JP2872178B2

JP2872178B2 - Ｌ−アスパラギン酸の製造方法

Info

Publication number: JP2872178B2
Application number: JP35137996A
Authority: JP
Inventors: 隆哉林; 正治向山; 公一阪野
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 1994-05-20
Filing date: 1996-12-27
Publication date: 1999-03-17
Anticipated expiration: 2014-03-17
Also published as: JPH09168394A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、例えばマレイン酸
とアンモニアとから得られるマレイン酸及び／又はその
塩を随伴している、結晶Ｌ−アスパラギン酸製品に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、アスパルターゼ活性を有する微生
物を用いてフマル酸アンモニウムからＬ−アスパラギン
酸を製造する方法としては、α−アミノ酪酸に耐性を有
する微生物を好気的に培養後反応に供する方法（特公昭
６１−２９７１８号公報）、フマル酸添加培地で培養し
た微生物菌体を用いる方法（特開昭６０−１２０９８３
号公報）、天然物多糖由来のポリマー等に大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）を固定化した固定化微
生物充填カラムを用いる方法（特開昭５３−６４８３号
公報）など種々の方法が知られている。

【０００３】しかし、これらの製造方法では、原料とし
てマレイン酸より高価なフマル酸を利用しているため、
酵素あるいは微生物菌体を高度に利用したプロセスが種
々開発されてきているが、原料面でのコスト増は否めな
かった。また、反応生成物であるＬ−アスパラギン酸の
回収は通常硫酸などの鉱酸を反応液に添加することによ
りＬ−アスパラギン酸を晶析、分離して行われている
が、この場合、硫安などの副生成物が多量に発生し、こ
れらを除去する必要や廃棄物の問題などがあり、経済的
にも、環境的にもＬ−アスパラギン酸を沈澱させた母液
を循環使用する閉鎖系のシステムが望まれていた。

【０００４】ＵＳ４５６０６５３においてＬ−アスパラ
ギン酸生産の際にアスパルターゼもしくはアスパルター
ゼ生産菌をフマル酸とアンモニアに作用させ、生成した
Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムの水溶液にマレイン酸
を添加することによりＬ−アスパラギン酸を析出させ溶
液を異性化することにより、晶析後の母液を循環使用す
る方法が開示されている。しかし、母液中のマレイン酸
をフマル酸に変換するために母液にブロミドなどの化学
触媒添加後加熱して異性化しており、異性化触媒の除去
など煩雑な工程になっていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、安価
な原料を用い、工程が簡単であり、且つ多量のアンモニ
ウム塩を排出しない、Ｌ−アスパラギン酸の製造方法を
提供しようとするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明では、上記のよう
な問題点を解決するために鋭意検討を行った結果、異性
化工程においても酵素、あるいは微生物を用いた生化学
的な方法を用いることにより安価なマレイン酸より直接
Ｌ−アスパラギン酸が得られ、しかも、母液の循環使用
を可能にできる方法を確立し、本発明を完成させるに至
った。

【０００７】従って本発明は、マレイン酸とアンモニ
ア、及び／又はマレイン酸アンモニウムを含有する基質
媒体に、マレイン酸イソメラーゼ活性とアスパルターゼ
活性とを有する酵素含有物、又はマレイン酸イソメラー
ゼ活性を有する酵素含有物とアスパルターゼ活性を有す
る酵素含有物を作用せしめることによりＬ−アスパラギ
ン酸を生成せしめ、次にＬ−アスパラギン酸を含有する
反応済媒体からＬ−アスパラギン酸を採取することによ
りＬ−アスパラギン酸を製造する方法において、前記反
応済媒体に無水マレイン酸、及び／又はマレイン酸を添
加することによりＬ−アスパラギン酸を析出せしめて採
取し、残った母液にアンモニアを添加し基質媒体として
再使用することを特徴とする方法を提供する。

【０００８】本発明はまた、上記の方法により製造され
たマレイン酸を含有する工業用結晶Ｌ−アスパラギン酸
製品を提供する。

【０００９】

【発明の効果】本発明によれば、フマル酸より安価なマ
レイン酸を原料にＬ−アスパラギン酸が得られ、しか
も、ブロミドなどの化学触媒を母液に添加することなく
母液を循環使用できるため、Ｌ−アスパラギン酸を安価
にかつ効率よく製造することができる。

【００１０】

【具体的な説明】本発明に使用する微生物としては、マ
レイン酸イソメラーゼ活性とアスパルターゼ活性を有す
る微生物であれば特に限定されないが、例えばアルカリ
ゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する微生物
（アルカリゲネス・フェカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ８７５０）などマレ
イン酸よりＬ−アスパラギン酸を収率よく生成する特徴
を有する微生物が好適に用いられる。またマレイン酸イ
ソメラーゼ活性を有する微生物およびアスパルターゼ活
性を有する微生物をくみあわせて使用することも可能で
ある。

【００１１】マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生
物としては例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）属に属する微生物（シュードモナス・マルトフィ
リア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉ
ａ）ＡＴＣＣ１３２７０）などマレイン酸よりフマル酸
を収率よく生成する特徴を有する微生物であれば特に限
定されない。

