JP2781438B2 - 白血病及びリンパ腫におけるモノクローナリテイーの診断法 - Google Patents
白血病及びリンパ腫におけるモノクローナリテイーの診断法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は悪性腫瘍（malignancy）を検出し、その直系
を測定するために白血病及びリンパ腫において使用する
ことができる診断法に関する。
を測定するために白血病及びリンパ腫において使用する
ことができる診断法に関する。
免疫応答性細胞であるリンパ球には （ａ）各々、特定の外来抗原に結合する特異性免疫グロ
ブリン分子を産生するＢ−リンパ球、及び （ｂ）各々、細胞をして特定の外来抗原に結合するのを
可能にする特異性表面リセプターを有するＴ−リンパ球 という２つのタイプがある。
ブリン分子を産生するＢ−リンパ球、及び （ｂ）各々、細胞をして特定の外来抗原に結合するのを
可能にする特異性表面リセプターを有するＴ−リンパ球 という２つのタイプがある。
各Ｂ−リンパ球は他の全てのＢ−リンパ球の免疫グロ
ブリン遺伝子とは構造がやや異なり、他方Ｔ−リンパ球
を含めて他の全ての体細胞（body cells）の免疫グロブ
リン遺伝子とは構造が著しく異なる、他にはない独特の
免疫グロブリン遺伝子を含む。同様に、各Ｔ−リンパ球
は他の全てのＴ−リンパ球のＴ−リセプタ遺伝子とは構
造がやや異なり、他方Ｂ−リンパ球を含めて全ての体細
胞のＴ−リセプタ遺伝子とは構造が著しく異なる、他に
はない独特のＴ−リセプタ遺伝子を含む。
ブリン遺伝子とは構造がやや異なり、他方Ｔ−リンパ球
を含めて他の全ての体細胞（body cells）の免疫グロブ
リン遺伝子とは構造が著しく異なる、他にはない独特の
免疫グロブリン遺伝子を含む。同様に、各Ｔ−リンパ球
は他の全てのＴ−リンパ球のＴ−リセプタ遺伝子とは構
造がやや異なり、他方Ｂ−リンパ球を含めて全ての体細
胞のＴ−リセプタ遺伝子とは構造が著しく異なる、他に
はない独特のＴ−リセプタ遺伝子を含む。
リンパ系白血病及びリンパ腫はリンパ組織の癌の１形
態である。各白血病又はリンパ腫は単一のＢ−又はＴ−
リンパ球から生じ、それが複合し、拡がり、そして治療
しなければ最後には死をもたらす。腫瘍の細胞は全て単
一の細胞に由来するので、それらは全て遺伝的に同一で
あり、全て同一の唯一の遺伝子、即ち腫瘍がＢ−リンパ
球に生じた場合は独特の免疫グロブリン遺伝子を、又は
腫瘍がＴ−リンパ球に生じた場合は独特のＴ−リセプタ
遺伝子を含む。
態である。各白血病又はリンパ腫は単一のＢ−又はＴ−
リンパ球から生じ、それが複合し、拡がり、そして治療
しなければ最後には死をもたらす。腫瘍の細胞は全て単
一の細胞に由来するので、それらは全て遺伝的に同一で
あり、全て同一の唯一の遺伝子、即ち腫瘍がＢ−リンパ
球に生じた場合は独特の免疫グロブリン遺伝子を、又は
腫瘍がＴ−リンパ球に生じた場合は独特のＴ−リセプタ
遺伝子を含む。
逆に、もし組織に白血病又はリンパ腫によって冒され
ている疑いがある場合、上記の独特の免疫グロブリン遺
伝子が検出されれば、それはＢ−リンパ球腫瘍を推定さ
せる証拠となり、これに対して独特のＴ−リセプタ遺伝
子が検出されれば、それはＴ−リンパ球腫瘍を推定させ
る証拠となる。
ている疑いがある場合、上記の独特の免疫グロブリン遺
伝子が検出されれば、それはＢ−リンパ球腫瘍を推定さ
せる証拠となり、これに対して独特のＴ−リセプタ遺伝
子が検出されれば、それはＴ−リンパ球腫瘍を推定させ
る証拠となる。
本発明の目的は組織の試料の中に白血病又はリンパ腫
が存在するか、それとも存在しないかを、その試料の中
にモノローナルのＢ−またはＴ−リンパ球集団が存在す
るか、存在しないかを測定することによって判定するこ
とである。一般的に言うと、本発明は免疫グロブリン分
子またはＴ−リセプタ分子の個別セグメントに焦点を当
て、そして組織試料中のこれらセグメントの全て又は大
部分が再配置され、かつ正確に同一の長さを有するかど
うかを測定することによって上記の判定を行うものであ
る。ここで、それらセグメントの全て又は大部分が同一
の長さを持つことはそれらセグメントが同じ独特の分子
に由来することを意味する。
が存在するか、それとも存在しないかを、その試料の中
にモノローナルのＢ−またはＴ−リンパ球集団が存在す
るか、存在しないかを測定することによって判定するこ
とである。一般的に言うと、本発明は免疫グロブリン分
子またはＴ−リセプタ分子の個別セグメントに焦点を当
て、そして組織試料中のこれらセグメントの全て又は大
部分が再配置され、かつ正確に同一の長さを有するかど
うかを測定することによって上記の判定を行うものであ
る。ここで、それらセグメントの全て又は大部分が同一
の長さを持つことはそれらセグメントが同じ独特の分子
に由来することを意味する。
現在のモノクローナリティー（monoclonality）の検
出法は制限酵素の消化、続いてサウザン・ブロッティン
グ（southern blotting）及び遺伝子の精査に基づく。
このアプローチは複雑で、高価で、しかも時間がかか
り、そのため情報は、それが実質的に実用価値のあるも
のとするには通常余りにも遅く提供される。
出法は制限酵素の消化、続いてサウザン・ブロッティン
グ（southern blotting）及び遺伝子の精査に基づく。
このアプローチは複雑で、高価で、しかも時間がかか
り、そのため情報は、それが実質的に実用価値のあるも
のとするには通常余りにも遅く提供される。
これに対して、本発明の方法は速やかで、かつ敏感な
診断試験法を提供する。更に、組織試料として使用する
ことができる材料として血液、節又は骨髄中の腫瘍組
織、ホルマリン固定され、包埋された組織材料、アスピ
レート（aspirate）された細胞材料又はスライド上の細
胞があるので、本発明の方法は用途が非常に多い。
診断試験法を提供する。更に、組織試料として使用する
ことができる材料として血液、節又は骨髄中の腫瘍組
織、ホルマリン固定され、包埋された組織材料、アスピ
レート（aspirate）された細胞材料又はスライド上の細
胞があるので、本発明の方法は用途が非常に多い。
本発明によれば、組織の試料の中の免疫グロブリン遺
伝子及び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメント長の均
一性又は不均一性を判定して試料中のＢ−及び／又はＴ
−リンパ球集団のモノクローナリティーの存否を表示す
ることを含んで成る、組織試料におけるリンパ系白血病
及び／又はリンパ腫の検出法が提供される。
伝子及び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメント長の均
一性又は不均一性を判定して試料中のＢ−及び／又はＴ
−リンパ球集団のモノクローナリティーの存否を表示す
ることを含んで成る、組織試料におけるリンパ系白血病
及び／又はリンパ腫の検出法が提供される。
本発明の１態様によれば、 （ａ）組織の試料の中の免疫グロブリン遺伝子及び／又
はＴ−リセプタ遺伝子のセグメントをそれらセグメント
のための特異性プライマー又は特異性プライマー混合物
を使用するポリメラーゼの連鎖反応で拡大する工程、及
び （ｂ）拡大されたセグメントを大きさに基づいて分離し
てそれら拡大セグメントの長さの均一性又は不均一性を
判定する工程 を含んで成る、組織試料におけるモノクローナリティー
及び推定悪性腫瘍を検出し、及び／又は主要のＢ−リン
パ球又はＴ−リンパ球の起源を判定する方法が提供され
る。１つの特定の態様において、使用されるプライマー
は免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ−リセプタ遺伝子
のセグメントのためのコンセンサスプライマー（consen
sus primers）である。
はＴ−リセプタ遺伝子のセグメントをそれらセグメント
のための特異性プライマー又は特異性プライマー混合物
を使用するポリメラーゼの連鎖反応で拡大する工程、及
び （ｂ）拡大されたセグメントを大きさに基づいて分離し
てそれら拡大セグメントの長さの均一性又は不均一性を
判定する工程 を含んで成る、組織試料におけるモノクローナリティー
及び推定悪性腫瘍を検出し、及び／又は主要のＢ−リン
パ球又はＴ−リンパ球の起源を判定する方法が提供され
る。１つの特定の態様において、使用されるプライマー
は免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ−リセプタ遺伝子
のセグメントのためのコンセンサスプライマー（consen
sus primers）である。
本発明はまた組織の試料の中の免疫グロブリン遺伝子
及び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメントをポリメタ
ラーゼの連鎖反応で拡大するための、免疫グロブリン遺
伝子及び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメント用の１
組の特異性プライマーまたは特異性プライマー混合物を
含んで成る、上記で広く概説した本発明の方法を実施す
るためのキットにも及ぶ。
及び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメントをポリメタ
ラーゼの連鎖反応で拡大するための、免疫グロブリン遺
伝子及び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメント用の１
組の特異性プライマーまたは特異性プライマー混合物を
含んで成る、上記で広く概説した本発明の方法を実施す
るためのキットにも及ぶ。
もう１度述べると、１つの特定の態様において、使用
されるプライマーは免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ
−リセプタ遺伝子のセグメントのためのコンセンサスプ
ライマーである。
されるプライマーは免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ
−リセプタ遺伝子のセグメントのためのコンセンサスプ
ライマーである。
免疫グロブリン（Ig）及びＴ−リセプタ（Tr）の遺伝
子は総ての細胞の中に存在する。各遺伝子は４つの族、
即ち可変（Ｖ）領域、不同（Ｄ）領域、結合（Ｊ）領域
及び不変（Ｃ）領域の族（Ｄセグメントを欠く免疫グロ
ブリンの軽鎖を除く）より成る。Ｂ−またはＴ−リンパ
球の発生過程において、遺伝子は各族のランダムに選択
された１員が一緒に結合されて最終分子を形成するよう
に再配置される。VD、DJ及びJCの各結合点ではランダム
な突然異変も起こる。このランダムな結合と突然変異の
結果、最終の免疫グロブリン又はＴ−リセプタの分子は
事実上他には見られない独特なものとなる。しかし、本
発明に関して特に重要な２つの特徴がある。
子は総ての細胞の中に存在する。各遺伝子は４つの族、
即ち可変（Ｖ）領域、不同（Ｄ）領域、結合（Ｊ）領域
及び不変（Ｃ）領域の族（Ｄセグメントを欠く免疫グロ
ブリンの軽鎖を除く）より成る。Ｂ−またはＴ−リンパ
球の発生過程において、遺伝子は各族のランダムに選択
された１員が一緒に結合されて最終分子を形成するよう
に再配置される。VD、DJ及びJCの各結合点ではランダム
な突然異変も起こる。このランダムな結合と突然変異の
結果、最終の免疫グロブリン又はＴ−リセプタの分子は
事実上他には見られない独特なものとなる。しかし、本
発明に関して特に重要な２つの特徴がある。
即ち、 （ａ）VD、DJ及びJC結合点において取り除かれ及び／又
は挿入される塩基数が極めて変りやすく、そのため異な
る免疫グロブリン又はＴ−リセプタの分子、特にVD、DJ
及びJCの各結合間のセグメントは長さが実質的に異な
る。
は挿入される塩基数が極めて変りやすく、そのため異な
る免疫グロブリン又はＴ−リセプタの分子、特にVD、DJ
及びJCの各結合間のセグメントは長さが実質的に異な
る。
（ｂ）遺伝子内に絶対的同一性がないとしても遺伝子内
には類似性を持つ若干の領域が存在する。これらの領域
は“フレームワーク（framework）”と称されるＶ領域
のある特定の部分、及びＪ領域とＣ領域の部分を含む。
には類似性を持つ若干の領域が存在する。これらの領域
は“フレームワーク（framework）”と称されるＶ領域
のある特定の部分、及びＪ領域とＣ領域の部分を含む。
本発明はポリメラーゼの連鎖反応（PCR）の新しい様
式での使用を含む。PCRは1985年に初めて記載された
が、今や周知のものであって、小さいcDNAセグメントの
配列が知られているという条件でそれらのセグメントの
指数関数的な拡大を可能にする。PCRの原理は２つのDNA
プライマー（その１つは各DNA鎖についてのものであ
る）が変性とそれに続くDNA合成の連続サイクルにおい
て使用され、これによってプライマーにより結合された
DNAのセグメントの指数関数的拡大がもたらされる、と
いうことである。各サイクルには６〜７分間要するの
で、20〜30サイクルを実施するのが実際的であり、また
各サイクルの効率は最大で70〜80％であるので、高忠実
度においては最大106倍の拡大が可能である。
式での使用を含む。PCRは1985年に初めて記載された
が、今や周知のものであって、小さいcDNAセグメントの
配列が知られているという条件でそれらのセグメントの
指数関数的な拡大を可能にする。PCRの原理は２つのDNA
プライマー（その１つは各DNA鎖についてのものであ
る）が変性とそれに続くDNA合成の連続サイクルにおい
て使用され、これによってプライマーにより結合された
DNAのセグメントの指数関数的拡大がもたらされる、と
いうことである。各サイクルには６〜７分間要するの
で、20〜30サイクルを実施するのが実際的であり、また
各サイクルの効率は最大で70〜80％であるので、高忠実
度においては最大106倍の拡大が可能である。
記載したPCRはプライマーに基づくものであり、各各
は既知の配列に対して正確に相補性である。本発明の１
つの態様において、免疫グロブリン及びＴ−リセプタの
分子を拡大するという問題はコンセンサスプライマーを
免疫グロブリン及びＴ−リセプタの遺伝子の中に類似し
ているが同一ではない配列をそれぞれ有する領域に対し
て使用することによって解決された。これらの領域は免
疫グロブリンのＶ領域のフレームワーク部、Ｔ−リセプ
タ遺伝子の保存Ｖ領域、並びに免疫グロブリン遺伝子又
はＴ−リセプタ遺伝子のＤ、Ｊ及び／又はＣ領域の１部
分を含んで成る。これらの領域に対するプライマーは２
つの理由から作用する。第一に、それらプライマーは免
疫グロブリン又はＴ−リセプタのDNAまたはRNAの適切な
領域に対して十分に相同性である構造を有し、それによ
って全DNA又はRNAにおけるそのような領域だけを認識す
ることである。第二に、PCR領域は２つのプライマーに
よって認識される配列が短かい場合に作用するだけであ
る、ということである。この状態はＶ、Ｄ及びＪ（又は
Ｃ）領域が一緒に結合されており、成熟した免疫グロブ
リン又はＴ−リセプタの分子が形成されているDNA又はR
NAのそのようなセグメントについて達成されるに過ぎな
い。これら２つの性質の結果として、プライマーは最終
の成熟免疫グロブリン又はＴ−リセプタ分子だけを認識
し、拡大するのである。
は既知の配列に対して正確に相補性である。本発明の１
つの態様において、免疫グロブリン及びＴ−リセプタの
分子を拡大するという問題はコンセンサスプライマーを
免疫グロブリン及びＴ−リセプタの遺伝子の中に類似し
ているが同一ではない配列をそれぞれ有する領域に対し
て使用することによって解決された。これらの領域は免
疫グロブリンのＶ領域のフレームワーク部、Ｔ−リセプ
タ遺伝子の保存Ｖ領域、並びに免疫グロブリン遺伝子又
はＴ−リセプタ遺伝子のＤ、Ｊ及び／又はＣ領域の１部
分を含んで成る。これらの領域に対するプライマーは２
つの理由から作用する。第一に、それらプライマーは免
疫グロブリン又はＴ−リセプタのDNAまたはRNAの適切な
領域に対して十分に相同性である構造を有し、それによ
って全DNA又はRNAにおけるそのような領域だけを認識す
ることである。第二に、PCR領域は２つのプライマーに
よって認識される配列が短かい場合に作用するだけであ
る、ということである。この状態はＶ、Ｄ及びＪ（又は
Ｃ）領域が一緒に結合されており、成熟した免疫グロブ
リン又はＴ−リセプタの分子が形成されているDNA又はR
NAのそのようなセグメントについて達成されるに過ぎな
い。これら２つの性質の結果として、プライマーは最終
の成熟免疫グロブリン又はＴ−リセプタ分子だけを認識
し、拡大するのである。
PCRにおいてこれらプライマーを使用すると、組織試
料の中の成熟免疫グロブリン又はＴ−リセプタの全分子
のプライマー間セグメントが拡大される。拡大されたセ
グメントはVD、DJ（及びJC）の結合点を横断している。
その結果、DNA配列に無関係にDNAの最終拡大片は、組織
中の免疫グロブリン又はＴ−リセプタの遺伝子が全てモ
ノクローナルな悪性の集団に由来する場合には単一の長
さを有し、あるいはそれらの分子が不均質な悪性でない
集団に由来する場合には不均一な長さを有する。免疫グ
ロブリン分子のためのプライマーはＢ−リンパ球起源の
悪性集団を同定し、他方Ｔ−リセプタ分子のためのプラ
イマーはＴ−リンパ球起源の悪性腫瘍を同定する。
料の中の成熟免疫グロブリン又はＴ−リセプタの全分子
のプライマー間セグメントが拡大される。拡大されたセ
グメントはVD、DJ（及びJC）の結合点を横断している。
その結果、DNA配列に無関係にDNAの最終拡大片は、組織
中の免疫グロブリン又はＴ−リセプタの遺伝子が全てモ
ノクローナルな悪性の集団に由来する場合には単一の長
さを有し、あるいはそれらの分子が不均質な悪性でない
集団に由来する場合には不均一な長さを有する。免疫グ
ロブリン分子のためのプライマーはＢ−リンパ球起源の
悪性集団を同定し、他方Ｔ−リセプタ分子のためのプラ
イマーはＴ−リンパ球起源の悪性腫瘍を同定する。
DNAの拡大片の長さは分子を大きさに基づいて分離す
る方法でDNA分子を分離することによって簡単に測定る
ことができる。現在、アガロースゲル又はポリアクリル
アミドゲル中での電気泳動が用いられているが、クロマ
トグラフィーが自動化の可能性のために色々な利点を持
つと思われる。大きさに基づいて分離された分子は非同
位体手段、例えばエチジウムブロマイド染色法で、若し
くは放射性同位体の組み込みで、または内部プローブへ
のサウザン転移（Souther transfer）とハイブリダイゼ
ーションで同定することができる。
る方法でDNA分子を分離することによって簡単に測定る
ことができる。現在、アガロースゲル又はポリアクリル
アミドゲル中での電気泳動が用いられているが、クロマ
トグラフィーが自動化の可能性のために色々な利点を持
つと思われる。大きさに基づいて分離された分子は非同
位体手段、例えばエチジウムブロマイド染色法で、若し
くは放射性同位体の組み込みで、または内部プローブへ
のサウザン転移（Souther transfer）とハイブリダイゼ
ーションで同定することができる。
本発明の更に他の特徴は次の詳細な説明によって明ら
かになるだろう。
かになるだろう。
A.プライマーの合成 1.免疫グロブリン遺伝子のためのプライマー 総ての免疫グロブリン重鎖遺伝子において同様である
DNA配列の４つの領域は次の通りである： （ａ） Ｊ−領域の３′末端において、34塩基のうち30
塩基が全６本の生殖系列のＪ−鎖の中の保存される。DN
A（＋）鎖に付く３つのDNAプライマーが用いられた。即
ち、 （ただし、Ｎは４種のヌクレオチド塩基のいずれかを表
わす。） である。
DNA配列の４つの領域は次の通りである： （ａ） Ｊ−領域の３′末端において、34塩基のうち30
塩基が全６本の生殖系列のＪ−鎖の中の保存される。DN
A（＋）鎖に付く３つのDNAプライマーが用いられた。即
ち、 （ただし、Ｎは４種のヌクレオチド塩基のいずれかを表
わす。） である。
（ｂ）〜（ｄ） Ｖ−領域は３つの“フレームワーク”
領域とその中に介在する“鎖決定”領域に細分すること
ができる。“フレームワーク”領域はあらゆる免疫グロ
ブリンの中で同様であり、他方“鎖決定”領域は大幅に
変化する。17リンパ球系列の配列を比較することによっ
て、DNAの保存伸張鎖（conserved stretches）を各フレ
ームワーク領域において同定した。しかし、それらの配
列は余り保存されない。不適組合わせのPCRに対する影
響の仕方は不明確であるので、若干の合成プライマーに
は重復が導入された。DNAの（−）鎖にハイブリダイズ
するプライマーに次のものがある： DNAの（＋）鎖に付くプライマーには がある。
領域とその中に介在する“鎖決定”領域に細分すること
ができる。“フレームワーク”領域はあらゆる免疫グロ
ブリンの中で同様であり、他方“鎖決定”領域は大幅に
変化する。17リンパ球系列の配列を比較することによっ
て、DNAの保存伸張鎖（conserved stretches）を各フレ
ームワーク領域において同定した。しかし、それらの配
列は余り保存されない。不適組合わせのPCRに対する影
響の仕方は不明確であるので、若干の合成プライマーに
は重復が導入された。DNAの（−）鎖にハイブリダイズ
するプライマーに次のものがある： DNAの（＋）鎖に付くプライマーには がある。
DNAの反対鎖に付くプライマー及び／又は他の免疫グ
ロブリン鎖のためのプライマーも等しく十分に使用する
ことができるだろう。
ロブリン鎖のためのプライマーも等しく十分に使用する
ことができるだろう。
内部の又は末端の制限酵素部位を含有するように変性
されたプライマーを使用しても好結果が得られた。それ
らは引続くクローニングの助けになる。
されたプライマーを使用しても好結果が得られた。それ
らは引続くクローニングの助けになる。
2.T−リセプタ遺伝子のためのプライマー Ｔ−リセプタ遺伝子のために類縁のプライマーが使用
される。これら遺伝子のためのプライマーを選択する際
に適用される原理は免疫グロブリン遺伝子についての原
理と同じであるが、強調しなければならないいくつかの
相違点がある。特に、VD、DJ及びJC結合部におけるヌク
レオチドの除去とランダムヌクレオチドの挿入による不
同性の発生に更に強い力点がある。Ｔ−リセプタのＶ−
領域は可変性がより小さい領域及び“フレームワーク”
領域、並びに可変性のより大きい“鎖決定”領域に容易
には分割することができない。しかし、VD結合部付近で
は約20塩基の伸張鎖が保存される。
される。これら遺伝子のためのプライマーを選択する際
に適用される原理は免疫グロブリン遺伝子についての原
理と同じであるが、強調しなければならないいくつかの
相違点がある。特に、VD、DJ及びJC結合部におけるヌク
レオチドの除去とランダムヌクレオチドの挿入による不
同性の発生に更に強い力点がある。Ｔ−リセプタのＶ−
領域は可変性がより小さい領域及び“フレームワーク”
領域、並びに可変性のより大きい“鎖決定”領域に容易
には分割することができない。しかし、VD結合部付近で
は約20塩基の伸張鎖が保存される。
（ａ）Ｔ−リセプタのα鎖 JAT2はPCRのためのＪ−領域プライマーである。
JAT1は内部プローブである。
3VTAはPCRのためのＶ−領域プライマーで、JAT1から
約80塩基対である。
約80塩基対である。
5VTAはJAT1から200〜300塩基対のＶ−領域プライマー
である。
である。
CTAとPTAは不変領域内にある。
Ｖ−及びＪ−領域プライマーはコンセンサンプライマ
ーである。
ーである。
（ｂ）Ｔ−リセプタのβ鎖 JBT2はPCRのためのＪ−領域プライマーである。
JBT1は内部プローブである。
3VTB1と3VTB2はそれぞれTCRベーター副分類のベータ
ー１及びベーター２のための、JBT1から約80塩基対のＶ
−領域プライマーである。
ー１及びベーター２のための、JBT1から約80塩基対のＶ
−領域プライマーである。
5VTB1と5VTB2はそれぞれTCRベーター副分類のベータ
ー１及びベーター２のための、JBT1から200〜300塩基対
のＶ−領域プライマーである。
ー１及びベーター２のための、JBT1から200〜300塩基対
のＶ−領域プライマーである。
CTBとPTBはβ遺伝子総てのための不変領域内にある。
Ｖ−及びＪ−領域プライマーはコンセンサスプライマ
ーである。
ーである。
（ｃ）Ｔ−リセプタのγ鎖 JGT12はPCRのためのＪ−領域プライマーである。それ
はTCRクラスのガンマーの４つの公知のＪ−鎖のうちの
２つの配列に基づく。
はTCRクラスのガンマーの４つの公知のＪ−鎖のうちの
２つの配列に基づく。
3VTGはJGT12から約80塩基対のＶ−領域プライマーで
ある。
ある。
CTGとPTG不変領域内にある。
不変領域のプライマーは、個々のケースによるが、場
合によっては拡大のために使用されるので、RNAから出
発し、そして１回の逆転写を行うことによってしRCRの
拡大を先行させることが必要であろう。
合によっては拡大のために使用されるので、RNAから出
発し、そして１回の逆転写を行うことによってしRCRの
拡大を先行させることが必要であろう。
上記の内部プローブJAT1及びJBT1は、拡大産生物をエ
チジウム−染色バンドとして可視化することができない
場合、その拡大産生物の最終検出のために使用すること
ができる。プローブには通常は放射線で標識を付けるこ
とができ、それによって非常に敏感で特異性の、拡大産
生物の検出法が得られる。
チジウム−染色バンドとして可視化することができない
場合、その拡大産生物の最終検出のために使用すること
ができる。プローブには通常は放射線で標識を付けるこ
とができ、それによって非常に敏感で特異性の、拡大産
生物の検出法が得られる。
γ鎖（Tgリセプタ）に適用可能なもう１つの別のアプ
ローチは9V−領域と5J−領域のためのプライマー混合物
を使用するものである。使用配列は次の通りである： Ｖ−領域プライマーは標的に精密にマッチする20〜40
塩基（３′末端に最も近いもの）を含有する。それらプ
ライマーはまた５′末端付近に制限酵素のための部位と
して配列CTGCAGを含有する。この部位は、クローニング
が必要な場合に、後続のクローニングの助けになる。
ローチは9V−領域と5J−領域のためのプライマー混合物
を使用するものである。使用配列は次の通りである： Ｖ−領域プライマーは標的に精密にマッチする20〜40
塩基（３′末端に最も近いもの）を含有する。それらプ
ライマーはまた５′末端付近に制限酵素のための部位と
して配列CTGCAGを含有する。この部位は、クローニング
が必要な場合に、後続のクローニングの助けになる。
B.DNAの拡大 DNA又はRNAは共に用いることができる。
cDNAを逆転写酵素及び１つの又は両PCRプライマーを用
いてRNAから作る。cDNAを沈殿させ、そして水に再懸濁
し、次いでPCR反応を用いる。この反応をサーマス・ア
クアティカス（Thermus apuaticus）からのポリメラー
ゼを用いて約30サイクル行う。この反応の産生物類をア
ガロースゲル上で分離し、そしてエチジウムブロマイド
による染色を行って可視化する。プライマーの結合部位
に内部結合するDNAプローブへのサウザン・ブロッティ
ングとハイブリダイゼーションも通常に行われる。拡大
されたセグメントの大きさの測定にはコントロール・サ
イズ−マーカー（Contorol size−markers）が助けにな
る。
いてRNAから作る。cDNAを沈殿させ、そして水に再懸濁
し、次いでPCR反応を用いる。この反応をサーマス・ア
クアティカス（Thermus apuaticus）からのポリメラー
ゼを用いて約30サイクル行う。この反応の産生物類をア
ガロースゲル上で分離し、そしてエチジウムブロマイド
による染色を行って可視化する。プライマーの結合部位
に内部結合するDNAプローブへのサウザン・ブロッティ
ングとハイブリダイゼーションも通常に行われる。拡大
されたセグメントの大きさの測定にはコントロール・サ
イズ−マーカー（Contorol size−markers）が助けにな
る。
C.免疫グロブリンのコンセンサスプライマーを使用して
モノクローナリティーについての試験結果 第１表及び第２表に免疫グロブリン遺伝子だけを用い
てモノクローナリティーについて各種試料を試験した結
果を示す。
モノクローナリティーについての試験結果 第１表及び第２表に免疫グロブリン遺伝子だけを用い
てモノクローナリティーについて各種試料を試験した結
果を示す。
これらの結果は前記のプライマーLJH−及びFR3Aを用
いて得られたものである。30サイクルの拡大を行い、拡
大されたフラグメントを２％の寒天中での電気泳動で分
離し、そしてエチジウムブロマイドで染色して紫外光で
の可視化を可能にした。同様に結果が最後の５サイクル
の拡大のための放射性ヌクレオチド（CTP）を加え、電
気泳動を行い、そしてフラグメントをオートラジオグラ
フィーで可視化することによって得られた。
いて得られたものである。30サイクルの拡大を行い、拡
大されたフラグメントを２％の寒天中での電気泳動で分
離し、そしてエチジウムブロマイドで染色して紫外光で
の可視化を可能にした。同様に結果が最後の５サイクル
の拡大のための放射性ヌクレオチド（CTP）を加え、電
気泳動を行い、そしてフラグメントをオートラジオグラ
フィーで可視化することによって得られた。
D.T−リセプタのプライマーを使用してのモノクローナ
イティについての試験結果 コンセンサンプライマーの１つの対又は他の対を用
い、上記と同じPCR法を使用すると、個別の再配置が検
出された。この検出においては８つの正常Ｔ−細胞クロ
ーンのうち６つに１つのプライマー対又は他のプライマ
ー対が用いられた。
イティについての試験結果 コンセンサンプライマーの１つの対又は他の対を用
い、上記と同じPCR法を使用すると、個別の再配置が検
出された。この検出においては８つの正常Ｔ−細胞クロ
ーンのうち６つに１つのプライマー対又は他のプライマ
ー対が用いられた。
同様に、前記の全９つのＶ−領域プライマーの混合物
の（TCRVG2PST−TCRVG12PST、並びにJGT12,JGT3及びJGT
4）を用いると、４つの正常Ｔ−細胞クローンのうちの
３つに個別再配置が検出された。
の（TCRVG2PST−TCRVG12PST、並びにJGT12,JGT3及びJGT
4）を用いると、４つの正常Ｔ−細胞クローンのうちの
３つに個別再配置が検出された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68
Claims (17)
- 【請求項１】組織の試料中の免疫グロブリン遺伝子及び
／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメント長の均一性又は
不均一性を判定して該試料中のＢ−及び／又はＴ−リン
パ球集団のモノクローナリティーの存否を表示すること
を含んで成る、組織試料におけるリンパ系白血病及び／
又はリンパ腫の検出法。 - 【請求項２】（ａ）組織の試料中の免疫グロブリン遺伝
子及び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメントをそれら
セグメントのための特異性プライマー又は特異性プライ
マー混合物を使用するポリメラーゼの連鎖反応で拡大
し、そして （ｂ）拡大されたセグメントを大きさに基づいて分離し
てそれら拡大セグメントの長さの均一性又は不均一性を
判定する 工程を含んで成る、組織試料におけるモノクローナリテ
ィー及び推定悪性腫瘍を検出し、及び／又は腫瘍のＢ−
リンパ球又はＴ−リンパ球の起源を判定する方法。 - 【請求項３】該プライマーが免疫グロブリン遺伝子及び
／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメントのためのコンセ
ンサスプライマーである、請求の範囲第２項に記載の方
法。 - 【請求項４】該組織試料が血液、節又は骨髄における腫
瘍組織、ホルマリン固定され、包埋された組織材料、ア
スピレートされた細胞材料及びスライドガラス上の細胞
から選択されたものである、請求の範囲第１項又は第２
項に記載の方法。 - 【請求項５】大きさに基づいて分離する該工程が電気泳
動法及びクロマトグラフィーから選択されたものであ
る、請求の範囲第２項に記載の方法。 - 【請求項６】大きさに基づく該分離工程がアガロースゲ
ル又はポリアクリルアミドゲルによる電気泳動法から成
る、請求の範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項７】大きさに基づいて分離され、拡大された該
遺伝子のセグメントを非同位体手段、放射性同位体の組
み込み、又は内部プローブへのサウザン転移又はハイブ
リダイゼーションによって検出する、請求の範囲第２項
に記載の方法。 - 【請求項８】非同位体手段による該検出がエチジウムブ
ロマイド染色法を含んで成る、請求の範囲第７項に記載
の方法。 - 【請求項９】免疫グロブリン遺伝子のセグメントのため
の該プライマーが免疫グロブリンのＶ領域のフレームワ
ーク部に対するプライマー及び該遺伝子のD.J及び／又
はＣ領域の一部分に対するプライマーから成る、請求の
範囲第２項に記載の方法。 - 【請求項１０】免疫グロブリン遺伝子のセグメントのた
めの該プライマーが （ただし、Ｎはヌクレオチド塩基のうちのいずれかを表
わす） から選択されたものである、請求の範囲第９項に記載の
方法。 - 【請求項１１】Ｔ−リセプタ遺伝子のセグメントのため
の該プライマーがＴ−リセプタ遺伝子の保存Ｖ領域に対
するプライマー及び該遺伝子のD.J及び／又はＣ領域の
一部分に対するプライマーから成る、請求の範囲第２項
に記載の方法。 - 【請求項１２】Ｔ−リセプタ遺伝子のセグメントのため
の該プライマーが （ａ）Ｔ−リセプタのα−鎖プライマー： （ｂ）Ｔ−リセプタのβ−鎖プライマー： （ｃ）Ｔ−リセプタのγ−鎖プライマー： から選択されたものである、請求の範囲第11項に記載の
方法。 - 【請求項１３】Ｔ−リセプタ遺伝子のセグメントのため
の該プ から選択された、Ｖ−領域及びＪ−領域のためのＴ−リ
セプタ遺伝子のγ−鎖プライマーの混合物から成る、請
求の範囲第11項に記載の方法。 - 【請求項１４】組織の試料中の免疫グロブリン遺伝子及
び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメントをポリメラー
ゼの連鎖反応で拡大するための、免疫グロブリン遺伝子
及び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメント用の１組の
特異性プライマー又は特異性プライマー混合物を含んで
成る、請求の範囲第２項に記載の方法を実施するための
キット。 - 【請求項１５】免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ−リ
セプタ遺伝子のセグメントのための１組のコンセンサス
プライマーを含んで成る、請求の範囲第14項に記載のキ
ット。 - 【請求項１６】請求の範囲第９項または第10項に記載
の、免疫グロブリン遺伝子のセグメントのためのプライ
マーを含んで成る、請求の範囲第14項に記載のキット。 - 【請求項１７】請求の範囲第11項若しくは第12項又は第
13項に記載の、Ｔ−リセプタ遺伝子のセグメントのため
のプライマーを含んで成る、請求の範囲第14項に記載の
キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPJ105788 | 1988-10-20 | ||
| AU1057 | 1999-06-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04501355A JPH04501355A (ja) | 1992-03-12 |
| JP2781438B2 true JP2781438B2 (ja) | 1998-07-30 |
Family
ID=3773456
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1510945A Expired - Lifetime JP2781438B2 (ja) | 1988-10-20 | 1989-10-20 | 白血病及びリンパ腫におけるモノクローナリテイーの診断法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5296351A (ja) |
| JP (1) | JP2781438B2 (ja) |
| WO (1) | WO1990004648A1 (ja) |
Families Citing this family (56)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9002625D0 (en) * | 1990-02-06 | 1990-04-04 | Univ Singapore | Human leukocyte antigen typing |
| US7294712B2 (en) | 1990-06-04 | 2007-11-13 | Aventis Pharma S.A. | Nucleotide sequences coding for variable regions of β chains of human T lymphocyte receptors, corresponding peptide segments and the diagnostic and therapeutic uses |
| FR2671356B1 (fr) * | 1991-01-09 | 1993-04-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede de description des repertoires d'anticorps (ab) et des recepteurs des cellules t (tcr) du systeme immunitaire d'un individu. |
| IE920447A1 (en) | 1991-02-12 | 1992-08-12 | Roussel Uclaf | NUCLEOTIDE SEQUENCES CODING FOR ß-CHAIN VARIABLE REGIONS OF¹HUMAN T-LYMPHOCYTE RECEPTORS, CORRESPONDING PEPTIDE SEGMENTS¹AND DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC APPLICATIONS |
| KR950701391A (ko) * | 1992-04-30 | 1995-03-23 | 원본미기재 | T세포 항원 리셉터 유전자 발현의 검출방법 |
| FR2693209B1 (fr) * | 1992-07-03 | 1994-09-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Procédé de détermination de la taille en nucléotides de fragments d'ADN. |
| US5668006A (en) * | 1992-07-17 | 1997-09-16 | American Cyanamid Company | Somatostatin receptors |
| US6087096A (en) * | 1995-11-13 | 2000-07-11 | Dau; Peter C. | Method of intrafamily fragment analysis of the T cell receptor α and β chain CDR3 regions |
| CA2257152C (en) * | 1996-06-03 | 2009-01-27 | Linda M. Pilarski | Methods for detection of rearranged dna |
| AU9148498A (en) * | 1997-09-19 | 1999-04-12 | Medleys Laboratories Inc. | Method and kit for early diagnosis of autoimmunity and lymphoma in central nervous system |
| AUPQ687600A0 (en) * | 2000-04-13 | 2000-05-11 | Flinders Technologies Pty Ltd | A method of detection |
| US6596492B2 (en) | 2000-07-11 | 2003-07-22 | Colorado State University Research Foundation | PCR materials and methods useful to detect canine and feline lymphoid malignancies |
| BR0212773A (pt) | 2001-09-24 | 2004-10-13 | One Lambda | Métodos para detecção de sequências-alvo de ácido nucléico com marcadores diagnósticos |
| EP2418287B1 (en) * | 2002-10-11 | 2013-09-18 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Nucleic acid amplification primers for PCR-based clonality studies of the TCR-beta gene |
| AU2003902299A0 (en) * | 2003-05-13 | 2003-05-29 | Flinders Medical Centre | A method of analysing a marker nucleic acid molecule |
| FR2863274B1 (fr) * | 2003-12-05 | 2012-11-16 | Commissariat Energie Atomique | Procede d'evaluation quantitative d'un rearrangement ou d'une recombinaison genetique ciblee d'un individu et ses applications. |
| US20070020670A1 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-25 | Hematologics, Inc. | Methods for detecting and confirming minimal disease |
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