JP2680666B2 - Method for producing putrescine oxidase - Google Patents
Method for producing putrescine oxidaseInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はプトレッシンオキシダーゼの新規な製造方法
に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Field of Industrial Application) The present invention relates to a novel method for producing putrescine oxidase.
（従来の技術） プトレッシンオキシダーゼは、ポリアミンを酸化して
ω−アミノアルキルアルデヒドと過酸化水素を生成さ
せ、該ω−アミノアルキルアルデヒド又は過酸化水素の
量を測定することにより、ポリアミンを定量する方法に
おいて、前記ポリアミンを酸化するための酵素として有
用である。(Prior Art) Putrescine oxidase quantifies polyamine by oxidizing polyamine to produce ω-aminoalkylaldehyde and hydrogen peroxide, and measuring the amount of the ω-aminoalkylaldehyde or hydrogen peroxide. In the above method, it is useful as an enzyme for oxidizing the polyamine.
従来、プトレッシンオキシダーゼの製造方法として
は、アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Agrical.Biol.Chem）,30巻,1202頁（1996）、特開
昭57−18984号広報等に記載のミクロコッカス属に属す
る菌体を培養して、その培養物からプトレッシンオキシ
ダーゼを採取する方法が知られている。上記方法におい
て菌体を培養するための培地としては、グルコースを炭
素源として含み、これに窒素源、誘導基質等を加えたも
のが一般的に使用されている。即ち、菌体よりプトレッ
シンオキシダーゼを採取する技術に関しての歴史は比較
的浅く、該菌体の培地としては、上記方法が研究され始
めた頃、既に菌体の培地として汎用されていた、グルコ
ースの炭素源として含む培地が当初より使用され、今日
に至っている。Conventionally, as a method for producing putrescine oxidase, micro-organisms described in Agricultural Biological Chemistry (Agrical.Biol.Chem), Vol. 30, p. 1202 (1996), JP-A-57-18984, etc. A method is known in which cells belonging to the genus Coccus are cultured and putrescine oxidase is collected from the culture. In the above method, as a medium for culturing cells, a medium containing glucose as a carbon source and adding a nitrogen source, an inducing substrate and the like is generally used. That is, the history of the technology for collecting putrescine oxidase from the bacterial cells is relatively short, and as a culture medium for the bacterial cells, glucose, which was already widely used as a culture medium for the bacterial cells when the above method was studied, was glucose. The medium containing as a carbon source has been used from the beginning and has been in use today.
（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、上記方法は菌体を培養する際プトレッ
シンオキシダーゼの生産活性が低く、工業的規模で該酸
素を生産しようとする場合、大容量の装置を必要とする
という問題を有していた。(Problems to be Solved by the Invention) However, the above-mentioned method has a low putrescine oxidase-producing activity when culturing cells, and a large-capacity device is required when the oxygen is to be produced on an industrial scale. Had the problem of.
（問題を解決するための手段） 本発明者らは、菌体の培養において、高い酵素生産活
性でプトレッシンオキシダーゼを産生する方法を開発す
べく研究を重ねた。その結果シュードモナス属又はミク
ロコッカス属に属し且つプトレッシンオキシダーゼ産生
能を有する菌体について、培地成分として従来使用され
ていたグルコースを除き、且つ誘導基質を特定量使用す
ることにより、プトレッシンオキシダーゼの生産活性が
著しく向上すると共に誘導時間も飛躍的に短縮し、該酵
素を極めて効率よく製造し得ることを見い出し、本発明
を完成するに至った。即ち本発明はシュードモナス属又
はミクロコッカス属に属し且つプトレッシンオキシダー
ゼ産生能を有する菌体を培養し、培養物からプトレッシ
ンオキシダーゼを採取するに際し、基質として実質的に
グルコースを含まず、且つ誘導基質を0.2重量％以上の
濃度で含有する培地を使用して、該菌体を培養すること
を特徴とするプトレッシンオキシダーゼの製造方法であ
る。(Means for Solving the Problem) The present inventors have conducted extensive research to develop a method for producing putrescine oxidase with high enzyme-producing activity in culturing bacterial cells. As a result, for the bacterial cells belonging to the genus Pseudomonas or the genus Micrococcus and having the ability to produce putrescine oxidase, glucose, which has been conventionally used as a medium component, is eliminated, and a specific amount of an inducing substrate is used to obtain putrescine oxidase. The present inventors have completed the present invention by discovering that the production activity of E. coli was significantly improved and the induction time was drastically shortened, and that the enzyme could be produced extremely efficiently. That is, the present invention, culturing a bacterial cell belonging to the genus Pseudomonas or Micrococcus and having putrescine oxidase-producing ability, when collecting putrescine oxidase from the culture, does not substantially contain glucose as a substrate, and A method for producing putrescine oxidase, which comprises culturing the cells using a medium containing an inducing substrate at a concentration of 0.2% by weight or more.
本発明に使用される微生物は、シュードモナス属又は
ミクロコッカス属に属し且つプトレッシンオキシダーゼ
産生能を有するものであれば該存の菌株、自然から新た
に分離された菌株及びこれらの変異株のいずれでも使用
することが出来る。そのうち、本発明の方法が特に好ま
しく適用されるシュードモナス属に属する微生物として
は、例えばシュードモナス・フルオレッセンスIFO−392
5（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・シン
ザンタIFO−3913（Pseudomonas synxantha）、シュード
モナス・シリンゲIFO−12655（Pseudomonas syringae）
等が挙げられる。又ミクロコッカス属に属する微生物と
してはミクロコッカス・ルーべンスIFO−3768（Microco
ccus rubens）、ミクロコッカス・フラビダス（微工研
菌寄第5633号）、ミクロコッカス・ルテウスIFO−3763
（Micrococcus luteus）、ミクロコッカス・バイアンス
IFO−3765（Micrococcus varians）等が挙げられる。The microorganism used in the present invention is any existing strain if it belongs to the genus Pseudomonas or the genus Micrococcus and has putrescine oxidase-producing ability, a strain newly isolated from nature and mutants thereof. But it can be used. Among them, the microorganism belonging to the genus Pseudomonas to which the method of the present invention is particularly preferably applied is, for example, Pseudomonas fluorescens IFO-392.
