JP2810255B2 - オリゴ糖の製造方法 - Google Patents
オリゴ糖の製造方法Info
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、キチン及びキトサンを
分解して得られる生理活性が高い高重合度のキチンオリ
ゴ糖及びキトサンオリゴ糖の製造方法に関するものであ
る。
分解して得られる生理活性が高い高重合度のキチンオリ
ゴ糖及びキトサンオリゴ糖の製造方法に関するものであ
る。
【0002】
【従来の技術】近年、キチンやキトサンを分解すること
により生理活性が高いオリゴ糖が見い出されている。生
理活性が高いオリゴ糖は比較的重合度の高いオリゴ糖で
ある。例えばキチンオリゴ糖のヘキサN−アセチルキト
ヘキサオース(重合度6のN−アセチルグルコサミン)
は、免疫機能亢進効果が著しい(鈴木茂生ら、第2回キ
チン、キトサンシンポジジウム講演要旨集、3-6、198
5)。また、キトサンオリゴ糖のヘプタキトヘプタオー
ス(重合度7のグルコサミン)は、フサリウム ソラニ
(Fusarium solani )の成育を阻害し(D.F.Kendra et.
al.,Exp.Mycology,8,276-281,1984) 、トマトの葉のプ
ロテアーゼ阻害剤を合成するために有用である(M.Walke
r-Simmons et.al.,Plant physiol.,76, 787-790,198
4)。
により生理活性が高いオリゴ糖が見い出されている。生
理活性が高いオリゴ糖は比較的重合度の高いオリゴ糖で
ある。例えばキチンオリゴ糖のヘキサN−アセチルキト
ヘキサオース(重合度6のN−アセチルグルコサミン)
は、免疫機能亢進効果が著しい(鈴木茂生ら、第2回キ
チン、キトサンシンポジジウム講演要旨集、3-6、198
5)。また、キトサンオリゴ糖のヘプタキトヘプタオー
ス(重合度7のグルコサミン)は、フサリウム ソラニ
(Fusarium solani )の成育を阻害し(D.F.Kendra et.
al.,Exp.Mycology,8,276-281,1984) 、トマトの葉のプ
ロテアーゼ阻害剤を合成するために有用である(M.Walke
r-Simmons et.al.,Plant physiol.,76, 787-790,198
4)。
【0003】一方、生理活性が高いオリゴ糖を得る方法
は酸加水分解や酵素分解が試みられているが、これまで
に効率のよい方法は見い出されていない。例えばキチン
を塩酸で加水分解しN−アセチルグルコサミンのオリゴ
糖を得ることができるが、分解物中における重合度が高
いオリゴ糖の割合は塩酸の濃度、温度及び反応時間など
に大きく影響される。この場合、加水分解を限定的に行
うと分解物中における高重合度のオリゴ糖の割合は増加
するが、分解物全体の収量が少ない。逆に、加水分解を
ほぼ完全に行うと分解物全体の収量は多くなるが、分解
物中の高重合度のオリゴ糖の割合が著しく減少する。ま
た、キトサンの酸加水分解によるグルコサミンのオリゴ
糖の生成についても同様であり、高重合度のオリゴ糖を
効率よく得る方法は確立されていない(坂井和雄、キチ
ン、キトサンの開発と応用、工業技術会、111-134、198
7)。
は酸加水分解や酵素分解が試みられているが、これまで
に効率のよい方法は見い出されていない。例えばキチン
を塩酸で加水分解しN−アセチルグルコサミンのオリゴ
糖を得ることができるが、分解物中における重合度が高
いオリゴ糖の割合は塩酸の濃度、温度及び反応時間など
に大きく影響される。この場合、加水分解を限定的に行
うと分解物中における高重合度のオリゴ糖の割合は増加
するが、分解物全体の収量が少ない。逆に、加水分解を
ほぼ完全に行うと分解物全体の収量は多くなるが、分解
物中の高重合度のオリゴ糖の割合が著しく減少する。ま
た、キトサンの酸加水分解によるグルコサミンのオリゴ
糖の生成についても同様であり、高重合度のオリゴ糖を
効率よく得る方法は確立されていない(坂井和雄、キチ
ン、キトサンの開発と応用、工業技術会、111-134、198
7)。
【0004】酵素分解による方法では、キチンをキチナ
ーゼで分解してN−アセチルグルコサミンのオリゴ糖を
得た場合、分解物が殆ど二糖であった(大宝明、昭和6
1年日本農芸化学会西日本支部大会要旨集、12、1986
)。また、キトサンをキトサナーゼで分解しグルコサ
ミンのオリゴ糖を得る場合も分解物は殆ど二糖から五糖
であり、その中でも五糖以上の重合度のオリゴ糖は少な
い(M.Izumi et.al.,Agric.Biol.Chem.,51,1189-1191,1
987) 。
ーゼで分解してN−アセチルグルコサミンのオリゴ糖を
得た場合、分解物が殆ど二糖であった(大宝明、昭和6
1年日本農芸化学会西日本支部大会要旨集、12、1986
)。また、キトサンをキトサナーゼで分解しグルコサ
ミンのオリゴ糖を得る場合も分解物は殆ど二糖から五糖
