JP2748347B2 - Aspergillus soya transformant - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus soja
e）の形質転換体に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION INDUSTRIAL APPLICATION The present invention relates to Aspergillus soja
e) The transformant.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

アスペルギルス（以下、Ａと略記する）・ソーヤは、
醤油等の醸造工業の他、酵素製造工業、医薬品製工業及
び食品工業等に用いられている。その使用は該微生物の
分泌能力に基づくものである。Ａ・ソーヤは、上記工業
に、大量に、商業的規模で用いられる微生物である。Ａ
・ソーヤに遺伝子工学技術を応用するためには、得られ
る形質転換体がさらに有用な生成物を発現し、これを大
量に分泌するように、DNAをＡ・ソーヤに移入する必要
がある。Aspergillus (hereinafter abbreviated as A) Sawyer
In addition to the brewing industry for soy sauce and the like, it is used in the enzyme manufacturing industry, the pharmaceutical manufacturing industry, the food industry, and the like. Its use is based on the secretory capacity of the microorganism. A. soya is a microorganism used in large quantities on a commercial scale in the industry. A
-In order to apply genetic engineering technology to soya, it is necessary to transfer DNA to A. soya such that the resulting transformant expresses a more useful product and secretes it in large quantities.

多くの遺伝子が種々の原核性ベクター（例えば大腸菌
を利用しての）でクローン化され、コードされたタンパ
ク質に関して高い発現レベルを得るための努力がなされ
ている。遺伝子を、その遺伝子が本来属している種と同
じか、または非常に良く似た宿主に導入した場合、これ
らの遺伝子はより効率良く発現され、加工され易く、本
来のタンパク質にさらによく似たタンパク質を産生し易
い。Many genes have been cloned into various prokaryotic vectors (eg, utilizing E. coli) and efforts have been made to obtain high expression levels of the encoded protein. When genes are introduced into a host that is the same as, or very similar to, the species to which they originally belong, these genes are more efficiently expressed, easier to process, and more closely resemble the original protein. Easy to produce.

Ａ・ソーヤは種々の工業的に重要な蛋白質、酵素、お
よび他の製品のもとを製造する微生物である。これはま
た、効率よく発現されたタンパク質を分泌することがで
きる。しかし、Ａ・ソーヤの形質転換は非常に困難であ
ることが判明している。A. Sawyer is a microorganism that produces a variety of industrially important proteins, enzymes, and other products. It can also secrete efficiently expressed proteins. However, transformation of A. soya has proven to be very difficult.

〔発明が解決しようとする課題〕[Problems to be solved by the invention]

本発明は、Ａ・ソーヤに遺伝子工学的手法により所定
の選択マーカーを付与した、有用なＡ・ソーヤの形質転
換体を開発することにある。An object of the present invention is to develop a useful transformant of A. soya in which a predetermined selection marker has been added to A. soya by a genetic engineering technique.

〔課題を解決するための手段〕[Means for solving the problem]

本発明は、所定の選択マーカーが欠損（「欠損」と
は、元来目的とする所定の選択マーカーを有する場合を
含む）したアスペルギルス・ソーヤ株のプロトプラスト
化した細胞を、前記所定の選択マーカーのDNA配列を含
有するDNAベクターで形質転換して得られる所定の選択
マーカーDNAを含むアスペルギルス・ソーヤ形質転換体
にある。The present invention relates to a protoplast-forming cell of an Aspergillus soya strain in which a predetermined selectable marker is deficient ("deletion" includes a case where a target specific selectable marker is originally contained). Aspergillus soya transformant containing a predetermined selectable marker DNA obtained by transforming with a DNA vector containing a DNA sequence.

上記DNAベクターとしは、環状、線状のいずれも用い
られる。また、所定の選択マーカーのDNAとしてはアス
ペルギルス属由来のものが用いられ、好ましくはオルニ
チンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子（arg B⁺）
が用いられる。このオルニチンカルバモイルトランスフ
ェラーゼ遺伝子はＡ・ソーヤまたはＡ・ニドランス由来
のものが用いられる。Both circular and linear DNA vectors are used. As the DNA for the predetermined selection marker, DNA derived from the genus Aspergillus is used, and preferably, the ornithine carbamoyltransferase gene (arg B ⁺ )
Is used. As the ornithine carbamoyltransferase gene, a gene derived from A. soya or A. nitrans is used.

本発明の形質転換体は、形質転換前のＡ・ソーヤの細
胞には存在しない選択マーカーDNAを含有するDNAベクタ
ーを用いて、宿主Ａ・ソーヤを形質転換することにより
調製される点に特徴がある。上記DNAベクターはＡ・ソ
ーヤに導入され、その選択マーカーのタンパク質の発現
を高めるものであるが、このDNAベクターには修飾する
のに必要な他の外来性DNAを含んでいてもよい。The transformant of the present invention is characterized in that it is prepared by transforming a host A. soya using a DNA vector containing a selectable marker DNA that is not present in A. soya cells before transformation. is there. The above-mentioned DNA vector is introduced into A. soya to enhance the expression of the protein of the selectable marker, and the DNA vector may contain other exogenous DNA necessary for modification.

次いで、この様にして形成された形質転換体は、組込
まれた選択マーカーに基づいて、非形質転換細胞から選
択し、単離し、通常の方法で増殖および培養することに
より得られる。The transformant thus formed can be obtained by selecting from non-transformed cells based on the incorporated selectable marker, isolating, growing, and culturing in a usual manner.

第１図は、本発明に従ったＡ・ソーヤ形質転換体の調
製に用いるDNAベクターpSal 43及び同pSal 23の構築図
である。FIG. 1 is a construction diagram of DNA vectors pSal43 and pSal23 used for preparing an A. soya transformant according to the present invention.

本発明において用いられる選択マーカーは、野性型Ａ
・ソーヤと比較して、形質転換体に存在していることが
その性質に実質的に影響しない様に、Ａ・ソーヤに天然
に存在しているものが適している。The selection marker used in the present invention is wild-type A
-Naturally present in A. soya is suitable so that its presence in the transformant does not substantially affect its properties as compared to soya.

このことから、本発明の形質転換体は、Ａ・ソーヤの
野生株、好ましくはその突然変異株を形質転換の宿主と
して用いた形質転換体である。元来、野生株型Ａ・ソー
ヤ株において所望の選択された遺伝子マーカーを欠損し
ている（即ち、有しない）場合は、これをそのまま形質
転換の宿主として用いることができる。しかし、この様
な場合は稀れである。従って野生型Ａ・ソーヤ株を突変
異処理し、選択された遺伝子マーカーが欠損した突然変
異株を用いることが好ましい。該形質転換体は、選択マ
ーカーおよび組込に必要な外来性DNAを含有するベクタ
ーで形質転換され、Ａ・ソーヤの選択マーカーのタンパ
ク質の発現が高められるものである。From this, the transformant of the present invention is a transformant using a wild type strain of A. soya, preferably a mutant strain thereof, as a host for transformation. If the wild-type A. soya strain originally lacks (ie, does not have) the desired selected genetic marker, it can be used directly as a transformation host. However, such cases are rare. Therefore, it is preferable to use a mutant strain in which a wild-type A. soya strain is subjected to a sudden mutation treatment and the selected gene marker is deleted. The transformant is transformed with a vector containing a selectable marker and exogenous DNA necessary for integration, so that the expression of the A. soya selectable marker protein is enhanced.

野生型Ａ・ソーヤを形質転換するためには、優性選択
マーカー、即ち、通常Ａ・ソーヤによって代謝されない
代謝物質を代謝する能力、または化学物質または抗生物
質の有害な作用に対する耐性等の新規表現型を特性する
遺伝子を用いることができる。野生型Ａ・ソーヤの形質
転換体は、導入された優性選択マーカーに基づいて選択
することができる。To transform wild-type A. soya, a dominant selectable marker, ie, a novel phenotype such as the ability to metabolize metabolites that are not normally metabolized by A. soya, or resistance to the deleterious effects of chemicals or antibiotics Can be used. Transformants of wild-type A. soya can be selected based on the introduced dominant selectable marker.

