JP2810255B2 - オリゴ糖の製造方法 - Google Patents
オリゴ糖の製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、キチン及びキトサンを
分解して得られる生理活性が高い高重合度のキチンオリ
ゴ糖及びキトサンオリゴ糖の製造方法に関するものであ
る。
分解して得られる生理活性が高い高重合度のキチンオリ
ゴ糖及びキトサンオリゴ糖の製造方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、キチンやキトサンを分解すること
により生理活性が高いオリゴ糖が見い出されている。生
理活性が高いオリゴ糖は比較的重合度の高いオリゴ糖で
ある。例えばキチンオリゴ糖のヘキサＮ−アセチルキト
ヘキサオース（重合度６のＮ−アセチルグルコサミン）
は、免疫機能亢進効果が著しい（鈴木茂生ら、第２回キ
チン、キトサンシンポジジウム講演要旨集、3-6、198
5）。また、キトサンオリゴ糖のヘプタキトヘプタオー
ス（重合度７のグルコサミン）は、フサリウム ソラニ
（Fusarium solani ）の成育を阻害し（D.F.Kendra et.
al.,Exp.Mycology,8,276-281,1984) 、トマトの葉のプ
ロテアーゼ阻害剤を合成するために有用である(M.Walke
r-Simmons et.al.,Plant physiol.,76, 787-790,198
4)。
により生理活性が高いオリゴ糖が見い出されている。生
理活性が高いオリゴ糖は比較的重合度の高いオリゴ糖で
ある。例えばキチンオリゴ糖のヘキサＮ−アセチルキト
ヘキサオース（重合度６のＮ−アセチルグルコサミン）
は、免疫機能亢進効果が著しい（鈴木茂生ら、第２回キ
チン、キトサンシンポジジウム講演要旨集、3-6、198
5）。また、キトサンオリゴ糖のヘプタキトヘプタオー
ス（重合度７のグルコサミン）は、フサリウム ソラニ
（Fusarium solani ）の成育を阻害し（D.F.Kendra et.
al.,Exp.Mycology,8,276-281,1984) 、トマトの葉のプ
ロテアーゼ阻害剤を合成するために有用である(M.Walke
r-Simmons et.al.,Plant physiol.,76, 787-790,198
4)。
【０００３】一方、生理活性が高いオリゴ糖を得る方法
は酸加水分解や酵素分解が試みられているが、これまで
に効率のよい方法は見い出されていない。例えばキチン
を塩酸で加水分解しＮ−アセチルグルコサミンのオリゴ
糖を得ることができるが、分解物中における重合度が高
いオリゴ糖の割合は塩酸の濃度、温度及び反応時間など
に大きく影響される。この場合、加水分解を限定的に行
うと分解物中における高重合度のオリゴ糖の割合は増加
するが、分解物全体の収量が少ない。逆に、加水分解を
ほぼ完全に行うと分解物全体の収量は多くなるが、分解
物中の高重合度のオリゴ糖の割合が著しく減少する。ま
た、キトサンの酸加水分解によるグルコサミンのオリゴ
糖の生成についても同様であり、高重合度のオリゴ糖を
効率よく得る方法は確立されていない（坂井和雄、キチ
ン、キトサンの開発と応用、工業技術会、111-134、198
7）。
は酸加水分解や酵素分解が試みられているが、これまで
に効率のよい方法は見い出されていない。例えばキチン
を塩酸で加水分解しＮ−アセチルグルコサミンのオリゴ
糖を得ることができるが、分解物中における重合度が高
いオリゴ糖の割合は塩酸の濃度、温度及び反応時間など
に大きく影響される。この場合、加水分解を限定的に行
うと分解物中における高重合度のオリゴ糖の割合は増加
するが、分解物全体の収量が少ない。逆に、加水分解を
ほぼ完全に行うと分解物全体の収量は多くなるが、分解
物中の高重合度のオリゴ糖の割合が著しく減少する。ま
た、キトサンの酸加水分解によるグルコサミンのオリゴ
糖の生成についても同様であり、高重合度のオリゴ糖を
効率よく得る方法は確立されていない（坂井和雄、キチ
ン、キトサンの開発と応用、工業技術会、111-134、198
7）。
【０００４】酵素分解による方法では、キチンをキチナ
ーゼで分解してＮ−アセチルグルコサミンのオリゴ糖を
得た場合、分解物が殆ど二糖であった（大宝明、昭和６
１年日本農芸化学会西日本支部大会要旨集、12、1986
）。また、キトサンをキトサナーゼで分解しグルコサ
ミンのオリゴ糖を得る場合も分解物は殆ど二糖から五糖
であり、その中でも五糖以上の重合度のオリゴ糖は少な
い（M.Izumi et.al.,Agric.Biol.Chem.,51,1189-1191,1
987) 。
ーゼで分解してＮ−アセチルグルコサミンのオリゴ糖を
得た場合、分解物が殆ど二糖であった（大宝明、昭和６
１年日本農芸化学会西日本支部大会要旨集、12、1986
）。また、キトサンをキトサナーゼで分解しグルコサ
ミンのオリゴ糖を得る場合も分解物は殆ど二糖から五糖
であり、その中でも五糖以上の重合度のオリゴ糖は少な