であり、その中でも五糖以上の重合度のオリゴ糖は少な
い(M.Izumi et.al.,Agric.Biol.Chem.,51,1189-1191,1
987) 。
【0005】その他、高重合度のオリゴ糖を得る方法
は、N−アセチルグルコサミンの四糖にキチナーゼを作
用させて糖転移反応を利用してN−アセチルグルコサミ
ンの六糖を得ることができるが、原料である四糖のN−
アセチルグルコサミン自体が得られにくい(F.Nanjo e
t.al.,Agric.Biol.Chem.,53,2189-2195,1989)。また、
分子内に20〜35%程度のN−アセチルグルコサミン
残基が不均一に分布した部分脱アセチル化キチンをキチ
ナーゼで分解してオリゴ糖を得ることもできるが、分解
物は二糖、三糖及び四糖に限られる(A.Ohtakara et.a
l.,Agric.Biol.Chem.,52,3181-3182,1988)。
は、N−アセチルグルコサミンの四糖にキチナーゼを作
用させて糖転移反応を利用してN−アセチルグルコサミ
ンの六糖を得ることができるが、原料である四糖のN−
アセチルグルコサミン自体が得られにくい(F.Nanjo e
t.al.,Agric.Biol.Chem.,53,2189-2195,1989)。また、
分子内に20〜35%程度のN−アセチルグルコサミン
残基が不均一に分布した部分脱アセチル化キチンをキチ
ナーゼで分解してオリゴ糖を得ることもできるが、分解
物は二糖、三糖及び四糖に限られる(A.Ohtakara et.a
l.,Agric.Biol.Chem.,52,3181-3182,1988)。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明は前記の課題を
解決するためなされたもので、生理活性が高いグルコサ
ミンオリゴ糖及びN−アセチルグルコサミンオリゴ糖の
効率の良い製造方法を提供することを目的とする。
解決するためなされたもので、生理活性が高いグルコサ
ミンオリゴ糖及びN−アセチルグルコサミンオリゴ糖の
効率の良い製造方法を提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】前記の目的を達成するた
めになされた本発明のオリゴ糖の製造方法は、均一に部
分脱アセチル化されたキチンをキチナーゼにより加水分
解し、高重合度のグルコサミン及びN−アセチルグルコ
サミンからなるヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホ
モオリゴ糖を得る。キチンのキチナーゼによる加水分解
は透析膜の内部で行い、同時に透析膜の外部に陽イオン
交換樹脂を配置して透析を行うことが好ましい。尚、使
用するキチンは甲殻類、または糸状菌から得られるもの
が好ましい。
めになされた本発明のオリゴ糖の製造方法は、均一に部
分脱アセチル化されたキチンをキチナーゼにより加水分
解し、高重合度のグルコサミン及びN−アセチルグルコ
サミンからなるヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホ
モオリゴ糖を得る。キチンのキチナーゼによる加水分解
は透析膜の内部で行い、同時に透析膜の外部に陽イオン
交換樹脂を配置して透析を行うことが好ましい。尚、使
用するキチンは甲殻類、または糸状菌から得られるもの
が好ましい。
【0008】均一に部分脱アセチル化されたキチンは、
N−アセチルグルコサミン残基が分子中に均一に分布し
たものであればよく、脱アセチル化の割合は70〜95
%程度、特に80〜90%が好ましい。
N−アセチルグルコサミン残基が分子中に均一に分布し
たものであればよく、脱アセチル化の割合は70〜95
%程度、特に80〜90%が好ましい。
【0009】キチンを均一に部分脱アセチル化する方法
としては、甲殻類のキチンであればキチン粉末を高濃度
のアルカリ溶液に溶解してアルカリキチンとして部分脱
アセチル化を行う(T.Sannan et.al.,Makromal.Chem.,1
77,3589-3600,1976 )。糸状菌のキチンは、菌体をアル
カリ処理した後、酢酸抽出を行えば脱アセチル化された
キチンが調整できる(小林丘ら、日本農芸化学会誌、6
2 、10、1988)。甲殻類のキチンよりも糸状菌のキチンの
方が調整法としては容易である。甲殻類のキチンは部分
脱アセチル化の際にアルカリキチンにすることが煩雑で
あり、高濃度のアルカリ廃液の処理が面倒である(キチ
ン、キトサン研究会編、キチン、キトサン実験マニュア
ル、技報堂出版、16-21、1991) 。
としては、甲殻類のキチンであればキチン粉末を高濃度
のアルカリ溶液に溶解してアルカリキチンとして部分脱
アセチル化を行う(T.Sannan et.al.,Makromal.Chem.,1
77,3589-3600,1976 )。糸状菌のキチンは、菌体をアル