5 (Pseudomonas fluorescens), Pseudomonas synzanta IFO-3913 (Pseudomonas synxantha), Pseudomonas syringae IFO-12655 (Pseudomonas syringae)
And the like. Microorganisms belonging to the genus Micrococcus include Micrococcus rubens IFO-3768 (Micrococus
ccus rubens), Micrococcus flavidus (Microtechnological Research Institute No. 5633), Micrococcus luteus IFO-3763
(Micrococcus luteus), Micrococcus viance
IFO-3765 (Micrococcus varians) etc. are mentioned.
本発明は、上記菌体を培養するための基質として、実
質的にグルコースを含まず、且つ誘導基質を0.2重量％
以上、好ましくは0.2〜2.0重量％含有する培地を使用す
ることを特徴とする。The present invention, as a substrate for culturing the above-mentioned bacterial cells, contains substantially no glucose, and contains 0.2% by weight of an inducing substrate.
As described above, a medium containing 0.2 to 2.0% by weight is preferably used.
従来、グルコースを培地成分として使用した場合にお
ける目的酵素の生成阻害については、大腸菌のβ−ガラ
クトシダーゼやガラクトザイマーゼ、サッカロミセス・
フラギリスのインベルターゼ等の酵素について報告され
ている。しかしながら、プトレッシンオキシダーゼにつ
いてはかかる研究は全く成されておらず、前記したよう
にグルコースを含む培地が常用されている。又、酵素を
生成するための菌体の培養において、グルコースが酵素
生成の阻害要因となるかどうかは、個々の菌体及び該菌
体により産生される目的酵素について、統計的な実験を
行って初めて判明するものである。例えば、バイオケミ
カ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Bi
ophysica Acta）26巻,662頁（1957）には、シュードモ
ナス属に属するシュードモナス・フルオレッセンスより
パラーアミノ安息香酸酸化酵素を産生する場合、グルコ
ースはその生成活性を助長すると報告されている。この
様に微生物による酵素生産は数多くの実験を重ねること
により、目的酵素の生産に最も適した培地が検討され、
利用されているのが現状である。本発明者等は、プトレ
ッシンオキシダーゼに対するグルコースの生成阻害につ
いて数多くの実験を行った結果、グルコースを実質的に
含まず、且つ誘導基質の仕込濃度を特定の値に調節する
ことにより、特定の菌体を用いたプトレッシンオキシダ
ーゼの製造における生産活性が著しく向上し得ることを
見い出した。Conventionally, for the inhibition of the production of the target enzyme when glucose was used as a medium component, β-galactosidase or galactozymease of Escherichia coli, Saccharomyces
Enzymes such as flagella invertase have been reported. However, no such research has been conducted on putrescine oxidase, and a medium containing glucose is commonly used as described above. In addition, in the culture of the bacterial cells for producing the enzyme, whether glucose is an inhibitory factor for the enzyme production is determined by conducting a statistical experiment on the individual bacterial cells and the target enzyme produced by the bacterial cells. It is the first to be known. For example, Biochimica et Bi
Ophysica Acta) 26, 662 (1957), it is reported that when Pseudomonas fluorescens belonging to the genus Pseudomonas produces para-aminobenzoic acid oxidase, glucose promotes its production activity. In this way, enzyme production by microorganisms has been repeated a number of experiments to study the most suitable medium for producing the target enzyme,
It is currently used. The present inventors have conducted many experiments on the inhibition of glucose production by putrescine oxidase, and as a result, the glucose concentration is substantially not contained, and by adjusting the charge concentration of the inducing substrate to a specific value, It has been found that the production activity in the production of putrescine oxidase using bacterial cells can be significantly improved.
尚、実質的にグルコースを含まないものとは、グルコ
ースを完全にゼロとすることのみを示すものではなく、
炭素源、窒素源域は誘導基質中に不可避的に混入する微
量、一般に0.05％以下のグルコースを許容するものであ
る。It should be noted that what does not substantially contain glucose does not indicate only that glucose is completely zero,
The carbon source and nitrogen source regions allow a trace amount of glucose, generally 0.05% or less, which is inevitably mixed in the induction substrate.
又本発明に用いられる誘導基質としてはプトレッシ
ン、スペルミジン、ジアミノプロパン、カルジン等のポ
リアミン、該ポリアミンの誘導体としてのアセチルプト
レッシン、アセチルカダベリン、ベンゾイルプトレッシ
ン等のポリアミンの誘導体、該ポリアミン又はその誘導
体の塩酸塩等が挙げられる。上記誘導基質は単独或は２
種以上を組合せて使用することができる。これら誘導基
質の添加量は、0.2重量％以上とするが、前期グルコー
スを実質的に含まない要件との組合せにより、プトレッ
シンオキシダーゼの生産活性を著しく向上させるために
必要である。上記誘導基質の添加濃度は、0.2重量％以
上であれば特に制限されないが、2.0重量％以下で使用
することが経済性から好適である。Further, as the inducing substrate used in the present invention, putrescine, spermidine, diaminopropane, polyamines such as calzine, acetylputrescine as a derivative of the polyamine, acetylcadaverine, a derivative of polyamine such as benzoylputrescine, the polyamine or the like Examples thereof include hydrochlorides of derivatives. The above-mentioned inducing substrate is alone or 2
More than one species can be used in combination. The addition amount of these inducing substrates is 0.2% by weight or more, but it is necessary to remarkably improve the putrescine oxidase production activity in combination with the requirement of substantially not containing glucose. The concentration of the above-mentioned induction substrate added is not particularly limited as long as it is 0.2% by weight or more, but it is preferable to use 2.0% by weight or less from the economical viewpoint.