選択マーカーの好ましい例として、酵素オルニチント
ランスカルバミラーゼをコードするarg B⁺遺伝子が挙げ
られる。この酵素は、野生型Ａ・ソーヤに存在する。こ
の酵素が欠損している突然変異体（arg B^-株）は、通常
の技術、例えば、紫外線照射で処理することにより調製
することができ、アルギニン含有培地上では増殖できる
が、最小培地上では増殖できないことにより選択され
る。本発明の方法に従って、Ａ・ソーヤのarg B^-株およ
びarg B⁺遺伝子を含有するベクターからつくられた形質
転換体は、従ってarg B⁺であり、標準的なプレーティン
グおよび培養技術により、形質転換されていないarg B^-
株から容易に選択および単離することができる。A preferred example of a selectable marker is the argB ⁺ gene encoding the enzyme ornithine transcarbamylase. This enzyme is present in wild type A. soya. Mutants lacking this enzyme (arg B ^- strain) can be prepared by conventional techniques, for example, by treatment with ultraviolet radiation, and can grow on arginine-containing media, but on minimal media. Selected by not being able to grow. According to the method of the present invention, the transformants produced from the arg B ^- strain of A. soya and the vector containing the arg B ⁺ gene are thus arg B ⁺ and are transformed by standard plating and culturing techniques. arg B that have not been converted ^-
It can be easily selected and isolated from strains.

前記の如く、野生型Ａ・ソーヤに天然に存在する選択
マーカーを用いるのが好ましいが、ベクターにおいて用
いる選択マーカーが実際にＡ・ソーヤ由来のものである
必要はない。発現の条件下で所望の遺伝子を含有する他
の類似した株からも同様に得ることができる。As noted above, it is preferred to use a selectable marker that is naturally present in wild-type A. soya, but it is not necessary that the selectable marker used in the vector be actually derived from A. soya. Similarly, they can be obtained from other similar strains containing the desired gene under the conditions of expression.

本発明の形質転換体を調製するために用いるDNAベク
ター構築の好ましい態様においては、先ず、第１図にお
ける選択マーカーarg B⁺「イ」又は「ロ」を、Ａ・ニド
ランス株の全DNAを適当な制限酵素で処理することによ
り得、次いでこれをＡ・ソーヤ（arg B^-）を形質転換体
するのに適当なベクター・プラスミドpBB8又はpBB29に
連結することからなる。In a preferred embodiment of the construction of the DNA vector used for preparing the transformant of the present invention, first, the selection marker argB ⁺ "I" or "B" in FIG. It consists of coupling to a suitable vector plasmids pBB8 or to transform the body of PBB29 ^- obtained, then this a · Sawyer by treating with Do restriction enzyme (arg B).

本発明の好ましい具体例においては、宿主微生物のＡ
・ソーヤとして該Ａ・ソーヤのプロトプラストが用いら
れる。このプロトプラストの好ましい調製法は、例え
ば、β−1,3−グルカナーゼ及び／又はキチナーゼを用
いて細胞壁を酵素で溶解することによる。Ａ・ソーヤを
酵素で溶解しそのプロトプラストを得るのに適した酵素
の選択は、公知である。上記酵素は、複雑なポリサッカ
ライドを溶解できるものであって、広範囲にわたるＡ・
ソーヤの真菌のプロトプラストを調製するのに有効であ
る。In a preferred embodiment of the invention, the host microorganism A
The protoplast of A. Sawyer is used as Sawyer. A preferred method for preparing this protoplast is by lysing the cell wall with an enzyme using, for example, β-1,3-glucanase and / or chitinase. The selection of an enzyme suitable for dissolving A. soya with the enzyme to obtain its protoplast is known. The enzyme is capable of dissolving complex polysaccharides and has a wide range of A.
It is effective for preparing protoplasts of soya fungus.

上記β−1,3−グルカナーゼとしては生化学工業社販
売ザイモリアーゼ（Zymolyase）20T、同100T及び本発明
者らが微生物バチラス・サーキュランスIAM1165及びス
トレプトマイセス0143（FERM P-7276）のそれぞれの培
養液から調製した２つの粗酵素等が挙げられる。Examples of the β-1,3-glucanase include zymolyase (Zymolyase) 20T, 100T, and culture of microorganisms Bacillus circulans IAM1165 and Streptomyces 0143 (FERM P-7276). And two crude enzymes prepared from the liquid.

また上記キチナーゼとしては、キチナーゼ活性を有す
る酵素剤が用いられ、例えば米国ICN社製キチナーゼNo.
100466、米国シグマ社製キチナーゼNo.C-6137、生化学
工業社販売キチナーゼ・ファンガル（fungal）No.10029
0等が挙げられる。他の適当な方法を用いてプロトプラ
ストを形成してもよい。さらにベクターを細胞内に取り
込ませる適当な方法に関しては、プロトプラストのかわ
りにＡ・ソーヤの胞子、菌糸等の全細胞を用いても良
い。Further, as the chitinase, an enzyme agent having chitinase activity is used.For example, chitinase No.
100466, Chitinase No. C-6137 manufactured by Sigma, USA, Chitinase fungal No. 10029 sold by Seikagaku Corporation
0 and the like. Protoplasts may be formed using other suitable methods. Further, as for a suitable method for incorporating the vector into cells, whole cells such as spores and hypha of A. soya may be used instead of protoplasts.

本発明の形質転換体は、適当な選択したDNAベクター
（例えば、第１図においてpSal 34及びpSal 23）を用い
て行なわれる。本発明の形質転換体の調製のためのベク
ターは特性の選択マーカー（例えば、arg B⁺）を含有し
ていなければならず、また、形質転換体に含まれるべき
他の有用な遺伝子を含有していなければならない。DNA
ベクターは、前述の通り線状または環状DNAのいずれで
あってもよい。好ましくは、DNAベクターは、選択マー
カー等を導入し、Ｅ・コリ（E.coli）において適当な量
のベクターを産生するために、操作および複製ができる
ように、Ｅ・コリ・レプリコン（模写因子）を含有する
ものが用いられる。The transformant of the present invention is carried out using an appropriately selected DNA vector (for example, pSal 34 and pSal 23 in FIG. 1). Vectors for the preparation of transformants of the present invention must contain a characteristic selectable marker (eg, argB ⁺ ), and will contain other useful genes to be included in the transformant. Must be. DNA
The vector may be either linear or circular DNA as described above. Preferably, the DNA vector is E. coli replicon (copying factor) so that it can be manipulated and replicated to introduce a selectable marker or the like and produce an appropriate amount of vector in E. coli. ) Is used.

次に、一具体例として、本発明は、典型的には細胞壁
を酵素（例えばβ−1,3−グルカナーゼとキチナーゼ）
で溶解し、続いて精製するこにより得られるプロトプラ
ストを、プラスミドの形態のＡ・ニドランスのオルニチ
ンカルバモイルトランスフェラーゼ構造遺伝子を含有す
るDNAで、ポリエチレングリコール（以下、PEGと略記す
る）4000又は同6000およびCaCl₂の存在下で処理するこ
とによりＡ・ソーヤ・アルギニン要求株（Ａ・ソーヤ W
20-4）からアルギニンを要求しない形質転換体Ａ・ソー
ヤ株を調製することができる。これらの形質転換体は、
DNAのarg B⁺部をその染色体に組み込み、この遺伝子を
発現できる。該形質転換体は、親株（宿主株）には存在
しないpBR327由来のDNAとハイブリットを形成すること
から、形質転換体に存在する配列より明らかな如く、DN
Aベクターに存在するarg B⁺以外の他のDNAも取り込む。Next, as a specific example, the present invention typically involves the use of enzymes (eg, β-1,3-glucanase and chitinase)
The protoplasts obtained by dissolving and subsequently purifying are obtained by using a DNA containing an ornithine carbamoyltransferase structural gene of A. nidulans in the form of a plasmid, polyethylene glycol (hereinafter abbreviated as PEG) 4000 or 6000 and CaCl 2 by treatment in the presence of ₂ a-soya arginine auxotroph (a-Sawyer W
From 20-4), a transformant A. soya strain not requiring arginine can be prepared. These transformants are:
The argB ⁺ portion of the DNA can be integrated into the chromosome and the gene can be expressed. Since the transformant forms a hybrid with DNA derived from pBR327 which is not present in the parent strain (host strain), DN is apparent from the sequence present in the transformant.
Other DNA than arg B ⁺ present in the A vector is also incorporated.

従って、本発明に記載した形質転換を行なうために
は、レシピエント株（宿主株）、およびその一部（プロ
トプラスト）が、この株において選択可能なDNA、即
ち、選択マーカーを含有するDNAを必要とする。しか
し、DNAをレシピエントに取り込むことにより得られる
形質転換体が、容易に選択し得る表現型を有するよう
に、該受容体株（レシピエント株）および形質転換DNA
を選択しなければならない。Therefore, in order to carry out the transformation described in the present invention, the recipient strain (host strain) and a part thereof (protoplast) require a DNA selectable in this strain, that is, a DNA containing a selection marker. And However, the receptor strain (recipient strain) and the transformed DNA should be selected such that the transformant obtained by incorporating the DNA into the recipient has a phenotype that can be easily selected.
You have to choose.

以下本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

アスペルギルス・ソーヤ（ATCC 42251）をUVで突然変
異誘発し、得られた単離物は、所定の最小培地における
増殖にシトルリンまたはアルギニンを必要とする。この
単離物の中からオルニチンカルバモイルトライスフェラ
ーゼの欠損した株を選択し、これをarg B^-と称する。Aspergillus soya (ATCC 42251) is mutagenized with UV and the resulting isolates require citrulline or arginine for growth in a defined minimal medium. The isolate select deficient strain of ornithine carbamoyl Trice Feller peptidase among which the arg B ^- referred to as.

上記アスペルギルス・ソーヤのプロトプラストの調製
法については、特開昭60-75281に記載されているのと同
様である。The method for preparing the above protoplasts of Aspergillus soya is the same as that described in JP-A-60-75281.

即ち、Ａ・ソーヤの株を試験管のスラント培地（米麹
汁寒天培地）に接種し、室温で分生胞子の着生が充分に
なるまで培養し、分生胞子を得る。That is, the strain of A. soya is inoculated into a slant medium (rice koji agar medium) in a test tube, and cultured at room temperature until conidia are sufficiently formed to obtain conidia.

次にこの分生胞子を、１×10⁷個/mlとなるように、0.
01％ソルビタン脂肪酸エステル溶液「ソルゲンTW-60
（第一工業製社製）」に分散懸濁する。Next, this conidia, at 1 × 10 ⁷ cells / ml, 0.
01% sorbitan fatty acid ester solution "Solgen TW-60
(Manufactured by Daiichi Kogyo Co., Ltd.).

次に、この分生胞子の分散懸濁液1mlを、液体栄養培
地［ツアペック培地に酵母エキス0.5％及びカザミノ酸
0.2％加え、pH6.0に調製し、これを水で10倍に希釈し得
られたもの］30mlに接種し、150ml容三角フラスコ内
で、30℃で、発芽した胞子の長さがもとの胞子外径の約
10倍となるのに充分な時間、振盪培養し、発芽胞子懸濁
液を得、該懸濁液は更に遠心分離（4500g、20分）し
て、そこから発芽胞子を分離する。Next, 1 ml of the conidiospore dispersion suspension was added to a liquid nutrient medium [Zapec medium containing 0.5% yeast extract and casamino acid.
0.2% was added to adjust the pH to 6.0, which was diluted 10-fold with water.] The obtained spores were inoculated into 30 ml and germinated at 30 ° C in a 150 ml Erlenmeyer flask. About the outer diameter of the spore
The cells are cultured with shaking for a time sufficient to increase the concentration by a factor of 10 to obtain a germinated spore suspension.

次に、こうして得られた発芽胞子は充分水洗浄したの
ち、これに細胞壁溶解酵素液1mlを加え、27℃で２時
間、ゆるく振盪（毎分50〜60往復）して酵素処理し、Ａ
・ソーヤ・arg B^-株のプロトプラストを得る。Next, the germinated spores thus obtained are sufficiently washed with water, and 1 ml of a cell wall lysing enzyme solution is added thereto.
Sojae · arg B ^- get the protoplasts of strain.

ここに用いた細胞壁溶解酵素は、バチラス・サーキュ
ランス起源の粗酵素と市販のキチナーゼ（米国ICN社
製）をそれぞれ溶液1mlに30mg及び5mgの割合で溶解し得
られたものである。The cell wall lysing enzyme used here was obtained by dissolving a crude enzyme derived from Bacillus circulans and a commercially available chitinase (manufactured by ICN, USA) at 30 mg and 5 mg, respectively, in 1 ml of a solution.

次に、こうして得たプロトプラストをＧ−３規格のガ
ラスフィルターにより分離し、これを高張液（0.8Mソル
ビトール溶液）で数回繰り返し洗浄し、洗浄プロトプラ
ストを得る。Next, the protoplasts thus obtained are separated by a G-3 standard glass filter, and washed with a hypertonic solution (0.8 M sorbitol solution) several times to obtain washed protoplasts.

〔DNAベクターの調製法〕(Preparation method of DNA vector)

本発明の形質転換体の調製において用い、第１図に示
すDNAベクターpSal 43及びpSal 23の調製は、ドモチョ
ウスから（DMOCHOWSKA et al,Journal of General Micr
obiology（1986），132,1729〜1937）に記載されている
方法により得られ、また上記２つのDNAベクターの調製
に用いられるプラスミドpB29（大腸菌プラスミドpBR327
と酵母由来のDNAフラグメントを連結して調製）及びpBB
116（大腸菌プラスミドpBB8とＡ・ニドランス由来のarg
B⁺を有するフラグメントを連結して調製）の調製は、
バースら、ジーン（Berse et al,Gene），25,109〜117
（1983）に記載されている方法により得られる。The DNA vectors pSal 43 and pSal 23 used in the preparation of the transformant of the present invention shown in FIG. 1 were prepared from Domochous (DMOCHOWSKA et al, Journal of General Micr.
obiology (1986), 132 , 1729-1937) and used for the preparation of the above two DNA vectors, plasmid pB29 (E. coli plasmid pBR327).
And DNA fragment derived from yeast) and pBB
116 (E. coli plasmid pBB8 and arg from A. nidulans
Prepared by linking fragments having B ⁺ )
Bath et al., Gene (Berse et al, Gene), 25 , 109-117.
(1983).

また、本発明に用いられSal I、BamH I、及びEcoR I
等の制限酵素は、宝酒造株式会社より入手し、製造者の
指示に従って用いた。In addition, Sal I, BamH I, and EcoR I used in the present invention
And the like were obtained from Takara Shuzo Co., Ltd. and used according to the manufacturer's instructions.

次に本発明の方法において有用な前記２種のDNAベク
ターの調製および構成を第１図に示す。Next, the preparation and constitution of the two DNA vectors useful in the method of the present invention are shown in FIG.

第１図に酵素BamH Iを用いて公知の技法によりＡ・ニ
ドランスのDNAから抽出したarg B⁺遺伝子を用いる方法
を示す。FIG. 1 shows a method using the arg B ⁺ gene extracted from A. nidulans DNA by a known technique using the enzyme BamHI.

Ａ・ニドランスのフラクション（DNA遺伝子の断片
「イ」）を、まず４リガーゼ（直結酵素）を用いて公知
のＥ・コリ（E.coli）プラスミドpBB8と連結して、公知
のプラスミドpBB116を形成する。The A. nidulans fraction (DNA gene fragment "i") is first ligated to the known E. coli plasmid pBB8 using 4 ligases (direct ligase) to form the known plasmid pBB116. .

次いでプラスミドpBB116を制限酵素Sal Iで処理し
て、Ａ・ニドランス由来のarg B⁺遺伝子を含有するフラ
グメント「ロ」を形成する。このarg B⁺遺伝子を含有す
るフラグメントは、通常の方法、例えば、アガロース電
気泳動法および電気溶出法により単離、精製してもよ
い。The plasmid pBB116 is then treated with the restriction enzyme Sal I to form a fragment "b" containing the argB ⁺ gene from A. nidulans. The fragment containing the arg B ⁺ gene may be isolated and purified by a conventional method, for example, agarose electrophoresis and electroelution.

一方、公知のプラスミドpBB29（斜線部は酵母由来のD
NAフラグメントを意味する）を制限酵素Sal Iで切断し
て得られる、フラグメントにリガーゼを用いて、前記フ
ラグメント「ロ」を連結し、プラスミドpSal 43を得
る。尚、上記においてフラグメントの単離は省略しても
よく、連結工程は全フラグメントを用いて行い、リガー
ゼで処理したものの中から所望の配列を含有するプラス
ミドを公知の方法により選択してもよい。On the other hand, the known plasmid pBB29 (shaded area indicates yeast-derived D
The above fragment "B" is ligated to the fragment obtained by digesting the NA fragment (which means NA fragment) with the restriction enzyme SalI, using ligase to obtain a plasmid pSal43. In the above, isolation of the fragment may be omitted, and the ligation step is performed using all fragments, and a plasmid containing a desired sequence may be selected from those treated with ligase by a known method.

pSal 43は、アスペルギルスにおける選択マーカーと
して、arg B⁺遺伝子を含有し、また公知の技術による形
質転換によりＡ・ソーヤarg B^-突然変異体のプロトプラ
ストに導入することができる他のDNA配列を有する。pSal 43 contains the arg B ⁺ gene as a selectable marker in Aspergillus and has other DNA sequences which can be introduced into the protoplasts of the A. soya arg B ^- mutant by transformation by known techniques.

こうして得られた形質転換体は、arg B⁺の特性に基づ
いて、形質転換されていない突然変異体（arg B^-）から
選択され、単離され、培養され得る。Transformants thus obtained, on the basis of the arg B ⁺ properties, mutants that are not transformed (arg B ^-) is selected from be isolated and cultured.

次に、Ａ・ソーヤ株arg B^-の形質転換を行なうための
DNAベクターpSal 23の形成法について説明する。Next, A · sojae strain arg B ^- for performing the transformation of
A method for forming the DNA vector pSal23 will be described.

上記で得られたDNAベクターpSal 43を制限酵素EcoR I
で切断し、２つのフラグメント、即ち斜線部分で示す酵
母由来のDNAフラグメント及びarg B⁺遺伝子を含むフラ
グメントを得る。The DNA vector pSal 43 obtained above was replaced with the restriction enzyme EcoR I.
To obtain two fragments, that is, a DNA fragment derived from yeast indicated by a shaded portion and a fragment containing the argB ⁺ gene.

次に上記arg B⁺遺伝子を含むフラグメントをT4リガー
ゼを用いて、連結し、プラスミドpSal 23を得る。Next, the fragment containing the argB ⁺ gene is ligated using T4 ligase to obtain a plasmid pSal23.

こうして得たDNAベクターpSal 43及び同pSal 23は、
それぞれ長さ約9.2キロ、約5.9キロ塩基対でpBB29由来
のアンピシリン耐性（Ap R）遺伝子およびpBB116由来
（Ａ・ニドランス由来）のarg B⁺遺伝子を含有する。こ
れをＡ・ソーヤのarg B^-突然変異体のプロトプラストで
の形質転換に用いることができる。The DNA vectors pSal 43 and pSal 23 thus obtained are
Each is about 9.2 kilograms and about 5.9 kilobase pairs in length and contains the ampicillin resistance (ApR) gene from pBB29 and the argB ⁺ gene from pBB116 (from A. nidulans). This arg B of A · sojae ^- can be used for transformation of protoplasts of the mutant.

DNAベクターpSal 43および同pSal 23の両方とも、そ
のDNA配列中に、選択マーカーarg B⁺およびＡ・ソーヤ
に組込まれるＡ・ソーヤに内在しない他のDNAを含有す
る。Both the DNA vectors pSal 43 and pSal 23 contain in their DNA sequences the selectable marker argB ⁺ and other DNA not endogenous to A. soya which is integrated into A. soya.

この外来性DNAは、Ａ・ソーヤ形質転換体に新規でか
つ有用な性質を付与する有用な遺伝子を含んでもよい。The exogenous DNA may include a useful gene that confers new and useful properties to the A. soya transformant.

本発明に関して、外来性DNAを含むベクターは、Ａ・
ソーヤ宿主株の染色体DNA（ゲノム）に組込まれる。即
ち、プラスミドとしてではなく、染色体または核DNAの
一部となり、従って、外来性DNAの発現はその後永続的
になり、形質転換細胞からその配列が欠損することは殆
んどない。形質転換体の新規表現型は従って非常に安定
である。In the context of the present invention, the vector containing the exogenous DNA is A.
It is integrated into the chromosomal DNA (genome) of the Sawyer host strain. That is, rather than as a plasmid, it becomes part of the chromosomal or nuclear DNA, and thus the expression of the exogenous DNA is then permanent, with little loss of that sequence from the transformed cells. The novel phenotype of the transformants is therefore very stable.

〔発明の効果〕〔The invention's effect〕

本発明のＡ・ソーヤの形質転換体は選択マーカー以外
に天然のＡ・ソーヤには存在しない他のDNAを含むもの
であり、この形質転換体は蛋白質、酵素及び他の製品の
開発及び生産のために有用な微生物である。The A. soya transformant of the present invention contains, in addition to a selectable marker, other DNA not present in natural A. soya, and this transformant is used for the development and production of proteins, enzymes and other products. It is a useful microorganism for.

〔実施例〕〔Example〕

以下、実施例を示した本発明を具体的に説明する。但
し、本発明はこの実施例により限定されるものでない。Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the present invention is not limited by this embodiment.

実施例１ Ａ・ソーヤの形質転換 Ａ・ソーヤ（ATCC 42251）の胞子懸濁液に、常法によ
り紫外線照射処理し、該処理液を適当に滅菌水で希釈し
て、最小培地にアルギニンを添加した培地にプレートし
て30℃で３〜７日間培養した。ここで出現したコロニー
を最小培地に植え換えて、この培地で30℃で、３〜７日
間培養する。そして、前記アルギニンを添加した培地で
は生育するが、最小培地では生育できない株を、アルギ
ニン要求性変異（arg B^-）株として選択、分離する。Example 1 Transformation of A. soya A spore suspension of A. soya (ATCC 42251) is irradiated with ultraviolet rays by a conventional method, the treatment solution is appropriately diluted with sterile water, and arginine is added to the minimal medium. The medium was plated and cultured at 30 ° C. for 3 to 7 days. The colonies appearing here are replaced with a minimal medium, and cultured in this medium at 30 ° C. for 3 to 7 days. Then, a strain that grows in the medium containing arginine but cannot grow in the minimal medium is selected and isolated as an arginine-requiring mutant (arg B ⁻ ) strain.

本発明では、この株をＡ・ソーヤW20-4と略記する。
そして、この変異株はアスペルギルス・ソーヤW20-4は
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第10604
号として寄託している。In the present invention, this strain is abbreviated as A. Sawyer W20-4.
And this mutant strain was Aspergillus soya W20-4, which was sent to the Institute of Microbial Industry and Technology of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
No. has been deposited.

Ａ・ソーヤW20-4（arg B^-）株を試験管のスラント培
地（米麹汁寒天培地）に接種し、室温で分生胞子の着生
が充分になるまで培養し、分生胞子を得た。A · Soya W20-4 (arg B ^-) strain was inoculated into a test tube slant medium (rice koji juice agar), and cultured until settlement of conidia is sufficiently at room temperature, to obtain a conidia Was.

次にこの分生胞子を、１×10⁷個/mlとなるように、0.
01％ソルビタン脂肪酸エステル溶液［ソルゲンTW-60
（第一工業製薬社製）］に分散懸濁した。Next, this conidia, at 1 × 10 ⁷ cells / ml, 0.
01% Sorbitan fatty acid ester solution [Sorgen TW-60
(Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.)].

次に、この分生胞子の分散懸濁液1mlを、液体栄養培
地［ツアペック培地に酵母エキス0.5％及びカザミノ酸
0.2％加え、pH6.0に調製し、これを水で10倍に希釈し得
られたもの］30mlに接種し、150ml容三角フラスコ内
で、30℃で、発芽した胞子の長さがもとの胞子外径の約
10倍となるに充分な時間、振盪培養し、発芽胞子懸濁液
を得、該懸濁液は更に遠心分離（4500g、20分）して、
そこから発芽胞子を分離した。Next, 1 ml of the conidiospore dispersion suspension was added to a liquid nutrient medium [Zapec medium containing 0.5% yeast extract and casamino acid.
0.2% was added to adjust the pH to 6.0, which was diluted 10-fold with water.] The obtained spores were inoculated into 30 ml and germinated at 30 ° C in a 150 ml Erlenmeyer flask. About the outer diameter of the spore
After culturing with shaking for a time sufficient to increase the concentration to 10 times, a germinated spore suspension is obtained. The suspension is further centrifuged (4500 g, 20 minutes).
Germinated spores were separated therefrom.

次に、こうして得られた発芽胞子は充分水洗浄したの
ち、これに細胞壁溶解酵素1mlを加え、27℃で２時間、
ゆるく振盪（毎分50〜60往復）して、Ａ・ソーヤW20-4
（arg B^-）株のプロトプラストを得た。Next, the germinated spores thus obtained are sufficiently washed with water, and 1 ml of a cell wall lysing enzyme is added thereto.
A. Sawyer W20-4 with gentle shaking (50-60 reciprocations per minute)
To obtain a strain of protoplast ^- (arg B).

ここに用いた細胞壁溶解酵素は、バチラス・サーキュ
ランス起源の粗酵素と市販のキチナーゼ（米国ICN社
製）をそれぞれ溶液1mlに30mg及び5mgの割合で溶解し得
られたものである。The cell wall lysing enzyme used here was obtained by dissolving a crude enzyme derived from Bacillus circulans and a commercially available chitinase (manufactured by ICN, USA) at 30 mg and 5 mg, respectively, in 1 ml of a solution.

次に、こうして得たプロトプラストをＧ−３規格のガ
ラスフィルターにより分離し、これを高張液（0.8Mソル
ビトール溶液）で洗浄し、洗浄プロトプラストを得た。Next, the protoplasts thus obtained were separated by a G-3 standard glass filter, and washed with a hypertonic solution (0.8 M sorbitol solution) to obtain washed protoplasts.

次に、プロトプラストを0.8M KCl、10mM CaCl₂、10mM
トリス/HCl、pH7.5中に最終濃度10⁸/mlとなるように再
懸濁する。この0.2mlの懸濁液を容量1.5mlプラスチック
製試験管に入れ、前記方法で調製したDNAベクター「pSa
l 43」または同「pSal 23」のいずれかのDNA10〜100μ
ｇ（総容量:TEバッファー10μｌ中）を添加し、氷温に
て30分間インキュベートする。これに25％PEG4000、50m
M、CaCl₂、10mMトリス/HCl、pH7.5の溶液1mlを添加し、
静かにかつ充分に攪拌し、次いで室温にてさらに15分間
インキュベートする。以上のようにして形質転換を行
う。DNAベクターpSal 43で形質転換された本発明のアス
ペルギルス・ソーヤ形質転換体はＡ・ソーヤKTR-3とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第1060
3号として寄託している。Next, the protoplasts were mixed with 0.8 M KCl, 10 mM CaCl ₂ , 10 mM
Resuspend in Tris / HCl, pH 7.5 to a final concentration of 10 ⁸ / ml. The 0.2 ml suspension was placed in a 1.5 ml plastic test tube, and the DNA vector `` pSa
l43 '' or the same `` pSal 23 '' DNA 10-100μ
g (total volume: in 10 μl of TE buffer) and incubate at ice temperature for 30 minutes. 25% PEG 4000, 50m
Add 1 ml of M, CaCl ₂ , 10 mM Tris / HCl, pH 7.5,
Shake gently and thoroughly, then incubate at room temperature for another 15 minutes. Transformation is performed as described above. The Aspergillus soya transformant of the present invention transformed with the DNA vector pSal 43 was designated as A. soya KTR-3 by the Microorganisms Research Institute of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
Deposited as No. 3.

次に、こうして形質転換されたプロトプラスト懸濁液
全量を、0.8M KCl、10mM CaCl₂、10mMトリス/HCl、pH7.
5溶液6mlと混和希釈し、700gで５分間遠心分離する。更
に、分離された形質転換体のプロトプラストに同容量の
上記希釈液を加え、遠心分離して、洗浄されたものを得
る。Next, the total amount of the protoplast suspension thus transformed was added to 0.8 M KCl, 10 mM CaCl ₂ , 10 mM Tris / HCl, pH 7.
5 Mix and dilute with 6 ml of the solution, and centrifuge at 700 g for 5 minutes. Further, the same volume of the above diluent is added to the separated protoplasts of the transformant, and centrifuged to obtain a washed one.

次に、洗浄された形質転換体のプロトプラストを1ml
の上記希釈液に懸濁し、この10μｌ〜100μｌを、0.6M
KClを含む最小培地（2.0％寒天）にプレートする。また
その上に同培地（但し、0.5％寒天）を重層する。次い
で30℃にて３〜10日間培養する。Next, 1 ml of the protoplasts of the washed transformant was added.
Suspended in the above diluent, and add 10 μl to 100 μl thereof to 0.6 M
Plate on minimal medium containing KCl (2.0% agar). The same medium (0.5% agar) is layered thereon. Then, the cells are cultured at 30 ° C. for 3 to 10 days.

arg B⁺およびDNAベクターpSal 43および同pSal 23由
来の他のDNAをとりこんだ形質転換体は、最小培地＋KCl
（塩化カリウムはプロトプラストが破裂するのを防ぐの
に必要である）上で増殖する。Transformants incorporating argB ⁺ and other DNA derived from the DNA vectors pSal 43 and pSal 23 were prepared in minimal medium + KCl
(Potassium chloride is necessary to prevent protoplasts from bursting).

未変化の細胞、未変化のプロトプラスト、形質転換
体、および復帰突然変異体を含むあらゆる生存可能な細
胞およびプロトプラストは、最小培地＋アルギニイン＋
KCl上で増殖する。かかる増殖培地により、生存可能な
物質の生存率を調べることができる。これらの実験にお
いて10⁸/mlのうち、上記アルギニンを含む培地で生存可
能な物質の生育できた割合は30％以上であった。最小培
地＋アルギニン上では、汚染された非プロトプラスト物
質のみが増殖する。この様な非浸透圧感受性細胞での汚
染は、本実験においては１％未満であった。Any viable cells and protoplasts, including unchanged cells, unchanged protoplasts, transformants, and revertants, are minimal medium + arginine +
Grow on KCl. With such a growth medium, the viability of a viable substance can be examined. In these experiments, the percentage of viable substances that could grow on the arginine-containing medium was 30% or more of 10 ⁸ / ml. On minimal medium + arginine, only contaminated non-protoplast material grows. Contamination with such non-osmosensitive cells was less than 1% in this experiment.

実施例２ 上記で得られたＡ・ソーヤW20-4の形質転換体が復帰
突然変異体ではなく、真正の形質転換体であるかどうか
を調べるために、該形質転換体を完全培地中で増殖さ
せ、これからDNAを調製し、放射性標識プラスミドで検
査する。Example 2 To determine whether the transformant of A. soya W20-4 obtained above was not a revertant but a genuine transformant, the transformant was grown in a complete medium. DNA is prepared from this and tested with a radiolabeled plasmid.

形質転換体の培養 下記ポリペプトン・デキストリン培地400mlに、10⁵分
生子/mlとなるように接種し、30℃にて16時間増殖させ
た菌糸体を、ファルコンフィルター（ファルコン社製
造）を用いてフィルター上に回収し、蒸留水で洗浄し培
地を除去する。The culture below polypeptone dextrin medium 400ml of transformants, 10 were inoculated to a ⁵ conidia / ml, the mycelium grown for 16 hours at 30 ° C., using a Falcon filter (Falcon production) filter Collect on top and wash with distilled water to remove medium.

［ポリペプトン・デキストリン培地］ デキストリン ２％ ポリペプトン 1.0％ KH₂PO₄ 0.5％ NaNO₃ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.05％ カザミノ酸 0.1％ pH 5.5〜6.0 水道水で調整 次いで、上記洗浄菌糸体を0.6M KClを含む0.1Mリン酸
バッハァー（pH5.5）で再び洗浄（除培地）し、水切り
したのち、該菌体をファルコンチューブ（ファルコン社
製造）に移し、これに上記KClを含むリン酸バッファー2
0mlを加え、更に細胞壁溶解酵素、バチラスサーキュラ
ンス起源の粗酵素と市販のキチナーゼをそれぞれ溶液1m
l当り30mg及び5mgとなるように加え、27℃で２時間、ゆ
るやかに振盪（毎分50〜60往復）して酵素処理し、菌体
の消化物を得た。Adjust [polypeptone dextrin medium] dextrin 2% polypeptone _{1.0% KH 2 PO 4 0.5%} NaNO 3 0.1% MgSO 4 · 7H 2 O 0.05% casamino acid 0.1% pH 5.5 to 6.0 tap water then the washed mycelium 0.6 After washing (removal of medium) again with 0.1 M phosphate buffer (pH 5.5) containing M KCl and draining the cells, the cells were transferred to a Falcon tube (manufactured by Falcon), and the above-mentioned phosphate buffer containing KCl was added thereto. Two
0 ml, and further add cell wall lytic enzyme, crude enzyme of Bacillus circulans origin and commercially available chitinase
The solution was added at 30 mg / l and 5 mg / l and subjected to an enzyme treatment at 27 ° C for 2 hours by gentle shaking (50-60 reciprocations per minute) to obtain digested cells.

この消化液を2,000r.p.m.で20分遠心分離し、沈澱物
と上澄液とに分離し、その上澄液を再度5,000r.p.m.で3
0分遠心分離し、得られた沈澱部を前記沈澱部と混ぜ
て、菌体を集めた。この集めた菌体を再度0.6M KClバッ
ファーで２回洗浄した。This digested liquid was centrifuged at 2,000 rpm for 20 minutes to separate a precipitate and a supernatant, and the supernatant was again centrifuged at 5,000 rpm for 3 minutes.
The mixture was centrifuged for 0 minutes, and the obtained precipitate was mixed with the precipitate to collect cells. The collected cells were washed twice with 0.6M KCl buffer again.

プロトプラスト及び細胞の破壊と、細胞内のDNA、RNA及
び蛋白質の溶出 洗浄菌体に、滅菌後、65℃に保温した下記バッファー
A10mlを加え、65℃で１時間振盪し、プロトプラスト及
び細胞の破壊と、細胞内のDNA、RNA及び蛋白質の溶出を
行う。Destruction of protoplasts and cells and elution of intracellular DNA, RNA, and proteins The following buffer, which was sterilized into washed cells and kept at 65 ° C
A10 ml is added and shaken at 65 ° C. for 1 hour to destroy protoplasts and cells and elute DNA, RNA and proteins in the cells.

［バッファーＡ］ トリスヒドロキシアミノメタン 50mM NaCl 0.15M EDTA 100mM SDS ２％ pH 7.5 次に、プロティナーゼＫ（ベーリンガー・マンハイム
社製）を溶解した下記TEバッファー（10mg/ml）を5ml添
加し、37℃で１夜保持し、蛋白質の分解を行う。[Buffer A] Trishydroxyaminomethane 50 mM NaCl 0.15 M EDTA 100 mM SDS 2% pH 7.5 Next, 5 ml of the following TE buffer (10 mg / ml) in which proteinase K (manufactured by Boehringer Mannheim) was dissolved was added, and the mixture was added at 37 ° C. Hold overnight for protein degradation.

［TEバッファー］ トリス/HCl 10mM EDTA 1mM pH 7.6 プロティナーゼ処理液に冷フェノール10mlを加え、5,
000r.p.m.で30分遠心分離し、その水相部を分取する。
この水相部にフェノール、クロロホルム1:1の混和液10m
lを加え、5,000r.p.m.で30分遠心分離し、水相部（上
部）を分取する。得られた水相部にクロホルム、イソア
ミルアルコール24:1の混和液10mlを加え、5,000r.p.m.
で30分遠心分離し、水相部を分取する。得られた水相部
にジエチルエーテル10mlを加え、氷温下で、5,000r.p.
m.で５分遠心分離し、水相部を分取する。得られた水相
部を湯せんで55〜60℃に数分保持し、該水相部の表面に
わずかに浮遊するジエチルエーテルを蒸発させて取除
き、除蛋白された高分子物質溶液を得る。[TE buffer] Tris / HCl 10 mM EDTA 1 mM pH 7.6 Add 10 ml of cold phenol to the proteinase-treated solution,
Centrifuge at 000 rpm for 30 minutes, and separate the aqueous phase.
Phenol, chloroform 1: 1 mixed solution 10m in this aqueous phase
Add l and centrifuge at 5,000 rpm for 30 minutes to separate the aqueous phase (upper part). To the obtained aqueous phase, chloroform, isoamyl alcohol 24: 1 10 ml of a mixed solution was added, and 5,000 rpm
And centrifuge for 30 minutes to separate the aqueous phase. 10 ml of diethyl ether was added to the obtained aqueous phase, and under ice temperature, 5,000 rp
Centrifuge at m. for 5 minutes to separate the aqueous phase. The obtained aqueous phase is kept in a water bath at 55-60 ° C. for several minutes, and diethyl ether slightly floating on the surface of the aqueous phase is removed by evaporation to obtain a deproteinized polymer solution.

この高分子物質溶液に50％PEG、2M NaClの溶液10mlを
加え、氷温下（氷中）で２時間保持し糖類は溶液側に移
行させ、RNA及びDNA等の高分子物質は沈澱させる。その
沈澱物をとり出すために、10,000r.p.m.で30分遠心分離
し、沈澱物を回収する。10 ml of a 50% PEG, 2M NaCl solution is added to this polymer solution, and the solution is kept at an ice temperature (in ice) for 2 hours to transfer saccharides to the solution side and precipitate polymer materials such as RNA and DNA. To remove the precipitate, centrifuge at 10,000 rpm for 30 minutes and collect the precipitate.

この沈澱物を冷（−20℃）95％エタノールで洗浄し、
PEGを充分に除き、次いでエタノールを吸引により蒸発
し、取り除く。The precipitate was washed with cold (-20 ° C) 95% ethanol,
The PEG is thoroughly removed and the ethanol is evaporated off by suction and removed.

そして、得られた沈澱物をTEバッファー（10mMトリス
/HCl、1mM EDTA、pH7.6）5mlに溶解し、RNase溶液（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）5mgを添加し、37℃で１
夜保持してRNAを分解する。Then, the obtained precipitate is subjected to TE buffer (10 mM Tris
/ HCl, 1mM EDTA, pH7.6) in 5 ml, add 5 mg of RNase solution (Boehringer Mannheim), and add
Hold at night to degrade RNA.

上記保持液に冷フェノール5mlを加えて、10,000r.p.
m.で20分遠心分離し、水相部を回収する。5 ml of cold phenol was added to the above retentate, and 10,000 rp
Centrifuge at m. for 20 minutes to collect the aqueous phase.

上記処理物に、冷（−20℃）エタノールを加え、−80
℃で30分以上保持して、DNAを沈澱させ、この沈澱物を1
0,000r.p.m.で30分遠心分離して、精製されたDNAを得
る。Cold (−20 ° C.) ethanol was added to the treated product,
C. for more than 30 minutes to precipitate the DNA, and
Centrifuge at 0,000 rpm for 30 minutes to obtain purified DNA.

この精製DNAを前記TEバッファー1mlに溶解してpSal 4
3の形質転換体から得たDNAを調製した。This purified DNA was dissolved in 1 ml of the TE buffer and pSal 4
DNA obtained from 3 transformants was prepared.

サザントランスファー及びハイブリッド形成 この方法は、サザーン「ジャーナル・モレキュラー・
バイオロジー〔Southern,J.Mol.Biol.,98,503（197
5）〕に記載されている方法に準じて行なわれる。Southern Transfer and Hybridization This method is based on Southern "Journal Molecular.
Biology [Southern, J. Mol. Biol., 98 , 503 (197
5)].

即ち、pSal 43の形質転換体（Ａ・ソーヤKTR-3）から
得たDNAと、コントロールとして、上記と同様にして調
製された、Ａ・ソーヤATCC 4225及び親株（宿主株）の
Ａ・ソーヤW20-4（arg B^-）から得たDNAについて、それ
ぞれ制限酵素BamH I、EcoR I、又はSal Iで切断する。That is, DNA obtained from a transformant of pSal 43 (A. soya KTR-3) was used as a control, and A. soya ATCC 4225 prepared as described above and A. soya W20 of the parent strain (host strain) were prepared as described above. -4 (arg B ^-) for DNA obtained from each restriction enzyme BamH I, cut with EcoR I, or Sal I.

前記３株の切断DNAを平板状アガロース・ゲル電気的
に泳動する。条件は20ボルトで14時間である。The cut DNAs of the three strains are electrophoresed on a flat agarose gel. Conditions are 14 hours at 20 volts.

次いで、後述のハイブリッドを形成しやすくするため
に、上記泳動したゲルを0.25M HCl溶液に30分浸し、次
いでアルカリバッファー1.5M NaCl、0.5M NaOHで30分処
理し、アルカリ化（DNAを変性）する。Next, in order to facilitate the formation of a hybrid described later, the electrophoresed gel was immersed in a 0.25 M HCl solution for 30 minutes, and then treated with an alkaline buffer (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) for 30 minutes to alkalize (denature DNA). I do.

次いで、中和バッファー（3M NaCl、0.5MトリスHCl、
pH7.0）に30分浸す。Then, neutralization buffer (3M NaCl, 0.5M Tris HCl,
pH 7.0) for 30 minutes.

次いで、中和した平板ゲルの上に、ニトロセルロース
フィルターを重ね、１夜保持して泳動したDNAを移し得
る。A nitrocellulose filter can then be placed over the neutralized slab gel and held overnight to transfer the migrated DNA.

次いで、移し取ったニトロセルロース・フィルターを
乾燥する。Then, the transferred nitrocellulose filter is dried.

次いで、ビニール袋内で乾燥したニトロセルロース・
フィルターを放射性標識プラスミド（探針）（pBR322）
の溶液５μｌ及びハイブリダイゼーション・バッファー
2mlの混合液に浸し、シールして、42℃で１夜保持す
る。放射性標識プラスミドとしてpBR322を用いた理由は
以下の通りである。Next, nitrocellulose dried in a plastic bag
Filter the radioactively labeled plasmid (tip) (pBR322)
Solution and hybridization buffer
Dip in 2 ml of the mixture, seal and keep at 42 ° C. overnight. The reason for using pBR322 as the radiolabeled plasmid is as follows.

即ち、本発明の形質転換体の作成に用いたDNAベクタ
ーpSal 43における大腸菌由来のプラスミドベクター
は、pBR327であり、また該pBR327は、前記pBR322の塩基
対が、0.6kbだけ欠失した誘導体である。従ってpBR327
の塩基配列はpBR322のそれと一致している。それゆえ、
pBR322を放射性標識プラスミドとして用いれば、大腸菌
由来のプラスミドベクターpBR327遺伝子の組込が判る。That is, the Escherichia coli-derived plasmid vector in the DNA vector pSal 43 used for preparing the transformant of the present invention is pBR327, and the pBR327 is a derivative in which the base pair of the pBR322 is deleted by 0.6 kb. . Therefore pBR327
Has the same nucleotide sequence as that of pBR322. therefore,
When pBR322 is used as a radiolabeled plasmid, integration of the plasmid vector pBR327 gene derived from Escherichia coli can be determined.

次いで、NaCl及びクエン酸ソーダを含む溶液（SSC溶
液）でニトロセルロース・フィルターを洗浄する。Next, the nitrocellulose filter is washed with a solution containing NaCl and sodium citrate (SSC solution).

次いで、洗浄したニトロセルロース・フィルターをラ
ジオオートグラフィーで感光する。サザンハイブリダイ
ゼーションでは、ニトロセルロース・フィルターに少な
くともその一部が相同であるDNAがあると、そこに標識
したプラスミド・ベクターDNAが吸着され、ハイブリッ
ドが形成され、従ってそこに放射性のバンドが形成され
る。従って、一部でも塩基配列が相同する部分があれ
ば，そこにハイグリッドを形成してバンドができる。The washed nitrocellulose filter is then exposed by radioautography. In Southern hybridization, when a nitrocellulose filter contains DNA that is at least partially homologous, the labeled plasmid vector DNA is adsorbed and hybrids are formed, thus forming a radioactive band there. . Therefore, if there is any part having a homologous nucleotide sequence, a high grid is formed there to form a band.

Ａ・ソーヤATCC 42251及びＡ・ソーヤW20-4（arg
B^-）はハイブリッド形成したバンドを示さなかった。A. Sawyer ATCC 42251 and A. Sawyer W20-4 (arg
B ^-) did not show a band hybridized.

これに対し、形質転換体（Ａ・ソーヤKTR-3）は分離
したバンドを呈し、同じ座における異なる組込み、また
はゲノムの異なるサイドにおける組込みが示された。In contrast, the transformant (A. soya KTR-3) exhibited a separate band, indicating different integrations at the same locus or on different sides of the genome.

以上は、Ａ・ソーヤの任意の菌株、アルギニン要求性
変異株（Ａ・ソーヤW20-4）及び形質転換体（Ａ・ソー
ヤKTR-3）の、大腸菌由来のプラスミドベクターpBR322
に関してサザンハイブリダイゼーションの結果である。The above is the plasmid vector pBR322 derived from Escherichia coli of any strain of A. soya, an arginine-requiring mutant (A. soya W20-4) and a transformant (A. soya KTR-3).
Is the result of Southern hybridization.

同様にして、今度は上記放射性標識プラスミドpBR322
に代えて放射性標識プラスミドpSal 43についても調べ
た。Similarly, this time the radiolabeled plasmid pBR322
Instead, the radiolabeled plasmid pSal 43 was also examined.

即ちpSal 43の形質転換体（Ａ・ソーヤKTR-3）から得
たDNAと、コントロールとして、上記と同様に調製して
得たＡ・ソーヤATCC 42251及び親株のＡ・ソーヤW20-4
から得たDNAについて、上記と同様にサザンハイブリダ
イゼーションを行った。That is, DNA obtained from a transformant of pSal 43 (A. soya KTR-3), as controls, A. soya ATCC 42251 prepared as described above and A. soya W20-4 of the parent strain
Was subjected to Southern hybridization in the same manner as described above.

即ち、これらの株のSal I消化DNAを処理し、pSal 43
をBamH Iを用いて１箇所で切断したものを放射性標識プ
ラスミドとして調べた。Ａ・ソーヤATCC 42251はハイブ
リッドを形成したバンドを示し、arg B⁺遺伝子と相同な
Sal Iフラグメントを有することが判明した。洗浄状態
で、Ａ・ソーヤW20-4はハイブリッドを形成したバンド
を示さなかった。これに対しpSal 43の形質転換体（Ａ
・ソーヤKTR-3）は分離したバンドを呈し、同じ座にお
ける異なる組込み、またはゲノムの異なるサイドにおけ
る組込みがされたことが判明した。That is, SalI digested DNA from these strains was treated and pSal43
Was cut at one site using BamHI and examined as a radiolabeled plasmid. A. soya ATCC 42251 shows a hybridized band, homologous to the argB ⁺ gene.
It was found to have a Sal I fragment. In the washed state, A. soya W20-4 did not show any hybridized bands. On the other hand, the transformant of pSal 43 (A
-Sawyer KTR-3) exhibited a separate band, indicating different integrations at the same locus or at different sides of the genome.

一方、上記と同様にpSal 23を用いて得られた形質転
換体も放射性標識プラスミドpBR322とハイブリッドを形
成し、該pSal 23を調製する際用いたベクターpBR327遺
伝子の取込みを示す。On the other hand, the transformant obtained using pSal23 in the same manner as described above also forms a hybrid with the radiolabeled plasmid pBR322, and shows the uptake of the vector pBR327 gene used in preparing the pSal23.

従ってＡ・ソーヤW20-4株はＡ・ニドランスarg B⁺遺
伝子で形質転換される。即ちこの遺伝子はＡ・ソーヤに
おいても発現される。ベクターpBR327もarg B⁺遺伝子と
ともに、これらの形質転換体に組込まれ、従って外来性
DNAをＡ・ソーヤに形質転換する方法が提供される。Thus, A. soya strain W20-4 is transformed with the A. nidulans argB ⁺ gene. That is, this gene is also expressed in A. soya. The vector pBR327, along with the argB ⁺ gene, has also been integrated into these transformants and is therefore exogenous
Methods for transforming DNA into A. soya are provided.

実施例３ 前記の如く調製した形質転換された株の表現型の安定
性を調べた。形質転換体を、最小培地から完全培地上に
接種し、30℃で４日培養した。培養物の胞子を取り出
し、再び完全培地に接種し上記と同様に培養した。これ
を合計30回繰り返した。この最終の分生子をコロニーか
らとり出し、適当に希釈し、最小培地＋10mMアルギニン
上で30℃で平板培養する。３日後、コロニーを最小培地
および最小培地＋アルギニン上でレプリカ平板培養す
る。１つの形質転換体から試験した100コロニーのう
ち、全てが原栄養体（アルギニンを要求しない）であ
り、形質転換された表現型が、ゲノムに組込まれるあら
ゆる遺伝子に関して予期される如く、この増殖期間中完
全に安定である。即ち、形質転換されたarg B⁺遺伝子が
もともとゲノムにあった麹菌本来の遺伝子と同じよう
に、組込まれた遺伝子も完全に安定であった。Example 3 The phenotypic stability of the transformed strain prepared as described above was examined. Transformants were inoculated from minimal medium onto complete medium and cultured at 30 ° C. for 4 days. The spores of the culture were removed, inoculated again into a complete medium, and cultured as described above. This was repeated 30 times in total. The final conidia are removed from the colonies, appropriately diluted and plated at 30 ° C. on minimal medium + 10 mM arginine. After 3 days, colonies are replica plated on minimal media and minimal media plus arginine. Of the 100 colonies tested from one transformant, all are prototrophy (not requiring arginine) and the transformed phenotype is expected to increase during this growth period as expected for any gene integrated into the genome. Inside is completely stable. That is, the integrated gene was completely stable, just like the original gene of Aspergillus oryzae in which the transformed argB ⁺ gene was originally in the genome.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１図はDNAベクターpSal 43及び同pSal 23の構築法を
示す図である。図中、pBB29及びpSal 43における斜線部
は酵母由来のDNAフラグメントを意味し、（イ）及び
（ロ）はＡ・ニドランス由来のarg B⁺遺伝子を含有する
フラグメントを意味する。FIG. 1 is a diagram showing a method for constructing DNA vectors pSal43 and pSal23. In the figure, the hatched portions in pBB29 and pSal43 indicate DNA fragments derived from yeast, and (a) and (b) indicate fragments containing the argB ⁺ gene derived from A. nidulans.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−162168（ＪＰ，Ａ) Ａｇｖｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．51 （９）（1987）ｐ．2549−2555 Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｎｏｎ．Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ．54（６）（1988）ｐ．1610 −1611 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (56) References JP-A-61-162168 (JP, A) Agvic. Biol. Chem. 51 (9) (1987) p. 2549-2555 Appl. Envinon. Microbiol. 54 (6) (1988) p. 1610 -1611

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】所定の選択マーカー遺伝子が欠損したアス
ペルギルス・ソーヤ株のプロトプラスト化した細胞を、
前記所定の選択マーカーのDNA配列を含有する環状又は
線状のDNAベクターで形質転換して得られる所定の選択
マーカーDNAを含むアスペルギルス・ソーヤKTR-3。1. A protoplast-forming cell of an Aspergillus soya strain deficient in a predetermined selectable marker gene,
An Aspergillus soya KTR-3 containing a predetermined selectable marker DNA obtained by transforming with a circular or linear DNA vector containing the predetermined selectable marker DNA sequence. 【請求項２】所定の選択マーカー遺伝子が欠損したアス
ペルギルス・ソーヤ株が野性型アスペルギルス・ソーヤ
の突然変異株である請求項１記載のアスペルギルス・ソ
ーヤKTR-3。2. The Aspergillus soya KTR-3 according to claim 1, wherein the Aspergillus soya strain deficient in the predetermined selectable marker gene is a wild-type Aspergillus soya mutant. 【請求項３】所定の選択マーカーのDNAが、野性型アス
ペルギルス属微生物由来のものである請求項１記載のア
スペルギルス・ソーヤKTR-3。3. The Aspergillus soya KTR-3 according to claim 1, wherein the DNA of the predetermined selection marker is derived from a wild-type Aspergillus microorganism. 【請求項４】所定の選択マーカー遺伝子が、オルニチン
カルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子（arg B⁺）であ
る請求項１又は２記載のアスペルギルス・ソーヤKTR-34. The Aspergillus soya KTR-3 according to claim 1 or 2, wherein the predetermined selectable marker gene is an ornithine carbamoyltransferase gene (arg B ⁺ ). 【請求項５】DNAベクターが、選択マーカーDNAとして、
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を含
む請求項１記載のアスペルギルス・ソーヤKTR-3。5. The method according to claim 5, wherein the DNA vector is selected from the group consisting of:
2. The Aspergillus soya KTR-3 according to claim 1, comprising an ornithine carbamoyltransferase gene. 【請求項６】所定の選択マーカーのDNAが、オルニチン
カルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子（arg B⁺）を含
む請求項１又は３記載のアスペルギルス・ソーヤKTR-
3。6. The Aspergillus soya KTR- according to claim 1 or 3, wherein the DNA of the predetermined selection marker contains an ornithine carbamoyltransferase gene (argB ⁺ ).
3. 【請求項７】オルニチンカルバモイルトランスフェラー
ゼ遺伝子が、アスペルギルス・ソーヤまたはアスペルギ
ルス・ニドランス由来のものである請求項５記載のアス
ペルギルス・ソーヤKRT-3。7. The Aspergillus soya KRT-3 according to claim 5, wherein the ornithine carbamoyltransferase gene is derived from Aspergillus soya or Aspergillus nidulans.