FI104496B - Yliekspressiojärjestelmät kolera B-alayksikön ekspressiota varten vieraiden promoottoreiden ja johtopeptidien avulla - Google Patents
Yliekspressiojärjestelmät kolera B-alayksikön ekspressiota varten vieraiden promoottoreiden ja johtopeptidien avulla Download PDFInfo
- Publication number
- FI104496B FI104496B FI894368A FI894368A FI104496B FI 104496 B FI104496 B FI 104496B FI 894368 A FI894368 A FI 894368A FI 894368 A FI894368 A FI 894368A FI 104496 B FI104496 B FI 104496B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- ctb
- protein
- gene
- promoter
- coli
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 title claims description 19
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 title description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 claims description 36
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 32
- 101150005152 ctb gene Proteins 0.000 claims description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 13
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 13
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 13
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 claims description 8
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims description 8
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 claims description 8
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 7
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 7
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 claims description 6
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 claims description 4
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 claims description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims 2
- KPZGRMZPZLOPBS-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloro-2,2-bis(chloromethyl)propane Chemical compound ClCC(CCl)(CCl)CCl KPZGRMZPZLOPBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- JTEJPPKMYBDEMY-UHFFFAOYSA-N 5-methoxytryptamine Chemical compound COC1=CC=C2NC=C(CCN)C2=C1 JTEJPPKMYBDEMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 1
- DVKQPQKQDHHFTE-ZLUOBGJFSA-N Cys-Cys-Asn Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)N)C(=O)N DVKQPQKQDHHFTE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims 1
- GZAUZBUKDXYPEH-CIUDSAMLSA-N Leu-Cys-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N GZAUZBUKDXYPEH-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- RYXPMWYHEBGTRV-UHFFFAOYSA-N Omeprazole sodium Chemical compound [Na+].N=1C2=CC(OC)=CC=C2[N-]C=1S(=O)CC1=NC=C(C)C(OC)=C1C RYXPMWYHEBGTRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- 241000607493 Vibrionaceae Species 0.000 claims 1
- 241000525018 Vibrionaceae bacterium Species 0.000 claims 1
- 108010010430 asparagine-proline-alanine Proteins 0.000 claims 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims 1
- 101150060022 med gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 27
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 58
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 101150021331 toxR gene Proteins 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 5
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 5
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 4
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 4
- 101150018411 LTB gene Proteins 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 101150114515 CTBS gene Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800000120 Host translation inhibitor nsp1 Proteins 0.000 description 3
- 101800000517 Leader protein Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101800000512 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- ARKDJZHBBZECNE-LSYRYXEQSA-N beta-D-Gal-(1->3)-beta-D-GalNAc-(1->4)-[alpha-Neu5Ac-(2->3)]-beta-D-Gal-(1->4)-beta-D-Glc-(1<->1')-Sph Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](N)[C@H](O)/C=C/CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 ARKDJZHBBZECNE-LSYRYXEQSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005004 cholera vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010968 computed tomography angiography Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 description 2
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 101150116497 sacm1l gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- OXWVQXZNTJTTEC-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2h-naphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)(Cl)CC=CC2=C1 OXWVQXZNTJTTEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N Arginine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- FWSKZDLWVKONFS-UHFFFAOYSA-K Cl[Rb].Cl[Ca]Cl Chemical compound Cl[Rb].Cl[Ca]Cl FWSKZDLWVKONFS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101710121697 Heat-stable enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101710090149 Lactose operon repressor Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000602423 Vibrio cholerae O1 Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 108010026341 choleragen receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 101150062186 cta gene Proteins 0.000 description 1
- 101150028842 ctxA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150087320 ctxB gene Proteins 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150030491 eltA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008944 intestinal immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L magnesium;aluminum;dihydroxide;trihydrate Chemical compound O.O.O.[OH-].[OH-].[Mg+2].[Al] ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 1
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Soy Sauces And Products Related Thereto (AREA)
- Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
- Exhaust Gas Treatment By Means Of Catalyst (AREA)
Description
104496
Yliekspressiojärjestelmät kolera B -alayksikön ekspressiota varten vieraiden promoottoreiden ja johtopeptidien avulla 5 Sellaisia menetelmiä kuvataan, joissa rekombinaatio DNA -menetelmien avulla koleratoksiinin (CTB) tai johdannaisten sidosalayksikköproteiinien, joihin kuuluvat CTB:n hybridigeenifuusioproteiinit, ekspressio on saatu vieraan (ei kolera toksiini) promoottorin hallintaan ja/tai CTB-proteiinia tai sen johdannaisia syntetisoidaan mieluummin vieraalla kuin luonnollisella johtoproteiinilla, jotta helpotetaan toksii-10 nin siirtymistä solumembraanien läpi.
Vibrio cholerae seroryhmästä 01 voi aiheuttaa useita ripulitauteja, kun se jakautuu infektoituneiden yksilöiden suolessa vapauttaen koleratoksiinia (CT), joka saa aikaan aktiivisen elektrolyytin ja veden erittymisen sisäepiteelissä. Samalla mekanis-15 millä useat muut bakteerit, esimerkiksi Escherichia coli voivat myös aiheuttaa ripulia vapauttaen muita enterotoksiineja, jotka voivat olla CT:n kaltaisia tai erilaisia.
CT on bakteeri enterotoksiinin prototyyppi. Se on kahdenlaisesta alayksiköstä muodostunut proteiinirakenne: yksittäinen A-alayksikkö, jonka molekyylipaino on 20 28 000 ja viisi B-alayksikköä, joista jokaisen molekyylipaino on 11 600. B-alayk- siköt ovat aggregoituneet renkaaksi vahvoilla ei-kovalenttisilla sidoksilla; A-alayksikkö on sitoutunut ja ehkä osittain liittynyt B-pentameeri renkaaseen heikkojen ei-kovalenttisten vaikutusten kautta. Kahdenlaisilla alayksiköillä on erilaiset roolit sai-rastumisprosessissa: B-alayksiköt ovat vastuussa solun sitoutumisesta ja A-alayksik-: 25 kö suorasta toksisesta aktiivisuudesta. Toksiinin sitoutumisen suolen sisäpintaan tai muihin nisäkässoluihin molekulaarisia näkökohtia ja sitä seuraavia tapahtumia, jotka johtavat adenylaattisyklaatin aktivoitumiseen A-alayksikön (ja sen AI fragmenttien) aiheuttaman solujenvälisen toiminnan vaikutuksesta, on hyvin yksityiskohtaisesti selitetty (ks. J Holmgren, Nature 292:413-417, 1981). Myöhemmin on tullut myös 30 tietoa V. cholerae -bakteerien koleratoksiinin synteesin, aggregaatin ja erityksen genetiikasta ja biokemiasta. CT:tä koodaavat kromosomaaliset A- ja B-alayksikön ra-kennegeenit, vastaavasti. Näitä geenejä on kloonattu useilla kannoilla, ja niiden nuk-leotidisekvenssit on määritetty.
35 CT:n A- ja B-alayksiköiden geenit ovat jäijestäytyneet yhdeksi transkriptionaali-seksi yksiköksi, jossa on A-cistron (ctxA), joka on B-cistronin (ctxB) edeltäjä. Klassisten ja E1 Tor -biotyyppisten V. cholerae -kantojen CT-geenien organisoitumistut-kimuksissa on ehdotettu, että on olemassa kaksi kopiota CT-geeneistä klassisissa 2 104496 biotyyppikannoissa kun taas useimmissa El Tor -kannoissa on vain yksi kopio (JJ Mekalanos et ai, Nature 306:551-557, 1983). CT:n synteesiä säätää positiivisesti geeni, toxR, joka lisää ctx-ekspressiota moninkertaisesti (VL Miller ja JJ Mekalanos, Proc Natl Acad Sei USA, 81:3471-3475, 1984). ToxR toimii trankriptionaali-5 sella tasolla, ja sitä on sekä klassisessa että El-biotyyppien kannoissa. ToxR ehkä lisää ctx-transkriptiota koodaamalla säätelyproteiinia, joka vaikuttaa positiivisesti ctx-promoottorialueen kanssa. Escherichia colin lämpölabiilin enterotoksiinin (LT) tutkimuksissa (alayksikkörakenne ja LT:n funktio on hyvin samanlainen, muttei identifinen CT:n kanssa) on osoittautunut, että A- ja B-alayksiköt ovat alkujaan 10 syntetisoituneet kuten prekursorit johtopeptidin kanssa, jotka ovat valmiiden alayk-sikköproteiinien edeltäjiä. Nämä prekursorit prosessoituvat (mikä tarkoittaa, että johtopeptidi siirretään) ja siirtyvät sisemmän mebraanin läpi periplasmaan, jossa ag-gregoitumattomat monomeeriset B-alayksiköt pentamerisoituvat ja yhdistyvät A-alayksikön kanssa puoliintumisajassa 1-2 min. Toksiinin muodostumisen kulku 15 näyttää etenevän A-alayksikön yhdistymisen B-monomeerien tai pienten oligomee-rien kautta. Kun kokonainen toksiini on muodostunut V. cholerassa (päinvastoin kuin E, colilla. jolla toksiini jää periplasmaan) toksiini kulkeutuu (erittyy) läpi V. choleran 01 ulkomembraanin jonkinlaisten B-alayksikön alueiden ja ulkomembraa-nin välisten yhteisvaikutusten kautta (TR Hirst & J Holmgren, Proc Natl Acad Sei 20 USA, 84:7418-7422, 1987 SJS Hardy et ai, ibid, in press, 1988). Jos CT:n tai LT:n B-alayksiköt ekspressoituvat minkään A-alayksikön poissaollessa (joitain tällaisia kantoja on valmistettu kemiallisen mutageneesin kautta tai poistamisilla rekombinaatio DNA -menetelmillä ctxR- tai eltA-cistroneissa), B-alayksiköt muodostavat pentameereja, jotka sitten erittyvät V. cholerasta samojen teiden kautta, kuten tapah-'· 25 tuu käsittelemättömillä toksiineilla lukuunottamatta ilmeisesti hieman hitaampaa yhdistymisprosessia periplasmassa (TR Hirst et ai, Proc Natl Acad Sei USA 81:2645-2649, 1984; SJS Hardy et ai, ibid, in press, 1988). Koska rokotus koleraa vastaan taudinaiheuttajainjektiolla on saanut aikaan vain lievän ja lyhytaikaisen suojan (tavallisesti alhaisemman kuin 50 % suojan alle 6 kuukaudeksi), huomiota on 30 suunnattu suun kautta otettavien rokotteiden kehittämiseen, jotka stimuloivat suoliston immuniteettia tehokkaammin. Erityistä huomiota on kiinnitetty CTB-pentamee-reihin yhtenä tällaisten suun kautta nautittavien kolerarokotteiden komponenttina (J Holmgren et ai.. Nature 269:602-604, 1977). CTB on tehokas suun kautta nautittava immunisoiva aine, jonka suurissa kenttäkokeissa on osoitettu saavan aikaan 35 suojan sekä koleraa että ripulia vastaan, joita aiheuttavat E, colin LT-enterotoksiinit (J Clemens et ai.. Lancet ii: 124-127, 1986 ja Infect Dis, in press, 1988). B-alayksikön erottaminen A:sta sulkee pois kaikki riskit sen kääntymisestä toksiseksi, ja 3 104496 CTB.llä on hoidettu suun kautta yli 25 000 ihmistä ilman mitään sivuvaikutuksia. Nämä ominaisuudet ovat tehneet CTB:n tärkeäksi komponentiksi, yhdessä tapettujen kokonaisten koleravibrioiden kanssa, osana uutta suun kautta nautittavaa kolerarokotetta. Lisäksi CTB on saanut viime aikoma paljon kiinnostusta immunogeenise-5 na kantajana monille muille peptidi- tai hiilihydraattiantigeeneille ja sitä on myös käytetty reseptoria blokkaavana ja reseptoria moduloivana aineena lyhytaikaisessa koleran profylaksiassa ja E. colin ripulia vastaan (Rl Glass et ai, J Infect Dis 149:495-500, 1984; ST Donta et ai, ibid 157:557-564, 1988; SJ McKenzie ja JF Halsey, J Immunol 133:1818-1824, 1984; A-M Svennerholm et ai J Clin Microbiol 10 24:585-590, 1986).
Nämä havainnot ovat korostaneet tarvetta kasvattaa CTB:n saantoa suuren mittakaavan tuotantoon, ideaalisesti samanaikaisesti välttäen takaiskuja, joita on tullut yleisesti käytettyjen valmistusmenetelmien yhteydessä (ks. JL Tayot et af Eur J 15 Biochem 113:249-258, 1981), joita tarvitaan, kun CTB proteiinia puhdistetaan aktiivisesta toksiinista.
Siten tässä hakemuksessa kuvailtujen strategioiden ja menetelmien avulla olemme suunnitelleet yliekspressiomenetelmän CTB:lle ja CTB-fuusioproteiineille, jossa 20 CTB-geeni (tai hybridifuusioproteiinigeeni) on vahvan vieraan (ei koleratoksiini) promoottorin kontrollin alaisena. Onnistumisemme tässä mielessä eroaa JJ Mekala-nosin et ai (Nature 306:551-557, 1983) aikaisemmista yrityksistä erilaisilla menetelmillä tämän päämäärän saavuttamiseksi käyttämällä yhtä promoottoreista (tacP), joka on kuvattu yhdessä esimerkeistämme, sillä näiden yritysten on kerrottu epäonnis-25 tuneen, koska niissä CTB:n ekspressoituminen on ollut alhaisempaa kuin luonnollista ctx-promoottoria käytettäessä saavutetaan.
Käyttämällä rekombinaatio DNA -menetelmiä olemme saaneet aikaan yliekspressio-jäqestelmän koleratoksiinin (CTB) tai CTB-johdannaisten B-alayksikölle, johon si-30 sältyvät CTB:n fuusioproteiinit. Tällaisille järjestelmille on ominaista se, että CTB:tä tai CTB-johdannaisproteiineja koodaavien geenien ekspressio on saatettu vahvan vieraan (ei-koleratoksiini) promoottorin kontrollin alaiseksi monilla laaja-isäntäisillä plasmidivektoreilla. Kuvatut geenirakenteet ovat riippumattomia luonnon CT-promoottoreista ja toxR-ekspression säätelysysteemeistä. Kaksi tällaista ylieks-35 pressiojärjestelmää ovat esimerkkeinä, toinen, jossa CTB-ekspressoituu indusoituvalla tai konstitutiivisella tavalla tacP promoottorin kontrollin alaisena, ja toinen, jossa CTB-ekspressiota kontrolloi T7 RNA -polymeraasista riippuvainen promoot- 4 104496 tori. Edellä olevissa esimerkeissä geenien rakenteet, jotka sallivat yliekspression, ovat olemassa laajaisäntäisillä plasmidivektoreilla. Tämä sallii CTB:n ja CTB-joh-dannaisten korkeiden määrien tuottamisen erilaisilla bakteerilajeilla, esimerkiksi & colilla ja V. choleraella. jotka ottavat vastaa näitä plasmideja. Vieraan promoottorin 5 yliekspressioijäijestelmän käyttökelpoisuus CTB-johdannaisten tuottamiseen fuusio-proteiinien muodossa on myöskin selitetty synteettisen DNA-sekvenssin, joka koo-daa ei-toksista dekapeptidiä, joka on E. colin lämpöstabiilin enterotoksiinin (STA) johdannainen, fuusiona CTB-geenin kanssa ja geenifuusioproteiinin ekspressiona V. choleraessa tacP-promoottorin kontrollin alla.
10
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
Termit CTB ja CTB-johdannaiset, tässä hakemuksessa käytettynä, määrittelevät minkä tahansa proteiinin tai peptidin (lukuunottamatta E. colin LTB:tä), joilla on 15 sellaiset ominaisuudet, jotka sallivat sen tunnistamisen immuuniseerumilla (antiseerumilla), jota on valmistettu CTB-proteiinia vastaan, jota koodaa plasmidi pJS162, joka on kuvattu tässä hakemuksessa.
Termi vieras promoottori määrittelee minkä tahansa promoottorin, jota kuvaa se, 20 että se on erilainen kuin luonnon ctx-promoottori.
Termi vieras johtopeptidi määrittelee minkä tahansa peptidisekvenssin proteiinimo-lekyylissä, joka suosii proteiinin siirtymistä, tässä hakemuksessa CTB:n tai CTB johdannaisten siirtymistä solumembraanien läpi, ja joka on erilainen kuin luonnon *· 25 johtopeptidit koleratoksiinialayksikölle.
Standardinimistöä, jota käytetään esimerkiksi E-L Winnackerin teoksessa, From Genes to Clones, VCH Publishers, New York (1987), on noudatettu määritelmissä, jotka koskevat DNA-restriktioendonukleaaseja, restriktiopaikkoja ja restriktiosek-30 venssejä. Oligodeoksinukleotideihin ja aminohappoihin viitataan perinteisillä yksi-. · kirjaimisilla ja kolmekirjaimisilla lyhennyskoodeilla.
Keksintöä kuvataan lisäksi kuvioiden avulla, joissa: 35 Kuviossa IA on kuvattu LTB- ja CTB-geenien välinen fuusioliitoskohta. Nukleotidit, jotka on alleviivattu avoimilla neliöillä, osoittavat DNA:n LTB-geenistä, ja ne, jotka on alleviivattu täytetyillä neliöillä, ovat synteettisiä oligodeoksinukleotideja, 5 104496 jotka ovat osa yhdistäjää, ja ne, jotka on alleviivattu kolmioilla, osoittavat CTB-geenin DNA:ta. Aminohappojen yläpuolella oleva numerointi viittaa niiden aiempiin paikkoihin suhteessa ensimmäiseen aminohappoon (+1) kunkin omissa johto-proteiineissa. Tähdet viittaavat aminohappoihin, joita ei alunperin koodaa mikään 5 kahdesta fuusiogeenistä. Synteettinen yhdistäjä, laitettuna Sacl-paikkaan ja siihen lisättynä Smal tunnistus sekvenssi. Fuusion jälkeen saatiin CTB:a koodaava plasmidi tacPistä (ks. kuvio B jäljempänä). Osoitettu sekvenssi on vahvistettu deoksinukleo-tidisekvensoinnilla.
10 Kuviossa B on plasmidin pj 162 kartta, jossa on CTB geeni tacP-promoottorin kontrollin alla. Plasmidilla on replikaatioon RSF1010 alkuperä, ja se on kooltaan noin 10,2 kb. Iso nuoli osoittaa tacP-promoottorin paikan. Tähdillä täytetty alue esittää geenimäärää, joka koodaa johto-CTB:n. Johtopeptidin koodaava alue (alunperin LTB:stä) on merkitty täytettynä alueena. Arviodut ampisilliiniresistenssialueet ja 15 laclq geenit on osoitettu.
Kuvio 2 esittää CTB-geenin nukleotidisekvenssin plasmidissa pJS162. Vain vasta-suuntainen säie on esitetty, koodatut aminohapot on esitetty niitä vastaavien koodien yläpuolella. Thr-jäännös, joka on numeroitu +1, on ensimmäinen normaalisti koko- 20 naisesta CTB.stä löydetty aminohappo, kun taas Ala-jäännös paikassa -7 (tai +1 suluissa) on ensimmäinen aminohappo kokonaisessa LTBrssä. Aminohapot, joita ei ole alunperin kummassakaan kahdessa proteiinissa, on merkitty tähdillä. Mahdollinen ribosomisidospaikka (Shine-Dalgamo-sekvenssi) on alleviivattu (SD). Vertikaaliset nuolet osoittavat peptidisidokset, jotka on katkaistu irrottamaan kokonainen *. 25 rekombinantti-CTB. Aminohapot 569B CTB-proteiinisekvenssissä, joita ei oletettu meidän CTB DNA -sekvenssissämme, ovat suluissa, jäännökset CTB:ssä El Tor -kannoilla, jotka poikkeavat meidän ja klassisesta 569B CTB:stä ovat suluissa ja vahvistetusti merkittyjä.
30 Kuviossa 3 on esitetty CTB-ekspression induktio IPGT:llä V, choleraessa JBK70 (pJS162). CTB-tasot (y-akselilla), ilmaistuina puhtaan 569B CTB -proteiinin ekvivalentteina on määritetty GMl-ELISA-menetelmällä käyttäen spesifistä monoklo-naalista vasta-ainetta. Todelliset pitoisuudet solupelleteissä olivat kymmenkertaisesti alhaisempia kuin kuvassa (solu x 10).
Kuviossa 4 on esitetty kiehautettujen ja kiehauttamattomien CTB-näytteet. Yhtä suuret määrät rekombinanttista CTB-proteiinia (ajopaikat 1 ja 2) tai referenssi 569B
35 6 104496 CTB -proteiinia (ajopaikat 3 ja 4) ajettiin elektroforeesilla 13,5-prosenttisessa poly-akryyliamidi-NaDodS04-geelissä 5 minuutin näytepuskurikäsittelyn jälkeen 100°C:ssa (ajolinjat 1 tai 3) tai huoneenlämpötilassa (ajolinjat 2 tai 4). Molekyyli-painomarkkeri (Bio-Rad) arvioitujen proteiinistandardikokojen (kDa) kanssa esite-5 tään (MW). Rekombinanttisen CTB:n hitaampi kulkeutuminen verrattuna 569B CTB:hen voidaan huomata vain heikosti, kun tutkitaan monomeereina (Bm), mutta se on selvempi oligomeerimuodossa (pentameeri) (Bp).
Kuviossa 5 esitetään 569 B CTB:n (kolot B ja F) ja rekombinanttisen CTB:n (kolot 10 G ja D) Ouchterlony-kaksoisdiffuusio geelianalyysi reagoineena kanin antiseerumia vastaan (kolot A ja E antirekombinanttinen CTB ja kolo C anti-569B CTB).
Kuviossa 6 on esitetty STa-sukuisen dekapeptidin fuusio CTB:n kanssa. Synteettinen oligonukleotidi (osoitettu paksuilla, isoilla kirjaimilla) yksisäikeisten pidenty-15 mien kanssa, joka on yhteensopiva Sacl- ja Xmal-restriktiopäiden kanssa liitettiin DNA-alueeseen, joka koodaa CTB:n aminopäätä plasmidissa pJS162. Synteettisen oligonukleotidin liittäminen tehtiin siten, että säilytettiin alkuperäinen lukemisrunko CTB-geenissä, ja tuloksena oli hybridigeeni, joka koodaa fuusioproteiinia, joka sisältää peptidipidentymisen, joka käsittää STa-sukuisen peptidin (tähdillä merkitty) 20 CTB:n aminopäässä (ensimmäinen aminohappo on merkitty numerolla +1). Aminohapot, jotka ovat (+)-merkittyjä, ovat aminohappoja, joita koodaa merkitty oligonukleotidi, ja niiden ei katsota muodostavan osaa STa-sukuisesta dekapeptidistä. Ensimmäisen aminohapon kanssa (Arg) vastavirrassa on johtopeptidi CTB:lie, joka on peräisin LTB:tä koodaavasta geenistä, ribosomin sidospaikka (S/D) ja taeP-promoot-25 tori hybridigeenin ekspressiota varten (ks. plasmidi pJS162 kuviossa IB).
Kuviossa 7 on esitetty STa-sukuisen dekapeptidi-CTB-hybridigeeniekspression induktio IPTG:n avulla V. choleraessa JBK70, johon on laitettu plasmidi pJS8. Soluja kasvatettiin nestemäisellä alustalla OD60o 0,5 asti ilman indusoivaa ainetta, ja sitten 30 lisättiin IPGT esitettyinä pitoisuuksina ja kasvatusta jatkettiin toiset 4 tuntia ennen bakteerisolujen ja kasvatussupematanttien talteenottoa, mikä on tekstissä kuvattu. Hybridiproteiinitasot (y-akseli) määritettiin GMl-ELISA-menetelmällä spesifistä monoklonaalista anti-STa-vasta-ainetta käyttäen (ST 1:3, jonka ystävällisesti antoi tri A-M Svennerholm, Göteborg, Ruotsi). Puhdistettua STa-sukuista dekapeptidi-35 CTB-hybridiproteiinipreparaattia käytettiin referenssinä. Tähdet osoittavat hybridi-proteiinin pitoisuudet supematanteissa ja avoimet neliöt osoittavat soluihin sitoutuneet pitoisuudet, jotka määritettiin solujen ultraäänihajotuksen jälkeen.
7 104496
Kuviossa 8 on esitetty STa-sukuisen dekapeptidi-CTB-hybridiproteiinin immuno-täpläanalyysi natriumdodekyylisulfaatipolyakryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen, josta erotetut proteiinit siirrettiin sähköisesti nitroselluloosapaperille. Rivit A-D näyttävät reaktiomallit kiehauttamattomalle puhdistetulle 569B CTBrlle (rivi A), 5 kiehautetulle CTB:lle (rivi B), kiehauttamattomalle STa-sukuiselle dekapetidi-CTB.lle (rivi C) ja kiehautetulle dekapeptidi CTB:lle (rivi D) anti-koleratoksiinin monoklonaalisen vasta-aineen Wi7:5 kanssa kehittymisen jälkeen. Rivit E-H näyttävät samoista proteiineista saadut reaktiomallit anti-STa-monoklonaalisen antibodin 1:3 kanssa kehittymisen jälkeen. Nuolet viittaavat referenssiproteiinien kulkeutumis- 10 paikkoihin, joilla on tunnetut molekyylipainot (esitetty kilodaltoneina) ajettuna samalla geelillä.
Esimerkki 1 15 Rekombinaatiomenetelmä CTB:n indusoituun yliekspressioon tacP-kontrollin alaisena.
1.1. Geeni(DNA)manipulaatiot CTB-geenin saattamiseksi indusoitavan tacP:n kontrollin alaiseksi 20
Teoreettisten tarkastelujen ja alustavien kokeiden perusteella oletimme, että CTB:n yliekspressio vieraalla (ei-koleratoksiini) promoottorilla voidaan saavuttaa, jos CTB-geeni voidaan tuoda niin lähelle kuin mahdollista vierasta promoottoria, ideaalisesti välttäen mitään V. cholerae -peräistä ei-CTB:tä koodaavaa DNA:ta promoot-:. 25 torin ja CTB-geenin välissä. Tässä esimerkissä kuvaamme menetelmää, jossa tätä strategiaa käytettiin rakentamaan onnistunut yliekspressiojärjestelmä CTB:n tuottamista varten laittamalla CTB-geeni indusoituvan tacP-promoottorin ekspressio-kontrolliin.
30 DNA:n, joka koodaa E. colin LTBitä, alussa on yksi EcoR 1 -restriktiopaikka sen 5'-päässä sijaiten juuri ribosomin sidospaikan vastavirrassa, joka on viimeksi käytetty korvaamaan LTB-geeni vahvan tacP-promoottorin jälkeen siten luoden pMMB68-plasmidin (M Sandqvist et ai, J Bacteriol 169:4570-4576, 1987). Jotta voitaisiin hyödyntää tämä strategisesti sijaitseva EcoRl-paikka (joka puuttuu CTB-geenistä) 35 ja jotta saataisiin CTB:n ekpressio saman promoottorin kontrollin alaiseksi, päätim me fuusioida geneettisesti valmiin CTB-proteiinin LTB:n johtopeptidiin laajaisän-täisellä plasmidilla pMMB68. pCDVD30:n CTB-geenillä (joka on peräisin V. cho- 8 104496 lerae 01 -kaimasta 0395, klassinen biotyyppi, Ogawa-serotyyppi) on Ndel-paikka johtopeptidin aminohapon (aa) paikassa 18, kun taas LTB-geenillä on Sacl-tunnis-tussekvenssi vabniin proteiinin alussa. CTB-geenin fuusio sen 5' Ndel -lopun ja LTB-geenin 3'SacI välillä, synteettisen sidosaineen avulla, kuten kuviossa IA on 5 esitetty, johti CTB-johtopeptidin korvautumiseen LTB:ssä olevan vastaavan peptidin kanssa. Tuloksena oleva plasmidi pJS162, joka on esitty kuviossa 2B. sisälsi hybridi CTB -geenin EcoRI-HindlH DNA -segmenttinä myötävirrassa tacP-promoot-toriin nähden.
10 Seuraavia menetelmiä käytettiin edellä mainittujen rakenteiden saavuttamiseksi. pMMB68-plasmidin E, coli -kannassa HB 101 valmisti ystävällisesti M. Sandquist, Uumajan yliopistosta. Plasmidi pCVD30 E. colissa HB101 saatiin tri J. Kaperilta, Marylandin yliopistosta, Baltimoresta USA:sta. (Yksityiskohtaiset kuvaukset näistä plasmideista ovat esittäneet M. Sandquist et ai, J Bacteriol 169:4570-4576 ja JB 15 Kaper et ai, Biotechnology 2:345-349, 1984). Fosforyloimattomat oligonukleotidit, joita käytettiin liittämään Sacl 3' -pää LTB:n alusta CTB:n Ndel-sekvenssiin, ostettiin yksisäikeisinä Upsalan yliopiston immunologian osaston biolääketieteen keskuksesta. Nämä säikeet saatiin yhdistymään pareittain sekoittamalla yhtä suuret moolimäärät kutakin säiettä ja inkuboimalla seosta yön yli huoneen lämmössä. Tu-20 loksena olevassa kaksoisketjuisessa oligonukleotidissa oli Sacl ja Ndel yhteensopivina yksisäikeisinä pidentyminä, ja sitä kyettiin siksi liittämään suoraan Sacl-HindUI-pilkottuun pMMB68-plasmidiin. Yhdistyminen toteutettiin inkuboimalla 10-kertainen molaarinen yliannos oligonukleotidia plasmidi DNA:han yön yli 4 °C:ssa T4 ligaasin kanssa. Yhdistämisseokseen lisättiin sitten yhtä suuressa mo-\ 25 laarisessa suhteessa vektoriplasmidi DNA:han nähden puhdistettua Ndel-Hindlll- fragmenttia plasmidista pCVD30, joka sisälsi CTB geenin, ja ligaasireaktion annettiin sitten jatkua 4 °C:ssa toiset 18 tuntia. Yhdistynyt DNA transformoitiin seuraa-vaksi sopiviin E. coli HB 101 -soluihin ampisilliiniresistenssiselektion kanssa (100 pg/ml). Kaikki entsyymit, joita näissä menetelmissä käytettiin, ostettiin Boeh-30 ringerilta Mannheimista, GmBH, FRG, ja niitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Plasmidi DNA:n puhdistaminen tehtiin alkali-liuotusmenetelmällä ja transformaatio E. coliin kalsium-rubidiumkloridimenetelmällä yksityiskohtaisen kuvauksen mukaan, jonka on tehnyt T Maniatis et ai, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
35
Kloonauksen jälkeen ennustettujen sekvenssien muodostumista vahvistamaan hybri-‘ digeeni kloonattiin uudelleen M13:een ja sekvensoitiin dideoksinukleotidimenetel- 9 104496 mällä, F Sanger et ai, Proc Natl Acad Sei, USA 74:5463-5467, 1977. Määritetty sekvenssi vahvistettiin sekvenssiksi, jonka oli julkaistu olevan LTB:n johto-osa (J Leong et ai, Infect Immun 48:73-77, 1985) ja se näytti olevan hyvin paljon samankaltainen kuin aiemmin esitetyt El Tor-ja klassisen CTB:n valmiit sekvenssit (ML 5 Gennaro & P Greenaway, Nucleic Acids Res 11:3855-3861, 1983; H Lockman & JB Kaper, J Biol Chem 285:132722-132726, 1983; JJ Mekalanos et al, Nature 306:551-557; A Kurosky et al, J Biol Chem 252:7257-7264, 1977; CY Lai, J Biol Chem 252:7249-7256, 1977). Vertailu meidän rekombinanttisen CTB:mme (peräisin V. cholerae 0395 klassisesta kannasta) ja mainittujen muiden sekvenssien välillä 10 on esitetty kuviossa 2.
1.2. tacP-kontrolloidun CTB-geenin ilmentäminen V.choleraessa
Plasmidi pJS162, joka sisälsi CTB-geenin tacP-kontrollin alaisena (kuvio 1) siirret-15 tiin konjugoimalla apuna olleesta E. coli -kannasta, S17-1 (R Simon et al, Biotechnology 2:784-791, 1983) joko V. cholerae 01 -kantaan JBK70 (El Tor -biotyyppi) (JB Kaper et al, Nature 308:655-658, 1983) tai muuhun El Tor- tai klassiseen V. cholerae -kantaan. Tämän siirron aikaansaamiseksi pJS162 plasmidi DNA eristettiin ensin uudelleen E, coli HB 101 -kannasta ja lisättiin se E. coli S17-1 -kantaan trans-20 formaatiolla käyttäen samoja menetelmiä, Maniatis et al (1982, joihin edellä viitattiin. Transformoituja S17-1-soluja käytettiin sitten antajaorganismeina konjugointi-kokeissa, joissa oli monia V. cholerae -saajakantoja. Konjugoinnit tehtiin seuraavasti. Transformaaliset S17-l-antajaorganismit ja saaja- V. cholerae -soluja kasvatettiin 10 ml:ssa LB-alustaa, johon oli lisätty sopivia antibiootteja 37 °C:ssa yön yli : 25 ilman sekoitusta. Jokaisesta kasvatuksesta 3 ml bakteerisuspensiota suodatettiin sit ten MilliporeR-suodattimen läpi, tyyppi GS 0,22 m, käyttäen apuna mäntää, ensin antaja- ja sitten saajasolukasvatus, jolloin siten solut saatiin läheiseen kontaktiin keskenään suodattimen pinnalla. Suodatin laitettiin sitten varovasti LB-agarin pinnalle ilman antibiootteja ja sitä kasvatettiin 37 °C:ssa noin 3 tuntia. Sen jälkeen suo-30 datin siirrettiin koeputkeen, jossa oli 5 ml LB-alustaa, bakteeri suspendoitiin sekoittamalla koeputkeen, ja noin 0,1 ml bakteerisuspensioseosta kasvatettiin sitten LB-alustalla antajasolujen sopivassa antibioottivalinnassa. Bakteeriseosta kasvatettiin LB-alustalla, jossa oli 50 U/ml polymyksiini B:tä ja 100 pg/ml ampisilliinia saaja-solujen vastavalintaa varten, kun V. cholerae -kannat El Tor -biotyypistä olivat 35 pJS162 plasmidin saajia. Kun plasmidia siirrettiin klassista biotyyppiä oleviin V. cholerae -kantoihin, eristettiin ensin näiden kantojen rifampisiiniresistantteja johdannaisia, ja valinta näissä esimerkeissä vastaanottajan rifampisiiniresistantti vibrio- 10 104496 kannoille tehtiin käyttämällä LB-alustaa, jossa oli 50 pg/ml rifampisiinia ja 100 pg/ml ampisilliinia.
CTB:n tuotto V. cholerae -kannoilla, joihin pJS162-plasmidi oli siirretty, määritet-5 tiin seuraavasti. Induktiota varten isopropyyli-B-D-tio-galaktopyranosidin (IPTG) kanssa viljelmiä kasvatettiin 37 °C:sssa haluttuun optiseen tiheyteen asti (A/0) LB-alustalla, johon oli lisätty antibiotteja ja tämän jälkeen IPTG:tä haluttuun konsent-raatioon asti. Kasvatusta jatkettiin neljä tuntia ja solut ja supematantti erotettiin sentrifugoimalla. Solupelletit pestiin varovasti ja suspendoitiin uudelleen alkutila-10 vuuteen kylmään fosfaattipuskuriin, pH 7,2, ja sitten ne rikottiin kaksi kertaa 30 sekunnin äänihajotuskäsittelyllä käyttämällä minikoetinta (Branson-äänilähde). CTB:n tasot viljelmäsupematanteissa ja särkyneissä soluissa määritetiin jälkeenpäin GM1-ELISA menetelmällä käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta LT39 (A-M Sven-nerholm & J Holmgren, Curr Microbiol 1:19-23, 1978). Plasmidin pJS162 konju-15 gaalinen siirto toksiinipoistettuun JBK70 V. cholerae -kantaan johti tuottoon 40-50 pg/ml CTB tästä kannasta LB-alustalla kasvatuksen ja IPTG-lisäyksen jälkeen; yli 95 % tästä CTBistä erittyi kasvatusalustaan (kuvio 3). CTB:n ekspressio tasoille 50-100 pg/ml myös saavutettiin muilla toksiini- tai CTA-poistetuilla klassisilla ja El Tor -kannoilla, joihin oli siirretty pJS 162-plasmidi, ja kun näitä kantoja oli kasvatet-20 tu IPTG:n läsnäollessa (taulukko 1). Tämä edusti selvää CTB:n yliekspressiota verrattuna tasoihin, joita tuotetaan monilla villeillä tyypeillä tai rekombinanttisilla V. cholerae -kannoilla, joita on tutkittu, mukaanlukien hypertoksigeeninen 569B-kanta, jota tällä hetkellä käytetään rokotteiden valmistuksessa CTB:n valmistukseen. Koska rekombinanttinen CTB, jota pJS 162 koodaa, erittyi solujen ulkopuolelle tuo-25 tettaessa sitä V. choleraella, sitä voidaan helposti puhdistaa päästen suuriin saanto-hin jonkin näiden kantojen kasvatusupematanteista käyttämällä esimerkiksi saajas-pesifistä affmiteettikromatografiaa lyso-GMl-gangliosidilla (17), ks. jäljempänä oleva esimerkki 4.
n 104496
Taulukko 1 CTB:n yliekspressio tacP-promoottorista V. choleraessa
Kanta_Fenotyyppi_CTB (ug/ml)
Ekspressoituva CTB tacP- promoottorista___ JBK70(pJS162)_E1 Tor Inaba CTA-* CTB- 75_ JS 1569# (pJS162)_klassinen Inaba CT A- CTB+ 75_ JS1395(pJS162)_klassinen Ogawa CTA- CTB+ 54_
Ekspressoituva CT tai CTB
omasta promoottorista___ 569B_klassinen Inaba CTA+ CTB+__C28_ CVD103 klassinen Inaba CTA-CTB+ 0,88 (569B-johdannainen)___
Kaikkia kantoja kasvatettiin sama aika 30 °C:ssa. Kantoja, joissa oli pJS162, kasva-5 tettiin Λ500 1,0 ennen IPGT-lisäystä 100 pg/ml, minkä jälkeen kasvatus jatkui neljä tuntia.
* Indikoi ei-funktionaalista (CTA-) tai funktionaalista (CTA+) CTA geeniä ja/tai ei-funktionaalista (CTB-) tai funktionaalista (CTB+) CTB geeniä. Kannat valmistettiin 10 geenien poistolla.
# Kannat JS 1569 ja JS 1395 ovat rifampisiiniresistenttijohdannaisia kannasta CVD103 ja CVD101 (0395 CTA-johdannainen) vastaavasti. CTB tasot, joita tuo-tetiin jälkimmäisillä kannoilla ilman IPGTra, olivat vähemmän kuin 0,5 pg/ml ja ei- 15 vät siksi parantaneet merkittävästi arvoja indusorin ollessa läsnä.
Esimerkki 2 CTB :n yliekspressio käyttämällä konstitutiivista tacP-promoottoria 20 Tässä rakenteessa CTB geeni plasmidissa pJS162, joka on selitetty esimerkissä 1 edellä, leikattiin ja asetettiin plasmidivektoriin pKK223-l, joka sisältää tacP-promoottorin, mutta ei laclq-geeniä, joka on plasmidissa pJS162, joka on vastuussa IPT G-riippuvuuudesta.
: 25 12 104496
Samoja standardimenetelmiä käytettin plasmidi DNA:n eristämiseen ja DNA:n leikkaamiseen, ligaatioon ja siirtoon E, coliin ja konjugaatioon V. choleraen, kuten esimerkissä 1. CTB-geeni plasmidissa pJS162 leikattiin EcoRI-Hindlll-ffagmenteiksi ja ligatoitiin EcoRI-Hindlll-restriktoituun plasmidiin pKK223-l (Pharmacia, Uppsa-5 la, Ruotsi), joka sisälsi tacP-promoottorin vastavirrassa EcoRI-paikan kanssa. Tästä syntyi plasmidi pJS7523-l, joka siirrettiin E. coliin transformaatiolla, ja se siirrettiin myös V. cholerae-kantoihin JBK70 ja JS 1395 konjugaatiolla apuna E, colin auttaja-kanta S17-1, Laclq-geeni plasmidissa pJS162 koodaa suurta määrä lacl-repressoria ja tämän geenin poissaolo plasmidissa pJS7523-l johtaa melkein IPTG-riippumatto-10 maan CTB:n ekspressioon tacP-kontrollin alla bakteerikannoilla, joissa on pJS723-l plasmidi. Tämä testattiin kasvattamalla E. coli 101-soluja, joissa oli plasmidi pJS7523-l LB-alustalla, jossa oli 100 pg/ml ampisilliinia 37 °C:ssa optiseen tiheyteen A^oo 1,0 rinnakkaisissa koeputkisarjoissa, ja sitten lisättiin IPTG:tä 100 pg/ml toiseen sarjaan, muttei toiseen, ja bakteeriviljelmän inkubointia jatkettiin toiset 4 15 tuntia 37 °C:ssa. Viljelynäytteet laitettiin sitten ultrasonikaattoriin kahdeksi 30 sekunnin äänikäsittelyksi minimittapäätä käyttäen (Bransonin äänilähde) tarkoituksena solujen hajottaminen, ja sentrifugoinnin jälkeen ultrasonikaatiolla käsitellyt viljelmät analysoitiin niiden CTB-pitoisuuden suhteen käyttäen GMl-ELISA-menetel-mää, joka on selitetty esimerkissä 1. Saadut tulokset osoittivat, että suhteellisen kor-20 keitä CTB tasoja 2-7 pg/ml tuotettiin IPTG:n ollessa täysin poissa, ja nämä tasot olivat vain 2-3 kertaa matalampia kuin saavutettiin IPTG:n läsnäollessa.Tämä on dramaattisesti vastaan IPTG:n vaikutusta CTB:n ekspressiossa tacP:n kontrollin alla plasmidissa pJS162, jossa IPTG:n poissaollessa CTB:n tasot ovat niin alhaisia, että niitä ei havaita (ks. esimerkki 1, kuvio 2). Siten vaikka CTB-ekspressiota plasmidis-25 sa pJS7523-l yhä säätää lacl-laktoosioperonirepressori, nämä tulokset osoittavat, että ekspressio on osaksi konstitutiivinen. Tämä johtuu ehkä siitä tiedosta, että kro-mosomaalisesti koodattu lacl-repressoria ei muodostu riittävästi sitomaan tehokkaasti sekä lac-operaattori kromosomiin ja tacP-plasmidiin pJS7532-l, jolla on suuri kopioluku.
30 , Esimerkki 3 CTB:n ekspressio T7-polymeraasiriippuvaisesta promoottorista 35 Tässä esimerkissä todistamme, että on myös mahdollista saavuttaa CTB:n ylieks-pressio saattamalla CTB-geeni toisen vahvan vieraan (ei-kolera toksiini) promoot- 13 104496 torin ekspressiokontrollin alaiseksi, joka on T7 RNA -polymeraasista riippuvainen promoottori.
CTB:n rakennegeeni (sisältäen LTB-johtopeptidiä koodaavan sekvenssin), jonka 5 plasmidi pJS162 sisältää, leikattiin uudelleen ja asetettiin T7-5-plasmidivektoriin, joka sisältää korkeasti spesifisen ja vahvan T7-RNA-polymeraasi riippuvaisen promoottorin (S Tabor ja CC Richardson, Proc Natl Acad Sei USA 82:1074-1078, 1985). Ekspressio tästä promoottorista vaatii T7 RNA -polymeraasin läsnäolon, joka on varustettu täydentävällä plasmidilla (pGPl-2); tämä plasmidi, joka koodaa RNA-10 polymeraasin, ekspressoituu itse sellaisen promoottorin kontrollin alla, joka voidaan indusoida muuttamalla kasvatuslämpötilaa (tavallisesti 30 °C:sta 42 °C:een).
Menetelmät, joita käytettiin plasmidi DNA:n eristämiseen ja DNA:n leikkaamiseen, ligaatioon, transformaatioon E. coliin ia konjugaaliseen siirtoon V. choleraen. olivat 15 oleellisilta osiltaan samat kuin ne, joita on kuvattu esimerkissä 1. CTB-plasmidissa pJS162 leikattiin EcoRI-HindHI-fragmentiksi. joka sitten liitettiin EcoRl-HindiII-lyhennettyyn plasmidivektoriin pT7-5 (saatu tri S Taborilta, Harvardin yliopisto, Mass, USA). Tuloksena ollut uusi plasmidi siirrettiin sitten E. coliin 101, jossa oli plasmidi pGPl-2 (myös saatu tri Taborilta). Kun näitä transformoituja E. coli -orga-20 nismeja kasvatettiin LB-alustalla, jossa oli sopivat antibiootit suhteessa soluissa oleviin kahdenlaisiin plasmideihin (kanamysiini 50 pg/ml; ampisilliini 100 pg/ml), solut eivät tuottaneet havaittavia määriä CTB:tä 30 °C:ssa, kun myöhempi muutos kasvatuslämpötilassa 30 °C:sta 42 °C:een johti ekspressioon 2-3 μg/ml CTB E, co-lissa analysoitaessa GMl-ELISA-menetelmällä. CTB-geeni yhdessä T7 RNA -pol-: 25 meraasiriippuvaisen promoottorin kanssa kloonattiin sitten myös PvuII-HindHI- lisäyksellä EcoRV-Hindll-lyhennettyyn plasmidiin pBR325. Uusi plasmidi (pJS7525) siirrettiin sitten E. coli -kannasta, jossa oli plasmidi pRK2013, V. chole-raen JBK70, johon oli aiemmin siirretty konjugoimalla plasmidi pGPl-2 samasta E. coli -antajasta. Kahden plasmidin läsnäolo oli mahdollista, koska niillä on replikaa-30 tion suhteen yhteensopivat alkuperät, ja koska pJS7525 koodaa resistanssia kloram-fenikolia (ja ampisilliinia) vastaan kun taas pGPl-2-plasmidilla on geeni kanamy-siiniresistanssia vastaan. Kun V. cholerae JBK70, joka sisälsi plasmidit pJS725 ja PGPl-2, kasvatettiin LB-alustalla, jossa oli 25 pg/ml kloramfenikolia ja 50 pg/ml kanamysiinia, korkeaan optiseen tiheyteen 30 °C:ssa organismit tuottivat havaitse-35 mattomia määriä CTB.tä, kun taas muutos kasvatuslämpötilassa 42 °C:een sai aikaan ennustetun T7 RNA -polymeraasiriippuvaisen lisäyksen CTB ekspressiossa tasoille 75-100 pg/ml CTB V. cholerae -kasvatussupematanteissa. Tässä esimerkissä 14 104496 kuvatut tulokset osoittivat selvästi sekä sen, että CTB yliekspressio useilla vierailla (ei-koleratoksiini) promoottoreilla on mahdollistaja myös sen, että yliekspressio on riippumaton toxR-säätelysysteemistä, kun yksi tekijöistä, jotka johtavat korkeaan CTB-ekpressioon, kuten toxR, vaikuttaa, on kasvatuslämpötila 30 °C:n ympärillä 5 (MJ Betley et ai, Ann Rev Microbiol 40:577-605,1986). Tässä kuvattu indusoitava menetelmä oli minimissä toxR optimilämpötilassa ja maksimissa toxR ei-optimiläm-pötilassa.
Esimerkki 4 10 V. choleraessa olevan plasmidin pJS162 koodaaman rekombinanttisen CTB:n tunnistaminen
Olemme kuvailleet rekombinanttisen CTB:n, jota on valmistettu edellisissä esimer-15 keissä mainittujen rakenteiden avulla, joitain ominaisuuksia. Tuloksemme, joita tässä esimerkkinä edustaa plasmidin pJS162 koodaama puhdistettu CTB ekspressoitu-neena V. choleraessa, osoittaa sen, että rekombinanttinen CTB, huolimatta muutamista aminohappoeroista, ei ole huomattavasti erilainen kuin CTB, joka on puhdistettu villin V. cholerae -tyypin 569B koleratoksiinista tutkituilta rakenteellis-toimin-20 nallisilta ja immunologisilta ominaisuuksiltaan.
4.1. CTB:n puhdistaminen ja aminopään määrittäminen V. cholerae El Tor JCK70 -organismeja, joissa on plasmidi pJS162, kasvatettiin : 25 30 °C:ssa jatkuvassa ravistelussa 2 1 LB -alustalla, jossa oli 100 pg/ml ampisilliinia ja 100 pg/ml IPGT. Kasvatuksen jälkeen bakteeri ja bakteerijäte poistettiin sentrifu-goimalla ja rekombinanttinen CTB puhdistettiin affiniteettikromatografialla lyso-GM1 gangliosidi-SpherosilR -kolonnissa käyttäen menetelmää, jonka on kuvannut JL Tayot et ai, Eur J Biochem 113:249-258, 1981. Puhdistetusta CTB:sta määritet-30 tiin aminoloppuiset jäämät, kuten on kuvaillut H von Bahr-Lindström et ai, J Prot Chem 1:257-262, 1982.
Rekombinanttisen CTB:n prekursoripeptidin katkeamisen voitaisiin luonnollisesti ennustaa tapahtuvan joko yhdessä tai molemmissa alkuperäisissä johtopeptidaasi-35 tunnistuspaikoissa LTB:ssa tai CTB:ssa. Ensimmäisen aa:n tunnistuksesta puhdistetusta proteiinista oli tuloksena sekä Tyr- että Ala-jäämät. Tämä ja se tosiasia, että rekombinanttinen CTB oli hieman suurempi kuin natiivi CTB, määritetty nat- 15 104496 riumdodekyylisulfaattipolyakryylamidigeelielektroforeesilla (N aDodS04/P AGE), ks. kuvio 4, näytti, että johtoproteiinin proteolyyttinen prosessointi oli tapahtunut seuraavassa välissä: linkkerin koodama Gly (asemassa -5) ja Tyr -4, kuten myös välissä jälkimmäinen aa ja Ala -3, ks. kuvio 2. Kun käsitellyn CTB:n jäännöksen ami-5 nopäätä määritettiin uudelleen, tunnistettiin nyt Ala- ja His-jäämät, mikä vahvisti ennustettuja katkeamispaikkoja ja antoi todistetta siitä, että rekombinanttisella CTB:llä oli lyhyitä peptidipidennöksiä sen aminopäässä käsittäen joko 3 tai 4 aa.
4.2. Reseptorin tunnistaminen ja reseptorin blokkausominaisuudet 10
Muutaman ylimääräisen aa:n läsnäolo CTBrssä ei vaikuttanut sen GM 1-reseptorin tunnistamiseen. Rekombinanttisen CTB:n ja puhdistetun vertailu-CTB:n, kanta 569B (lahja Dr J Armandilta, Institut Merieux, Ranska), sitoutumisaffiniteettia muo-vipäällysteiseen GMl-gangliosidiin verrattiin kokeilemalla erilaisia pitoisuuksia 15 käyttämällä GM 1 -ELISA-menetelmää ja mitään eroa ei paljastunut. GM 1 -gangliosi-din korkean sitoutumisaffiniteetin retentiota käytettiin itse asiassa hyväksi CTB:n puhdistamisessa lyso-GMl-SpheroliR:lla, kuten edellä on kuvattu.
Kokeita tehtiin myös määrittämään rekombinanttisen CTB:n kyky verrattuna 569B 20 CTB:n kykyyn blokata koleratoksiinireseptorit rottien suolistossa. Nämä kokeet tehtiin siten, että joko CTB-preparaatit injektoitiin eläimen sidottuihin suoliston-mutkiin noin 10 minuuttia ennen puhdistetun koleratoksiin injektioannosta (0,2 pg), jonka tiedettiin indusoivan valtavan nesteen erittymisen (kokeellinen kolera) spesifisen reseptoriblokkauksen ollessa poissa (yksityiskohtaiset menetelmät on kuvaillut J : 25 Holmgren et ai, Infect Immun 38:424-433, 1982). Saadut tulokset osoittivat, että re- kombinanttisilla ja 569B CTB -preparaateilla oli samanlainen reseptoria blokkaava aktiivisuus. Molemmat preparaatit kykenivät täysin estämään koleraerittymisen, kun niitä lisättiin noin 5 cm:ä pitkiin sidottuihin suolistomutkiin 50 pg 1 ml:n tilavuutena juuri ennen koleratoksiinin injektiota (569B V. cholerael mutkiin. Kim kontrolli-30 na mutkia esikäsiteltiin pelkästään puskurilla CTB:n sijasta ja sitten injektoitiin sa-. ma annos koleratoksiinia, huomattava määrä nestettä kerääntyi, 1,7+-0,2 ml/cm, ja mutkissa, joita esikäsiteltiin 10 pg.lla tai pienemmillä CTB-määrillä ennen toksiinille altistusta, nesteen akkumulointi aleni osaksi tai ei ollenkaan, kun sitä verrattiin puskuri-esikäsiteltyihin kontrolleihin.
35 16 104496 4.3. Oligomerisointi ja kyky yhdistyä A-alayksikön kanssa
Toisissa kokeissa nähtiin, että rekombinanttinen CTB oli myös muuntumaton sen kyvyssä sekä oligomeroitua ja yhdistyä koleratoksiinin A-alayksikön kanssa (CTA). 5 Näitä tutkimuksia varten puhdistettua CTA.ta (valmistettu kannasta 569B CT; List Biological Laboratories) sekoitettiin puhdistetun rekombinanttisen tai 569B CTB:n kanssa tavallisessa CT:ssä löydettävässä molaarisessa CTB:n suhteessa CTA:han siten, että kokonaisproteiinipitoisuus oli 200 pg/ml. Sekoituksen jälkeen näytteet tehtiin happamiksi 0,2 M glysiinipuskurilla pH 2,7 ja sitten neutraloitiin dialyysillä 10 yli yön 0,05 M Tris-puskuria pH 8,0 vastaan, jota vaihdettiin usein. Neutraloidut näytteet testattiin sitten GMl-ELISA:lla alayksikköspesifisillä monoklonaalisilla vasta-ainella, joita on kuvaillut SJS Hardy et ai, Proc Natl Acad Sei USA, painossa 1988. 569B CTA -määrät, jotka yhdistyivät rekombinanttisen tai 569B CTB:n kanssa muodostaen holotoksiinin, laskettiin käyttäen käsittelemätöntä vastaavaa kolera-15 toksiinia referenssinä. Tulokset on esitetty taulukossa 2. Ne osoittavat immunore-aktiivisen CTB:n korkeata takaisinsaamista, mikä on suora pentameerin mittaus mieluummin kuin monomeerinen CTB, koska tunnistavan CTB-spesifisen mo-noklonaalisen vasta-aineen tiedetään reagoivan vain B-pentameerimuodon kanssa. Ne osoittivat myös korkean immunoreaktiivisen CTA:n saannon, mikä on suora 20 mittaus CTA.n määrästä, joka on yhdistyneenä CTB:n kanssa, koska yhdistymätön CTA ei sitoutuisi GMl-pinnoitettuihin muovikuiluihin, jolloin sitä ei tunnisteta. Rekombinanttinen CTB ja puhdistettu referenssi 569B käyttäytyivät hyvin samalla tavoin näissä kokeissa (taulukko 2).
·· 25 Taulukko 2
Rekombinanttinen CTB:n affiniteetti CTA:ta kohtaan CTA:n yhdistyminen Alayksikön määrä holotoksiinissa määritettynä _GMl-ELlSA-menetelmällä_ ♦ _CTA pg/ml_CTB pg/ml_ 569 BCTB:n kanssa_ 43,3 (65 %)#_ 114,0 (86%)_
Rekombinanttisen CTB:n kanssa 42,0 (63 %)_ 109,6 (82 %)_ 30 # Prosentteina ilmaistut arvot viittaavat alayksikön fraktioon CT:ssä laskettuna suh- . teessä teoreettiseen maksimimäärään holotoksiinissa.
104496 17 4.4. Rekombinanttien CTB:n immunologiset ominaisuudet
Aikuisille kaneille annettiin kolme ihonalaista immunisaatiota 30 μg rekombinanttis-ta CTB.tä tai 569B CTB:tä 2 viikon välein tapahtuvin rokotuksin. Proteiinit annet-5 tiin täydellisellä Freundin adjuvantilla ensimmäisessä siirrostuksessa ja sitten epätäydellisellä adjuvantilla. Kahden viikon kuluttua kolmannesta immunisaatiosta eläimistä otettiin veret talteen ja seerumi kerättiin analysointia varten.
Ouchterolonin kaksoisdiffuusio geelissä -immunosaostusanalyysi tehtiin mikrokam-10 miosysteemiä käyttäen, jonka on kuvaillut C. Wadsworth, Int Arch Allergy 17:165-177, 1957. Kokeet tehtiin puhdistetulla rekombinanttisella CTBillä ja 569B CTB.llä ja vastaavien rottaimmunoseerumien ollessa reagoivina aineina. Tulokset osoittivat immunosaostusvyöhykkeiden yhteensulautumisen ilman mitään "ulokkeita" rekom-binanttisen ja natiivin CTB.n välillä, mikä osoitti immunologisen samankaltaisuuden 15 (kuvio 5).
Antitoksiinivasta-aineiden titraus rottien immuniseerumeilla rekombinanttista ja 569B CTB:tä vastaan, vastaavasti, tehtiin GMl-ELISA-menetelmällä käyttäen puhdistettua rekombinanttista ja 569B CTB:tä antigeeneinä sitoutuneina GM1-20 pinnoitettuihin levyihin (A-M Svennerholm et ai, J Infect Dis 147:514-521,1983). Anti-CTB-tiitterit GMl-ELISA-menetelmässä olivat samanlaisia, vaihdellen välillä 4x105-1x106 antirekombinanttisella ja anti-569B CTB:lle, kun molempia CTB-preparaatteja testattiin kiinteäfaasi antigeeninä.
·* 25 Neutralisoidut vasta-aineet analysoitiin ihotestimenetelmällä, JP Craig (Nature 207:614-616,1965) käyttäen puhdistettua 569B CT:tä testitoksiinina. Lämmöllä inaktivoitua seerumia sekoitettiin laimennossarjaan yhtä suurissa tilavuuksissa puhdistettua 569B, CT, 40 ng/ml fysiologisessa fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, jossa oli 10 mg/ml häränseerumialbumiinia, ja 0,1 ml seosta testattiin sitten jääntei-30 den toksisuuden suhteen ihonalaisella injektiolla. Neutralisoidut antitoksiinitiitterit .. eivät myöskään eronneet seerumeiltaan kumpaakaan rekombinanttista CTB:tä tai 569B CTB:tä vastaan. Molemman tyyppiset antiseerumit kykenivät täysin neutraloimaan 2 ng CT:tä konsentraatioihin niin alas kuin 1x10^ asti.
• · is 104496
Esimerkki 5
TacP-johdettu hybridi-CTB-geenifuusioproteiinin yliekspressio 5 Esimerkissä 1 kuvatut manipulaatiot CTB-geenin asettamisesta tacP-kontrollin alaiseksi sisälsivät tarkoituksella yksittäisten entsyymien restriktiopaikkojen lisäämisen geenifuusiota varten CTB:n aminopäähän. Kloonaus näihin paikkoihin mahdollistaa CTB-peräisten hybridiproteiinien rakentumisen, joissa on esimerkiksi useita oletettuja rokotepeptidiantigeeneja, jotka ovat myös samojen vieraiden promoottorien 10 ekspressiokontrollin alaisina, esimerkiksi tacP, kuten on kuvailtu CTB:n itsensä kohdalla edellisissä esimerkeissä. Tämän lähestymistavan mahdollisuutta on esitetty esimerkillä tässä lämpöstabiilin E. colin enterotoksiini(STa)-tyyppisen peptidin, synteettisen oligodeoksinukleotidin koodaama, fuusiona CTB:n aminopäähän tacP-johtamassayliekspressiojäijestelmässä.
15 5.1. Konstruoimisen kuvaus
Plasmidi pJS 162, joka sisältää yksittäiset Sacl- ia Xmal (Smal)-restriktiopaikat liitoskohdassa, joka on johtopeptidin ja valmiin CTB:n välillä (ks. kuvio IB), järjes-20 teltiin yhteensopivien kahden entsyymin kanssa ja ligatoitiin synteettiseen oligo-deoksinukleotidiin, joka koodaa STa-sukuista dekapeptidiä Cys-Ala-Glu-Leu-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys Sacl- ja Xmal-yhteensopivien päiden kautta (kuvio 6). Tuloksena oleva pJS8-plasmidi varustettiin tällä tavoin, tacP-promoottorin kontrollin alaisena, hybridigeenin kanssa, jotka koodaa fuusioproteiini, jossa STa-sukuinen dekapeptidi, : 25 jota reunustivat muutamat ylimääräiset aminohapot, oli kovalenttisesti sidottu val miin CTB:n aminopäähän kuten kuviossa 6 on esitetty. Fuusioidun STa-sukuisen dekapeptidin sekvenssi oli samankaltainen natiivi STaissa olevan alueen kanssa lukuunottamatta kysteiinijäämän substituutiota alaniinin kanssa. Valittu sekvenssi perustui aiempiin havaintoihin ei-toksisen synteettisen nonadekapeptidin kapasiteetis-30 ta, joka sisälsi tämän aminohappokorvauksen spesifisesti sitomaan anti-STa-.. monoklonaalinen vasta-aine, jolla on kyky neutraloida E. coli STa (A-M Svenner- holm et ai, FEMS Microbiol Lett, painossa 1988). Tässä fuusioitu sekvenssi on kuitenkin lyhyempi, ja se käsittää vain 10 aminohappoa sisältäen neljä kysteiiniä.
35 Koemenetelmät ja reagenssit, joita tässä rakenteessa käytettiin, on eritelty jäljempänä. E. coli -kantaa HB 101 käytettiin lyhytaikaisena isäntänä plasmidieristyksissä. V. cholerae kanta JS 1569 on rifampsiiniresistantti johdannainen kannasta CVD103. E.
19 104496 colia S17-1 käytettiin konjugaalisena plasntidien siiirtäjänä kantaan JS 1569. Lähde ja näiden kantojen myöhemmät ominaisuudet on kuvattu esimerkissä 1. Plasmidi DNA.n eristys alkalilyysi-menetelmällä sisältäen sentrifugoinnin CsCl/etidiumbro-midigradientissa, DNA-transformaatiot E. coliin ja konjugaatiot V. choleraeen teh-5 tiin myös Maniatis et ai (1982) mukaan, kuten on eritelty esimerkissä 1. Olosuhteet, joita käytettiin DNA:n restriktioon ja ligaatioon olivat erilaisten entsyymien valmistajien suosittelemia. Entsyymit hankittiin Boehringer-Mannheimilta ja New England Biologioilta. Synteettiset oligodeoksinukleotidit, jotka koodaavat STa-sukuista de-kapeptidia ja läheisiä aminohappoja hankittiin täydennettävinä yksittäisinä säikeinä, 10 Department of Immunology (Lena Samuelsson), Biomedical Centre, Uppsala, Ruotsi. Niiden parien muodostamisen jälkeen, huoneen lämpötilassa olosuhteissa, jotka on kuvattu esimerkissä 1, synteettinen kaksoisketjuinen oligodeoksinukleotidi sisälsi yksisäikeiset päät, jotka sopivat yhteen Sacl 5'-pään ja Xmal 3'-pään kanssa.
15 5.2. ST-dekapeptidi/CTB-fuusioproteiinin tacP-ohjattu ilmentäminen E. coli 101- tai V. cholerae JS1569 -viljelmiä, joissa oli pJS8-plasmidi, kasvatettiin yön yli tai siihen asti, kunnes ne saavuttivat halutun optisen tiheyden (600 nm) jatkuvassa ravistelussa 37 °C:ssa (E. coli) tai 30 °C:ssa (V. cholerae) nestemäisellä 20 LB-alustalla, jossa oli ampisilliinia (100 pg/ml) ja/tai rifampisiinia (50 pg/ml), tarkoituksenmukaisesti. Yliekspression induktio tacP-promoottorista isopropyyli-B-D-tio-galaktopyranosidilla (IPTG) saatiin aikaan joko sen lisäyksellä kasvatuksen alussa (0,4 mM loppukonsentraatio) tai kasvattamalla ensin kantoja O.D.60o 0,5 induso-rin poissaollessa ja lisäämällä sitten IPGT ja jatkamalla kasvatusta toiset 4 tuntia : 25 ennen tuotteen talteenottoa. Kasvatuksen jälkeen bakteerisolut ja kasvatussupema-
tantit erotettiin sentrifugoimalla 5 minuuttia mikrosentrifugissa (Eppendorf). Solu-pelletit suspendoitiin uudelleen kylmään fosfaattipuskurisuolaliuokseen (pH 7,2) ja rikottiin kahdella 30 sekunnin äänihajottamisella (Branson-äänilähde). STa-ja CTB-antigeenien tunnistaminen supematanteista ja solusonikaateista tehtiin GM1-ELISA-30 menetelmällä kuten on kuvattu käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita, joita kohdis-. tettiin natiivi STa:ta ja CTBitä vastaan, molempia erikseen (J Sanchez et ai, FEBS
Letters 208:194-198,1986).
STa-sukuinen dekapeptidi-CTB-hybridi, jota koodaa pJS8, identifioitiin alunperin 35 transformoidussa E. coli 101 kannassa, jota kasvatettiin IPTG:n läsnäollessa kuten edellä on kuvattu. Plasmidi pJS8 siirrettiin myöhemmin konjugoimalla auttaja-E. • coli -kannasta (S 17-1) V. choleraeen JS 1569 (käyttäen esimerkissä 1 kuvattuja me- 20 104496 netelmiä). Hybridigeenin ekspressiota tässä organismissa tutkittiin sitten kasvattamisen jälkeen, kun erilaisia pitoisuuksia IPGT:tä lisättiin logaritmisen kasvun aikana, ja dekapeptidi-CTB-proteiinin sijoittuminen solussa määritettiin kuten määritettiin pelkän CTB:n, kuvattu esimerkissä 1. Tulokset kuviossa 7 osoittavat, että hybridi-5 proteiinia tuotettiin selvästi IPTG-riippumattomalla tavalla, ja sitä erittyi solun ulkopuoliseen tilaan. Tällainen dekapeptidi-CTB-sijaitseminen mahdollisti sen puhdistamisen lyso-GMl-affmiteettikromatografialla samoin kuin pelkän rekombinanttisen CTB:n esimerkissä 4.
10 5.3. Geenifuusio-dekapeptidi/CTB-hybridiproteiinin ominaisuudet
Dekapeptidi-CTB-ominaisuuksien tutkimista varten hybridiproteiini puhdistettiin V, cholerae -kannan JS 1569, jossa oli plasmidi pJS8, kasvatussupematanteista yksivaiheisella affiniteettikromatografialla, olennaisilta osin JL Tayotin et ai mukaan, Eur J 15 Biochem, 113:249-258, 1981.
Viisi pg puhdistettua proteiinia tai referenssi-CTB:tä laitettiin elektroforeesiin 13,5-prosenttisille SDS-polyakryyliamigeeleille ilman β-merkaptoetanolia. Proteiininäyt-teet joko keitettiin tai jätettiin huoneen lämpötilaan näytepuskurissa ennen elektrofo-20 reesia, jossa analysoitiin proteiinit niiden pentameerisissa ja monomeerisissa muodoissa (ks. TR Horst & J Holmgren, Proc Natl Acad Sei USA; 84:7418-7422, 1987). Erotetut proteiinit siirrettiin sitten sähköisesti nitroselluloosaan reaktioita varten an-ti-STa- tai anti-CTB-monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, minkä jälkeen niitä inkuboitiin anti-hiiri-IgG:n kanssa, joka oli kytketty peroksidaasiin (Jackson Biolo-25 gicals). Immunoreaktiiviset proteiinivyöhykkeet kehitettiin lopuksi käyttäen a-kloro-naftolisubstraattia. Tulokset näkyvät kuviossa 8. Reaktio anti-CTB:llä toi esiin vyöhykkeet odotetuissa paikoissa kontrolli-CTB:n tai STa-sukuisen dekapeptidi-CTB:n hybridiproteiinin pentameerisille muodoille. Keitettyjen ja keittämättömien näytteiden inkubointi erikseen anti-STa-moonoklonaalisten vasta-aineiden kanssa kehitti 30 vyöhykkeitä vastaten dekapeptidi-CTB:n pentameerisia ja monomeerisia muotoja, mutta antoi negatiivisen reaktion sekä kontrolli-LCTB:n pentameerisen että mono-meerisen muodon kanssa. CTB:n monomeerinen muoto ei reagoinut anti-CTB:n kanssa, kun taas dekapeptidi-CTB:n monomeerisen muodon pieni reaktio tämän vasta-aineen kanssa havaittiin.
35
Dekapeptidi-CTB-proteiini ei osoittanut toksisuutta, kun sitä kokeiltiin määrinä ·· 10 pg asti nuorilla hiirillä vatsansisäisinä injektioannoksina, jotka tehtiin, kuten on 21 104496 kuvannut A-M Svennerholm et ai, FEMS Microbiol Letters, painossa, 1988. Samanaikaisesti testattu puhdistettu natiivi STa (saatu tri A-M Svennerholmilta) antoi positiiviset testit nuorilla hiirillä alhaisilla määrillä 1 ng, joka on 10 000 kertaa alhaisempi annos. STa-sukuinen dekapeptidi-CTB-hybridiproteiini kykeni tehokkaasti 5 sitomaan anti-STa-monoklonaalisia vasta-aineita sekä GM 1-ELISA- ja immunotäp-lä-analyyseillä; ks. kuviot 7 ja 8. Hydridiproteiini osoitti lisäksi monia ominaisuuksia, jotka ovat tunnusomaisia CTB-osalle, kuten kyvyn pentamerisoitua, sitoutua GM 1-vastaanottajaan ja kyvyn erittyä V. choleraesta; nämä ominaisuudet määritettiin esimerkissä 4 pelkälle CTB:lle kuvattuja menetelmiä käyttäen.
10
Kun puhdistettua proteiinia käytettiin immunisoimaan rottia, syntyi vasta-aineita, jotka ristireagoivat natiivi-STa:n kanssa. Anti-STa-tiitteri, joka määritettiin ELISA-menetelmällä käyttäen synteettistä, muovipäällysteistä STa:ta kiinteäfaasiantigeeni-nä, kohosi havaitsemattomalta tasolta esi-immunisointiseerumista tiitteriin 1:2000 15 kolmen peräkkäisen immunisoinnin jälkeen, mikä on parempi verrattuna tiittereihin, joita saadaan rotista, joita on immunisoitu kemiallista alkuperää olevilla hybridipro-teiineilla, joissa on natiivi STa. Immunogeenisuus yhdessä toksisuuden puuttumisen kanssa STa-sukuisella dekapeptidi-CTB-proteiinilla ja sen kyky tunnistaa GM1-suolensisäinen reseptori tekee hybridiproteiinista mahdollisen toksoidin suun kautta 20 tapahtuvaan immunisaatioon STa-yhdistynyttä E. coli -ripulia vastaan eläimillä ja ihmisillä.
« •« • 4 »
Claims (6)
1. Yliekspressiojäijestelmä koleratoksiinin sidosalayksikköproteiinin (CTB-pro-teiinin) tai proteiinin tai peptidin, joka on muu kuin E. colin lämpölabiilin entero- 5 toksiinin sidosalayksikköproteiini, valmistamiseksi, jolla on sellaisia ominaisuuksia, jotka aiheuttavat sen tunnistamisen CTB-proteiinia (CTB-johdannaista) vastaan valmistetun immuuniseerumin avulla, jossa järjestelmässä plasmidivektorissa, jossa CTB-proteiinin tai CTB-johdannaista koodaavan geenin ekspressio on ei-koleratok-siinin promoottorin transkriptiokontrollin alaisena, tunnettu siitä, että mainitun pro-10 moottorin ja mainitun geenin ribosominsitomiskohdan välillä ei ole Vibrio cholerae -peräistä DNA:ta ja että CTB-proteiini tai CTB-johdannainen syntetisoidaan E. colin lämpölabiilin enterotoksiinin sidosalayksikköproteiinin johtopeptidin kanssa.
2. System enligt patentkrav 1, kännetecknat av att nämnda CTB-derivat är ett genfusionsprotein. 15
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen järjestelmä, tunnettu siitä, että mainittu CTB-15 johdannainen on geenifuusioproteiini.
3. System enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att icke-koleratoxinpro-motom är tacP-promotom.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen järjestelmä, tunnettu siitä, että ei-kole-ratoksiinin promoottori on tacP-promoottori.
4. System enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att icke-koleratoxinpro-20 motom är T7 RNA polymeraspromotom.
4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen järjestelmä, tunnettu siitä, että ei-kole- ratoksiinin promoottori on T7 RNA -polymeraasipromoottori.
5-CCC GGG-3', 5-TAC CCG GGA GCT-3’, 5'-AGA ATT CAC TGC GCT GAA TTG TGT AAT CCT GCA TGCC-3' eller 5'-CCG GGG CAT GCA GGA TTA CAA CAC AAT TCA GCG CAG TGA ATT CTA GCT-3', eller en oligonukleotid-sekvens som kodar för dekapeptiden NH2-CYS ALA GLU LEU CYS CYS ASN 30 PRO ALA CYS-COOH. • · .
5. System enligt nägot av patentkraven 1-4, kännetecknat av att genen för moget CTB och DNA som kodar för ledarpeptiden har mellan sig minst en oligodeoxinu-kleotidisekvens som är vald frän den grupp som bestär av: 25
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen järjestelmä, tunnettu siitä, että kypsän CTB-geenin ja ei-koleratoksiinin johtopeptidiä koodaavan DNA-sekvenssin 25 välillä on vähintään yksi seuraavista oligodeoksinukleotidisekvensseistä: 5'-CCC GGG-3', 5-TAC CCG GGA GCT-3', 5’-AGA ATT CAC TGC GCT GAA TTG TGT AAT CCT GCA TGCC-3' tai 5'-CCG GGG CAT GCA GGA TTA CAA CAC AAT TCA GCG CAG TGA ATT CTA GCT-3', tai dekapeptidiä NH2-CYS 30 ALA GLU LEU CYS CYS ASN PRO ALA CYS-COOH koodaava oligonukleotidi-sekvenssi.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen järjestelmä, tunnettu siitä, että mainittu plasmidivektori ekspressoidaan Escherichia colissa. Vibrio choleraessa tai 35 muussa Vibrionaceae-bakteerissa, jolta puuttuu kyky syntetisoida koleratoksiinia. 23 104496 1. överexpressionssystem för produktion av det bindande subenhetsproteinet frän koleratoxin (CTB protein) eller ett protein eller en peptid, annat än det bindande subenhetsproteinet frän E. coli värmelabilt enterotoxin, med egenskaper som gör att 5 det kan kannas igen av immunserum som framställts mot CTB-proteinet (CTB-deri-vat), vid vilket, i en plasmidvektor, expressionen av en gen som kodar för CTB-protein eller ett CTB-derivat är under transkriptionskontroll av en icke-koleratoxin-promotor, kännetecknat av att det inte finns nägot DNA av Vibrio cholerae ursprung mellan nämnda promotor och genens ribosombindande ställe, och att 10 nämnda CTB-protein eher CTB-derivat syntetiseras med ledarpeptiden för det bindande subenhetsproteinet frän E. coli värmelabilt enterotoxin.
6. System enligt nägot av patentkraven 1-5, kännetecknat av att nämdna plasmidvektor uttrycks i Escherichia coli. Vibrio cholerae eller andra Vibrionaceae bakterier som saknar förmäga att syntetisera koleratoxin. 35
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE8803291A SE462285B (sv) | 1988-09-16 | 1988-09-16 | Expression av koleratoxinets bindande subenhet med hjaelp av fraemmande promotor- och/eller ledarpeptidstrukturer |
SE8803291 | 1988-09-16 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI894368A0 FI894368A0 (fi) | 1989-09-15 |
FI894368A FI894368A (fi) | 1990-03-17 |
FI104496B true FI104496B (fi) | 2000-02-15 |
Family
ID=20373364
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI894368A FI104496B (fi) | 1988-09-16 | 1989-09-15 | Yliekspressiojärjestelmät kolera B-alayksikön ekspressiota varten vieraiden promoottoreiden ja johtopeptidien avulla |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0368819B1 (fi) |
JP (1) | JP2790333B2 (fi) |
AT (1) | ATE161885T1 (fi) |
AU (1) | AU633842B2 (fi) |
CA (1) | CA1340577C (fi) |
DE (1) | DE68928529T2 (fi) |
DK (1) | DK175694B1 (fi) |
ES (1) | ES2113342T3 (fi) |
FI (1) | FI104496B (fi) |
GR (1) | GR3025846T3 (fi) |
IS (1) | IS1804B (fi) |
NO (1) | NO301175B1 (fi) |
SE (1) | SE462285B (fi) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109096403A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-12-28 | 浙江工商大学 | 一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0416505A3 (en) * | 1989-09-04 | 1991-10-02 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Expression plasmids and use thereof |
US5356797A (en) * | 1991-11-15 | 1994-10-18 | Board Of Regents, The University Of Texas | Membrane expression of heterologous genes |
EP0613500A1 (en) * | 1991-11-15 | 1994-09-07 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Membrane expression of heterologous genes |
US5932714A (en) * | 1995-02-23 | 1999-08-03 | Connaught Laboratories Limited | Expression of gene products from genetically manipulated strains of Bordetella |
US5998168A (en) * | 1995-06-07 | 1999-12-07 | Connaught Laboratories Limited | Expression of gene products from genetically manipulated strains of bordetella |
US6008329A (en) * | 1998-03-06 | 1999-12-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Method for purifying cholera toxin |
WO2007117339A2 (en) * | 2006-01-11 | 2007-10-18 | The United States Of America As Respresented By The Secretary Of The Navy | Adhesin-enterotoxin chimera based immunogenic composition against entertoxigenic escherichia coli |
DE102011111688A1 (de) * | 2011-08-24 | 2013-02-28 | Bioserv Analytik Und Medizinprodukte Gmbh | Verfahren zur schnellen Isolation bzw. Aufreinigung von rekombinanten Proteinen mit einer (nicht toxischen) Choleratoxin-Domäne |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4666837A (en) * | 1982-05-24 | 1987-05-19 | Smithkline-Rit | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing the A and B subunits of cholera toxin and preparations containing so-obtained subunit or subunits |
US5135862A (en) * | 1983-03-04 | 1992-08-04 | University Of Maryland | Method of isolating restriction fragment deletions in vibrio cholerae, products thereof |
US4882278A (en) * | 1983-04-29 | 1989-11-21 | President And Fellows Of Harvard College | Non-toxinogenic vibrio cholerae mutants |
EP0251579A3 (en) * | 1986-06-24 | 1989-03-22 | Enterovax Research Pty. Ltd. | Non-antibiotic marker system |
HU205372B (en) * | 1987-04-29 | 1992-04-28 | Harvard College | Process for producing vaccines against cholera |
-
1988
- 1988-09-16 SE SE8803291A patent/SE462285B/sv not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-09-04 IS IS3505A patent/IS1804B/is unknown
- 1989-09-11 EP EP89850295A patent/EP0368819B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-11 DE DE68928529T patent/DE68928529T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-11 ES ES89850295T patent/ES2113342T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-11 AT AT89850295T patent/ATE161885T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-09-14 JP JP1239733A patent/JP2790333B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-15 DK DK198904569A patent/DK175694B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-09-15 NO NO893702A patent/NO301175B1/no not_active IP Right Cessation
- 1989-09-15 FI FI894368A patent/FI104496B/fi active IP Right Grant
- 1989-09-15 AU AU41349/89A patent/AU633842B2/en not_active Expired
- 1989-09-15 CA CA000611596A patent/CA1340577C/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-01-08 GR GR970402939T patent/GR3025846T3/el unknown
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109096403A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-12-28 | 浙江工商大学 | 一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用 |
CN109096403B (zh) * | 2018-07-04 | 2020-06-30 | 浙江工商大学 | 一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2113342T3 (es) | 1998-05-01 |
NO893702L (no) | 1990-03-19 |
ATE161885T1 (de) | 1998-01-15 |
SE462285B (sv) | 1990-05-28 |
GR3025846T3 (en) | 1998-04-30 |
AU633842B2 (en) | 1993-02-11 |
IS1804B (is) | 2002-02-26 |
FI894368A (fi) | 1990-03-17 |
JPH0322997A (ja) | 1991-01-31 |
DK456989A (da) | 1990-03-17 |
FI894368A0 (fi) | 1989-09-15 |
DE68928529D1 (de) | 1998-02-12 |
CA1340577C (en) | 1999-06-01 |
DK175694B1 (da) | 2005-01-24 |
DE68928529T2 (de) | 1998-04-16 |
IS3505A7 (is) | 1990-03-17 |
JP2790333B2 (ja) | 1998-08-27 |
NO301175B1 (no) | 1997-09-22 |
AU4134989A (en) | 1990-04-05 |
SE8803291D0 (sv) | 1988-09-16 |
NO893702D0 (no) | 1989-09-15 |
DK456989D0 (da) | 1989-09-15 |
EP0368819B1 (en) | 1998-01-07 |
EP0368819A1 (en) | 1990-05-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sanchez et al. | Recombinant system for overexpression of cholera toxin B subunit in Vibrio cholerae as a basis for vaccine development. | |
JP5566684B2 (ja) | Clostridiumdifficileに対する、組換え毒素A/毒素Bワクチン | |
Vodkin et al. | A heat shock operon in Coxiella burnetti produces a major antigen homologous to a protein in both mycobacteria and Escherichia coli | |
Sanchez et al. | Genetic fusion of a non‐toxic heat‐stable enterotoxin‐related decapeptide antigen to cholera toxin B‐subunit | |
Dertzbaugh et al. | Cholera toxin B-subunit gene fusion: structural and functional analysis of the chimeric protein | |
US7238345B1 (en) | Recombinant microorganism expressing meningococcal class 1 outer membrane protein | |
US20050244425A1 (en) | Histidine-tagged intimin and methods of using intimin to stimulate an immune response and as an antigen carrier with targeting capability | |
JP2002541808A (ja) | ポリサッカリド結合体ワクチンのための組換えトキシンaタンパク質キャリア | |
EP0746621A1 (en) | Expression of proteins on bacterial surface | |
EP0584167A1 (en) | Recombinant dna coding for signal peptide, selective interacting polypeptide and membrane anchoring sequence | |
Sanchez et al. | Recombinant cholera toxin B subunit and gene fusion proteins for oral vaccination | |
US5268276A (en) | Recombinant systems for expression of cholera B-sub-unit with the aid of foreign promoters and/or leader peptides | |
NZ220027A (en) | Antigens or haptens coupled to escherichia coli outer membrane proteins for enhancement of immune response | |
FI104496B (fi) | Yliekspressiojärjestelmät kolera B-alayksikön ekspressiota varten vieraiden promoottoreiden ja johtopeptidien avulla | |
Haeuw et al. | The recombinant Klebsiella pneumoniae outer membrane protein OmpA has carrier properties for conjugated antigenic peptides | |
CA2219943C (en) | Hybrid molecules between heat-labile enterotoxin and cholera toxin b subunits | |
JPH05503420A (ja) | キメラタンパク質 | |
US5834246A (en) | Recombinant systems for expression of cholera B-subunit with the aid of foreign promoters and/or leader peptides | |
US20030165526A1 (en) | Vaccines and agents for inducing immunity against rickettsial diseases, and associated preventative therapy | |
US6043057A (en) | Recombinant systems for expression of the cholera B-sub-unit with the aid of foreign promoters and/or leader peptides | |
US6015889A (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group B streptococcus: process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
Bäckström et al. | Characterization of an internal permissive site in the cholera toxin B-subunit and insertion of epitopes from human immunodeficiency virus-1, hepatitis B virus and enterotoxigenic Escherichia coli | |
JP3135060B2 (ja) | ヘモフィルスインフルエンザb型菌の外皮膜タンパク質P2の部分断片を用いた接合体 | |
GB2356632A (en) | OspA lipoproteins | |
US5976839A (en) | Immunopotentiation through covalent linkage between immunogen and immunopotentiating molecules |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: VITEC AKTIEBOLAG |
|
FG | Patent granted |
Owner name: VITEC AKTIEBOLAG |