本発明に使用する培地は基質として実質的にグルコー
スを含まず、且つ誘導基質を0.2重量％以上の濃度で含
有する要件を満足するものであれば、他の培地成分は公
知のものが特に制限なく使用し得る。例えば、炭素源と
しては、酢酸等の有機酸、糖密、可溶性デンプン、グリ
セロール等が挙げられる。又窒素源としては牛肉エキ
ス、魚肉エキス等の肉エキス、酵母エキス、ポリペプト
ン、ペプトン等制限はなく利用できるが、このうち酵母
エキス及びポリペプトンの組合せが好適である。。更に
本発明においては燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム等の無機塩類を適宜含有させる
ことも制限なく採用される。又本発明においては、炭素
源又は窒素源又はその両者を含有しない培地でも菌体を
培養し、プトレッシンオキシダーゼを製造することは可
能であるが、本発明をより効率的に実施するためには、
前記炭素源を0.1〜2.0重量％窒素源を0.1〜2.0重量％の
濃度で添加した培地が良く、特に好ましくは、窒素源と
してポリペプトン0.3〜0.7重量％、酵母エキス0.2〜0.6
重量％を含有する培地が好適に用いられる。The medium used in the present invention does not substantially contain glucose as a substrate, and other medium components are particularly limited to known ones as long as they satisfy the requirement of containing an inducing substrate at a concentration of 0.2% by weight or more. Can be used without. Examples of the carbon source include organic acids such as acetic acid, sugar-tight, soluble starch, glycerol and the like. As the nitrogen source, meat extract such as beef extract, fish meat extract, yeast extract, polypeptone, peptone and the like can be used without limitation, and among these, a combination of yeast extract and polypeptone is preferable. . Further, in the present invention, it is also possible to appropriately contain inorganic salts such as potassium monobasic phosphate, dibasic potassium phosphate, sodium chloride, magnesium sulfate, ammonium sulfate and ammonium chloride without limitation. Further, in the present invention, it is possible to produce putrescine oxidase by culturing the cells in a medium containing no carbon source or nitrogen source or both, but in order to carry out the present invention more efficiently Is
A medium containing 0.1 to 2.0% by weight of the carbon source and 0.1 to 2.0% by weight of a nitrogen source is preferable, and particularly preferably 0.3 to 0.7% by weight of polypeptone as a nitrogen source and 0.2 to 0.6 of yeast extract.
A medium containing wt% is preferably used.
又培養条件としては公知の条件が特に制限なく採用さ
れる。例えば、通気撹拌条件下で培養温度が15〜40℃、
好ましくは20〜35℃の範囲で培養する方法が好適であ
る。又、培養時のpH条件は4.0〜9.0、好ましくはpH5.0
〜8.0の範囲が適当である。更に培養時間は特に限定さ
れないが酵素生産の経済性を考慮すると菌体の増殖の後
期から休止状態に入って10時間以内の範囲が適当であ
る。Known conditions may be used without particular limitation as culture conditions. For example, the culture temperature is 15 to 40 ° C under aeration and stirring conditions,
Preferably, a method of culturing at 20 to 35 ° C is suitable. The pH condition during the culture is 4.0 to 9.0, preferably pH 5.0.
A range of ~ 8.0 is suitable. Further, the culturing time is not particularly limited, but in consideration of the economical efficiency of enzyme production, the range of 10 hours or less after entering the quiescent state from the latter stage of bacterial growth is suitable.
本発明において、上記した培養によって産生されるプ
トレッシンオキシダーゼは培養物中に蓄積される。即
ち、培養後の菌体内と培養液の両者又は一方に蓄積され
るが、その多くは菌体内に蓄積する。培養によって得ら
れた培養物から培養液と菌体とを分離する方法は如何な
る方法でもよいが、通常は遠心分離法や濾過等の方法が
用いられ、遠心分離の方法が速やかに分離でき好適であ
る。本発明によって製造されるプトレッシンオキシダー
ゼは、そのまま培養液又は菌体の状態でも使用できる
が、精製する必要が生じた場合は次のような一般的な方
法又はその組合せにより精製することが出来る。菌体内
のプトレッシンオキシダーゼを抽出する方法は、如何な
る方法により抽出してもよいが通常用いられている方法
は、超音波破砕装置による抽出、凍結融解、ガラスビー
ズと菌体とを混ぜ合わせて回転させるダイノミル破砕装
置による抽出や有機溶媒例えば冷アセトンや冷アルコー
ルによる細胞膜の破壊による抽出法又はリゾチーム等を
用いて菌体細胞壁を破壊して抽出する方法又はそれらの
組合せによる方法が一般的に用いられるが工業的に大量
に処理する場合はダイノミル破砕装置による抽出が好適
に用いられる。又培養液中に存在するプトレッシンオキ
シダーゼを濃縮する場合も如何なる方法も制限なく採用
されるが、一般的には硫酸アンモニウム等を用いた塩析
や限外濾過膜等を用いた濾過による方法が好適に用いら
れる。更に菌体から抽出されたプトレシンオキシダーゼ
又は培養液中のプトレッシンオキシダーゼの精製を進め
る必要がある場合は、如何なる方法又はそれらの組合せ
も制限なく採用されるが一般的に用いられる方法は、硫
酸アンモニウム等を用いた塩析、有機溶媒沈澱法、イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイ
トカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマト
グラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィ
ー、調製用電気泳動法等用いるか、適宜組み合わせる
か、あるいは繰り返すことによって目的とする精製を行
うことができる。In the present invention, putrescine oxidase produced by the above-mentioned culture is accumulated in the culture. That is, it is accumulated in the microbial cells and / or the culture solution after culturing, but most of them are accumulated in the microbial cells. The method for separating the culture solution and the bacterial cells from the culture obtained by the culturing may be any method, but usually a method such as a centrifugation method or filtration is used, and the centrifugation method is preferable because it can be rapidly separated. is there. The putrescine oxidase produced by the present invention can be used as it is in a culture medium or in the state of bacterial cells, but if purification is necessary, it can be purified by the following general method or a combination thereof. . The method for extracting putrescine oxidase in the cells may be extracted by any method, but the method usually used is extraction by an ultrasonic disruption device, freeze-thawing, mixing glass beads and cells. Extraction by rotating Dynomill crushing device or extraction method by destruction of cell membrane with organic solvent such as cold acetone or cold alcohol, or method of disrupting cell wall of lysozyme or the like or a combination thereof is generally used. However, when industrially treating a large amount, extraction with a Dynomill crushing device is preferably used. Further, when concentrating putrescine oxidase present in the culture solution, any method can be adopted without limitation, but in general, a method by salting out using ammonium sulfate or the like or filtration using an ultrafiltration membrane or the like is used. It is preferably used. Further, when it is necessary to proceed with the purification of putrescine oxidase extracted from the bacterial cells or putrescine oxidase in the culture solution, any method or a combination thereof can be adopted without limitation, but a commonly used method is ammonium sulfate. Salting out using, etc., organic solvent precipitation method, ion exchange column chromatography, hydroxyapatite column chromatography, gel filtration column chromatography, affinity column chromatography, preparative electrophoresis method, etc., or appropriately combined or repeated. By doing so, the desired purification can be performed.