【００１２】またアスパルターゼ活性を有する微生物と
しては例えばエッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）属に属する微生物（エッシェリシア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１１３０３，Ａ
ＴＣＣ９６３７，ＡＴＣＣ２７３２５）、ブレビバクテ
リウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微
生物などフマル酸よりＬ−アスパラギン酸を収率よく生
成する特徴を有する微生物であれば特に限定されない。

【００１３】マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生
物とアスパルターゼ活性を有する微生物は混合して反応
に用いてもまた別々に反応に用いることも可能である。
本発明の方法に使用される上記微生物菌体の調製に使用
する培地は特に限定されるものではなく、一般の微生物
に使用される培地でよい。培地の炭素源としては、例え
ば、グルコース、フラクトース、ショ糖などの糖類、マ
レイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酢酸などの有機酸、お
よびエタノールなどのアルコールが使用できる。

【００１４】培地の窒素源としては、アンモニア、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、
尿素などの無機塩類が使用できる。さらにペプトン、酵
母エキス、コーンスティープリカー、カサミノ酸などの
有機窒素源も使用できる。無機塩としては、燐酸−水素
カリウム、燐酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫
酸第一鉄等が用いられる。また必要に応じてビタミン類
も適宜添加できる。

【００１５】培養は通気攪拌、振とうなどの好気的条件
下で行い、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２８〜
３７℃である。培養液のpHはpH５〜１０、好ましくはpH
７〜８で行い、pHの調整は酸またはアルカリの添加によ
り行う。培養開始時の培地中の炭素源の濃度は０．０５
〜１０重量％、好ましくは０．５〜２重量％で行う。培
養期間は１０時間から４日間、好ましくは１５時間から
３日間で行う。

【００１６】上記のごとく培養して得られる微生物菌体
は遠心または濾過により集め、水または適当な緩衝液を
用いて洗浄し、本発明の反応に使用する。本発明の反応
に使用する酵素含有物としては、微生物菌体をそのまま
用いることもできるし、超音波、摩砕、凍結融解、界面
活性剤処理などにより物理的または生化学的に処理して
破砕した菌体破砕物、さらに、硫酸アンモニウム塩析、
アセトン沈澱等常法により得られる酵素を用いることも
できる。

【００１７】また当該菌体又は菌体破砕物もしくは酵素
をセルロース、アルギン酸、κ−カラギーナンなどの適
当な天然系高分子、あるいはイオン交換樹脂やポリアク
リルアミドなどの適当な合成系高分子を担体として常法
により固定化して用いることも可能である。固定化する
ことにより、酵素含有物と生産物との分離が容易にな
り、反応済媒体からの母液の循環使用の操作がより容易
に行うことが可能である。

【００１８】また、反応に用いる酵素含有物中からフマ
ラーゼなど該反応の妨げになりうる酵素を予め失活させ
た後に酵素含有物を反応に用いることも可能である。例
えば、酵素含有物を、予め、Ｌ−アスパラギン酸および
アンモニウムイオン存在下、アルカリ域で４０〜６０℃
に加熱処理を行うことでフマラーゼ活性を予め失活させ
ておくこともできる。

【００１９】本発明に用いられる基質となるカルボン酸
は無水マレイン酸、マレイン酸あるいはマレイン酸塩か
ら選ばれる少なくとも１つである。また本発明に用いら
れるアンモニアは液体アンモニア、アンモニア水溶液等
が使用可能であるが、取扱上、アンモニア水溶液が有利
である。アンモニア水の濃度としては特に限定されるも
のではないが、１０〜３５重量％が工業的に利用するの
が望ましい。

【００２０】使用されるアンモニアの量は母液中に含有
されるマレイン酸に対して１．０倍モル以上３倍モル以
下が好ましい。アンモニアの量が１倍モル未満ではＬ−
アスパラギン酸の収率が低下する結果を招いてしまい好
ましくない。またアンモニア量が３倍モル以上では反応
に関与する生体触媒の安定性が悪くなる結果を招く可能
性が高く好ましくない。また必要に応じて上記のアンモ
ニア量の範囲で水酸化ナトリウムあるいは水酸化カリウ
ムなどのアルカリ金属水酸化物を併用することもでき
る。

【００２１】なお、基質媒体のpHは５から１０の範囲、
好ましくは７．０から９．０の範囲、さらに８．０〜
９．０の範囲がより好ましい。マレイン酸とアンモニア
を混合する場合、混合は、どのように行ってもよいが、
両者の全量を一度に混合するのではなく、一方の全量に
対して他方を徐々に添加するのが好ましく、特にマレイ
ン酸の水溶液に対してアンモニアまたはアンモニア水を
徐々に添加するのが好ましい。

