JP2862556B2 - 微生物を検出するための装置及びデバイス - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、サンプルを作製し容器を密封後容器内に立
入ることなく、生育媒体及び密封容器を用いて検体中の
pH又はCO2変化を連続的に監視するためのデバイス及び
装置に関する。本発明の更なる効果は検体中の成分によ
り比色定量が影響されないことにあり、本発明は検体中
のpH又はCO2濃度を実質的に連続に監視するための手段
にも関する。
入ることなく、生育媒体及び密封容器を用いて検体中の
pH又はCO2変化を連続的に監視するためのデバイス及び
装置に関する。本発明の更なる効果は検体中の成分によ
り比色定量が影響されないことにあり、本発明は検体中
のpH又はCO2濃度を実質的に連続に監視するための手段
にも関する。
従来の技術 臨床検体中に微生物汚染の有無は、通常栄養素の存在
下で検体を培養し、長期間後の検体中もしくは検体上方
の雰囲気中の変化から微生物活性を検出して調べる。例
えば、米国特許第4,182,656号明細書（Ahnellら）で
は、サンプルを13C標識した醗酵可能な基質を含む培地
と一緒に容器に導入する。容器を密閉し、検体を生物学
的活性を促す状態に置いた後、検体上方の気体状雰囲気
中の13C対12Cの比率を測定し、当初の比率と比較してい
る。米国特許第4,152,213号明細書には、検体中の酸素
消費バクテリアの存在を、密閉容器内で容器中のガス圧
を監視して検体上方の雰囲気中の酸素量の減少を検出す
ることにより測定する方法が記載されている。米国特許
第4,073,691号明細書には、培地を含む密閉容器中でバ
クテリアを含めた生物学的活性物の存在を長期間後の検
体上方の気体状雰囲気の特性の変化を測定することによ
り調べる方法が提供されている。気体状雰囲気中のCO2
変化を非侵入的（non−invasive）に検出する方法は、1
984年４月４日付にて公開された欧州特許出願83108468.
6号明細書に開示されている如くSuppmanらにより教示さ
れている。上記した刊行物及びその他の刊行物に記載さ
れている方法及び装置は全て、培養後の気体状雰囲気中
の変化を調べるために放射測定法もしくは密閉容器への
侵入を必要とするか、又は赤外光を通過させる特殊な材
料を必要とするものである。
下で検体を培養し、長期間後の検体中もしくは検体上方
の雰囲気中の変化から微生物活性を検出して調べる。例
えば、米国特許第4,182,656号明細書（Ahnellら）で
は、サンプルを13C標識した醗酵可能な基質を含む培地
と一緒に容器に導入する。容器を密閉し、検体を生物学
的活性を促す状態に置いた後、検体上方の気体状雰囲気
中の13C対12Cの比率を測定し、当初の比率と比較してい
る。米国特許第4,152,213号明細書には、検体中の酸素
消費バクテリアの存在を、密閉容器内で容器中のガス圧
を監視して検体上方の雰囲気中の酸素量の減少を検出す
ることにより測定する方法が記載されている。米国特許
第4,073,691号明細書には、培地を含む密閉容器中でバ
クテリアを含めた生物学的活性物の存在を長期間後の検
体上方の気体状雰囲気の特性の変化を測定することによ
り調べる方法が提供されている。気体状雰囲気中のCO2
変化を非侵入的（non−invasive）に検出する方法は、1
984年４月４日付にて公開された欧州特許出願83108468.
6号明細書に開示されている如くSuppmanらにより教示さ
れている。上記した刊行物及びその他の刊行物に記載さ
れている方法及び装置は全て、培養後の気体状雰囲気中
の変化を調べるために放射測定法もしくは密閉容器への
侵入を必要とするか、又は赤外光を通過させる特殊な材
料を必要とするものである。
検体特に血液培養物の微生物汚染を調べる他の公知の
方法では、温度,pH,濁度，色，生物発光及びインピーダ
ンスの僅かな変化を調べている。通常、これらの方法は
細菌の代謝副産物を検出して微生物汚染を調べる。微生
物汚染を継代培養及び／又は染色により調べることもで
きる。これらの方法の中で、インピーダンス、放射測定
法及び赤外分光法のみが臨床検体を自動処理し得る可能
性を有する。また、インピーダンス及び赤外測定以外の
方法は、液体検体又は検体上方の気体状雰囲気を調べる
ために容器に侵入しなければならない。汚染の可能性が
あり且つ測定時に検体上方の雰囲気の構成要素が変化す
る可能性が生ずるので、これらの方法では長期間に亘り
連続的に又は短期間づつ繰返し測定することができな
い。これは重大な欠点である。なぜならば、汚染微生物
の生育速度が微生物及びオリジナルサンプル中の微生物
の数により異なり、雰囲気又は流体サンプル中の検出可
能な変化が汚染検体により生じたときに予知できないか
らである。関連する問題において、汚染を液体サンプル
中のpH変化により測定したときには各種代謝産物がサン
プルのpHに様々な影響を及ぼすことがある。例えば、ア
ンモニアの産生はpHを上昇させ、CO2の産生はpHを低下
させる。汚染生物の生育速度の違いにより、あるときに
はpHが上昇し、またあるときにはpHが低下するので、pH
を長時間間隔で測定したときには微生物汚染は検出され
ない。全血サンプルのpH測定により変化を検出すると
き、特に指示染料がpH測定の手段のときの誤差原因は、
染料の外観が赤血球により影響されたり又は閉塞される
可能性があることである。検体の種類に応じて生じる誤
差が染料の外観の影響を受けないならば、比色指示薬が
有効に使用され得る。
方法では、温度,pH,濁度，色，生物発光及びインピーダ
ンスの僅かな変化を調べている。通常、これらの方法は
細菌の代謝副産物を検出して微生物汚染を調べる。微生
物汚染を継代培養及び／又は染色により調べることもで
きる。これらの方法の中で、インピーダンス、放射測定
法及び赤外分光法のみが臨床検体を自動処理し得る可能
性を有する。また、インピーダンス及び赤外測定以外の
方法は、液体検体又は検体上方の気体状雰囲気を調べる