い（M.Izumi et.al.,Agric.Biol.Chem.,51,1189-1191,1
987) 。
【０００５】その他、高重合度のオリゴ糖を得る方法
は、Ｎ−アセチルグルコサミンの四糖にキチナーゼを作
用させて糖転移反応を利用してＮ−アセチルグルコサミ
ンの六糖を得ることができるが、原料である四糖のＮ−
アセチルグルコサミン自体が得られにくい（F.Nanjo e
t.al.,Agric.Biol.Chem.,53,2189-2195,1989)。また、
分子内に２０〜３５％程度のＮ−アセチルグルコサミン
残基が不均一に分布した部分脱アセチル化キチンをキチ
ナーゼで分解してオリゴ糖を得ることもできるが、分解
物は二糖、三糖及び四糖に限られる（A.Ohtakara et.a
l.,Agric.Biol.Chem.,52,3181-3182,1988)。
は、Ｎ−アセチルグルコサミンの四糖にキチナーゼを作
用させて糖転移反応を利用してＮ−アセチルグルコサミ
ンの六糖を得ることができるが、原料である四糖のＮ−
アセチルグルコサミン自体が得られにくい（F.Nanjo e
t.al.,Agric.Biol.Chem.,53,2189-2195,1989)。また、
分子内に２０〜３５％程度のＮ−アセチルグルコサミン
残基が不均一に分布した部分脱アセチル化キチンをキチ
ナーゼで分解してオリゴ糖を得ることもできるが、分解
物は二糖、三糖及び四糖に限られる（A.Ohtakara et.a
l.,Agric.Biol.Chem.,52,3181-3182,1988)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は前記の課題を
解決するためなされたもので、生理活性が高いグルコサ
ミンオリゴ糖及びＮ−アセチルグルコサミンオリゴ糖の
効率の良い製造方法を提供することを目的とする。
解決するためなされたもので、生理活性が高いグルコサ
ミンオリゴ糖及びＮ−アセチルグルコサミンオリゴ糖の
効率の良い製造方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】前記の目的を達成するた
めになされた本発明のオリゴ糖の製造方法は、均一に部
分脱アセチル化されたキチンをキチナーゼにより加水分
解し、高重合度のグルコサミン及びＮ−アセチルグルコ
サミンからなるヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホ
モオリゴ糖を得る。キチンのキチナーゼによる加水分解
は透析膜の内部で行い、同時に透析膜の外部に陽イオン
交換樹脂を配置して透析を行うことが好ましい。尚、使
用するキチンは甲殻類、または糸状菌から得られるもの
が好ましい。
めになされた本発明のオリゴ糖の製造方法は、均一に部
分脱アセチル化されたキチンをキチナーゼにより加水分
解し、高重合度のグルコサミン及びＮ−アセチルグルコ
サミンからなるヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホ
モオリゴ糖を得る。キチンのキチナーゼによる加水分解
は透析膜の内部で行い、同時に透析膜の外部に陽イオン
交換樹脂を配置して透析を行うことが好ましい。尚、使
用するキチンは甲殻類、または糸状菌から得られるもの
が好ましい。
【０００８】均一に部分脱アセチル化されたキチンは、
Ｎ−アセチルグルコサミン残基が分子中に均一に分布し
たものであればよく、脱アセチル化の割合は７０〜９５
％程度、特に８０〜９０％が好ましい。
Ｎ−アセチルグルコサミン残基が分子中に均一に分布し
たものであればよく、脱アセチル化の割合は７０〜９５
％程度、特に８０〜９０％が好ましい。
【０００９】キチンを均一に部分脱アセチル化する方法
としては、甲殻類のキチンであればキチン粉末を高濃度
のアルカリ溶液に溶解してアルカリキチンとして部分脱
アセチル化を行う（T.Sannan et.al.,Makromal.Chem.,1
77,3589-3600,1976 ）。糸状菌のキチンは、菌体をアル
カリ処理した後、酢酸抽出を行えば脱アセチル化された
キチンが調整できる（小林丘ら、日本農芸化学会誌、6
2 、10、1988）。甲殻類のキチンよりも糸状菌のキチンの
方が調整法としては容易である。甲殻類のキチンは部分
脱アセチル化の際にアルカリキチンにすることが煩雑で
あり、高濃度のアルカリ廃液の処理が面倒である（キチ
ン、キトサン研究会編、キチン、キトサン実験マニュア
ル、技報堂出版、16-21、1991) 。
としては、甲殻類のキチンであればキチン粉末を高濃度
のアルカリ溶液に溶解してアルカリキチンとして部分脱
アセチル化を行う（T.Sannan et.al.,Makromal.Chem.,1
77,3589-3600,1976 ）。糸状菌のキチンは、菌体をアル
カリ処理した後、酢酸抽出を行えば脱アセチル化された
キチンが調整できる（小林丘ら、日本農芸化学会誌、6
