CN104597230B - 一种功能高分子薄膜、制备方法及其应用 - Google Patents
一种功能高分子薄膜、制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种功能高分子薄膜、制备方法及其应用。所述方法包括如下步骤:1)将光交联剂修饰在基底表面;2)将聚合物溶液旋涂在步骤1)形成表面;3)用紫外光照射反应,使聚合物共价接枝到基底上形成聚合物薄膜;4)对聚合物进一步功能化或直接进行生物传感应用。该方法制备三维高分子表面简单、快速、高效,通过调控光交联剂密度、聚合物分子量、旋涂参数等可以精确控制表面高分子的密度和厚度,而且,所述方法可操作性强、重复性好,适合规模化生产。得到的聚合物薄膜表面对生物分子的固定量高,同时具有良好的抗非特异性吸附能力,可提高生物传感器(如表面等离激元共振成像、荧光、石英晶体微天平和电化学传感器等)的检测性能。
Description
技术领域
本发明涉及一种简单、快速、通用的高分子薄膜、制备方法及其在生物传感中的应用,特别是在表面等离激元共振成像中的应用。
背景技术
生物芯片主要通过对基底的表面化学修饰,将蛋白质、多肽、核酸等生物分子及细胞、组织等生物样品固定在芯片表面,进而实现对目标生物组分的准确、快速、大信息量检测,具有高度平行性、多样性、微型化以及自动化等特点。合理的表面化学修饰可以使生物样品固定的更为高效、稳定。为了提高生物芯片对生物样品的固定能力,减少非特异性吸附,提高检测的信号强度,进而提高仪器检测灵敏度,人们对表面化学方面进行了大量的研究。
目前,自组装单分子层在生物传感和芯片技术领域应用较为广泛,其优点在于可以在表面形成稳定、均一、致密的分子层,不但可以在检测过程中保护基底,减小非特异性吸附,也可以拥有多样化的末端功能基团,做进一步修饰;另外,自组装单分子层修饰操作极为简单,修饰重复性好。但是,自组装单分子层作为二维表面因其生物分子固定量小,检测生物分子相互作用时信号弱,使其应用受到了很大限制。为了进一步增强生物芯片对生物分子的固定量,从而提高生物传感器检测灵敏度,很多研究采用了三维结构的芯片表面修饰方法。在生物芯片基底上构建一层具有三维结构的富含各种活性基团的高分子薄膜,这类修饰方式所制备的表面通常被称作三维表面,因其三维空间表面具有大量生物分子的结合位点,大大提高了生物分子的固定量,可以达到普通芯片的数十甚至数百倍。
现有的关于三维结构表面修饰的研究包括各种聚合物膜的三维表面,如葡聚糖、聚丙烯酸、硝酸纤维素、尼龙、琼脂糖、聚丙烯酰胺、赖氨酸修饰的聚乙二醇水凝胶、微/纳米级粗糙表面结构以及一些超分子自组装三维结构等,其中葡聚糖三维表面应用最广(Johnsson B.,et al.,Comparison of methods for immobilization to carboxymethyldextran sensor surfaces by analysis of the specific activity of monoclonalantibodies.Journal of Molecular Recognition,1995.8(1-2):p.125-131.)。另外,基于原子转移自由基聚合(ATRP)方法制备的高分子刷状聚合物的研究也因为其反应条件温和、易操作,抗非特异性吸附能力强等优点,受到广泛关注(Wang,J.-S.and K.Matyjaszewski,Controlled/"living"radical polymerization.Atom transfer radicalpolymerization in the presence of transition-metal complexes.Journal of theAmerican Chemical Society,1995.117(20):p.5614-5615.)。而且,该材料生物相容性好,末端功能集团丰富,具有抗非特异性吸附等优良特性,被广泛应用到生物传感器表面中。
在聚合物生长中,分子链与表面或界面的连接一般有两种方法:一种是“接枝到”(graft-to)的方法,另外一种是“从表面接枝”的方法(graft-from)。“从表面接枝”方法中,聚合物直接在基底表面上生长,通常先将聚合物的引发剂固定于表面上,再通过表面上的引发剂引发下一步聚合,该方法可以通过调整单体和反应时间控制聚合物厚度,并通过调整引发剂的表面覆盖度来控制聚合物的接枝密度。然而,此方法实验步骤较为复杂,在调控表面聚合物密度时重复性相对较差,生产成本较高,使用催化剂通常有生物毒性,且易残留在表面,不利于生物分子活性保持。而“接枝到”方法由于制备简单、快捷,使用材料容易进行产前质控,受到人们青睐。但聚合物反应官能团通过化学键连接,对于不同官能团要采用不同反应体系,相对考虑因素较多,而且对于液-固界面反应,反应速率通常不高,时间较长,高分子在溶液中移动较难以及自身空间位阻大,造成局部反应受限,缺点越发突出。
发明内容
针对已有技术的问题,本发明的目的之一在于提供一种功能高分子薄膜的制备方法,该方法利用紫外光交联的方式随机地将聚合物共价固定在基底表面,得到高分子薄膜,然后对其进一步功能化或直接进行生物分子和药物分子等的捕获和检测。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
一种功能高分子薄膜的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(1)在生物芯片基底表面形成末端功能化的自组装单分子层;
(2)将光交联剂通过化学键合,接枝到自组装单分子层末端;
(3)将高分子溶液在避光条件下旋涂到步骤(2)形成的表面,然后干燥;
(4)将表面旋涂有高分子的生物芯片在惰性气体保护下进行紫外光照,在紫外光条件下进行化学键合,使高分子接枝到表面,形成高分子薄膜;
任选地,进行步骤(5):
(5)将高分子进行末端功能化,形成功能高分子薄膜,其用以捕捉生物分子及药物分子等,并进行高通量检测。
本发明结合旋涂技术和光交联技术,建立了一种简单、快速和通用的生物芯片表面化学修饰方法,制备得到了(功能)高分子薄膜。本发明主要利用光交联的方法在生物芯片表面进行化学修饰,用以形成高密度接枝的三维表面,然后对其进行进一步功能化并利用末端的功能化基团在SPRi仪器上实现生物分子(如蛋白、多肽、多糖,核酸)或药物等小分子的固定和检测或直接进行生物分子或药物分子的固定和检测。
优选地,步骤(1)前对生物芯片基底进行如下预处理:将生物芯片基底清洗干净。
优选地,所述生物芯片基底,包括一切可以用于制备生物芯片支持物的物质,例如玻璃、硅片和石英;聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚甲基丙烯酸甲酯等高分子类薄膜;金膜、银膜和三氧化二铝膜等金属和金属氧化物薄膜等。
优选地,所述生物芯片基底的清洗方式包括但不限于用有机溶剂(如乙醇、甲醇和N,N-二甲基甲酰胺等)或去离子水进行冲洗、摇洗或超声清洗,还包括利用等离子清洗仪进行表面清洗,或者将其中的任意两者或者三种方式组合使用。
优选地,步骤(1)中自组装单分子层的试剂包括但不限于单硫醇、双硫醇和硅烷化试剂等中的任意一种或者至少两种的混合试剂。
优选地,步骤(1)中末端功能化的基团包括但不限于烷氧基、羟基、羧基、氨基、环氧基或氰基等。
优选地,步骤(2)中所述光交联剂指含有光敏感基团,在特定波长(能量)光照下可以进行化学反应的试剂,如吖丙因、重氮、乙酰苯、二苯甲酮或蒽醌类等中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地,所述使光交联剂通过化学键合,接枝到自组装单分子层末端的方法根据生物芯片基底表面功能化基团以及光交联剂末端官能团的不同而采用不同的键合方法,如酰胺化、酯化、开环或亲核取代反应等。
例如本发明可采用的光交联剂结构式如图2所示,对于(a)结构,采用酯化反应接枝到自组装单分子层末端;对于(b)结构,采用酰胺化反应接枝到自组装单分子层末端。以酯化方法将羧基末端光交联剂接枝到羟基硫醇表面为例,由于上述光交联剂中含有F和N元素,而酯化接枝光交联剂之前的表面并无两种元素存在,所以可以根据F和N两种元素峰的出现在判断光交联剂是否接枝成功。如图3所示,酯化后的表面XPS数据显示同时出现F和N两个明显的峰,而对照中并无两元素,证明光交联剂已被成功接枝到表面。
优选地,所述高分子主要指具有生物相容性且具有活性端基的功能高分子,包括但不限于具有良好抗非特异性结合性能的高分子,如聚乙二醇及其衍生物、含氟聚合物、聚丙烯酸、聚苯乙烯和聚乳酸等;两性甜菜碱类聚合物等;具有良好生物相容性的高分子,如硝化纤维、壳聚糖、葡聚糖及其衍生物等。
优选地,步骤(4)所述惰性气体包括但不限于氮气或/和氩气等惰性气体。
优选地,步骤(4)所述紫外光波长为365nm。
如图4所示,将高分子通过365nm紫外光交联到表面后,用FT-IR(掠角附件)对芯片表面进行了表征。对于接枝聚(甲基丙烯酸聚乙二醇酯)的表面来说,3500cm-1出现O-H伸缩振动峰,3000-3200cm-1处出现CH2的振动双峰,1740cm-1左右出现明显的C=O伸缩振动峰,而低波数区域,如1100cm-1左右出现明显的C-O和C-C振动的峰。同样地,对于接枝葡聚糖的表面来说,3500cm-1出现-OH特征峰,3000-3200cm-1处出现CH2的振动双峰,1100cm-1左右出现明显的C-O-C伸缩振动的峰。以上证据均证明高分子被成功光交联到生物芯片表面,也证明该技术方案的可行性。
优选地,步骤(5)中末端功能化的基团包括但不限于羟基、羧基、醛基、氨基、环氧基、氰基、炔基、叠氮基或吖丙因等。
优选地,通过调控光交联剂密度(1mM~100mM)、高分子数均分子量(10万~200万)、旋涂参数(1000rpm~8000rpm)等可以精确控制表面高分子薄膜的密度和厚度。该方法制备三维高分子表面简单、快速和高效。
本发明的目的之二在于提供一种由如上所述方法得到的功能高分子薄膜。
本发明的目的之三在于提供一种如上所述的功能高分子薄膜的用途,其用于生物分子及药物分子的固定和高通量检测。
优选地,本发明中所述生物分子包括但不限于蛋白、多肽、核酸(DNA、RNA、cDNA和肽核酸等)以及糖等分子。药物分子主要为化学合成的药物活性化合物以及天然产物分离提纯得到的活性成分等。
本发明中所述的高通量检测方法,主要包括表面等离激元共振成像技术、荧光标记检测技术、荧光强度、荧光偏振、荧光共振能量转移、荧光淬灭、石英晶体微天平技术以及各种高通量的电化学检测技术和热检测技术等方法。
与已有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供了一种新的“接枝到”方法,利用旋涂技术和光交联技术得到了普适性的固定高分子的方法,可以利用紫外光一步将高分子非选择性地共价固定在表面,直接用于制备具有光交联结构的三维表面生物芯片。
此外,本发明所述方法采用光交联剂在紫外光照射下产生高反应活性的卡宾,其反应活性强,反应时间短,可随机与高分子进行***反应,适用于所有高分子,具有普适性。
另外,该方法基于成熟可靠的旋涂技术,所需的仪器设备具有普及性和通用性。利用本方法制备的生物芯片对各种生物检测物的固定和检测信号均有明显的提高,实用性强,适合大规模推广和商业化应用,具有非常广阔的应用前景。
此外,本发明优选采用相对较长的紫外光(365nm),副反应少,对表面其他修饰分子(如硫醇等)没有伤害。
附图说明
图1是基于光交联方法的功能高分子三维表面修饰流程图;
图2是本发明中的光交联剂分子结构式,其中,(a)羧基末端光交联剂;(b)氨基末端光交联剂;
图3是X射线光电子能谱(XPS)对接枝光交联剂前后的表面元素分析结果,其中,图(a)和(b)分别为N1s元素接枝前后的XPS图,图(c)和图(d)分别为F1s元素接枝前后的XPS图;
图4是傅里叶变换红外光谱(FT-IR)对光交联接枝高分子的表面进行表征,(a)聚(甲基丙烯酸聚乙二醇酯);(b)葡聚糖);
图5是基于光交联方法制备的葡聚糖三维表面生物传感芯片,以流通的方式固定链霉亲和素(SA),并检测4nM生物素(Biotin);
图6是在聚(甲基丙烯酸聚乙二醇酯)表面上固定雷帕霉素,利用SPRi检测与100nM的FKBP12(PBS,pH7.4,0.5%T20)蛋白的相互作用,其中,雷帕霉素-1、雷帕霉素-2和雷帕霉素-3分别表示三次重复实验采用的样品;
图7是凝集素微阵列表面等离子共振成像图;
图8是凝集素阵列对血清筛选结果。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1.葡聚糖表面(小分子检测:流通固定SA,检测Biotin)
(1)在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层3nm厚度的铬层和一层47nm厚度的金层,作为生物芯片的基底。
(2)准备羟基末端硫醇的乙醇溶液HS-(CH2)11-EG6-OH,浓度为1mM。
(3)将生物芯片基底用乙醇或去离子水清洗干净,然后将生物芯片放入等离子体清洗仪中清洗3分钟。
(4)将生物芯片浸泡在准备好的硫醇溶液中,在4℃下孵育12小时,达到预定时间后,将生物芯片取出,乙醇和去离子水交替清洗,氮气吹干。
(5)配制酯化连接光交联剂所需溶液20mL,羧基末端光交联剂10mM,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)10mM,4-二甲氨基吡啶(DMAP)1mM,溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
(6)将生物芯片浸入配制好的酯化溶液中,室温避光反应4小时,达到预定时间后,将生物芯片依次用DMF、乙醇和去离子水进行清洗,氮气吹干备用。
(7)将分子量为2000KDa的葡聚糖配制成质量浓度40%的水溶液,搅拌均匀,除去气泡至无色透明的均一溶液。
(8)将配制好的葡聚糖溶液铺满于生物芯片表面,以8000rpm的转速,旋涂1分钟,旋涂后,将生物芯片在室温下避光静置1小时晾干。
(9)将生物芯片放入紫外光交联仪中,氮气环境下,用365nm紫外光照射15分钟(2.4J/cm2)。
(10)达到预定时间后,将生物芯片用50℃的热水反复摇洗1小时,去除表面未共价固定的葡聚糖分子,期间换水3-5次,生物芯片清洗后氮气吹干备用。
(11)将生物芯片浸入丁二酸酐(10mg/mL)和4-二甲氨基吡啶(15mg/mL)的DMF溶液中,室温(25℃)反应16小时,达到预定反应时间后,将生物芯片取出,依次用DMF、乙醇、去离子水清洗,氮气吹干。
(12)配制50ug/mL链霉亲和素(SA)的乙酸钠缓冲液(pH=4.5)备用。
(13)调整SPRi光学位置,将SA溶液以3uL/s的速度流通到生物芯片表面,持续结合100s。
(14)重复步骤12,直到表面固定量达到饱和。
(15)将***溶液换成PBS缓冲液(含1%DMSO),调整光学位置,通入含4nM的生物素的PBS溶液(1%DMSO),结合300s,解离300s,1:100磷酸水溶液重生,10mM NaOH水溶液重生。
实验结果证明,用该方法制备的生物芯片有很高的蛋白固定量,足以检测到与蛋白结合的小分子(如图5)。
实施例2.聚(甲基丙烯酸聚乙二醇酯)表面(小分子阵列)
(1)在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层3nm厚度的铬层和一层47nm厚度的金层,作为生物芯片的基底。
(2)制备羟基末端和羧基末端的硫醇的乙醇溶液(HS-(CH2)11-EG6-OH和HS-(CH2)11-EG6-COOH),浓度均为1mM,将以上两种硫醇溶液按照999:1(v/v)混合,备用。
(3)将生物芯片用乙醇或去离子水清洗干净,然后将生物芯片放入等离子体清洗仪中清洗3分钟。
(4)将生物芯片浸泡在混合好的硫醇溶液中,在4℃下孵育12小时,达到预定时间后,将生物芯片取出,乙醇和去离子水交替清洗,氮气吹干。
(5)将生物芯片表面羧基进行活化,再浸入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液中(0.4M和0.1M),室温孵育30分钟,达到预定时间,用水清洗,氮气吹干备用。
(6)将生物芯片浸入10mM氨基末端光交联剂的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,室温避光反应4小时,达到预定时间后,将生物芯片依次用DMF、乙醇和去离子水进行清洗,氮气吹干备用。
(7)利用原子自由基转移聚合(ATRP)方法合成聚(甲基丙烯酸聚乙二醇酯)高分子聚合物的甲醇/水溶液。将氯化铜(CuCl2)溶液与其配体二联吡啶(Bpy)混合,搅拌15min。首先将单体OEGMA和单体HEMA以1:1(摩尔比)加入甲醇和水(1:1,体积比)的混合溶液,超声15min,持续通入氮气30min。再加入0.04M新配置的抗坏血酸水溶液,搅拌10min混均,然后加入1mM的双硫醇引发剂的乙醇溶液,其中引发剂与单体的摩尔比为1:25000,持续通入氮气,反应16小时。
(8)将步骤7得到的ATRP高分子原液旋蒸(35℃),除去甲醇,剩余液体用二氯甲烷溶剂萃取,离心。取出下层二氯甲烷溶液部分,旋干。
(9)用乙醇溶解步骤(8)中纯化的高分子,得到2μM的聚(甲基丙烯酸聚乙二醇酯)高分子聚合物的乙醇溶液,备用。
(10)将配置好的高分子溶液铺满于生物芯片表面,以8000rpm的转速,旋涂1分钟,旋涂后,将生物芯片在室温下避光静置1小时晾干,达到预定时间后,乙醇和水交替清洗,氮气吹干。
(11)将生物芯片放入紫外光交联仪中,氮气环境下,用365nm紫外光照射15分钟(2.4J/cm2)。
(12)达到预定时间后,将生物芯片用乙醇和水超声清洗,氮气吹干备用芯。
(13)将生物芯片浸入丁二酸酐(10mg/mL)和4-二甲氨基吡啶(15mg/mL)的DMF溶液中,室温反应12小时,达到预定反应时间后,将生物芯片取出,依次用DMF、乙醇和去离子水清洗,氮气吹干。
(14)用1mM的EG3的乙醇溶液铺在生物芯片表面,封闭30min,然后乙醇和水交替清洗,氮气吹干。至此,光交联方法制备的聚(甲基丙烯酸聚乙二醇酯)表面芯片已经完成,再次利用光交联方法固定小分子并利用SPRi对其相关蛋白进行检测,如下:
(15)将生物芯片表面进行再次活化,浸入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液中(0.4M和0.1M),室温孵育30分钟,达到预定时间,用水清洗,氮气吹干备用。
(16)将生物芯片再次浸入10mM光交联剂的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,室温避光反应4小时,达到预定时间后,将生物芯片依次用DMF、乙醇和去离子水进行清洗,氮气吹干备用。
(17)配制100nM雷帕霉素(Rapamycin)小分子溶液以及100ug/mLFKBP12蛋白的PBST缓冲液(其中吐温0.05%),备用。
(18)将小分子溶液通过点样仪点样于步骤(16)中制备好的表面,真空干燥。
(19)将芯片再次放入紫外光交联仪中,氮气环境下,用365nm紫外光照射15分钟(2.4J/cm2),进行光交联。
(20)调整SPRi光学位置,将FKBP12蛋白溶液以3uL/s的速度流通到芯片表面,持续结合300s,解离300s,甘氨酸-盐酸重生。
实验结果证明,用该方法制备的生物芯片有很高的小分子固定量,足以检测到小分子与其相关蛋白结合的相互作用(如图6所示)。
实施例3.葡聚糖表面(抗原抗体荧光检测)
(1)玻璃基底用乙醇或去离子水清洗干净,将生物芯片放入等离子体清洗仪中清洗3分钟,作为生物芯片的基底。
(2)准备1:50丙酮稀释的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)中,20-30s后取出,再用纯丙酮溶液去除未结的APES,使APES与玻璃结合,在玻璃表面形成一层单分子层。
(3)在25%的戊二醛中浸泡30分钟,用丙酮清洗,浸入1mM的一端为氨基一端为羟基的PEG的水溶液中,室温下孵育1h,达到预定时间后,将生物芯片取出,用去离子水清洗,氮气吹干。
(4)配制酯化连接光交联剂所需溶液20mL,羧基末端光交联剂10mM,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)10mM,4-二甲氨基吡啶(DMAP)1mM,溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
(5)将生物芯片浸入配制好的酯化溶液中,室温避光反应4小时,达到预定时间后,将生物芯片依次用DMF、乙醇和去离子水进行清洗,氮气吹干备用。
(6)将分子量为2000KDa的葡聚糖配制成质量浓度40%的水溶液,搅拌均匀,除去气泡至无色透明的均一溶液。
(7)将配制好的葡聚糖溶液铺满于生物芯片表面,以8000rpm的转速,旋涂1分钟,旋涂后,将芯片在室温下避光静置1小时晾干。
(8)将生物芯片放入紫外光交联仪中,氮气环境下,用365nm紫外光照射15分钟(2.4J/cm2)。
(9)达到预定时间后,将生物芯片用50℃的热水反复摇洗1小时,去除表面未共价固定的葡聚糖分子,期间换水3-5次,生物芯片清洗后氮气吹干备用。
(10)将生物芯片浸入丁二酸酐(10mg/mL)和4-二甲氨基吡啶(15mg/mL)的DMF溶液中,室温(25℃)反应16小时,达到预定反应时间后,将生物芯片取出,依次用DMF、乙醇、去离子水清洗,氮气吹干,备用。
(11)用移液枪取3μl的1mg/ml的人IgG(溶剂为pH值4.5的乙酸钠溶液)滴在步骤(10)中得到的表上,并辅以1mg/ml的BSA为阴性对照,室温孵育1小时,用含有0.0005g/ml的Tween-20的磷酸缓冲液清洗表面两次(每次5分钟),并用去离子水清洗后,氮气吹干。
(12)用0.05g/ml的脱脂牛奶溶液(Skim milk)(称取5g脱脂奶粉溶于100ml的0.1M的磷酸缓冲液制备而成)对表面进行室温封闭1小时后,用含有0.0005g/ml的Tween-20的磷酸缓冲液清洗表面两次(每次5分钟),去离子水清洗,氮气吹干。
(13)将异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的山羊抗人IgG以1:50的稀释倍数稀释在0.005mg/ml的脱脂牛***溶液中,并将经过步骤12处理后的芯片浸泡在该脱脂牛奶中,室温放置1小时,进行抗原抗体反应,用0.0005g/ml的Tween-20的磷酸缓冲液清洗表面两次(每次5分钟),并用去离子水清洗后,氮气吹干。
(14)将经过步骤13处理后的芯片,通过使用Leica M-6000荧光显微镜在480nm卤素光灯下以300ms曝光时间,光强为5的条件下以20倍物镜进行荧光成像。
实施例4.聚(甲基丙烯酸聚乙二醇酯)表面(SPRi糖蛋白阵列检测血清)
(1)在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层3nm厚度的铬层和一层47nm厚度的金层,作为生物芯片的基底。
(2)制备羟基末端和羧基末端的硫醇的乙醇溶液(HS-(CH2)11-EG6-OH和HS-(CH2)11-EG6-COOH),浓度均为1mM,将以上两种硫醇溶液按照999:1(v/v)混合,备用。
(3)将生物芯片用乙醇或去离子水清洗干净,然后将生物芯片放入等离子体清洗仪中清洗3分钟。
(4)将生物芯片浸泡在混合好的硫醇溶液中,在4℃下孵育12小时,达到预定时间后,将生物芯片取出,乙醇和去离子水交替清洗,氮气吹干。
(5)将生物芯片表面羧基进行活化,将芯片浸入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液中(0.4M和0.1M),室温孵育30分钟,达到预定时间,用水清洗,氮气吹干备用。
(6)将生物芯片浸入10mM光交联剂的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,室温避光反应4小时,达到预定时间后,将生物芯片依次用DMF、乙醇和去离子水进行清洗,氮气吹干备用。
(7)利用原子自由基转移聚合(ATRP)方法合成聚(甲基丙烯酸聚乙二醇酯)高分子聚合物的甲醇/水溶液。将氯化铜(CuCl2)溶液与其配体二联吡啶混合,搅拌15min。首先将单体OEGMA和单体HEMA以1:1(摩尔比)加入甲醇和水(1:1,体积比)的混合溶液,超声15min,持续通入氮气30min。再加入0.04M新配置的抗坏血酸水溶液,搅拌10min混均。然后加入1mM的双硫醇引发剂的乙醇溶液,其中引发剂与单体的摩尔比为1:25000,持续通入氮气,反应16小时。
(8)将步骤(7)得到的ATRP高分子原液旋蒸(35度),除去甲醇,剩余液体用二氯甲烷溶剂萃取,离心,取出下层二氯甲烷溶液部分,旋干。
(9)用乙醇溶解步骤(8)中纯化的高分子,得到纯化的聚(甲基丙烯酸聚乙二醇酯)高分子聚合物的乙醇溶液,备用。
(10)将配置好的高分子溶液铺满于生物芯片表面,以8000rpm的转速,旋涂1分钟,旋涂后,将生物芯片在室温下避光静置1小时晾干。
(11)将生物芯片放入紫外光交联仪中,氮气环境中,用365nm紫外光照射15分钟(2.4J/cm2)。
(12)达到预定时间后,将生物芯片用乙醇和水超声清洗,氮气吹干备用。
(13)将生物芯片浸入丁二酸酐(10mg/mL)和4-二甲氨基吡啶(15mg/mL)的DMF溶液中,室温反应16小时,达到预定反应时间后,将生物芯片取出,依次用DMF、乙醇、去离子水清洗,氮气吹干。至此,光交联方法制备的聚(甲基丙烯酸聚乙二醇酯)表面芯片已经完成,利用点样仪进行凝集素(lectin)的固定以及利用SPRi对1型糖尿病(T1)、2型糖尿病(T2)以及1.5型糖尿病(LADA)人血清的相关检测,并用正常人血清作为对照(C)。
(14)将生物芯片表面进行活化,浸入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液中(0.4M和0.1M),室温孵育30分钟,达到预定时间,用水清洗,氮气吹干备用。
(15)利用点样仪将49种不同lectin点样于制备好的芯片表面,真空干燥,待用。
(16)将步骤(15)中的芯片用2%的脱脂牛奶(PBS溶液)进行封闭,4度条件下过夜,依次用10*PBST,1*PBST,0.1*PBST以及水清洗10min,氮气吹干,待用。
(17)用HEPES缓冲液将4种不同血清样品以1:4000进行稀释,备用。
(18)调整SPRi光学位置,先以4ul/s的流速通入HEPES缓冲液10min,再用1:200盐酸(加入0.05%吐温)重生表面3次,并将血清样品溶液以3uL/s的速度随机顺序流通到芯片表面,持续结合300s,解离300s,1:200盐酸(加入0.05%吐温)重生。
实验结果证明,用该方法制备的芯片有很高的lectin固定量,并可以很好的检测到不同种类糖尿病血清(如图7和图8)。
实施例5.聚丙烯酸表面(PAA)制备蛋白质微阵列
(1)在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层3nm厚度的铬层和一层47nm厚度的金层,作为生物芯片的基底。
(2)制备羟基末端和羧基末端的硫醇的乙醇溶液(HS-(CH2)11-EG6-OH和HS-(CH2)11-EG6-COOH),浓度均为1mM。将两种硫醇溶液(EG6-OH:EG6-COOH)按照999:1混合,备用。
(3)将生物芯片用乙醇或去离子水清洗干净,然后将生物芯片放入等离子体清洗仪中清洗3分钟。
(4)将生物芯片浸泡在混合好的硫醇溶液中,在4℃下孵育12小时,达到预定时间后,将生物芯片取出,乙醇和去离子水交替清洗,氮气吹干。
(5)将生物芯片表面羧基进行活化,将生物芯片浸入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液中(0.4M和0.1M),室温孵育30分钟,达到预定时间,用水清洗,氮气吹干备用。
(6)将生物芯片浸入10mM羧基末端光交联剂的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,室温避光反应4小时,达到预定时间后,将生物芯片依次用DMF、乙醇和去离子水进行清洗,氮气吹干备用。
(7)将分子量为140000的聚丙烯酸高分子(PAA)配制成体积浓度1%的水溶液,搅拌均匀,除去气泡至无色透明的均一溶液。
(8)将配置好的PAA溶液铺满于生物芯片表面,以8000rpm的转速,旋涂1分钟,旋涂后,将生物芯片在室温下避光静置1小时晾干。
(9)将生物芯片放入紫外光交联仪中,氮气环境下,用365nm紫外光照射15分钟(2.4J/cm2)。
(10)达到预定时间后,将生物芯片用水清洗,氮气吹干备用。
(11)将生物芯片表面进行活化,浸入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液中(0.4M和0.1M),室温孵育30分钟。达到预定时间,用水清洗,氮气吹干备用。至此,光交联方法制备的聚丙烯酸表面芯片已经完成,利用SPRi进行抗原的固定以及抗体的检测。
(12)配置1mg/ml的H-IgG的PBS溶液以及100ug/ml的Goat-anti-H-IgG的PBS溶液,备用。
(13)将配好的H-IgG溶液点洋于步骤(11)中制备好的芯片表面,干燥,待用。
(14)将生物芯片用1mg/ml的BSA溶液室温下封闭10min,PBS溶液和水清洗,氮气吹干,备用。
(15)调整SPRi光学位置,将Goat-anti-H-IgG的PBS溶液以3uL/s的速度流通到芯片表面,持续结合300s,解离300s,NaOH溶液重生。
实验结果证明,用该方法制备的生物芯片有很高的抗原固定量,可以很好的检测到抗原与其抗体的相互作用。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (14)
1.一种功能高分子薄膜的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)在生物芯片基底表面形成末端功能化的自组装单分子层;
(2)将光交联剂通过化学键合,接枝到自组装单分子层末端;
(3)将高分子溶液在避光条件下旋涂到步骤(2)形成的表面,然后干燥;
(4)将表面旋涂有高分子的生物芯片在惰性气体保护下进行紫外光照,在紫外光条件下进行化学键合,使高分子接枝到表面,形成高分子薄膜;
任选地,进行步骤(5):
(5)将高分子进行末端功能化,形成功能高分子薄膜;
光交联剂密度为1mM~100mM,高分子数均分子量为10万~200万,旋涂转速为1000rpm~8000rpm;步骤(1)中自组装单分子层的试剂为单硫醇、双硫醇和硅烷化试剂中的任意一种或者至少两种的混合试剂,步骤(5)中末端功能化的基团为羟基、羧基、醛基、氨基、环氧基、氰基、炔基、叠氮基或吖丙因。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)前对生物芯片基底进行如下预处理:将生物芯片基底清洗干净。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物芯片基底为玻璃、硅片、石英、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、金膜、银膜或三氧化二铝膜。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物芯片基底的清洗方式为用有机溶剂或去离子水进行冲洗、摇洗或超声清洗,或者利用等离子清洗仪进行表面清洗,或其组合。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中末端功能化的基团为烷氧基、羟基、羧基、氨基、环氧基或氰基。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述光交联剂为吖丙因、重氮、乙酰苯、二苯甲酮或蒽醌类中的任意一种或者至少两种的组合。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,使光交联剂通过化学键合,接枝到自组装单分子层末端的方法为酰胺化、酯化、开环或亲核取代反应。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述高分子为聚乙二醇及其衍生物、含氟聚合物、聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚乳酸、两性甜菜碱类聚合物、硝化纤维、壳聚糖或葡聚糖及其衍生物。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)所述惰性气体为氮气或/和氩气。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)所述紫外光波长为365nm。
11.一种由权利要求1-10之一所述方法得到的功能高分子薄膜。
12.一种如权利要求11所述的功能高分子薄膜的用途,其用于生物分子及药物分子的固定和高通量检测。
13.如权利要求12所述的用途,其特征在于,所述生物分子为蛋白、多肽、核酸以及糖;所述药物分子为化学合成的药物活性化合物以及天然产物分离提纯得到的活性成分。
14.如权利要求12所述的用途,其特征在于,所述高通量检测包括表面等离激元共振成像技术、荧光标记检测技术、荧光强度、荧光偏振、荧光共振能量转移、荧光淬灭、石英晶体微天平技术、高通量的电化学检测技术和高通量的热检测技术。
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