JP2739473B2 - Ｄ−乳酸の高感度測定量法 - Google Patents
Ｄ−乳酸の高感度測定量法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、体液中に微量に存在するＤ−乳酸の高感度
定量法に関する。 本発明者らは体液即ち血液，尿等でヒトの健康時に微
量に存在するＤ−乳酸は糖尿病、或いはリンパ腫等の疾
病時において著しく増加することを発見した。従って本
発明のＤ−乳酸の高感度定量法はこれら疾病の診断を目
的とする臨床検査の分野で有用である。 〔従来技術〕 これまでにも体液中のＤ−乳酸をＤ−乳酸脱水素酵素
（以下Ｄ−LDHという。）を用いて測定する試みがなさ
れており〔例えばMethods in Enzymology 89巻,35〜40
（1982）〕、その反応式は以下に示される。 しかしながら、従来の測定法においてはその反応式に
おいて生成したNADHを紫外部（例えば波長340nm）にて
直接測定するか又はNADHを種々の発色剤（例えばホルマ
ザン色素）にて発色させ可視部にて測定することが試み
られてきた。 〔従来技術の問題点〕 しかしながら、このような測定法による体液中のＤ−
乳酸を定量する方法では感度が低すぎるため、極く微量
のＤ−乳酸の定量を行うためには体液の測定試料を多く
せねばならず、これでは、極少量の試料を用い、短時間
に測定することを要する臨床検査の分野において到底使
用することが不可能であった。 〔問題点を解決するための手段〕 そこで本発明者らは、微量のＤ−乳酸を感度よく定量
できる方法を見出すべく鋭意検討した結果、生成するピ
ルビン酸に蛍光化合物をカップリングさせ、カップリン
グ化合物の蛍光強度を定量することによりＤ−乳酸を感
度よく定量できる方法を見出したのである。これにより
健常人の体液中に極微量存在するＤ−乳酸を精度よく測
定することが可能になり、各種疾病により体液中のＤ−
乳酸量が増加した場合健常人の値と比較することにより
診断することが可能となった。即ち本発明は、体液にNA
D存在下、Ｄ−LDHを作用させ、ピルビン酸とNADHを生成
せしめ、次いで生成したピルビン酸と蛍光化合物とを反
応させることによってカップリング化合物を形成せしめ
た後、該カップリング化合物の蛍光強度を測定すること
により、体液中のＤ−乳酸量を求めることを特徴とする
ところのＤ−乳酸の高感度定量法である。この場合にお
いて、さらに本発明者らは、反応系にジアホラーゼとチ
オクタミドとを存在せしめ、NADHを酸化させることによ
ってＤ−LDHによるピルビン酸からＤ−乳酸生成反応即
ち逆反応を阻止し、Ｄ−乳酸からピルビン酸を生成する
反応を促進せしめたのである。 本発明において使用する体液には血液，尿等があり、
血液は通常血清、血漿等に分画したものが用いられる。
又本発明において使用するＤ−LDHは微生物起源のもの
であれ動物起源のものであれ、いずれでもよいがＬ−乳
酸に作用せずＤ−乳酸のみに特異的に作用するものが望
ましい。具体的にはスタフィロコッカス属菌から得られ
るＤ−LDH（例えば天野製薬製LDH“AMANO"）等が挙げら
れる。 本発明のピルビン酸と蛍光化合物とのカップリング反
応は塩酸酸性化で行われ、形成されたカップリング化合
物の蛍光強度を測定することによって体液中のＤ−乳酸
量が求められる。蛍光化合物として好ましいのはｏ−フ
ェニレンジアミン,4,5−ジメトキシ−1,2−ジアミノベ
ンゼン等であり、形成されるカップリング化合物として
は２−メチルキサール，ジメトキシ２−メチルキサール
等が挙げられる。 以下に本発明を試験例，実施例にて具体的に説明す
る。 試験例１ 人尿中のＤ−乳酸量とＤ−乳酸の添加回収実
験 正常な人尿0.15mlを２倍量の0.5M過塩素酸で除蛋白
し、上清を1M KOHにて中和した試料0.5mlに15nmol,30nm
ol,60nmol,90nmol量のＤ−乳酸を添加したもの及びＤ−
乳酸無添加のものを検体とした。 各検体に21mM硫酸ヒドラジン50μ,0.1Mリン酸緩衝
液（pH7.0）0.2mlを加え、37℃,30分反応させ、内因性
ピルビン酸を除去し、次いで10mM NAD 50μ,100u/ml
のＤ−LDH 50μ,26mM DL−6,8チオタミド100μ,25u
