JP2001095595A - キトサンオリゴ糖の製造方法 - Google Patents
キトサンオリゴ糖の製造方法Info
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- chitosan oligosaccharide
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 効率よく容易にキトサンオリゴ糖が得られる
キトサンオリゴ糖の製造方法を提供する。 【解決手段】 しゃこやえび、かになどの甲殻類の外殻
から抽出したキチンをアルカリ処理したキトサンをpH
4〜5程度の200mM酢酸アンモニウム水溶液に溶解
し、1%キトサン水溶液とする。CNBr−活性化セフ
ァロースにトリコデルマリーゼイ(Trichoderma resse
i)が生成するセルラーゼのうちのセロビオヒドロラー
ゼI(cellobiohydrolase I)を固定化して固定化酵素
を調製する。固定化酵素10mlと、1%キトサン水溶
液90mlを反応槽内に投入し、液温55℃に保温しつ
つ回転数6rpmで4時間攪拌し、キトサンオリゴ糖を
分解生成する。生理特性の優れた6量体〜15量体の高
重合度のキトサンオリゴ糖を高収率で回収できる。水産
加工の際の廃棄物を有効利用でき、コストを低減でき
る。
キトサンオリゴ糖の製造方法を提供する。 【解決手段】 しゃこやえび、かになどの甲殻類の外殻
から抽出したキチンをアルカリ処理したキトサンをpH
4〜5程度の200mM酢酸アンモニウム水溶液に溶解
し、1%キトサン水溶液とする。CNBr−活性化セフ
ァロースにトリコデルマリーゼイ(Trichoderma resse
i)が生成するセルラーゼのうちのセロビオヒドロラー
ゼI(cellobiohydrolase I)を固定化して固定化酵素
を調製する。固定化酵素10mlと、1%キトサン水溶
液90mlを反応槽内に投入し、液温55℃に保温しつ
つ回転数6rpmで4時間攪拌し、キトサンオリゴ糖を
分解生成する。生理特性の優れた6量体〜15量体の高
重合度のキトサンオリゴ糖を高収率で回収できる。水産
加工の際の廃棄物を有効利用でき、コストを低減でき
る。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、キトサンオリゴ糖
を高収率で生成するキトサンオリゴ糖の製造方法に関す
る。
を高収率で生成するキトサンオリゴ糖の製造方法に関す
る。
【0002】
【従来の技術】近年、しゃこや甘えび、かになどの甲殻
類の水産加工品の増加に伴って、甲殻類の外殻が廃棄物
として増大しており、これら外殻の再資源化が検討され
てきている。
類の水産加工品の増加に伴って、甲殻類の外殻が廃棄物
として増大しており、これら外殻の再資源化が検討され
てきている。
【0003】ところで、しゃこや甘えび、かになどの外
殻の主成分としては、N−アセチルグルコサミンを構成
糖とし自然界に広く存在する天然のアミノ多糖であるキ
チンが主成分であることは広く知られている。そして、
キチンを脱アセチル化して精製されるキトサンは、抗菌
性、抗かび活性あるいはコレステロール吸収抑制作用な
どを備えた機能性食品素材として需要が高まってきてい
る。また、キトサンをさらに加水分解したキトサンオリ
ゴ糖は、高分子のキトサンに比して低粘性、低苦味性、
高水溶性などの利点を備えた食品素材として、その中で
も6量〜15量体の高重合度のキトサンオリゴ糖は免疫
賦活活性などの優れた生理活性を有することから注目さ
れてきている。
殻の主成分としては、N−アセチルグルコサミンを構成
糖とし自然界に広く存在する天然のアミノ多糖であるキ
チンが主成分であることは広く知られている。そして、
キチンを脱アセチル化して精製されるキトサンは、抗菌
性、抗かび活性あるいはコレステロール吸収抑制作用な
どを備えた機能性食品素材として需要が高まってきてい
る。また、キトサンをさらに加水分解したキトサンオリ
ゴ糖は、高分子のキトサンに比して低粘性、低苦味性、
高水溶性などの利点を備えた食品素材として、その中で
も6量〜15量体の高重合度のキトサンオリゴ糖は免疫
賦活活性などの優れた生理活性を有することから注目さ
れてきている。
【0004】そして、このキトサンオリゴ糖を製造する
方法としては、例えば熱濃塩酸などの酸を用いて加水分
解により低分子化して調製する化学法と、キトサンを加
水分解するキトサナーゼと呼ばれる分解酵素を用いて調
製する酵素法とが知られている。
方法としては、例えば熱濃塩酸などの酸を用いて加水分
解により低分子化して調製する化学法と、キトサンを加
水分解するキトサナーゼと呼ばれる分解酵素を用いて調
製する酵素法とが知られている。
【0005】しかしながら、化学法では、濃塩酸などの
酸を用いるため、製造設備に耐食性の機能を持たせた構
造とする必要があり、装置構成が複雑で装置コストも増
大する。また、多量に使用する酸を中和する処理が必要
であるとともに廃液処理も必要となり、製造性の向上お
よび製造コストの低減が図れない。さらには、反応の制
御が難しく、低重合度のキトサンオリゴ糖が主体になっ
て高重合度産物が得られにくく、高重合度のキトサンオ
リゴ糖の収率の向上が図れない。
酸を用いるため、製造設備に耐食性の機能を持たせた構
造とする必要があり、装置構成が複雑で装置コストも増
大する。また、多量に使用する酸を中和する処理が必要
であるとともに廃液処理も必要となり、製造性の向上お
よび製造コストの低減が図れない。さらには、反応の制
御が難しく、低重合度のキトサンオリゴ糖が主体になっ
て高重合度産物が得られにくく、高重合度のキトサンオ
リゴ糖の収率の向上が図れない。
【0006】一方、例えば特公平3−139878号公
報に記載のような従来のキトサナーゼと呼ばれるキトサ
ン分解酵素を用いた酵素法では、キトサンオリゴ糖は得
られるが、重合度が1〜5量体の低重合度の比率が大き
く、キトサンオリゴ糖のうち特に種々の生理活性の高い
高重合度のキトサンオリゴ糖は得られにくく、高重合度
のキトサンオリゴ糖の製造効率の向上が図れない。さら
には、従来のキトサナーゼとして知られている酵素の価
格が高く、製造コストの低減が図れない。
報に記載のような従来のキトサナーゼと呼ばれるキトサ
ン分解酵素を用いた酵素法では、キトサンオリゴ糖は得
られるが、重合度が1〜5量体の低重合度の比率が大き
く、キトサンオリゴ糖のうち特に種々の生理活性の高い
高重合度のキトサンオリゴ糖は得られにくく、高重合度
のキトサンオリゴ糖の製造効率の向上が図れない。さら
には、従来のキトサナーゼとして知られている酵素の価
格が高く、製造コストの低減が図れない。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】上述したように、キト
サンオリゴ糖を化学法で製造する従来の構成では、酸を
用いるため、製造設備に耐食性の機能を持たせた構造と
する必要があり、装置構成が複雑で装置コストも増大す