カリ処理した後、酢酸抽出を行えば脱アセチル化された
キチンが調整できる(小林丘ら、日本農芸化学会誌、6
2 、10、1988)。甲殻類のキチンよりも糸状菌のキチンの
方が調整法としては容易である。甲殻類のキチンは部分
脱アセチル化の際にアルカリキチンにすることが煩雑で
あり、高濃度のアルカリ廃液の処理が面倒である(キチ
ン、キトサン研究会編、キチン、キトサン実験マニュア
ル、技報堂出版、16-21、1991) 。
【0010】キチナーゼは、部分脱アセチル化キチン分
子中のN−アセチルグルコサミン残基を認識し分解する
エンド型キチナーゼであれば良く、できればキトビアー
ゼ(β−N−アセチルグルコサミナーゼ)活性を除去し
た精製品が好ましい。前記キチナーゼとしては、例えば
寶酒造製のトリコデルマ sp.AF6-T8 (Trichodermasp.AF
6-T8)、シグマ ケミカル社(SIGMA CHEMICAL COMPAN
Y)製のストレプトミセス グリソイス( Streptomyces
griseus )が挙げられる。
子中のN−アセチルグルコサミン残基を認識し分解する
エンド型キチナーゼであれば良く、できればキトビアー
ゼ(β−N−アセチルグルコサミナーゼ)活性を除去し
た精製品が好ましい。前記キチナーゼとしては、例えば
寶酒造製のトリコデルマ sp.AF6-T8 (Trichodermasp.AF
6-T8)、シグマ ケミカル社(SIGMA CHEMICAL COMPAN
Y)製のストレプトミセス グリソイス( Streptomyces
griseus )が挙げられる。
【0011】透析膜は分画分子量が1000〜1500
0程度、特に2000〜8000が好ましい。市販品で
は、例えばスペクトラ/ピーオーアール(SPECTR
A/POR)社製の透析膜が挙げられる。
0程度、特に2000〜8000が好ましい。市販品で
は、例えばスペクトラ/ピーオーアール(SPECTR
A/POR)社製の透析膜が挙げられる。
【0012】陽イオン交換樹脂は、予めH+ のイオンに
変えた強酸性型であれば良い。市販品としては、例えば
ダウ ケミカル社(DOW CHEMICAL COMPANY)製のDOW
EX50WやDOWEX HGRが挙げられる。
変えた強酸性型であれば良い。市販品としては、例えば
ダウ ケミカル社(DOW CHEMICAL COMPANY)製のDOW
EX50WやDOWEX HGRが挙げられる。
【0013】
【作用】部分脱アセチル化キチンはN−アセチルグルコ
サミン残基が分子中に均一に分布し、キチナーゼがN−
アセチルグルコサミン残基の部分を優先的に切断するた
め、効率よく高重合度のオリゴ糖を得ることができる。
サミン残基が分子中に均一に分布し、キチナーゼがN−
アセチルグルコサミン残基の部分を優先的に切断するた
め、効率よく高重合度のオリゴ糖を得ることができる。
【0014】また、透析膜の内部で加水分解しながら透
析膜外部に陽イオン交換樹脂を配置して透析を行うと、
より効率的に加水分解でき、加水分解終了後の処理を省
くことができる。
析膜外部に陽イオン交換樹脂を配置して透析を行うと、
より効率的に加水分解でき、加水分解終了後の処理を省
くことができる。
【0015】
【実施例】以下、本発明の実施例を説明するが、これに
限定されるものではない。
限定されるものではない。
【0016】キチンを均一に部分脱アセチル化した後、
これを乳酸に溶解して均一に溶解する。乳酸は、部分脱
アセチル化キチン1gに対して、2〜20容積%好まし
くは5〜10容積%の乳酸を20〜200ml好ましく
は60〜100ml加える。前記溶液をアセトンに滴下
すると、部分脱アセチル化キチン乳酸塩がゲル状沈殿物
として生成する。アセトンは前記溶液100ml当たり
900ml以上使用するのが好ましい。生成したゲル状
沈殿物を濾過し、アセトンで数回洗浄を行って乳酸を完
全に除去した後、減圧で乾燥し、部分脱アセチル化キチ
ン乳酸塩を得る。
これを乳酸に溶解して均一に溶解する。乳酸は、部分脱
アセチル化キチン1gに対して、2〜20容積%好まし
くは5〜10容積%の乳酸を20〜200ml好ましく
は60〜100ml加える。前記溶液をアセトンに滴下
すると、部分脱アセチル化キチン乳酸塩がゲル状沈殿物
として生成する。アセトンは前記溶液100ml当たり
900ml以上使用するのが好ましい。生成したゲル状
沈殿物を濾過し、アセトンで数回洗浄を行って乳酸を完
全に除去した後、減圧で乾燥し、部分脱アセチル化キチ
ン乳酸塩を得る。
【0017】得られた部分脱アセチル化キチン乳酸塩を
水に溶解し、0.1〜1重量%の水溶液とする。前記乳
酸塩水溶液にキチナーゼを添加し、20〜50℃で24
時間以上加水分解を行う。キチナーゼは、乳酸塩水溶液
10ml中に1〜10ユニット(units)のキチナ
ーゼを含む濃度に調整し、前記濃度のキチナーゼ水溶液
は乳酸塩水溶液の容積の1/500〜1/10倍を添加
する。加水分解を24時間以上行った後、熱処理により
加水分解を停止し、反応液からキチナーゼを限外濾過で
除去する。
水に溶解し、0.1〜1重量%の水溶液とする。前記乳
酸塩水溶液にキチナーゼを添加し、20〜50℃で24
時間以上加水分解を行う。キチナーゼは、乳酸塩水溶液
10ml中に1〜10ユニット(units)のキチナ
ーゼを含む濃度に調整し、前記濃度のキチナーゼ水溶液
は乳酸塩水溶液の容積の1/500〜1/10倍を添加
する。加水分解を24時間以上行った後、熱処理により
加水分解を停止し、反応液からキチナーゼを限外濾過で
除去する。
【0018】キチナーゼを除去した反応液は陽イオン交
換樹脂に吸着させた後、陽イオン交換樹脂を蒸留水で洗
浄し遊離した乳酸を除去する。樹脂に吸着した部分脱ア
セチル化キチンの加水分解物は希塩酸で溶出し、蒸発乾
固する。生成物質はグルコサミン及びN−アセチルグル
コサミンのヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホモオ
リゴ糖の塩酸塩である。
換樹脂に吸着させた後、陽イオン交換樹脂を蒸留水で洗
浄し遊離した乳酸を除去する。樹脂に吸着した部分脱ア
セチル化キチンの加水分解物は希塩酸で溶出し、蒸発乾
固する。生成物質はグルコサミン及びN−アセチルグル
コサミンのヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホモオ
リゴ糖の塩酸塩である。
【0019】また、透析膜内部で加水分解を行う場合
は、キチナーゼを添加した部分脱アセチル化キチン乳酸
塩水溶液を透析膜の内部に入れ、透析膜の外側から陽イ
オン交換樹脂を分散した蒸留水で透析しながら、前記と
同様に20〜50℃で加水分解を24時間以上行う。蒸
留水に分散する陽イオン交換樹脂は、部分脱アセチル化
キチン乳酸塩100mg当たり陽イオン交換樹脂10〜
50mlの割合である。透析に使用する陽イオン交換樹
脂を分散した蒸留水の容量は、キチナーゼを添加した乳
酸塩水溶液の容量の10〜100倍であることが好まし
い。加水分解を24時間以上行った後、透析膜外側の陽
イオン交換樹脂を集めて蒸留水で洗浄後、分解物を希塩
酸で溶出し蒸発乾固する。前記と同様にグルコサミン及
びN−アセチルグルコサミンのヘテロオリゴ糖、及びグ
ルコサミンのホモオリゴ糖の塩酸塩が生成する。
は、キチナーゼを添加した部分脱アセチル化キチン乳酸
塩水溶液を透析膜の内部に入れ、透析膜の外側から陽イ
オン交換樹脂を分散した蒸留水で透析しながら、前記と
同様に20〜50℃で加水分解を24時間以上行う。蒸
留水に分散する陽イオン交換樹脂は、部分脱アセチル化
キチン乳酸塩100mg当たり陽イオン交換樹脂10〜
50mlの割合である。透析に使用する陽イオン交換樹
脂を分散した蒸留水の容量は、キチナーゼを添加した乳
酸塩水溶液の容量の10〜100倍であることが好まし
い。加水分解を24時間以上行った後、透析膜外側の陽
イオン交換樹脂を集めて蒸留水で洗浄後、分解物を希塩
酸で溶出し蒸発乾固する。前記と同様にグルコサミン及
びN−アセチルグルコサミンのヘテロオリゴ糖、及びグ
ルコサミンのホモオリゴ糖の塩酸塩が生成する。
【0020】実施例1 甲殻類のキチン市販試薬(和光純薬製)を T.San
nan et.al.,Makromol.Che
m.,177,3589−3600,1976に記載の
方法で部分脱アセチル化を行う。得られた脱アセチル化
度が87%の部分脱アセチル化キチン2.0gを5容積
%の乳酸160mlに加えて均一に溶解する。前記溶液
を1800mlのアセトンに滴下して部分脱アセチル化
キチン乳酸塩の沈殿物を生成し、これを500ミクロン
のふるいで濾過した。回収した部分脱アセチル化キチン
乳酸塩は減圧下、室温で乾燥した。収量は2.02gで
あった。
nan et.al.,Makromol.Che
m.,177,3589−3600,1976に記載の
方法で部分脱アセチル化を行う。得られた脱アセチル化
度が87%の部分脱アセチル化キチン2.0gを5容積
%の乳酸160mlに加えて均一に溶解する。前記溶液
を1800mlのアセトンに滴下して部分脱アセチル化
キチン乳酸塩の沈殿物を生成し、これを500ミクロン
のふるいで濾過した。回収した部分脱アセチル化キチン
乳酸塩は減圧下、室温で乾燥した。収量は2.02gで
あった。
【0021】得られた部分脱アセチル化キチン乳酸塩1
00.0mgを14.6mlの蒸留水に溶解し、20unit
s/mlのキチナーゼ(寶酒造製、Trichoderma sp.AF6-T8、
活性10units/mg) の水溶液を400μl加え、37℃で
加水分解反応を行った。48時間加水分解した後、90℃
で5分間熱処理を行って反応を停止する。反応液は分離
分子量20000の限外濾過によりキチナーゼを除去し
た後、陽イオン交換樹脂(バイオ−ラッド(Bio-Rad )
社製、AG50W−X8、H+ 型)30mlに吸着させ
る。樹脂を蒸留水で洗浄後、5.5規定の塩酸で溶出
し、溶出液は40℃でエバポレータにより蒸発乾固した。
63.0mgの分解物の塩酸塩が得られ、収率78%で
あった。
00.0mgを14.6mlの蒸留水に溶解し、20unit
s/mlのキチナーゼ(寶酒造製、Trichoderma sp.AF6-T8、
活性10units/mg) の水溶液を400μl加え、37℃で
加水分解反応を行った。48時間加水分解した後、90℃
で5分間熱処理を行って反応を停止する。反応液は分離
分子量20000の限外濾過によりキチナーゼを除去し
た後、陽イオン交換樹脂(バイオ−ラッド(Bio-Rad )
社製、AG50W−X8、H+ 型)30mlに吸着させ
る。樹脂を蒸留水で洗浄後、5.5規定の塩酸で溶出
し、溶出液は40℃でエバポレータにより蒸発乾固した。
63.0mgの分解物の塩酸塩が得られ、収率78%で
あった。
【0022】得られた分解物の塩酸塩を高性能液体クロ
マトグラフィ(以下、HPLCと記す)で分析した結果
を図1に示す。図中における各グルコサミンオリゴ糖塩
酸塩(GlcN.HCln :nは2〜6の整数、実施例
2以下も同様に示す)の位置は各々、以下の市販試薬で
決定した。キトビアーゼ ヒドロクロライド、キトトリ
オース ヒドロクロライド、キトテトラーゼ ヒドロク
ロライド、キトペンタオーゼ ヒドロクロライド、キト
ヘキサオース ヒドロクロライド(ChitobioseHydrochl
oride, Chitotriose Hydrochloride, Chitotetraose Hy
drochloride,Chitopentaose Hydrochloride, Chitohexa
ose Hydrochloride,生化学工業製)。
マトグラフィ(以下、HPLCと記す)で分析した結果
を図1に示す。図中における各グルコサミンオリゴ糖塩
酸塩(GlcN.HCln :nは2〜6の整数、実施例
2以下も同様に示す)の位置は各々、以下の市販試薬で
決定した。キトビアーゼ ヒドロクロライド、キトトリ
オース ヒドロクロライド、キトテトラーゼ ヒドロク
ロライド、キトペンタオーゼ ヒドロクロライド、キト
ヘキサオース ヒドロクロライド(ChitobioseHydrochl
oride, Chitotriose Hydrochloride, Chitotetraose Hy
drochloride,Chitopentaose Hydrochloride, Chitohexa
ose Hydrochloride,生化学工業製)。
【0023】分解物のうちグルコサミン及びN−アセチ
ルグルコサミンのヘテロオリゴ糖は直接に分析できない
ため、分解物の塩酸塩全体をN−アセチル化し、N−ア
セチルグルコサミンオリゴ糖として重合度を調べた。分
解物の塩酸塩をN−アセチル化する反応は、トリエチル
アミンを添加した蒸留水−メタノール混合溶媒中で、分
解物塩酸塩を無水酢酸と反応させて行った。得られたN
−アセチル化物のHPLCによる分析結果を図2に示
す。図中でGlcNAcn (nは1〜8の整数)は、重
合度が1〜8である各々のN−アセチルグルコサミンオ
リゴ糖を表す(実施例2以下も同様に示す)。
ルグルコサミンのヘテロオリゴ糖は直接に分析できない
ため、分解物の塩酸塩全体をN−アセチル化し、N−ア
セチルグルコサミンオリゴ糖として重合度を調べた。分
解物の塩酸塩をN−アセチル化する反応は、トリエチル
アミンを添加した蒸留水−メタノール混合溶媒中で、分
解物塩酸塩を無水酢酸と反応させて行った。得られたN
−アセチル化物のHPLCによる分析結果を図2に示
す。図中でGlcNAcn (nは1〜8の整数)は、重
合度が1〜8である各々のN−アセチルグルコサミンオ
リゴ糖を表す(実施例2以下も同様に示す)。
【0024】更に、図2の分析結果をN−アセチルグル
コサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法により分析し、分
解物中の各オリゴ糖の重量割合を求めた。結果は図3に
示す。図3より分解物中において重合度が4以上のオリ
ゴ糖の割合は65%で、重合度が5以上のオリゴ糖の割
合は36%であり、高重合度のオリゴ糖が効率よく製造
できたといえる。
コサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法により分析し、分
解物中の各オリゴ糖の重量割合を求めた。結果は図3に
示す。図3より分解物中において重合度が4以上のオリ
ゴ糖の割合は65%で、重合度が5以上のオリゴ糖の割
合は36%であり、高重合度のオリゴ糖が効率よく製造
できたといえる。
【0025】実施例2 実施例1で調整した部分脱アセチル化キチン乳酸塩100.