【００２２】マレイン酸とアンモニアとの反応はそれら
を溶解した水性媒体、例えば水又は緩衝液中で行う。緩
衝液としてはリン酸緩衝液等、常用の緩衝液を用いるこ
とができる。反応の際の原料のマレイン酸の濃度は５〜
４０重量％が好ましいが、マレイン酸塩の溶解性と生体
触媒の反応性を考えると特に１０〜３０重量％の範囲の
水溶液で反応させるのが効果的であり、より好ましくは
１０〜２５重量％の範囲の水溶液で反応させるのが効果
的である。

【００２３】また基質媒体には、さらに塩化マンガン、
硫酸マンガンなどのマンガン塩、または塩化マグネシウ
ム、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩または、亜
鉛塩、カルシウム塩、ニッケル塩、コバルト塩、鉄塩な
どの金属塩を０．１〜５０mM、好ましくは１〜１０mMの
濃度で添加することが望ましい。またメルカプトエタノ
ール、グルタチオン、システイン、ジチオスレイトール
などのＳＨ基を有する化合物を０．１〜５０mM、好まし
くは１〜１０mMの濃度で添加することが望ましい。

【００２４】本発明における反応槽の態様は特に限定さ
れないが、例えば、バッチ型反応装置、カラム型反応装
置など従来から知られている反応槽で反応を行うことが
できる。反応槽は１つであってもよいし、複数あっても
差し支えない。またカラム型の反応装置の場合には、通
液速度をカラムに充填されている酵素含有物の種類によ
って変えて反応することも可能である。

【００２５】反応温度は２０〜５０℃、好ましくは２５
〜４０℃の範囲で実施するのが望ましい。上記のような
条件でマレイン酸とアンモニアを反応させた後、得られ
た反応済媒体に無水マレイン酸、および／またはマレイ
ン酸を添加してＬ−アスパラギン酸を晶析させる。ま
た、母液の循環使用の妨げにならない範囲でマレイン酸
塩の添加も可能である。マレイン酸塩としては、マレイ
ン酸アンモニウム、マレイン酸ナトリウム、マレイン酸
カリウム等が使用される。

【００２６】前記マレイン酸などを用いてＬ−アスパラ
ギン酸の析出を行うことにより母液の循環使用が可能に
なる。晶析に鉱酸を用いると母液を循環使用するために
は鉱酸のアンモニウム塩が蓄積し脱塩工程が必要となり
好ましくない。ここでＬ−アスパラギン酸の析出のため
に添加されるマレイン酸は無水物でも有水物でも、また
酸でも塩でも使用可能である。またマレイン酸を水溶液
やスラリーの状態で添加することも可能である。この場
合マレイン酸水溶液の濃度は操作上２０重量％以上が望
ましい。いずれにせよ無機塩が生成しないため晶析物や
母液からの無機塩の除去操作は不要にすることが可能で
ある。

【００２７】Ｌ−アスパラギン酸の析出のために反応済
媒体に添加されるマレイン酸などの量は反応済媒体中に
含まれているＬ−アスパラギン酸（塩として存在）の量
に応じて決めることができる。添加されるマレイン酸の
モル比は、反応済媒体に含まれているＬ−アスパラギン
酸に対して０．５〜１．５倍モルが好ましく、０．８〜
１．２倍モルがより好ましく、１．００５〜１．１倍モ
ルがさらに好ましい。このモル比より少ないと晶析時に
回収されるＬ−アスパラギン酸の収率が低くなる恐れが
あり、過剰であるとＬ−アスパラギン酸以外の結晶が析
出する恐れがあり好ましくない。

【００２８】Ｌ−アスパラギン酸を析出せしめる際に
は、反応済媒体にマレイン酸等を徐々に添加していく方
法が好ましい。この方法であれば、析出したＬ−アスパ
ラギン酸の結晶が大きく、母液からの遠心分離などによ
り分離に適したものとなる。Ｌ−アスパラギン酸の晶析
は、０〜１００℃で１０分間〜４時間、好ましくは、２
０〜８０℃で３０〜１２０分間攪拌して晶析を完了させ
ることができる。

【００２９】また、反応済媒体を全く加温することなし
に、例えば酵素含有物との反応温度である２０〜５０℃
の温度において、マレイン酸を添加し、３０〜１２０分
間攪拌することにより同様にＬ−アスパラギン酸を高収
率で析出、回収することが可能である。２０〜５０℃の
範囲での晶析は、反応済媒体を加熱、冷却する操作を行
うことなく、Ｌ−アスパラギン酸を析出、採取できるた
め、工業的に極めて有利な方法である。

【００３０】析出したＬ−アスパラギン酸は、遠心濾
過、濾別などの従来の方法と同じやり方に従って母液と
分離される。分離されたＬ−アスパラギン酸は、必要に
応じて従来の方法と同じやり方に従って洗浄される。母
液と分離されたＬ−アスパラギン酸の粗結晶は、約１５
〜７重量％のマレイン酸又はその塩を含有しており、こ
の結晶を水洗することによりマレイン酸及び／又はマレ
イン酸塩の量を減少させることができる。