2 、10、1988）。甲殻類のキチンよりも糸状菌のキチンの
方が調整法としては容易である。甲殻類のキチンは部分
脱アセチル化の際にアルカリキチンにすることが煩雑で
あり、高濃度のアルカリ廃液の処理が面倒である（キチ
ン、キトサン研究会編、キチン、キトサン実験マニュア
ル、技報堂出版、16-21、1991) 。
【００１０】キチナーゼは、部分脱アセチル化キチン分
子中のＮ−アセチルグルコサミン残基を認識し分解する
エンド型キチナーゼであれば良く、できればキトビアー
ゼ（β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ）活性を除去し
た精製品が好ましい。前記キチナーゼとしては、例えば
寶酒造製のトリコデルマ sp.AF6-T8 (Trichodermasp.AF
6-T8)、シグマ ケミカル社（SIGMA CHEMICAL COMPAN
Y）製のストレプトミセス グリソイス（ Streptomyces
griseus ）が挙げられる。
子中のＮ−アセチルグルコサミン残基を認識し分解する
エンド型キチナーゼであれば良く、できればキトビアー
ゼ（β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ）活性を除去し
た精製品が好ましい。前記キチナーゼとしては、例えば
寶酒造製のトリコデルマ sp.AF6-T8 (Trichodermasp.AF
6-T8)、シグマ ケミカル社（SIGMA CHEMICAL COMPAN
Y）製のストレプトミセス グリソイス（ Streptomyces
griseus ）が挙げられる。
【００１１】透析膜は分画分子量が１０００〜１５００
０程度、特に２０００〜８０００が好ましい。市販品で
は、例えばスペクトラ／ピーオーアール（ＳＰＥＣＴＲ
Ａ／ＰＯＲ）社製の透析膜が挙げられる。
０程度、特に２０００〜８０００が好ましい。市販品で
は、例えばスペクトラ／ピーオーアール（ＳＰＥＣＴＲ
Ａ／ＰＯＲ）社製の透析膜が挙げられる。
【００１２】陽イオン交換樹脂は、予めＨ+ のイオンに
変えた強酸性型であれば良い。市販品としては、例えば
ダウ ケミカル社（DOW CHEMICAL COMPANY）製のＤＯＷ
ＥＸ５０ＷやＤＯＷＥＸ ＨＧＲが挙げられる。
変えた強酸性型であれば良い。市販品としては、例えば
ダウ ケミカル社（DOW CHEMICAL COMPANY）製のＤＯＷ
ＥＸ５０ＷやＤＯＷＥＸ ＨＧＲが挙げられる。
【００１３】
【作用】部分脱アセチル化キチンはＮ−アセチルグルコ
サミン残基が分子中に均一に分布し、キチナーゼがＮ−
アセチルグルコサミン残基の部分を優先的に切断するた
め、効率よく高重合度のオリゴ糖を得ることができる。
サミン残基が分子中に均一に分布し、キチナーゼがＮ−
アセチルグルコサミン残基の部分を優先的に切断するた
め、効率よく高重合度のオリゴ糖を得ることができる。
【００１４】また、透析膜の内部で加水分解しながら透
析膜外部に陽イオン交換樹脂を配置して透析を行うと、
より効率的に加水分解でき、加水分解終了後の処理を省
くことができる。
析膜外部に陽イオン交換樹脂を配置して透析を行うと、
より効率的に加水分解でき、加水分解終了後の処理を省
くことができる。
【００１５】
【実施例】以下、本発明の実施例を説明するが、これに
限定されるものではない。
限定されるものではない。
【００１６】キチンを均一に部分脱アセチル化した後、
これを乳酸に溶解して均一に溶解する。乳酸は、部分脱
アセチル化キチン１ｇに対して、２〜２０容積％好まし
くは５〜１０容積％の乳酸を２０〜２００ｍｌ好ましく
は６０〜１００ｍｌ加える。前記溶液をアセトンに滴下
すると、部分脱アセチル化キチン乳酸塩がゲル状沈殿物
として生成する。アセトンは前記溶液１００ｍｌ当たり
９００ｍｌ以上使用するのが好ましい。生成したゲル状
沈殿物を濾過し、アセトンで数回洗浄を行って乳酸を完
全に除去した後、減圧で乾燥し、部分脱アセチル化キチ
ン乳酸塩を得る。
これを乳酸に溶解して均一に溶解する。乳酸は、部分脱
アセチル化キチン１ｇに対して、２〜２０容積％好まし
くは５〜１０容積％の乳酸を２０〜２００ｍｌ好ましく
は６０〜１００ｍｌ加える。前記溶液をアセトンに滴下
すると、部分脱アセチル化キチン乳酸塩がゲル状沈殿物
として生成する。アセトンは前記溶液１００ｍｌ当たり
９００ｍｌ以上使用するのが好ましい。生成したゲル状
沈殿物を濾過し、アセトンで数回洗浄を行って乳酸を完
全に除去した後、減圧で乾燥し、部分脱アセチル化キチ
ン乳酸塩を得る。
【００１７】得られた部分脱アセチル化キチン乳酸塩を
水に溶解し、０．１〜１重量％の水溶液とする。前記乳
酸塩水溶液にキチナーゼを添加し、２０〜５０℃で２４
時間以上加水分解を行う。キチナーゼは、乳酸塩水溶液
１０ｍｌ中に１〜１０ユニット（ｕｎｉｔｓ）のキチナ
ーゼを含む濃度に調整し、前記濃度のキチナーゼ水溶液
は乳酸塩水溶液の容積の１／５００〜１／１０倍を添加
する。加水分解を２４時間以上行った後、熱処理により