07mgを14.6mlの蒸留水に溶解し、実施例1と同じキチナ
ーゼで濃度が20units/mlの水溶液を400μl加えた。
この溶液を分画分子量が8000の透析チューブ(SPEC
TRA/POR 社製、NO.132116 )に入れ、透析チューブの外
部から実施例1と同じ陽イオン交換樹脂20mlを分散
させた蒸留水200mlで透析を行いながら、37℃で
加水分解を行った。48時間加水分解した後、透析チュ
ーブの外部にある陽イオン交換樹脂を回収し、樹脂を蒸
留水で洗浄する。樹脂に吸着した分解物を5.5規定の
塩酸で溶出し、溶出液は40℃でエバポレータにより蒸発
乾固する。49.3mgの分解物塩酸塩が得られ、収率
61%であった。
07mgを14.6mlの蒸留水に溶解し、実施例1と同じキチナ
ーゼで濃度が20units/mlの水溶液を400μl加えた。
この溶液を分画分子量が8000の透析チューブ(SPEC
TRA/POR 社製、NO.132116 )に入れ、透析チューブの外
部から実施例1と同じ陽イオン交換樹脂20mlを分散
させた蒸留水200mlで透析を行いながら、37℃で
加水分解を行った。48時間加水分解した後、透析チュ
ーブの外部にある陽イオン交換樹脂を回収し、樹脂を蒸
留水で洗浄する。樹脂に吸着した分解物を5.5規定の
塩酸で溶出し、溶出液は40℃でエバポレータにより蒸発
乾固する。49.3mgの分解物塩酸塩が得られ、収率
61%であった。
【0026】得られた分解物塩酸塩のHPLCによる分
析結果を図4に示す。図中のグルコサミンオリゴ糖の塩
酸塩の位置は、実施例1と同じ試薬で決定した。
析結果を図4に示す。図中のグルコサミンオリゴ糖の塩
酸塩の位置は、実施例1と同じ試薬で決定した。
【0027】実施例1と同様にして分解物をN−アセチ
ル化し、N−アセチルグルコサミンオリゴ糖をHPLC
により分析した結果を図5に示す。図5の結果をN−ア
セチルグルコサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法により
分析し、分解物中の各オリゴ糖の重量割合を求めた。結
果は図6に示す。
ル化し、N−アセチルグルコサミンオリゴ糖をHPLC
により分析した結果を図5に示す。図5の結果をN−ア
セチルグルコサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法により
分析し、分解物中の各オリゴ糖の重量割合を求めた。結
果は図6に示す。
【0028】実施例1と比較すると分解物塩酸塩の収量
は61%に減少したが、分解物中において重合度が4以
上のオリゴ糖の割合は67%、重合度が5以上のオリゴ
糖の割合は47%であり、高重合度オリゴ糖の割合が高
くなった。従って、透析膜を使用することでより効率的
に高重合度オリゴ糖が製造できたといえる。
は61%に減少したが、分解物中において重合度が4以
上のオリゴ糖の割合は67%、重合度が5以上のオリゴ
糖の割合は47%であり、高重合度オリゴ糖の割合が高
くなった。従って、透析膜を使用することでより効率的
に高重合度オリゴ糖が製造できたといえる。
【0029】実施例3 糸状菌(アブシディア コエルレア(Absidia coerule
a):IFO NO.5301) を用いて小林丘らにより日本農芸化
学会誌、62、10、1988に記載された方法で、脱アセチル化
度が86%の部分脱アセチル化キチンを得た。前記部分
脱アセチル化キチン0.81gを5容積%の乳酸80mlに
加えて均一に溶解し、この溶液を720ml のアセトンに滴
下して糸状菌の部分脱アセチル化キチン乳酸塩の沈殿物
を生成する。沈殿物を500 ミクロンのふるいで濾過し、
減圧下、室温で乾燥した。1.01g の部分脱アセチル化キ
チン乳酸塩が得られた。
a):IFO NO.5301) を用いて小林丘らにより日本農芸化
学会誌、62、10、1988に記載された方法で、脱アセチル化
度が86%の部分脱アセチル化キチンを得た。前記部分
脱アセチル化キチン0.81gを5容積%の乳酸80mlに
加えて均一に溶解し、この溶液を720ml のアセトンに滴
下して糸状菌の部分脱アセチル化キチン乳酸塩の沈殿物
を生成する。沈殿物を500 ミクロンのふるいで濾過し、
減圧下、室温で乾燥した。1.01g の部分脱アセチル化キ
チン乳酸塩が得られた。
【0030】糸状菌の部分脱アセチル化キチン乳酸塩1
00.09mgを14.6mlの蒸留水に溶解し、20un
its/mlの実施例1と同じキチナーゼの水溶液を400μ
l加えて37℃で加水分解を行った。48時間の加水分解
後、90℃で5分間の熱処理で加水分解を停止し、分離
分子量20000の限外濾過によりキチナーゼを除去し
た。キチナーゼを除去した溶液を実施例1と同じ陽イオ
ン交換樹脂30mlに吸着させた後、蒸留水で洗浄し
た。樹脂に吸着した分解物を5.5規定の塩酸で溶出
し、溶出液を40℃でエバポレータにより蒸発乾固し
た。分解物の塩酸塩が43.5mgが得られ、収率は5
4%であった。
00.09mgを14.6mlの蒸留水に溶解し、20un
its/mlの実施例1と同じキチナーゼの水溶液を400μ
l加えて37℃で加水分解を行った。48時間の加水分解
後、90℃で5分間の熱処理で加水分解を停止し、分離
分子量20000の限外濾過によりキチナーゼを除去し
た。キチナーゼを除去した溶液を実施例1と同じ陽イオ
ン交換樹脂30mlに吸着させた後、蒸留水で洗浄し
た。樹脂に吸着した分解物を5.5規定の塩酸で溶出
し、溶出液を40℃でエバポレータにより蒸発乾固し
た。分解物の塩酸塩が43.5mgが得られ、収率は5
4%であった。
【0031】得られた分解物の塩酸塩をHPLCで分析
し、図7はその結果である。図中のグルコサミンオリゴ
糖の塩酸塩の位置は、実施例1と同じ試薬によって決定
した。
し、図7はその結果である。図中のグルコサミンオリゴ
糖の塩酸塩の位置は、実施例1と同じ試薬によって決定
した。
【0032】実施例1と同様にして分解物をN−アセチ
ル化し、N−アセチルグルコサミンオリゴ糖をHPLC
により分析した結果を図8に示す。図8の結果をN−ア
セチルグルコサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法により
分析し、分解物中の各オリゴ糖の重量割合を求めた。結
果は図9に示す。図9に示す通り、分解物中における重
合度が4以上のオリゴ糖の割合は67%、重合度が5以
上のオリゴ糖の割合は40%であり、この割合は実施例
1以上である。
ル化し、N−アセチルグルコサミンオリゴ糖をHPLC
により分析した結果を図8に示す。図8の結果をN−ア
セチルグルコサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法により
分析し、分解物中の各オリゴ糖の重量割合を求めた。結
果は図9に示す。図9に示す通り、分解物中における重
合度が4以上のオリゴ糖の割合は67%、重合度が5以
上のオリゴ糖の割合は40%であり、この割合は実施例
1以上である。
【0033】実施例4 実施例3で使用した糸状菌の部分脱アセチル化キチン乳
酸塩100.04mgを14.6mlの蒸留水に溶解
し、濃度が20units/mlの実施例1で使用したキチナーゼ
の水溶液を400μl加えた。前記溶液を分画分子量8
000の透析チューブ(SPECTRA/POR 社製、NO.13211
6)に入れ、透析チューブの外側から実施例1と同じ陽
イオン交換樹脂20mlを分散させた蒸留水200mlで透
析を行いながら、37℃で加水分解を行った。48時間
の加水分解後、透析膜外部の陽イオン交換樹脂を回収し
蒸留水で洗浄した。樹脂に吸着した分解物を5.5規定
の塩酸で溶出し、溶出液を40℃でエバポレータにより
蒸発乾固した。24.8mgの分解物塩酸塩が得られ、
収率は31%であった。
酸塩100.04mgを14.6mlの蒸留水に溶解
し、濃度が20units/mlの実施例1で使用したキチナーゼ
の水溶液を400μl加えた。前記溶液を分画分子量8
000の透析チューブ(SPECTRA/POR 社製、NO.13211
6)に入れ、透析チューブの外側から実施例1と同じ陽
イオン交換樹脂20mlを分散させた蒸留水200mlで透
析を行いながら、37℃で加水分解を行った。48時間
の加水分解後、透析膜外部の陽イオン交換樹脂を回収し
蒸留水で洗浄した。樹脂に吸着した分解物を5.5規定
の塩酸で溶出し、溶出液を40℃でエバポレータにより
蒸発乾固した。24.8mgの分解物塩酸塩が得られ、
収率は31%であった。
【0034】得られた分解物塩酸塩をHPLCにより分
析した結果を図10に示す。図中のグルコサミンオリゴ
糖の塩酸塩の位置は実施例1と同じ試薬により決定し
た。
析した結果を図10に示す。図中のグルコサミンオリゴ
糖の塩酸塩の位置は実施例1と同じ試薬により決定し
た。
【0035】実施例1と同様にして分解物をN−アセチ
ル化し、N−アセチルグルコサミンオリゴ糖をHPLC
により分析した結果を図11に示す。図11の結果をN
−アセチルグルコサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法に
より分析し、分解物中の各オリゴ糖の重量割合を求め
た。結果は図12に示す。
ル化し、N−アセチルグルコサミンオリゴ糖をHPLC
により分析した結果を図11に示す。図11の結果をN
−アセチルグルコサミンオリゴ糖標準試薬の検量線法に
より分析し、分解物中の各オリゴ糖の重量割合を求め
た。結果は図12に示す。
【0036】実施例3と比較すると分解物塩酸塩の収量
が31%に減少したが、図12に示す通り分解物中にお
ける重合度が4以上のオリゴ糖の割合は68%、重合度
が5以上のオリゴ糖の割合は45%である。従って、透
析膜を使用することで、より効率的に高重合度のオリゴ
糖を生成することができた。
が31%に減少したが、図12に示す通り分解物中にお
ける重合度が4以上のオリゴ糖の割合は68%、重合度
が5以上のオリゴ糖の割合は45%である。従って、透
析膜を使用することで、より効率的に高重合度のオリゴ
糖を生成することができた。
【0037】
【発明の効果】以上、詳細に説明したように本発明のオ
リゴ糖の製造方法でキチンを分解すれば、確実に生理活
性が高い高重合度のオリゴ糖を得ることができる。ま
た、加水分解するときに透析膜を使用すれば、より簡単
で効率的に高重合度のオリゴ糖を得ることができる。従
って、簡単に入手できるキチンから生理活性が高いオリ
ゴ糖が得られるので、医療等の研究にも大いに有用であ
る。
リゴ糖の製造方法でキチンを分解すれば、確実に生理活
性が高い高重合度のオリゴ糖を得ることができる。ま
た、加水分解するときに透析膜を使用すれば、より簡単
で効率的に高重合度のオリゴ糖を得ることができる。従
って、簡単に入手できるキチンから生理活性が高いオリ
ゴ糖が得られるので、医療等の研究にも大いに有用であ
る。
【図1】実施例1のグルコサミンオリゴ糖塩酸塩の分析
結果を表す図。
結果を表す図。
【図2】実施例1のN−アセチル化オリゴ糖の分析結果
を表す図。
を表す図。
【図3】実施例1のキチン分解物の各オリゴ糖の重量割
合を表す図。
合を表す図。
【図4】実施例2のグルコサミンオリゴ糖塩酸塩の分析
結果を表す図。
結果を表す図。
【図5】実施例2のN−アセチル化オリゴ糖の分析結果
を表す図。
を表す図。
【図6】実施例2のキチン分解物の各オリゴ糖の重量割
合を表す図。
合を表す図。
【図7】実施例3のグルコサミンオリゴ糖塩酸塩の分析
結果を表す図。
結果を表す図。
【図8】実施例3のN−アセチル化オリゴ糖の分析結果
を表す図。
を表す図。
【図9】実施例3のキチン分解物の各オリゴ糖の重量割
合を表す図。
合を表す図。
【図10】実施例4のグルコサミンオリゴ糖塩酸塩の分
析結果を表す図。
析結果を表す図。
【図11】実施例4のN−アセチル化オリゴ糖の分析結
果を表す図。
果を表す図。
【図12】実施例4のキチン分解物の各オリゴ糖の重量
割合を表す図。
割合を表す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 千葉 徹 神奈川県川崎市高津区坂戸100−1 信 越化学工業株式会社コーポレートリサー チセンター内 (72)発明者 渡辺 公綱 東京都渋谷区恵比寿南3−11−17−308 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12P 19/26
Claims (3)
- 【請求項1】 均一に部分脱アセチル化されたキチンを
キチナーゼにより加水分解して高重合度のグルコサミン
及びN−アセチルグルコサミンからなるヘテロオリゴ
糖、及びグルコサミンのホモオリゴ糖を得ることを特徴
とするオリゴ糖の製造方法。 - 【請求項2】 前記加水分解を透析膜の内部で行い、同
時に透析膜の外部に陽イオン交換樹脂を配置して透析を
行い、高重合度のグルコサミン及びN−アセチルグルコ
サミンからなるヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホ
モオリゴ糖を得ることを特徴とする請求項1に記載のオ
リゴ糖の製造方法。 - 【請求項3】 前記キチンは甲殻類、または糸状菌から
得られることを特徴とする請求項1に記載のオリゴ糖の
製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16184091A JP2810255B2 (ja) | 1991-07-02 | 1991-07-02 | オリゴ糖の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16184091A JP2810255B2 (ja) | 1991-07-02 | 1991-07-02 | オリゴ糖の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH057496A JPH057496A (ja) | 1993-01-19 |
JP2810255B2 true JP2810255B2 (ja) | 1998-10-15 |
Family
ID=15742938
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16184091A Expired - Fee Related JP2810255B2 (ja) | 1991-07-02 | 1991-07-02 | オリゴ糖の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2810255B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5998173A (en) * | 1996-02-20 | 1999-12-07 | The University Of Bristish Columbia | Process for producing N-acetyl-D-glucosamine |
JP4109989B2 (ja) * | 2000-12-01 | 2008-07-02 | 株式会社林原生物化学研究所 | エルソン−モルガン反応陽性物質の製造方法とその用途 |
KR100483847B1 (ko) * | 2002-07-11 | 2005-04-20 | 주식회사 건풍바이오 | 수족냉증 완화효과를 나타내는 키틴/키토산올리고당 |
US20050148546A1 (en) * | 2003-12-09 | 2005-07-07 | Grund Alan D. | Deacetylation of N-acetylglucosamine |
KR100735826B1 (ko) * | 2005-09-30 | 2007-07-06 | 주식회사 키토라이프 | 효소분해에 의한 n-아세틸-d-글루코사민의 제조방법 |
JP2012031107A (ja) * | 2010-07-30 | 2012-02-16 | Koyo Chemical Kk | ヘテロ二糖、キトビオース、及びジ‐n‐アセチルキトビオースの製造方法、並びにそれらの用途 |
CN103913532A (zh) * | 2014-04-14 | 2014-07-09 | 南京林业大学 | 一种利用离子交换色谱法测定n-乙酰氨基葡萄糖的方法 |
-
1991
- 1991-07-02 JP JP16184091A patent/JP2810255B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH057496A (ja) | 1993-01-19 |
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LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |