JPH05509000A - Dnaシーケンス決定方法 - Google Patents
Dnaシーケンス決定方法Info
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- JPH05509000A JPH05509000A JP3514835A JP51483591A JPH05509000A JP H05509000 A JPH05509000 A JP H05509000A JP 3514835 A JP3514835 A JP 3514835A JP 51483591 A JP51483591 A JP 51483591A JP H05509000 A JPH05509000 A JP H05509000A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
DNAシーケンス決定方法
関連特許および出願の参照
本已願は米国特許第4,833,332号[走査蛍光検出系J (Scanni
ng Detection Systems) (Robertsonet a
l、) 、米国出願第071057566号(1987年6月12日出願、出願
人: Prober et al、 ) rDNAシーケンシング方法、システ
ムおよび試薬J (Method、 Systems。
and Reagents for DNA Sequencing ) (I
P−597−A)、および米国出願筒071545.746号(1990年6月
29日出願、出願人: Dam et al、) rDNAシーケンス決定方法
J (Method for Determining DNA 5equen
ces) (IP−0846)に関連する。
技術分野
本発明はより正確なりNAクシ−ンス情報を得る方法に関するものである。
背景技術
DNAシーケンシングは現代分子生物学の柱石となる分析技術の一つである。シ
ーケンシングのための信頼性のある方法の開発が遺伝情報の機構の理解に大きな
進展をもたらし、遺伝子材料の操作(すなわち、遺伝子工学)を可能にした。
現在DNAシーケンシングのための二つの一般的な方法がある。すなわち、マク
サム−ギルバート(Maxam−Gilbert)の化学的分解方法[A、M、
Maxam et al、。
Meth、 in Enzym、、 Vol、 65.499−559 (19
11tO)] と、ササンガのジデオキシ鎖停止方法[F、 Sanger、
et al、。
Proc、 Nat、 Acad、 Sci、 USA、 Vol、 74.5
463−5467(1977)]がある。これら二つの方法の共通の特長は電気
泳動により分析される1組のDNAフラグメントの生成である。これらの技法は
フラグメントを調製するのに使用される方法が異なる。
マクサム−ギルバート技法では、DNAフラグメントはシーケンシングされるべ
きDNA片の塩基特異性化学開裂により調製される。シーケンシングされるべき
DNA片は、まず、32pで5′−末端標識され、次いで4つの部分に分割され
る。各部分は、所与の塩基(または複数の塩基)に隣接する位置でDNAを開裂
するように設計された異なる組の化学処理に付される。その結果、すべての標識
化フラグメントはDNA原片と同じ5′−末端を有し、開裂の位置によって決る
3′−末端を有する。この処理はゲル電気泳動により分離するのに都合のよい長
さのDNAフラグメントを生成する条件下で行われる。
サンガーの技法では、DNAフラグメントはシーケンシングされるべきDNA片
の部分的酵素的複製(すなわち、合成)により生成される。最も普通のバージョ
ンでは、シーケンシングされるべきDNA片は標準的技法を使用して、バクテリ
オファージM13のような、大きな、環状の、一本1iDNA片である「シーケ
ンシングベクター」内に挿入される。これは複製工程のためのテンプレート(鋳
型)となる。挿入物(インサート)のすぐ上流のテンプレート部分の領域に相補
的なシーケンスを持つ短いDNA片がアニールされて合成のためのプライマーと
して役立つテンプレートとなる。4種の天然デオキシリボヌクレオシドトリフオ
スフェート(dNTP)の存在下、DNAポリメラーゼはプライマーを3′−末
端から延長してインサートの領域のテンプレートの相補的複製を生成する。シー
ケンシングフラグメントの完全なセットを生成するには、4つの反応が並列に行
われ、それぞれが4種のdNTPと一緒に各塩基に対して一つの単一のジデオキ
シリボヌクレオシドトリフオスフェート(ddNTP )ターミネータ−を含ん
でいる。(32P標識化またはフルオロフォア標識化dNTPが添加されて標識
化フラグメントを与える)。dNTPがポリメラーゼにより取り込まれると、鎖
延長が継続できる。対応するddNTPが選択されると、鎖は停止される。dd
NTPのdNTPに対する比を調整して適当な長さのDNAフラグメントを生成
する。4種の反応混合物のそれぞれが、このように、同じジデオキシヌクレオシ
ド残基を3′−末端に持ち、プライマー定義された5′−末端を持つフラグメン
トの分布を含む。
サンガー法でもマクサム−ギルバート法でも、一般に物理的方法では直接決定で
きない塩基シーケンス情報が決定できる鎖長情報に変換されている。この決定は
電気泳動分離により達成できる。変性条件下(高温、尿素存在等)では、短いD
NAフラグメントは硬い棒であるかのように移動する。電気泳動にゲルマトリッ
クスが使用されると、DNAフラグメントはサイズによって選別される。シーケ
ンシングに要求される単一塩基解像度は、通常、高々数百塩基を含むDNAフラ
グメントについて得ることができる。
完全なシーケンスを決定するためには、マクサム−ギルバート法またはサンガー
法のいずれかにより生成された4組のフラグメントが電気泳動に付される。この
結果、ゲルの長さに沿って空間的に解像されたフラグメントが得られる。(32
P標識を置き換える)染料を識別し、この情報を使用してDNAシーケンスを決
定する一つの方法が上述したProber et al、出願に記載されている
。この系は米国プラウエア州つィルミントン市在、イー・アイ・デニボン・ドウ
・ヌムール社から入手できるジェネシス2000 (GENESIS” 200
0)として知られる商用装置で得られる。DNAをシーケンシングするためのG
ENESISTl′系は、密接に関連しているが依然として識別可能なレポータ
ーすなわち標識からの放射エネルギーの存在を検知する手段を備え、このレポー
ターは変更されたサンガーのDNA鎖延長方法において鎖停止ヌクレオチドとし
て機能する化合物に共有結合で結合している。識別可能な蛍光レポーターは、サ
ンガーのDNAシーケンシング反応において代表される4種のジデオキシヌクレ
オチド塩基、すなわちアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンのジデオキシ
ヌクレオチド、のそれぞれに結合される。これらのレポーター標識化鎖停止試薬
は伝統的サンガー法の未標識化鎖ターミネータ−と置き換えられ、相当するデオ
キシヌクレオチド、適当なプライマー、テンプレートおよびポリメラーゼとの反
応において結合される。得られた混合物は、相互に1塩基分だけ長さがことなり
、かつ、3′−末端が4種のDNA塩基の一つに相当する特異的に標識された鎖
ターミネータ−で終るDNAフラグメントを含む。この新しい標識方法によれば
、伝統的サンガー法のデオキシヌクレオチドの一つに含有される在来の放射活性
標識を排除することができる。
これらのレポーター標識の検知は、 DNAフラグメント上の鎖ターミネータ−
に結合したレーザで励起されたレポーターから異なる波長バンドの蛍光発光を受
ける2つの固定光増倍管(PMT)を用いて達成できる。
これらのフラグメントは電気泳動により空間的および/または時間的に分離され
てPMTの感知領域に垂直な軸に沿って移動する。これらの蛍光発光は、まず、
一つの特性波長を一つのPMTに向け、他の特性波長を他のPMTに向けるよう
に置かれた二色性その他の波長選択フィルタを通過する。このようにして、一連
の蛍光レポーターが間隔の詰まった発光波長を持つときでも、与えられた蛍光レ
ポーターに特異的な第3の信号を生成するように比率を定めることができる、異
なるデジタル信号が各PMTに創成される。この系は48gnm線のような単一
のレーザ線によりすべて効率的に励起され、かつ最大値が相互に通常わずか5な
いし7nmだけ異なる密に間隔を置いた発光を有するレポーターを検知すること
ができる。従って、関心のあるDNAストランドにおける塩基配列指定(seq
uential baseassignment)が、DNA中の4種の塩基の
それぞれに相当する4種のレポーター標識化鎖ターミネータ−のそれぞれに対し
て導かれる特異的な比に基づいて行うことができる。
塩基情報はGENESISTM2000ユニットの蛍光標識に含まれているが、
注意されるのは、この情報は測色標識(S、 Beck、 Anal、 Bio
chei、、 164 (2) 514−520(1987)) 、化学ルミネ
ッセンス(S、 Beak、 NucleicAcids Res、、 17.