本発明においてシュードモナス属に属する菌体より得
られるプトレッシンオキシダーゼは、新規なものであり
次のような理化学的性質を有する。In the present invention, putrescine oxidase obtained from cells belonging to the genus Pseudomonas is novel and has the following physicochemical properties.
作用 次式に示す通り、酸素存在下で、１モルのプトレッシ
ンから１モルの４−アミノブタナールと１モルの過酸化
水素と１モルのアンモニアを生成し、且つ１モルのスペ
ルミジンから１モルの４−アミノブタナールと１モルの
1,3−ジアミノプロパンと１モルの過酸化水素を生成せ
しめる。Action As shown in the following formula, in the presence of oxygen, 1 mol of putrescine produces 1 mol of 4-aminobutanal, 1 mol of hydrogen peroxide and 1 mol of ammonia, and 1 mol of spermidine produces 1 mol of 4-aminobutanal and 1 mole
This produces 1,3-diaminopropane and 1 mol of hydrogen peroxide.
NH2（CH2）4NH2＋O2＋H2O→NH2（CH2）3CHO＋H2O2＋NH3 NH2（CH2）4NH（CH2）3NH3＋O2＋H2O→NH2（CH2）3CHO
＋H2O2＋NH2（CH2）3NH2 基質特異性 プトレッシン、カダベリン、スペルミジンに対して作
用し、1,3−ジアミノプロパンに対しては、作用を示さ
ない。これらのポリアミン類に対する作用の強さを、プ
トレッシンに対する作用を100とした相対活性値で第１
表に示す。NH 2 (CH 2 ) 4 NH 2 + O 2 + H 2 O → NH 2 (CH 2 ) 3 CHO + H 2 O 2 + NH 3 NH 2 (CH 2 ) 4 NH (CH 2 ) 3 NH 3 + O 2 + H 2 O → NH 2 (CH 2 ) 3 CHO
+ H 2 O 2 + NH 2 (CH 2 ) 3 NH 2 Substrate specificity It acts on putrescine, cadaverine and spermidine, but does not show an effect on 1,3-diaminopropane. The strength of the action on these polyamines was first calculated by the relative activity value with the action on putrescine being 100.
It is shown in the table.
至適pH pH7.5〜8.0 pH安定性 25℃下にて48時間保存した時、pH5.5〜9.0において、
90％以上の残存活性を有する。 Optimum pH pH 7.5 to 8.0 pH stability When stored at 25 ° C for 48 hours, at pH 5.5 to 9.0,
It has a residual activity of 90% or more.
分子量 83,000±5,000（Bio−Sil TSK−250（BIO−RAD社製）
によるゲル濾過法により） サブユニットの分子量 42,000±5,000（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法より） サブユニットの数:2個 本発明における分子量の値は、特に断わらない限りゲ
ル濾過法により、サブユニットの分子量の値は、ドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により、それぞれ測定したものをいう。Molecular weight 83,000 ± 5,000 (Bio-Sil TSK-250 (manufactured by BIO-RAD)
Molecular weight of subunits 42,000 ± 5,000 (from SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) Number of subunits: 2 Molecular weight values in the present invention are determined by gel filtration unless otherwise specified. The value of the molecular weight of is the value measured by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.
Km値 0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）の条件における各
基質に対するKm値は、プトレッシン:0.2mM、カダベリ
ン:0.6mM、スペルミジン:0.3mMである。Km values Km values for each substrate under the condition of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) are putrescine: 0.2 mM, cadaverine: 0.6 mM, spermidine: 0.3 mM.
至適温度 0.1M燐酸緩衝液（pH7.5）において35〜45℃である。Optimum temperature: 35-45 ℃ in 0.1M phosphate buffer (pH 7.5).
温度安定性 0.1M燐酸緩衝液（pH7.5）において、30℃以下の温度
条件下、２時間処理で90％以上の残存活性を有する。Temperature stability 0.1M phosphate buffer (pH 7.5) has a residual activity of 90% or more after 2 hours of treatment at a temperature of 30 ° C or lower.
吸収スペクトル 274nm、380nm、460nmに極大吸収を持つ。Absorption spectrum It has maximum absorption at 274 nm, 380 nm and 460 nm.
阻害剤 種々の試薬及び金属イオンの濃度1mMでの本発明の酵
素に対する影響を第２表に示す。銀イオン、水銀イオ
ン、コバルトイオンにより強く阻害を受ける。Inhibitors Table 2 shows the effect of various reagents and the metal ion on the enzyme of the present invention at a concentration of 1 mM. It is strongly inhibited by silver, mercury and cobalt ions.
