. | |
| KR920005963B1 (ko) | 특이적으로 결합가능한 물질의 측정방법 | |
| US4624930A (en) | Immunochemical process | |
| US5188939A (en) | Displacement immunoassay utilizing an oligavalent labelled antibody | |
| WO2013132338A2 (en) | Competitive immunoassay for calprotectin | |
| WO2013132347A2 (en) | Improved elisa immunoassay for calprotectin | |
| JP2619549B2 (ja) | 抗原の定量法およびそれに用いる固相 | |
| JP4920415B2 (ja) | プローブ複合体 | |
| JP2000508075A (ja) | 発光特異的結合アッセイ | |
| JP2002502037A (ja) | 生体試料におけるフコシル化タンパク質の測定のためのイムノアッセイおよび試験キット | |
| US6686167B2 (en) | Test device for detecting semen and method of use | |
| JPH0373852A (ja) | 特異的糖鎖を有する物質の測定法 | |
| EP1540343B1 (en) | Method for the elimination of interferences in immunochromatographic assays | |
| EP0368273B1 (en) | New method of assay for antigen | |
| JPH0827284B2 (ja) | 免疫学的に検出可能の物質を測定する方法および試薬 | |
| JP2892879B2 (ja) | 高分子量分析物の測定法 | |
| JPH02124462A (ja) | 改良免疫測定法 | |
| Kohno et al. | Novel enzyme immunoassay of anti‐insulin IgG in human serum | |
| CA1208550A (en) | Method of quantitative determination utilizing enzyme aggregation | |
| JPH11223631A (ja) | 前立腺特異抗原−α１−アンチキモトリプシン複合体の改善された測定方法 | |
| JPH03170058A (ja) | イムノアッセイ用試薬複合体 | |
| Teni et al. | Prostatic inhibin-like peptide quantified in urine of prostatic cancer patients by enzyme-linked immunosorbent assay. | |
| US6787325B1 (en) | Complexes containing crosslinked avidin, analytical method with the use of crosslinked avidin and analytical reagents and kits |