るとともに、多量に使用する酸を中和する処理が必要で
廃液処理も必要となり、製造性の向上および製造コスト
の低減が図れない。さらには、反応の制御が難しく高重
合度のキトサンオリゴ糖の収率の向上が図れない問題が
ある。
サンオリゴ糖を化学法で製造する従来の構成では、酸を
用いるため、製造設備に耐食性の機能を持たせた構造と
する必要があり、装置構成が複雑で装置コストも増大す
るとともに、多量に使用する酸を中和する処理が必要で
廃液処理も必要となり、製造性の向上および製造コスト
の低減が図れない。さらには、反応の制御が難しく高重
合度のキトサンオリゴ糖の収率の向上が図れない問題が
ある。
【0008】また、特公平3−139878号公報に記
載のようなキトサンオリゴ糖をキトサナーゼなどの酵素
を用いた酵素法で製造する従来の構成でも、重合度が5
量体以下の低重合度のキトサンオリゴ糖の比率が大き
く、キトサンオリゴ糖のうち特に種々の生理活性の高い
高重合度のキトサンオリゴ糖の製造効率の向上が図れな
いとともに、従来のキトサナーゼとして知られている酵
素の価格が高く、製造コストの低減が図れない問題があ
る。
載のようなキトサンオリゴ糖をキトサナーゼなどの酵素
を用いた酵素法で製造する従来の構成でも、重合度が5
量体以下の低重合度のキトサンオリゴ糖の比率が大き
く、キトサンオリゴ糖のうち特に種々の生理活性の高い
高重合度のキトサンオリゴ糖の製造効率の向上が図れな
いとともに、従来のキトサナーゼとして知られている酵
素の価格が高く、製造コストの低減が図れない問題があ
る。
【0009】本発明は、このような問題点に鑑みなされ
たもので、効率よく容易にキトサンオリゴ糖が得られる
キトサンオリゴ糖の製造方法を提供することを目的とす
る。
たもので、効率よく容易にキトサンオリゴ糖が得られる
キトサンオリゴ糖の製造方法を提供することを目的とす
る。
【0010】
【課題を解決するための手段】請求項1記載のキトサン
オリゴ糖の製造方法は、キトサンを不完全菌類のトリコ
デルマリーゼイ(Trichoderma ressei)が生成するセル
ラーゼにより分解するものである。
オリゴ糖の製造方法は、キトサンを不完全菌類のトリコ
デルマリーゼイ(Trichoderma ressei)が生成するセル
ラーゼにより分解するものである。
【0011】そして、セルロースの分解酵素として広く
利用されている安価な不完全菌類のトリコデルマリーゼ
イ(Trichoderma ressei)が生成するセルラーゼを用い
てキトサンを分解することにより、生理活性の優れた6
量体以上の高重合度のキトサンオリゴ糖が高収率で生成
され、コストが低減する。
利用されている安価な不完全菌類のトリコデルマリーゼ
イ(Trichoderma ressei)が生成するセルラーゼを用い
てキトサンを分解することにより、生理活性の優れた6
量体以上の高重合度のキトサンオリゴ糖が高収率で生成
され、コストが低減する。
【0012】請求項2記載のキトサンオリゴ糖の製造方
法は、キトサンをセロビオヒドロラーゼI(cellobiohy
drolase I)により分解するものである。
法は、キトサンをセロビオヒドロラーゼI(cellobiohy
drolase I)により分解するものである。
【0013】そして、セロビオヒドロラーゼI(cellob
iohydrolase I)を用いてキトサンを分解するので、効
率よく容易に6量体以上の高重合度のキトサンオリゴ糖
が得られる。
iohydrolase I)を用いてキトサンを分解するので、効
率よく容易に6量体以上の高重合度のキトサンオリゴ糖
が得られる。
【0014】請求項3記載のキトサンオリゴ糖の製造方
法は、請求項1または2記載のキトサンオリゴ糖の製造
方法において、キトサンを酢酸アンモニウム水溶液に溶
解した後にセルラーゼで分解するものである。
法は、請求項1または2記載のキトサンオリゴ糖の製造
方法において、キトサンを酢酸アンモニウム水溶液に溶
解した後にセルラーゼで分解するものである。
【0015】そして、キトサンを酢酸アンモニウム水溶
液に溶解した後にセルラーゼで分解することにより、後
工程で必要になる高重合度のキトサンオリゴ糖の分離、
生成が容易になる。
液に溶解した後にセルラーゼで分解することにより、後
工程で必要になる高重合度のキトサンオリゴ糖の分離、
生成が容易になる。
【0016】請求項4記載のキトサンオリゴ糖の製造方
法は、請求項1ないし3いずれか一記載のキトサンオリ
ゴ糖の製造方法において、キトサンを溶解した水溶液の
水温を40℃以上55℃以下に保温してセルラーゼで分
解するものである。
法は、請求項1ないし3いずれか一記載のキトサンオリ
ゴ糖の製造方法において、キトサンを溶解した水溶液の
水温を40℃以上55℃以下に保温してセルラーゼで分
解するものである。
【0017】そして、水温を40℃以上55℃以下に保
温することにより、セルラーゼによるキトサンの分解速
度が増大し、効率よく高重合度のキトサンオリゴ糖が高
収率で得られる。
温することにより、セルラーゼによるキトサンの分解速
度が増大し、効率よく高重合度のキトサンオリゴ糖が高
収率で得られる。
【0018】請求項5記載のキトサンオリゴ糖の製造方
法は、請求項1ないし4いずれか一記載のキトサンオリ
ゴ糖の製造方法において、甲殻類の外殻から抽出したキ
チンをアルカリ処理して得たキトサンを用いるものであ
る。
法は、請求項1ないし4いずれか一記載のキトサンオリ
ゴ糖の製造方法において、甲殻類の外殻から抽出したキ
チンをアルカリ処理して得たキトサンを用いるものであ
る。
【0019】そして、キトサンとして甲殻類の外殻から
抽出したキチンをアルカリ処理したものを用いるため、
例えば水産加工の際に生じる廃棄物となる外殻の有効利
用が図れ、産業廃棄物の低減およびキトサンオリゴ糖の
コストの低減が図れる。原料として、特殊なもの、例え
ばキトサンとして菌類の細胞壁などを使う必要はない。
抽出したキチンをアルカリ処理したものを用いるため、
例えば水産加工の際に生じる廃棄物となる外殻の有効利
用が図れ、産業廃棄物の低減およびキトサンオリゴ糖の
コストの低減が図れる。原料として、特殊なもの、例え
ばキトサンとして菌類の細胞壁などを使う必要はない。
【0020】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態におけ
るキトサンオリゴ糖の製造工程を説明する。
るキトサンオリゴ糖の製造工程を説明する。
【0021】あらかじめ、しゃこや甘えび、かになどの
甲殻類の外殻を脱蛋白、脱灰処理、例えば5%苛性ソー
ダで処理した後に5%塩酸でカルシウムを分解して抽出
したキチンを脱アセチル化処理、例えば80℃、40℃
苛性ソーダで処理して粉砕し粉末状のキトサンを得る。
甲殻類の外殻を脱蛋白、脱灰処理、例えば5%苛性ソー
ダで処理した後に5%塩酸でカルシウムを分解して抽出
したキチンを脱アセチル化処理、例えば80℃、40℃
苛性ソーダで処理して粉砕し粉末状のキトサンを得る。
【0022】そして、得られた粉末のキトサンを酸性の