【００３１】例えば上記粗結晶を一回水洗することによ
り、マレイン酸及び／又はその塩の含量は約１重量％と
なり、さらに１回水洗することにより、マレイン酸及び
／又はその塩の量は約０．０３重量％となり、さらに数
回水洗することによりマレイン酸及び／又はその塩の量
は約０．０１重量％にまで減少させることができる。た
だし、母液の循環使用を考えた場合、あまり多量の水で
結晶を洗浄することはあまり好ましくない。なお、マレ
イン酸を含む洗液はＬ−アスパラギン酸晶析物を分離し
た母液と混合してＬ−アスパラギン酸の製造用原料とし
て再利用することが可能である。この場合、洗液は濃縮
した後に母液に混合しても何ら差しつかえない。

【００３２】こうして、極めて簡単な方法により、例え
ば０．０１〜１５重量％好ましくは０．０１〜１重量％
のマレイン酸及び／又はその塩を随伴するＬ−アスパラ
ギン酸の結晶を得ることができ、こうして得られたＬ−
アスパラギン酸の結晶の平均サイズは、晶析の方法を変
えることにより所望の平均サイズにすることができる
が、特にとり扱いやすい結晶の平均サイズとして５０〜
５００μｍの範囲結晶を得ることも可能である。このＬ
−アスパラギン酸は工業用アスパラギン酸として、例え
ば界面活性剤、金属イオン封鎖剤、洗剤用組成物、化粧
品用組成物、腐食防止剤、医薬品、塗料などの原料とし
て、また、アスパラギン酸（１）ポリマー及びそれらの
誘導体などの工業用有用なポリマーの原料として極めて
有用である。

【００３３】Ｌ−アスパラギン酸晶析物と分離した母液
は、Ｌ−アスパラギン酸の製造用原料として使用され
る。またＬ−アスパラギン酸の結晶を洗浄して生じた洗
液も母液と混合してＬ−アスパラギン酸の製造用原料と
して再使用される。すなわち、この母液（洗液を含んで
もよい）にマレイン酸、アンモニア、水などを適宜添加
したり、あるいは母液を濃縮したりして、母液中のマレ
イン酸濃度を例えば初期反応液と同じ濃度としたり、マ
レイン酸に対するアンモニアの当量比を１〜３倍モルに
調整したり、また容量を、例えば初期反応混合物と同じ
容積とするなど、適宜調整し、基質媒体としてから、マ
レイン酸とアンモニアの微生物菌体あるいは菌体破砕物
との反応→Ｌ−アスパラギン酸の上記晶析→Ｌ−アスパ
ラギン酸晶析物の上記分離（洗浄）→母液の上記使用を
繰り返すことにより、母液が循環使用される。本発明に
よれば、母液の循環使用は、１０回以上可能である。

【００３４】母液へのアンモニアの添加は、例えば、次
の点を考慮して行うのが、母液の循環使用を繰り返すた
めに、また微生物菌体あるいはその破砕物の寿命を長く
するためには好ましい。すなわち、循環使用される母液
中に含まれるアンモニア量が該母液に含まれるマレイン
酸に対して１〜３倍モル、好ましくは１．５〜２．５倍
モルになるように、アンモニアを添加する。

【００３５】本発明では、マレイン酸とアンモニア、あ
るいはマレイン酸アンモニウム塩をマレイン酸に対して
アンモニアを１〜３倍モル用い、マレイン酸イソメラー
ゼ活性とアスパルターゼ活性とを有する微生物菌体、あ
るいはマレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物菌体
およびアスパルターゼ活性を有する微生物菌体からなる
少なくとも２種類の微生物菌体、あるいはそれらの菌体
破砕物と２０〜５０℃で反応させる。

【００３６】マイレン酸イソメラーゼ活性を有する微生
物菌体などの酵素含有物およびアスパルターゼ活性を有
する酵素含有物は混合して用いてもよいし、あるいはマ
イレン酸イソメラーゼ含有物を用いて得られた反応済媒
体にアスパルターゼ含有物を作用させても差しつかえな
い。また反応に使用する微生物菌体あるいは菌体破砕物
などの酵素含有物は活性の低下に応じて適宜活性の高い
酵素含有物に一部ないし全部を交換したり、又は活性の
高い酵素含有物を追加すればよい。

【００３７】この反応によりＬ−アスパラギン酸アンモ
ニウムが生成するが、得られた反応済媒体に無水マレイ
ン酸、マレイン酸あるいはマレイン酸塩を添加してＬ−
アスパラギン酸結晶を析出させる。析出したＬ−アスパ
ラギン酸を母液と分離してＬ−アスパラギン酸が得られ
る。採取したＬ−アスパラギン酸結晶は水洗することに
よりマレイン酸及び／又はその塩の量を減少させること
ができる。このようにして製造されたＬ−アスパラギン
酸は工業用アスパラギン酸として極めて有用である。

【００３８】晶析物を分離した母液は、Ｌ−アスパラギ
ン酸結晶を洗浄した液とともにＬ−アスパラギン酸の製
造用原料として循環使用を繰り返すことができる。これ
により、原料の効率的利用、および、廃棄物の減少が図
られる。

