JP3968618B2

JP3968618B2 - Inducible promoter, inducible expression vector, and use thereof that can be used in Schizosaccharomyces pombe

Info

Publication number: JP3968618B2
Application number: JP30677398A
Authority: JP
Inventors: 英毅東田; 祐子浜; 博道熊谷
Original assignee: Asahi Glass Co Ltd
Current assignee: AGC Inc
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1998-10-28
Publication date: 2007-08-29
Anticipated expiration: 2018-10-28
Also published as: JPH11192094A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、***酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）で使用可能な誘導プロモータ、誘導発現ベクター、およびそれらを用いたタンパク質の生産方法に関し、特に***酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼプロモータを用いることによって特定の栄養源の有無による遺伝子発現制御を行い、目的タンパク質の生産時期を制御可能とするタンパク質の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
***酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe）は真核生物でありながら遺伝学、分子生物学、細胞生物学分野での応用がきわめて容易な単細胞生物として広く研究されている（Nasim A. et al. eds., Molecular biology of the fission yeast, Academic Press, 1989）。その培養には炭素源としてブドウ糖（グルコース）や果糖（フルクトース）等の単糖が主に用いられる。培地中にこれら単糖が存在しない場合、ショ糖（スクロース）をブドウ糖と果糖に分解する酵素であるインベルターゼの発現が誘導され、生育に必要な炭素源を獲得することが知られている（Moreno S. et al., Arch. Microbiol. 142, 370, 1985）。
【０００３】
***酵母シゾサッカロミセス・ポンベにおいて、インベルターゼは細胞表層に存在しており、分子量２０５０００の高分子量糖タンパク質である。その６７％が糖鎖であり、等モルのマンノース残基とガラクトース残基から成り立っている。精製酵素のタンパク質分子量やアミノ酸組成および抗体を用いた実験から、***酵母シゾサッカロミセス・ポンベ由来のインベルターゼは出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のインベルターゼとタンパク質化学的にも非常に類似していることが知られている（Moreno S. et al., Biochem. J. 267,697,1990）。またグルコース濃度の低下によりインベルターゼの合成抑制が解除されることも知られている（Mitchison J. et al., Cell Sci 5,373,1969）。
【０００４】
出芽酵母サッカロミセス・セレビシエにおいても同様に、固有のインベルターゼの誘導生産現象（脱抑制）が知られている。その発現における遺伝子レベルでの制御、生合成経路、糖鎖部分の構造解析等に関する研究はすでに詳細に行われている。すなわち、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのインベルターゼ遺伝子は染色体上に６個重複しており、ＳＵＣ１〜ＳＵＣ５およびＳＵＣ７という遺伝子によってコードされている。このうちの１つでも活性なＳＵＣ遺伝子を持てばスクロースとラフィノースの資化性を示すことがわかっている（Hohmann S. et al., Curr Genet 11, 217, 1986 ）。
【０００５】
これに対し***酵母シゾサッカロミセス・ポンベでは、インベルターゼタンパク質の精製については報告されているが（Moreno S. et al., 1985）、その遺伝子に関しては本発明者らのグループの研究によって最近になってようやく明らかになった。すなわち、***酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼ遺伝子は染色体上に２個重複しており、ｉｎｖ０⁺およびｉｎｖ１⁺として同定されている。このうちｉｎｖ０⁺はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）が不完全で偽遺伝子であると推定された。よって唯一ｉｎｖ１⁺が***酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼをコードする遺伝子である。***酵母シゾサッカロミセス・ポンベはショ糖を唯一の炭素源として生育することが知られており（橋谷義孝編、「酵母学」、岩波書店、1967）、本インベルターゼによってショ糖の資化性を示すことが推定できる。
【０００６】
単離された遺伝子のプロモーター領域の解析がなされた結果、１ｂｐから６２０ｂｐの間にある特別な配列がカタボライト抑制に関与していることが推定された。
【０００７】
出芽酵母サッカロミセス・セレビシエではＳＵＣ２遺伝子から転写開始点が異なる２種類のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が転写されることが知られている。短い方のｍＲＮＡは構成的な転写であり、細胞内インベルターゼを発現している。長い方のｍＲＮＡは分泌型インベルターゼをコードしており、その発現はカタボライト抑制を受け、その脱抑制比は２００倍以上である（Carlson M. et al. 、Mol. Cell. Biol. 3、439 、1983）。長い方のｍＲＮＡに対するプロモーター領域の解析がなされた結果、−６５０ｂｐから−４１８ｂｐの間にある特別な繰り返し配列に転写制御因子が結合していると考えられている（Salokin L et al.、Mol. Cell. Biol. 6、2314、1986）。また、−４１８位から−１４０位までの領域がグルコース抑制に必要とされる領域であることがわかっている。
【０００８】
これらの領域とｉｎｖ１⁺遺伝子の上流領域１位から２８０９位までの領域を比較したところ有意な相同性は認められなかった。しかしグルコース抑制解除に必要とされる領域の中には７ｂｐモチーフと呼ばれる（Ａ／Ｃ）（Ａ／Ｇ）ＧＡＡＡＴの塩基配列の繰り返し配列が５箇所確認されており、７ｂｐモチーフがｉｎｖ１⁺遺伝子の上流領域にも多数存在していることが明らかとなった。その上グルコース抑制により制御される遺伝子（ＳＵＣ、ＭＡＬ、ＧＡＬ）の上流領域にはステム・アンド・ループ構造と類似したパリンドローム構造が同じような位置に存在していることが確認されている。シゾサッカロミセス・ポンベにおいてｉｎｖ１⁺遺伝子の上流領域においてもパリンドローム構造を形成する領域が認められた。これらの配列は***酵母シゾサッカロミセス・ポンベにおけるグルコース抑制に重要な役割を果たしていると考えられた。
【０００９】
***酵母シゾサッカロミセス・ポンベは出芽酵母サッカロミセス・セレビシエとは進化系統的に全く異なる酵母である。すでに、染色体構造、ゲノム複製機構、ＲＮＡスプライシング機構、転写機構、翻訳後修飾等の諸機構が他の酵母と大きく異なり、その一部は動物細胞と類似していることが知られている。このため真核生物のモデルとして広く用いられている（Giga-Hama and Kumagai, eds., Foreign gene expression in fission yeast Schizosaccharomyces pombe, Springer-Verlag, 1997）。
【００１０】
***酵母シゾサッカロミセス・ポンベは異種タンパク質遺伝子発現の宿主としても広く用いられており、特にヒトを含む動物細胞由来の遺伝子の発現に適していることが知られている（特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、ＷＯ９６／２３８９０）。またゴルジ体や小胞体を含む膜構造の発達が知られており、このことから膜タンパク質の発現にも用いられ、高い発現量を示している。発現ベクターとしては通常構成発現ベクター（ｐＥＶＰ１１、ｐＡＲＴ１、ｐＴＬ２Ｍ）あるいはｎｍｔ１⁺遺伝子のプロモータ領域を用いた誘導発現ベクター（ｐＲＥＰ１）が用いられている。出芽酵母サッカロミセス・セレビシエで汎用されるＧＡＬタイプあるいはＳＵＣ２タイプのものは知られていない。
【００１１】
***酵母シゾサッカロミセス・ポンベにおいて出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのＳＵＣ２遺伝子を発現させた場合、宿主に依存してガラクトース残基が含まれるが、カタボライト抑制を受けずに構成的な発現がなされることが知られている（Zarate, V. et al., J Applied Bacteriology, 80,45,1996）。このことから、***酵母シゾサッカロミセス・ポンベと出芽酵母サッカロミセス・セレビシエとでは、インベルターゼのカタボライト抑制のメカニズムが異なっている可能性がある。このことは重大な意味を含む。すなわち、***酵母シゾサッカロミセス・ポンベでインベルターゼ（ＳＵＣ２）型の誘導発現ベクターを作製する場合、通常当該業者が行う方法である出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのプロモータの流用は、***酵母シゾサッカロミセス・ポンベでは行うことができない。このため、長らくこのようなタイプのベクターの開発は遅れていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、新たに***酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼ遺伝子のクローニングを行い、誘導発現ベクターを構築することによって本発明を完成させた。
【００１３】
本発明は、***酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼ遺伝子中のカタボライト抑制に関与している遺伝子領域、この遺伝子領域を利用した誘導発現ベクター、これを用いた外来遺伝子発現システム等に関する、下記の発明である。
【００１４】
配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡ。
【００１５】
上記ＤＮＡの配列を含む組換えベクター。
【００１６】
配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第６２０番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列および塩基番号第１６１０番〜第２６１０番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列を含む組換えベクター。
【００１７】
配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列とマルチクローニングサイトとを含む、または、配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第６２０番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列および塩基番号第１６１０番〜第２６１０番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列とマルチクローニングサイトとを含む、マルチクローニングベクター。
【００１８】
配列表の配列番号２の塩基配列で表されるマルチクローニングベクター。
【００１９】
配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列と異種タンパク質構造遺伝子とを含む、または、配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第６２０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列および塩基番号第１６１０番〜第２６１０番の塩基配列で表されるＤＮＡの配列と異種タンパク質構造遺伝子とを含む、***酵母シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換用の発現ベクター。
【００２０】
上記発現ベクターを含む、***酵母シゾサッカロミセス・ポンベからなる形質転換体。
【００２１】
上記形質転換体を培養し、発現された異種タンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の生産方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明者らはまず、従来その遺伝子レベルでの実体が不明であった***酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（以下、「S. pombe」と記す）のインベルターゼ遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。遺伝子破壊法によりインベルターゼ遺伝子が１種ですべての活性を担っていることを明らかにした。さらにカタボライト抑制に関与している遺伝子領域の検討をし、この領域を用いて誘導発現ベクターを作製した。実際に緑色螢光タンパク質遺伝子を組込んだ組換えベクターを作製し、これを用いて S. pombe を形質転換した。タンパク質の発現を活性並びに免疫学的手法によって確認した。さらに培地中のグルコースによって発現が抑制され、グルコースが消費されることによって外来遺伝子の発現が脱抑制されることを見出した。
【００２３】
本発明者らは、具体的には以下に示す方法で S. pombe のインベルターゼの前駆体遺伝子を見出し、その構造を決定した。
（１）S. pombe のｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、他生物種起源のインベルターゼ遺伝子に良く保存されたアミノ酸配列から作製したプライマーに用いてＰＣＲ反応を行う。
（２）得られたＰＣＲ産物をプローブとして S. pombe のゲノムライブラリーからプラークハイブリダイゼーション法によりポジティブクローンを選別する。
（３）ポジティブクローンを制限酵素で消化して電気泳動パターンを確認する。
（４）確認されたポジティブクローンからサザンハイブリダイゼーション法を用いて特定長のフラグメントを選別し、全塩基配列を決定する。
（５）遺伝子破壊法を用いてインベルターゼ活性の有無を調べる。
（６）S. pombe のインベルターゼ遺伝子における至適ｐＨ、グルコース抑制、および脱抑制に対するグルコース濃度の影響について測定する。
（７）グルコース抑制に関与している上流領域をサブクローニングし、必要領域を決定する。
【００２４】
さらに本発明者らは、次に示す方法で、S. pombe のインベルターゼの誘導発現ベクターを作製し、具体例として緑色螢光タンパク質の誘導発現を確認した。
（１）S. pombe 用マルチクローニングベクターｐＴＬ２Ｍ（特開平７−１６３３７３号公報参照）を改変して、インベルターゼプロモータを用いた誘導発現マルチクローニングベクターｐＲＩ０Ｍを作製する。
（２）誘導発現マルチクローニングベクターｐＲＩ０Ｍをもとに緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰを作製する。
（３）緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰを用いて S. pombe 野生株を形質転換する。
（４）緑色螢光タンパク質変異体の発現を活性（螢光）並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ・ウエスタンブロッティングを用いて確認する。
（５）培地中のグルコース濃度と発現の相関から、誘導発現の条件を決定する。
【００２５】
配列表の配列番号１はカタボライト抑制に関与している遺伝子領域を含むインベルターゼ前駆体遺伝子の塩基配列である。カタボライト抑制に関与している遺伝子領域は、塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡ部分ないしその内部のＤＮＡ部分にある。すなわち、実施例６や図８の解析の結果が示すように、塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡ部分中で特に重要な領域は塩基番号第１番から第６２０番までの配列部分、および第１６１０番から第２６１０番までの配列部分である（なお、図８は配列表１の第２８１０番を第１番として位置を表記）。したがって、本発明における誘導プロモータとしては、これらのカタボライト抑制に関与している遺伝子を含んで誘導プロモータとして機能する限り、塩基番号第１番〜第２８０９番の全塩基配列で表されるＤＮＡに限られるものではない。しかし、現実に S. pombe で機能していることより、誘導プロモータとしては塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡが好ましい。
【００２６】
上記のようにカタボライト抑制に関与している遺伝子を含んで誘導プロモータとして機能するＤＮＡ、特に好ましくは塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡ、を以下誘導プロモータ遺伝子という。この誘導プロモータ遺伝子をベクターに組み込んでマルチクローニングベクターや発現ベクターなどの組換えベクターを構築することができる。マルチクローニングベクターはマルチクローニングサイトを有するベクターであり、マルチクローニングサイトに所望の構造遺伝子を導入することにより発現ベクターを構築することができる。発現ベクターは構造遺伝子を有するベクターであり、構造遺伝子でコードされた異種タンパク質の発現用に用いられる。「異種」タンパク質とは宿主が本来有していないタンパク質であり、宿主が S. pombe の場合、S. pombe が本来有していないタンパク質（例えばヒトタンパク質）である。
【００２７】
発現ベクターにおいて、誘導プロモータ遺伝子は異種タンパク質構造遺伝子の上流部に位置しその構造遺伝子の発現を制御する。配列番号１で表される塩基配列において、誘導プロモータ遺伝子がインベルターゼ前駆体の構造遺伝子の上流部にあってその発現を制御しているように、発現ベクターにおいて誘導プロモータ遺伝子はその下流に位置する異種タンパク質構造遺伝子の発現を制御する。マルチクローニングベクターにおいても、マルチクローニングサイトに異種タンパク質構造遺伝子が導入されることより、誘導プロモータ遺伝子はマルチクローニングサイトの上流部に位置する。
【００２８】
本発明マルチクローニングベクターの例として、図９に実施例で構築したマルチクローニングベクターｐＲＩ０Ｍのベクター構築図を示す。またこのｐＲＩ０Ｍの全塩基配列を配列番号２に示す。Ｉｎｖ１−Ｐが上記誘導プロモータ遺伝子部分、ＭＣＳがマルチクローニングサイトである。本発明発現ベクターの１例として、図１０に実施例で構築した緑色蛍光タンパク質変異体構造遺伝子（ＥＧＦＰ−ＯＲＦ）導入した緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰのベクター構築図を示す。またこの発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰの全塩基配列を配列番号１３に示す。
【００２９】
本発明における誘導プロモータ遺伝子が S. pombe が有する誘導プロモータ遺伝子であることより、本発明発現ベクターで形質転換される細胞（宿主）としては S. pombe が最適である。
【００３０】
上記本発明の発現ベクターで形質転換された S. pombe をカタボライト抑制条件下で（例えばグルコース濃度の高い培養液中で）培養することにより異種タンパク質を発現することなく（あるいは少ない発現量で）S. pombe を増殖させることができる。この過程では、異種タンパク質の発現という負荷がないことより負荷がある場合に比較して増殖の効率が高い。次に、カタボライト抑制を解除した条件下で（例えばグルコースがないあるいはグルコース濃度の低い培養液中で）S. pombe を培養することにより、カタボライト抑制条件下に比較して S. pombe の増殖量は少なくなるが、S. pombe の細胞量が多いことより多量の異種タンパク質が発現する。このように S. pombe の増殖と異種タンパク質の発現をカタボライト抑制の制御によって制御することにより、より効率的に異種タンパク質の生産を行うことができる。
【００３１】
カタボライト抑制の制御は上記のような積極的制御はもちろん、消極的な制御を行うこともできる。例えば、ある所定量のグルコースを含む培養液中で形質転換された S. pombe を培養することにより、培養初期ではグルコース量が多いことよりカタボライト抑制下で S. pombe の増殖が進行し、培養後期ではグルコースが消費されてその量が少なくなることによりカタボライト抑制が解除され異種タンパク質の産生が進行する。このように積極的にグルコース量を制御することなくしても従来に比較して効率的に異種タンパク質の生産を行うことができる。
【００３２】
【実施例】
以下に本発明を具体的な実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３３】
［実施例１］
S. pombe のインベルターゼ遺伝子の単離
S. pombeのｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、他生物種起源のインベルターゼ遺伝子間で良く保存された配列部分をもとに設計した配列表の配列番号３〜５に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、３００ｂｐおよび４００ｂｐの近傍に増幅されたバンドが得られた。それぞれのＰＣＲ産物をＥＡＳＹＴＲＡＰ（宝酒造（株）製）を用いて精製した。ｐＭＯＳＢｌｕｅＴベクターキット(アマシャムファルマシアバイオテク社製)を用いて得られたＰＣＲ産物をベクターに組み込み、塩基配列の決定を行った。その結果、４００ｂｐのＰＣＲ産物をアミノ酸に変換した部分アミノ酸配列が出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのＳＵＣ２遺伝子と高い相同性を示した。
【００３４】
この４００ｂｐのＰＣＲ産物をプローブとして S. pombe のゲノムＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼーション法により全インベルターゼ遺伝子を含むポジティブクローンの取得を試みた。その結果、約８０００のプラークから１５個のポジティブクローンが取得された。このポジティブクローンの２次スクリーニングを行うため、再びプラークハイブリダイゼーションを行った。その結果、４個のポジティブクローンが得られた。ポジティブクローンのファージＤＮＡを少量抽出し、種々の制限酵素で処理して切断パターンを比較したところすべて同一であった。よって、取得されたポジティブクローンは１種類であることがわかった。
【００３５】
インベルターゼ遺伝子の全長は、次の二段階の方法で取得した。ハイブリッドを形成した３．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ消化フラグメントを単離し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−（東洋紡（株）製）に組み込んだ。制限酵素地図を作成したところ、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩの制限酵素部位が確認された。そこでこれらの制限酵素を用いてサブクローニングを行い、加えてディレーションを併用して塩基配列の決定を行った。その結果、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに遺伝子のＯＲＦをすべて含むことがわかった。しかし遺伝子発現に関与すると思われる上流領域は約２００ｂｐしか含まなかった。そのため新たに、ハイブリッドを形成した３．５ｋｂのＢａｍＨＩ消化フラグメントをさらにＨｉｎｄＩＩＩ消化によって２．６ｋｂのフラグメントとして単離し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−に組み込み、同様にサブクローニングとディレーションにより塩基配列を決定した。その結果、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントには遺伝子発現に関与する上流配列と思われる領域が含まれていることがわかった。得られた全長５．６ｋｂの遺伝子をｉｎｖ１⁺遺伝子と名付けた。その塩基配列およびＯＲＦのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。この結果、ｉｎｖ１⁺遺伝子にはアスパラギン結合型糖鎖付加部位が１６箇所存在していることがわかった。また、S. pombe のｉｎｖ１⁺遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列、シュワニオミセス・オキシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）のインベルターゼのアミノ酸配列、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのＳＵＣ２遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列間の比較を図１に示す。アスタリスク（＊）で３種間で共通のアミノ酸を示す。図１から明らかなように、ｉｎｖ１⁺遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列は、他生物種起源のインベルターゼであるシュワニオミセス・オシデンタリス由来のものや出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ由来のものと高い相同性を示すことがわかった。このことから、ｉｎｖ１⁺遺伝子はインベルターゼをコードするものであると推定された。
【００３６】
［実施例２］
ｉｎｖ１⁺遺伝子配列の破壊
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−の制限酵素ＣｌａＩ認識部位に S. pombe 由来ｕｒａ４⁺遺伝子を組み込んだプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、末端平滑化の後セルフライゲーション（自己環状化）させてＨｉｎｄＩＩＩサイトを破壊した。このプラスミドを制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｃＩＩで二重消化してｕｒａ４⁺フラグメントを取得した。次にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−を制限酵素ＳｐｅＩで消化して末端平滑化し、さらに制限酵素ＸｂａＩで消化したベクターに上述のｕｒａ４⁺フラグメントを組み込み、制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位をｕｒａ４⁺の両側に配置したプラスミドを作製した。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−の制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位も上述のように制限酵素処理、末端平滑化、セルフライゲーションにより破壊し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にｉｎｖ１⁺遺伝子のＯＲＦ領域を含む３．０ｋｂのフラグメントを組み込んだ。このプラスミドをＢａｍＨＩで消化して挿入フラグメント中の１．４ｋｂのフラグメント（ｉｎｖ１⁺のＯＲＦのＣ末端側領域を含む）を除き、両側にＢａｍＨＩサイトを持つｕｒａ４⁺遺伝子を組み込んだ。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化して両端にｉｎｖ１⁺遺伝子の近傍の領域を含むＤＮＡフラグメントを取得した（図２）。図２はｉｎｖ１⁺遺伝子の制限酵素地図を示し、ｉｎｖ１⁺遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を矢印（ｉｎｖ１⁺ＯＲＦ）、置換したシゾサッカロミセス・ポンベｕｒａ４⁺遺伝子を長方形（ｕｒａ４⁺）で示した。ＯＲＦを含んだｉｎｖ１⁺の１．４ＫｂＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、S. pombe ｕｒａ４⁺遺伝子に置き換えられていることにより、破壊株ができた。
【００３７】
このフラグメントで S. pombe の野生株ＴＰ４−１Ｄ〔ｈ^-、ｌｅｕ１、ｕｒａ４、ａｄｅ６−Ｍ２１６、ｈｉｓ２、登田隆博士（Imperial Cancer Research Foundation）より供与〕を形質転換してウラシル無添加の培地に生育してきたコロニーを得た。オーバーレイアッセイによりインベルターゼ活性について検討したところ、活性の消失した株は２８株中７株存在していた。すなわち得られたｕｒａ４⁺コロニーの中でインベルターゼ活性の消失した株は２５％であった。
【００３８】
さらに染色体上のｉｎｖ１⁺遺伝子の破壊をサザンハイブリダイゼーションによって確認した。インベルターゼ活性の消失した株からゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩによって二重消化し、ｉｎｖ１⁺遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ消化フラグメント（２ｋｂ）をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、図３に示すようにインベルターゼ活性の消失した株の染色体ＤＮＡ上のｉｎｖ１⁺遺伝子がｕｒａ４⁺遺伝子に置換されていることをＳａｌＩ消化により３ｋｂのハイブリッドが形成されたことから確認した。
【００３９】
以上の結果から、S. pombe において発現しているインベルターゼ遺伝子は、ｉｎｖ１⁺遺伝子唯一つであることが証明された。
【００４０】
［実施例３］
ｉｎｖ１⁺遺伝子によるインベルターゼ活性の回復
S. pombe 用発現ベクターｐＡＵ−ＳＫ（大阪市立大学理学部下田親博士より供与）に、インベルターゼ遺伝子ｉｎｖ１⁺を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理したＯＲＦ全長を含む３．０ｋｂの切断フラグメントを組み込み、得られた組換えベクターを用いてインベルターゼ欠損株（実施例２）を形質転換した。得られた形質転換体をＹＰスクロース培地（１０μｇ／ｍｌのアンチマイシンＡおよび２０μｇ／ｍｌのブロムクレゾールパープル添加）にストリークして、インベルターゼ活性の有無をオーバーレイアッセイによって調べた。加えてインベルターゼ遺伝子ｉｎｖ１⁺の上流プロモータ領域を含む２．６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラグメントをインベルターゼ遺伝子のＯＲＦを含む２．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ切断フラグメントと連結させた４．６ｋｂＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ切断フラグメントをｐＡＵ−ＳＫに組込み、得られた組換えベクターを用いてインベルターゼ欠損株を形質転換し、同様にインベルターゼ活性の有無をオーバーレイアッセイによって調べた。
【００４１】
その結果、いずれの形質転換株（ｉｎｖ１Δ［ｐＡＵ−ＳＫ：：iｎｖ１⁺］）においても、また野生株ＴＰ４−１Ｄ（ＷＴ）においても、破壊株（ｉｎｖ１Δ）にはみられない青い染色が観察され、インベルターゼを発現していることが確認された。さらに上流プロモータ領域を付加した場合、染色度がより強く、高いレベルでインベルターゼを発現していることが示唆された（図４（ａ）、（ｂ））。図４（ａ）はゲルオーバーレイアッセイ写真、図４（ｂ）は図４（ａ）の染色部分を説明する模式図を示す。
【００４２】
また、ＹＰスクロース培地（１０μｇ／ｍｌのアンチマイシン含有）における生育を調べた結果、インベルターゼ欠損株はほとんど生育を示さなかったが、野生株と形質転換株は３０℃、５日間の培養での生育を確認した（図５（ａ）、（ｂ））。図５（ａ）はコロニーの形態を示す写真、図５（ｂ）は図５（ａ）を説明する模式図を示す。
【００４３】
以上の結果よりｉｎｖ１⁺遺伝子がインベルターゼを発現して細胞表層にインベルターゼを生産していることが証明された。
【００４４】
［実施例４］
発現抑制培養のためのグルコース濃度の決定
インベルターゼ遺伝子のカタボライト抑制に必要なグルコース濃度を決定するため、野生株ＴＰ４−１Ｄをそれぞれグルコースを２％、４％、８％、１６％の濃度で含有する５ｍｌのＭＭ培地に植菌した後、対数増殖期中期になるまで３０℃で振盪培養した。菌体のインベルターゼの酵素活性をＧｏｌｄｓｔｅｉｎらの方法で、培養後の培地中のグルコース濃度をフェノール硫酸法によって測定した（図６）。図中、斜線を付したグラフは菌体あたりのインベルターゼ活性（Ｕ／ＯＤ）を、白抜きグラフは残存グルコース濃度を示す。同図から、インベルターゼ活性は、８％の濃度がグルコースの減少度も少なく、発現抑制培養に最も適当であることがわかった。
【００４５】
［実施例５］
誘導生産のためのグルコース濃度の決定
インベルターゼの誘導生産を行うために最も効果のあるグルコース濃度を決定するため、野生株ＴＰ４−１Ｄをそれぞれ、グルコースを０％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２５％、０．５％、１．０％、２．０％の濃度で含有するＭＭ培地に、対数増殖期中期になるまで２％グルコースが含まれた培地で生育させた野生株と形質転換株〔インベルターゼ欠損株（実施例３）をｉｎｖ１⁺遺伝子のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ領域を挿入したｐＡＵ−ＳＫベクターで形質転換した株〕の前培養菌体を移し、２７℃で３時間振盪培養してインベルターゼ活性を測定した（図７）。各点における菌体のインベルターゼ活性を１８０分間、３０℃で測定した。インベルターゼの１Ｕは３０℃、ｐＨ４．０のもとに、１分間にショ糖を１ｎｍｏｌのグルコースに変化させる酵素の量を示す。
【００４６】
その結果、野生株では誘導に最適なグルコース濃度は０．１％であり、形質転換株では０．０５％であることがわかった。また野生株では、抑制解除時のインベルターゼ活性は抑制時の４０倍の値を示した。このような結果から S. pombe においてカタボライト抑制が存在していることが明示された。
【００４７】
［実施例６］
ｉｎｖ１⁺遺伝子のプロモータ領域の解析
S. pombe のインベルターゼ遺伝子ｉｎｖ１⁺の上流領域１位、６２０位、１１００位、１６１０位、２６１０位のそれぞれをｉｎｖ１⁺遺伝子のＯＲＦと連結させたフラグメントを発現ベクターｐＡＵ−ＳＫに組み込んで５種類の欠失体を作製した。上流領域１位、１６１０位、２６１０位を連結させたプラスミドは、それぞれｉｎｖ１⁺遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位、ＳａｃＩ−ＳａｌＩ部位、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位を含んでいる。６２０位、１１００位の上流領域を含むプラスミドはｐＡＵ−ＳＫ：：ｉｎｖ１⁺（ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ）をテンプレートとしてそれぞれ配列表の配列番号６、７に示すプライマーを用いた部位特異的変異を行ってＳｐｅＩサイトを作製した。そして、制限酵素ＳｐｅＩ処理により上流の一部を除去して６２０位、１１００位の上流領域を含むｉｎｖ１⁺遺伝子のプラスミドを作製した。
【００４８】
得られたそれぞれのプラスミドでインベルターゼ欠損株（実施例３）を形質転換した。得られた組換え体のそれぞれのインベルターゼ活性を測定し、酵素活性を決定した（図８）。その結果、グルコース抑制に必要な領域は１位から６２０位までと考えられた。グルコースの抑制解除に従ってインベルターゼの高い脱抑制に必要な領域は１６１０位から２６１０位までにあることが確認された。
【００４９】
［実施例７］
インベルターゼプロモータを用いた誘導発現マルチクローニングベクターｐＲＩ０Ｍの作製
S. pombe のインベルターゼ遺伝子を含むプラスミド（実施例１）をテンプレートとして、配列番号８および配列番号９に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によってインベルターゼ遺伝子のプロモータ領域を含む配列を増幅し、かつ、両末端に制限酵素認識配列を導入した。制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造（株）製）およびＥｃｏＲＩ（宝酒造（株）製）による二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約３０００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入フラグメントとした。
【００５０】
S. pombe 用マルチクローニングベクターｐＴＬ２Ｍ（特開平７−１６３３７３号）を、制限酵素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＩによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、ベクターフラグメントとした。
【００５１】
これら２本のフラグメントを、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用いて連結した。大腸菌ＤＨ５株（東洋紡（株）製）を形質転換した後、制限酵素地図の作製および塩基配列決定によって、図９ならびに配列表の配列番号２に示す誘導発現マルチクローニングベクターｐＲＩ０Ｍを保持する大腸菌をスクリーニングし、このベクターをアルカリ−ＳＤＳ法によって大量調製した。
【００５２】
［実施例８］
緑色螢光タンパク質誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰの作製
S. pombe のインベルターゼ遺伝子を含むプラスミド（実施例１）をテンプレートとして、配列表の配列番号８および配列番号１０に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によってインベルターゼ遺伝子のプロモータ領域を含む配列を増幅し、かつ、両末端に制限酵素認識配列を導入した。制限酵素ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩ（宝酒造（株）製）による二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約３０００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入プロモータフラグメントとした。
【００５３】
オワンクラゲの緑色螢光タンパク質変異体遺伝子を含むプラスミドｐＥＧＦＰ−１（Clonetech製）をテンプレートとして、配列表の配列番号１１および配列番号１２に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって緑色螢光タンパク質変異体遺伝子のＯＲＦを含む領域を増幅した。制限酵素ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約７００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入ＯＲＦフラグメントとした。
【００５４】
S. pombe 用マルチクローニングベクターｐＴＬ２Ｍ（特開平７−１６３３７３号）を、制限酵素ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化で切断し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、ベクターフラグメントとした。
【００５５】
これら３本のフラグメントを、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。大腸菌ＤＨ５株を形質転換した後、制限酵素地図の作製および塩基配列決定によって、図１０ならびに配列表の配列番号１３に示す緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰを保持する大腸菌をスクリーニングし、この発現ベクターをアルカリ−ＳＤＳ法によって大量調製した。
【００５６】
［実施例９］
S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３８株の作製
緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰおよび導入ベクターｐＡＬ７を用いて、S. pombe 野生株ＡＲＣ００１〔ｌｅｕ１-３２ｈ^-（ＡＴＣＣ３８３９９と同等）〕を岡崎ら（Okazaki et al., "Nucleic Acids Res.", 18, 6485-6489, 1990）の方法に従って形質転換した。
【００５７】
ＹＰＤ液体培地で前培養済みのＡＲＣ００１培養液１ｍｌを１００ｍｌの最少培地ＭＢ＋Ｌｅｕに植菌し、３０℃で１４時間振盪培養した。菌数１ｍｌあたり２．３×１０⁷個の段階で集菌し、水で洗菌後、１ｍｌの０．１Ｍ酢酸リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁し、３０℃で６０分間インキュベートした。上記懸濁液１００μｌに、４μｇの誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰおよび０．５μｇのＰｓｔＩ消化したｐＡＬ７をＴＥ１５μｌに溶かして加え、さらに５０％ＰＥＧ４０００を２９０μｌ加えてよく混合した後、３０℃で６０分間、４３℃で１５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。ＰＥＧを遠心除去した後、菌体を１ｍｌの１／２ＹＥＬ＋Ｌｅｕ培地に懸濁した。１／１０に希釈したもの１ｍｌを３２℃で２時間インキュベートし、うち３００μｌを最少寒天培地ＭＭＡにスプレッドした。３２℃で３日間培養したところ、約３００個の互いに独立したコロニーがプレート上に出現した。
【００５８】
得られた形質転換体１０個（コロニー）を、抗生物質Ｇ４１８を１０μｇ／ｍｌの濃度で含有する２ｍｌのＹＥＬ培地（ＹＥＬ１０培地）に植菌し、３２℃で振盪培養した。２日目に６個のクローンが生育した。さらに同じＹＥＬ１０培地で継代培養したところ、３日目に４個のクローンが生育した。これらを目的の形質転換体候補株、ＡＳＰ１３８株として、グリセロール凍結保存するとともに、以下の実験に使用した。
【００５９】
［実施例１０］
緑色螢光タンパク質変異体の発現解析
S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３８株（実施例９）を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（ＹＰＤ１００培地）に植菌し、３２℃で２日間培養した。蛍光顕微鏡（励起波長４９０ｎｍ／蛍光波長５３０ｎｍ）で菌体を観察したところ、個々の菌体が緑色蛍光を発することが観察された。さらに遠心集菌した菌体に紫外線を照射したところ、やはり緑色蛍光を発することが観察された。以上のことから、目的の緑色蛍光タンパク質が活性体として発現していることがわかった。
【００６０】
ＡＳＰ１３８株（実施例９）をＹＰＤ１００培地５ｍｌに植菌し、３２℃で３日間培養した。集菌、洗菌後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で懸濁し、ミニビードビーター（バイオスペック製）を用いたガラスビーズによる破砕を行った。ガラスビーズを除いた後、ＳＤＳ（１％）存在下で８０℃、１５分間加熱し、抽出液を得た。別にｐＲＩ０Ｍを導入した形質転換体についても、同じ方法で抽出液を作製し、ネガティブコントロールとした。
【００６１】
５０μｇタンパク質相当の抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析した（図１１（ａ）、（ｂ））。クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色したところ、ポジティブコントロールである組換え緑色蛍光タンパク質（Clonetech製）と同じ分子量２５０００付近にネガティブコントロールにない顕著なバンドが確認された。さらに５０μｇ相当のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜にブロッティングし、抗緑色蛍光タンパク質抗体（Clonetech製）を用いたウエスタンブロッティング法で解析した。その結果、ポジティブコントロールと同じ分子量２５０００付近にネガティブコントロールにない顕著なバンドが確認された。以上のことから、目的の緑色蛍光タンパク質が発現していることが生化学的に明らかになった。
【００６２】
［実施例１１］
培養方法の最適化（１）
S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３８株（実施例９）を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（ＹＰＤ１００培地）に植菌し、３２℃で培養した。蛍光付属装置（励起波長４９０ｎｍ／蛍光波長５３０ｎｍ）付きマイクロプレートリーダー（コロナ電気（株）製）で培養液の発する蛍光値を測定し、緑色蛍光タンパク質の発現量を調べた（図１２（ａ）、（ｂ））。図中、ＯＤは菌体濃度を、ＦＬＵ／ＯＤは菌体あたりの蛍光値を、時間は培養時間をそれぞれ示す。同図に示される結果から、非誘導型のサイトメガロウイルスプロモータを用いたＡＳＰ１２２株［ｐｈＧＦＰＳ６５Ｔ（Clonetech製）をもとに特開平７−１６３３７３号公報記載の方法にしたがって作成した緑色蛍光蛋白質Ｓ６５Ｔ変異体発現組換え体］に比べ、ＡＳＰ１３８株では増殖期中期まで発現がみられず、グルコースが枯渇する増殖期後期になって初めて発現が開始することがわかった。これは明らかに誘導型プロモータであるインベルターゼプロモータがグルコース存在下で抑制され、グルコースが消費されることによって抑制が解除されるためであり、この機構が異種タンパク質である緑色蛍光タンパク質の発現にも利用できることがわかった。
【００６３】
［実施例１２］
ＡＳＰ１３８株の培養（２）
S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３８株（実施例９）を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（グルコース濃度８％）に植菌し、３２℃で培養した。さらに増殖期中期に１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤＧ培地（グルコース濃度０．１％、グリセロール濃度３％）に培地を交換し、培養を続けた（図１３（ａ）、（ｂ））。図中、ＯＤは菌体濃度を、ＦＬＵ／ＯＤは菌体あたりの蛍光値を、時間は培養時間をそれぞれ示す。同図に示される結果から、培地を交換しないもの（Untreated）に比べて、培地を交換したもの（Medium-changed）では培地交換によって発現が開始することが観察された。これは培地中のグルコースが除去されることにより急速にインベルターゼプロモータの脱抑制がかかり、発現が誘導されるためであると考えられた。よって低濃度のグルコースを含む発現培地に交換することによって高い発現量が得られること、すなわち菌体の増殖と発現を増殖培地（高グルコース濃度）と発現培地（低グルコース濃度）を用いることによって分離できることがわかった。これは明らかに誘導型プロモータであるインベルターゼプロモータがグルコース存在したで抑制され、グルコースが消費されることによって抑制が解除されるためであり、この機構が異種タンパク質である緑色蛍光タンパク質の発現にも利用できることがわかった。
【００６４】
［実施例１３］
ＡＳＰ１３８株の培養（３）
S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３８株（実施例９）を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（グルコース濃度８％）に植菌し、３２℃で培養した。さらに増殖期後期に１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤＧ培地（グルコース濃度０．１％、グリセロール濃度３％）に培地を交換し、培養を続けた（図１４（ａ）、（ｂ））。図中、ＯＤは菌体濃度を、ＦＬＵ／ＯＤは菌体あたりの蛍光値を、時間は培養時間をそれぞれ示す。同図に示される結果から、培地を交換しないもの（Untreated）に比べて、培地を交換したもの（Medium-changed）では培地交換によって発現が開始することが観察された。これは培地中のグルコースが除去されることにより急速にインベルターゼプロモータの脱抑制がかかり、発現が誘導されるためであると考えられた。よって高濃度のグルコースを含む培地で培養を開始し、グルコースが消費される前に低濃度のグルコースを含む発現培地に交換することによって高い発現量が得られること、すなわち菌体の増殖と発現を増殖培地（高グルコース濃度）と発現培地（低グルコース濃度）を用いることによって分離できることがわかった。これは明らかに誘導型プロモータであるインベルターゼプロモータがグルコース存在下で抑制され、グルコースが消費されることによって抑制が解除されるためであり、この機構が異種タンパク質である緑色蛍光タンパク質の発現にも利用できることがわかった。
【００６５】
［実施例１４］
リポコルチンＩ誘導発現ベクターｐＲＩ０ＬＰＩの作製
S. pombe のインベルターゼ遺伝子を含むプラスミド（実施例１）をテンプレートとして、配列表の配列番号１４および配列番号１５に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によってインベルターゼ遺伝子のプロモータ領域を含む配列を増幅し、かつ、両末端に制限酵素認識配列を導入した。制限酵素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約３０００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入プロモータフラグメントとした。
【００６６】
ヒトのリポコルチンＩ遺伝子を含む発現ベクターｐＴＬ２Ｌ（特開平７−１６３３７３号）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化で切断し、アガロースゲル電気泳動によって、約１０００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入ＯＲＦフラグメントとした。
【００６７】
S. pombe 用マルチクローニングベクターｐＴＬ２Ｍ（特開平７−１６３３７３号）を、制限酵素ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化で切断し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で精製し、ベクターフラグメントとした。
【００６８】
これら３本のフラグメントを、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。大腸菌ＤＨ５株を形質転換した後、制限酵素地図の作製および塩基配列決定によってリポコルチンＩ誘導発現ベクターｐＲＩ０ＬＰＩを保持する大腸菌をスクリーニングし、このベクターをアルカリ−ＳＤＳ法によって大量調製した。
【００６９】
［実施例１５］
S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３９株の作製
リポコルチンＩ誘導発現ベクターｐＲＩ０ＬＰＩおよび導入ベクターｐＡＬ７を用いて、S. pombe 野生株ＡＲＣ００１を前記岡崎らの方法に従って形質転換した。
【００７０】
ＹＰＤ液体培地で前培養済みのＡＲＣ００１培養液１ｍｌを１００ｍｌの最少培地ＭＢ＋Ｌｅｕに植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。菌数１ｍｌあたり１．０×１０⁷個の段階で集菌し、水で洗菌後、１ｍｌの０．１Ｍ酢酸リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁し、３０℃で６０分間インキュベートした。上記懸濁液１００μｌに、２μｇの組換えベクターｐＲＩ０ＬＰＩおよび１μｇのＰｓｔＩ消化したｐＡＬ７を１５μｌのＴＥに溶かして加え、さらに５０％ＰＥＧ４０００を２９０μｌ加えてよく混合した後、３０℃で６０分間、４３℃で１５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。ＰＥＧを遠心除去した後、菌体を１ｍｌの１／２ＹＥＬ＋Ｌｅｕ培地に懸濁した。１／１０に希釈したもの１ｍｌを３２℃で２時間インキュベートし、うち３００μｌを最少寒天培地ＭＭＡにスプレッドした。３２℃で３日間培養したところ、約３００個の互いに独立したコロニーがプレート上に出現した。
【００７１】
得られた形質転換体１０個（コロニー）を、抗生物質Ｇ４１８を１０μｇ／ｍｌの濃度で含有する２ｍｌのＹＥＬ培地（ＹＥＬ１０培地）に植菌し、３２℃で振盪培養した。２日目に３個のクローンが生育した。さらに同じＹＥＬ１０培地で継代培養したところ、３日目に全てのクローンが生育した。これらを目的の形質転換体候補株、ＡＳＰ１３９株としてグリセロール凍結保存するとともに、以下の実験に使用した。
【００７２】
［実施例１６］
リポコルチンＩの発現解析
S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３９株（実施例１５）を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（グルコース濃度８％）に植菌し、３２℃で定常状態にいたるまで培養して集菌し、非誘導培養菌体とした。これとは別に、同じ培地で培養を開始し、増殖期中期に１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤＧ培地（グルコース濃度０．１％、グリセロール濃度３％）に培地を交換して培養を続け、定常期に集菌し、誘導培養菌体とした。両菌体を洗浄後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で懸濁し、ミニビードビーターを用いたガラスビーズによる破砕を行った。ガラスビーズを除いた後、ＳＤＳ（１％）存在下で８０℃、１５分間加熱し、抽出液を得た。
【００７３】
５０μｇタンパク質相当の両抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、クマシーブリリアントブルーで染色した。その結果、誘導培養菌体由来の抽出物において、組換えリポコルチンＩタンパク質の配列から予想される位置と同じ分子量４５０００付近に、非誘導培養菌体由来の抽出物にない顕著なバンドが確認された。より感度の高いウエスタン法によって両者のバンドの濃さを比べたところ、誘導培養菌体抽出物に由来するバンドは非誘導培養菌体抽出物のものに比べて１０倍以上あることがわかった。以上のことから、培地を交換しないものに比べて、培地を交換したものでは培地交換によって発現が開始することが明らかになった。これは培地中のグルコースが除去されることにより急速にインベルターゼプロモータの脱抑制がかかり、発現が誘導されるためであると考えられた。よって低濃度のグルコースを含む発現培地に交換することによってた発現量が得られること、すなわち菌体の増殖と発現を増殖培地（高グルコース濃度）と発現培地（低グルコース濃度）を用いることによって分離できることがわかった。これは明らかに誘導型プロモータであるインベルターゼプロモータがグルコース存在したで抑制され、グルコースが消費されることによって抑制が解除されるためであり、この機構が異種タンパク質であるリポコルチンＩの発現にも利用できることがわかった。
【００７４】
【発明の効果】
本発明のタンパク質生産方法を実施することによって、特定の栄養源の有無により遺伝子発現を制御し、目的タンパク質の生産時期が制御可能になる効果が認められる。ひいては、自身の生理活性のために生産量が低いタンパク質や、他の理由でこれまで生産できなかったタンパク質を生産可能とする効果が達成される。
【００７５】
【配列表】

【００７６】

【００７７】

【００７８】

【００７９】

【００８０】

【００８１】

【００８２】

【００８３】

【００８４】

【００８５】

【００８６】

【００８７】

【００８８】

【００８９】

【００９０】

【図面の簡単な説明】
【図１】ｉｎｖ１⁺、シュワニオミセス・オキシデンタリスのインベルターゼ遺伝子、出芽酵母のＳＵＣ２のアミノ酸配列（部分）の比較を示す図である。
【図２】ｉｎｖ１⁺遺伝子の制限酵素地図を示す。
【図３】ｉｎｖ１⁺遺伝子破壊を示す電気泳動図である。
【図４】図４（ａ）はゲルオーバーレイアッセイによるインベルターゼ活性を示すコロニーの図面代用写真（生物の形態）である。図４（ｂ）は図４（ａ）に示すインベルターゼ活性の解析を示す模式図である。
【図５】図５（ａ）はコロニーの形態を示す図面代用写真（生物の形態）である。図５（ｂ）は図５（ａ）に示すインベルターゼ活性の解析を示す模式図である。
【図６】インベルターゼ活性とグルコース濃度の関係を示すグラフである。
【図７】インベルターゼ活性とグルコース濃度の関係を示すグラフである。
【図８】インベルターゼプロモータの解析図である。
【図９】誘導発現ベクターｐＲＩ０Ｍの構築図である。
【図１０】緑色螢光タンパク質誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰの構築図である。
【図１１】図１１（ａ）、図１１（ｂ）は、それぞれ緑色蛍光タンパク質の発現解析図である。
【図１２】図１２（ａ）、図１２（ｂ）は、それぞれ培養時間と緑色蛍光タンパク質の発現との関係を示すグラフである。
【図１３】図１３（ａ）、図１３（ｂ）は、それぞれ培養時間と緑色蛍光タンパク質の発現との関係を示すグラフである。
【図１４】図１４（ａ）、図１４（ｂ）は、それぞれ培養時間と緑色蛍光タンパク質の発現との関係を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an inducible promoter that can be used in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, an inducible expression vector, and a method for producing a protein using them, in particular, using the invertase promoter of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. The present invention relates to a protein production method in which gene expression is controlled depending on the presence or absence of a specific nutrient source, and the production time of the target protein can be controlled.
[0002]
[Prior art]
The fission yeast S. pombe is a eukaryotic organism but has been extensively studied as a unicellular organism that is extremely easy to apply in the fields of genetics, molecular biology, and cell biology (Nasim A. et al. al. eds., Molecular biology of the fission yeast, Academic Press, 1989). In the culture, monosaccharides such as glucose (glucose) and fructose (fructose) are mainly used as a carbon source. In the absence of these monosaccharides in the medium, it is known that expression of invertase, an enzyme that breaks down sucrose into glucose and fructose, is induced to acquire the carbon source necessary for growth (Moreno S. et al., Arch. Microbiol. 142, 370, 1985).
[0003]
In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, invertase is present on the cell surface and is a high molecular weight glycoprotein with a molecular weight of 205000. 67% of them are sugar chains, and consist of equimolar mannose and galactose residues. Invertase derived from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe is very similar in protein chemistry to the invertase from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. It is known (Moreno S. et al., Biochem. J. 267,697, 1990). It is also known that inhibition of invertase synthesis is released by a decrease in glucose concentration (Mitchison J. et al., Cell Sci 5,373, 1969).
[0004]
Similarly, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, an inherent invertase-induced production phenomenon (disinhibition) is known. Studies on gene-level control of its expression, biosynthetic pathways, structural analysis of sugar chains, etc. have already been carried out in detail. That is, six invertase genes of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae overlap on the chromosome and are encoded by genes SUC1 to SUC5 and SUC7. It is known that sucrose and raffinose can be assimilated if one of them has an active SUC gene (Hohmann S. et al., Curr Genet 11, 217, 1986).
[0005]
In contrast, in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, purification of the invertase protein has been reported (Moreno S. et al., 1985), but the gene has recently been studied by our group's research. Finally it became clear. That is, the invertase gene of fission yeast Schizosaccharomyces pombe is duplicated on the chromosome, and inv0⁺And inv1⁺Has been identified as Of these, inv0⁺Was presumed to be a pseudogene with an incomplete ORF (open reading frame). So only inv1⁺Is a gene encoding the invertase of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Fission yeast Shizosaccharomyces pombe is known to grow using sucrose as the sole carbon source (edited by Yoshitaka Hashiya, “Yeastology”, Iwanami Shoten, 1967). Can be estimated.
[0006]
As a result of analyzing the promoter region of the isolated gene, it was estimated that a special sequence between 1 bp and 620 bp is involved in catabolite repression.
[0007]
In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, it is known that two types of messenger RNAs (mRNAs) having different transcription start points are transcribed from the SUC2 gene. The shorter mRNA is a constitutive transcript and expresses intracellular invertase. The longer mRNA encodes a secreted invertase whose expression is catabolite-suppressed and its derepression ratio is over 200-fold (Carlson M. et al., Mol. Cell. Biol. 3, 439, 1983). As a result of analysis of the promoter region for the longer mRNA, it is considered that a transcriptional regulatory factor is bound to a special repetitive sequence between -650 bp and -418 bp (Salokin L et al., Mol. Cell. Biol. 6, 2314, 1986). Further, it is known that the region from the −418th position to the −140th position is a region required for glucose suppression.
[0008]
These areas and inv1⁺When the region from the first position to the 2809th position of the upstream region of the gene was compared, no significant homology was observed. However, in the region required for derepression of glucose, five repeated sequences of the base sequence of (A / C) (A / G) GAAAT called 7bp motif have been confirmed, and the 7bp motif is inv1.⁺It was revealed that many existed in the upstream region of the gene. In addition, it has been confirmed that a palindromic structure similar to a stem-and-loop structure exists at the same position in the upstream region of genes (SUC, MAL, GAL) controlled by glucose suppression. Inv1 at Shizosaccharomyces pombe⁺A region forming a palindromic structure was also found in the upstream region of the gene. These sequences were thought to play an important role in glucose suppression in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.
[0009]
The fission yeast Schizosaccharomyces pombe is a yeast that is completely evolutionary different from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. It is already known that various structures such as chromosome structure, genome replication mechanism, RNA splicing mechanism, transcription mechanism, post-translational modification and the like are greatly different from other yeasts, and some of them are similar to animal cells. For this reason, it is widely used as a model for eukaryotes (Giga-Hama and Kumagai, eds., Foreign gene expression in fission yeast Schizosaccharomyces pombe, Springer-Verlag, 1997).
[0010]
Fission yeast Schizosaccharomyces pombe is widely used as a host for heterologous protein gene expression, and is known to be particularly suitable for the expression of genes derived from animal cells including humans (Japanese Patent Laid-Open No. 5-15380). Publication, JP-A-7-163373, WO96 / 23890). In addition, the development of membrane structures including the Golgi apparatus and endoplasmic reticulum is known, and from this, it is also used for the expression of membrane proteins, and shows a high expression level. As an expression vector, a normal expression vector (pEVP11, pART1, pTL2M) or nmt1⁺An inducible expression vector (pREP1) using a promoter region of a gene has been used. GAL type or SUC2 type widely used in Saccharomyces cerevisiae is not known.
[0011]
When the SUC2 gene of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is expressed in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, galactose residues are included depending on the host, but constitutive expression may be achieved without receiving catabolite suppression. (Zarate, V. et al., J Applied Bacteriology, 80, 45, 1996). This suggests that the mechanism of catabolite suppression by invertase may be different between fission yeast Schizosaccharomyces pombe and budding yeast Saccharomyces cerevisiae. This has serious implications. That is, when an invertase (SUC2) -type inducible expression vector is produced in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, the diversion of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae promoter, which is usually carried out by those skilled in the art, is used in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. It can not be done. For this reason, the development of this type of vector has long been delayed.
[0012]
Problems to be solved by the invention and means for solving the problems
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors completed the present invention by newly cloning the invertase gene of fission yeast Schizosaccharomyces pombe and constructing an inducible expression vector. It was.
[0013]
  The present invention relates to a catalyst in the invertase gene of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.BoraThe present invention relates to a gene region that is involved in the suppression of citrate, an inducible expression vector using the gene region, a foreign gene expression system using the gene region, and the like.
[0014]
  DNA represented by the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 2809 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0015]
  A recombinant vector comprising the DNA sequence.
[0016]
  A recombination comprising a DNA sequence represented by nucleotide sequences Nos. 1 to 620 and a DNA sequence represented by nucleotides Nos. 1610 to 2610 in Sequence No. 1 of the Sequence Listing vector.
[0017]
  DNA sequence represented by nucleotide sequence Nos. 1 to 2809 of SEQ ID No. 1 in the sequence listing and multiple cloning site are included, or nucleotide numbers No. 1 to No. 1 of SEQ ID No. 1 in the sequence listing It is represented by the DNA sequence represented by the 620th base sequence and the base sequences of base numbers 1610 to 2610A multi-cloning vector comprising a DNA sequence and a multi-cloning site.
[0018]
  The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listingA multi-cloning vector represented by
[0019]
  The DNA sequence represented by the nucleotide sequence Nos. 1 to 2809 of SEQ ID No. 1 in the sequence listing and the heterologous protein structural gene are included, or the nucleotide numbers No. 1 to No. 1 of SEQ ID No. 1 in the sequence listing It is represented by the DNA sequence represented by the 620th base sequence and the base sequences from the 16th to 2610th base numbersAn expression vector for transformation of fission yeast Schizosaccharomyces pombe comprising a DNA sequence and a heterologous protein structural gene.
[0020]
  the aboveA transformant comprising fission yeast Schizosaccharomyces pombe comprising an expression vector.
[0021]
  the aboveA method for producing a protein comprising culturing a transformant and collecting an expressed heterologous protein.
[0022]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present inventors first cloned the invertase gene of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (hereinafter referred to as “S. pombe”), whose entity at the gene level was unknown, and determined the nucleotide sequence. It was clarified by the gene disruption method that one invertase gene is responsible for all activities. Furthermore, the gene region involved in catabolite suppression was examined, and an inducible expression vector was prepared using this region. A recombinant vector into which the green fluorescent protein gene was actually constructed was prepared and S. pombe was transformed with it. Protein expression was confirmed by activity as well as immunological techniques. Furthermore, it discovered that expression was suppressed by glucose in a culture medium and expression of a foreign gene was derepressed when glucose was consumed.
[0023]
Specifically, the present inventors found a precursor gene of S. pombe invertase by the following method and determined its structure.
(1) Using a cDNA library of S. pombe as a template, PCR reaction is performed using primers prepared from amino acid sequences well conserved in invertase genes derived from other species.
(2) Using the obtained PCR product as a probe, a positive clone is selected from the genomic library of S. pombe by plaque hybridization.
(3) Digest positive clones with restriction enzymes and confirm the electrophoresis pattern.
(4) A fragment having a specific length is selected from the confirmed positive clones using Southern hybridization, and the entire base sequence is determined.
(5) The presence or absence of invertase activity is examined using a gene disruption method.
(6) Measure the effect of glucose concentration on the optimum pH, glucose suppression, and derepression in the S. pombe invertase gene.
(7) Subclone the upstream region involved in glucose suppression and determine the necessary region.
[0024]
Furthermore, the present inventors prepared an inducible expression vector of S. pombe invertase by the following method, and confirmed the inducible expression of green fluorescent protein as a specific example.
(1) A multicloning vector pTL2M for S. pombe (see JP-A-7-163373) is modified to produce an inducible multicloning vector pRI0M using an invertase promoter.
(2) A green fluorescent protein mutant inducible expression vector pRI0EGFP is prepared based on the inducible expression multicloning vector pRI0M.
(3) S. pombe wild type strain is transformed with the green fluorescent protein mutant inducible expression vector pRI0EGFP.
(4) The expression of the green fluorescent protein mutant is confirmed using activity (fluorescence) and SDS-PAGE / Western blotting.
(5) The conditions for inducible expression are determined from the correlation between the glucose concentration in the medium and the expression.
[0025]
  Sequence number 1 in the sequence listing is KataBoraIt is a base sequence of an invertase precursor gene including a gene region involved in the suppression of citrate. KataBoraThe gene region involved in site suppression is in the DNA portion represented by the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 2809 or the DNA portion therein. That is, as shown in the analysis results of Example 6 and FIG. 8, particularly important regions in the DNA portion represented by the nucleotide sequences of nucleotide numbers 1 to 2809 are nucleotide numbers 1 to 620. The arrangement part from No. 16 and the arrangement part from No. 1610 to No. 2610 (in FIG. 8, the position is indicated by No. 2810 of the arrangement table 1 as No. 1). Therefore, as an induction promoter in the present invention, these catalogs are used.BoraAs long as it includes a gene involved in site suppression and functions as an inducible promoter, it is not limited to DNA represented by the entire nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 2809. However, since it actually functions in S. pombe, a DNA represented by the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 2809 is preferred as the induction promoter.
[0026]
  Kata as aboveBoraA DNA that functions as an inducible promoter including a gene that is involved in the suppression of the mitochondrion, particularly preferably a DNA represented by the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 2809, is hereinafter referred to as an inducible promoter gene. A recombinant vector such as a multicloning vector or an expression vector can be constructed by incorporating this inducible promoter gene into a vector. A multicloning vector is a vector having a multicloning site, and an expression vector can be constructed by introducing a desired structural gene into the multicloning site. An expression vector is a vector having a structural gene and is used for expression of a heterologous protein encoded by the structural gene. A “heterologous” protein is a protein that the host does not originally have, and when the host is S. pombe, it is a protein that S. pombe does not originally have (for example, a human protein).
[0027]
In the expression vector, the inducible promoter gene is located upstream of the heterologous protein structural gene and controls the expression of the structural gene. In the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, the inducible promoter gene is located in the downstream of the expression vector so that the inducible promoter gene is upstream of the structural gene of the invertase precursor and regulates its expression. Controls the expression of protein structural genes. Also in the multicloning vector, the heterologous protein structural gene is introduced into the multicloning site, so that the inducible promoter gene is located upstream of the multicloning site.
[0028]
As an example of the multicloning vector of the present invention, FIG. 9 shows a vector construction diagram of the multicloning vector pRI0M constructed in the example. The entire base sequence of pRI0M is shown in SEQ ID NO: 2. Inv1-P is the inducible promoter gene portion, and MCS is the multicloning site. As an example of the expression vector of the present invention, FIG. 10 shows a vector construction diagram of a green fluorescent protein mutant inducible expression vector pRI0EGFP introduced with the green fluorescent protein mutant structural gene (EGFP-ORF) constructed in the example. The entire base sequence of this expression vector pRI0EGFP is shown in SEQ ID NO: 13.
[0029]
Since the inducible promoter gene in the present invention is an inducible promoter gene of S. pombe, S. pombe is optimal as a cell (host) transformed with the expression vector of the present invention.
[0030]
S. pombe transformed with the above expression vector of the present invention is cultured under catabolite-inhibiting conditions (for example, in a culture solution having a high glucose concentration) without expressing a heterologous protein (or with a small expression level). pombe can be grown. In this process, the efficiency of proliferation is higher than when there is a load because there is no load of expression of a heterologous protein. Next, by culturing S. pombe under conditions where catabolite suppression is canceled (for example, in a culture medium without glucose or at a low glucose concentration), the amount of S. pombe grown is less than that under catabolite suppression conditions. Although it is less, a larger amount of heterologous protein is expressed than a large amount of S. pombe cells. Thus, by controlling the growth of S. pombe and the expression of the heterologous protein by controlling the catabolite repression, the heterologous protein can be produced more efficiently.
[0031]
Catabolite suppression control can be carried out passively as well as positively as described above. For example, by culturing S. pombe transformed in a culture medium containing a certain amount of glucose, the growth of S. pombe progresses under catabolite suppression at the early stage of the culture due to the high amount of glucose. Then, when glucose is consumed and the amount thereof is reduced, catabolite suppression is released and production of a heterologous protein proceeds. Thus, even without actively controlling the amount of glucose, a heterologous protein can be produced more efficiently than before.
[0032]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples.
[0033]
[Example 1]
Isolation of S. pombe invertase gene
Using the primers of SEQ ID NOs: 3 to 5 in the sequence listing designed based on the sequence portion well conserved among invertase genes derived from other species using the S. pombe cDNA library as a template, Amplification was performed. As a result, amplified bands in the vicinity of 300 bp and 400 bp were obtained. Each PCR product was purified using EASY TRAP (Takara Shuzo Co., Ltd.). The PCR product obtained using the pMOSBlueT vector kit (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) was incorporated into the vector, and the nucleotide sequence was determined. As a result, the partial amino acid sequence obtained by converting the 400 bp PCR product into an amino acid showed high homology with the SUC2 gene of Saccharomyces cerevisiae.
[0034]
Using this 400 bp PCR product as a probe, an attempt was made to obtain a positive clone containing all invertase genes from a genomic DNA library of S. pombe by plaque hybridization. As a result, 15 positive clones were obtained from about 8000 plaques. Plaque hybridization was performed again to perform secondary screening of this positive clone. As a result, 4 positive clones were obtained. A small amount of phage DNA of positive clones was extracted, treated with various restriction enzymes, and the cleavage patterns were compared. Therefore, it was found that there was one kind of acquired positive clone.
[0035]
The full length of the invertase gene was obtained by the following two-step method. A hybridized 3.0 kb HindIII digested fragment was isolated and incorporated into plasmid pBluescript II SK- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). When restriction enzyme maps were prepared, restriction enzyme sites of BamHI and SalI were confirmed. Therefore, subcloning was performed using these restriction enzymes, and in addition, the nucleotide sequence was determined using dilation. As a result, it was found that the HindIII fragment contains the entire ORF of the gene. However, the upstream region thought to be involved in gene expression contained only about 200 bp. Therefore, a newly formed 3.5 kb BamHI digested fragment was further isolated as a 2.6 kb fragment by HindIII digestion, incorporated into the plasmid pBluescript II SK-, and the nucleotide sequence was determined in the same manner by subcloning and dilation. As a result, it was found that the BamHI-HindIII fragment contained a region considered to be an upstream sequence involved in gene expression. The obtained 5.6 kb gene was inv1⁺Named gene. The base sequence and amino acid sequence of ORF are shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. As a result, inv1⁺The gene was found to have 16 asparagine-linked glycosylation sites. Inv1 of S. pombe⁺A comparison between the amino acid sequence deduced from the gene sequence, the amino acid sequence of Schwanniomyces occidentalis invertase, and the amino acid sequence deduced from the SUC2 gene sequence of Saccharomyces cerevisiae is shown in FIG. An asterisk (*) indicates an amino acid common to the three species. As is apparent from FIG. 1, inv1⁺The amino acid sequence deduced from the gene sequence was found to be highly homologous to those derived from Schwaniomyces ocidentalis, which is an invertase derived from other species, and those derived from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. From this, inv1⁺The gene was presumed to encode invertase.
[0036]
[Example 2]
inv1⁺Destruction of gene sequence
S. pombe derived ura4 in the restriction enzyme ClaI recognition site of plasmid pBluescript II SK-⁺The plasmid incorporating the gene was digested with the restriction enzyme HindIII, blunt-ended, and self-ligated (self-cyclized) to destroy the HindIII site. This plasmid was double digested with restriction enzymes XbaI and HincII to give ura4⁺A fragment was obtained. Next, the plasmid pBluescript II SK- is digested with the restriction enzyme SpeI, blunt-ended, and further digested with the restriction enzyme XbaI.⁺The fragment is incorporated, and the restriction enzyme BamHI recognition site is ura4⁺A plasmid placed on both sides of was prepared. The restriction enzyme BamHI recognition site of the plasmid pBluescript II SK- was also destroyed by restriction enzyme treatment, terminal blunting, and self-ligation as described above, and the inv1 was found at the HindIII site.⁺A 3.0 kb fragment containing the ORF region of the gene was incorporated. This plasmid was digested with BamHI to obtain a 1.4 kb fragment (inv1⁺Ura4 with BamHI sites on both sides except for the C-terminal region of ORF⁺Incorporated the gene. This plasmid was digested with HindIII to inv1 at both ends.⁺A DNA fragment containing a region near the gene was obtained (FIG. 2). Figure 2 is inv1⁺Shows the restriction enzyme map of the gene, inv1⁺The open reading frame (ORF) of the gene is indicated by an arrow (inv1⁺ORF), substituted Schizosaccharomyces pombe ura4⁺Genes are rectangular (ura4⁺). Inv1 including ORF⁺The 1.4 Kb BamHI-BamHI fragment of S. pombe ura4⁺By being replaced with a gene, a disrupted strain was created.
[0037]
S. pombe wild strain TP4-1D [h^-, Leu1, ura4, ade6-M216, his2, donated by Dr. Takashi Toda (Imperial Cancer Research Foundation)] were transformed to obtain colonies that had grown in a medium lacking uracil. When invertase activity was examined by overlay assay, 7 strains out of 28 were found to have lost activity. That is, obtained ura4⁺Of the colonies, 25% of the invertase activity disappeared.
[0038]
Inv1 on the chromosome⁺Gene disruption was confirmed by Southern hybridization. Genomic DNA is extracted from a strain that has lost invertase activity, double digested with restriction enzymes HindIII and SalI, and inv1⁺Southern hybridization was performed using the HindIII-SalI digested fragment (2 kb) of the gene as a probe. As a result, as shown in FIG. 3, inv1 on the chromosomal DNA of the strain in which the invertase activity disappeared.⁺The gene is ura4⁺It was confirmed that a 3 kb hybrid was formed by digestion with SalI.
[0039]
From the above results, the invertase gene expressed in S. pombe is inv1.⁺Proven to be the only gene.
[0040]
[Example 3]
inv1⁺Recovery of invertase activity by genes
The invertase gene inv1 is expressed in the expression vector pAU-SK for S. pombe (provided by Dr. Shin Shimoda, Osaka City University).⁺An invertase-deficient strain (Example 2) was transformed with the recombinant vector obtained by incorporating a 3.0 kb cleavage fragment containing the entire ORF treated with restriction enzyme HindIII. The obtained transformant was streaked in YP sucrose medium (10 μg / ml antimycin A and 20 μg / ml bromcresol purple added), and the presence or absence of invertase activity was examined by overlay assay. In addition, the invertase gene inv1⁺A 4.6 kb BamHI-SalI cleavage fragment ligated with a 2.0 kb HindIII-SalI cleavage fragment containing the ORF of the invertase gene containing the upstream promoter region of the ligation into pAU-SK. The invertase-deficient strain was transformed using the obtained recombinant vector, and the presence or absence of invertase activity was similarly examined by overlay assay.
[0041]
As a result, any transformed strain (inv1Δ [pAU-SK :: inv1⁺]) And also in the wild strain TP4-1D (WT), blue staining not observed in the disrupted strain (inv1Δ) was observed, confirming that invertase was expressed. Furthermore, when an upstream promoter region was added, it was suggested that the degree of staining was stronger and invertase was expressed at a high level (FIGS. 4 (a) and (b)). FIG. 4 (a) is a gel overlay assay photograph, and FIG. 4 (b) is a schematic diagram illustrating the stained portion of FIG. 4 (a).
[0042]
Further, as a result of examining the growth in YP sucrose medium (containing 10 μg / ml antimycin), the invertase-deficient strain showed almost no growth, but the wild strain and the transformed strain grew at 30 ° C. for 5 days. Was confirmed (FIGS. 5A and 5B). Fig.5 (a) shows the photograph which shows the form of a colony, FIG.5 (b) shows the schematic diagram explaining Fig.5 (a).
[0043]
Inv1 from the above results⁺It was proved that the gene expresses invertase to produce invertase on the cell surface.
[0044]
[Example 4]
Determination of glucose concentration for expression-suppressed culture
In order to determine the glucose concentration required for catabolite repression of the invertase gene, after inoculating wild strain TP4-1D in 5 ml of MM medium containing glucose at concentrations of 2%, 4%, 8% and 16%, The culture was shaken at 30 ° C. until the middle of the logarithmic growth phase. The enzyme activity of the invertase in the cells was measured by the method of Goldstein et al., And the glucose concentration in the culture medium after the culture was measured by the phenol sulfate method (FIG. 6). In the figure, the hatched graph indicates the invertase activity (U / OD) per cell, and the open graph indicates the residual glucose concentration. From the figure, it was found that the invertase activity was most suitable for the expression-suppressed culture, with a concentration of 8% having a small decrease in glucose.
[0045]
[Example 5]
Determination of glucose concentration for induced production
In order to determine the most effective glucose concentration for inducible production of invertase, the wild-type TP4-1D was treated with 0%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.25 glucose, respectively. Wild strains and transformants grown in a medium containing 2% glucose in MM medium containing concentrations of 0.5%, 0.5%, 1.0%, and 2.0% until the middle of the logarithmic growth phase [Invertase-deficient strain (Example 3) was inv1⁺The precultured cells of the strain transformed with the pAU-SK vector into which the BamHI-SalI region of the gene was inserted] were transferred and cultured with shaking at 27 ° C. for 3 hours to measure the invertase activity (FIG. 7). The invertase activity of the bacterial cells at each point was measured at 30 ° C. for 180 minutes. 1U of invertase indicates the amount of enzyme that changes sucrose to 1 nmol of glucose per minute at 30 ° C. and pH 4.0.
[0046]
As a result, it was found that the optimum glucose concentration for induction in the wild strain was 0.1%, and that in the transformed strain was 0.05%. In the wild strain, the invertase activity at the time of the release of inhibition showed a value 40 times that at the time of inhibition. These results clearly indicate that catabolite suppression exists in S. pombe.
[0047]
[Example 6]
inv1⁺Analysis of promoter region of gene
S. pombe invertase gene inv1⁺Upstream region 1st, 620th, 1100th, 1610th, 2610th inv1⁺The fragment ligated with the gene ORF was incorporated into the expression vector pAU-SK to prepare 5 types of deletions. Plasmids in which the upstream region 1st, 1610th and 2610th positions are ligated are inv1⁺It contains a HindIII-SalI site, a SacI-SalI site, and a BamHI-SalI site of the gene. The plasmid containing the upstream region at positions 620 and 1100 is pAU-SK :: inv1⁺Site-specific mutation was performed using (BamHI-SalI) as a template and the primers shown in SEQ ID Nos. 6 and 7 in the sequence listing, respectively, to produce a SpeI site. And inv1 containing the upstream region of the 620th position and the 1100th position by removing a part of the upstream by the restriction enzyme SpeI treatment⁺A gene plasmid was prepared.
[0048]
Invertase-deficient strain (Example 3) was transformed with each of the obtained plasmids. The invertase activity of each of the obtained recombinants was measured to determine the enzyme activity (FIG. 8). As a result, the region necessary for glucose suppression was considered to be from the 1st to the 620th position. It was confirmed that the region necessary for the high deinhibition of invertase was located from the 1610th position to the 2610th position according to the deregulation of glucose.
[0049]
[Example 7]
Construction of inducible expression multi-cloning vector pRI0M using invertase promoter
Using a plasmid containing the S. pombe invertase gene (Example 1) as a template, the sequence containing the promoter region of the invertase gene was amplified by PCR using the oligo DNAs shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 as primers, and Restriction enzyme recognition sequences were introduced at both ends. The ends were treated by double digestion with restriction enzymes SpeI (Takara Shuzo) and EcoRI (Takara Shuzo), a band corresponding to about 3000 base pairs was excised by agarose gel electrophoresis, and EASY TRAP was used. And purified by the glass bead method.
[0050]
The end of a multicloning vector pTL2M for S. pombe (Japanese Patent Laid-Open No. 7-163373) was treated with double digestion with restriction enzymes SpeI and EcoI, and a band corresponding to about 4500 base pairs was excised by agarose gel electrophoresis. It refine | purified by the glass bead method using EASY TRAP, and it was set as the vector fragment.
[0051]
These two fragments were ligated using a DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). After transforming E. coli DH5 strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), screening of E. coli harboring the inducible expression multicloning vector pRI0M shown in FIG. This vector was prepared in large quantities by the alkali-SDS method.
[0052]
[Example 8]
Construction of green fluorescent protein inducible expression vector pRI0EGFP
Using a plasmid containing the invertase gene of S. pombe (Example 1) as a template, the sequence containing the promoter region of the invertase gene was amplified by PCR using the oligo DNAs shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 of the Sequence Listing as primers. And restriction enzyme recognition sequences were introduced at both ends. The ends were treated by double digestion with restriction enzymes SpeI and NheI (Takara Shuzo Co., Ltd.), a band corresponding to about 3000 base pairs was excised by agarose gel electrophoresis, and purified by the glass bead method using EASY TRAP. The inserted promoter fragment.
[0053]
Green fluorescent protein mutant by PCR using plasmid pEGFP-1 (manufactured by Clonetech) containing green jellyfish green fluorescent protein mutant gene as a template and oligo DNAs shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 of the sequence listing as primers The region containing the gene ORF was amplified. The ends were treated by double digestion with restriction enzymes NheI and HindIII, a band corresponding to about 700 base pairs was excised by agarose gel electrophoresis, and purified by a glass bead method using EASY TRAP to obtain an inserted ORF fragment.
[0054]
A multicloning vector pTL2M for S. pombe (JP-A-7-163373) was cleaved by double digestion with restriction enzymes SpeI and HindIII, a band corresponding to about 4500 base pairs was excised by agarose gel electrophoresis, and EASY TRAP was excised. It was purified by the glass bead method using
[0055]
These three fragments were ligated using a DNA ligation kit. After transformation of E. coli DH5, E. coli carrying the green fluorescent protein mutant-derived expression vector pRI0EGFP shown in FIG. 10 and SEQ ID NO: 13 in the sequence listing was screened by preparing a restriction enzyme map and determining the base sequence. Expression vectors were prepared in large quantities by the alkali-SDS method.
[0056]
[Example 9]
Production of S. pombe transformant ASP138 strain
Using the green fluorescent protein mutant inducible expression vector pRI0EGFP and the introduction vector pAL7, S. pombe wild type ARC001 [leu1-32h^-(Equivalent to ATCC 38399)] was transformed according to the method of Okazaki et al. (Okazaki et al., “Nucleic Acids Res.”, 18, 6485-6489, 1990).
[0057]
1 ml of ARC001 culture solution pre-cultured in YPD liquid medium was inoculated into 100 ml of minimal medium MB + Leu and cultured with shaking at 30 ° C. for 14 hours. 2.3 x 10 per 1 ml of bacteria⁷The cells were collected in stages, washed with water, suspended in 1 ml of 0.1 M lithium acetate (pH 5.0), and incubated at 30 ° C. for 60 minutes. To 100 μl of the above suspension, 4 μg of the inducible expression vector pRI0EGFP and 0.5 μg of PstI-digested pAL7 were dissolved in 15 μl of TE, and 290 μl of 50% PEG4000 was further added and mixed well. Incubation was carried out in this order at 15 ° C. for 15 minutes and at room temperature for 10 minutes. After PEG was removed by centrifugation, the cells were suspended in 1 ml of 1/2 YEL + Leu medium. 1 ml diluted to 1/10 was incubated at 32 ° C. for 2 hours, 300 μl of which was spread on minimal agar medium MMA. When cultured at 32 ° C. for 3 days, about 300 independent colonies appeared on the plate.
[0058]
Ten transformants (colony) obtained were inoculated into 2 ml of YEL medium (YEL10 medium) containing antibiotic G418 at a concentration of 10 μg / ml and cultured at 32 ° C. with shaking. On the second day, 6 clones grew. Furthermore, when subcultured in the same YEL10 medium, 4 clones grew on the 3rd day. These were cryopreserved as the target transformant candidate strain, ASP138 strain, and used for the following experiments.
[0059]
[Example 10]
Expression analysis of green fluorescent protein mutants
S. pombe transformant ASP138 strain (Example 9) was inoculated into a YPD medium (YPD100 medium) containing 100 μg / ml G418 and cultured at 32 ° C. for 2 days. When the cells were observed with a fluorescence microscope (excitation wavelength: 490 nm / fluorescence wavelength: 530 nm), it was observed that each cell emitted green fluorescence. Furthermore, when the collected cells were irradiated with ultraviolet rays, green fluorescence was observed. From the above, it was found that the target green fluorescent protein was expressed as an active substance.
[0060]
The ASP138 strain (Example 9) was inoculated into 5 ml of YPD100 medium and cultured at 32 ° C. for 3 days. After collection and washing, the cells were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and crushed with glass beads using a mini bead beater (Biospec). After removing the glass beads, the mixture was heated at 80 ° C. for 15 minutes in the presence of SDS (1%) to obtain an extract. Separately, for the transformant into which pRI0M was introduced, an extract was prepared by the same method and used as a negative control.
[0061]
The extract corresponding to 50 μg protein was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (FIGS. 11A and 11B). When Coomassie brilliant blue (CBB) staining was performed, a prominent band not present in the negative control was confirmed around the same molecular weight of 25000 as that of the recombinant green fluorescent protein (manufactured by Clonetech) as a positive control. Further, 50 μg of protein was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, blotted on a PVDF membrane, and analyzed by Western blotting using an anti-green fluorescent protein antibody (Clonetech). As a result, a remarkable band not found in the negative control was confirmed around the same molecular weight of 25,000 as that of the positive control. From the above, it was revealed biochemically that the target green fluorescent protein was expressed.
[0062]
[Example 11]
Optimization of culture method (1)
S. pombe transformant ASP138 strain (Example 9) was inoculated into a YPD medium (YPD100 medium) containing 100 μg / ml G418 and cultured at 32 ° C. The fluorescence value emitted from the culture solution was measured with a microplate reader (Corona Electric Co., Ltd.) equipped with a fluorescence attachment device (excitation wavelength: 490 nm / fluorescence wavelength: 530 nm), and the expression level of green fluorescent protein was examined (FIG. 12 (a)). (B)). In the figure, OD represents the cell concentration, FLU / OD represents the fluorescence value per cell, and time represents the culture time. From the results shown in the figure, the green fluorescent protein S65T mutation prepared according to the method described in JP-A-7-163373 based on the ASP122 strain [phGFPS65T (manufactured by Clonetech) using a non-inducible cytomegalovirus promoter. In comparison with the somatic expression recombinant], it was found that the expression of ASP138 strain was not observed until the middle of the growth phase, and the expression started only at the late growth phase where glucose was depleted. This is because the invertase promoter, which is an inducible promoter, is repressed in the presence of glucose and is released when glucose is consumed. This mechanism is also used for the expression of the green fluorescent protein, a heterologous protein. I knew it was possible.
[0063]
[Example 12]
Culture of ASP138 strain (2)
S. pombe transformant ASP138 strain (Example 9) was inoculated in a YPD medium (glucose concentration 8%) containing 100 μg / ml G418 and cultured at 32 ° C. Further, the medium was changed to a YPDG medium (glucose concentration 0.1%, glycerol concentration 3%) containing 100 μg / ml G418 in the middle of the growth phase, and the culture was continued (FIGS. 13A and 13B). In the figure, OD represents the cell concentration, FLU / OD represents the fluorescence value per cell, and time represents the culture time. From the results shown in the figure, it was observed that expression was initiated by medium exchange in the medium-changed medium compared to the one without medium exchange (Untreated). This was considered to be because the invertase promoter was rapidly derepressed by the removal of glucose in the medium, and the expression was induced. Therefore, it is possible to obtain a high expression level by exchanging it with an expression medium containing a low concentration of glucose, that is, the growth and expression of cells are separated by using a growth medium (high glucose concentration) and an expression medium (low glucose concentration). I knew it was possible. This is because the invertase promoter, which is an inducible promoter, is suppressed by the presence of glucose, and the suppression is released when glucose is consumed. This mechanism is also used for the expression of the green fluorescent protein, a heterologous protein. I knew it was possible.
[0064]
[Example 13]
Culture of ASP138 strain (3)
S. pombe transformant ASP138 strain (Example 9) was inoculated in a YPD medium (glucose concentration 8%) containing 100 μg / ml G418 and cultured at 32 ° C. Further, in the late growth phase, the medium was replaced with a YPDG medium (glucose concentration 0.1%, glycerol concentration 3%) containing 100 μg / ml G418, and the culture was continued (FIGS. 14A and 14B). In the figure, OD represents the cell concentration, FLU / OD represents the fluorescence value per cell, and time represents the culture time. From the results shown in the figure, it was observed that expression was initiated by medium exchange in the medium-changed medium compared to the one without medium exchange (Untreated). This was considered to be because the invertase promoter was rapidly derepressed by the removal of glucose in the medium, and the expression was induced. Therefore, start culture in a medium containing a high concentration of glucose, and replace it with an expression medium containing a low concentration of glucose before the glucose is consumed. It was found that separation was possible by using a growth medium (high glucose concentration) and an expression medium (low glucose concentration). This is because the invertase promoter, which is an inducible promoter, is repressed in the presence of glucose and is released when glucose is consumed. This mechanism is also used for the expression of the green fluorescent protein, a heterologous protein. I knew it was possible.
[0065]
[Example 14]
Preparation of lipocortin I-inducible expression vector pRI0LPI
Using the plasmid (Example 1) containing the S. pombe invertase gene as a template, a sequence containing the promoter region of the invertase gene was amplified by PCR using the oligo DNAs shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 in the Sequence Listing as primers. And restriction enzyme recognition sequences were introduced at both ends. The ends were treated by double digestion with restriction enzymes SpeI and EcoRI, a band corresponding to about 3000 base pairs was excised by agarose gel electrophoresis, and purified by the glass bead method using EASY TRAP to obtain an inserted promoter fragment.
[0066]
An expression vector pTL2L containing human lipocortin I gene (JP-A-7-163373) was digested by double digestion with restriction enzymes EcoRI and HindIII, and a band corresponding to about 1000 base pairs was excised by agarose gel electrophoresis. It refine | purified by the glass bead method using TRAP, and was set as the insertion ORF fragment.
[0067]
A multicloning vector pTL2M for S. pombe (JP-A-7-163373) was cleaved by double digestion with restriction enzymes SpeI and HindIII, a band corresponding to about 4500 base pairs was excised by agarose gel electrophoresis, and EASY TRAP was excised. It was purified by the glass bead method using
[0068]
These three fragments were ligated using a DNA ligation kit. After transformation of E. coli strain DH5, E. coli carrying the lipocortin I-inducible expression vector pRI0LPI was screened by preparing a restriction enzyme map and determining the nucleotide sequence, and this vector was prepared in large quantities by the alkali-SDS method.
[0069]
[Example 15]
Construction of S. pombe transformant ASP139 strain
Using the lipocortin I-inducible expression vector pRI0LPI and the transfer vector pAL7, S. pombe wild strain ARC001 was transformed according to the method of Okazaki et al.
[0070]
1 ml of ARC001 culture solution pre-cultured in YPD liquid medium was inoculated into 100 ml of minimal medium MB + Leu and cultured with shaking at 30 ° C. for 16 hours. 1.0 x 10 per 1 ml of bacteria⁷The cells were collected in stages, washed with water, suspended in 1 ml of 0.1 M lithium acetate (pH 5.0), and incubated at 30 ° C. for 60 minutes. To 100 μl of the suspension, 2 μg of recombinant vector pRI0LPI and 1 μg of PstI-digested pAL7 were dissolved in 15 μl of TE, 290 μl of 50% PEG4000 was further added, and mixed well, then at 30 ° C. for 60 minutes at 43 ° C. For 15 minutes and then for 10 minutes at room temperature. After PEG was removed by centrifugation, the cells were suspended in 1 ml of 1/2 YEL + Leu medium. 1 ml diluted to 1/10 was incubated at 32 ° C. for 2 hours, 300 μl of which was spread on minimal agar medium MMA. When cultured at 32 ° C. for 3 days, about 300 independent colonies appeared on the plate.
[0071]
Ten transformants (colony) obtained were inoculated into 2 ml of YEL medium (YEL10 medium) containing antibiotic G418 at a concentration of 10 μg / ml and cultured at 32 ° C. with shaking. Three clones grew on the second day. Furthermore, when subcultured in the same YEL10 medium, all clones grew on the third day. These were cryopreserved as the target transformant candidate strain, ASP139 strain, and used in the following experiments.
[0072]
[Example 16]
Expression analysis of lipocortin I
S. pombe transformant ASP139 strain (Example 15) was inoculated into a YPD medium (glucose concentration 8%) containing 100 μg / ml G418, cultured at 32 ° C. until reaching a steady state, and collected. Induced cultured cells were used. Separately, the culture was started with the same medium, and the medium was replaced with a YPDG medium (glucose concentration 0.1%, glycerol concentration 3%) containing 100 μg / ml G418 in the middle of the growth phase. The cells were collected during the period and used as induced cultured cells. Both cells were washed, suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), and crushed with glass beads using a mini bead beater. After removing the glass beads, the mixture was heated at 80 ° C. for 15 minutes in the presence of SDS (1%) to obtain an extract.
[0073]
Both extracts corresponding to 50 μg protein were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie Brilliant Blue. As a result, a remarkable band that was not found in the extract derived from the non-induced cultured cells was confirmed in the extract derived from the induced cultured cells in the vicinity of the same molecular weight of 45,000 as the position expected from the sequence of the recombinant lipocortin I protein. . When the density of both bands was compared by a more sensitive Western method, it was found that the band derived from the induced cultured cell extract was 10 times or more compared to that of the non-induced cultured cell extract. From the above, it was clarified that expression was started by medium exchange in the case where the medium was exchanged, compared to the case where the medium was not exchanged. This was considered to be because the invertase promoter was rapidly derepressed by the removal of glucose in the medium, and the expression was induced. Therefore, the expression level obtained by exchanging with an expression medium containing low concentration of glucose can be obtained, that is, the growth and expression of bacterial cells are separated by using a growth medium (high glucose concentration) and an expression medium (low glucose concentration). I knew it was possible. This is because the invertase promoter, which is an inducible promoter, is suppressed in the presence of glucose, and the suppression is released when glucose is consumed. This mechanism can also be used for the expression of lipocortin I, a heterologous protein. I understood.
[0074]
【The invention's effect】
By carrying out the protein production method of the present invention, it is recognized that the gene expression is controlled by the presence or absence of a specific nutrient source, and the production time of the target protein can be controlled. As a result, the effect of enabling the production of a protein having a low production amount due to its own physiological activity or a protein that could not be produced for other reasons is achieved.
[0075]
[Sequence Listing]

[0076]

[0077]

[0078]

[0079]

[0080]

[0081]

[0082]

[0083]

[0084]

[0085]

[0086]

[0087]

[0088]

[0089]

[0090]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 inv1⁺FIG. 2 is a view showing a comparison of amino acid sequences (parts) of Schwanniomyces oxydentalis invertase gene and SUC2 of Saccharomyces cerevisiae.
FIG. 2 inv1⁺The restriction enzyme map of a gene is shown.
FIG. 3 inv1⁺It is an electrophoretic diagram which shows gene destruction.
FIG. 4 (a) is a drawing-substituting photograph (form of organism) of a colony showing invertase activity by gel overlay assay. FIG.4 (b) is a schematic diagram which shows the analysis of the invertase activity shown to Fig.4 (a).
FIG. 5 (a) is a drawing-substituting photograph (organism form) showing the form of a colony. FIG.5 (b) is a schematic diagram which shows the analysis of the invertase activity shown to Fig.5 (a).
FIG. 6 is a graph showing the relationship between invertase activity and glucose concentration.
FIG. 7 is a graph showing the relationship between invertase activity and glucose concentration.
FIG. 8 is an analysis diagram of an invertase promoter.
FIG. 9 is a construction diagram of an inducible expression vector pRI0M.
FIG. 10 is a construction diagram of a green fluorescent protein-inducible expression vector pRI0EGFP.
FIGS. 11 (a) and 11 (b) are diagrams showing the expression analysis of green fluorescent protein, respectively.
FIGS. 12 (a) and 12 (b) are graphs showing the relationship between the culture time and the expression of green fluorescent protein, respectively.
FIGS. 13 (a) and 13 (b) are graphs showing the relationship between the culture time and the expression of green fluorescent protein, respectively.
14 (a) and 14 (b) are graphs showing the relationship between the culture time and the expression of green fluorescent protein, respectively.

Claims

配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡ。 DNA represented by the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 2809 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第６２０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列および塩基番号第１６１０番〜第２６１０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列を含む組換えベクター。A recombinant vector comprising a DNA sequence represented by a nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 620 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a DNA sequence represented by a nucleotide sequence of nucleotide numbers 1610 to 2610.

請求項１に記載のＤＮＡ配列を含む組換えベクター。Recombinant vector comprising a DNA sequence of claim 1.

請求項１に記載のＤＮＡ配列とマルチクローニングサイトとを含む、または、配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第６２０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列および塩基番号第１６１０番〜第２６１０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列とマルチクローニングサイトとを含む、マルチクローニングベクター。A DNA sequence comprising the DNA sequence according to claim 1 and a multicloning site , or a DNA sequence represented by base numbers 1 to 620 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and base numbers 1610 to 1610 A multicloning vector comprising a DNA sequence represented by the nucleotide sequence of No. 2610 and a multicloning site .

配列表の配列番号２の塩基配列で表されるマルチクローニングベクター。 A multicloning vector represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing .

請求項１のＤＮＡ配列と異種タンパク質構造遺伝子とを含む、または、配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第６２０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列および塩基番号第１６１０番〜第２６１０番の塩基配列で表されるＤＮＡ配列と異種タンパク質構造遺伝子とを含む、***酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe）の形質転換用の発現ベクター。 A DNA sequence comprising the DNA sequence of claim 1 and a heterologous protein structural gene, or a DNA sequence represented by nucleotide numbers 1 to 620 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and nucleotide numbers 1610 to 1610 An expression vector for transformation of fission yeast S. pombe comprising a DNA sequence represented by the nucleotide sequence of No. 2610 and a heterologous protein structural gene .

請求項６の発現ベクターを含む、***酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe）からなる形質転換体。 A transformant comprising the fission yeast S. pombe comprising the expression vector of claim 6.

請求項７の形質転換体を培養し、発現された異種タンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の生産方法。 A method for producing a protein comprising culturing the transformant of claim 7 and collecting the expressed heterologous protein.