水溶液、例えばpHが4〜5程度に調製された酢酸アン
モニウム水溶液や酢酸ナトリウム水溶液などに溶解して
キトサン水溶液を調製する。なお、キトサンは、酸性水
溶液に可溶で中性からアルカリ性水溶液では溶解せず、
また濃度を増大させていくと粘調性が増加して取扱が困
難となるので、好ましくは0.5%以上2%以下、より
好ましくは0.5%以上1%以下の濃度となるようにキ
トサン水溶液を調製する。また、後述する不完全菌類の
トリコデルマリーゼイ(Trichoderma ressei)が生成す
るセルラーゼのうちのセロビオヒドロラーゼI(cellob
iohydrolase I)は、pH4〜5の酸性領域で安定であ
るので、キトサンを酢酸ナトリウムや酢酸アンモニウム
水溶液を用いてpH4〜5程度のキトサン水溶液となる
ように調製することが好ましい。ここで、酢酸アンモニ
ウムや酢酸ナトリウムを用いるのは、水溶液のpHを4
〜5に調製すること、水溶液から高重合度のキトサンオ
リゴ糖を分離および精製する操作が比較的容易になるこ
となどによるためである。
水溶液、例えばpHが4〜5程度に調製された酢酸アン
モニウム水溶液や酢酸ナトリウム水溶液などに溶解して
キトサン水溶液を調製する。なお、キトサンは、酸性水
溶液に可溶で中性からアルカリ性水溶液では溶解せず、
また濃度を増大させていくと粘調性が増加して取扱が困
難となるので、好ましくは0.5%以上2%以下、より
好ましくは0.5%以上1%以下の濃度となるようにキ
トサン水溶液を調製する。また、後述する不完全菌類の
トリコデルマリーゼイ(Trichoderma ressei)が生成す
るセルラーゼのうちのセロビオヒドロラーゼI(cellob
iohydrolase I)は、pH4〜5の酸性領域で安定であ
るので、キトサンを酢酸ナトリウムや酢酸アンモニウム
水溶液を用いてpH4〜5程度のキトサン水溶液となる
ように調製することが好ましい。ここで、酢酸アンモニ
ウムや酢酸ナトリウムを用いるのは、水溶液のpHを4
〜5に調製すること、水溶液から高重合度のキトサンオ
リゴ糖を分離および精製する操作が比較的容易になるこ
となどによるためである。
【0023】また、例えば固定化酵素、すなわち担体と
なるCNBr(臭化シアン)−活性化セファロースに、
不完全菌類のトリコデルマリーゼイが生成するセルラー
ゼのうちのセロビオヒドロラーゼIなどを固定化したも
のを反応槽内に充填しておく。
なるCNBr(臭化シアン)−活性化セファロースに、
不完全菌類のトリコデルマリーゼイが生成するセルラー
ゼのうちのセロビオヒドロラーゼIなどを固定化したも
のを反応槽内に充填しておく。
【0024】そして、この固定化酵素を充填した反応槽
内に、あらかじめ調製したキトサン水溶液を、キトサン
とセロビオヒドロラーゼIとの比率が約5:1〜約2
0:1、好ましくは約5:1〜約10:1程度となるよ
うに流入する。ここで、セロビオヒドロラーゼIの比率
が約5:1より多くなっても生成されるキトサンオリゴ
糖の生成量が多くならず、セロビオヒドロラーゼIの使
用量の増大に伴って、コストが増大する。また、約2
0:1より少なくなると実用的なレベルでは反応が進ま
ず、キトサンオリゴ糖を十分に生成できなくなる。この
ためキトサンとセロビオヒドロラーゼIとの比率を約
5:1〜約20:1にする。なお、セルラーゼとキトサ
ンとの接触方法としては、固定化酵素を用いる他に、酵
素を溶解した水溶液にキトサンを溶解させたり、酵素を
溶解した水溶液とキトサン水溶液とを混合するなどの方
法も取り得る。
内に、あらかじめ調製したキトサン水溶液を、キトサン
とセロビオヒドロラーゼIとの比率が約5:1〜約2
0:1、好ましくは約5:1〜約10:1程度となるよ
うに流入する。ここで、セロビオヒドロラーゼIの比率
が約5:1より多くなっても生成されるキトサンオリゴ
糖の生成量が多くならず、セロビオヒドロラーゼIの使
用量の増大に伴って、コストが増大する。また、約2
0:1より少なくなると実用的なレベルでは反応が進ま
ず、キトサンオリゴ糖を十分に生成できなくなる。この
ためキトサンとセロビオヒドロラーゼIとの比率を約
5:1〜約20:1にする。なお、セルラーゼとキトサ
ンとの接触方法としては、固定化酵素を用いる他に、酵
素を溶解した水溶液にキトサンを溶解させたり、酵素を
溶解した水溶液とキトサン水溶液とを混合するなどの方
法も取り得る。
【0025】この後、例えば反応槽自体を振とうまたは
回転させて適宜攪拌しつつ、水温を約40℃以上約55
℃、好ましくは50℃以上55℃以下に保温して所定時
間、例えば4時間程度反応させ、高重合度のキトサンオ
リゴ糖、すなわち重合度が6量体以上、具体的には6量
体以上15量体程度を主要とするキトサンオリゴ糖を得
る。なお、セロビオヒドロラーゼIは、pH4〜5で6
0℃まで反応温度を上げても反応速度は速くなり、得ら
れるキトサンオリゴ糖の組成に変化は認められないが、
60℃では酵素が比較的早期に失活するので、反応温度
を約40℃〜約55℃、好ましくは約50℃〜約55℃
に保温することが好ましい。
回転させて適宜攪拌しつつ、水温を約40℃以上約55
℃、好ましくは50℃以上55℃以下に保温して所定時
間、例えば4時間程度反応させ、高重合度のキトサンオ
リゴ糖、すなわち重合度が6量体以上、具体的には6量
体以上15量体程度を主要とするキトサンオリゴ糖を得
る。なお、セロビオヒドロラーゼIは、pH4〜5で6
0℃まで反応温度を上げても反応速度は速くなり、得ら
れるキトサンオリゴ糖の組成に変化は認められないが、
60℃では酵素が比較的早期に失活するので、反応温度
を約40℃〜約55℃、好ましくは約50℃〜約55℃
に保温することが好ましい。
【0026】次に、上記実施の形態の動作を説明する。
【0027】まず、例えばCNBr(臭化シアン)−活
性化セファロースに、不完全菌類のトリコデルマリーゼ
イが生成するセロビオヒドロラーゼIを含むセルラー
ゼ、約100mgを固定化した固定化酵素10mlと、
200mM酢酸アンモニウム水溶液にキトサンの白色粉
末を加えて調製した1%キトサン水溶液90mlを反応
槽内に投入し、液温55℃に保温しつつ回転数6rpm
で4時間攪拌しつつ反応させ、キトサンオリゴ糖を分解
生成する。
性化セファロースに、不完全菌類のトリコデルマリーゼ
イが生成するセロビオヒドロラーゼIを含むセルラー
ゼ、約100mgを固定化した固定化酵素10mlと、
200mM酢酸アンモニウム水溶液にキトサンの白色粉
末を加えて調製した1%キトサン水溶液90mlを反応
槽内に投入し、液温55℃に保温しつつ回転数6rpm
で4時間攪拌しつつ反応させ、キトサンオリゴ糖を分解
生成する。
【0028】そして、反応終了後、反応槽内の溶液を高
速液体クロマトグラフィを用いて分析した結果、6量体
〜15量体のキトサンオリゴ糖は全体の約40%で0.
36gの高い収率となった。
速液体クロマトグラフィを用いて分析した結果、6量体
〜15量体のキトサンオリゴ糖は全体の約40%で0.