等電点:3.9〜4.3 本発明におけるプトレッシンオキシダーゼの酵素活性
測定方法及び酵素活性値の表示方法は以下の通りであ
る。 Isoelectric point: 3.9 to 4.3 The method for measuring the enzyme activity of putrescine oxidase and the method for displaying the enzyme activity value in the present invention are as follows.
0.01重量％の４−アミノアンチピリン、0.005重量％
の2,4−ジクロロフェノール、0.004重量％のぺルオキシ
ダーゼを含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）を2.0m
l、10mMのプトレッシン・２塩酸塩を含む水溶液を0.2m
l、それぞれ光路長1cmの標準キュベットに分注し、酵素
液0.05mlを添加混合した後、30℃に設定された分光光度
計のセルホールダに設置し、510nmにおける吸光度の時
間当りの増加量（Ａ）を測定し、生成する過酸化水素の
量を次に示す換算式（１）から求める。酵素活性は、１
分間に１μmoleの過酸化水素を生成する酵素量を１ユニ
ットとする。0.01 wt% 4-aminoantipyrine, 0.005 wt%
Of 2,4-dichlorophenol and 0.004% by weight of peroxidase in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0)
l, 0.2m of an aqueous solution containing 10mM putrescine dihydrochloride
l, each was dispensed into a standard cuvette with an optical path length of 1 cm, 0.05 ml of enzyme solution was added and mixed, and then placed in the cell holder of the spectrophotometer set at 30 ° C. to increase the absorbance at 510 nm per hour (A ) Is measured and the amount of hydrogen peroxide produced is determined from the following conversion formula (1). Enzyme activity is 1
One unit is the amount of enzyme that produces 1 μmole of hydrogen peroxide per minute.
本発明により得られたシュードモナス・フルオレッセ
ンスのプトレッシンオキシダーゼの完全に純化された酵
素の比活性値は80.2ユニット/mg−タンパクを示す。
又、ドデシル硫酸ナトリウムの存在、非存在下でのポリ
アクリルアミドゲル電気泳動上において両者共に単一の
蛋白バンドが観測される。 The specific activity value of the completely purified enzyme of Pseudomonas fluorescens putrescine oxidase obtained according to the present invention is 80.2 units / mg-protein.
In addition, a single protein band is observed for both on polyacrylamide gel electrophoresis in the presence or absence of sodium dodecyl sulfate.
（効果） 本発明の方法によれば、シュードモナス属又はミクロ
コッカス属に属し、且つプトレッシンオキシダーゼ産生
能を有する菌体の培養において、該プトレッシンオキシ
ダーゼの産生を極めて高い生産で且つ短時間の酵素誘導
時間で行うことが可能である。(Effect) According to the method of the present invention, in the culture of bacterial cells belonging to the genus Pseudomonas or the genus Micrococcus and having the ability to produce putrescine oxidase, the production of the putrescine oxidase is extremely high and for a short time. It is possible to carry out with the enzyme induction time of.
従って、プトレッシンオキシダーゼの生産を極めて効
率よく実施することが可能であり、その工業的価値は極
めて高いものである。Therefore, it is possible to carry out the production of putrescine oxidase extremely efficiently, and its industrial value is extremely high.
以下、本発明を実施例によって更に具体的に説明する
が、本発明はこの実施例に限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例） 実施例１ 0.5重量％ポリペプトン、0.5重量％酵母エキス、0.5
重量％プトレッシン、0.1重量％食塩、0.02重量％硫酸
マグネシウム７水塩から成る培地（pH7.0）1,000mlを５
の三角フラスコに入れ、120℃で20分間オートクレー
ブした後、30℃下でこの培地にシュードモナス・フルオ
レッセンス（IFO−3925）を植菌した。30℃で24時間振
とう培養を行った後この培養液を、予め上記と同様の組
成を有する培地150を仕込み、そしてオートクレーブ
にて減菌をしたジャー・ファーメンターに全量加えて本
培養を行った。Example 1 Example 1 0.5 wt% polypeptone, 0.5 wt% yeast extract, 0.5
1,000 ml of a medium (pH 7.0) consisting of 5% by weight putrescine, 0.1% by weight sodium chloride and 0.02% by weight magnesium sulfate heptahydrate was added.
The mixture was placed in an Erlenmeyer flask of No. 2 and autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes, and then Pseudomonas fluorescens (IFO-3925) was inoculated into this medium at 30 ° C. After shaking culture at 30 ° C. for 24 hours, this culture solution was charged with a medium 150 having the same composition as the above in advance, and the whole amount was added to a jar fermenter sterilized by an autoclave for main culture. It was
18時間培養の後、培養物を遠心分離機にかけ、培養液
上清と菌体とに分離し採取した。得られた培養液上清中
のプトレッシンオキシダーゼ活性を測定した結果、0.2
ユニット/ml−培液液上清であった。After culturing for 18 hours, the culture was subjected to a centrifuge to separate and collect the culture supernatant and cells. As a result of measuring putrescine oxidase activity in the obtained culture supernatant, 0.2
Unit / ml-broth supernatant.
更に得られた菌体（全湿菌体重量1850g）の30gを１
の0.01M燐酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し、その懸濁液をダ
イノミル細胞破砕機に連続的に通過させて菌体破砕を行
った。その破砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し、
上清液を得た。この上清液中のプトレッシンオキシダー
ゼの総活性は3650ユニット、比活性は0.18ユニット/mg
−タンパクであった。30 g of the obtained bacterial cells (total wet bacterial cell weight: 1850 g)
The cells were suspended in 0.01 M phosphate buffer (pH 7.5), and the suspension was continuously passed through a dynomyl cell disruptor to disrupt the cells. The crushed liquid is centrifuged using a centrifuge,
A supernatant was obtained. The total activity of putrescine oxidase in this supernatant is 3650 units and the specific activity is 0.18 units / mg.
-It was a protein.
この上清液を、予め0.01Μの燐酸緩衝液（pH7.5）に
て平衡化したω−アミノドデカン−セロファロース（フ
ァルマシア社製のセファロース4Bにブロムシアン法で1,
12−ジアミノドデカンをカップリングして調製）を充填
したカラム（2.2×28cm）に負荷させる。カラムを２
の0.3Μの食塩を含む0.01Μ燐酸緩衝液（pH7.5）で十分
に洗浄後、1.0Μ食塩と10mΜの1,3−ジアミノプロパン
を含む0.01Μの燐酸緩衝液（pH7.5）にてプトレッシン
オキシダーゼを溶出せしめた。この溶出液中のプトレッ
シンオキシダーゼの総活性は3,530ユニット、比活性は1
7.9ユニット/mg−タンパクであった。The supernatant was mixed with ω-aminododecane-cellophalose (Pharmacia Sepharose 4B, which had been previously equilibrated with 0.01 M phosphate buffer (pH 7.5) by the Bromusian method.
Load a column (2.2 x 28 cm) packed with 12-diaminododecane prepared by coupling). 2 columns
After thoroughly washing with 0.01M phosphate buffer (pH7.5) containing 0.3M sodium chloride, add 0.01M phosphate buffer (pH7.5) containing 1.0M sodium chloride and 10mM 1,3-diaminopropane. Putrescine oxidase was eluted. The total activity of putrescine oxidase in this eluate was 3,530 units and the specific activity was 1
It was 7.9 units / mg-protein.
この溶出液を限外濾過により脱塩濃縮後、次いで予め
0.01Μの燐酸緩衝液（pH7.5）で平衡化したDEAE−トヨ
パール（商品名：東ソー社製）を充填したカラム（2.2
×28cm）に通した。１の50mMの食塩を含む燐酸緩衝液
（pH7.5）でカラムを洗浄後、食塩濃度が50mMから300mM
である直線濃度勾配（総容量:2）にて吸着された蛋白
質を溶出せしめ、プトレッシンオキシダーゼ活性画分を
回収した。本活性画分中のプトレッシンオキシダーゼの
総活性は3,010ユニット、比活性は50.8ユニット/mg−タ
ンパクであった。This eluate is desalted and concentrated by ultrafiltration, and then beforehand.
Column packed with DEAE-TOYOPEARL (trade name: Tosoh Corporation) equilibrated with 0.01 M phosphate buffer (pH 7.5) (2.2
X 28 cm). After washing the column with phosphate buffer (pH 7.5) containing 50 mM sodium chloride, the salt concentration was 50 mM to 300 mM.
The adsorbed protein was eluted with a linear concentration gradient (total volume: 2), and the putrescine oxidase active fraction was collected. The total activity of putrescine oxidase in this active fraction was 3,010 units and the specific activity was 50.8 units / mg-protein.
この活性画分を限外濾過装置を用いて、脱塩及び濃縮
した後、予め0.1Μの食塩を含有する0.01Μ燐酸緩衝液
（pH7.5）で平衡化したセファクリルＳ−300（商品名：
ファルマシア社製）を充填したカラム（2.2×120cm）に
負荷しゲルを濾過を行った。プトレッシンオキシダーゼ
活性画分を回収し、限外濾過装置にて脱塩、濃縮するこ
とによって精製酵素溶液を得た。この精製酵素溶液中の
プトレッシンオキシダーゼの総活性は2.570ユニット、
比活性は80.2ユニット/mg−タンパクであった。This active fraction was desalted and concentrated by using an ultrafiltration device, and then Sephacryl S-300 (trade name: trade name: equilibrated with 0.01M phosphate buffer (pH7.5) containing 0.1M sodium chloride in advance).
The gel was filtered by loading on a column (2.2 × 120 cm) packed with Pharmacia. The putrescine oxidase active fraction was collected, desalted and concentrated with an ultrafiltration device to obtain a purified enzyme solution. The total activity of putrescine oxidase in this purified enzyme solution is 2.570 units,
The specific activity was 80.2 units / mg-protein.
こうして得られた酵素の純度をSDS存在下、及び非存
在下でのポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって調
べた結果、両者共に一本のバンドのみが観察され、純粋
なプトレッシンオキシダーゼであることが確認された。The purity of the thus obtained enzyme was examined by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence and absence of SDS, and as a result, only one band was observed in both, indicating that it was pure putrescine oxidase. confirmed.
実施例２ 実施例１と同じ組成を有する培地（pH7.0）10mlを大
型チューブに入れ120℃で20分間オートクレーブした
後、30℃下でこの培地にシュードモナス・フルオレッセ
ンスIFO−3925、シュードモナス・シリンゲIFO−1265
5、ミクロコッカス・ルーベンスIFO−3768、ミクロコッ
カス・フラビタス（微工研菌寄第5633号）をそれぞれ一
白金耳植菌した。30℃で24時間振とう培養を行った後、
この培養液の各1mlを予め120℃20分間オートクレーブし
た実施例１と同じ組成を有する培地（pH7.0）の100mlを
仕込んだ500ml坂口フラスコにそれぞれ加え本培養を行
った。18時間後培養物の10mlを遠心分離機にかけて菌体
を採取した。得られた菌体を10mlの0.01Μ隣酸緩衝液に
懸濁し、その懸濁液を超音波破砕処理を行いその破砕液
を遠心分離機を使用して遠心分離し上清液を得た。この
上清液中のプトレッシンオキシダーゼの活性を測定した
結果を第３表に記す。Example 2 10 ml of a medium (pH 7.0) having the same composition as in Example 1 was placed in a large tube and autoclaved at 120 ° C for 20 minutes, and then Pseudomonas fluorescens IFO-3925 and Pseudomonas syringae were added to this medium at 30 ° C. IFO-1265
5. One platinum loop was inoculated with each of Micrococcus rubens IFO-3768 and Micrococcus flavitas (Microtechnology Research Institute No. 5633). After shaking culture at 30 ° C for 24 hours,
Each 1 ml of this culture solution was autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes in advance and added to a 500 ml Sakaguchi flask charged with 100 ml of a medium (pH 7.0) having the same composition as in Example 1 to carry out main culture. After 18 hours, 10 ml of the culture was centrifuged to collect the bacterial cells. The obtained bacterial cells were suspended in 10 ml of 0.01 M phosphate buffer, the suspension was subjected to ultrasonic disruption, and the disrupted liquid was centrifuged using a centrifuge to obtain a supernatant. The results of measuring the activity of putrescine oxidase in this supernatant are shown in Table 3.
比較例１ 実施例２の培地に0.5重量％グルコースを添加した培
地を使用した以外は、実施例２と全く同じ操作を行っ
た。その結果を第４表に示す。 Comparative Example 1 The same operation as in Example 2 was performed except that the medium of Example 2 containing 0.5% by weight glucose was used. Table 4 shows the results.
実施例３ 0.5重量％ポリペプトン、0.5重量％酵母エキス、0.1
重量％食塩、0.02重量％硫酸マグネシウム７水塩からな
る培地（pH7.0）に第５表に示す濃度に誘導基質である
プトレッシンを添加した培地100mlを坂口フラスコに入
れ、120℃20分間オートクレーブした後30℃下でこの培
地にシュードモナス・フルオレッセンスIFO−3925を植
菌した。30℃で18時間振とう培養を行った後、この培養
物の10mlを遠心分離機にかけて菌体を採取した。得られ
た菌体を10mlの0.01Μ燐酸緩衝液に懸濁し、その懸濁液
を超音波破砕処理を行った。その破砕液を遠心分離機を
使用して遠心分離し上清液を得た。この上清液中のプト
レッシンオキシダーゼの活性を測定した結果を第５表に
記す。 Example 3 0.5 wt% polypeptone, 0.5 wt% yeast extract, 0.1
100 ml of a medium (pH 7.0) containing 0.02% by weight sodium sulfate and 0.02% by weight magnesium sulfate heptahydrate and putrescine as an inducing substrate at the concentration shown in Table 5 was placed in a Sakaguchi flask and autoclaved at 120 ° C for 20 minutes. Thereafter, Pseudomonas fluorescens IFO-3925 was inoculated into this medium at 30 ° C. After shaking culture at 30 ° C. for 18 hours, 10 ml of this culture was centrifuged to collect bacterial cells. The obtained bacterial cells were suspended in 10 ml of 0.01M phosphate buffer, and the suspension was subjected to ultrasonic disruption treatment. The disrupted liquid was centrifuged using a centrifuge to obtain a supernatant liquid. The results of measuring the activity of putrescine oxidase in this supernatant are shown in Table 5.
実施例４ 0.5重量％ポリペプトン、0.2重量％酵母エキス、0.2
重量％プトレッシン、0.1重量％食塩からなる培地（pH
7.0）100mlを坂口フラスコに入れ120℃で20分間オート
クレーブした後、30℃下でこの培地にシュードモナス・
フルオレッセンス（IFO−3925）を植菌し、30℃で24時
間振とう培養した。この培養を予め120℃20分間オート
クレーブした0.5重量％ポリペプトン、0.5重量％プトレ
ッシン、0.1重量％食塩、第６表に示すような濃度に酵
母エキスを添加した培地（pH7.0）の各100ml入った500m
l容坂口フラスコにそれぞれ各1.0ml植菌した。各坂口フ
ラスコの30℃で24時間振とう培養を行った後、この培養
物の10mlを遠心分離機にかけて菌体を採取した。得られ
た菌体を10mlの0.01Μ燐酸緩衝液に懸濁、その懸濁液を
超音波破砕処理を行い、その破砕液を遠心分離機を使用
して遠心分離し上清液を得た。この上清液中のプトレッ
シンオキシダーゼの活性を測定した結果を第６表に記
す。 Example 4 0.5 wt% polypeptone, 0.2 wt% yeast extract, 0.2
A medium consisting of wt% putrescine and 0.1 wt% sodium chloride (pH
7.0) 100 ml was placed in a Sakaguchi flask and autoclaved at 120 ° C for 20 minutes, and then Pseudomonas
Fluorescence (IFO-3925) was inoculated and shake-cultured at 30 ° C for 24 hours. This culture was autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes, and contained 100 ml each of 0.5% by weight polypeptone, 0.5% by weight putrescine, 0.1% by weight sodium chloride, and a medium (pH 7.0) containing yeast extract at a concentration shown in Table 6. 500m
1.0 ml of each was inoculated into each Sakaguchi flask. After shaking culture of each Sakaguchi flask at 30 ° C. for 24 hours, 10 ml of this culture was centrifuged to collect bacterial cells. The obtained bacterial cells were suspended in 10 ml of 0.01 M phosphate buffer, the suspension was subjected to ultrasonic disruption treatment, and the disrupted liquid was centrifuged using a centrifuge to obtain a supernatant liquid. The results of measuring the activity of putrescine oxidase in this supernatant are shown in Table 6.
実施例５ 0.5重量％ポリペプトン、0.5重量％酵母エキス、0.5
重量％プトレッシン、0.1重量％食塩、0.02重量％硫酸
マグネシウム７水塩から成る培地（pH7.0）10mlを大型
チューブに入れ、120℃で20分間オートクレーブした後3
0℃下でこの培地にシュードモナス・フルオレッセンスI
FO−3925、ミクロコッカス・ルーベンスIFO−3768をそ
れぞれ一白金耳植菌した。30℃で24時間振とう培養を行
った後、この培養液を予め120℃、20分間オートクレー
ブした上記と同様な組成を有する培地（pH7.0）の100ml
を仕込んだ500ml坂口フラスコに各1.0ml加え、18時間培
養後この培養液を上記と同じ組成を有する培地（pH7.
0）の10を仕込みそしてオートクレーブにて滅菌した2
0ジャーファーメンターに加え、本培養を行った。培
養開始後、第８表に示す各時間にその培養物の30mlをサ
ンプリングし、遠心分離機にかけて菌体を採取した。得
られた菌体を0.01Μ燐酸緩衝液（pH7.5）30mlに懸濁し
その懸濁液に超音波処理を施し、菌体を破砕した。この
破砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し上清液を得
た。この上清掃中のプトレッシンオキシダーゼ活性を測
定した。その結果を第７表に示す。 Example 5 0.5 wt% polypeptone, 0.5 wt% yeast extract, 0.5
Put 10 ml of medium (pH 7.0) consisting of wt% putrescine, 0.1 wt% sodium chloride and 0.02 wt% magnesium sulfate heptahydrate into a large tube and autoclave at 120 ° C for 20 minutes.
Pseudomonas fluorescens I was added to this medium at 0 ℃.
One platinum loop of each of FO-3925 and Micrococcus rubens IFO-3768 was inoculated. After shaking culture at 30 ° C for 24 hours, this culture solution was autoclaved at 120 ° C for 20 minutes in advance, and 100 ml of a medium (pH 7.0) having the same composition as above was prepared.
Each 1.0 ml was added to a 500 ml Sakaguchi flask charged with, and after culturing for 18 hours, this culture solution was added to a medium (pH 7.
0) 10 was charged and sterilized in an autoclave 2
In addition to 0 jar fermenters, main culture was performed. After the start of culture, 30 ml of the culture was sampled at each time shown in Table 8 and centrifuged to collect the bacterial cells. The obtained bacterial cells were suspended in 30 ml of 0.01M phosphate buffer (pH 7.5), and the suspension was subjected to ultrasonic treatment to crush the bacterial cells. The disrupted liquid was centrifuged using a centrifuge to obtain a supernatant liquid. The putrescine oxidase activity during cleaning on this was measured. Table 7 shows the results.
比較例２ 本培養培地中にグルコースを0.5重量％添加した以外
は、実施例５と同じ培地組成からなる培地を使用し、実
施例５と同じ操作を行った。その結果を第８表に示す。 Comparative Example 2 The same operation as in Example 5 was performed using a medium having the same medium composition as in Example 5, except that 0.5% by weight of glucose was added to the main culture medium. Table 8 shows the results.
実施例６ 実施例１で用いた培地に更に第９表に示す炭素源を0.
5重量％添加した組成からなる培地（pH7.0）10mlを大型
チューブに入れ120℃で20分間オートクレーブした後30
℃下でこの培地にシュードモナス・フルオレッセンスを
一白金耳植菌した。30℃で20時間振とう培養後、この培
養液を予め120℃20分間オートクレーブした上記と同様
の組成を有する培地をそれぞれ100ml入れた500ml坂口フ
ラスコに各1.0ml植菌し、30℃下15時間振とう培養し
た。この培養物の10mlを遠心分離機にかけて菌体を採取
した。得られた菌体を10mlの0.01Μ燐酸緩衝液に懸濁
し、その懸濁液を超音波破砕処理を行いその破砕液を遠
心分離機を使用して遠心分離し上清液を得た。この上清
液中のプトレッシンオキシダーゼの活性を測定した結果
を第９表に記す。 Example 6 The carbon source shown in Table 9 was added to the medium used in Example 1 in an amount of 0.
Add 10 ml of medium (pH 7.0) containing 5% by weight to a large tube and autoclave at 120 ° C for 20 minutes.
One platinum loop of Pseudomonas fluorescens was inoculated into this medium at ℃. After shaking culture at 30 ° C for 20 hours, each culture medium was autoclaved at 120 ° C for 20 minutes in advance and inoculated with 1.0 ml of each in a 500 ml Sakaguchi flask containing 100 ml of a medium having the same composition as described above, and at 30 ° C for 15 hours. Shake culture was performed. 10 ml of this culture was centrifuged to collect bacterial cells. The obtained bacterial cells were suspended in 10 ml of 0.01M phosphate buffer, the suspension was subjected to ultrasonic disruption, and the disrupted liquid was centrifuged using a centrifuge to obtain a supernatant. The results of measuring the activity of putrescine oxidase in this supernatant are shown in Table 9.
Claims (1)
属し且つプトレッシンオキシダーゼ産生能を有する菌体
を培養し、培養物からプトレッシンオキシダーゼを採取
するに際し、基質として実質的にグルコースを含まず、
且つ誘導基質を0.2重量％以上の濃度で含有する培地を
使用して該菌体を培養することを特徴とするプトレッシ
ンオキシダーゼの製造方法。1. When culturing bacterial cells belonging to the genus Pseudomonas or the genus Micrococcus and having putrescine oxidase-producing ability, and collecting putrescine oxidase from the culture, it does not substantially contain glucose as a substrate,
A method for producing putrescine oxidase, which comprises culturing the cells using a medium containing an inducing substrate at a concentration of 0.2% by weight or more.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1050017A JP2680666B2 (en) | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Method for producing putrescine oxidase |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02231079A JPH02231079A (en) | 1990-09-13 |
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|---|---|---|---|---|
| WO2007023602A1 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-01 | Kikkoman Corporation | Novel enzyme, method of producing the same and method of producing monoacetylpolyamine by using the enzyme |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5718984A (en) * | 1980-07-09 | 1982-01-30 | Tokuyama Soda Co Ltd | Production of putrescine oxidase |
| JPS6041481A (en) * | 1983-08-17 | 1985-03-05 | Meito Sangyo Kk | Preparation of putrescine oxidase |
| JPS6098982A (en) * | 1983-11-04 | 1985-06-01 | Nagase Seikagaku Kogyo Kk | Preparation of enzyme for measuring polyamine |
-
1989
- 1989-03-03 JP JP1050017A patent/JP2680666B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS5718984A (en) * | 1980-07-09 | 1982-01-30 | Tokuyama Soda Co Ltd | Production of putrescine oxidase |
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| JPS6098982A (en) * | 1983-11-04 | 1985-06-01 | Nagase Seikagaku Kogyo Kk | Preparation of enzyme for measuring polyamine |
Also Published As
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| JPH02231079A (en) | 1990-09-13 |
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