ために容器に侵入しなければならない。汚染の可能性が
あり且つ測定時に検体上方の雰囲気の構成要素が変化す
る可能性が生ずるので、これらの方法では長期間に亘り
連続的に又は短期間づつ繰返し測定することができな
い。これは重大な欠点である。なぜならば、汚染微生物
の生育速度が微生物及びオリジナルサンプル中の微生物
の数により異なり、雰囲気又は流体サンプル中の検出可
能な変化が汚染検体により生じたときに予知できないか
らである。関連する問題において、汚染を液体サンプル
中のpH変化により測定したときには各種代謝産物がサン
プルのpHに様々な影響を及ぼすことがある。例えば、ア
ンモニアの産生はpHを上昇させ、CO2の産生はpHを低下
させる。汚染生物の生育速度の違いにより、あるときに
はpHが上昇し、またあるときにはpHが低下するので、pH
を長時間間隔で測定したときには微生物汚染は検出され
ない。全血サンプルのpH測定により変化を検出すると
き、特に指示染料がpH測定の手段のときの誤差原因は、
染料の外観が赤血球により影響されたり又は閉塞される
可能性があることである。検体の種類に応じて生じる誤
差が染料の外観の影響を受けないならば、比色指示薬が
有効に使用され得る。
発明の要旨 本発明は、血液又は他の体液のような臨床検体中の微
生物の存在を、検体を透明な密封滅菌容器中で無菌生育
媒体を用いて培養することにより検出するための装置及
びデバイスに関する。微生物の存在は、検体中のpH変化
又は検体内でのCO2の産生を容器の内表面に貼付した使
い捨て式センサを用いて検出又は測定することにより調
べられる。本発明によれば、微生物を非放射測定及び非
侵入手段（non−radiometric and non−invasive mean
s）により高濃度の赤血球のような干渉物質の存在下で
検出することができる。
生物の存在を、検体を透明な密封滅菌容器中で無菌生育
媒体を用いて培養することにより検出するための装置及
びデバイスに関する。微生物の存在は、検体中のpH変化
又は検体内でのCO2の産生を容器の内表面に貼付した使
い捨て式センサを用いて検出又は測定することにより調
べられる。本発明によれば、微生物を非放射測定及び非
侵入手段（non−radiometric and non−invasive mean
s）により高濃度の赤血球のような干渉物質の存在下で
検出することができる。
図面の説明 第１図……血液培養器具 第１図に器具の機能要素、（１）容器，（２）セン
サ，（３）培地，（４）光源，（５）光検出器を備えた
検出器アセンブリ、並びに（６）電源，（７）電流−電
圧変換器及び（８）低域濾波器を含む付随電子装置の外
観を示す。
サ，（３）培地，（４）光源，（５）光検出器を備えた
検出器アセンブリ、並びに（６）電源，（７）電流−電
圧変換器及び（８）低域濾波器を含む付随電子装置の外
観を示す。
各検出器は好ましくは、埋頭孔内の光ダイオード及び
光が検出器そのものに直接ではなく観察すべき面に当た
るように配列した１個もしくはそれ以上のLEDから構成
される。この具体例における電子回路は、信号を検出器
からコンティションするためのアンプリファイア及びフ
ィルタ、有効な信号の中から選択するためのマルチプレ
クサ並びに発光体用定電流源を含む。
光が検出器そのものに直接ではなく観察すべき面に当た
るように配列した１個もしくはそれ以上のLEDから構成
される。この具体例における電子回路は、信号を検出器
からコンティションするためのアンプリファイア及びフ
ィルタ、有効な信号の中から選択するためのマルチプレ
クサ並びに発光体用定電流源を含む。
デバイス全体を、微生物の発育に適した環境が与えら
れている37℃インキュベータ内の攪拌機上に設置した。
前記インキュベータでは室内光が光検出器から締め出さ
れている。
れている37℃インキュベータ内の攪拌機上に設置した。
前記インキュベータでは室内光が光検出器から締め出さ
れている。
第２図……pH感応性 各種の着色ボトルを用いて器具を客観的に調べた他、
pH感応膜ボトルを用いて調べた。この図には、センサを
各種緩衝液を用いてpH 5.8乃至8.2の範囲に平衡化させ
た後の７種の検出器の平均電圧出力を示す。詳細な研究
の結果、システムはpH 6.0乃至7.5の範囲で0.1pH単位の
変化を確実に区別できることが判明した。
pH感応膜ボトルを用いて調べた。この図には、センサを
各種緩衝液を用いてpH 5.8乃至8.2の範囲に平衡化させ
た後の７種の検出器の平均電圧出力を示す。詳細な研究
の結果、システムはpH 6.0乃至7.5の範囲で0.1pH単位の
変化を確実に区別できることが判明した。
第３図……微生物の生育に伴うpH及びCO2変化 器具を用いて、微生物の生育をpH変化及びCO2産生に
より検出した。この図には、バクテリア（大腸菌）の生
育に伴うpH及びCO2の変化を示す。
より検出した。この図には、バクテリア（大腸菌）の生
育に伴うpH及びCO2の変化を示す。
第４図……各種微生物の検出 本質的に全ての微生物はその代謝過程でCO2を放出す
る。従って、このシステムを使用すると広範囲に亘る微
生物の生育を検出することができる。この図には、大腸
菌（グラム陰性菌）、化膿連鎖球菌（グラム陽性菌）、
緑膿菌（グラム陰性非醗酵菌）、バシラス・フラギリス
（嫌気性菌）及びカンジダ・アルビカンス（酵母）の生
育中に産生したCO2の検出を示す。単位は、アッセイ開
始時のCO2濃度を基準とした媒体中の相対CO2濃度であ
る。サンプル容器及び媒体を室温（約20℃）におき、容
器及びサンプルをアッセイ中37℃でインキュベートする
と、CO2は最初の２〜４時間液体サンプル及び媒体上方
の空間に放出される。これは温度の上昇に伴ってCO2の
液体中への溶解度が低下するからである。サンプルを器
具中に導入し配置する前に容器及び媒体を37℃に維持し
ないならば、最小CO2濃度に達するまで典型的には最初
の２〜４時間内は微生物の存在を確実に検出することが
できない。
る。従って、このシステムを使用すると広範囲に亘る微