5115−5123 (1989))その他の信号にも含まれていてもよい。
GENESIS” 2000シーケンサはジデオキシ鎖停止化学反応を利用して
設計されている。この化学反応を使用するために、4種の化学的に類似の染料を
使用して4種の塩基A、C,G、Tを区別する必要があった。染料を注意深く選
び、徹底的に評価しない限り、それらの電気泳動移動度はあるDNAシーケンス
では異なることもあり、シーケンス情報の混乱につながる。これら4種の染料は
類似の電気泳動移動度を持つように選ばれているが、発光および励起スペクトル
が重なり合っていた。極端に狭いバンドフィルタの光損失が大きすぎないように
してこれらの染料を識別する必要から、2つの信号の比を使用してどの塩基が検
出器を通過したかを決定する2チヤンネル検出系が採用された。
ピークの解像度が良好でノイズがないときは比測定信号を解釈するのは容易であ
る(第1図、)、シかしながら、各回で得られるシーケンス情報の量を最大にす
るには、ピーク解像度が低くノイズが顕著な条件下でこの2チャンネル信号を正
確に解釈することが必要である。
2チヤンネルデータをこれらの条件下で分析する方法は従来の電気泳動図(el
ectrophoretogram)およびクロマトグラムを処理するのに使用
されるものとは異なる。ここで説明する分析のアウトプットは塩基A。
C,G、Tの同定のシーケンスであるが、クロマトグラフィーでは所望のアウト
プットは典型的にはピーク位置と領域のリストである。クロマトグラフィー法は
一般に4つの比の内の1つと組み合わされた2つの検出器信号を用いない。2°
信号間のこの関係はProber et al、特許出願に記載されたシーケン
サの特質である。シーケンシングではクロマトグラフィーよりも計算効率はより
重要な考慮点である。クラマドグラフィーでは2本または3本のピークについて
膨大な計算を実行することにより有用な結果を得ることができるが、シーケンシ
ングでは300本ないし600本のピークを分析する必要がある。
Prober et al、の比率測定系は、また、他のDNAシーケンサのそ
れと異なる信号解釈問題を提示している。プライマー化学反応を用いるシーケン
サが[L、 M、 Sm1th et al、、 Nucleic Ac1ds
Res、、 13゜2399−2412 (1985) およびW、 Ans
orge et al、。
J、 Biochem、 Biophys、 Meth、、 13.315−3
23 (198B)]に記載されている。これらのシーケンサは、各塩基に対し
て1種の、4種の信号チャンネルを用いている。
[H,Kambara et al、、 Biotechnology、 6.
