JP2760234B2 - 基質濃度測定方法 - Google Patents
基質濃度測定方法Info
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- enzyme
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料中の特定成分につ
いて、迅速かつ高精度な定量を簡便に実施することので
きるバイオセンサを用いた基質濃度測定方法に関する。
いて、迅速かつ高精度な定量を簡便に実施することので
きるバイオセンサを用いた基質濃度測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、試料中の特定成分について、試料
液の希釈や撹拌などを行なう事なく簡易に定量しうる方
式として、次のようなバイオセンサが提案され、以下の
ような基質濃度測定方法について開示されている（特開
平３−２０２７６４号公報）。
液の希釈や撹拌などを行なう事なく簡易に定量しうる方
式として、次のようなバイオセンサが提案され、以下の
ような基質濃度測定方法について開示されている（特開
平３−２０２７６４号公報）。
【０００３】このバイオセンサは、絶縁性の基板上に形
成した電極系の表面に親水性高分子と酵素および電子受
容体の混合物からなる酵素反応層を形成し、前記酵素と
電子受容体と試料液との反応に際しての物質濃度変化を
電気化学的に前記電極系で検知し、前記基質濃度を測定
するものである。
成した電極系の表面に親水性高分子と酵素および電子受
容体の混合物からなる酵素反応層を形成し、前記酵素と
電子受容体と試料液との反応に際しての物質濃度変化を
電気化学的に前記電極系で検知し、前記基質濃度を測定
するものである。
【０００４】以下、このバイオセンサの動作を、グルコ
ースセンサを例にして説明する。グルコースを含む試料
液をグルコースセンサへ供給すると、酵素反応層が試料
液に溶解する。酵素反応層中の酵素であるグルコースオ
キシダーゼによってグルコースは酸化される。この時、
酵素反応層中の電子受容体が還元される。試料液中のグ
ルコースが全て反応した段階で、電極系を構成する測定
極と対極間に適当な一定電圧を一回印加すると、電子受
容体の還元体が酸化される。この酸化電流値を測定する
ことにより、試料液中のグルコース濃度を定量すること
ができる。
ースセンサを例にして説明する。グルコースを含む試料
液をグルコースセンサへ供給すると、酵素反応層が試料
液に溶解する。酵素反応層中の酵素であるグルコースオ
キシダーゼによってグルコースは酸化される。この時、
酵素反応層中の電子受容体が還元される。試料液中のグ
ルコースが全て反応した段階で、電極系を構成する測定
極と対極間に適当な一定電圧を一回印加すると、電子受
容体の還元体が酸化される。この酸化電流値を測定する
ことにより、試料液中のグルコース濃度を定量すること
ができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のような従来の基
質濃度測定方法においては、複数の基質に対して、各基
質濃度を一度に定量することができなかった。複数の基
質濃度を一度に定量する場合には、複数種類のバイオセ
ンサを用いる必要があった。あるいは一つのバイオセン
サで測定する場合には、複数組の電極系と各基質に応じ
た酵素を有する反応層を複数個備えたバイオセンサが必
要であり、バイオセンサの構造および測定方法が複雑化
するといった課題を有していた。
質濃度測定方法においては、複数の基質に対して、各基
質濃度を一度に定量することができなかった。複数の基
質濃度を一度に定量する場合には、複数種類のバイオセ
ンサを用いる必要があった。あるいは一つのバイオセン
サで測定する場合には、複数組の電極系と各基質に応じ
た酵素を有する反応層を複数個備えたバイオセンサが必
要であり、バイオセンサの構造および測定方法が複雑化
するといった課題を有していた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め本発明は、バイオセンサを用いて、試料液中に含まれ
る第１基質および第２基質のそれぞれの濃度を測定する
方法であって、前記バイオセンサは、絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成され、かつ作用極と対極を有
する電極系と、前記第１基質と反応する第１酵素、前記
第２基質と反応する第２酵素、電子伝達体、および親水
性高分子を含有する反応層とを有し、 （ａ）上記バイオセンサに、第１基質および第２基質を
含む試料液を供給し、時間Ｔ 1 経過した後、電極系の作
用極と対極間に一定電圧を印加して電流値Ｉ 1 を測定す
る工程、および、 （ｂ）上記バイオセンサに前記試料液を供給してから時