加水分解を停止し、反応液からキチナーゼを限外濾過で
除去する。
水に溶解し、０．１〜１重量％の水溶液とする。前記乳
酸塩水溶液にキチナーゼを添加し、２０〜５０℃で２４
時間以上加水分解を行う。キチナーゼは、乳酸塩水溶液
１０ｍｌ中に１〜１０ユニット（ｕｎｉｔｓ）のキチナ
ーゼを含む濃度に調整し、前記濃度のキチナーゼ水溶液
は乳酸塩水溶液の容積の１／５００〜１／１０倍を添加
する。加水分解を２４時間以上行った後、熱処理により
加水分解を停止し、反応液からキチナーゼを限外濾過で
除去する。
【００１８】キチナーゼを除去した反応液は陽イオン交
換樹脂に吸着させた後、陽イオン交換樹脂を蒸留水で洗
浄し遊離した乳酸を除去する。樹脂に吸着した部分脱ア
セチル化キチンの加水分解物は希塩酸で溶出し、蒸発乾
固する。生成物質はグルコサミン及びＮ−アセチルグル
コサミンのヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホモオ
リゴ糖の塩酸塩である。
換樹脂に吸着させた後、陽イオン交換樹脂を蒸留水で洗
浄し遊離した乳酸を除去する。樹脂に吸着した部分脱ア
セチル化キチンの加水分解物は希塩酸で溶出し、蒸発乾
固する。生成物質はグルコサミン及びＮ−アセチルグル
コサミンのヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホモオ
リゴ糖の塩酸塩である。
【００１９】また、透析膜内部で加水分解を行う場合
は、キチナーゼを添加した部分脱アセチル化キチン乳酸
塩水溶液を透析膜の内部に入れ、透析膜の外側から陽イ
オン交換樹脂を分散した蒸留水で透析しながら、前記と
同様に２０〜５０℃で加水分解を２４時間以上行う。蒸
留水に分散する陽イオン交換樹脂は、部分脱アセチル化
キチン乳酸塩１００ｍｇ当たり陽イオン交換樹脂１０〜
５０ｍｌの割合である。透析に使用する陽イオン交換樹
脂を分散した蒸留水の容量は、キチナーゼを添加した乳
酸塩水溶液の容量の１０〜１００倍であることが好まし
い。加水分解を２４時間以上行った後、透析膜外側の陽
イオン交換樹脂を集めて蒸留水で洗浄後、分解物を希塩
酸で溶出し蒸発乾固する。前記と同様にグルコサミン及
びＮ−アセチルグルコサミンのヘテロオリゴ糖、及びグ
ルコサミンのホモオリゴ糖の塩酸塩が生成する。
は、キチナーゼを添加した部分脱アセチル化キチン乳酸
塩水溶液を透析膜の内部に入れ、透析膜の外側から陽イ
オン交換樹脂を分散した蒸留水で透析しながら、前記と
同様に２０〜５０℃で加水分解を２４時間以上行う。蒸
留水に分散する陽イオン交換樹脂は、部分脱アセチル化
キチン乳酸塩１００ｍｇ当たり陽イオン交換樹脂１０〜
５０ｍｌの割合である。透析に使用する陽イオン交換樹
脂を分散した蒸留水の容量は、キチナーゼを添加した乳
酸塩水溶液の容量の１０〜１００倍であることが好まし
い。加水分解を２４時間以上行った後、透析膜外側の陽
イオン交換樹脂を集めて蒸留水で洗浄後、分解物を希塩
酸で溶出し蒸発乾固する。前記と同様にグルコサミン及
びＮ−アセチルグルコサミンのヘテロオリゴ糖、及びグ
ルコサミンのホモオリゴ糖の塩酸塩が生成する。
【００２０】実施例１ 甲殻類のキチン市販試薬（和光純薬製）を Ｔ．Ｓａｎ
ｎａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，１７７，３５８９−３６００，１９７６に記載の
方法で部分脱アセチル化を行う。得られた脱アセチル化
度が８７％の部分脱アセチル化キチン２．０ｇを５容積
％の乳酸１６０ｍｌに加えて均一に溶解する。前記溶液
を１８００ｍｌのアセトンに滴下して部分脱アセチル化
キチン乳酸塩の沈殿物を生成し、これを５００ミクロン
のふるいで濾過した。回収した部分脱アセチル化キチン
乳酸塩は減圧下、室温で乾燥した。収量は２．０２ｇで
あった。
ｎａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，１７７，３５８９−３６００，１９７６に記載の
方法で部分脱アセチル化を行う。得られた脱アセチル化
度が８７％の部分脱アセチル化キチン２．０ｇを５容積
％の乳酸１６０ｍｌに加えて均一に溶解する。前記溶液
を１８００ｍｌのアセトンに滴下して部分脱アセチル化
キチン乳酸塩の沈殿物を生成し、これを５００ミクロン
のふるいで濾過した。回収した部分脱アセチル化キチン
乳酸塩は減圧下、室温で乾燥した。収量は２．０２ｇで
あった。
【００２１】得られた部分脱アセチル化キチン乳酸塩１
００．０ｍｇを１４．６ｍｌの蒸留水に溶解し、20unit
s/mlのキチナーゼ（寶酒造製、Trichoderma sp.AF6-T8、
活性10units/mg) の水溶液を４００μｌ加え、３７℃で
加水分解反応を行った。４８時間加水分解した後、90℃
で５分間熱処理を行って反応を停止する。反応液は分離
分子量２００００の限外濾過によりキチナーゼを除去し
た後、陽イオン交換樹脂（バイオ−ラッド（Bio-Rad ）
社製、ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８、Ｈ+ 型）３０ｍｌに吸着させ
る。樹脂を蒸留水で洗浄後、５．５規定の塩酸で溶出
し、溶出液は40℃でエバポレータにより蒸発乾固した。
６３．０ｍｇの分解物の塩酸塩が得られ、収率７８％で
あった。
００．０ｍｇを１４．６ｍｌの蒸留水に溶解し、20unit
s/mlのキチナーゼ（寶酒造製、Trichoderma sp.AF6-T8、
活性10units/mg) の水溶液を４００μｌ加え、３７℃で
加水分解反応を行った。４８時間加水分解した後、90℃
で５分間熱処理を行って反応を停止する。反応液は分離
分子量２００００の限外濾過によりキチナーゼを除去し
た後、陽イオン交換樹脂（バイオ−ラッド（Bio-Rad ）
社製、ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８、Ｈ+ 型）３０ｍｌに吸着させ
る。樹脂を蒸留水で洗浄後、５．５規定の塩酸で溶出
し、溶出液は40℃でエバポレータにより蒸発乾固した。
６３．０ｍｇの分解物の塩酸塩が得られ、収率７８％で
あった。
【００２２】得られた分解物の塩酸塩を高性能液体クロ
マトグラフィ（以下、ＨＰＬＣと記す）で分析した結果
を図１に示す。図中における各グルコサミンオリゴ糖塩
酸塩（ＧｌｃＮ．ＨＣｌn ：ｎは２〜６の整数、実施例
２以下も同様に示す）の位置は各々、以下の市販試薬で
決定した。キトビアーゼ ヒドロクロライド、キトトリ
オース ヒドロクロライド、キトテトラーゼ ヒドロク
ロライド、キトペンタオーゼ ヒドロクロライド、キト
ヘキサオース ヒドロクロライド（ChitobioseHydrochl
oride, Chitotriose Hydrochloride, Chitotetraose Hy
drochloride,Chitopentaose Hydrochloride, Chitohexa
ose Hydrochloride,生化学工業製）。
マトグラフィ（以下、ＨＰＬＣと記す）で分析した結果
を図１に示す。図中における各グルコサミンオリゴ糖塩
酸塩（ＧｌｃＮ．ＨＣｌn ：ｎは２〜６の整数、実施例
２以下も同様に示す）の位置は各々、以下の市販試薬で
決定した。キトビアーゼ ヒドロクロライド、キトトリ
オース ヒドロクロライド、キトテトラーゼ ヒドロク
ロライド、キトペンタオーゼ ヒドロクロライド、キト
ヘキサオース ヒドロクロライド（ChitobioseHydrochl
oride, Chitotriose Hydrochloride, Chitotetraose Hy
drochloride,Chitopentaose Hydrochloride, Chitohexa
ose Hydrochloride,生化学工業製）。
【００２３】分解物のうちグルコサミン及びＮ−アセチ
ルグルコサミンのヘテロオリゴ糖は直接に分析できない
ため、分解物の塩酸塩全体をＮ−アセチル化し、Ｎ−ア
セチルグルコサミンオリゴ糖として重合度を調べた。分
解物の塩酸塩をＮ−アセチル化する反応は、トリエチル
アミンを添加した蒸留水−メタノール混合溶媒中で、分
解物塩酸塩を無水酢酸と反応させて行った。得られたＮ
−アセチル化物のＨＰＬＣによる分析結果を図２に示
す。図中でＧｌｃＮＡｃn （ｎは１〜８の整数）は、重
合度が１〜８である各々のＮ−アセチルグルコサミンオ
リゴ糖を表す（実施例２以下も同様に示す）。
ルグルコサミンのヘテロオリゴ糖は直接に分析できない
ため、分解物の塩酸塩全体をＮ−アセチル化し、Ｎ−ア
セチルグルコサミンオリゴ糖として重合度を調べた。分
解物の塩酸塩をＮ−アセチル化する反応は、トリエチル
アミンを添加した蒸留水−メタノール混合溶媒中で、分
解物塩酸塩を無水酢酸と反応させて行った。得られたＮ
−アセチル化物のＨＰＬＣによる分析結果を図２に示
す。図中でＧｌｃＮＡｃn （ｎは１〜８の整数）は、重
合度が１〜８である各々のＮ−アセチルグルコサミンオ
リゴ糖を表す（実施例２以下も同様に示す）。
【００２４】更に、図２の分析結果をＮ−アセチルグル
コサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法により分析し、分
解物中の各オリゴ糖の重量割合を求めた。結果は図３に
示す。図３より分解物中において重合度が４以上のオリ
ゴ糖の割合は６５％で、重合度が５以上のオリゴ糖の割
合は３６％であり、高重合度のオリゴ糖が効率よく製造
できたといえる。
コサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法により分析し、分
解物中の各オリゴ糖の重量割合を求めた。結果は図３に
示す。図３より分解物中において重合度が４以上のオリ
ゴ糖の割合は６５％で、重合度が５以上のオリゴ糖の割
合は３６％であり、高重合度のオリゴ糖が効率よく製造
できたといえる。
【００２５】実施例２ 実施例１で調整した部分脱アセチル化キチン乳酸塩100.