【００３９】

【実施例】以下に本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。なお反応
生成物は、液体クロマトグラフィーにより分析した。実施例１．マレイン酸１重量％、マロン酸０．５重量
％、硫酸アンモニウム０．５重量％、燐酸１水素カリウ
ム０．３重量％、燐酸２水素カリウム０．１重量％、硫
酸マグネシウム７水塩０．０５重量％、酵母エキス２重
量％からなる組成の培地（pH６．５）６Ｌを全容１０Ｌ
のジャーファーメンターに仕込み、アルカリゲネス・フ
ェカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉ
ｓ）ＡＴＣＣ８７５０を接種し、３０℃で通気攪拌培養
を行った。培養２０時間目後に培養を終了し菌体を遠心
分離によって集めた。

【００４０】マレイン酸４００ｇをイオン交換水に溶解
し、２５重量％アンモニア水溶液４７０ｇ（マレイン酸
に対して２．０倍モル）を添加して、pH８．４のマレイ
ン酸アンモニウム溶液２Ｌを調整した。得られたマレイ
ン酸アンモニウム水溶液に０．１重量％の濃度になるよ
うにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を、また１mMの濃度にな
るように硫酸マグネシウムおよび１０mMの濃度になるよ
うにβ−メルカプトエタノールを添加し、基質媒体とし
た。基質媒体に上記の方法で集菌したアルカリゲネス・
フェカーリスの菌体を添加し、３０℃で２４時間にわた
り軽く基質媒体を攪拌した。

【００４１】反応後の反応済媒体の分析の結果、Ｌ−ア
スパラギン酸アンモニウムが、初期仕込マレイン酸に対
して９９．０モル％生成していた。遠心により菌体と分
離した反応済媒体を７０〜８０℃に保ちながら、マレイ
ン酸を４１０ｇ該反応済媒体に添加し、３０℃に冷却し
た。このときの液のpHは３．７であった。析出したＬ−
アスパラギン酸を濾別し、母液１．６Ｌを回収した。

【００４２】一方、濾別されたＬ−アスパラギン酸粗結
晶は５１０ｇ（水分を除く）（アスパラギン酸８８．４
重量％、マレイン酸１１．０重量％、平均結晶サイズ４
００μｍ）であった。濾過器内の結晶を約３００mlの水
で洗浄し、乾燥したところ、得られたＬ−アスパラギン
酸結晶は４５０ｇ（アスパラギン酸９９．０重量％、マ
レイン酸０．５８重量％、平均結晶サイズ１５０μｍ）
であった。

【００４３】ついで結晶を分離した母液と洗液を減圧濃
縮し、２５重量％アンモニア水溶液を添加してpHを８．
４に調整し、水を加えて２Ｌとした。これを基質媒体と
して、遠心回収した菌体と再度上記と同条件で反応させ
た。反応後の反応済媒体を分析したところ、反応済媒体
中にＬ−アスパラギン酸アンモニウムが、晶析のために
添加されたマレイン酸基準で９９．２モル％存在してい
た。

【００４４】この反応済媒体を同様に遠心分離して菌体
を除去後、マレイン酸を４１０ｇ添加して、上記と同様
な方法で加熱・冷却の操作を行った。析出したＬ−アス
パラギン酸を吸引濾過し、約３００mlの水で２回洗浄
し、再度吸引濾過し、十分に水分をきり、乾燥してＬ−
アスパラギン酸結晶４６０ｇを得た。この結晶の純度は
９９．６重量％（マレイン酸含有率０．０２重量％）
（水分を除く）（結晶平均サイズ８０μｍ）であった。

【００４５】得られた結晶を２Ｌの水中に懸濁させなが
ら水洗し、再度吸引濾過後、乾燥したところ、Ｌ−アス
パラギン酸の結晶の純度は９９．６重量％（マレイン酸
含有量０．０１重量％）（水分除く）（結晶平均サイズ
８０μｍ）であった。

【００４６】実施例２．実施例１の要領でマレイン酸４
００ｇを含むマレイン酸アンモニウム基質媒体２Ｌにア
ルカリゲネス・フェカーリスＡＴＣＣ８７５０の菌体を
添加し３０℃で２４時間にわたり軽く基質媒体を攪拌し
た。反応後の反応済媒体の分析の結果、Ｌ−アスパラギ
ン酸アンモニウムが、初期仕込マレイン酸に対して９
９．０モル％生成していた。遠心により菌体と分離した
反応済媒体に３０℃で、マレイン酸４１０ｇを添加し
た。添加後の液温は３４．５℃、液のpHは３．８であっ
た。

【００４７】析出したＬ−アスパラギン酸を濾別し、母
液１．６Ｌを回収した。一方、濾別されたＬ−アスパラ
ギン酸粗結晶は５０２ｇ（水分を除く）（アスパラギン
酸８９．１重量％、マレイン酸１０．２重量％、平均結
晶サイズ２５０μｍ）であった。濾過器内の結晶を約３
００mlの水で洗浄し、乾燥したところ、得られたＬ−ア
スパラギン酸の結晶は４４７ｇ（アスパラギン酸９９．
０重量％、マレイン酸０．６２重量％、平均結晶サイズ
１００μｍ）であった。