生物の生育を検出することができる。この図には、大腸
菌（グラム陰性菌）、化膿連鎖球菌（グラム陽性菌）、
緑膿菌（グラム陰性非醗酵菌）、バシラス・フラギリス
（嫌気性菌）及びカンジダ・アルビカンス（酵母）の生
育中に産生したCO2の検出を示す。単位は、アッセイ開
始時のCO2濃度を基準とした媒体中の相対CO2濃度であ
る。サンプル容器及び媒体を室温（約20℃）におき、容
器及びサンプルをアッセイ中37℃でインキュベートする
と、CO2は最初の２〜４時間液体サンプル及び媒体上方
の空間に放出される。これは温度の上昇に伴ってCO2の
液体中への溶解度が低下するからである。サンプルを器
具中に導入し配置する前に容器及び媒体を37℃に維持し
ないならば、最小CO2濃度に達するまで典型的には最初
の２〜４時間内は微生物の存在を確実に検出することが
できない。
好ましい具体例の記載 本発明の装置及びデバイスは、臨床検体例えば血液サ
ンプル又は他の体液中の微生物の存在を、微生物により
産生される代謝産物の増加を測定することにより検出す
るための非侵入的（non−invasive）手段である。検体
を或る微生物の代謝産物の産生を増強するように特に調
製された媒体に添加し、前記代謝産物を培養ボトルの底
に配置した独自の使い捨て式センサを用いて検出する。
センサは固体組成物もしくは膜（付属物又は指示媒体と
称する）、及びその上若しくはその内に不動化させた指
示媒体を含む。センサを、指示媒体が外側から目に見え
るように容器の内表面と同一表面に置き、細胞，タンパ
ク，他の固体又は他の不透明なもしくは着色された成分
がセンサと容器表面の間に入り込まないように密封す
る。ある具体例では、気体分子は通過するがイオンは通
過しない膜又は固体層により、センサと検体及び生育媒
体とが隔離されている。本発明によれば、1ml当り１個
の微生物を含む血液のような体液検体中の微生物を検出
することができる。前記検体では、微生物の数が代謝産
物の増加を測定し得る臨界レベルに達するまで最高７日
のインキュベーション期間を要する。本出願人の知見で
は、ある種の微生物の場合106CFU/mlの濃度でpH又はCO2
に測定可能な変化が生ずる。全ての微生物が107〜108CF
U/mlの濃度で測定可能な結果が認められた。
ンプル又は他の体液中の微生物の存在を、微生物により
産生される代謝産物の増加を測定することにより検出す
るための非侵入的（non−invasive）手段である。検体
を或る微生物の代謝産物の産生を増強するように特に調
製された媒体に添加し、前記代謝産物を培養ボトルの底
に配置した独自の使い捨て式センサを用いて検出する。
センサは固体組成物もしくは膜（付属物又は指示媒体と
称する）、及びその上若しくはその内に不動化させた指
示媒体を含む。センサを、指示媒体が外側から目に見え
るように容器の内表面と同一表面に置き、細胞，タンパ
ク，他の固体又は他の不透明なもしくは着色された成分
がセンサと容器表面の間に入り込まないように密封す
る。ある具体例では、気体分子は通過するがイオンは通
過しない膜又は固体層により、センサと検体及び生育媒
体とが隔離されている。本発明によれば、1ml当り１個
の微生物を含む血液のような体液検体中の微生物を検出
することができる。前記検体では、微生物の数が代謝産
物の増加を測定し得る臨界レベルに達するまで最高７日
のインキュベーション期間を要する。本出願人の知見で
は、ある種の微生物の場合106CFU/mlの濃度でpH又はCO2
に測定可能な変化が生ずる。全ての微生物が107〜108CF
U/mlの濃度で測定可能な結果が認められた。
本発明は下記するような独自な利点を有する。
１）微生物の代謝産物を、検体上方の雰囲気中よりもむ
しろ培養ボトルの液相中で測定する； ２）独自の使い捨て式センサがボトルの内表面に貼付さ
れているので、ボトルの形を損うことなくボトルの透明
壁の外側から測定することが可能である； ３）肉眼で又は反射率を測定する計器を用いて外部から
測定することができる； ４）センサの上記変化を測定又は検出する能力が検体中
の不透明又は着色成分により妨害されない； ５）高濃度の指示分子（indicator molecules）が少
量、即ち膜上に保持されているので、色の変化を容易に
観察することができる。
しろ培養ボトルの液相中で測定する； ２）独自の使い捨て式センサがボトルの内表面に貼付さ
れているので、ボトルの形を損うことなくボトルの透明
壁の外側から測定することが可能である； ３）肉眼で又は反射率を測定する計器を用いて外部から
測定することができる； ４）センサの上記変化を測定又は検出する能力が検体中
の不透明又は着色成分により妨害されない； ５）高濃度の指示分子（indicator molecules）が少
量、即ち膜上に保持されているので、色の変化を容易に
観察することができる。
複雑な微生物媒体を構成する栄養素成分は、微生物の
代謝経路に影響を及ぼす。有機酸、塩基及び各種気体が
使用した栄養素に応じて産生される。これらの産物は微
生物の種によっても異なる。液体媒体中にこれらの産物
が存在すると、pHの変化が生ずる。本発明で使用される
センサは、環境のpH変化に応答した測定可能な変化を示
すpH感応性指示体である。pHセンサを気体透過性・イオ
ン不透過性膜で被覆した具体例では、指示体のpHに影響
を及ぼす気体例えばCO2又はアンモニアの存在を測定す
る。従って、微生物の生育は、液体培地のpH変化又は微
生物により産生され媒体中に溶存している気体を測定す
ることにより検出され得る。CO2は全ての生物により産
生される一般的な代謝物質であり、微生物の生育を検出
するための好ましい代謝物質である。
代謝経路に影響を及ぼす。有機酸、塩基及び各種気体が
使用した栄養素に応じて産生される。これらの産物は微
生物の種によっても異なる。液体媒体中にこれらの産物
が存在すると、pHの変化が生ずる。本発明で使用される
センサは、環境のpH変化に応答した測定可能な変化を示
すpH感応性指示体である。pHセンサを気体透過性・イオ
ン不透過性膜で被覆した具体例では、指示体のpHに影響
を及ぼす気体例えばCO2又はアンモニアの存在を測定す
る。従って、微生物の生育は、液体培地のpH変化又は微
生物により産生され媒体中に溶存している気体を測定す
ることにより検出され得る。CO2は全ての生物により産
生される一般的な代謝物質であり、微生物の生育を検出
するための好ましい代謝物質である。
CO2センサ及びpHセンサは共通する２つの要素、pHセ
ンサとして有用な分子物質（molecular species）及び
付属物（attachment）／支持媒体を含む。pH指示体は支
持媒体に共有的に（covalently）又は非共有的に取付け
られ得る。或いは、指示体を気体透過性であるポリマー
マトリックス内にカプセル化してもよく、例えばpH指示
体をポリマーマトリックス内で乳化させた後硬化させ
る。CO2センサは第三の要素、指示体の膜を検体及び生
育媒体から完全に隔離する半透過性物質を含む。上記セ
ンサは透明な容器の内側に適当な接着剤を用いて貼付さ
れる。
ンサとして有用な分子物質（molecular species）及び
付属物（attachment）／支持媒体を含む。pH指示体は支
持媒体に共有的に（covalently）又は非共有的に取付け
られ得る。或いは、指示体を気体透過性であるポリマー
マトリックス内にカプセル化してもよく、例えばpH指示
体をポリマーマトリックス内で乳化させた後硬化させ
る。CO2センサは第三の要素、指示体の膜を検体及び生
育媒体から完全に隔離する半透過性物質を含む。上記セ
ンサは透明な容器の内側に適当な接着剤を用いて貼付さ
れる。
各種螢光及び可視のpH指示体がpH又はCO2センサ中の
活性分子物質として使用され得る。通常指示体を選択す
る際には、指示体が現在の螢光又は反射率技術により容
易に検出可能な許容され得る動的pH範囲及び波長変化を
有する要件を考慮しなければならない。
活性分子物質として使用され得る。通常指示体を選択す
る際には、指示体が現在の螢光又は反射率技術により容
易に検出可能な許容され得る動的pH範囲及び波長変化を
有する要件を考慮しなければならない。
本発明の培地中のpH変化を検出するためのセンサは、
約5.0〜8.0のpH範囲で螢光強度の変化又は目に見える色
の変化を示すものでなければならない。
約5.0〜8.0のpH範囲で螢光強度の変化又は目に見える色
の変化を示すものでなければならない。
CO2センサ用指示体は、CO2濃度の変化を検出すべく約
10〜６のpH範囲で螢光強度の変化又は目に見える色の変
化を示すものでなければならない。
10〜６のpH範囲で螢光強度の変化又は目に見える色の変
化を示すものでなければならない。
特定のpH指示媒体のみが支持媒体に共有的又は非共有
的に結合し、pH指示特性を保持し得る。本出願人の知見
によれば、キサンタン，フェノールフタレイン及びフェ
ノールスルホンフタレイン類に属する指示体が有用であ
る。例えば、フルオレセイン，クマリン，フェノールフ
タレイン，チモールフタレイン，ブロモチモールブル
ー，キシレノールブルー及びα−ナフトールベンゼイン
が包含される。
的に結合し、pH指示特性を保持し得る。本出願人の知見
によれば、キサンタン，フェノールフタレイン及びフェ
ノールスルホンフタレイン類に属する指示体が有用であ
る。例えば、フルオレセイン，クマリン，フェノールフ
タレイン，チモールフタレイン，ブロモチモールブル
ー，キシレノールブルー及びα−ナフトールベンゼイン
が包含される。
付属物／支持媒体はセルロースのような基質であり、
これに対してpH指示体が有機反応により共有的に取付け
られ得る。pH指示体は、正又は負のゼータ電位を有する
ナイロン膜のようなイオン性支持材料を使用して非共有
的に取付けられ得る。使用可能なイオン性支持次料は、
正又は負に帯電したイオン性樹脂例えばジエチルアミノ
エチル（DEAE）樹脂又はDEAEセルロースである。支持膜
が微生物生育媒体に直接接触しているときには、支持材
料をタンパクにより前処理することが必要であり得る。
これに対してpH指示体が有機反応により共有的に取付け
られ得る。pH指示体は、正又は負のゼータ電位を有する
ナイロン膜のようなイオン性支持材料を使用して非共有
的に取付けられ得る。使用可能なイオン性支持次料は、
正又は負に帯電したイオン性樹脂例えばジエチルアミノ
エチル（DEAE）樹脂又はDEAEセルロースである。支持膜
が微生物生育媒体に直接接触しているときには、支持材
料をタンパクにより前処理することが必要であり得る。
pH指示体センサは、微生物生育媒体のpH環境によるpH
変化を直接検出する。しかしながら、これらのセンサ
は、イオンの通過を防止しつつ気体を選択的に拡散し得
るシリコーン，ラテックス又は他のプラスチックスのよ
うな選択的に半透過性の組成物又は膜で被覆することに
より、液体生育媒体中の気体（例えば二酸化炭素，アン
モニア）と選択的に反応し得る。ポリマーマトリックス
内でカプセル化された指示体を含むセンサの場合、マト
リックスを形成するポリマーは気体を通すがイオンは通
さない半透過性バリアとして作用し得る。
変化を直接検出する。しかしながら、これらのセンサ
は、イオンの通過を防止しつつ気体を選択的に拡散し得
るシリコーン，ラテックス又は他のプラスチックスのよ
うな選択的に半透過性の組成物又は膜で被覆することに
より、液体生育媒体中の気体（例えば二酸化炭素，アン
モニア）と選択的に反応し得る。ポリマーマトリックス
内でカプセル化された指示体を含むセンサの場合、マト
リックスを形成するポリマーは気体を通すがイオンは通
さない半透過性バリアとして作用し得る。
指示体をカプセル化した実施態様の場合、CO2センサ
は４つの成分を含む。第一の成分は、６〜10のpH範囲で
反応性を有する可視又は螢光pH指示体である。これらの
要件を満す指示体としては、ブロモチモールブルー，キ
シレノールブルー，フェノールフタレイン，クマリン及
びフルオレスセインが例示される。第二の成分は、密封
したpH指示体によりCO2を検出するのに最適のpH環境を
維持する水酸化ナトリウム又はそれと同等の塩基であ
る。第三の成分は、非硬化ポリマー内に乳化された指示
体溶液のミセルを形成するグリセロール又はそれと同等
の乳化剤である。第四の成分は、指示体に対して適当な
環境を維持する室温加硫（RTV）白色シリコーンのよう
な未硬化ポリマーである。気体は通すがイオンを通さな
い限り、化学的もしくは物理的特性により或いは硬化条
件によって指示体の化学的活性に影響を及ぼすことがな
く、オートクレーブにて滅菌したときにその特性が変わ
らないポリマーであれば何れも使用され得る。好ましい
他のシリコーンポリマーは、高温度，触媒活性又は紫外
線加硫により硬化されるものである。エマルジョンは４
つの成分から製造され、ポリマーを硬化させるとpH指示
体のミセルの周りに半透過性マトリックスが形成され
る。前記指示体は液体微生物生育媒体からCO2及び他の
気体を選択的に拡散させる結果、測定可能な変化を示
す。センサを例えばモールドで別個に製造し、硬化さ
せ、次いでシリコーン接着剤のような適当な接着剤を用
いて培養ボトルに取り付けることもできる。または、好
ましくは、センサをボトルの底部に形成し、その場で硬
化させてもよい。ボトルを硬化させた後、センサを例え
ばオートクレーブにて滅菌する。
は４つの成分を含む。第一の成分は、６〜10のpH範囲で
反応性を有する可視又は螢光pH指示体である。これらの
要件を満す指示体としては、ブロモチモールブルー，キ
シレノールブルー，フェノールフタレイン，クマリン及
びフルオレスセインが例示される。第二の成分は、密封
したpH指示体によりCO2を検出するのに最適のpH環境を
維持する水酸化ナトリウム又はそれと同等の塩基であ
る。第三の成分は、非硬化ポリマー内に乳化された指示
体溶液のミセルを形成するグリセロール又はそれと同等
の乳化剤である。第四の成分は、指示体に対して適当な
環境を維持する室温加硫（RTV）白色シリコーンのよう
な未硬化ポリマーである。気体は通すがイオンを通さな
い限り、化学的もしくは物理的特性により或いは硬化条
件によって指示体の化学的活性に影響を及ぼすことがな
く、オートクレーブにて滅菌したときにその特性が変わ
らないポリマーであれば何れも使用され得る。好ましい
他のシリコーンポリマーは、高温度，触媒活性又は紫外
線加硫により硬化されるものである。エマルジョンは４
つの成分から製造され、ポリマーを硬化させるとpH指示
体のミセルの周りに半透過性マトリックスが形成され
る。前記指示体は液体微生物生育媒体からCO2及び他の
気体を選択的に拡散させる結果、測定可能な変化を示
す。センサを例えばモールドで別個に製造し、硬化さ
せ、次いでシリコーン接着剤のような適当な接着剤を用
いて培養ボトルに取り付けることもできる。または、好
ましくは、センサをボトルの底部に形成し、その場で硬
化させてもよい。ボトルを硬化させた後、センサを例え
ばオートクレーブにて滅菌する。
pHセンサ及びCO2センサの特定な例を以下に示す。こ
れらの例は本発明の例示にすぎず、これにより本発明の
範囲が限定されるものではない。
れらの例は本発明の例示にすぎず、これにより本発明の
範囲が限定されるものではない。
実施例：螢光pHセンサの製造 セルロース透析管材料（Spectrapor M.W.カットオフ1
2,000−14,000、乾燥厚さ0.001インチ）をアーチポンチ
を用いて5/16インチの円に切り抜いた。セルロースの円
（1.2g）を蒸溜水に30分間浸漬後、脱水し、乾燥イソプ
ロパノール（12ml）に10分間浸漬させた。膜を脱水し、
攪拌棒を用いて100ml丸底フラスコ内に装入した。乾燥
イソプロパノール（50ml）及びトリエチルアミン（5m
l）をフラスコに添加し、次いで75mgFITC（フルオレス
セインイソチオシアネート）を混合物に溶解させた。こ
の混合物をゆっくり攪拌しながら５時間還流させた。
2,000−14,000、乾燥厚さ0.001インチ）をアーチポンチ
を用いて5/16インチの円に切り抜いた。セルロースの円
（1.2g）を蒸溜水に30分間浸漬後、脱水し、乾燥イソプ
ロパノール（12ml）に10分間浸漬させた。膜を脱水し、
攪拌棒を用いて100ml丸底フラスコ内に装入した。乾燥
イソプロパノール（50ml）及びトリエチルアミン（5m
l）をフラスコに添加し、次いで75mgFITC（フルオレス
セインイソチオシアネート）を混合物に溶解させた。こ
の混合物をゆっくり攪拌しながら５時間還流させた。
セルロース膜を冷却し、脱水し、100mlの蒸溜水を用
いて10回洗浄した。飽和セルロース膜を適当なガラスボ
トルの底部にシリコーン接着剤（GE2501 Silicone Seal
ant,透明）を用いて取付けた。硬化させた後、生育媒体
を添加し、密閉したボトルを121℃、15psiで15分間オー
トクレーブにて滅菌した。
いて10回洗浄した。飽和セルロース膜を適当なガラスボ
トルの底部にシリコーン接着剤（GE2501 Silicone Seal
ant,透明）を用いて取付けた。硬化させた後、生育媒体
を添加し、密閉したボトルを121℃、15psiで15分間オー
トクレーブにて滅菌した。
実施例2:非螢光指示体pHセンサの製造 正のゼータ電位（Zeta Probe,BioRad）を有するよう
に変性させたナイロン膜を、Tryptic SoyBrothの３％溶
液に導入し、回転式振盪器上でゆっくり振盪させながら
室温で１時間浸漬させた。ナイロン膜を脱イオン水を用
いて十分に洗浄して過剰のTryptic Soy Brothを除去し
た。洗浄した膜を、0.1N水酸化ナトリウムに溶解させた
pH指示体（ブロモチモールブルー）の0.0001〜0.1％溶
液に導入した。膜をゆっくり振盪させながら室温で１時
間反応させた。過剰の指示体溶液を、指示体が膜から洗
いだされなくなるまで脱イオン水で十分に洗浄すること
により、過剰の指示体溶液を膜から除去した。pH指示体
膜を24時間風乾させ、膜を11/16インチの円に打ち抜い
た。
に変性させたナイロン膜を、Tryptic SoyBrothの３％溶
液に導入し、回転式振盪器上でゆっくり振盪させながら
室温で１時間浸漬させた。ナイロン膜を脱イオン水を用
いて十分に洗浄して過剰のTryptic Soy Brothを除去し
た。洗浄した膜を、0.1N水酸化ナトリウムに溶解させた
pH指示体（ブロモチモールブルー）の0.0001〜0.1％溶
液に導入した。膜をゆっくり振盪させながら室温で１時
間反応させた。過剰の指示体溶液を、指示体が膜から洗
いだされなくなるまで脱イオン水で十分に洗浄すること
により、過剰の指示体溶液を膜から除去した。pH指示体
膜を24時間風乾させ、膜を11/16インチの円に打ち抜い
た。
pH指示体膜をシリコーン接着剤（GE 2501 Silicone S
ealant、透明）を用いてガラス容器の底部に取り付け
た。これらのボトルに微生物生育媒体を充填し、オート
クレーブにて滅菌した。
ealant、透明）を用いてガラス容器の底部に取り付け
た。これらのボトルに微生物生育媒体を充填し、オート
クレーブにて滅菌した。
実施例3:非螢光指示体CO2センサの製造 正のゼータ電位（Zeta Probe,BioRad）を有するよう
に変性させたナイロン膜を、0.1N水酸化ナトリウムに溶
解させた0.001〜0.1％のキシレノールブルー及び0.0001
〜0.1％のブロモチモールブルーからなる指示体溶液に
導入した。膜をゆっくり振盪させながら室温で１時間浸
漬させた。指示体溶液を反応させた後、膜を脱イオン水
を用いて十分に洗浄して過剰の指示体を除去した。指示
体膜を24時間風乾させ、膜を11/16インチの円に打ち抜
いた。次いで、指示体膜をシリコーン接着剤（GE 2501
Silicone Sealant、透明）を用いて透明なガラス容器の
底部内面に取り付け、第二のシリコーン接着剤層を指示
体膜の上に載せてナイロン指示体膜を完全に密封した。
に変性させたナイロン膜を、0.1N水酸化ナトリウムに溶
解させた0.001〜0.1％のキシレノールブルー及び0.0001
〜0.1％のブロモチモールブルーからなる指示体溶液に
導入した。膜をゆっくり振盪させながら室温で１時間浸
漬させた。指示体溶液を反応させた後、膜を脱イオン水
を用いて十分に洗浄して過剰の指示体を除去した。指示
体膜を24時間風乾させ、膜を11/16インチの円に打ち抜
いた。次いで、指示体膜をシリコーン接着剤（GE 2501
Silicone Sealant、透明）を用いて透明なガラス容器の
底部内面に取り付け、第二のシリコーン接着剤層を指示
体膜の上に載せてナイロン指示体膜を完全に密封した。
これらのボトルに微生物生育媒体を充填し、オートク
レーブにて滅菌した。
レーブにて滅菌した。
培地の調製 微生物のpH変化による検出用培地は、３％Tryptic So
y Broth（DIFCO）、0.5％プロテオースペプトン（DIFC
O）＃３、1.25％Ｄ−グルコース及び１％Ｌ−アルギニ
ンから構成される。他の成分は還元剤（0.01％のＬ−シ
スティン）及び抗凝固剤（0.05％のSPS、ポリスルホン
酸ナトリウム）である。この培地の緩衝能力は低く、pH
に影響を及ぼす代謝産物により培地のpHが容易に変化す
る。グルコースは、微生物により代謝されたときpHの低
下をもたらす有機酸を産生する醗酵性炭水化物である。
アルギニンを、通常グルコースを代謝しない非醗酵性
（non−fermenting）微生物（即ち緑膿菌）に対する基
質として添加する。アルギニンを添加すると、培地のpH
を上昇させる塩基性代謝産物が放出される。緑膿菌によ
るCO2産生を調べるときには、アルギニンを添加しな
い。他の種の微生物による代謝が行なわれるときにpH変
化を生じさせるべく、他の炭水化物又はアミノ酸を培地
に添加してもよい。
y Broth（DIFCO）、0.5％プロテオースペプトン（DIFC
O）＃３、1.25％Ｄ−グルコース及び１％Ｌ−アルギニ
ンから構成される。他の成分は還元剤（0.01％のＬ−シ
スティン）及び抗凝固剤（0.05％のSPS、ポリスルホン
酸ナトリウム）である。この培地の緩衝能力は低く、pH
に影響を及ぼす代謝産物により培地のpHが容易に変化す
る。グルコースは、微生物により代謝されたときpHの低
下をもたらす有機酸を産生する醗酵性炭水化物である。
アルギニンを、通常グルコースを代謝しない非醗酵性
（non−fermenting）微生物（即ち緑膿菌）に対する基
質として添加する。アルギニンを添加すると、培地のpH
を上昇させる塩基性代謝産物が放出される。緑膿菌によ
るCO2産生を調べるときには、アルギニンを添加しな
い。他の種の微生物による代謝が行なわれるときにpH変
化を生じさせるべく、他の炭水化物又はアミノ酸を培地
に添加してもよい。
微生物汚染の自動検出装置 微生物生育によるpH変化及びCO2産生は以下に示す計
器（instrument）を用いて検出、測定され得る。
器（instrument）を用いて検出、測定され得る。
この計器により監視されるセンサは、生育もしくは代
謝する微生物が存在するときに色が変化する指示体を含
む。色変化を肉眼で観察してもよいが、計器を用いると
客観的に、敏感に且つ連続的に測定することができる。
好ましい具体例では、計器は本質的にセンサの色変化を
監視する可視光線反射計である。全てのサンプルを連続
的に監視するために、各サンプルに対する検出器を設け
るのが好ましい。他の態様は当業者にとって自明であ
り、例えば慣用の手段を用いて検体容器を１つ又はそれ
以上の定置検出器を通過させて移動させてもよく、１つ
以上の検出器を定置検体を通過させて移動させてもよ
い。
謝する微生物が存在するときに色が変化する指示体を含
む。色変化を肉眼で観察してもよいが、計器を用いると
客観的に、敏感に且つ連続的に測定することができる。
好ましい具体例では、計器は本質的にセンサの色変化を
監視する可視光線反射計である。全てのサンプルを連続
的に監視するために、各サンプルに対する検出器を設け
るのが好ましい。他の態様は当業者にとって自明であ
り、例えば慣用の手段を用いて検体容器を１つ又はそれ
以上の定置検出器を通過させて移動させてもよく、１つ
以上の検出器を定置検体を通過させて移動させてもよ
い。
好ましい具体例では、固体状態の発光体及び検出器を
使用する。照明の白熱光源及びアークランプ光源をミラ
ー，レンズ，オプチカルファイバ又は光をセンサに検出
させる他の手段と組合せて使用してもよい。
使用する。照明の白熱光源及びアークランプ光源をミラ
ー，レンズ，オプチカルファイバ又は光をセンサに検出
させる他の手段と組合せて使用してもよい。
表１に示した各種微生物が本発明により検出され得
る。これらの結果から、同タイプの他の微生物、検出可
能な気体を発生する任意の生物又は液体媒体のpHに影響
を及ぼす他の産物も本発明により検出され得る。
る。これらの結果から、同タイプの他の微生物、検出可
能な気体を発生する任意の生物又は液体媒体のpHに影響
を及ぼす他の産物も本発明により検出され得る。
実施例4:カプセル化指示体センサの製造 25〜75％グリセロールを含有する0.0005〜0.5N水酸化
ナトリウム中に溶解させた0.1〜1.0％フェノールフタレ
イン、キシレノールブルー又はブロモチモールブルーの
ストック溶液を作製した。指示体−水酸化ナトリウム−
グリセロールのストック溶液0.1〜0.5mlを未硬化のRTV
白色シリコーン（GE Silicone II、白）1.0gに添加し、
微細なエマルジョンが形成されるまで混合した。シリコ
ーン−指示体エマルジョンをシリンジ分配装置に充填
し、シリンジ分配装置の底部に0.1〜0.2ml分配させ、エ
マルジョンをガラス容器の底部上に均等に分散させた。
指示体−シリコーンエマルジョンセンサを相対湿度50％
未満の雰囲気中、室温で最低24時間硬化させた。硬化
後、CO2センサを備えた容器に微生物生育媒体を充填
し、オートクレーブにて滅菌した。
ナトリウム中に溶解させた0.1〜1.0％フェノールフタレ
イン、キシレノールブルー又はブロモチモールブルーの
ストック溶液を作製した。指示体−水酸化ナトリウム−
グリセロールのストック溶液0.1〜0.5mlを未硬化のRTV
白色シリコーン（GE Silicone II、白）1.0gに添加し、
微細なエマルジョンが形成されるまで混合した。シリコ
ーン−指示体エマルジョンをシリンジ分配装置に充填
し、シリンジ分配装置の底部に0.1〜0.2ml分配させ、エ
マルジョンをガラス容器の底部上に均等に分散させた。
指示体−シリコーンエマルジョンセンサを相対湿度50％
未満の雰囲気中、室温で最低24時間硬化させた。硬化
後、CO2センサを備えた容器に微生物生育媒体を充填
し、オートクレーブにて滅菌した。
表１ 腸内細菌 大腸菌 スタフィロコッカスspp. コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス 黄色ぶどう球菌 ストレプトコッカスspp. 肺炎レンサ級菌 グループＡ グループＢ エンテロコッカス 酵母 カンジダ・アルビカンス クリプトコッカス・ネオフォルマンス トルロプシス・グラブラダ 非発酵菌（nonfermentors） 緑膿菌 アシネトバクター・カルコアセチカス 嫌気性菌 バクテロイデス・フラギリス クロストリジウム・パーフリンジェンス フソバクテリウム・ネクロフォラム ペプトストレプトコッカス・アネロビウス他の微生物 ヘモフィルス・インフルエンザ ナイセリア・メニンギチジス
第１図は本発明の血液培養器具の概略図であり、第２図
は本発明装置のpH感応性を示すグラフであり、第３図は
微生物の生育に伴うpH及びCO2の変化を示すグラフであ
り、第４図は各種微生物により産生されたCO2濃度を示
すグラフである。 １……容器、６……電源 ２……センサ、７……電流−電圧変換器 ３……培地、８……低域濾波器 ４……光源 ５……光検出器
は本発明装置のpH感応性を示すグラフであり、第３図は
微生物の生育に伴うpH及びCO2の変化を示すグラフであ
り、第４図は各種微生物により産生されたCO2濃度を示
すグラフである。 １……容器、６……電源 ２……センサ、７……電流−電圧変換器 ３……培地、８……低域濾波器 ４……光源 ５……光検出器
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジエイムズ・ローレンス・デイギセツ ピ・ジユニア アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27712、ダラム、レイジイ・リバー・ド ライブ・4218 (72)発明者 リチヤード・コーネリアス・ドリスコー ル アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27614、ラレイ、トレーゴ・トレイル・ 10721 (72)発明者 マイケル・ジヨン・カランドラ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 08873、サマセツト、デイケンズ・コー ト・187 (56)参考文献 特開 昭59−55183（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−207861（ＪＰ，Ａ) 実開 昭55−8305（ＪＰ，Ｕ) 米国特許2880070（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12M 1/34 G01N 33/84
Claims (10)
- 【請求項１】検体を滅菌培地を用いて培養するための内
部チャンバを有する密封且つ滅菌可能な検体容器及び不
動化指示媒体を含むセンサ手段からなる検体中の生物活
性を連続的に監視するためのデバイスであって、前記指
示媒体としては生物の代謝活性を有する産物に露したと
き検出し得る変化を示すものが選択され、前記容器には
少なくとも１ケ所透明領域が設けられており、前記セン