07mgを14.6mlの蒸留水に溶解し、実施例１と同じキチナ
ーゼで濃度が20units/mlの水溶液を４００μｌ加えた。
この溶液を分画分子量が８０００の透析チューブ（SPEC
TRA/POR 社製、NO.132116 ）に入れ、透析チューブの外
部から実施例１と同じ陽イオン交換樹脂２０ｍｌを分散
させた蒸留水２００ｍｌで透析を行いながら、３７℃で
加水分解を行った。４８時間加水分解した後、透析チュ
ーブの外部にある陽イオン交換樹脂を回収し、樹脂を蒸
留水で洗浄する。樹脂に吸着した分解物を５．５規定の
塩酸で溶出し、溶出液は40℃でエバポレータにより蒸発
乾固する。４９．３ｍｇの分解物塩酸塩が得られ、収率
６１％であった。
07mgを14.6mlの蒸留水に溶解し、実施例１と同じキチナ
ーゼで濃度が20units/mlの水溶液を４００μｌ加えた。
この溶液を分画分子量が８０００の透析チューブ（SPEC
TRA/POR 社製、NO.132116 ）に入れ、透析チューブの外
部から実施例１と同じ陽イオン交換樹脂２０ｍｌを分散
させた蒸留水２００ｍｌで透析を行いながら、３７℃で
加水分解を行った。４８時間加水分解した後、透析チュ
ーブの外部にある陽イオン交換樹脂を回収し、樹脂を蒸
留水で洗浄する。樹脂に吸着した分解物を５．５規定の
塩酸で溶出し、溶出液は40℃でエバポレータにより蒸発
乾固する。４９．３ｍｇの分解物塩酸塩が得られ、収率
６１％であった。
【００２６】得られた分解物塩酸塩のＨＰＬＣによる分
析結果を図４に示す。図中のグルコサミンオリゴ糖の塩
酸塩の位置は、実施例１と同じ試薬で決定した。
析結果を図４に示す。図中のグルコサミンオリゴ糖の塩
酸塩の位置は、実施例１と同じ試薬で決定した。
【００２７】実施例１と同様にして分解物をＮ−アセチ
ル化し、Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ糖をＨＰＬＣ
により分析した結果を図５に示す。図５の結果をＮ−ア
セチルグルコサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法により
分析し、分解物中の各オリゴ糖の重量割合を求めた。結
果は図６に示す。
ル化し、Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ糖をＨＰＬＣ
により分析した結果を図５に示す。図５の結果をＮ−ア
セチルグルコサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法により
分析し、分解物中の各オリゴ糖の重量割合を求めた。結
果は図６に示す。
【００２８】実施例１と比較すると分解物塩酸塩の収量
は６１％に減少したが、分解物中において重合度が４以
上のオリゴ糖の割合は６７％、重合度が５以上のオリゴ
糖の割合は４７％であり、高重合度オリゴ糖の割合が高
くなった。従って、透析膜を使用することでより効率的
に高重合度オリゴ糖が製造できたといえる。
は６１％に減少したが、分解物中において重合度が４以
上のオリゴ糖の割合は６７％、重合度が５以上のオリゴ
糖の割合は４７％であり、高重合度オリゴ糖の割合が高
くなった。従って、透析膜を使用することでより効率的
に高重合度オリゴ糖が製造できたといえる。
【００２９】実施例３ 糸状菌（アブシディア コエルレア（Absidia coerule
a）:IFO NO.5301) を用いて小林丘らにより日本農芸化
学会誌、62、10、1988に記載された方法で、脱アセチル化
度が８６％の部分脱アセチル化キチンを得た。前記部分
脱アセチル化キチン０．８１ｇを５容積％の乳酸80mlに
加えて均一に溶解し、この溶液を720ml のアセトンに滴
下して糸状菌の部分脱アセチル化キチン乳酸塩の沈殿物
を生成する。沈殿物を500 ミクロンのふるいで濾過し、
減圧下、室温で乾燥した。1.01g の部分脱アセチル化キ
チン乳酸塩が得られた。
a）:IFO NO.5301) を用いて小林丘らにより日本農芸化
学会誌、62、10、1988に記載された方法で、脱アセチル化
度が８６％の部分脱アセチル化キチンを得た。前記部分
脱アセチル化キチン０．８１ｇを５容積％の乳酸80mlに
加えて均一に溶解し、この溶液を720ml のアセトンに滴
下して糸状菌の部分脱アセチル化キチン乳酸塩の沈殿物
を生成する。沈殿物を500 ミクロンのふるいで濾過し、
減圧下、室温で乾燥した。1.01g の部分脱アセチル化キ
チン乳酸塩が得られた。
【００３０】糸状菌の部分脱アセチル化キチン乳酸塩１
００．０９ｍｇを１４．６ｍｌの蒸留水に溶解し、20un
its/mlの実施例１と同じキチナーゼの水溶液を４００μ
ｌ加えて37℃で加水分解を行った。４８時間の加水分解
後、９０℃で５分間の熱処理で加水分解を停止し、分離
分子量２００００の限外濾過によりキチナーゼを除去し
た。キチナーゼを除去した溶液を実施例１と同じ陽イオ
ン交換樹脂３０ｍｌに吸着させた後、蒸留水で洗浄し
た。樹脂に吸着した分解物を５．５規定の塩酸で溶出
し、溶出液を４０℃でエバポレータにより蒸発乾固し
た。分解物の塩酸塩が４３．５ｍｇが得られ、収率は５
４％であった。
００．０９ｍｇを１４．６ｍｌの蒸留水に溶解し、20un
its/mlの実施例１と同じキチナーゼの水溶液を４００μ
ｌ加えて37℃で加水分解を行った。４８時間の加水分解
後、９０℃で５分間の熱処理で加水分解を停止し、分離
分子量２００００の限外濾過によりキチナーゼを除去し
た。キチナーゼを除去した溶液を実施例１と同じ陽イオ
ン交換樹脂３０ｍｌに吸着させた後、蒸留水で洗浄し
た。樹脂に吸着した分解物を５．５規定の塩酸で溶出
し、溶出液を４０℃でエバポレータにより蒸発乾固し
た。分解物の塩酸塩が４３．５ｍｇが得られ、収率は５
４％であった。
【００３１】得られた分解物の塩酸塩をＨＰＬＣで分析