【００４８】ついで結晶を分離した母液と洗液を減圧濃
縮し、２５重量％アンモニア水溶液を添加してpHを８．
４に調整し、水を加えて２Ｌとした。これを基質媒体と
して、遠心回収した菌体と再度上記と同条件で反応させ
た。反応後の反応済媒体を分析したところ、反応済媒体
中にＬ−アスパラギン酸アンモニウムが、晶析時に添加
されたマレイン酸基準で９９．３モル％存在していた。
この反応済媒体から菌体を除去後、上記と同様の方法で
マレイン酸を４１０ｇ添加して、上記と同様の方法でＬ
−アスパラギン酸の晶析、回収を行った後に、約３００
mlの水で２回洗浄し、乾燥してＬ−アスパラギン酸結晶
を４５５ｇ（水分除く）得た。得られたＬ−アスパラギ
ン酸は純度９９．４重量％、結晶平均サイズ６０μｍで
あった。

【００４９】実施例３．実施例１の要領でマレイン酸４
００ｇを含むマレイン酸アンモニウム基質媒体２Ｌにア
ルカリゲネス・フェカーリスＡＴＣＣ８７５０の菌体を
添加し３０℃で２４時間にわたり軽く基質媒体を攪拌し
た。反応後の反応済媒体の分析の結果、Ｌ−アスパラギ
ン酸アンモニウムが、初期仕込マレイン酸に対して９
９．０モル％生成していた。遠心により菌体と分離した
反応済媒体に３０℃で、３３．３重量％のマレイン酸水
溶液１．２３kgを添加した。添加後の液温は３８．５
℃、液のpHは３．７であった。析出したＬ−アスパラギ
ン酸を濾別し、母液２．３７Ｌを回収した。

【００５０】一方、濾別されたＬ−アスパラギン粗結晶
は４８１ｇ（水分を除く）（アスパラギン酸９３．６重
量％、マレイン酸６．０重量％、平均結晶サイズ２５０
μｍ）であった。濾過器内の結晶を約３００mlの水で洗
浄し、乾燥したところ、得られたＬ−アスパラギン酸の
結晶は４４８ｇ（水分を除く）（アスパラギン酸９９．
１重量％、マレイン酸０．５０重量％、平均結晶サイズ
２００μｍ）であった。

【００５１】ついで結晶を分離した母液２．３７Ｌと洗
液を混合後、１．７Ｌまで減圧濃縮した。濃縮液に２５
重量％アンモニア水溶液２４０ｇを添加してpHを８．４
に調整後、水を加えて全量を２Ｌに調整した。これを基
質媒体として、上記に述べた菌体と再度上記の条件で反
応させた。反応後の反応済媒体を分析したところ、反応
済媒体中にＬ−アスパラギン酸アンモニウムが、晶析の
ために添加されたマレイン酸基準で９９．３モル％存在
していた。

【００５２】この反応済媒体を同様に遠心分離して菌体
を除去後、加温することなしに室温で３３．３重量％の
マレイン酸水溶液１．２３kgを添加してＬ−アスパラギ
ン酸の晶析を行った。析出したＬ−アスパラギン酸を吸
引濾過し、約３００mlの水で２回洗浄し、乾燥してＬ−
アスパラギン酸結晶４６０ｇ（水分を除く）を得た。こ
の結晶の純度は９９．３重量％（マレイン酸含有率０．
４４重量％）（結晶平均サイズ２００μｍ）であった。

【００５３】実施例４．実施例１の要領でマレイン酸２
００ｇをイオン交換水に溶解し、２５重量％のアンモニ
ア水溶液２３５ｇ（対マレイン酸２．０倍モル）を添加
してマレイン酸２００ｇを含むマレイン酸アンモニウム
基質媒体（pH８．４）２Ｌにアルカリゲネス・フェカー
リスＡＴＣＣ８７５０の菌体を添加し３０℃で２４時間
にわたり軽く基質媒体を攪拌した。反応後の反応済媒体
の分析の結果、Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムが、初
期仕込マレイン酸に対して９９．０モル％生成してい
た。遠心により菌体と分離した反応液に３０℃で、マレ
イン酸を２０５ｇを添加した。添加後の液温は３２．５
℃、液のpHは３．７であった。

【００５４】析出したＬ−アスパラギン酸を濾別し、母
液１．７５Ｌを回収した。一方、濾別されたＬ−アスパ
ラギン粗結晶は２４５ｇ（水分を除く）（アスパラギン
酸９１．４重量％、マレイン酸８．０重量％、平均結晶
サイズ３００μｍ）であった。濾過器内の結晶を約３０
０mlの水で洗浄し、乾燥したところ、得られたＬ−アス
パラギン酸の結晶は２２５ｇ（水分を除く）（アスパラ
ギン酸９９．０重量％、マレイン酸０．６９重量％、平
均結晶サイズ１５０μｍ）であった。ついで結晶を分離
した母液と洗液を減圧濃縮し、２５重量％アンモニア水
溶液を添加してpHを８．４に調整し、水を加えて２Ｌと
した。

【００５５】これを基質媒体として、遠心回収した菌体
と再度上記と同条件で反応させた。反応後の反応済媒体
を分析したところ、反応済媒体中にＬ−アスパラギン酸
アンモニウムが、晶析時に添加されたマレイン酸基準で
９８．９モル％存在していた。この反応済媒体から菌体
を除去後、上記と同様の方法でマレイン酸を２０５ｇ添
加して、上記と同様の方法でＬ−アスパラギン酸の晶
析、回収を行った後に、約３００mlの水で２回洗浄し、
乾燥してＬ−アスパラギン酸結晶を２２８ｇ（水分除
く）得た。得られたＬ−アスパラギン酸は純度９９．５
重量％、結晶平均サイズ８０μｍであった。

【００５６】実施例５．実施例１の要領でマレイン酸６
００ｇをイオン交換水に溶解し、２５重量％のアンモニ
ア水溶液７０５ｇ（対マレイン酸２．０倍モル）を添加
してマレイン酸６００ｇを含むマレイン酸アンモニウム
基質媒体（pH８．４）２Ｌにアルカリゲネス・フェカー
リスＡＴＣＣ８７５０の菌体を添加し３０℃で７２時間
にわたり軽く基質媒体を攪拌した。反応後の反応済媒体
の分析の結果、Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムが、初
期仕込マレイン酸に対して９８．８モル％生成してい
た。遠心により菌体と分離した反応済媒体に３０℃で、
マレイン酸を６１０ｇを添加した。添加後の液温は３７
℃、液のpHは３．８であった。

【００５７】析出したＬ−アスパラギン酸を濾別し、母
液１．５Ｌを回収した。一方、濾別されたＬ−アスパラ
ギン粗結晶は７６９ｇ（水分を除く）（アスパラギン酸
８８．０重量％、マレイン酸１１．４重量％、平均結晶
サイズ２５０μｍ）であった。濾過器内の結晶を約６０
０mlの水で洗浄し、乾燥したところ、得られたＬ−アス
パラギン酸の結晶は６７５ｇ（水分を除く）（アスパラ
ギン酸９８．８重量％、マレイン酸０．７７重量％、平
均結晶サイズ１００μｍ）であった。

【００５８】ついで結晶を分離した母液と洗液を減圧濃
縮し、２５重量％アンモニア水溶液を添加してpHを８．
４に調整し、水を加えて２Ｌとした。これを基質媒体と
して、遠心回収した菌体と再度上記と同条件で反応させ
た。反応後の反応済媒体を分析したところ、反応済媒体
中にＬ−アスパラギン酸アンモニウムが、晶析時に添加
されたマレイン酸基準で９８．８モル％存在していた。
この反応済媒体から菌体を除去後、上記と同様の方法で
マレイン酸を６１０ｇ添加して、上記と同様の方法でＬ
−アスパラギン酸の晶析、回収を行った後に、約１Ｌの
水で２回洗浄し、乾燥してＬ−アスパラギン酸結晶を６
７３ｇ（水分除く）得た。得られたＬ−アスパラギン酸
は純度９９．５重量％、結晶平均サイズ１５０μｍであ
った。

【００５９】実施例６．マレイン酸１重量％、硫酸アン
モニウム０．５重量％、燐酸１水素カリウム０．３重量
％、燐酸２水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウ
ム７水塩０．０５重量％、酵母エキス２重量％からなる
組成の培地（pH６．５）６Ｌを全容１０Ｌのジャーファ
ーメンターに仕込み、シュードモナス・マルトフィリラ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）
ＡＴＣＣ１３２７０を接種し、３０℃で通気攪拌培養を
行った。培養２０時間目後に培養を終了し菌体を遠心分
離によって集めた。

【００６０】また、フマル酸２重量％、コーンスティー
プ・リカー２重量％、酵母エキス２重量％、リン酸一カ
リウム０．１重量％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０
５重量％の組成からなる培地（アンモニア水でpHを７．
５に調整）１Ｌを全容２Ｌのジャーファーメンターに仕
込み、エッシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１１３０３を接種し、３７℃で通
気攪拌培養を行った。培養２０時間目後に培養を終了し
菌体を遠心分離によって回収した。

【００６１】マレイン酸４００ｇをイオン交換水に溶解
し、２５％アンモニア水溶液４７０ｇ（マレイン酸に対
して２．０倍モル）を添加してpHを８．４に調整したマ
レイン酸アンモニウム溶液２Ｌを調整した。得られたマ
レイン酸アンモニウム水溶液に０．１％の濃度になるよ
うにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を、また１mMの濃度にな
るように硫酸マグネシウムおよび１０mMの濃度になるよ
うにβ−メルカプトエタノールを添加し、基質媒体とし
た。基質媒体に上記の方法で集菌して得られたシュード
モナス・マルトフィリアの菌体及びエッシェリシア・コ
リの菌体を添加し、３０℃で２４時間にわたり軽く基質
媒体を攪拌した。

【００６２】反応後の反応済媒体の分析の結果、Ｌ−ア
スパラギン酸アンモニウムが、初期仕込マレイン酸に対
して９９．３モル％生成していた。遠心により菌体と分
離した反応済媒体を７０〜８０℃に保ちながら、マレイ
ン酸４１０ｇを該反応液に添加し、３０℃に冷却した。
このときの液のpHは３．８であった。析出したＬ−アス
パラギン酸は濾別し、母液１．７０Ｌを回収した。一
方、濾別されたＬ−アスパラギン酸は５０５ｇ（水分を
除く）（アスパラギン酸９０．０重量％、マレイン酸
９．５重量％、結晶平均サイズ３５０μｍ）であった。
濾過器内の結晶を約３００mlの水で洗浄し、乾燥したと
ころ、得られたＬ−アスパラギン酸結晶は４５１ｇ（ア
スパラギン酸９９．１重量％、マレイン酸０．５５重量
％、結晶平均サイズ１００μｍ）であった。

【００６３】ついで結晶を分離した母液と洗液を濃縮
し、２５重量％アンモニア水溶液を添加したpHを８．４
に調整した後、水を加えて２Ｌとした。これを基質媒体
として、遠心回収した２種類の菌体と再度上記と同条件
で反応させた。反応後の反応済媒体を分析したところ、
Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムが、晶析のために添加
されたマレイン酸基準で９９．５モル％生成していた。
この反応済媒体から菌体を除去後、マレイン酸を４１０
ｇ添加し、上記と同様な方法で析出したＬ−アスパラギ
ン酸の結晶を水洗、乾燥したところ、４５５ｇ（水分除
く）の結晶を得た。得られたＬ−アスパラギン酸結晶は
純度９９．０％（マレイン酸０．６重量％、結晶平均サ
イズ１００μｍ）であった。

【００６４】結晶を分離した母液と結晶を洗浄した洗液
を循環使用し、上記と同様の操作を上記に述べた２種類
の新鮮な菌体を用いてさらに繰り返しマレイン酸とアン
モニアの反応を合計１０回行った（母液の循環使用回数
は９回）。１０回目の操作により、得られたＬ−アスパ
ラギン酸は、９回目の操作において晶析のために添加さ
れたマレイン酸に対して収率９５．０モル％、純度９
９．３％、マレイン酸０．５２重量％、結晶平均サイズ
１００μｍであった。

【００６５】実施例７．実施例６の要領でマレイン酸４
００ｇを含むマレイン酸アンモニウム基質媒体２Ｌにシ
ュードモナス・マルトフィラ（ＡＴＣＣ１３２７０）の
菌体及びエッシェリシア・コリ（ＡＴＣＣ１１３０３）
の菌体を添加し、３０℃で２４時間にわたり軽く基質媒
体を攪拌した。反応後の反応済媒体の分析の結果、Ｌ−
アスパラギン酸アンモニウムが、初期仕込マレイン酸に
対して９９．３モル％生成していた。遠心により菌体と
分離した反応済媒体に３０℃で、マレイン酸を４１０ｇ
を添加した。添加後の液温は３４℃、液のpHは３．７で
あった。

【００６６】析出したＬ−アスパラギン酸を濾別し、母
液１．６Ｌを回収した。一方、濾別されたＬ−アスパラ
ギン粗結晶は５１７ｇ（水分を除く）（アスパラギン酸
８８．０重量％、マレイン酸１０．７重量％、平均結晶
サイズ４００μｍ）であった。濾過器内の結晶を約４０
０mlの水で洗浄し、乾燥したところ、得られたＬ−アス
パラギン酸の結晶は４５２ｇ（水分を除く）（アスパラ
ギン酸９８．６重量％、マレイン酸１．０重量％、平均
結晶サイズ３００μｍ）であった。

【００６７】ついで結晶を分離した母液と洗液を減圧濃
縮し、２５重量％アンモニア水溶液を添加してpHを８．
４に調整し、水を加えて２Ｌとした。これを基質媒体と
して、遠心回収した菌体と再度上記と同条件で反応させ
た。反応後の反応済媒体を分析したところ、反応済媒体
中にＬ−アスパラギン酸アンモニウムが、晶析時に添加
されたマレイン酸基準で９８．５モル％存在していた。
この反応済媒体から菌体を除去後、上記と同様の方法で
マレイン酸を４１０ｇ添加して、上記と同様の方法でＬ
−アスパラギン酸の晶析、回収を行った後に、約３００
mlの水で２回洗浄し、乾燥してＬ−アスパラギン酸結晶
を４５７ｇ（水分除く）得た。得られたＬ−アスパラギ
ン酸は純度９９．５重量％、結晶平均サイズ１００μｍ
であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献特開平８−205880（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 13/00 - 13/24

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】０．０１〜１５重量％のマレイン酸及び
／又はその塩を随伴しており、且つ結晶サイズが５０〜
５００μｍである結晶Ｌ−アスパラギン酸製品。
【請求項２】０．０１〜１重量％のマレイン酸及び／
又はその塩を随伴しており且つ結晶の平均サイズが５０
〜５００μｍであるＬ−アスパラギン酸製品。