36gの高い収率となった。
【0029】次に、上記実施の形態の作用を説明する。
【0030】まず、各種酵素によるキトサンオリゴ糖の
生成状況について実験した。
生成状況について実験した。
【0031】なお、対象の酵素としては、セルロース分
解酵素であるトリコデルマリーゼイ由来のセルラーゼ
(SIGMA社製(試料1)、および、Worthington Bi
ochemical Corporation 社製(試料2))、トリコデル
マビリディ(Trichoderma viride)由来のセルラーゼ
(SIGMA社製(試料3)、生化学工業株式会社製
(試料4)、和光純薬工業株式会社製(試料5)、およ
び、株式会社天野製薬社製(試料6))、キトサン分解
酵素であるストレプトミセスグリセウス(Streptomyces
griseus)由来のキトサナーゼ(SIGMA社製(試料
7))、バチルス種(Bacillus sp.)PI−7S由来の
キトサナーゼ(生化学工業株式会社製(試料8))、キ
チン分解酵素であるストレプトミセスグリセウス(Stre
ptomyces griseus)由来のキチナーゼ(SIGMA社製
(試料9))、および、セラティアマルセシェンス(Se
rratia marcescens )由来のキチナーゼ(SIGMA社
製(試料10))を用いた。
解酵素であるトリコデルマリーゼイ由来のセルラーゼ
(SIGMA社製(試料1)、および、Worthington Bi
ochemical Corporation 社製(試料2))、トリコデル
マビリディ(Trichoderma viride)由来のセルラーゼ
(SIGMA社製(試料3)、生化学工業株式会社製
(試料4)、和光純薬工業株式会社製(試料5)、およ
び、株式会社天野製薬社製(試料6))、キトサン分解
酵素であるストレプトミセスグリセウス(Streptomyces
griseus)由来のキトサナーゼ(SIGMA社製(試料
7))、バチルス種(Bacillus sp.)PI−7S由来の
キトサナーゼ(生化学工業株式会社製(試料8))、キ
チン分解酵素であるストレプトミセスグリセウス(Stre
ptomyces griseus)由来のキチナーゼ(SIGMA社製
(試料9))、および、セラティアマルセシェンス(Se
rratia marcescens )由来のキチナーゼ(SIGMA社
製(試料10))を用いた。
【0032】また、実験方法としては、上記各酵素をD
Cプロテインアッセイ(BioRad社製のアッセイキ
ット)によって検量して1mg/mlの酵素溶液を調製
する。そして、しゃこの外殻を脱蛋白、脱灰処理して抽
出したキチンを、苛性ソーダを用いて脱アセチル化処理
し、平均分子量が約20万で98%脱アセチル化してキ
トサンを得た。このキトサンをpH4.5の酢酸アンモ
ニウム水溶液に溶解して0.1%キトサン水溶液を調製
する。そして、酵素溶液および0.1%キトサン水溶液
とを1:9で混合し、37℃で24時間反応させる。こ
の後、反応後の分解生成物をゲル濾過カラム(ファルマ
シア社製 商品名:Superdex Peptide HR10/30)で分離
し、市販の標準試薬と比較して特定した。その結果を図
1に示す。なお、ゲル濾過カラムでは、高分子の分解生
成物ほど速く溶出し、溶出時間の早い時期にピークを生
じる。そして、標準試薬である6量体のキトサンオリゴ
糖(生化学工業株式会社製)の溶出時間に基づいて生成
物を特定した。
Cプロテインアッセイ(BioRad社製のアッセイキ
ット)によって検量して1mg/mlの酵素溶液を調製
する。そして、しゃこの外殻を脱蛋白、脱灰処理して抽
出したキチンを、苛性ソーダを用いて脱アセチル化処理
し、平均分子量が約20万で98%脱アセチル化してキ
トサンを得た。このキトサンをpH4.5の酢酸アンモ
ニウム水溶液に溶解して0.1%キトサン水溶液を調製
する。そして、酵素溶液および0.1%キトサン水溶液
とを1:9で混合し、37℃で24時間反応させる。こ
の後、反応後の分解生成物をゲル濾過カラム(ファルマ
シア社製 商品名:Superdex Peptide HR10/30)で分離
し、市販の標準試薬と比較して特定した。その結果を図
1に示す。なお、ゲル濾過カラムでは、高分子の分解生
成物ほど速く溶出し、溶出時間の早い時期にピークを生
じる。そして、標準試薬である6量体のキトサンオリゴ
糖(生化学工業株式会社製)の溶出時間に基づいて生成
物を特定した。
【0033】この図1に示す結果から、キトサナーゼの
他にセルラーゼやキチナーゼも高分子のキトサンを分解
してキトサンオリゴ糖を生成することが分かるが、重合
度が6量体〜15量体の特に生理特性の優れた高重合度
のキトサンオリゴ糖は、試料1ないし試料3および試料
5の4つである。そして、キトサナーゼとして市販され
ている試料7および試料8は5量体以下の比較的に低重
合度のキトサンオリゴ糖の生成比率が高く、重合度が6
量体〜15量体の高重合度のキトサンオリゴ糖はあまり
得られない。また、同じセルラーゼでも試料4および試
料6では、反応が進んでおらず、キトサンオリゴ糖はあ
まり得られないとともに、未分解のキトサンが残ってお
り、キトサンの分解効率が低いことがわかる。さらに、
キチナーゼの試料10も同様に、キトサンの分解効率が
低いことがわかる。
他にセルラーゼやキチナーゼも高分子のキトサンを分解
してキトサンオリゴ糖を生成することが分かるが、重合
度が6量体〜15量体の特に生理特性の優れた高重合度
のキトサンオリゴ糖は、試料1ないし試料3および試料
5の4つである。そして、キトサナーゼとして市販され
ている試料7および試料8は5量体以下の比較的に低重
合度のキトサンオリゴ糖の生成比率が高く、重合度が6
量体〜15量体の高重合度のキトサンオリゴ糖はあまり
得られない。また、同じセルラーゼでも試料4および試
料6では、反応が進んでおらず、キトサンオリゴ糖はあ
まり得られないとともに、未分解のキトサンが残ってお
り、キトサンの分解効率が低いことがわかる。さらに、
キチナーゼの試料10も同様に、キトサンの分解効率が
低いことがわかる。
【0034】そして、試料1および試料2のトリコデル
マリーゼイ由来のセルラーゼは、比活性が高く、6量体
〜15量体の比較的に高重合度のキトサンオリゴ糖の生
成比率が高く、かつ、セルロース分解酵素として広く流
通されて比較的に安価であることから、キトサンを分解
して所望の生理活性の高い6量体〜15量体の比較的に
高重合度のキトサンオリゴ糖を生成させるには、トリコ
デルマリーゼイ由来のセルラーゼを用いることが好まし
い。
マリーゼイ由来のセルラーゼは、比活性が高く、6量体
〜15量体の比較的に高重合度のキトサンオリゴ糖の生
成比率が高く、かつ、セルロース分解酵素として広く流
通されて比較的に安価であることから、キトサンを分解
して所望の生理活性の高い6量体〜15量体の比較的に
高重合度のキトサンオリゴ糖を生成させるには、トリコ
デルマリーゼイ由来のセルラーゼを用いることが好まし
い。
【0035】次に、トリコデルマリーゼイ由来のセルラ
ーゼによるキトサン分解状況について実験した。
ーゼによるキトサン分解状況について実験した。
【0036】なお、上記実験のしゃこから得たキトサン
を用いて1%キトサン水溶液を同様に調製するととも
に、上記実験の試料1のトリコデルマリーゼイ由来のセ
ルラーゼを用いて1%酵素溶液を調製したものを用い、
1%キトサン水溶液と1%酵素溶液とを9:1の比率で
混合し、約55℃に保温した状態で所定時間反応させ、
同様に生成物を特定した。
を用いて1%キトサン水溶液を同様に調製するととも
に、上記実験の試料1のトリコデルマリーゼイ由来のセ
ルラーゼを用いて1%酵素溶液を調製したものを用い、
1%キトサン水溶液と1%酵素溶液とを9:1の比率で
混合し、約55℃に保温した状態で所定時間反応させ、
同様に生成物を特定した。
【0037】その結果、約1時間半程度の反応により、
6量体〜15量体のキトサンオリゴ糖が50%程度生成
するが、より長時間で反応させると徐々に6量体〜15
量体のキトサンオリゴ糖の量が減少する傾向が確認でき
た。すなわち、6量体〜15量体のキトサンオリゴ糖が
さらに分解されたものと考えられる。
6量体〜15量体のキトサンオリゴ糖が50%程度生成
するが、より長時間で反応させると徐々に6量体〜15
量体のキトサンオリゴ糖の量が減少する傾向が確認でき
た。すなわち、6量体〜15量体のキトサンオリゴ糖が
さらに分解されたものと考えられる。
【0038】そこで、トリコデルマリーゼイ由来のセル
ラーゼの性状について実験した。
ラーゼの性状について実験した。
【0039】トリコデルマリーゼイが生成するセルラー
ゼとして、2つのセロビオヒドロラーゼ(セロビオヒド
ロラーゼI(CBHI),II(CBHII))、3つのエ
ンドグルカナーゼ(endoglucanase I(EGI),III
(EGIII ),V(EGV))、β−グルコシダーゼ
(β−glucosidase)が知られている。
ゼとして、2つのセロビオヒドロラーゼ(セロビオヒド
ロラーゼI(CBHI),II(CBHII))、3つのエ
ンドグルカナーゼ(endoglucanase I(EGI),III
(EGIII ),V(EGV))、β−グルコシダーゼ
(β−glucosidase)が知られている。
【0040】そこで、上記実験に用いた試料1のトリコ
デルマリーゼイ由来のセルラーゼを10mM酢酸アンモ
ニウム水溶液に溶解し、12000rpmで5分間遠心
分離し、0.45μmのフィルタを用いて濾過した後に
陰イオン交換樹脂(ファルマシア社製 Q-Sepharose )
カラムで処理し、10mM〜500mMの酢酸アンモニ
ウムの緩衝液濃度勾配により溶出させた。
デルマリーゼイ由来のセルラーゼを10mM酢酸アンモ
ニウム水溶液に溶解し、12000rpmで5分間遠心
分離し、0.45μmのフィルタを用いて濾過した後に
陰イオン交換樹脂(ファルマシア社製 Q-Sepharose )
カラムで処理し、10mM〜500mMの酢酸アンモニ
ウムの緩衝液濃度勾配により溶出させた。
【0041】その結果、セルロースの分解能が強くキト
サンオリゴ糖を生成する能力が劣る画分のセルラーゼ活
性画分と、セルロースの分解能は劣るがキトサンオリゴ
糖を生成する能力が強いキトサナーゼ活性画分とを分離
した。
サンオリゴ糖を生成する能力が劣る画分のセルラーゼ活
性画分と、セルロースの分解能は劣るがキトサンオリゴ
糖を生成する能力が強いキトサナーゼ活性画分とを分離
した。
【0042】なお、この分離したキトサナーゼ活性画分
を凍結乾燥し、キトサナーゼ粉末0.35mgを、0.
