JPH05509000A - Ｄｎａシーケンス決定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡシーケンス決定方法 関連特許および出願の参照 本已願は米国特許第４，８３３，３３２号［走査蛍光検出系Ｊ　（Ｓｃａｎｎｉ ｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）　（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｅｔ　ａ ｌ、）　、米国出願第０７１０５７５６６号（１９８７年６月１２日出願、出願 人：　Ｐｒｏｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　ｒＤＮＡシーケンシング方法、システ ムおよび試薬Ｊ　（Ｍｅｔｈｏｄ、　Ｓｙｓｔｅｍｓ。

ａｎｄ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　）　（Ｉ Ｐ−５９７−Ａ）、および米国出願筒０７１５４５．７４６号（１９９０年６月 ２９日出願、出願人：　Ｄａｍ　ｅｔ　ａｌ、）　ｒＤＮＡシーケンス決定方法 Ｊ　（Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎ ｃｅｓ）　（ＩＰ−０８４６）に関連する。

技術分野 本発明はより正確なりＮＡクシ−ンス情報を得る方法に関するものである。

背景技術 ＤＮＡシーケンシングは現代分子生物学の柱石となる分析技術の一つである。シ ーケンシングのための信頼性のある方法の開発が遺伝情報の機構の理解に大きな 進展をもたらし、遺伝子材料の操作（すなわち、遺伝子工学）を可能にした。

現在ＤＮＡシーケンシングのための二つの一般的な方法がある。すなわち、マク サム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）の化学的分解方法［Ａ、Ｍ、 　Ｍａｘａｍ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ、、　Ｖｏｌ、　６５．４９９−５５９　（１９ １１ｔＯ）］　と、ササンガのジデオキシ鎖停止方法［Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ、　 ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、　７４．５ ４６３−５４６７（１９７７）］がある。これら二つの方法の共通の特長は電気 泳動により分析される１組のＤＮＡフラグメントの生成である。これらの技法は フラグメントを調製するのに使用される方法が異なる。

マクサム−ギルバート技法では、ＤＮＡフラグメントはシーケンシングされるべ きＤＮＡ片の塩基特異性化学開裂により調製される。シーケンシングされるべき ＤＮＡ片は、まず、３２ｐで５′−末端標識され、次いで４つの部分に分割され る。各部分は、所与の塩基（または複数の塩基）に隣接する位置でＤＮＡを開裂 するように設計された異なる組の化学処理に付される。その結果、すべての標識 化フラグメントはＤＮＡ原片と同じ５′−末端を有し、開裂の位置によって決る ３′−末端を有する。この処理はゲル電気泳動により分離するのに都合のよい長 さのＤＮＡフラグメントを生成する条件下で行われる。

サンガーの技法では、ＤＮＡフラグメントはシーケンシングされるべきＤＮＡ片 の部分的酵素的複製（すなわち、合成）により生成される。最も普通のバージョ ンでは、シーケンシングされるべきＤＮＡ片は標準的技法を使用して、バクテリ オファージＭ１３のような、大きな、環状の、一本１ｉＤＮＡ片である「シーケ ンシングベクター」内に挿入される。これは複製工程のためのテンプレート（鋳 型）となる。挿入物（インサート）のすぐ上流のテンプレート部分の領域に相補 的なシーケンスを持つ短いＤＮＡ片がアニールされて合成のためのプライマーと して役立つテンプレートとなる。４種の天然デオキシリボヌクレオシドトリフオ スフェート（ｄＮＴＰ）の存在下、ＤＮＡポリメラーゼはプライマーを３′−末 端から延長してインサートの領域のテンプレートの相補的複製を生成する。シー ケンシングフラグメントの完全なセットを生成するには、４つの反応が並列に行 われ、それぞれが４種のｄＮＴＰと一緒に各塩基に対して一つの単一のジデオキ シリボヌクレオシドトリフオスフェート（ｄｄＮＴＰ　）ターミネータ−を含ん でいる。（３２Ｐ標識化またはフルオロフォア標識化ｄＮＴＰが添加されて標識 化フラグメントを与える）。ｄＮＴＰがポリメラーゼにより取り込まれると、鎖 延長が継続できる。対応するｄｄＮＴＰが選択されると、鎖は停止される。ｄｄ ＮＴＰのｄＮＴＰに対する比を調整して適当な長さのＤＮＡフラグメントを生成 する。４種の反応混合物のそれぞれが、このように、同じジデオキシヌクレオシ ド残基を３′−末端に持ち、プライマー定義された５′−末端を持つフラグメン トの分布を含む。

サンガー法でもマクサム−ギルバート法でも、一般に物理的方法では直接決定で きない塩基シーケンス情報が決定できる鎖長情報に変換されている。この決定は 電気泳動分離により達成できる。変性条件下（高温、尿素存在等）では、短いＤ ＮＡフラグメントは硬い棒であるかのように移動する。電気泳動にゲルマトリッ クスが使用されると、ＤＮＡフラグメントはサイズによって選別される。シーケ ンシングに要求される単一塩基解像度は、通常、高々数百塩基を含むＤＮＡフラ グメントについて得ることができる。

完全なシーケンスを決定するためには、マクサム−ギルバート法またはサンガー 法のいずれかにより生成された４組のフラグメントが電気泳動に付される。この 結果、ゲルの長さに沿って空間的に解像されたフラグメントが得られる。（３２ Ｐ標識を置き換える）染料を識別し、この情報を使用してＤＮＡシーケンスを決 定する一つの方法が上述したＰｒｏｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、出願に記載されている 。この系は米国プラウエア州つィルミントン市在、イー・アイ・デニボン・ドウ ・ヌムール社から入手できるジェネシス２０００　（ＧＥＮＥＳＩＳ”　２００ ０）として知られる商用装置で得られる。ＤＮＡをシーケンシングするためのＧ ＥＮＥＳＩＳＴｌ′系は、密接に関連しているが依然として識別可能なレポータ ーすなわち標識からの放射エネルギーの存在を検知する手段を備え、このレポー ターは変更されたサンガーのＤＮＡ鎖延長方法において鎖停止ヌクレオチドとし て機能する化合物に共有結合で結合している。識別可能な蛍光レポーターは、サ ンガーのＤＮＡシーケンシング反応において代表される４種のジデオキシヌクレ オチド塩基、すなわちアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンのジデオキシ ヌクレオチド、のそれぞれに結合される。これらのレポーター標識化鎖停止試薬 は伝統的サンガー法の未標識化鎖ターミネータ−と置き換えられ、相当するデオ キシヌクレオチド、適当なプライマー、テンプレートおよびポリメラーゼとの反 応において結合される。得られた混合物は、相互に１塩基分だけ長さがことなり 、かつ、３′−末端が４種のＤＮＡ塩基の一つに相当する特異的に標識された鎖 ターミネータ−で終るＤＮＡフラグメントを含む。この新しい標識方法によれば 、伝統的サンガー法のデオキシヌクレオチドの一つに含有される在来の放射活性 標識を排除することができる。

これらのレポーター標識の検知は、　ＤＮＡフラグメント上の鎖ターミネータ− に結合したレーザで励起されたレポーターから異なる波長バンドの蛍光発光を受 ける２つの固定光増倍管（ＰＭＴ）を用いて達成できる。

これらのフラグメントは電気泳動により空間的および／または時間的に分離され てＰＭＴの感知領域に垂直な軸に沿って移動する。これらの蛍光発光は、まず、 一つの特性波長を一つのＰＭＴに向け、他の特性波長を他のＰＭＴに向けるよう に置かれた二色性その他の波長選択フィルタを通過する。このようにして、一連 の蛍光レポーターが間隔の詰まった発光波長を持つときでも、与えられた蛍光レ ポーターに特異的な第３の信号を生成するように比率を定めることができる、異 なるデジタル信号が各ＰＭＴに創成される。この系は４８ｇｎｍ線のような単一 のレーザ線によりすべて効率的に励起され、かつ最大値が相互に通常わずか５な いし７ｎｍだけ異なる密に間隔を置いた発光を有するレポーターを検知すること ができる。従って、関心のあるＤＮＡストランドにおける塩基配列指定（ｓｅｑ ｕｅｎｔｉａｌ　ｂａｓｅａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）が、ＤＮＡ中の４種の塩基の それぞれに相当する４種のレポーター標識化鎖ターミネータ−のそれぞれに対し て導かれる特異的な比に基づいて行うことができる。