/mlのジアホラーゼ50μにて37℃,2時間反応を行い、
生じたピルビン酸を1M HCl 0.3ml,70mM o−フェニレン
ジアミンと50℃,1時間反応させることにより２−メチル
キサノールとし、このものをHPLCにて定量することによ
り検体中のＤ−乳酸量を求めた。その結果は表１に示さ
れる。 表１より明らかのように人尿中に含まれるＤ−乳酸量
は29.9nmol/0.5mlであり、又本発明の測定法によるＤ−
乳酸の人尿への添加回収は良好であった。 実施例１ 血清中のＤ−乳酸の定量法 健常人４人の食前，食後における血液を採取し、その
各血清0.15mlを２倍量の0.5M過塩素酸で除蛋白し、上清
を1M KOHにて中和した試料0.5mlに21mM硫酸ヒドラジン5
0μ,0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）0.2mlを加え37℃,30
分反応させて内因性ピルビン酸を除去し、次に10mM NAD
50μ,100u/mlのＤ−LDH 50μ,26mM DL−6,8チオク
タミド100μ,25u/mlのジアホラーゼ50μを添加し、
37℃,2時間反応を行い生じたピルビン酸を1M HCl 0.3m
l,70mM o−フェニレンジアミンと50℃,1時間反応させる
ことにより２−メチルキサノールとし、このものをHPLC
にて定量することにより各血清中のＤ−乳酸量を求め
た。HPLCの分析条件は次の通りである。 移動相 10mM KH2PO4（pH2.1） （20％ CH3CNを含む） 流 速 1ml/ml カラム UNISIL−ODS−QT 5ケ 温 度 41℃ 波 長 λex341nm λem416nm その結果は表２に示される。 表２より明らかのように食後に血清中のＤ−乳酸量が
増加することが分かる。 実施例２ ラットにストレプトゾシンを腹腔内投与し、普通食で
17日間飼育し慢性糖尿病にした後、採血を行い血清を分
取したのち実施例１の方法に準じてＤ−乳酸の定量を行
った。 その結果を表３に示す。 表３から明らかのように糖尿ラットでＤ−乳酸の値の
高い投与が得られた。 〔発明の効果〕 本発明のＤ−乳酸の高感度定量法は、体液中に微量に
存在するＤ−乳酸を正確に定量することができる。それ
故、本発明の方法は糖尿病，リンパ腫等の疾病の診断を
目的とする臨床検査の分野に使用することが可能であ
る。
定量法に関する。 本発明者らは体液即ち血液，尿等でヒトの健康時に微
量に存在するＤ−乳酸は糖尿病、或いはリンパ腫等の疾
病時において著しく増加することを発見した。従って本
発明のＤ−乳酸の高感度定量法はこれら疾病の診断を目
的とする臨床検査の分野で有用である。 〔従来技術〕 これまでにも体液中のＤ−乳酸をＤ−乳酸脱水素酵素
（以下Ｄ−LDHという。）を用いて測定する試みがなさ
れており〔例えばMethods in Enzymology 89巻,35〜40
（1982）〕、その反応式は以下に示される。 しかしながら、従来の測定法においてはその反応式に
おいて生成したNADHを紫外部（例えば波長340nm）にて
直接測定するか又はNADHを種々の発色剤（例えばホルマ
ザン色素）にて発色させ可視部にて測定することが試み
られてきた。 〔従来技術の問題点〕 しかしながら、このような測定法による体液中のＤ−
乳酸を定量する方法では感度が低すぎるため、極く微量
のＤ−乳酸の定量を行うためには体液の測定試料を多く
せねばならず、これでは、極少量の試料を用い、短時間
に測定することを要する臨床検査の分野において到底使
用することが不可能であった。 〔問題点を解決するための手段〕 そこで本発明者らは、微量のＤ−乳酸を感度よく定量
できる方法を見出すべく鋭意検討した結果、生成するピ
ルビン酸に蛍光化合物をカップリングさせ、カップリン
グ化合物の蛍光強度を定量することによりＤ−乳酸を感
度よく定量できる方法を見出したのである。これにより
健常人の体液中に極微量存在するＤ−乳酸を精度よく測
定することが可能になり、各種疾病により体液中のＤ−
乳酸量が増加した場合健常人の値と比較することにより
診断することが可能となった。即ち本発明は、体液にNA
D存在下、Ｄ−LDHを作用させ、ピルビン酸とNADHを生成
せしめ、次いで生成したピルビン酸と蛍光化合物とを反
応させることによってカップリング化合物を形成せしめ
た後、該カップリング化合物の蛍光強度を測定すること
により、体液中のＤ−乳酸量を求めることを特徴とする
ところのＤ−乳酸の高感度定量法である。この場合にお
いて、さらに本発明者らは、反応系にジアホラーゼとチ
オクタミドとを存在せしめ、NADHを酸化させることによ
ってＤ−LDHによるピルビン酸からＤ−乳酸生成反応即
ち逆反応を阻止し、Ｄ−乳酸からピルビン酸を生成する
反応を促進せしめたのである。 本発明において使用する体液には血液，尿等があり、
血液は通常血清、血漿等に分画したものが用いられる。
又本発明において使用するＤ−LDHは微生物起源のもの
であれ動物起源のものであれ、いずれでもよいがＬ−乳
酸に作用せずＤ−乳酸のみに特異的に作用するものが望
ましい。具体的にはスタフィロコッカス属菌から得られ
るＤ−LDH（例えば天野製薬製LDH“AMANO"）等が挙げら
れる。 本発明のピルビン酸と蛍光化合物とのカップリング反
応は塩酸酸性化で行われ、形成されたカップリング化合
物の蛍光強度を測定することによって体液中のＤ−乳酸
量が求められる。蛍光化合物として好ましいのはｏ−フ
ェニレンジアミン,4,5−ジメトキシ−1,2−ジアミノベ
ンゼン等であり、形成されるカップリング化合物として
は２−メチルキサール，ジメトキシ２−メチルキサール
等が挙げられる。 以下に本発明を試験例，実施例にて具体的に説明す
る。 試験例１ 人尿中のＤ−乳酸量とＤ−乳酸の添加回収実
験 正常な人尿0.15mlを２倍量の0.5M過塩素酸で除蛋白
し、上清を1M KOHにて中和した試料0.5mlに15nmol,30nm
ol,60nmol,90nmol量のＤ−乳酸を添加したもの及びＤ−
乳酸無添加のものを検体とした。 各検体に21mM硫酸ヒドラジン50μ,0.1Mリン酸緩衝
液（pH7.0）0.2mlを加え、37℃,30分反応させ、内因性
ピルビン酸を除去し、次いで10mM NAD 50μ,100u/ml
のＤ−LDH 50μ,26mM DL−6,8チオタミド100μ,25u
/mlのジアホラーゼ50μにて37℃,2時間反応を行い、
生じたピルビン酸を1M HCl 0.3ml,70mM o−フェニレン
ジアミンと50℃,1時間反応させることにより２−メチル
キサノールとし、このものをHPLCにて定量することによ
り検体中のＤ−乳酸量を求めた。その結果は表１に示さ
れる。 表１より明らかのように人尿中に含まれるＤ−乳酸量
は29.9nmol/0.5mlであり、又本発明の測定法によるＤ−
乳酸の人尿への添加回収は良好であった。 実施例１ 血清中のＤ−乳酸の定量法 健常人４人の食前，食後における血液を採取し、その
各血清0.15mlを２倍量の0.5M過塩素酸で除蛋白し、上清
を1M KOHにて中和した試料0.5mlに21mM硫酸ヒドラジン5
0μ,0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）0.2mlを加え37℃,30
分反応させて内因性ピルビン酸を除去し、次に10mM NAD
50μ,100u/mlのＤ−LDH 50μ,26mM DL−6,8チオク
タミド100μ,25u/mlのジアホラーゼ50μを添加し、
37℃,2時間反応を行い生じたピルビン酸を1M HCl 0.3m
l,70mM o−フェニレンジアミンと50℃,1時間反応させる
ことにより２−メチルキサノールとし、このものをHPLC
にて定量することにより各血清中のＤ−乳酸量を求め
た。HPLCの分析条件は次の通りである。 移動相 10mM KH2PO4（pH2.1） （20％ CH3CNを含む） 流 速 1ml/ml カラム UNISIL−ODS−QT 5ケ 温 度 41℃ 波 長 λex341nm λem416nm その結果は表２に示される。 表２より明らかのように食後に血清中のＤ−乳酸量が
増加することが分かる。 実施例２ ラットにストレプトゾシンを腹腔内投与し、普通食で
17日間飼育し慢性糖尿病にした後、採血を行い血清を分
取したのち実施例１の方法に準じてＤ−乳酸の定量を行
った。 その結果を表３に示す。 表３から明らかのように糖尿ラットでＤ−乳酸の値の
高い投与が得られた。 〔発明の効果〕 本発明のＤ−乳酸の高感度定量法は、体液中に微量に
存在するＤ−乳酸を正確に定量することができる。それ
故、本発明の方法は糖尿病，リンパ腫等の疾病の診断を
目的とする臨床検査の分野に使用することが可能であ
る。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．体液にNAD存在下、Ｄ−乳酸脱水素酵素を作用さ
せ、ピルビン酸とNADHを生成せしめ、次いでピルビン酸
と蛍光化合物とを反応させることによって得られるカッ
プリング化合物の蛍光強度をHPLCを用いて測定すること
により体液中のＤ−乳酸量を求めることを特徴とするＤ
−乳酸の高感度定量法。 ２．反応系にジアホラーゼとチオクタミドとを存在せし
め、NADHを酸化させることによってＤ−乳酸からピルビ
ン酸の生成を促進せしめることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載のＤ−乳酸の高感度定量法。 ３．蛍光化合物がｏ−フェニレンジアミン又は4,5−ジ
メトキシ1,2−ジアミノベンゼンであるところの特許請
求の範囲第１項記載のＤ−乳酸の高感度定量法。 ４．カップリング化合物が２−メチルキサノール又はジ
メトキシ２−メチルキサノールであるところの特許請求
の範囲第１項記載のＤ−乳酸の高感度定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33138087A JP2739473B2 (ja) | 1987-12-26 | 1987-12-26 | Ｄ−乳酸の高感度測定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33138087A JP2739473B2 (ja) | 1987-12-26 | 1987-12-26 | Ｄ−乳酸の高感度測定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01171498A JPH01171498A (ja) | 1989-07-06 |
| JP2739473B2 true JP2739473B2 (ja) | 1998-04-15 |
Family
ID=18243040
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33138087A Expired - Fee Related JP2739473B2 (ja) | 1987-12-26 | 1987-12-26 | Ｄ−乳酸の高感度測定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2739473B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1033196A (ja) * | 1996-07-23 | 1998-02-10 | Unitika Ltd | 試験片 |
| US6030802A (en) * | 1998-05-29 | 2000-02-29 | Roche Diagnostics Corporation | Liquid reagent set for L-lactate determination |
| JP3707479B2 (ja) | 2002-04-26 | 2005-10-19 | ヤマハ株式会社 | ドラムヘッド緊張装置 |
| CN109342634A (zh) * | 2018-12-07 | 2019-02-15 | 西北大学 | 一种柱前衍生-hplc测定dxs酶催化活性的方法 |
-
1987
- 1987-12-26 JP JP33138087A patent/JP2739473B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01171498A (ja) | 1989-07-06 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
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| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |