JPH04501355A - 白血病及びリンパ腫におけるモノクローナリテイーの診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 白血病及びリンパ腫におけるモノクローナリティーの診断法 本発明は悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）を検出し、その直系を測定するため に白血病及びリンパ腫において使用することができる診断法に関する。

免疫応答性細胞であるリンパ球には （ａ）各々、特定の外来抗原に結合する特異性免疫グロブリン分子を産生ずるＢ −リンパ球、及び（ｂ）各々、細胞をして特定の外来抗原に結合するのを可能に する特異性表面リセブターを存するＴ−リンパ球 という２つのタイプがある。

各Ｂ−リンパ球は他の全てのＢ−リンパ球の免疫グロブリン遺伝子とは構造がや や異なり、他方Ｔ−リンパ球を含めて他の全ての体細胞（ｂｏｄｙ　ｃｅｌｌｓ ）の免疫グロブリン遺伝子とは構造が著しく異なる、他にはない独特の免疫グロ ブリン遺伝子を含む。同様に、各Ｔ−リンパ球は他の全てのＴ−リンパ球のＴ− リセブタ遺伝子とは構造がやや異なり、他方Ｂ−リンパ球を含めて全ての体細胞 のＴ−リセブタ遺伝子とは構造が著しく異なる、他にはない独特のＴ−リセブタ 遺伝子を含む。

リンパ系白血病及びリンパ腫はリンパ組織の癌のｌ形特界平４−５０１３５５　 （３） 態である。各白血病又はリンパ腫は単一のＢ−又はＴ−リンパ球から生じ、それ が複合し、拡がり、そして治療しなければ最後には死をもたらす。腫瘍の細胞は 全て単一の細胞に由来するので、それらは全て遺伝的に同一であり、全て同一の 唯一の遺伝子、即ち腫瘍がＢ−リンパ球に生じた場合は独特の免疫グロブリン遺 伝子を、又は腫瘍がＴ−リンパ球に生じた場合は独特のＴ−リセブタ遺伝子を含 む。

逆に、もし組織に白血病又はリンパ腫によって冒されている疑いがある場合、上 記の独特の免疫グロブリン遺伝子が検出されれば、それはＢ−リンパ球腫瘍を推 定させる証拠となり、これに対して独特のＴ−リセブタ遺伝子が検出されれば、 それはＴ−リンパ球腫瘍を推定させる証拠となる。

本発明の目的は組織の試料の中に白血病又はリンパ腫が存在するか、それとも存 在しないかを、その試料の中にモノクローナルのＢ−またはＴ−リンパ球集団が 存在するか、存在しないかを測定することによって判定することである。一般的 に言うと、本発明は免疫グロブリン分子またはＴ−リセブタ分子の個別セグメン トに焦点を当て、そして組織試料中のこれらセグメントの全て又は大部分が再配 置され、かつ正確に同一の長さを有するかどうかを測定することによって上記の 判定を行うものである。ここで、それらセグメントの全て又は大部分が同一の長 さを持つことはそれらセグメントが同じ独特の分子に由来することを意味する。

現在のモノクローナリテイ−（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｉｔｙ）の検出法は制限酵 素の消化、続いてサウザン・プロッティング（ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉ ｎｇ）及び遺伝子の精査に基づく。このアプローチは複雑で、高価で、しかも時 間がかかり、そのため情報は、それが実質的に実用価値のあるものとするには通 常余りにも遅く提供される。

これに対して、本発明の方法は速やかで、かつ敏感な診断試験法を提供する。更 に、組織試料として使用することができる材料として血液、節又は骨髄中の腫瘍 組織、ホルマリン固定され、包埋された組織材料、アスピレート（ａｓｐｉｒａ ｔｅ）された細胞材料又はスライド上の細胞があるので、本発明の方法は用途が 非常に多い。

本発明によれば、組織の試料の中の免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ−リセブ タ遺伝子のセグメント長の均−性又は不均一性を判定して試料中のＢ−及び／又 はＴ−リンパ球集団のモノクローナリティーの存否を表示することを含んで成る 、組織試料におけるリンパ系白血病及び／又はリンパ腫の検出法が提供される。

本発明の１態様によれば、 （ａ）組織の試料の中の免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ−リセブタ遺伝子の セグメントをそれらセグメントのための特異性プライマー又は特異性プライマー 混合物を使用するポリメラーゼの連鎖反応で拡大する工程、及び （ｂ）拡大されたセグメントを大きさに基づいて分離してそれら拡大セグメント の長さの均−性又は不均一性を判定する工程 を含んで成る、組織試料におけるモノクローナリティー及び推定悪性腫瘍を検出 し、及び／又は主要のＢ−リンパ球又はＴ−リンパ球の起源を判定する方法が提 供される。　１つの特定の態様において、使用されるプライマーは免疫グロブリ ン遺伝子及び／又はＴ−リセブタ遺伝子のセグメントのためのコンセンサスブラ イマー（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　ｐｒｉｍｅｒｓ）である◎本発明はまた組織の試 料の中の免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ−リセブタ遺伝子のセグメントをポ リメタラーゼの連鎖反応で拡大するための、免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ −リセブタ遺伝子のセグメント用の１組の特異性プライマーまたは特異性プライ マー混合物を含んで成る、上記で広く概説した本発明の方法を実施するためのキ ットにも及ぶ。

もう１度述べると、１つの特定の態様において、使用されるプライマーは免疫グ ロブリン遺伝子及び／又はＴ−リセブタ遺伝子のセグメントのためのコンセンサ スブライマーである。

免疫グロブリン（Ｉｇ）及びＴ−リセブタ（Ｔｒ）の遺伝子は総ての細胞の中に 存在する。各遺伝子は４つの族、即ち可変（Ｖ）領域、不同（Ｄ）領域、結合（ Ｊ）領域及び不変（Ｃ）領域の族（Ｄセグメントを欠く免疫グロブリンの軽鎖を 除く）より成る。Ｂ−またはＴ−リンパ球の発生過程において、遺伝子は各族の ランダムに選択されたｌ員が一緒に結合されて最終分子を形成するように再配置 される。ＶＤ、ＤＪ及びＪＣの各結合点ではランダムな突然変異も起こる。この ランダムな結合と突然変異の結果、最終の免疫グロブリン又はＴ−リセブタの分 子は事実上地には見られない独特なものとなる。

しかし、本発明に関して特に重要な２つの特徴がある。

即ち、 （ａ）ＶＤ、ＤＪ及びＪＣ結合点において取り除かれ及び／又は挿入される塩基 数が極めて変りやすく、そのため異なる免疫グロブリン又はＴ−リセブタの分子 、特にＶＤ、ＤＪ及びＪＣの各結合間のセグメントは長さが実質的に異なる。

（ｂ）遺伝子内に絶対的同一性がないとしても遺伝子内には類似性を持つ若干の 領域が存在する。これらの領域は“フレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）”と 称されるＶ領域のある特定の部分、及びＪ領域とＣ領域の部分を含む。

本発明はポリメラーゼの連鎖反応（ＰＣＲ）の新しい様式での使用を含む。ＰＣ Ｒは１９８５年に初めて記載されたが、今や周知のものであって、小さいｃＤＮ Ａセグメントの配列が知られているという条件でそれらセグメントの指数関数的 な拡大を可能にする。ＰＣＲの原理は２つのＤＮＡプライマー（その１つは各Ｄ ＮＡ鎖についてのものである）が変性とそれに続＜ＤＮＡ合成の連続サイクルに おいて使用され、これによってプライマーにより結合されたＤＮＡのセグメント の指数関数的拡大がもたらされる、ということである。各サイクルには６〜７分 間要するので、２０〜３０サイクルを実施するのが実際的であり、また各サイク ルの効率は最大で７０〜８０％であるので、高忠実度においては最大ｌＯ・倍の 拡大が可能である。

記載したＰＣＲはプライマーに基づくものであり、各各は既知の配列に対して正 確に相補性である。本発明の１つの態様において、免疫グロブリン及びＴ−リセ ブタの分子を拡大するという問題はコンセンサスブライマーを免疫グロブリン及 びＴ−リセブタの遺伝子の中に類似しているが同一ではない配列をそれぞれ存す る領域に対して使用することによって解決された。これらの領域は免疫グロブリ ンのＶ領域のフレームワーク部、Ｔ−リセブタ遺伝子の保存Ｖ領域、並びに免疫 グロブリン遺伝子又はＴ−リセブタ遺伝子のり、Ｊ及び／又はＣ領域の１部分を 含んで成る。これら領域に対するプライマーは２つの理由から作用する。第一に 、それらプライマーは免疫グロブリン又はＴ−リセブタのＤＮＡまたはＲＮＡの 適切な領域に対して十分に相同性である構造を有し、それによって全ＤＮＡ又は ＲＮＡにおけるそのような領域だけを認識することである。第二に、ＰＣＲ領域 は２つのプライマーによって認識される配列か短かい場合に作用するだけである 、ということである。この状態はｖｌＤ及びＪ（又はＣ）領域が一緒に結合され ており、成熟した免疫グロブリン又はＴ−リセブタの分子が形成されているＤＮ Ａ又はＲＮＡのそのようなセグメントについて達成されるに過ぎない。これら２ つの性質の結果として、プライマーは最終の成熟免疫グロブリン又はＴ−ＩＪセ ブタ分子だけを認識し、拡大するのである。

ＰＣＲにおいてこれらプライマーを使用すると、組織試料の中の成熟免疫グロブ リン又はＴ−リセブタの全分子のプライマー間セグメントが拡大される。拡大さ れたセグメントはＶＤ、ＤＪ　（及びＪＣ）の結合点を横断している。その結果 、ＤＮＡ配列に無関係にＤＮＡの最終拡大片は、組織中の免疫グロブリン又はＴ −リセブタの遺伝子が全てモノクローナルな悪性の集団に由来する場合には単一 の長さを有し、あるいはそれらの分子が不均質な悪性でない集団に由来する場合 には不均一な長さを有する。免疫グロブリン分子のためのプライマーはＢ−リン パ球起源の悪性集団を同定し、他方Ｔ−リセブタ分子のためのプライマーはＴ− リンパ球起源の悪性腫瘍を同定する。

ＤＮＡの拡大片の長さは分子を大きさに基づいて分離する方法でＤＮＡ分子を分 離することによって簡単に測定することができる。現在、アガロースゲル又はポ リアクリルアミドゲル中での電気泳動が用いられているが、クロマトグラフィー が自動化の可能性のために色々な利点を持つと思われる。大きさに基づいて分離 された分子は非同位体手段、例えばエチジウムブロマイド染色法で、若しくは放 射性同位体の組み込みで、または内部プローブへのサウザン転移（Ｓｏｕｔｈｅ ｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）とハイブリダイゼーションで同定することができる。

本発明の更に他の特徴は次の詳細な説明によって明らかになるだろう。

総ての免疫グロブリン重鎮遺伝子において同様であるＤＮＡ配列の４つの領域は 次の通りである：（ａ）　Ｊ−領域の３′末端において、３４塩基のうち３０塩 基が全６本の生殖系列のＪ−鎖の中に保存される。

ＤＮＡ　（＋）鎖に付く３つのＤＮＡプライマーが用いられた。即ち、 ＥＬＪｒ５”ＴＧＡＧＧ　ＡＧＡＣＧ　Ｇ”！’ＧＡＣＣＡＧＧＧ　ＴＮＣＣＴ πＧＣＣＣＣＡＧ３゜ＷＨ−ＳｏＴｕＧＧ　ＡＧＡＣＧ　ＧＴＧＡＣＣ３””ｎ Ｊｙ−５″　ＧＴＧＡＣＣＡＧＧ（３”ｒｓｃｃｒ　ＴＧＧＣＣＣＣＡＧ３゜（ ただし、Ｎは４種のヌクレオチド塩基のいずれかを表（ｂ）〜（ｄ）　Ｖ−領域 は３つの“フレームワーク”領域とその中に介在する“鎖決定“領域に細分する ことができる。“フレームワーク“領域はあらゆる免疫グロブリンの中で同様で あり、他方“鎖決定”領域は大幅に変化する。１７リンパ球系列の配列を比較す ることによって、ＤＮＡの保存伸張鎖（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　５ｔｒｅｔｃｈｅ ｓ）を各フレームワーク領域において同定した。しかし、それらの配列は余り保 存されない。不適組合わせのＰＣＲに対する影響の仕方は不明確であるので、若 干の合成プライマーには重複が導入された。ＤＮＡの（−）鎖にハイブリダイズ するプライマーに次のものがある：ＦＩＩＢＩ：　Ｓ’（Ｙ［Ｃ／ＧＪ［Ｔ／Ａ ＩＣＣｒＧ（’ｒ／ＣＪ［Ｇ／Ａ］ＣＡＧｔＴ／ＣＩＣＴＣｒＧＧ　３’Ｆｊｌ ｌＢＳ：　Ｓ’ＣｒＣＴＣＣｎｉ℃　ＣＡＧＣＣｐ＝Ｎｃ３’ＤＮＡの（＋）鎖 に付くプライマーにはｍＡ−ｘ　Ｉ画ＭＴＡＣＡ［Ｇ／Ｃ１［Ａ／ＧＩＧＣＣＫ ；ＴＧＴ　３’がある。

ＤＮＡの反対鎖に付くプライマー及び／又は他の免疫グロブリン鎖のためのプラ イマーも等しく十分に使用することができるだろう。

内部の又は末端の制限酵素部位を含有するように変性されたプライマーを使用し ても好結果が得られた。それらは引続くクローニングの助けになる。

Ｔ−リセブタ遺伝子のために類縁のプライマーが使用される。これら遺伝子のた めのプライマーを選択する際に適用される原理は免疫グロブリン遺伝子について の原理と同じであるが、強調しなければならないいくつかの相違点がある。特に 、ＶＤ、ＤＪ及びＪＣ結合部におけるヌクレオチドの除去とランダムヌクレオチ ドの挿入による不同性の発生に更に強い力点がある。Ｔ−リセブタのＶ−領域は 可変性がより小さい領域及び“フレームワーク”領域、並びに可変性のより大き い“鎖決定”領域に容易には分割することができない。しかし、ＶＤ結合部付近 では約２０塩基の伸張鎖が保存される。

Ｃ工＾　Ｓ＠　Ｇｈ＾　ＴＡＧ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＣｒＴ　（Ｔ　ｒＥ Ｃａｋ　Ｓ’ＡＣｒＧＧＡｆｆｌゴＡＧ＾光式ゴ３゜ＪＡＴ２はＰＣＲのための Ｊ−領域プライマーである。

ＪＡＴ　１は内部プローブである。

３ＶＴＡはＰＣＲのためのＶ−領域プライマーで、ＪＡＴＩから約８０塩基対で ある。

５ＶＴＡ＋１ＪＡＴ１から２００〜３００塩基対（７）Ｖ−領域プライマーであ る。

ＣＴＡとＰＴＡは不変領域内にある。

■−及びＪ−領域プライマーはコンセンサンプライマーＥ−５°ＴＧＴＡＣＴＧ ＧＴＡ　ＴＣＧＡＣＡＡＧ　３゜ｃｎ　Ｓ＠　Ｔｒｉ’　ＧＧＧ　ＴＯＹ　ＧＧ Ｇ　ＡＧＡ　ｒ　ＣＴＧ　Ｃ３”ｍ　Ｓ”　ＣＴＴ　慣ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＣＡＡ 　ＡＣＡ　３’ＪＢＴ２はＰＣＲのためのＪ−領域プライマーである。

ＪＢＴＩは内部プローブである。

３ＶＴＢ１と３ＶＴＢ２はそれぞれＴＣＲベーター副分類のベーター１及びベー ター、のための、ＪＢＴＩから約８０塩基対のＶ−領域プライマーである。

５　ＶＴＢ　１　ト５　ＶＴＢ　２ｉｔｌ’ＬソれＴＣＲベーター副分類のベー ター、及びベーター２のための、ＪＢＴＩから２００〜３００塩基対（７）Ｖ− 領域プライマーである。

ＣＴＢとＰＴＢはβ遺伝子総てのための不変領域内にある。

Ｖ−及びＪ−領域プライマーはコンセンサスプライマー茜ｎト５’　ＡＡＧ　Ｔ ＧＴ　ＴＧＴ　ＴＣ（：　ＡＣＴ　ＧＣＣＡＡＡ　１゜ユｍ　ｓ’″　ＧＴＣ丁 Ａτ　丁ＡＣ”ｒＧＩ　ＧＣＣＡＣＣ丁ＧＧ３”エ　５−口Ｇ＾Ｇσ買Ｇ雷ＧＡ Ｇ賜３゜ｆｆｌ　Ｓ’　ＧＣＡ、八Ｇ＾　＾へ＾ＡτＡＧ丁Ｇ　ＧＧＣ３’ＪＧ Ｔ１２はＰＣＲのためのＪ−領域プライマーである。それはＴＣＲクラスのガン マ−の４つの公知のＪ−鎖のうち２つの配列に基づく。

３ＶＴＧはＪＧＴ１２から約８０塩基対のＶ−領域プライマーである。

ＣＴＧとＰＴＧは不変領域内にある。

不変領域のプライマーは、個々のケースによるが、場合によっては拡大のために 使用されるので、ＲＮＡから出発し、そして１回の逆転写を行うことによってし ＲＣＲの拡大を先行させることが必要であろう。

上記の内部プローブＪＡＴＩ及びＪＢＴＩは、拡大産生物をエチジウム−染色バ ンドとして可視化することができない場合、その拡大産生物の最終検出のために 使用することができる。プローブには通常は放射線で標識を付けることができ、 それによって非常に敏感で特異性の、拡大産生物の検出法が得られる。

γ！ｌ（Ｔｇリセプタ）に適用可能なもう１つ別のアブローチは９Ｖ−領域と５ Ｊ−領域のためのプライマー混合物を使用するものである。使用配列は次の通り である： テＣｆに２ＰＳ’ｒ　Ｓ”　Ｃ丁’ｒＣＣＴＧＣＡＧ　ＡＴＧ　Ａ（：’ＩＩ’ 　ＣＣＴ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＡＧＧＴｒＧ３ゝ ？１ＷＧ３Ｐｆｒ　Ｓ”　ＣＴＴＣＣＴＧ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＡＣＧ　ＴＣＴ　 ＣＣＡ　ＣＣＧ　ＣＡＡ　ＧＧＧＡπ３畳 ＴＣＲＶＧ４ｍ　５°ＣＴｒＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＡπＡＣＴ　ＣＣＴ　ＡＣＡ　 ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＧテτＧｌ＠ ＴＣＷＧ５１’ｒ　５’　ＴｒＣＣＴＣＣＪｋＧ　ＡπＡＣＧ　’ｅ　ＣＣＡＡ 　ａｒｃ　ＡＡＡ　（４’ｆ’Ｇ３ゝ ＴＯｆｆＧＪｌｉ’ＳＴ　Ｓ＠ＣｒＴＣＣＴＧＣＡＧ　ＡＴＯＡＣＴ　Ｃｅｒ　 ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＧＧＧＴＴＣ３’ ＴＣＲＶＧ９Ｐ！ｉ　５’　ＧＧ（Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）　ＡＣｒＧ　ＣＡＧＧＡＡ ＾ＧＧＡＡτ−ＧＣＡＴＩ（２）３゜ ｆｆＧＩＯＰ１５Ｔ　Ｓ＠ｃｒＣＴＧ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＣＴ ＣＧＡＣＧＣＡ　ＧＣＡ　３”丁ＣＲＶＧ１１Ｐｓ’ｒ　５’　ｃＡ　ＣＴＧ　 ＣＡに　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＴＧＣ？ＣＡ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　３゜ＴＣＲ ’ＶＧ１２１’Ｓ’Ｔ　Ｓ”　ＡＣＴ　ＣＴＣ（ＪＧ　ＣＣＴ　ＣＴＴ　ＧＧＧ 　ＣＪｋＣＴＧＣＴＣＴ　ＪＩＪｕ　３”ＪＧ’ｒ１２−　Ｓ”　ＡＡＧ　’ｒ ＧＴ　ＴＣＴ　ＴＣＣＡＣＴ　（：ＣＣＡＡＡ　３゜、７Ｇ？３　５°　ＡＧＴ ＴＡ　ＣＴＡ　ＴＧ　ＡＧ　Ｃ（Ｔ／Ｃ）Ｔ　ＡＧＴ　ＣＣＣ３゜ＪＧＴ４　Ｓ ”　ＴＧＴ　ＡＡＴ　ＣＡＴ　ＡＡＧ　ｃｒｒ　ＴＧＴ　ＴＣＣ３゜■−領域プ ライマーは標的に精密にマツチする２０〜４０塩基（３′末端に最も近いもの） を含有する。それらプライマーはまた５°末端付近に制限酵素のための部位とし て配列ＣＴＧＣＡＧを含有する。この部位は、クローニングが必要な場合に、後 続のクローニングの助けＤＮＡ又はＲＮＡは共に用いることができる。

ｃＤＮＡを逆転写酵素及び１つの−又は両ＰＣＲプライマーを用いてＲＮＡから 作る。ｃＤＮＡを沈殿させ、そして水に再懸濁し、次いでＰＣＲ反応を用いる。

この反応をサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ） からのポリメラーゼを用いて約３０サイクル行う。この反応の産生物類をアガロ ースゲル上で分離し、そしてエチジウムブロマイドによる染色を行って可視化す る。プライマーの結合部位に内部結合するＤＮＡプローブへのサウザン・プロッ ティングとハイブリダイゼーションも通常行われる。拡大されたセグメントの大 きさの測定にはコントロール・サイズ−マーカー（Ｃｏｎｔｏｒｏｌ　ｓｉｚｅ −ｍａｒｋｅｒｓ）か助けになる。

第１表及び第２表に免疫グロブリン遺伝子だけを用いてモノクローナリティーに ついて各種試料を試験した結果を示す。

第１表　抽出されたＤＮＡについての結果正常Ｔ細胞のクローン　１５　拡大な しコメント：予想通り 正常Ｂ細胞のクローン　１６　１つ又は２つの個別正常混合血液のリンパ球　２ ０　広がったピークコメント：予想通り Ｂ細胞リンパ腫　２４　１９の中に１つ又は２つの個別バンド０． ５つの中に拡大なし− コメント：　８予想通り。。拡大を示していないケースは多分他とは異なった形 の再配置を伴ったケースに該当する。

第２表　固定（ｆｉｘｅｄ）材料及び節のアスピレート固定材料 Ｂ細胞リンパ腫　２６　２４の中に１つ又は２つの個別バンド Ｔ細胞リンパ腫　７　拡大なし 反応性の節　９　拡大なし 癌　１２　拡大なし 節のアスピレート Ｂ！］？胞リンパ腫　５　３つの中に１つ又は２つの個別バンド 癌　２　拡大なし これらの結果は前記のプライマーＬＪ、−及びＦＲ３Ａを用いて得られたもので ある。３ｏサイクルの拡大を行い、拡大されたフラグメントを２％の寒天中での 電気泳動で分離し、そしてエチジウムブロマイドで染色して紫外光での可視化を 可能にした。同様に結果が最後の５サイクルの拡大のために放射性ヌクレオチド （ＣＴＰ）を加え、電気泳動を行い、そしてフラグメントをオートラジオグラフ ィーで可視化することによって得られた。

Ｄ、Ｔ−リセブタのプライマーを使用してのモノクロ−コンセンサンプライマー の１つの対又は他の対を用い、上記と同じＰＣＲ法を使用すると、個別の再配置 が検出された。この検出においては８つの正常Ｔ−細胞クローンのうち６つに１ つのプライマー対又は他のプライマー対が用いられた。

個別バンドを示す プライマーの組合わせ　クローン数 ３ＶＴＡ及びＪＡＴ　２　３ ３ＶＴＡ及びＪＢＴ２　５ ３ＶＴＢ２及びＪＢＴ２　２ ５ＶＴＢｌ及びＪＢＴＩ　５ ５ＶＴＢ２及びＪＢＴ２　４ 同様に、前記の全９つのＶ−領域プライマーの混合物（ＴＣＲＶＧ２ＰＳＴ−Ｔ ＣＲＶＧ　１２ＰＳＴ、並びにＪＧＴ、□−、ＪＧＴ、及びＪＧＴ４　）を用い ると、４つの正常Ｔ−細胞クローンのうちの３つに個別再配置が検出された。

手続補正書（自発） 平成３　年Σ月ＩＧム

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．組織の試料中の免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグ メント長の均一性又は不均一性を判定して該試料中のＢ−及び／又はＴ−リンパ 球集団のモノクローナリティーの存否を表示することを含んで成る、組織試料に おけるリンパ系白血病及び／又はリンパ腫の検出法。
2. ２．（ａ）組織の試料中の免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ−リセプタ遺伝子 のセグメントをそれらセグメントのための特異性プライマー又は特異性プライマ ー混合物を使用するポリメラーゼの連鎖反応で拡大し、そして （ｂ）拡大されたセグメントを大きさに基づいて分離してそれら拡大セグメント の長さの均一性又は不均一性を判定する 工程を含んで成る、組織試料におけるモノクローナリティー及び推定悪性腫瘍を 検出し、及び／又は腫瘍のＢ−リンパ球又はＴ−リンパ球の起源を判定する方法 。
3. ３．該プライマーが免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグ メントのためのコンセンサスプライマーである、請求の範囲第２項に記載の方法 。
4. ４．該組織試料が血液、節又は骨髄における腫瘍組織、ホルマリン固定され、包 埋された組織材料、アスピレートされた細胞材料及びスライドガラス上の細胞か ら選択されたものである、請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。
5. ５．大きさに基づいて分離する該工程が電気泳動法及びクロマトグラフィーから 選択されたものである、請求の範囲第２項に記載の方法。
6. ６．大きさに基づく該分離工程がアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルに よる電気泳動法から成る、請求の範囲第５項に記載の方法。
7. ７．大きさに基づいて分離され、拡大された該遺伝子のセグメントを非同位体手 段、放射性同位体の組み込み、又は内部プローブヘのサウザン転移又はハイブリ ダイゼーションによって検出する、請求の範囲第２項に記載の方法。
8. ８．非同位体手段による該検出がエチジウムブロマイド染色法を含んで成る、請 求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．免疫グロブリン遺伝子のセグメントのための該プライマーが免疫グロブリン のＶ領域のフレームワーク部に対するプライマー及び該遺伝子のＤ．Ｊ及び／又 はＣ領域の一部分に対するプライマーから成る、請求の範囲第２項に記載の方法 。
10. １０．免疫グロブリン遺伝子のセグメントのための該プライマーが 【配列があります】 （ただし、Ｎはヌクレオチド塩基のうちのいずれかを表わす） から選択されたものである、請求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．Ｔ−リセプタ遺伝子のセグメントのための該プライマーがＴ−リセプタ遺 伝子の保存Ｖ領域に対するプライマー及び該遺伝子のＤ．Ｊ及び／又はＣ領域の 一部分に対するプライマーから成る、請求の範囲第２項に記載の方法。
12. １２．Ｔ−リセプタ遺伝子のセグメントのための該プライマーが （ａ）Ｔ−リセプタのα−鎖プライマー：【配列があります】 （ｂ）Ｔ−リセプタのβ−鎖プライマー：【配列があります】 （ｃ）Ｔ−リセプタのγ−鎖プライマー：【配列があります】 から選択されたものである、請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．Ｔ−リセプタ遺伝子のセグメントのための該プライマーが Ｖ−領域 プライマー配列 【配列があります】 Ｊ−領域 プライマー配列 【配列があります】 から選択された、Ｖ−領域及びＪ−領域のためのＴ−リセプタ遺伝子のγ−鎖プ ライマーの混合物から成る、請求の範囲第１１項に記載の方法。
14. １４．組織の試料中の免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセ グメントをポリメラーゼの連鎖反応で拡大するための、免疫グロブリン遺伝子及 び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメント用の１組の特異性プライマー又は特異 性プライマー混合物を含んで成る、請求の範囲第２項に記載の方法を実施するた めのキット。
15. １５．免疫グロブリン遺伝子及び／又はＴ−リセプタ遺伝子のセグメントのため の１組のコンセンサスプライマーを含んで成る、請求の範囲第１４項に記載のキ ット。
16. １６．請求の範囲第９項または第１０項に記載の、免疫グロブリン遺伝子のセグ メントのためのプライマーを含んで成る、請求の範囲第１４項に記載のキット。
17. １７．請求の範囲第１１項若しくは第１２項又は第１３項に記載の、Ｔ−リセプ タ遺伝子のセグメントのためのプライマーを含んで成る、請求の範囲第１４項に 記載のキット。