816−821(198g) ]に記載のもののような他のシーケンサは4つの
電気泳動レーンのそれぞれに1つの信号を用いている。これらの系はさらに別の
クラスのデータ分析方法を使用しているが、これは、4つの分離されたレーンか
らの結果を適正なタイムシーケンスで位置合わせ、すなわち、整列させなければ
ならないからである。
これらの自動化板DNAシーケンシングでは、レポータはProber at
al、特許出願に記載のように蛍光分析を使用するものでもよく、測色(S、
Beck、 Anal。
Biochem、、 164 (2) 514−520 (1987)) 、化
学ルミネッセンス(S、 Beck、 Nucleic Ac1ds Res、
、 17.5115−5123 (1989) ) 、または他のタイプのもの
でもよい。
(Hunkapiller et al、、米国特許第4,811,218号明
細書)のようなプライマー化学反応を用いるシーケンサはDNAフラグメントを
標識するのに使用することができる染料の選定においてそれほど限定されていな
い。これらのシーケンサは各塩基に1つの、4つの信号チャンネルを使用するこ
とができるので、比率計測信号を解釈するのに必要とされる複雑なアルゴリズム
を要求しない、一方、これらのシーケンサはターミネータ−化学反応の利点を享
受することができない。
特に、プライマー化学反応はシーケンシングする各サンプルにつき4本の別個の
反応管を必要とするが、ターミネータ−化学反応が必要とするのは1本だけであ
る。さらに、プライマー化学反応は「偽停止」からのエラーを受け易く、誤信号
はポリメラーゼがDNAストランド上のある点を過ぎて進行することができない
ときに生成される。
[H,Kao+bara et al、、 Biotechnology、 6
.816−821(1988) ]記載のもののような他のシーケンサは4つの
電気泳動レーンのそれぞれに1つの信号を用いている。これにより従来技術の自
動化DNAシーケンサの解像問題の遭遇する困難の多くが克服される。これらの
系は別のクラスのデータ分析方法を用いるが、これは4つの分離レーンからの結
果を適当なタイムシーケンスで位置合わせまたは整列しなければならないからで
ある。いったん、レーンが位置合わせされると、これらのシーケンサに対するデ
ータ分析方法はHunkapiller et al、の方法と同じものを使用
できる。
レーンの適正な位置合わせは明らかに正しいシーケンス決定をするのに決定的に
重要である。レーンの位置合わせが適正でないと、対応する塩基の解釈がでたら
めになる。4つのレーンの位置合わせの問題は、その性質が組み合わせであるた
め、複雑である。4つのレーンの全てにおける間隔の詰まった与えられた1対の
バンドに対して、4!=2x3x4=24の可能なバンドの順序がある。1つだ
けが正しいシーケンスに対応する。位置合わせ工程はシーケンス解釈においてエ
ラーを導入することがあり、このため、等しい解像度と信号対ノイズ比(S/N
比)を与えられても、上述したKambaraにより記載されたタイプのシーケ
ンサは、Hunkapillerのシーケンサよりも正確なシーケンス情報の生
成量が少ないことがある。これらのシーケンサは分析すべき各DNAサンプルに
対して、4つの反応管を必要とするだけでなく、4つの電気泳動レーンをも必要
とすることに注意すべきである。
発明の開示
これらの正確さまたは解像度と位置合わせの双子問題は本発明の方法によりほと
んど克服される。本発明の方法に従えば、塩基のシーケンスは、DNAをシーケ
ンシングすべき各サンプルについて2つの電気泳動レーンを使用することにより
塩基のシーケンスを決定、すなわち、「命名」することができる。各レーンは2
つのターミネータ−染料を導入する。本発明に従えば、DNAをシーケンシング
して4つの塩基G、C。
AおよびTを確認する方法は、下記工程を具備している24種の塩基の2種につ
いて、それぞれ異なるレポーターを有する第1の組のレポーター標識化DNAフ
ラグメントを生成し;これら4種の塩基の残る2種について、それぞれ異なるレ
ポーターを有する第2の組のレポーター標識化DNAフラグメントを生成し;ゲ
ル電気泳動により第1および第2の組をそれぞれ分離し;各組のそれぞれについ
て、振幅の変動する第1の信号を発生して、レポーターの一つの特性と塩基がゲ
ルを移動する速度とに応じたピークを形成し;各組のそれぞれについて、振幅の
変動する第2の信号を発生して、レポーターの一つの特性とそれぞれがゲルを移
動した速度とに応じたピークを形成し;かつ、ゲルを移動する順序で第1および
第2の信号を前記4種の塩基に対応する信号に変換する。
本発明の好適な実施例に従えば、上述した第1の組のDNAフラグメントはGお
よびCを含む。これにより、C信号ピークとすぐそれに続(信号ピークとの間の
間隔がおおいに変動的であるという周知のG−C圧縮現象が克服され易い。さら
に、本発明の好適な実施例に従久ば、第1および第2の組がゲル上で隣接するレ
ーンに分離されている。これが有利であるのは、分離すべきDNAフラグメント
が本質的に同じゲル組成、熱環境および電界に付されるからである。シーケンシ
ング中は、4種の塩基信号は、塩基のゲル通過速度に従って順序づけられる。ま
た、第1の組について使用されたレポーターは第2の組について使用されたレポ
ーターと同じであってもよい。
この方法は多くの利点を有する。ターミネータ−化学反応はProber et
al、により記載された比率測定信号処理の複雑さがな(使用することができ
る。この方法は、単一レーン系に必要とされる4種のレポーターではなく、似た
ような電気泳動移動度と異なる分光特性を持つ2種のレポーターのみを使用する
ことを必要としているに過ぎない。レーンの位置合わせが含まれているが、組み
合わせ論的ではない、というのは、2つの対象の2つの可能な順序が存在するだ
けであるからである。2つの信号は、適正な整列が決定されるまで、すなわち、
以下に記載されるように、単に互いに「スライド」させるだけでよい、比率も複
雑な位置合わせアルゴリズムも使用していないので、この方法は与えられたサン
プルから従来の方法よりも大量の正確なシーケンス情報を生成することができる
。4つのレーンでな(,2つのレーンを使用するのは、4つの分離した信号を得
るもう1つの4−レーン方法よりも経済的である。
また別の択一的方法では、本発明はプライマー・ラベリングとともに使用しても
よい。サンガー化学反応またはマクサム−ギルバート化学反応のいずれを使用し
てもよい。
図面の簡単な説明
本発明の詳細な説明と関連して以下の図面を考慮することによりもっと容易に理
解できよう。
第1図は、DNAフラグメントをシーケンシングするための本発明方法に従う工
程を示すフローチャートである。
第2図は、第1図に示すレーンを位置合わせするための方法において使用される
工程を示すフローチャートである。
第3図は、検出されたピークを時間に対して図示した線図であり、い(つかのピ
ークの間隔を適正にするためにピーク間隔を設定する方法を説明するものである
。
第4図は、第1図のフローチャートの塩基命名工程の詳細を示すフローチャート
である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法は、上述したRおよびTの出力信号を与える2つの検出器を有する
Genesis” 2000シーケンサに関連して説明する。これらの出力信号
は振幅が変動してDNAフラグメントとともに使用されたレポーターの特性と塩
基がゲルを移動する速度とに従うピークを形成する。例えばGenesisTl
′2000シーケンサと共に使用するために入手できる試薬キットを使用して、
DNAサンプルが調製され、2つのターミネータ−反応が蛍光ジデオキシターミ
ネータ−を用いて行われる。
1つの反応では、2種のターミネータ−GおよびCだけが含まれる。他の反応で
はAおよびTだけが含まれる。このベアリングはG−C圧縮現象の故に好ましい
。
これは、C信号ピークとすぐそれに続(C信号ピークの間の間隔がおおいに変動
し得るからである。GおよびCターミネータ−が単一の反応に含まれていると、
2つのレーンを整列するアルゴリズムが後でG−C間隔変動性を考慮に入れる必
要がない。2つの反応混合物はシーケンシングゲル上で分離される。これらの2
つの混合物をゲル上で隣接したレーンに置いてこれら2つのレーン間の不整列を
最小にするのが好ましい。上述したGenesis装置を使用して各レーンから
2つの光増倍管信号が出て(る。
染料とターミネータ−の好ましい組み合わせはG−染料1、A−染料1、C−染
料2およびT−染料2である。染料1と染料2の選択は多(の可能性がある。染
料1と染料2はそれら同士を識別するのに十分なスペクトル分離が得られるよう
に、かつ、4種の塩基すべてについて最も強く、最も均一に分布した信号が得ら
れるように選ばれなければならない。この後者のパラメータは実験的に決定され
る必要がある。というのは、それがシーケンシング使用される酵素と反応条件に
複雑に依存しているからである。
4種の信号(2つのレーンのそれぞれからの2つの光増倍管信号)は正しい順序
で4種の塩基に対応する信号に変換されなければならない、まず、多対の光増倍
管は直交基底に変換して、1つの信号が1つの塩基に対応し他の信号が他の塩基
にに対応するようにする必要がある。これは2つの光増倍管がこれらの2つの塩
基に対して異なった応答をすることに基づいて行うことができる。 G−Cレー
ンを例にとると:P1=βQl−G+βc+ec
P2=βaZ*a+βC1”に
こに、PlおよびP2はPMT信号、GおよびCは信号が得られるときの染料の
現実の濃度、およびβは2つのPMTの2種の染料に対する応答を記述する。
そうすると、感知された染料の濃度を表す信号を次のように記述することが可能
である:
G=(βe2’Pl−β、、 −P2)/(βC2βG1−βC1βax)[t
lC=(βQ1’Pl−βa+ ・P2)/(β62βc1−βC1βax)
[2]他のレーンから、AおよびT信号が同じに得られる。
次に、G−CおよびA−T信号を位置合わせまたは整列させることが必要である
。信号の位置合わせのために多(のアルゴリズムが知られている(例えば、A、
Rosenfeld、 et al、、 Digital Picture
ProcessingAcademic Press、 297−302 (1
976)) m一つの特別の方法は以下の実施例に記載されている。いったん信
号が順序づけられると、データは外見上は、各信号が1つの塩基に対応する米国
特許第4,811.218号明細書(Hunkapiller et al、)
の系により生成されたものと同じである。そのデータに適用できる任意のシーケ
ンス解釈手段を使用することができる。
第1図のフローチャートに示すように、レーンの位置合わせは第2図のフローチ
ャートにおいてより詳細に示す手順により達成される。2−レーンデータ分析法
への入力として使用される4種の信号はG−CレーンおよびA−Tレーンの光増
倍管信号に対応する。これら4種の光増倍管信号は上述した式1および2を使用
して4種の塩基信号A、G、CおよびTに変換される。次に、G−Cレーンのピ
ークの位置がつきとめられる。まず、GおよびC信号が合計される。得られたデ
ータアレイは始めから終りまで走査され、データの一次導関数が一定の閾値(0
,00015V/データ点)を超える傾きを持ってゼロを横切る任意の点がピー
ク位置とされる。このように、G−Cチャンネル内のピークのリストが得られる
。A−Tチャンネル内のピークのリストは同じ方法により他のレーンのデータか
ら得られる。
次に、2つのアレイの整列が決定される。この整列は40ビークのグループにつ
いて行われる。第2図および第3図に示すように、ピーク位置の2つのリストが
組み合わされるときの整列が不適正であると、組み合わされたリスト内のピーク
間隔の変動幅が広くなる。
A−Tビークがオフセット値だけシフトされて適正な位置になると、それにより
間隔変動は減少する。A−Tビーク位置はG−Cピーク位置に対してシフトされ
、このシフトは、G−CおよびA−Tビークリストが組み合わされたときにピー
ク−ピーク間隔の変動が最小になるオフセットの程度が見出されるまで行われる
。そのように決定されたオフセットを使用して、新しいA−Tデータアレイが創
成され、G−Cデータアレイに対して整列される。オフセットは1つの40ピー
クブロツクから次へ変動するので、直線的に内挿されたオフセット値が各データ
点で使用される。
ピークの命名を容易にするために、データは規格化される。すなわち、アレイは
同じ平均信号振幅を4つのチャンネルすべてに与えるようにスケーリングされる
。
塩基の命名は4つのアレイのいずれかにおける第1のピークで始まり、アレイを
下って一時に−ビーク進行する。第4図のフローチャートに示すように、いった
ん予想されたピーク位置が決定されると、ピークが発見されるまで、この位置の
周りに振幅検索が行われる。ピークは上述したゼロ−横断(zero−cros
sing )規準により定義される。4つのチャンネルA、C。
G、Tの内の1つだけがその位置にピークを持つならばそれに対応する塩基が命
名される。2つのチャンネルが(通常、チャンネルの一方におけるノイズにより
)同じ場所にピークを持つと、最大ピークに対応する塩基が命名される。
あるいは、2つのレーンと2種の染料を使用する本発明をプライマー・ラベリン
グとともに使用することができる。この場合、サンガー化学反応とマクサム−ギ
ルバート化学反応のいずれを使用してもよい。本発明がこの態様で使用されると
きは、プライマー・ラベリングについてと同様に、2種ではな(,4種の反応が
行われなければならない、しかしながら、これらの4種の反応は組み合わされて
ゲル上の2つのレーンだけを必要とするようにすることができる。例えば、Gと
CのスポットおよびAとTのスポットを組み合わせることができる。このように
、プライマー化学反応を使用しても、ゲル空間の効率的な使用とレーン位置合わ
せの単純化が依然として利用できる。
本発明の方法は従来可能であったよりも正確で多数の塩基の命名が行える。
実施例
以下の実施例は2−レーン、2−染料シーケンシングの原理を説明するものであ
る。実際、4染料−ターミネータ−、すなわち、ddG−SF505 、 dd
A−SF512 、 ddC−SF519 、 ddT−3F526が使用され
た。これにより、ジエネシス・システム(Genesis System)社か
ら市販されている標識されたターミネータ−試薬を使用することができた。真正
の2−染料系はその合成がProberet al、願に記載されている染料−
ターミネータ−の組み合わせ、例えば、GenesisT′1000キットとし
て市販されているddG−SF505 、 ddA−SF505 、 ddCニ
ー5F519およびddT−SF519 、を使用することもできよう。本実施
例のサンプルは、C染料をA染料から、またはT染料からC染料を識別すること
を含まない仕方で、対で使用され分析される。従って、5F505を5F512
に、または5F519を5F52Gに変えても結果に実質的な影響はない。
試薬は、注記したもの以外は、すべて米国プラウエア州つィルミントン市在、イ
ー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール社、バイオテクノロジー・システムズ・デ
ィビジョンの市販品を使用した。3つの反応、すなわち、G−C反応、 A−T
反応およびコントロールのそれぞれに対して3μgのM13mp1gテンプレー
トDNAが使用された。各反応混合物は5equenaseT′緩衝液(米国オ
ハイオ州りリーブチンド市在、ニー・ニス・バイオケミカル・コーポレーション
(U、 S。
Biochemical Corp、 )社)中で15ngの17−量体−IL
ニバーサルM13ブライマーオリゴヌクレオチド(5′−GTTTT(:CCA
GTCACGAC−3′)とともに容量21μL(マイクロリットル)で95℃
2分間インキュベートしてテンプレートを変成し、ついで37℃で10分間イン
キュベートしてこのプライマーをアニールした。G−C反応管は次いで2.5μ
Lのジチオスレイトール、3.0μLの各75μMのdATP、 dCTP、
dGTPj15よびdTTP、および0.5μLの混合ターミネータ−(1,1
2μMのddGTP−F蛍光標識化Cターミネータ−と8.96μMのdd C
TP−F蛍光標識化Cターミネータ−)を受領した。このA−T反応管は次いで
2.5LLLのジチオスレイトール、3.0μLの各75μMのdATP、 d
CTP、 dGTPおよびdTTP、および0.5μLの混合ターミネータ−(
3,36μMのddATP−F蛍光標識化Aターミネータ−と112μMのdd
TTP−F蛍光標識化Tターミネータ−)を受領した。コントロール反応は4種
のターミネータ−をすべて受領した。各反応は0.5μMの5equenase
Tl″T7ボリメラーゼ(米国オハイオ州りリーブチンド市在、ニー・ニス・バ
イオケミカル・コーポレーション(U、 S。
Biochemical Corp、 )社)を受領し、42℃で2分間インキ
ュベートされた。追加の5equenase”を1.0μLそれぞれに添加し、
42℃でさらに5分間インキュベートした。取り込まれなかったddNTP−F
をセファデックスG−50スピンカラムを用いて各反応系から除去した。
これらのG−C、A−Tおよびコントロール反応混合物は、次いで、それぞれ隣
接するレーンに装荷され、Genesis T′2000 DNA分析システム
(米国プラウエア州つィルミントン市在、イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムー
ル社)上で181で6%ポリアクリルアミドゲル) (L’l:1架橋)を使用
して電気泳動した。 10時間データを収集し、マツキントッシュIIコンピュ
ータ(米国カリフォルニア州りベルチノ市在、アップル・コーポレーション社)
で第1図に示すとともに第2図にフローチャートで示したプログラムを使用して
分析した。
この方法によるデータ分析の結果、501塩基のシーケンス情報が97%の正確
さで得られ、命名がはっきりしなかった(期待されたピーク間隔内にピークがな
かった)のは3つであった。コントロール反応はGenesis′r1″200
0 DNA分析システム(ヴアージョン3゜0.2)で供給されるソフトウェア
を使用して分析し379塩基を97%の正確さで得た。命名がはっきりしなかっ
たのは23であった。このように、2−レーン、2−染料法を使用してテンプレ
ートからより大量の情報が得られた。
G−Cピーク
一一:X導関妖のセ゛ロークロー/ ’7 ”y 7 ’に−Lズ定幻粁ヒ一り
Fig、4
要約書
各DNAサンプルに対して2つの電気泳動レーンを使用することによりDNAの
シーケンスを決定する方法が開示されている。各レーンは2種の染料を含有する
。
補正書の写しく翻訳文)提出書
(特許法第184条の8)
平成5年2月5日
Claims (13)
- 1.下記工程を具備したことを特徴とするDNAをシーケンシングして4種の塩 基G,C,AおよびTを確認する方法: 4種の塩基の2種について、それぞれ異なるレポーターを有する第1の組のレポ ーター標識化DNAフラグメントを生成し; 前記4種の塩基の残る2種について、それぞれ異なるレポーターを有する第2の 組のレポーター標識化DNAフラグメントを生成し; ゲル電気泳動により前記第1および第2の組をそれぞれ分離し; 前記各組のそれぞれについて、振幅の変動する第1の信号を発生して、前記レポ ーターの一つの特性と塩基が前記ゲルを移動する速度とに応じたピークを形成し ; 前記各組のそれぞれについて、振幅の変動する第2の信号を発生して、前記レポ ーターの一つの特性とそれぞれが前記ゲルを移動した速度とに応じたピークを形 成し;かつ 前記ゲルを移動する順序で前記第1および第2の信号を前記4種の塩基に対応す る信号に変換する。
- 2.前記第1の組のDNAフラグメントがGおよびCであることを特徴とする請 求の範囲第1項記載の方法。
- 3.前記第1および第2の組が前記ゲル上で隣接するレーンに分離されることを 特徴とする請求の範囲第1項記載の方法。
- 4.前記4種の塩基信号を、前記塩基が前記ゲルを通過する速度に従って順序づ けする工程を備えたことを特徴とする請求の範囲第3項記載の方法。
- 5.前記4種の塩基信号を、前記塩基が前記ゲルを通過する速度に従って順序づ けする工程を備えたことを特徴とする請求の範囲第1項記載の方法。
- 6.前記第1および第2の組が前記ゲル上で隣接するレーンに分離される工程を 備えたことを特徴とする請求の範囲第2項記載の方法。
- 7.前記4種の塩基信号を、前記塩基が前記ゲルを通過する速度に従って順序づ けする工程を備えたことを特徴とする請求の範囲第6項記載の方法。
- 8.前記第1の組について使用されたレポーターは前記第2の組について使用さ れたレポーターと同じであることを特徴とする請求の範囲第1項記載の方法。
- 9.前記第1の組のDNAフラグメントがGおよびCであることを特徴とする請 求の範囲第8項記載の方法。
- 10.前記第1および第2の組が前記ゲル上で隣接するレーンに分離される工程 を備えたことを特徴とする請求の範囲第3項記載の方法。
- 11.前記4種の塩基信号を、前記塩基が前記ゲルを通過する速度に従って順序 づけする工程を備えたことを特徴とする請求の範囲第3項記載の方法。
- 12.前記DNAフラグメントが標識化ターミネーターを有することを特徴とす る請求の範囲第1項記載の方法。
- 13.前記DNAフラグメントが標識化プライマーを有することを特徴とする請 求の範囲第1項記載の方法。
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