サ手段は容器の透明領域に配置されており、これにより
センサ手段の外観の変化が透明領域を介して容器の外部
から連続的に監視することが可能であり、その結果、密
封後の容器の汚染なしに生物活性を監視し得、且つ前記
センサ手段はその機能に影響を与えることなしに熱滅菌
可能であることを特徴とするデバイス。 - 【請求項２】指示媒体がpHに応答する分子物質であるこ
とを特徴とする請求項１に記載のデバイス。 - 【請求項３】センサ手段が帯電膜からなることを特徴と
する請求項１に記載のデバイス。 - 【請求項４】センサ手段の膜が容器の内表面に結合して
いることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。 - 【請求項５】検体及び培地が膜と容器表面の間を通過し
ないようにセンサ手段の膜が少なくとも周辺を取囲むよ
うに容器の内表面に結合していることを特徴とする請求
項４に記載のデバイス。 - 【請求項６】センサ手段が半透膜により容器中の検体か
ら隔離されていることを特徴とする請求項１に記載のデ
バイス。 - 【請求項７】半透膜がその場で形成された膜からなるこ
とを特徴とする請求項６に記載のデバイス。 - 【請求項８】センサ手段がポリマーマトリックス内で不
動化された指示媒体ミセルからなることを特徴とする請
求項１に記載のデバイス。 - 【請求項９】ポリマーマトリックス内の指示媒体のミセ
ルが未硬化ポリマー中で指示体溶液を乳化させ、ポリマ
ーを硬化させる方法により形成されることを特徴とする
請求項８に記載のデバイス。 - 【請求項１０】壁に少なくもと１ケ所透明領域を有する
検体容器であって、前記透明領域の容器の内表面には生
物の代謝活性を有する気体状産物に露したときに検出し
得る変化を示す指示媒体を含むセンサ手段が貼付されて
いる滅菌検体容器に検体を滅菌状態で導入する； 検体容器のセンサ手段を検体と生育媒体の下に完全に没
する位置に配して、滅菌容器内の検体を微生物生育媒体
を用いてインキュベートする； 検体及び生育媒体からセンサ手段に通過する気体状産物
によってセンサ手段の指示媒体に生じた変化を検出する
ことにより容器の形を損うことなく生物の代謝活性を有
する気体状産物の産生を容器の外側から透明領域を介し
て監視する； ことからなる検体中の微生物を検出する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US168291 | 1988-03-15 | ||
| US07/168,291 US4945060A (en) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | Device for detecting microorganisms |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0216965A JPH0216965A (ja) | 1990-01-19 |
| JP2862556B2 true JP2862556B2 (ja) | 1999-03-03 |
Family
ID=22610896
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1061990A Expired - Lifetime JP2862556B2 (ja) | 1988-03-15 | 1989-03-14 | 微生物を検出するための装置及びデバイス |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4945060A (ja) |
| EP (1) | EP0333253B1 (ja) |
| JP (1) | JP2862556B2 (ja) |
| KR (1) | KR970003150B1 (ja) |
| AT (1) | ATE126267T1 (ja) |
| AU (1) | AU631533B2 (ja) |
| CA (1) | CA1339512C (ja) |
| DE (2) | DE333253T1 (ja) |
| DK (1) | DK123889A (ja) |
| ES (1) | ES2031807T3 (ja) |
| GR (1) | GR3017974T3 (ja) |
| IE (1) | IE67634B1 (ja) |
| ZA (1) | ZA891788B (ja) |
Families Citing this family (97)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5164796A (en) * | 1988-03-15 | 1992-11-17 | Akzo N.V. | Apparatus and method for detection of microorganisms |
| US5094955A (en) | 1988-03-15 | 1992-03-10 | Akzo N.V. | Device and method for detecting microorganisms |
| US5162229A (en) * | 1988-03-15 | 1992-11-10 | Akzo N.V. | Device and method for enhanced recovery and detection of microbial growth in the presence of antimicrobial substances |
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| US4945060A (en) * | 1988-03-15 | 1990-07-31 | Akzo N. V. | Device for detecting microorganisms |
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