塩基情報はＧＥＮＥＳＩＳＴＭ２０００ユニットの蛍光標識に含まれているが、 注意されるのは、この情報は測色標識（Ｓ、　Ｂｅｃｋ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｉ、、　１６４　（２）　５１４−５２０（１９８７））　、化学ルミネ ッセンス（Ｓ、　Ｂｅａｋ、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　１７． ５１１５−５１２３　（１９８９））その他の信号にも含まれていてもよい。

ＧＥＮＥＳＩＳ”　２０００シーケンサはジデオキシ鎖停止化学反応を利用して 設計されている。この化学反応を使用するために、４種の化学的に類似の染料を 使用して４種の塩基Ａ、Ｃ，Ｇ、Ｔを区別する必要があった。染料を注意深く選 び、徹底的に評価しない限り、それらの電気泳動移動度はあるＤＮＡシーケンス では異なることもあり、シーケンス情報の混乱につながる。これら４種の染料は 類似の電気泳動移動度を持つように選ばれているが、発光および励起スペクトル が重なり合っていた。極端に狭いバンドフィルタの光損失が大きすぎないように してこれらの染料を識別する必要から、２つの信号の比を使用してどの塩基が検 出器を通過したかを決定する２チヤンネル検出系が採用された。

ピークの解像度が良好でノイズがないときは比測定信号を解釈するのは容易であ る（第１図、）、シかしながら、各回で得られるシーケンス情報の量を最大にす るには、ピーク解像度が低くノイズが顕著な条件下でこの２チャンネル信号を正 確に解釈することが必要である。

２チヤンネルデータをこれらの条件下で分析する方法は従来の電気泳動図（ｅｌ ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ）およびクロマトグラムを処理するのに使用 されるものとは異なる。ここで説明する分析のアウトプットは塩基Ａ。

Ｃ，Ｇ、Ｔの同定のシーケンスであるが、クロマトグラフィーでは所望のアウト プットは典型的にはピーク位置と領域のリストである。クロマトグラフィー法は 一般に４つの比の内の１つと組み合わされた２つの検出器信号を用いない。２° 信号間のこの関係はＰｒｏｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、特許出願に記載されたシーケン サの特質である。シーケンシングではクロマトグラフィーよりも計算効率はより 重要な考慮点である。クラマドグラフィーでは２本または３本のピークについて 膨大な計算を実行することにより有用な結果を得ることができるが、シーケンシ ングでは３００本ないし６００本のピークを分析する必要がある。

Ｐｒｏｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、の比率測定系は、また、他のＤＮＡシーケンサのそ れと異なる信号解釈問題を提示している。プライマー化学反応を用いるシーケン サが［Ｌ、　Ｍ、　Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、、　１３゜２３９９−２４１２　（１９８５）　およびＷ、　Ａｎｓ ｏｒｇｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｍｅｔｈ、、　１３．３１５−３ ２３　（１９８Ｂ）］に記載されている。これらのシーケンサは、各塩基に対し て１種の、４種の信号チャンネルを用いている。

［Ｈ，Ｋａｍｂａｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６． ８１６−８２１（１９８ｇ）　］に記載のもののような他のシーケンサは４つの 電気泳動レーンのそれぞれに１つの信号を用いている。これらの系はさらに別の クラスのデータ分析方法を使用しているが、これは、４つの分離されたレーンか らの結果を適正なタイムシーケンスで位置合わせ、すなわち、整列させなければ ならないからである。

これらの自動化板ＤＮＡシーケンシングでは、レポータはＰｒｏｂｅｒ　ａｔ　 ａｌ、特許出願に記載のように蛍光分析を使用するものでもよく、測色（Ｓ、　 Ｂｅｃｋ、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１６４　（２）　５１４−５２０　（１９８７））　、化 学ルミネッセンス（Ｓ、　Ｂｅｃｋ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 、　１７．５１１５−５１２３　（１９８９）　）　、または他のタイプのもの でもよい。

（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４，８１１，２１８号明 細書）のようなプライマー化学反応を用いるシーケンサはＤＮＡフラグメントを 標識するのに使用することができる染料の選定においてそれほど限定されていな い。これらのシーケンサは各塩基に１つの、４つの信号チャンネルを使用するこ とができるので、比率計測信号を解釈するのに必要とされる複雑なアルゴリズム を要求しない、一方、これらのシーケンサはターミネータ−化学反応の利点を享 受することができない。

特に、プライマー化学反応はシーケンシングする各サンプルにつき４本の別個の 反応管を必要とするが、ターミネータ−化学反応が必要とするのは１本だけであ る。さらに、プライマー化学反応は「偽停止」からのエラーを受け易く、誤信号 はポリメラーゼがＤＮＡストランド上のある点を過ぎて進行することができない ときに生成される。

［Ｈ，Ｋａｏ＋ｂａｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６ ．８１６−８２１（１９８８）　］記載のもののような他のシーケンサは４つの 電気泳動レーンのそれぞれに１つの信号を用いている。これにより従来技術の自 動化ＤＮＡシーケンサの解像問題の遭遇する困難の多くが克服される。これらの 系は別のクラスのデータ分析方法を用いるが、これは４つの分離レーンからの結 果を適当なタイムシーケンスで位置合わせまたは整列しなければならないからで ある。いったん、レーンが位置合わせされると、これらのシーケンサに対するデ ータ分析方法はＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、の方法と同じものを使用 できる。

レーンの適正な位置合わせは明らかに正しいシーケンス決定をするのに決定的に 重要である。レーンの位置合わせが適正でないと、対応する塩基の解釈がでたら めになる。４つのレーンの位置合わせの問題は、その性質が組み合わせであるた め、複雑である。４つのレーンの全てにおける間隔の詰まった与えられた１対の バンドに対して、４！＝２ｘ３ｘ４＝２４の可能なバンドの順序がある。１つだ けが正しいシーケンスに対応する。位置合わせ工程はシーケンス解釈においてエ ラーを導入することがあり、このため、等しい解像度と信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ 比）を与えられても、上述したＫａｍｂａｒａにより記載されたタイプのシーケ ンサは、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒのシーケンサよりも正確なシーケンス情報の生 成量が少ないことがある。これらのシーケンサは分析すべき各ＤＮＡサンプルに 対して、４つの反応管を必要とするだけでなく、４つの電気泳動レーンをも必要 とすることに注意すべきである。

発明の開示 これらの正確さまたは解像度と位置合わせの双子問題は本発明の方法によりほと んど克服される。本発明の方法に従えば、塩基のシーケンスは、ＤＮＡをシーケ ンシングすべき各サンプルについて２つの電気泳動レーンを使用することにより 塩基のシーケンスを決定、すなわち、「命名」することができる。各レーンは２ つのターミネータ−染料を導入する。本発明に従えば、ＤＮＡをシーケンシング して４つの塩基Ｇ、Ｃ。

ＡおよびＴを確認する方法は、下記工程を具備している２４種の塩基の２種につ いて、それぞれ異なるレポーターを有する第１の組のレポーター標識化ＤＮＡフ ラグメントを生成し；これら４種の塩基の残る２種について、それぞれ異なるレ ポーターを有する第２の組のレポーター標識化ＤＮＡフラグメントを生成し；ゲ ル電気泳動により第１および第２の組をそれぞれ分離し；各組のそれぞれについ て、振幅の変動する第１の信号を発生して、レポーターの一つの特性と塩基がゲ ルを移動する速度とに応じたピークを形成し；各組のそれぞれについて、振幅の 変動する第２の信号を発生して、レポーターの一つの特性とそれぞれがゲルを移 動した速度とに応じたピークを形成し；かつ、ゲルを移動する順序で第１および 第２の信号を前記４種の塩基に対応する信号に変換する。

本発明の好適な実施例に従えば、上述した第１の組のＤＮＡフラグメントはＧお よびＣを含む。これにより、Ｃ信号ピークとすぐそれに続（信号ピークとの間の 間隔がおおいに変動的であるという周知のＧ−Ｃ圧縮現象が克服され易い。さら に、本発明の好適な実施例に従久ば、第１および第２の組がゲル上で隣接するレ ーンに分離されている。これが有利であるのは、分離すべきＤＮＡフラグメント が本質的に同じゲル組成、熱環境および電界に付されるからである。シーケンシ ング中は、４種の塩基信号は、塩基のゲル通過速度に従って順序づけられる。ま た、第１の組について使用されたレポーターは第２の組について使用されたレポ ーターと同じであってもよい。

この方法は多くの利点を有する。ターミネータ−化学反応はＰｒｏｂｅｒ　ｅｔ 　ａｌ、により記載された比率測定信号処理の複雑さがな（使用することができ る。この方法は、単一レーン系に必要とされる４種のレポーターではなく、似た ような電気泳動移動度と異なる分光特性を持つ２種のレポーターのみを使用する ことを必要としているに過ぎない。レーンの位置合わせが含まれているが、組み 合わせ論的ではない、というのは、２つの対象の２つの可能な順序が存在するだ けであるからである。２つの信号は、適正な整列が決定されるまで、すなわち、 以下に記載されるように、単に互いに「スライド」させるだけでよい、比率も複 雑な位置合わせアルゴリズムも使用していないので、この方法は与えられたサン プルから従来の方法よりも大量の正確なシーケンス情報を生成することができる 。４つのレーンでな（，２つのレーンを使用するのは、４つの分離した信号を得 るもう１つの４−レーン方法よりも経済的である。

また別の択一的方法では、本発明はプライマー・ラベリングとともに使用しても よい。サンガー化学反応またはマクサム−ギルバート化学反応のいずれを使用し てもよい。

図面の簡単な説明 本発明の詳細な説明と関連して以下の図面を考慮することによりもっと容易に理 解できよう。

第１図は、ＤＮＡフラグメントをシーケンシングするための本発明方法に従う工 程を示すフローチャートである。

第２図は、第１図に示すレーンを位置合わせするための方法において使用される 工程を示すフローチャートである。

第３図は、検出されたピークを時間に対して図示した線図であり、い（つかのピ ークの間隔を適正にするためにピーク間隔を設定する方法を説明するものである 。

第４図は、第１図のフローチャートの塩基命名工程の詳細を示すフローチャート である。

発明を実施するための最良の形態 本発明の方法は、上述したＲおよびＴの出力信号を与える２つの検出器を有する Ｇｅｎｅｓｉｓ”　２０００シーケンサに関連して説明する。これらの出力信号 は振幅が変動してＤＮＡフラグメントとともに使用されたレポーターの特性と塩 基がゲルを移動する速度とに従うピークを形成する。例えばＧｅｎｅｓｉｓＴｌ ′２０００シーケンサと共に使用するために入手できる試薬キットを使用して、 ＤＮＡサンプルが調製され、２つのターミネータ−反応が蛍光ジデオキシターミ ネータ−を用いて行われる。

１つの反応では、２種のターミネータ−ＧおよびＣだけが含まれる。他の反応で はＡおよびＴだけが含まれる。このベアリングはＧ−Ｃ圧縮現象の故に好ましい 。

これは、Ｃ信号ピークとすぐそれに続（Ｃ信号ピークの間の間隔がおおいに変動 し得るからである。ＧおよびＣターミネータ−が単一の反応に含まれていると、 ２つのレーンを整列するアルゴリズムが後でＧ−Ｃ間隔変動性を考慮に入れる必 要がない。２つの反応混合物はシーケンシングゲル上で分離される。これらの２ つの混合物をゲル上で隣接したレーンに置いてこれら２つのレーン間の不整列を 最小にするのが好ましい。上述したＧｅｎｅｓｉｓ装置を使用して各レーンから ２つの光増倍管信号が出て（る。

染料とターミネータ−の好ましい組み合わせはＧ−染料１、Ａ−染料１、Ｃ−染 料２およびＴ−染料２である。染料１と染料２の選択は多（の可能性がある。染 料１と染料２はそれら同士を識別するのに十分なスペクトル分離が得られるよう に、かつ、４種の塩基すべてについて最も強く、最も均一に分布した信号が得ら れるように選ばれなければならない。この後者のパラメータは実験的に決定され る必要がある。というのは、それがシーケンシング使用される酵素と反応条件に 複雑に依存しているからである。

４種の信号（２つのレーンのそれぞれからの２つの光増倍管信号）は正しい順序 で４種の塩基に対応する信号に変換されなければならない、まず、多対の光増倍 管は直交基底に変換して、１つの信号が１つの塩基に対応し他の信号が他の塩基 にに対応するようにする必要がある。これは２つの光増倍管がこれらの２つの塩 基に対して異なった応答をすることに基づいて行うことができる。　Ｇ−Ｃレー ンを例にとると：Ｐ１＝βＱｌ−Ｇ＋βｃ＋ｅｃ Ｐ２＝βａＺ＊ａ＋βＣ１”に こに、ＰｌおよびＰ２はＰＭＴ信号、ＧおよびＣは信号が得られるときの染料の 現実の濃度、およびβは２つのＰＭＴの２種の染料に対する応答を記述する。

そうすると、感知された染料の濃度を表す信号を次のように記述することが可能 である： Ｇ＝（βｅ２’Ｐｌ−β、、　−Ｐ２）／（βＣ２βＧ１−βＣ１βａｘ）［ｔ ｌＣ＝（βＱ１’Ｐｌ−βａ＋　・Ｐ２）／（β６２βｃ１−βＣ１βａｘ）　 ［２］他のレーンから、ＡおよびＴ信号が同じに得られる。

次に、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔ信号を位置合わせまたは整列させることが必要である 。信号の位置合わせのために多（のアルゴリズムが知られている（例えば、Ａ、 　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｐｉｃｔｕｒｅ　 ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　２９７−３０２　（１ ９７６））　ｍ一つの特別の方法は以下の実施例に記載されている。いったん信 号が順序づけられると、データは外見上は、各信号が１つの塩基に対応する米国 特許第４，８１１．２１８号明細書（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、） の系により生成されたものと同じである。そのデータに適用できる任意のシーケ ンス解釈手段を使用することができる。

第１図のフローチャートに示すように、レーンの位置合わせは第２図のフローチ ャートにおいてより詳細に示す手順により達成される。２−レーンデータ分析法 への入力として使用される４種の信号はＧ−ＣレーンおよびＡ−Ｔレーンの光増 倍管信号に対応する。これら４種の光増倍管信号は上述した式１および２を使用 して４種の塩基信号Ａ、Ｇ、ＣおよびＴに変換される。次に、Ｇ−Ｃレーンのピ ークの位置がつきとめられる。まず、ＧおよびＣ信号が合計される。得られたデ ータアレイは始めから終りまで走査され、データの一次導関数が一定の閾値（０ ，０００１５Ｖ／データ点）を超える傾きを持ってゼロを横切る任意の点がピー ク位置とされる。このように、Ｇ−Ｃチャンネル内のピークのリストが得られる 。Ａ−Ｔチャンネル内のピークのリストは同じ方法により他のレーンのデータか ら得られる。

次に、２つのアレイの整列が決定される。この整列は４０ビークのグループにつ いて行われる。第２図および第３図に示すように、ピーク位置の２つのリストが 組み合わされるときの整列が不適正であると、組み合わされたリスト内のピーク 間隔の変動幅が広くなる。

Ａ−Ｔビークがオフセット値だけシフトされて適正な位置になると、それにより 間隔変動は減少する。Ａ−Ｔビーク位置はＧ−Ｃピーク位置に対してシフトされ 、このシフトは、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔビークリストが組み合わされたときにピー ク−ピーク間隔の変動が最小になるオフセットの程度が見出されるまで行われる 。そのように決定されたオフセットを使用して、新しいＡ−Ｔデータアレイが創 成され、Ｇ−Ｃデータアレイに対して整列される。オフセットは１つの４０ピー クブロツクから次へ変動するので、直線的に内挿されたオフセット値が各データ 点で使用される。

ピークの命名を容易にするために、データは規格化される。すなわち、アレイは 同じ平均信号振幅を４つのチャンネルすべてに与えるようにスケーリングされる 。

塩基の命名は４つのアレイのいずれかにおける第１のピークで始まり、アレイを 下って一時に−ビーク進行する。第４図のフローチャートに示すように、いった ん予想されたピーク位置が決定されると、ピークが発見されるまで、この位置の 周りに振幅検索が行われる。ピークは上述したゼロ−横断（ｚｅｒｏ−ｃｒｏｓ ｓｉｎｇ　）規準により定義される。４つのチャンネルＡ、Ｃ。

Ｇ、Ｔの内の１つだけがその位置にピークを持つならばそれに対応する塩基が命 名される。２つのチャンネルが（通常、チャンネルの一方におけるノイズにより ）同じ場所にピークを持つと、最大ピークに対応する塩基が命名される。

あるいは、２つのレーンと２種の染料を使用する本発明をプライマー・ラベリン グとともに使用することができる。この場合、サンガー化学反応とマクサム−ギ ルバート化学反応のいずれを使用してもよい。本発明がこの態様で使用されると きは、プライマー・ラベリングについてと同様に、２種ではな（，４種の反応が 行われなければならない、しかしながら、これらの４種の反応は組み合わされて ゲル上の２つのレーンだけを必要とするようにすることができる。例えば、Ｇと ＣのスポットおよびＡとＴのスポットを組み合わせることができる。このように 、プライマー化学反応を使用しても、ゲル空間の効率的な使用とレーン位置合わ せの単純化が依然として利用できる。

本発明の方法は従来可能であったよりも正確で多数の塩基の命名が行える。

実施例 以下の実施例は２−レーン、２−染料シーケンシングの原理を説明するものであ る。実際、４染料−ターミネータ−、すなわち、ｄｄＧ−ＳＦ５０５　、　ｄｄ Ａ−ＳＦ５１２　、　ｄｄＣ−ＳＦ５１９　、　ｄｄＴ−３Ｆ５２６が使用され た。これにより、ジエネシス・システム（Ｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ）社か ら市販されている標識されたターミネータ−試薬を使用することができた。真正 の２−染料系はその合成がＰｒｏｂｅｒｅｔ　ａｌ、願に記載されている染料− ターミネータ−の組み合わせ、例えば、ＧｅｎｅｓｉｓＴ′１０００キットとし て市販されているｄｄＧ−ＳＦ５０５　、　ｄｄＡ−ＳＦ５０５　、　ｄｄＣニ ー５Ｆ５１９およびｄｄＴ−ＳＦ５１９　、を使用することもできよう。本実施 例のサンプルは、Ｃ染料をＡ染料から、またはＴ染料からＣ染料を識別すること を含まない仕方で、対で使用され分析される。従って、５Ｆ５０５を５Ｆ５１２ に、または５Ｆ５１９を５Ｆ５２Ｇに変えても結果に実質的な影響はない。

試薬は、注記したもの以外は、すべて米国プラウエア州つィルミントン市在、イ ー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール社、バイオテクノロジー・システムズ・デ ィビジョンの市販品を使用した。３つの反応、すなわち、Ｇ−Ｃ反応、　Ａ−Ｔ 反応およびコントロールのそれぞれに対して３μｇのＭ１３ｍｐ１ｇテンプレー トＤＮＡが使用された。各反応混合物は５ｅｑｕｅｎａｓｅＴ′緩衝液（米国オ ハイオ州りリーブチンド市在、ニー・ニス・バイオケミカル・コーポレーション （Ｕ、　Ｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　）社）中で１５ｎｇの１７−量体−ＩＬ ニバーサルＭ１３ブライマーオリゴヌクレオチド（５′−ＧＴＴＴＴ（：ＣＣＡ ＧＴＣＡＣＧＡＣ−３′）とともに容量２１μＬ（マイクロリットル）で９５℃ ２分間インキュベートしてテンプレートを変成し、ついで３７℃で１０分間イン キュベートしてこのプライマーをアニールした。Ｇ−Ｃ反応管は次いで２．５μ Ｌのジチオスレイトール、３．０μＬの各７５μＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　 ｄＧＴＰｊ１５よびｄＴＴＰ、および０．５μＬの混合ターミネータ−（１，１ ２μＭのｄｄＧＴＰ−Ｆ蛍光標識化Ｃターミネータ−と８．９６μＭのｄｄ　Ｃ ＴＰ−Ｆ蛍光標識化Ｃターミネータ−）を受領した。このＡ−Ｔ反応管は次いで ２．５ＬＬＬのジチオスレイトール、３．０μＬの各７５μＭのｄＡＴＰ、　ｄ ＣＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、および０．５μＬの混合ターミネータ−（ ３，３６μＭのｄｄＡＴＰ−Ｆ蛍光標識化Ａターミネータ−と１１２μＭのｄｄ ＴＴＰ−Ｆ蛍光標識化Ｔターミネータ−）を受領した。コントロール反応は４種 のターミネータ−をすべて受領した。各反応は０．５μＭの５ｅｑｕｅｎａｓｅ Ｔｌ″Ｔ７ボリメラーゼ（米国オハイオ州りリーブチンド市在、ニー・ニス・バ イオケミカル・コーポレーション（Ｕ、　Ｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　）社）を受領し、４２℃で２分間インキ ュベートされた。追加の５ｅｑｕｅｎａｓｅ”を１．０μＬそれぞれに添加し、 ４２℃でさらに５分間インキュベートした。取り込まれなかったｄｄＮＴＰ−Ｆ をセファデックスＧ−５０スピンカラムを用いて各反応系から除去した。

これらのＧ−Ｃ、Ａ−Ｔおよびコントロール反応混合物は、次いで、それぞれ隣 接するレーンに装荷され、Ｇｅｎｅｓｉｓ　Ｔ′２０００　ＤＮＡ分析システム （米国プラウエア州つィルミントン市在、イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムー ル社）上で１８１で６％ポリアクリルアミドゲル）　（Ｌ’ｌ：１架橋）を使用 して電気泳動した。　１０時間データを収集し、マツキントッシュＩＩコンピュ ータ（米国カリフォルニア州りベルチノ市在、アップル・コーポレーション社） で第１図に示すとともに第２図にフローチャートで示したプログラムを使用して 分析した。

この方法によるデータ分析の結果、５０１塩基のシーケンス情報が９７％の正確 さで得られ、命名がはっきりしなかった（期待されたピーク間隔内にピークがな かった）のは３つであった。コントロール反応はＧｅｎｅｓｉｓ′ｒ１″２００ ０　ＤＮＡ分析システム（ヴアージョン３゜０．２）で供給されるソフトウェア を使用して分析し３７９塩基を９７％の正確さで得た。命名がはっきりしなかっ たのは２３であった。このように、２−レーン、２−染料法を使用してテンプレ ートからより大量の情報が得られた。

Ｇ−Ｃピーク 一一：Ｘ導関妖のセ゛ロークロー／　’７　”ｙ　７　’に−Ｌズ定幻粁ヒ一り Ｆｉｇ、４ 要約書 各ＤＮＡサンプルに対して２つの電気泳動レーンを使用することによりＤＮＡの シーケンスを決定する方法が開示されている。各レーンは２種の染料を含有する 。

補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年２月５日

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．下記工程を具備したことを特徴とするＤＮＡをシーケンシングして４種の塩 基Ｇ，Ｃ，ＡおよびＴを確認する方法： ４種の塩基の２種について、それぞれ異なるレポーターを有する第１の組のレポ ーター標識化ＤＮＡフラグメントを生成し； 前記４種の塩基の残る２種について、それぞれ異なるレポーターを有する第２の 組のレポーター標識化ＤＮＡフラグメントを生成し； ゲル電気泳動により前記第１および第２の組をそれぞれ分離し； 前記各組のそれぞれについて、振幅の変動する第１の信号を発生して、前記レポ ーターの一つの特性と塩基が前記ゲルを移動する速度とに応じたピークを形成し ； 前記各組のそれぞれについて、振幅の変動する第２の信号を発生して、前記レポ ーターの一つの特性とそれぞれが前記ゲルを移動した速度とに応じたピークを形 成し；かつ 前記ゲルを移動する順序で前記第１および第２の信号を前記４種の塩基に対応す る信号に変換する。
2. ２．前記第１の組のＤＮＡフラグメントがＧおよびＣであることを特徴とする請 求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記第１および第２の組が前記ゲル上で隣接するレーンに分離されることを 特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．前記４種の塩基信号を、前記塩基が前記ゲルを通過する速度に従って順序づ けする工程を備えたことを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．前記４種の塩基信号を、前記塩基が前記ゲルを通過する速度に従って順序づ けする工程を備えたことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．前記第１および第２の組が前記ゲル上で隣接するレーンに分離される工程を 備えたことを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
7. ７．前記４種の塩基信号を、前記塩基が前記ゲルを通過する速度に従って順序づ けする工程を備えたことを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．前記第１の組について使用されたレポーターは前記第２の組について使用さ れたレポーターと同じであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．前記第１の組のＤＮＡフラグメントがＧおよびＣであることを特徴とする請 求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．前記第１および第２の組が前記ゲル上で隣接するレーンに分離される工程 を備えたことを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。
11. １１．前記４種の塩基信号を、前記塩基が前記ゲルを通過する速度に従って順序 づけする工程を備えたことを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。
12. １２．前記ＤＮＡフラグメントが標識化ターミネーターを有することを特徴とす る請求の範囲第１項記載の方法。
13. １３．前記ＤＮＡフラグメントが標識化プライマーを有することを特徴とする請 求の範囲第１項記載の方法。