13M Tris- HCl(pH7.6)(+6Mグアニジ
ン塩酸、0.01%EDTA)に溶解し、50mg/m
lDTTを5μl加えて55℃で3時間還元処理する。
さらに、4−ビニルピリジン1μlを加えて遮光下、室
温で90分放置して還元ピリジルエチル化し、10mM
重炭酸アンモニウムで透析する。そして、この還元ピリ
ジルエチル化した酵素溶液に1mg/mlリジルエンド
ペプチダーゼ(和光純薬工業株式会社製)(1:100
w/w)を加えて37℃で24時間反応させてペプチド
に分解し、20%トリクロロ酢酸を終濃度10%となる
ように加え、攪拌の後に15000rpmで10分間遠
心分離する操作を2回繰り返して上澄みと沈殿に遠心分
離した。
を凍結乾燥し、キトサナーゼ粉末0.35mgを、0.
13M Tris- HCl(pH7.6)(+6Mグアニジ
ン塩酸、0.01%EDTA)に溶解し、50mg/m
lDTTを5μl加えて55℃で3時間還元処理する。
さらに、4−ビニルピリジン1μlを加えて遮光下、室
温で90分放置して還元ピリジルエチル化し、10mM
重炭酸アンモニウムで透析する。そして、この還元ピリ
ジルエチル化した酵素溶液に1mg/mlリジルエンド
ペプチダーゼ(和光純薬工業株式会社製)(1:100
w/w)を加えて37℃で24時間反応させてペプチド
に分解し、20%トリクロロ酢酸を終濃度10%となる
ように加え、攪拌の後に15000rpmで10分間遠
心分離する操作を2回繰り返して上澄みと沈殿に遠心分
離した。
【0043】そして、上澄み分は、逆相クロマトグラフ
ィのカラム(ナカライテスク社製商品名:Cosmosil 5
C18AR)で直接分離し、得られたペプチドのN末端
アミノ酸配列をシークエンサ(島津製作所社製 商品
名:PSQ−1)により分析した。また、沈殿物は、ア
セトンで洗浄し、少量の尿素溶液で溶解し、SDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後にゲルを蒸留水とバッ
ファ(25mMトリス、192mMグリシン、20%メ
タノール)に浸し、同様に蒸留水およびバッファで処理
してメンブレン(ATTO社製 商品名:クリアプロッ
ト・P膜)と重ねて、10Vで60分電圧を印加してブ
ロッティングしシークエンシングした。
ィのカラム(ナカライテスク社製商品名:Cosmosil 5
C18AR)で直接分離し、得られたペプチドのN末端
アミノ酸配列をシークエンサ(島津製作所社製 商品
名:PSQ−1)により分析した。また、沈殿物は、ア
セトンで洗浄し、少量の尿素溶液で溶解し、SDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後にゲルを蒸留水とバッ
ファ(25mMトリス、192mMグリシン、20%メ
タノール)に浸し、同様に蒸留水およびバッファで処理
してメンブレン(ATTO社製 商品名:クリアプロッ
ト・P膜)と重ねて、10Vで60分電圧を印加してブ
ロッティングしシークエンシングした。
【0044】この結果、精製したキトサナーゼ活性画分
のペプチドの配列は、セロビオヒドロラーゼIと同定で
きた。
のペプチドの配列は、セロビオヒドロラーゼIと同定で
きた。
【0045】次に、精製したキトサナーゼ活性画分とセ
ルラーゼ活性画分との基質特異性について実験した。
ルラーゼ活性画分との基質特異性について実験した。
【0046】なお、基質としては、キトサン(平均分子
量;約20万、脱アセチル化;98%)、実験で得られ
た高重合度のキトサンオリゴ糖(6量体〜15量体)、
6量体キトサンオリゴ糖(GlcN)6 、6量体キチン
オリゴ糖(GlcNAc)6を用いた。
量;約20万、脱アセチル化;98%)、実験で得られ
た高重合度のキトサンオリゴ糖(6量体〜15量体)、
6量体キトサンオリゴ糖(GlcN)6 、6量体キチン
オリゴ糖(GlcNAc)6を用いた。
【0047】そして、キトサナーゼ活性画分およびセル
ラーゼ活性画分をそれぞれ酢酸アンモニウム水溶液に溶
解して酵素溶液を調製し、基質から、0.1%キトサン
水溶液、0.1%高重合度のキトサンオリゴ糖水溶液、
0.1%6量体キトサンオリゴ糖水溶液、および、0.
1%6量体キチンオリゴ糖水溶液に調製した。これらを
1:9で混合し、37℃で72時間反応させ、分解生成
物を得た後、高速液体クラマトグラフィを用いて特定し
た。その結果を図2ないし図5に示す。なお、図2は基
質にキトサンを用いたもの、図3は基質に高重合度のキ
トサンオリゴ糖を用いたもの、図4は基質に6量体のキ
トサンオリゴ糖を用いたもの、図5は基質に6量体のキ
チンオリゴ糖を用いたものを示す。
ラーゼ活性画分をそれぞれ酢酸アンモニウム水溶液に溶
解して酵素溶液を調製し、基質から、0.1%キトサン
水溶液、0.1%高重合度のキトサンオリゴ糖水溶液、
0.1%6量体キトサンオリゴ糖水溶液、および、0.
1%6量体キチンオリゴ糖水溶液に調製した。これらを
1:9で混合し、37℃で72時間反応させ、分解生成
物を得た後、高速液体クラマトグラフィを用いて特定し
た。その結果を図2ないし図5に示す。なお、図2は基
質にキトサンを用いたもの、図3は基質に高重合度のキ
トサンオリゴ糖を用いたもの、図4は基質に6量体のキ
トサンオリゴ糖を用いたもの、図5は基質に6量体のキ
チンオリゴ糖を用いたものを示す。
【0048】この図2に示す結果から、キトサンを基質
とした場合、キトサナーゼ活性画分では効率的に高重合
度オリゴ糖が生成していることがわかる。また、セルラ
ーゼ活性画分では、あまり反応は進んでおらず、効率的
に高重合度オリゴ糖が生成されていないことが分かる。
とした場合、キトサナーゼ活性画分では効率的に高重合
度オリゴ糖が生成していることがわかる。また、セルラ
ーゼ活性画分では、あまり反応は進んでおらず、効率的
に高重合度オリゴ糖が生成されていないことが分かる。
【0049】そして、図3に示す結果から、高重合度の
キトサンオリゴ糖を基質とした場合には、セルラーゼ活
性画分では6量体以下の比較的に低重合度のキトサンオ
リゴ糖が生成されているが、キトサナーゼ活性画分では
低重合度のキトサンオリゴ糖は生成しておらず、反応前
のキトサンオリゴ糖に近似したピークパターンを示して
いる。このことから、キトサナーゼ活性画分は高重合度
のキトサンオリゴ糖を分解しない反応特異性を有するこ
とがわかる。
キトサンオリゴ糖を基質とした場合には、セルラーゼ活
性画分では6量体以下の比較的に低重合度のキトサンオ
リゴ糖が生成されているが、キトサナーゼ活性画分では
低重合度のキトサンオリゴ糖は生成しておらず、反応前
のキトサンオリゴ糖に近似したピークパターンを示して
いる。このことから、キトサナーゼ活性画分は高重合度
のキトサンオリゴ糖を分解しない反応特異性を有するこ
とがわかる。
【0050】また、図4および図5に示す結果から、セ
ルラーゼ活性画分では6量体のキトサンオリゴ糖を基質
とした場合に2量体のオリゴ糖、4量体のオリゴ糖を含
む低重合度のオリゴ糖を生成し、6量体のキチンオリゴ
糖を基質とした場合には単量体のキチンオリゴ糖を生成
しており、セルラーゼ活性画分はさらにキトサンオリゴ
糖を低重合度に分解してしまうことがわかる。一方、キ
トサナーゼ活性画分では反応前の6量体のキトサンオリ
ゴ糖および6量体のキチンオリゴ糖のピークパターンと
ほぼ同一形状のピークパターンを示しており、6量体の
キトサンオリゴ糖および6量体のキチンオリゴ糖を全く
分解しない反応特異性を有することがわかる。
ルラーゼ活性画分では6量体のキトサンオリゴ糖を基質
とした場合に2量体のオリゴ糖、4量体のオリゴ糖を含
む低重合度のオリゴ糖を生成し、6量体のキチンオリゴ
糖を基質とした場合には単量体のキチンオリゴ糖を生成
しており、セルラーゼ活性画分はさらにキトサンオリゴ
糖を低重合度に分解してしまうことがわかる。一方、キ
トサナーゼ活性画分では反応前の6量体のキトサンオリ
ゴ糖および6量体のキチンオリゴ糖のピークパターンと
ほぼ同一形状のピークパターンを示しており、6量体の
キトサンオリゴ糖および6量体のキチンオリゴ糖を全く
分解しない反応特異性を有することがわかる。
【0051】このことから、キトサナーゼ活性画分であ
るセロビオヒドロラーゼIは、高分子のキトサンは効率
的に高重合度のキトサンオリゴ糖を生成するが、実験で
得られた高重合度のキトサンオリゴ糖、6量体のキトサ
ンオリゴ糖および6量体のキチンオリゴ糖は全く分解せ
ず、キトサンを高収率で生理特性の優れた比較的高重合
度のキトサンオリゴ糖に分解生成できることがわかる。
るセロビオヒドロラーゼIは、高分子のキトサンは効率
的に高重合度のキトサンオリゴ糖を生成するが、実験で
得られた高重合度のキトサンオリゴ糖、6量体のキトサ
ンオリゴ糖および6量体のキチンオリゴ糖は全く分解せ
ず、キトサンを高収率で生理特性の優れた比較的高重合
度のキトサンオリゴ糖に分解生成できることがわかる。
【0052】そして、45℃、50℃、55℃、60℃
の温度で反応させても、温度が高くなるに従って分解反
応速度は速くなるものの、反応温度による反応生成物の
組成の違いはあまり認められなかった。すなわち、ある
程度の高温でも分解反応できることがわかる。ただし、
上述したとおり、60℃では、早期に酵素の失活が生じ
るので40℃〜55℃で反応させることが望ましい。
の温度で反応させても、温度が高くなるに従って分解反
応速度は速くなるものの、反応温度による反応生成物の
組成の違いはあまり認められなかった。すなわち、ある
程度の高温でも分解反応できることがわかる。ただし、
上述したとおり、60℃では、早期に酵素の失活が生じ
るので40℃〜55℃で反応させることが望ましい。
【0053】上述したように、本実施の形態によれば、
セルロースの分解酵素として広く利用されている安価な
不完全菌類のトリコデルマリーゼイが生成するセルラー
ゼを用いてキトサンを分解するため、生理活性の優れた
6量体以上の高重合度のキトサンオリゴ糖を高収率で分
解生成でき、コストを低減できる。
セルロースの分解酵素として広く利用されている安価な
不完全菌類のトリコデルマリーゼイが生成するセルラー
ゼを用いてキトサンを分解するため、生理活性の優れた
6量体以上の高重合度のキトサンオリゴ糖を高収率で分
解生成でき、コストを低減できる。
【0054】また、不完全菌類のトリコデルマリーゼイ
が生成するセルラーゼのうちセロビオヒドロラーゼIを
用いてキトサンを分解するため、効率よく容易に6量体
以上の高重合度のキトサンオリゴ糖を得ることができ
る。
が生成するセルラーゼのうちセロビオヒドロラーゼIを
用いてキトサンを分解するため、効率よく容易に6量体
以上の高重合度のキトサンオリゴ糖を得ることができ
る。
【0055】そして、キトサンを酢酸アンモニウム水溶
液に溶解した後にセルラーゼで分解するため、pHが4
〜5に保つことが容易になり、セルラーゼのうちのセロ
ビオヒドロラーゼIは安定して効率よくキトサンを高重
合度のキトサンオリゴ糖に分解できる。さらに、後工程
の高重合度のキトサンオリゴ糖の分離、精製も容易にな
る。
液に溶解した後にセルラーゼで分解するため、pHが4
〜5に保つことが容易になり、セルラーゼのうちのセロ
ビオヒドロラーゼIは安定して効率よくキトサンを高重
合度のキトサンオリゴ糖に分解できる。さらに、後工程
の高重合度のキトサンオリゴ糖の分離、精製も容易にな
る。
【0056】また、水温を40℃以上55℃以下に保温
するため、セルラーゼによるキトサンの分解速度を増大
でき、効率よく高重合度のキトサンオリゴ糖を高収率で
得ることができる。
するため、セルラーゼによるキトサンの分解速度を増大
でき、効率よく高重合度のキトサンオリゴ糖を高収率で
得ることができる。
【0057】そして、基質として用いるキトサンを、し
ゃこなどの甲殻類の外殻から抽出したキチンを脱アセチ
ル化したものを用いるため、水産加工の際に生じ廃棄物
となる外殻を有効利用でき、産業廃棄物を低減できると
ともに、安価にキトサンオリゴ糖を得ることができる。
ゃこなどの甲殻類の外殻から抽出したキチンを脱アセチ
ル化したものを用いるため、水産加工の際に生じ廃棄物
となる外殻を有効利用でき、産業廃棄物を低減できると
ともに、安価にキトサンオリゴ糖を得ることができる。
【0058】なお、上記実施の形態において、固定化酵
素を用いて回転攪拌しつつ反応を促進して分解させる回
転法について説明したが、例えばカラム法を用いてもよ
い。すなわち、例えば内径約50mmの円筒カラム内に
固定化酵素120mlを充填し、液温55℃の1%キト
サン水溶液を90ml/時間で流通させてキトサンオリ
ゴ糖を分解生成してもよい。なお、この条件では、分析
した結果、6量体〜15量体のキトサンオリゴ糖は全体
の約40%となった。また、カラム内の流速を増大させ
ると未反応のキトサンの量が増大するため、上記条件で
送液させることが好ましい。
素を用いて回転攪拌しつつ反応を促進して分解させる回
転法について説明したが、例えばカラム法を用いてもよ
い。すなわち、例えば内径約50mmの円筒カラム内に
固定化酵素120mlを充填し、液温55℃の1%キト
サン水溶液を90ml/時間で流通させてキトサンオリ
ゴ糖を分解生成してもよい。なお、この条件では、分析
した結果、6量体〜15量体のキトサンオリゴ糖は全体
の約40%となった。また、カラム内の流速を増大させ
ると未反応のキトサンの量が増大するため、上記条件で
送液させることが好ましい。
【0059】また、基質としては、しゃこに限らず、え
びやかになどのキチンを含有する甲殻類の外殻、さらに
はいずれのキトサンを用いてもよい。なお、甲殻類の外
殻から抽出したキチンをアルカリ処理したキトサンを用
いることにより、上述したように、キトサンとして菌類
の細胞壁など特殊な原料を使う必要はなく、水産加工の
際に生じる外殻の有効利用による産業廃棄物の低減およ
び安価なキトサンオリゴ糖の生成が得られる。
びやかになどのキチンを含有する甲殻類の外殻、さらに
はいずれのキトサンを用いてもよい。なお、甲殻類の外
殻から抽出したキチンをアルカリ処理したキトサンを用
いることにより、上述したように、キトサンとして菌類
の細胞壁など特殊な原料を使う必要はなく、水産加工の
際に生じる外殻の有効利用による産業廃棄物の低減およ
び安価なキトサンオリゴ糖の生成が得られる。
【0060】
【発明の効果】請求項1記載のキトサンオリゴ糖の製造
方法によれば、セルロースの分解酵素として広く利用さ
れている安価な不完全菌類のトリコデルマリーゼイ(Tr
ichoderma ressei)が生成するセルラーゼを用いてキト
サンを分解することにより、生理活性の優れた6量体以
上の高重合度のキトサンオリゴ糖を高収率で生成でき、
キトサンオリゴ糖のコストを低減できる。
方法によれば、セルロースの分解酵素として広く利用さ
れている安価な不完全菌類のトリコデルマリーゼイ(Tr
ichoderma ressei)が生成するセルラーゼを用いてキト
サンを分解することにより、生理活性の優れた6量体以
上の高重合度のキトサンオリゴ糖を高収率で生成でき、
キトサンオリゴ糖のコストを低減できる。
【0061】請求項2記載のキトサンオリゴ糖の製造方
法によれば、セルラーゼであるセロビオヒドロラーゼI
(cellobiohydrolase I)を用いてキトサンを分解する
ので、効率よく容易に6量体以上の高重合度のキトサン
オリゴ糖を得ることができる。
法によれば、セルラーゼであるセロビオヒドロラーゼI
(cellobiohydrolase I)を用いてキトサンを分解する
ので、効率よく容易に6量体以上の高重合度のキトサン
オリゴ糖を得ることができる。
【0062】請求項3記載のキトサンオリゴ糖の製造方
法によれば、請求項1または2記載のキトサンオリゴ糖
の製造方法の効果に加え、キトサンを酢酸アンモニウム
水溶液に溶解した後にセルラーゼで分解するため、安定
して効率よくキトサンを高重合度のキトサンオリゴ糖に
分解できる。さらに、後工程の高重合度のキトサンオリ
ゴ糖の分離、精製も容易になる。
法によれば、請求項1または2記載のキトサンオリゴ糖
の製造方法の効果に加え、キトサンを酢酸アンモニウム
水溶液に溶解した後にセルラーゼで分解するため、安定
して効率よくキトサンを高重合度のキトサンオリゴ糖に
分解できる。さらに、後工程の高重合度のキトサンオリ
ゴ糖の分離、精製も容易になる。
【0063】請求項4記載のキトサンオリゴ糖の製造方
法によれば、請求項1ないし3いずれか一記載のキトサ
ンオリゴ糖の製造方法の効果に加え、水温を40℃以上
55℃以下に保温するため、セルラーゼによるキトサン
の分解速度が増大して効率よく高重合度のキトサンオリ
ゴ糖を高収率で得ることができる。
法によれば、請求項1ないし3いずれか一記載のキトサ
ンオリゴ糖の製造方法の効果に加え、水温を40℃以上
55℃以下に保温するため、セルラーゼによるキトサン
の分解速度が増大して効率よく高重合度のキトサンオリ
ゴ糖を高収率で得ることができる。
【0064】請求項5記載のキトサンオリゴ糖の製造方
法によれば、請求項1ないし4いずれか一記載のキトサ
ンオリゴ糖の製造方法の効果に加え、キトサンとして甲
殻類の外殻から抽出したキチンをアルカリ処理したもの
を用いるため、原料のキトサンとして菌類の細胞壁など
特殊なものを使う必要はなく、例えば水産加工の際に生
じる廃棄物となる外殻を有効利用でき、産業廃棄物を低
減できるとともにキトサンオリゴ糖のコストを低減でき
る。
法によれば、請求項1ないし4いずれか一記載のキトサ
ンオリゴ糖の製造方法の効果に加え、キトサンとして甲
殻類の外殻から抽出したキチンをアルカリ処理したもの
を用いるため、原料のキトサンとして菌類の細胞壁など
特殊なものを使う必要はなく、例えば水産加工の際に生
じる廃棄物となる外殻を有効利用でき、産業廃棄物を低
減できるとともにキトサンオリゴ糖のコストを低減でき
る。
【図1】本発明の実施の形態を示す各種酵素を用いてキ
トサンを分解して得られた分解生成物を示すグラフであ
る。 (a)トリコデルマリーゼイ(Trichoderma ressei)由
来のセルラーゼ(試料1)を用いた分解生成物の分離パ
ターン (b)トリコデルマリーゼイ由来のセルラーゼ(試料
2)を用いた分解生成物の分離パターン (c)トリコデルマビリディ(Trichoderma viride)由
来のセルラーゼ(試料3)を用いた分解生成物の分離パ
ターン (d)トリコデルマビリディ由来のセルラーゼ(試料
4)を用いた分解生成物の分離パターン (e)トリコデルマビリディ由来のセルラーゼ(試料
5)を用いた分解生成物の分離パターン (f)トリコデルマビリディ由来のセルラーゼ(試料
6)を用いた分解生成物の分離パターン (g)ストレプトミセスグリセウス(Streptomyces gri
seus)由来のキトサナーゼ(試料7)を用いた分解生成
物の分離パターン (h)バチルス種(Bacillus sp.)PI−7S由来のキ
トサナーゼ(試料8)を用いた分解生成物の分離パター
ン (i)ストレプトミセスグリセウス由来のキチナーゼ
(試料9)を用いた分解生成物の分離パターン (j)セラティアマルセシェンス(Serratia marcescen
s )由来のキチナーゼ(試料10)を用いた分解生成物
の分離パターン
トサンを分解して得られた分解生成物を示すグラフであ
る。 (a)トリコデルマリーゼイ(Trichoderma ressei)由
来のセルラーゼ(試料1)を用いた分解生成物の分離パ
ターン (b)トリコデルマリーゼイ由来のセルラーゼ(試料
2)を用いた分解生成物の分離パターン (c)トリコデルマビリディ(Trichoderma viride)由
来のセルラーゼ(試料3)を用いた分解生成物の分離パ
ターン (d)トリコデルマビリディ由来のセルラーゼ(試料
4)を用いた分解生成物の分離パターン (e)トリコデルマビリディ由来のセルラーゼ(試料
5)を用いた分解生成物の分離パターン (f)トリコデルマビリディ由来のセルラーゼ(試料
6)を用いた分解生成物の分離パターン (g)ストレプトミセスグリセウス(Streptomyces gri
seus)由来のキトサナーゼ(試料7)を用いた分解生成
物の分離パターン (h)バチルス種(Bacillus sp.)PI−7S由来のキ
トサナーゼ(試料8)を用いた分解生成物の分離パター
ン (i)ストレプトミセスグリセウス由来のキチナーゼ
(試料9)を用いた分解生成物の分離パターン (j)セラティアマルセシェンス(Serratia marcescen
s )由来のキチナーゼ(試料10)を用いた分解生成物
の分離パターン
【図2】同上キトサンを基質としたキトサナーゼ活性画
分とセルラーゼ活性画分との基質特異性を示すグラフで
ある。 (a)キトサナーゼ活性画分による分解生成物の分離パ
ターン (b)セルラーゼ活性画分による分解生成物の分離パタ
ーン (c)反応前のキトサンを示す成分の分離パターン (d)標準オリゴ糖混合物を示す成分の分離パターン
分とセルラーゼ活性画分との基質特異性を示すグラフで
ある。 (a)キトサナーゼ活性画分による分解生成物の分離パ
ターン (b)セルラーゼ活性画分による分解生成物の分離パタ
ーン (c)反応前のキトサンを示す成分の分離パターン (d)標準オリゴ糖混合物を示す成分の分離パターン
【図3】同上高重合度のキトサンオリゴ糖を基質とした
キトサナーゼ活性画分とセルラーゼ活性画分との基質特
異性を示すグラフである。 (a)キトサナーゼ活性画分による分解生成物の分離パ
ターン (b)セルラーゼ活性画分による分解生成物の分離パタ
ーン (c)反応前の高重合度キトサンオリゴ糖を示す成分の
分離パターン (d)標準オリゴ糖混合物を示す成分の分離パターン
キトサナーゼ活性画分とセルラーゼ活性画分との基質特
異性を示すグラフである。 (a)キトサナーゼ活性画分による分解生成物の分離パ
ターン (b)セルラーゼ活性画分による分解生成物の分離パタ
ーン (c)反応前の高重合度キトサンオリゴ糖を示す成分の
分離パターン (d)標準オリゴ糖混合物を示す成分の分離パターン
【図4】同上6量体のキトサンオリゴ糖を基質としたキ
トサナーゼ活性画分とセルラーゼ活性画分との基質特異
性を示すグラフである。 (a)キトサナーゼ活性画分による分解生成物の分離パ
ターン (b)セルラーゼ活性画分による分解生成物の分離パタ
ーン (c)反応前の6量体キトサンオリゴ糖を示す成分の分
離パターン (d)標準オリゴ糖混合物を示す成分の分離パターン
トサナーゼ活性画分とセルラーゼ活性画分との基質特異
性を示すグラフである。 (a)キトサナーゼ活性画分による分解生成物の分離パ
ターン (b)セルラーゼ活性画分による分解生成物の分離パタ
ーン (c)反応前の6量体キトサンオリゴ糖を示す成分の分
離パターン (d)標準オリゴ糖混合物を示す成分の分離パターン
【図5】同上6量体のキチンオリゴ糖を基質としたキト
サナーゼ活性画分とセルラーゼ活性画分との基質特異性
を示すグラフである。 (a)キトサナーゼ活性画分による分解生成物の分離パ
ターン (b)セルラーゼ活性画分による分解生成物の分離パタ
ーン (c)反応前の6量体キチンオリゴ糖を示す成分の分離
パターン (d)標準オリゴ糖混合物を示す成分の分離パターン
サナーゼ活性画分とセルラーゼ活性画分との基質特異性
を示すグラフである。 (a)キトサナーゼ活性画分による分解生成物の分離パ
ターン (b)セルラーゼ活性画分による分解生成物の分離パタ
ーン (c)反応前の6量体キチンオリゴ糖を示す成分の分離
パターン (d)標準オリゴ糖混合物を示す成分の分離パターン
Claims (5)
- 【請求項1】 キトサンを不完全菌類のトリコデルマリ
ーゼイ(Trichoderma ressei)が生成するセルラーゼに
より分解することを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造
方法。 - 【請求項2】 キトサンをセロビオヒドロラーゼI(ce
llobiohydrolase I)により分解することを特徴とする
キトサンオリゴ糖の製造方法。 - 【請求項3】 キトサンを酢酸アンモニウム水溶液に溶
解した後にセルラーゼで分解することを特徴とする請求
項1または2記載のキトサンオリゴ糖の製造方法。 - 【請求項4】 キトサンを溶解した水溶液の水温を40
℃以上55℃以下に保温してセルラーゼで分解すること
を特徴とする請求項1ないし3いずれか一記載のキトサ
ンオリゴ糖の製造方法。 - 【請求項5】 甲殻類の外殻から抽出したキチンをアル
カリ処理して得たキトサンを用いることを特徴とする請
求項1ないし4いずれか一記載のキトサンオリゴ糖の製
造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27904799A JP2001095595A (ja) | 1999-09-30 | 1999-09-30 | キトサンオリゴ糖の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP27904799A JP2001095595A (ja) | 1999-09-30 | 1999-09-30 | キトサンオリゴ糖の製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001095595A true JP2001095595A (ja) | 2001-04-10 |
Family
ID=17605668
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP27904799A Pending JP2001095595A (ja) | 1999-09-30 | 1999-09-30 | キトサンオリゴ糖の製造方法 |
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Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2001095595A (ja) |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001261565A (ja) * | 2000-03-10 | 2001-09-26 | Food Industry Research & Development Inst | 細胞の酸化窒素の生産を阻害するためのキチン質物質の使用 |
WO2004101804A1 (fr) * | 2003-05-16 | 2004-11-25 | Obschestvo S Ogranichennoy Otvetstvennost'yu 'invest-Farm' | Procede de production d'oligosaccharide de chitosane et oligosaccharide de chitosane correspondant |
JP2005229962A (ja) * | 2004-02-23 | 2005-09-02 | Yaegaki Hakko Giken Kk | キトサン分解物の製造方法及び製造装置 |
KR101381179B1 (ko) * | 2011-03-31 | 2014-04-04 | 주식회사 건풍바이오 | 키토산올리고당 혼합물로부터 올리고당별 분리 방법 |
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CN109134676A (zh) * | 2018-07-25 | 2019-01-04 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 低聚糖及其制备方法、应用 |
CN111718972A (zh) * | 2020-07-27 | 2020-09-29 | 安亦臣(武汉)健康科技有限公司 | 一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法 |
CN113832203A (zh) * | 2021-10-28 | 2021-12-24 | 湛江市博泰生物化工科技实业有限公司 | 壳寡糖及其制备方法 |
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CN114807190A (zh) * | 2021-01-27 | 2022-07-29 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种南极地衣链霉菌壳聚糖酶基因及其应用 |
-
1999
- 1999-09-30 JP JP27904799A patent/JP2001095595A/ja active Pending
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP4709343B2 (ja) * | 2000-03-10 | 2011-06-22 | フード インダストリー リサーチ アンド ディヴェロップメント インスティテュート | 細胞の酸化窒素の生産を阻害するためのキチン質物質の使用 |
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