間Ｔ 2 経過した後、電極系の作用極と対極間に一定電圧
を印加して電流値Ｉ 2 を測定する工程、 からなり、前記
時間Ｔ 1 が、前記第１基質の少なくとも一部と前記第１
酵素とが反応するに十分な時間であり、かつその時間内
には前記第２基質と前記第２酵素とが十分に反応せず、
前記時間Ｔ 2 が、前記第２基質の少なくとも一部と前記
第２酵素とが反応するに十分な時間であることを特徴と
する基質濃度測定方法を提供する。
め本発明は、バイオセンサを用いて、試料液中に含まれ
る第１基質および第２基質のそれぞれの濃度を測定する
方法であって、前記バイオセンサは、絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成され、かつ作用極と対極を有
する電極系と、前記第１基質と反応する第１酵素、前記
第２基質と反応する第２酵素、電子伝達体、および親水
性高分子を含有する反応層とを有し、 （ａ）上記バイオセンサに、第１基質および第２基質を
含む試料液を供給し、時間Ｔ 1 経過した後、電極系の作
用極と対極間に一定電圧を印加して電流値Ｉ 1 を測定す
る工程、および、 （ｂ）上記バイオセンサに前記試料液を供給してから時
間Ｔ 2 経過した後、電極系の作用極と対極間に一定電圧
を印加して電流値Ｉ 2 を測定する工程、 からなり、前記
時間Ｔ 1 が、前記第１基質の少なくとも一部と前記第１
酵素とが反応するに十分な時間であり、かつその時間内
には前記第２基質と前記第２酵素とが十分に反応せず、
前記時間Ｔ 2 が、前記第２基質の少なくとも一部と前記
第２酵素とが反応するに十分な時間であることを特徴と
する基質濃度測定方法を提供する。
【０００７】
【作用】
本発明の方法によれば、上記第１および第２の
基質と、上記時間Ｔ 1 およびＴ 2 を適当に選ぶことによ
り、一つの電極系を備えたバイオセンサを用いて、試料
液中の２種の基質濃度を一度に定量することができる。
基質と、上記時間Ｔ 1 およびＴ 2 を適当に選ぶことによ
り、一つの電極系を備えたバイオセンサを用いて、試料
液中の２種の基質濃度を一度に定量することができる。
【０００８】本発明によれば、第１酵素にグルコ−ス酸
化酵素、第２酵素にスクロースの加水分解酵素をそれぞ
れ用いたスクロース・グルコース応答型糖センサにより
グルコースおよびスクロースを精度よく定量することが
できる。また、第１酵素にフルクトース酸化酵素、第２
酵素にスクロースの加水分解酵素をそれぞれ用いたスク
ロース・フルクトース応答型糖センサによりフルクトー
スおよびスクロースを精度よく定量することができる。
化酵素、第２酵素にスクロースの加水分解酵素をそれぞ
れ用いたスクロース・グルコース応答型糖センサにより
グルコースおよびスクロースを精度よく定量することが
できる。また、第１酵素にフルクトース酸化酵素、第２
酵素にスクロースの加水分解酵素をそれぞれ用いたスク
ロース・フルクトース応答型糖センサによりフルクトー
スおよびスクロースを精度よく定量することができる。
【０００９】
【実施例】以下、本発明を実施例により説明する。
【００１０】（実施例１）バイオセンサの一例として、
スクロースとグルコースを定量するスクロース・グルコ
ース応答型糖センサについて説明する。
スクロースとグルコースを定量するスクロース・グルコ
ース応答型糖センサについて説明する。
【００１１】図１は本発明のバイオセンサの一実施例と
して作製したスクロース・グルコース応答型糖センサの
断面図、図２は同スクロース・グルコース応答型糖セン
サのうち反応層を除いた分解斜視図である。
して作製したスクロース・グルコース応答型糖センサの
断面図、図２は同スクロース・グルコース応答型糖セン
サのうち反応層を除いた分解斜視図である。
【００１２】以下、糖センサの作製方法について説明す
る。ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板
１に、スクリーン印刷により銀ペ−ストを印刷しリ−ド
２、３を形成した。つぎに、樹脂バインダーを含む導電
性カーボンペーストを印刷して測定極４を形成した。測
定極４はリード２と接触している。
る。ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板
１に、スクリーン印刷により銀ペ−ストを印刷しリ−ド
２、３を形成した。つぎに、樹脂バインダーを含む導電
性カーボンペーストを印刷して測定極４を形成した。測
定極４はリード２と接触している。
【００１３】つぎに絶縁性ペーストを印刷して絶縁層６
を形成した。絶縁層６は、測定極４の外周部を覆ってお
り、これによって測定極４の露出部分の面積を一定に保
っている。さらに、絶縁層６は、リード２、３を部分的
に覆っている。つぎに、樹脂バインダーを含む導電性カ
ーボンペーストをリード３と接触するように印刷して対
極５を形成した。
を形成した。絶縁層６は、測定極４の外周部を覆ってお
り、これによって測定極４の露出部分の面積を一定に保
っている。さらに、絶縁層６は、リード２、３を部分的
に覆っている。つぎに、樹脂バインダーを含む導電性カ
ーボンペーストをリード３と接触するように印刷して対
極５を形成した。
【００１４】つぎに、前記電極系上に親水性高分子とし
てカルボキシメチルセルロ−ス（以下ＣＭＣと略す）の
０．５wt％水溶液を滴下、乾燥させてＣＭＣ層を形成し
た。つづいて、前記ＣＭＣ層上に酵素としてインベルタ
ーゼ（ＥＣ３．２．１．２６：以下ＩＮＶと略す）、ム
タロターゼ（ＥＣ５．１．３．３：以下ＭＵＴと略
す）、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４：
以下ＧＯＤと略す）および電子受容体としてフェリシア
ン化カリウムをリン酸緩衝液（０．２Ｍ：ＫＨ2ＰＯ4−
０．２Ｍ：Ｎａ2ＨＰＯ4；ｐＨ＝７．４）に溶解させた
混合溶液を滴下し、乾燥させて反応層７を形成した。
てカルボキシメチルセルロ−ス（以下ＣＭＣと略す）の
０．５wt％水溶液を滴下、乾燥させてＣＭＣ層を形成し
た。つづいて、前記ＣＭＣ層上に酵素としてインベルタ
ーゼ（ＥＣ３．２．１．２６：以下ＩＮＶと略す）、ム
タロターゼ（ＥＣ５．１．３．３：以下ＭＵＴと略
す）、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４：
以下ＧＯＤと略す）および電子受容体としてフェリシア
ン化カリウムをリン酸緩衝液（０．２Ｍ：ＫＨ2ＰＯ4−
０．２Ｍ：Ｎａ2ＨＰＯ4；ｐＨ＝７．４）に溶解させた
混合溶液を滴下し、乾燥させて反応層７を形成した。
【００１５】酵素および電子受容体の混合溶液を滴下す
るとＣＭＣ層は一度溶解し、その後の乾燥過程で酵素な
どと混合された形で反応層７が形成される。しかし、撹
拌等をともなわないため完全な混合状態とはならず、電
極系表面はＣＭＣのみによって被覆された状態となる。
試料液中にタンパク質等の物質が存在する場合には、親
水性高分子層によってこれらのタンパク質等の物質が電
極系表面に吸着するのを阻止することができる。その結
果、高精度なセンサ応答を得ることができる。
るとＣＭＣ層は一度溶解し、その後の乾燥過程で酵素な
どと混合された形で反応層７が形成される。しかし、撹
拌等をともなわないため完全な混合状態とはならず、電
極系表面はＣＭＣのみによって被覆された状態となる。
試料液中にタンパク質等の物質が存在する場合には、親
水性高分子層によってこれらのタンパク質等の物質が電
極系表面に吸着するのを阻止することができる。その結
果、高精度なセンサ応答を得ることができる。
【００１６】上記のようにして反応層７を形成した後、
カバー９およびスペーサー８を図２中、一点鎖線で示す
ような位置関係をもって接着した。
カバー９およびスペーサー８を図２中、一点鎖線で示す
ような位置関係をもって接着した。
【００１７】上記のように作製したスクロース・グルコ
ース応答型糖センサに試料液としてグルコース水溶液３
μｌを試料供給孔１０より供給した。試料液は速やかに
空気孔１１部分まで達し、電極系上の反応層７が溶解し
た。
ース応答型糖センサに試料液としてグルコース水溶液３
μｌを試料供給孔１０より供給した。試料液は速やかに
空気孔１１部分まで達し、電極系上の反応層７が溶解し
た。
【００１８】試料液を供給してから１０秒後に対極５を
基準にして測定極４に一定電圧（０．５Ｖ）を印加し、
５秒後の電流値を測定したところ、試料液中のグルコー
ス濃度に対応した応答電流値が得られた。
基準にして測定極４に一定電圧（０．５Ｖ）を印加し、
５秒後の電流値を測定したところ、試料液中のグルコー
ス濃度に対応した応答電流値が得られた。
【００１９】反応層７が試料液に溶解すると、試料液中
のグルコースはＧＯＤによって酸化される。同時にフェ
リシアン化カリウムが還元されてフェロシアン化カリウ
ムが生成する。上記一定電圧の印加によりフェロシアン
化カリウムが酸化され、その際の酸化電流値がグルコー
ス濃度に対応した。
のグルコースはＧＯＤによって酸化される。同時にフェ
リシアン化カリウムが還元されてフェロシアン化カリウ
ムが生成する。上記一定電圧の印加によりフェロシアン
化カリウムが酸化され、その際の酸化電流値がグルコー
ス濃度に対応した。
【００２０】さらに、試料液を供給して３分後に、再び
対極５を基準にして測定極４に一定電圧（０．５Ｖ）を
印加し、５秒後の電流値を測定したところ、試料液中の
グルコース濃度に対応した応答電流値が得られた。
対極５を基準にして測定極４に一定電圧（０．５Ｖ）を
印加し、５秒後の電流値を測定したところ、試料液中の
グルコース濃度に対応した応答電流値が得られた。
【００２１】つぎに、上記の手順にて別途作製したスク
ロース・グルコース応答型糖センサに試料液としてスク
ロース水溶液３μｌを試料供給孔１０より供給した。
ロース・グルコース応答型糖センサに試料液としてスク
ロース水溶液３μｌを試料供給孔１０より供給した。
【００２２】試料液を供給してから１０秒後に対極５を
基準にして測定極４に一定電圧（０．５Ｖ）を印加し、
５秒後の電流値を測定したところ、試料液中のスクロー
ス濃度にかかわらず、応答電流値は得られなかった。
基準にして測定極４に一定電圧（０．５Ｖ）を印加し、
５秒後の電流値を測定したところ、試料液中のスクロー
ス濃度にかかわらず、応答電流値は得られなかった。
【００２３】さらに、試料液を供給して３分後に、再び
対極５を基準にして測定極４に一定電圧（０．５Ｖ）を
印加し、５秒後の電流値を測定したところ、試料液中の
スクロース濃度に対応した応答電流値が得られた。
対極５を基準にして測定極４に一定電圧（０．５Ｖ）を
印加し、５秒後の電流値を測定したところ、試料液中の
スクロース濃度に対応した応答電流値が得られた。
【００２４】反応層７が試料液に溶解すると、試料液中
のスクロースはＩＮＶによって加水分解されフルクトー
スとα−グルコースが生成する。α−グルコースは水溶
液として放置すると光学異性体であるβ−グルコースと
の平衡に達するが、長い時間を要する。この平衡移動は
ＭＵＴによって触媒されるため、迅速にβ−グルコース
となり、ＧＯＤによって酸化される。ＧＯＤによる酸化
反応にともなって共存するフェリシアン化カリウムがフ
ェロシアン化カリウムに還元される。次に、前記の一定
電圧の印加により、生成したフェロシアン化カリウムが
酸化する際の酸化電流が得られ、この電流値は基質であ
るスクロースの濃度に対応する。
のスクロースはＩＮＶによって加水分解されフルクトー
スとα−グルコースが生成する。α−グルコースは水溶
液として放置すると光学異性体であるβ−グルコースと
の平衡に達するが、長い時間を要する。この平衡移動は
ＭＵＴによって触媒されるため、迅速にβ−グルコース
となり、ＧＯＤによって酸化される。ＧＯＤによる酸化
反応にともなって共存するフェリシアン化カリウムがフ
ェロシアン化カリウムに還元される。次に、前記の一定
電圧の印加により、生成したフェロシアン化カリウムが
酸化する際の酸化電流が得られ、この電流値は基質であ
るスクロースの濃度に対応する。
【００２５】試料液を供給して１０秒後では、ＩＮＶあ
るいはＭＵＴによる酵素反応が十分に進行せず、β−グ
ルコースがほとんど生成していないものと考えられる。
るいはＭＵＴによる酵素反応が十分に進行せず、β−グ
ルコースがほとんど生成していないものと考えられる。
【００２６】つぎに、上記の手順にて別途作製したスク
ロース・グルコース応答型糖センサに試料液としてグル
コースとスクロースの混合水溶液３μｌを試料供給孔１
０より供給した。
ロース・グルコース応答型糖センサに試料液としてグル
コースとスクロースの混合水溶液３μｌを試料供給孔１
０より供給した。
【００２７】試料液を供給してから１０秒後に対極５を
基準にして測定極４に一定電圧（０．５Ｖ）を印加し、
５秒後の電流値を測定したところ、試料液中のグルコー
ス濃度のみに対応した応答電流値が得られた。
基準にして測定極４に一定電圧（０．５Ｖ）を印加し、
５秒後の電流値を測定したところ、試料液中のグルコー
ス濃度のみに対応した応答電流値が得られた。
【００２８】さらに、試料液を供給して３分後に、再び
対極５を基準にして測定極４に一定電圧（０．５Ｖ）を
印加し、５秒後の電流値を測定したところ、試料液中の
グルコース濃度とスクロース濃度の和に対応した応答電
流値が得られた。
対極５を基準にして測定極４に一定電圧（０．５Ｖ）を
印加し、５秒後の電流値を測定したところ、試料液中の
グルコース濃度とスクロース濃度の和に対応した応答電
流値が得られた。
【００２９】１０秒後に一定電圧を印加した際の電流値
より試料液中のグルコース濃度が定量でき、３分後に一
定電圧を印加した際の酸化電流値よりグルコース濃度と
スクロース濃度の和が得られたため、グルコースおよび
スクロースそれぞれの濃度を精度よく定量することがで
きた。
より試料液中のグルコース濃度が定量でき、３分後に一
定電圧を印加した際の酸化電流値よりグルコース濃度と
スクロース濃度の和が得られたため、グルコースおよび
スクロースそれぞれの濃度を精度よく定量することがで
きた。
【００３０】（実施例２）バイオセンサの一例として、
スクロースとフルクトースを定量するスクロース・フル
クトース応答型糖センサについて説明する。
スクロースとフルクトースを定量するスクロース・フル
クトース応答型糖センサについて説明する。
【００３１】実施例１と同様にして、ポリエチレンテレ
フタレートからなる絶縁性の基板１上に、リ−ド２、３
と電極系（測定極４、対極５）および絶縁層６を形成し
た。
フタレートからなる絶縁性の基板１上に、リ−ド２、３
と電極系（測定極４、対極５）および絶縁層６を形成し
た。
【００３２】つぎに、前記電極系上に親水性高分子とし
てヒドロキシエチルセルロース（以下ＨＥＣと略す）の
０．５wt％水溶液を滴下、乾燥させてＨＥＣ層を形成し
た。
てヒドロキシエチルセルロース（以下ＨＥＣと略す）の
０．５wt％水溶液を滴下、乾燥させてＨＥＣ層を形成し
た。
【００３３】つづいて、前記電極系上にＩＮＶとフルク
トースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．９９．１１：以
下ＦＤＨと略す）とフェリシアン化カリウムをMcIlvain
eの緩衝液（０．１Ｍ：クエン酸−０．２Ｍ：Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4；ｐＨ＝５．５）に溶解させた混合溶液を滴下し、
乾燥させて反応層を形成した。さらに、実施例１と同様
にしてカバー９およびスペーサー８と共に一体化してス
クロース・フルクトース応答型糖センサを作製した。
トースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．９９．１１：以
下ＦＤＨと略す）とフェリシアン化カリウムをMcIlvain
eの緩衝液（０．１Ｍ：クエン酸−０．２Ｍ：Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4；ｐＨ＝５．５）に溶解させた混合溶液を滴下し、
乾燥させて反応層を形成した。さらに、実施例１と同様
にしてカバー９およびスペーサー８と共に一体化してス
クロース・フルクトース応答型糖センサを作製した。
【００３４】上記のようにして作製したスクロース・フ
ルクトース応答型糖センサに、試料液としてスクロース
とフルクトースの混合水溶液３μｌを試料供給孔より供
給し、実施例１と同様にして２回の測定操作を行なっ
た。具体的手順は、以下の通りである。
ルクトース応答型糖センサに、試料液としてスクロース
とフルクトースの混合水溶液３μｌを試料供給孔より供
給し、実施例１と同様にして２回の測定操作を行なっ
た。具体的手順は、以下の通りである。
【００３５】試料液を供給してから１０秒後に対極を基
準にして測定極に一定電圧（０．５Ｖ）を印加し、５秒
後の電流値を測定したところ、試料液中のフルクトース
濃度のみに対応した応答電流値が得られた。
準にして測定極に一定電圧（０．５Ｖ）を印加し、５秒
後の電流値を測定したところ、試料液中のフルクトース
濃度のみに対応した応答電流値が得られた。
【００３６】さらに、試料液を供給して３分後に、再び
対極を基準にして測定極に一定電圧（０．５Ｖ）を印加
し、５秒後の電流値を測定したところ、試料液中のフル
クトース濃度とスクロース濃度の和に対応した応答電流
値が得られた。
対極を基準にして測定極に一定電圧（０．５Ｖ）を印加
し、５秒後の電流値を測定したところ、試料液中のフル
クトース濃度とスクロース濃度の和に対応した応答電流
値が得られた。
【００３７】１０秒後に一定電圧を印加した際の電流値
より試料液中のフルクトース濃度が定量でき、３分後に
一定電圧を印加した際の酸化電流値よりフルクトース濃
度とスクロース濃度の和が得られたため、フルクトース
およびスクロースそれぞれの濃度を精度よく定量するこ
とができた。
より試料液中のフルクトース濃度が定量でき、３分後に
一定電圧を印加した際の酸化電流値よりフルクトース濃
度とスクロース濃度の和が得られたため、フルクトース
およびスクロースそれぞれの濃度を精度よく定量するこ
とができた。
【００３８】なお、上記実施例では、反応層は電極系表
面に接して形成する方法について述べたが、必ずしもそ
の必要はない。図２のようなカバー９およびスペーサー
８と一体化する場合には、カバー９とスペーサー８と絶
縁性の基板１とによって電極系上部に空間部が形成され
る。前記カバー９、スペーサー８、絶縁性の基板１の前
記空間部の内壁面に相当する部位であれば適当な場所に
反応層を形成することができる。センサに供給された試
料液は前記空間部を満たすため、反応層を溶解すること
が可能である。
面に接して形成する方法について述べたが、必ずしもそ
の必要はない。図２のようなカバー９およびスペーサー
８と一体化する場合には、カバー９とスペーサー８と絶
縁性の基板１とによって電極系上部に空間部が形成され
る。前記カバー９、スペーサー８、絶縁性の基板１の前
記空間部の内壁面に相当する部位であれば適当な場所に
反応層を形成することができる。センサに供給された試
料液は前記空間部を満たすため、反応層を溶解すること
が可能である。
【００３９】上記実施例では、電極系間に一定電圧を印
加する時間を試料液供給後１０秒および３分としたがこ
の組合せに限定されるものではなく、上記の効果が得ら
れる範囲内で自由に設定することが可能である。
加する時間を試料液供給後１０秒および３分としたがこ
の組合せに限定されるものではなく、上記の効果が得ら
れる範囲内で自由に設定することが可能である。
【００４０】さらに、上記実施例ではスクロース・グル
コース応答型糖センサおよびスクロース・フルクトース
応答型糖センサについて述べたが、これらに限定される
ものではなく、上記効果が得られる酵素反応系に広く適
用することができる。
コース応答型糖センサおよびスクロース・フルクトース
応答型糖センサについて述べたが、これらに限定される
ものではなく、上記効果が得られる酵素反応系に広く適
用することができる。
【００４１】上記実施例では、緩衝液としてＫＨ2ＰＯ4
−Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ＝７．４）およびMcIlvaineの緩
衝液（ｐＨ＝５．５）を用いたが、緩衝液の種類および
そのｐＨはこれらに限定されるものではない。
−Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ＝７．４）およびMcIlvaineの緩
衝液（ｐＨ＝５．５）を用いたが、緩衝液の種類および
そのｐＨはこれらに限定されるものではない。
【００４２】さらに、上記実施例では親水性高分子とし
てカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセル
ロスを用いたが、これらに限定されることはなく、他の
セルロース誘導体、具体的には、メチルセルロース、エ
チルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチ
ルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチ
ルセルロースを用いてもよく、さらには、ポリビニルピ
ロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチンおよびその
誘導体、アクリル酸およびその塩、メタアクリル酸およ
びその塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸
およびその塩を用いても同様の効果が得られた。
てカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセル
ロスを用いたが、これらに限定されることはなく、他の
セルロース誘導体、具体的には、メチルセルロース、エ
チルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチ
ルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチ
ルセルロースを用いてもよく、さらには、ポリビニルピ
ロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチンおよびその
誘導体、アクリル酸およびその塩、メタアクリル酸およ
びその塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸
およびその塩を用いても同様の効果が得られた。
【００４３】一方、電子受容体としては、上記実施例に
示したフェリシアン化カリウム以外に、ｐ−ベンゾキノ
ン、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フ
ェロセン誘導体なども使用できる。
示したフェリシアン化カリウム以外に、ｐ−ベンゾキノ
ン、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フ
ェロセン誘導体なども使用できる。
【００４４】また、上記実施例において酵素および電子
受容体については試料液に溶解する方式について示した
が、これに制限されることはなく、固定化によって試料
液に不溶化させた場合にも適用することができる。
受容体については試料液に溶解する方式について示した
が、これに制限されることはなく、固定化によって試料
液に不溶化させた場合にも適用することができる。
【００４５】また、上記実施例では、測定極と対極のみ
の二極電極系について述べたが、参照極を加えた三電極
方式にすれば、より正確な測定が可能である。
の二極電極系について述べたが、参照極を加えた三電極
方式にすれば、より正確な測定が可能である。
【００４６】
【発明の効果】以上のように本発明の基質濃度測定方法
によると、従来構成の少なくとも一つの電極系備えたバ
イオセンサを用いて、試料中の複数種類の基質濃度を一
度に定量することができる。
によると、従来構成の少なくとも一つの電極系備えたバ
イオセンサを用いて、試料中の複数種類の基質濃度を一
度に定量することができる。
【図１】本発明のバイオセンサの一実施例として作製し
たスクロース・グルコース応答型糖センサの断面図
たスクロース・グルコース応答型糖センサの断面図
【図２】同スクロース・グルコース応答型糖センサのう
ち反応層を除いた分解斜視図
ち反応層を除いた分解斜視図
１ 絶縁性の基板 ２、３ リード ４ 測定極 ５ 対極 ６ 絶縁層 ７ 反応層 ８ スペーサー ９ カバー １０ 試料供給孔 １１ 空気孔
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 南海 史朗 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電 器産業株式会社内 (56)参考文献 特開 平４−264246（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−202764（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 27/327 G01N 27/416 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】バイオセンサを用いて、試料液中に含まれ
る第１基質および第２基質のそれぞれの濃度を測定する
方法であって、前記バイオセンサは、絶縁性の基板と、
前記絶縁性の基板上に形成され、かつ作用極と対極を有
する電極系と、前記第１基質と反応する第１酵素、前記
第２基質と反応する第２酵素、電子伝達体、および親水
性高分子を含有する反応層とを有し、 （ａ）上記バイオセンサに、第１基質および第２基質を
含む試料液を供給し、時間Ｔ 1 経過した後、電極系の作
用極と対極間に一定電圧を印加して電流値Ｉ 1 を測定す
る工程、および、 （ｂ）上記バイオセンサに前記試料液を供給してから時
間Ｔ 2 経過した後、電極系の作用極と対極間に一定電圧
を印加して電流値Ｉ 2 を測定する工程、 からなり、前記時間Ｔ 1 が、前記第１基質の少なくとも
一部と前記第１酵素とが反応するに十分な時間であり、
かつその時間内には前記第２基質と前記第２酵素とが十
分に反応せず、前記時間Ｔ 2 が、前記第２基質の少なく
とも一部と前記第２酵素とが反応するに十分な時間であ
る ことを特徴とする基質濃度測定方法。 - 【請求項２】前記第１酵素がグルコ−ス酸化酵素であ
り、前記第２酵素がスクロースの加水分解酵素である請
求項１記載の基質濃度測定方法。 - 【請求項３】前記第１酵素がフルクトース酸化酵素であ
り、前記第２酵素がスクロースの加水分解酵素である請
求項１記載の基質濃度測定方法。
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| JP4261183A JP2760234B2 (ja) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | 基質濃度測定方法 |
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| EP93115800A EP0590661B1 (en) | 1992-09-30 | 1993-09-30 | A method for measuring concentrations of substrates in a sample liquid by using a biosensor |
| DE69316499T DE69316499T2 (de) | 1992-09-30 | 1993-09-30 | Verfahren zur Konzentrationsmessung in einer Probenflüssigkeit mit einem Biosensor |
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|---|---|---|---|
| JP4261183A JP2760234B2 (ja) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | 基質濃度測定方法 |
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| JP4261183A Expired - Fee Related JP2760234B2 (ja) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | 基質濃度測定方法 |
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