し、図７はその結果である。図中のグルコサミンオリゴ
糖の塩酸塩の位置は、実施例１と同じ試薬によって決定
した。
し、図７はその結果である。図中のグルコサミンオリゴ
糖の塩酸塩の位置は、実施例１と同じ試薬によって決定
した。
【００３２】実施例１と同様にして分解物をＮ−アセチ
ル化し、Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ糖をＨＰＬＣ
により分析した結果を図８に示す。図８の結果をＮ−ア
セチルグルコサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法により
分析し、分解物中の各オリゴ糖の重量割合を求めた。結
果は図９に示す。図９に示す通り、分解物中における重
合度が４以上のオリゴ糖の割合は６７％、重合度が５以
上のオリゴ糖の割合は４０％であり、この割合は実施例
１以上である。
ル化し、Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ糖をＨＰＬＣ
により分析した結果を図８に示す。図８の結果をＮ−ア
セチルグルコサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法により
分析し、分解物中の各オリゴ糖の重量割合を求めた。結
果は図９に示す。図９に示す通り、分解物中における重
合度が４以上のオリゴ糖の割合は６７％、重合度が５以
上のオリゴ糖の割合は４０％であり、この割合は実施例
１以上である。
【００３３】実施例４ 実施例３で使用した糸状菌の部分脱アセチル化キチン乳
酸塩１００．０４ｍｇを１４．６ｍｌの蒸留水に溶解
し、濃度が20units/mlの実施例１で使用したキチナーゼ
の水溶液を４００μｌ加えた。前記溶液を分画分子量８
０００の透析チューブ（SPECTRA/POR 社製、NO.13211
6）に入れ、透析チューブの外側から実施例１と同じ陽
イオン交換樹脂20mlを分散させた蒸留水２００ｍｌで透
析を行いながら、３７℃で加水分解を行った。４８時間
の加水分解後、透析膜外部の陽イオン交換樹脂を回収し
蒸留水で洗浄した。樹脂に吸着した分解物を５．５規定
の塩酸で溶出し、溶出液を４０℃でエバポレータにより
蒸発乾固した。２４．８ｍｇの分解物塩酸塩が得られ、
収率は３１％であった。
酸塩１００．０４ｍｇを１４．６ｍｌの蒸留水に溶解
し、濃度が20units/mlの実施例１で使用したキチナーゼ
の水溶液を４００μｌ加えた。前記溶液を分画分子量８
０００の透析チューブ（SPECTRA/POR 社製、NO.13211
6）に入れ、透析チューブの外側から実施例１と同じ陽
イオン交換樹脂20mlを分散させた蒸留水２００ｍｌで透
析を行いながら、３７℃で加水分解を行った。４８時間
の加水分解後、透析膜外部の陽イオン交換樹脂を回収し
蒸留水で洗浄した。樹脂に吸着した分解物を５．５規定
の塩酸で溶出し、溶出液を４０℃でエバポレータにより
蒸発乾固した。２４．８ｍｇの分解物塩酸塩が得られ、
収率は３１％であった。
【００３４】得られた分解物塩酸塩をＨＰＬＣにより分
析した結果を図１０に示す。図中のグルコサミンオリゴ
糖の塩酸塩の位置は実施例１と同じ試薬により決定し
た。
析した結果を図１０に示す。図中のグルコサミンオリゴ
糖の塩酸塩の位置は実施例１と同じ試薬により決定し
た。
【００３５】実施例１と同様にして分解物をＮ−アセチ
ル化し、Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ糖をＨＰＬＣ
により分析した結果を図１１に示す。図１１の結果をＮ
−アセチルグルコサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法に
より分析し、分解物中の各オリゴ糖の重量割合を求め
た。結果は図１２に示す。
ル化し、Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ糖をＨＰＬＣ
により分析した結果を図１１に示す。図１１の結果をＮ
−アセチルグルコサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法に
より分析し、分解物中の各オリゴ糖の重量割合を求め
た。結果は図１２に示す。
【００３６】実施例３と比較すると分解物塩酸塩の収量
が３１％に減少したが、図１２に示す通り分解物中にお
ける重合度が４以上のオリゴ糖の割合は６８％、重合度
が５以上のオリゴ糖の割合は４５％である。従って、透
析膜を使用することで、より効率的に高重合度のオリゴ
糖を生成することができた。
が３１％に減少したが、図１２に示す通り分解物中にお
ける重合度が４以上のオリゴ糖の割合は６８％、重合度
が５以上のオリゴ糖の割合は４５％である。従って、透
析膜を使用することで、より効率的に高重合度のオリゴ
糖を生成することができた。
【００３７】
【発明の効果】以上、詳細に説明したように本発明のオ
リゴ糖の製造方法でキチンを分解すれば、確実に生理活
性が高い高重合度のオリゴ糖を得ることができる。ま
た、加水分解するときに透析膜を使用すれば、より簡単
で効率的に高重合度のオリゴ糖を得ることができる。従
って、簡単に入手できるキチンから生理活性が高いオリ
ゴ糖が得られるので、医療等の研究にも大いに有用であ
る。
リゴ糖の製造方法でキチンを分解すれば、確実に生理活
性が高い高重合度のオリゴ糖を得ることができる。ま
た、加水分解するときに透析膜を使用すれば、より簡単
で効率的に高重合度のオリゴ糖を得ることができる。従
って、簡単に入手できるキチンから生理活性が高いオリ
ゴ糖が得られるので、医療等の研究にも大いに有用であ
る。
【図１】実施例１のグルコサミンオリゴ糖塩酸塩の分析
結果を表す図。
結果を表す図。
【図２】実施例１のＮ−アセチル化オリゴ糖の分析結果
を表す図。
を表す図。
【図３】実施例１のキチン分解物の各オリゴ糖の重量割
合を表す図。
合を表す図。
【図４】実施例２のグルコサミンオリゴ糖塩酸塩の分析
結果を表す図。
結果を表す図。
【図５】実施例２のＮ−アセチル化オリゴ糖の分析結果
を表す図。
を表す図。
【図６】実施例２のキチン分解物の各オリゴ糖の重量割
合を表す図。
合を表す図。
【図７】実施例３のグルコサミンオリゴ糖塩酸塩の分析
結果を表す図。
結果を表す図。
【図８】実施例３のＮ−アセチル化オリゴ糖の分析結果
を表す図。
を表す図。
【図９】実施例３のキチン分解物の各オリゴ糖の重量割
合を表す図。
合を表す図。
【図１０】実施例４のグルコサミンオリゴ糖塩酸塩の分
析結果を表す図。
析結果を表す図。
【図１１】実施例４のＮ−アセチル化オリゴ糖の分析結
果を表す図。
果を表す図。
【図１２】実施例４のキチン分解物の各オリゴ糖の重量
割合を表す図。
割合を表す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 千葉 徹 神奈川県川崎市高津区坂戸100−１ 信 越化学工業株式会社コーポレートリサー チセンター内 (72)発明者 渡辺 公綱 東京都渋谷区恵比寿南３−11−17−308 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 19/26
Claims (3)
- 【請求項１】 均一に部分脱アセチル化されたキチンを
キチナーゼにより加水分解して高重合度のグルコサミン
及びＮ−アセチルグルコサミンからなるヘテロオリゴ
糖、及びグルコサミンのホモオリゴ糖を得ることを特徴
とするオリゴ糖の製造方法。 - 【請求項２】 前記加水分解を透析膜の内部で行い、同
時に透析膜の外部に陽イオン交換樹脂を配置して透析を
行い、高重合度のグルコサミン及びＮ−アセチルグルコ
サミンからなるヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホ
モオリゴ糖を得ることを特徴とする請求項１に記載のオ
リゴ糖の製造方法。 - 【請求項３】 前記キチンは甲殻類、または糸状菌から
得られることを特徴とする請求項１に記載のオリゴ糖の
製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16184091A JP2810255B2 (ja) | 1991-07-02 | 1991-07-02 | オリゴ糖の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16184091A JP2810255B2 (ja) | 1991-07-02 | 1991-07-02 | オリゴ糖の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH057496A JPH057496A (ja) | 1993-01-19 |
| JP2810255B2 true JP2810255B2 (ja) | 1998-10-15 |
Family
ID=15742938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16184091A Expired - Fee Related JP2810255B2 (ja) | 1991-07-02 | 1991-07-02 | オリゴ糖の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2810255B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5998173A (en) * | 1996-02-20 | 1999-12-07 | The University Of Bristish Columbia | Process for producing N-acetyl-D-glucosamine |
| JP4109989B2 (ja) * | 2000-12-01 | 2008-07-02 | 株式会社林原生物化学研究所 | エルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法とその用途 |
| KR100483847B1 (ko) * | 2002-07-11 | 2005-04-20 | 주식회사 건풍바이오 | 수족냉증 완화효과를 나타내는 키틴/키토산올리고당 |
| US20050148546A1 (en) * | 2003-12-09 | 2005-07-07 | Grund Alan D. | Deacetylation of N-acetylglucosamine |
| KR100735826B1 (ko) * | 2005-09-30 | 2007-07-06 | 주식회사 키토라이프 | 효소분해에 의한 ｎ-아세틸-ｄ-글루코사민의 제조방법 |
| JP2012031107A (ja) * | 2010-07-30 | 2012-02-16 | Koyo Chemical Kk | ヘテロ二糖、キトビオース、及びジ‐ｎ‐アセチルキトビオースの製造方法、並びにそれらの用途 |
| CN103913532A (zh) * | 2014-04-14 | 2014-07-09 | 南京林业大学 | 一种利用离子交换色谱法测定n-乙酰氨基葡萄糖的方法 |
-
1991
- 1991-07-02 JP JP16184091A patent/JP2810255B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH057496A (ja) | 1993-01-19 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |