JP3121905B2 - Novel histamine oxidase and its production method - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、アースロバクター属に
属する微生物から採取された新規ヒスタミンオキシダー
ゼ（ヒスタミン酸化酵素 Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｏｋｉ
ｄａｓｅ）及びその製造方法に関するものである。The present invention relates to a novel histamine oxidase (histamine oxidase) obtained from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter.
dase) and a method for producing the same.

【０００２】本発明に係る新規ヒスタミンオキシダーゼ
はヒスタミンの酸化分解能にすぐれており、本発明は、
アレルギー（アレルゲン）診断、魚等の鮮度センサー、
抗ヒスタミン剤等に利用することができる。[0002] The novel histamine oxidase according to the present invention has excellent oxidizing ability of histamine.
Allergy (allergen) diagnosis, fish and other freshness sensors,
It can be used as an antihistamine.

【０００３】[0003]

【従来の技術】ヒスタミンは人体アレルギーと密接な関
係を持つ生体アミンの一つで、アレルギー症状に伴って
生成する。抗ヒスタミン作用を示す化合物はアレルギー
症状に有効である。ヒスタミンは蛋白質の構成アミノ酸
であるヒスチジンから、ある種の細菌の脱炭酸酵素によ
って生成し、鮮度の低い食品中に見いだされる場合があ
る。2. Description of the Related Art Histamine is one of biogenic amines closely related to human allergies, and is produced in association with allergic symptoms. Compounds showing an antihistamine action are effective for allergic symptoms. Histamine is produced from histidine, a constituent amino acid of proteins, by certain types of bacterial decarboxylase, and may be found in foods with low freshness.

【０００４】グルコースオキシダーゼに代表されるオキ
シダーゼ型の酵素は分析用酵素としての有用性が広く知
られている。それは酸素電極をベースとする酵素電極の
構築が容易であること、ペルオキシダーゼと組み合わせ
た簡便な活性測定法が開発されていること、などによる
ものである。[0004] Oxidase-type enzymes such as glucose oxidase are widely known to be useful as analytical enzymes. This is due to the fact that an enzyme electrode based on an oxygen electrode can be easily constructed, and a simple activity measurement method in combination with peroxidase has been developed.

【０００５】本発明は、アースロバクター属細菌由来の
ヒスタミンオキシダーゼに関するものであるが、アミン
を分解する酵素としては、ブタ腎臓由来のジアミンオキ
シダーゼ（ヒスタミナーゼ）の存在は知られているもの
の（Experimentia 38, 906 (1982)）、動物以外の起
源、特にアースロバクター属細菌を起源とし、ヒスタミ
ンを分解する酵素、ヒスタミンオキシダーゼを単離した
という知見は得られていない。The present invention relates to a histamine oxidase derived from a bacterium belonging to the genus Arthrobacter. As an enzyme for decomposing an amine, the presence of a diamine oxidase (histaminase) derived from pig kidney is known (Experimentia 38). , 906 (1982)), and no knowledge has been obtained that histamine oxidase, an enzyme that degrades histamine, has been isolated from non-animal sources, particularly bacteria of the genus Arthrobacter.

【０００６】すなわち、細菌界において生体アミンが分
解される場合、グラム陰性細菌ではポリアミンデヒドロ
ゲナーゼのようなデヒドロゲナーゼの存在は知られてい
るが、コリネバクテリウム型細菌や放線菌等のグラム陽
性細菌ではこのような知見は知られておらず、まして
や、本発明のようにコリネホルム細菌に属するアースロ
バクター属細菌がポリアミンとは異なる構造を有するヒ
スタミン（β−イミダゾールエチルアミン）を特異的に
酸化分解する酵素を生産することは従来全く知られてお
らず、新規な知見である。That is, when biogenic amines are degraded in the bacterial kingdom, the presence of dehydrogenases such as polyamine dehydrogenase is known in Gram-negative bacteria, but this is not the case in Gram-positive bacteria such as corynebacterium-type bacteria and actinomycetes. Such findings are not known, and moreover, as in the present invention, an Arthrobacter bacterium belonging to the coryneform bacterium has an enzyme that specifically oxidatively degrades histamine (β-imidazoleethylamine) having a structure different from polyamine. Production has never been known before and is a new finding.

【０００７】[0007]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒスタミン
分解の重要性に鑑み、ヒスタミンを分解しうる新規酵素
を効率よく製造する技術を開発する目的でなされたもの
である。SUMMARY OF THE INVENTION In view of the importance of histamine degradation, the present invention has been made to develop a technique for efficiently producing a novel enzyme capable of degrading histamine.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】本発明は上記目的を達成
するためになされたものであって、効率的製造法の確立
という面から微生物を利用する方法に着目した。そこ
で、ヒスタミンを窒素炭素源とする培地に生育するコリ
ネホルム細菌の分離を試みたが、その結果生育が認めら
れた菌株はシュードモナス属と思われるグラム陰性細菌
のみであり、ヒスタミン資化性のコリネホルム細菌は分
離することはできなかったし、該シュードモナス属と思
われる細菌のヒスタミン資化性も低く、実用に供するこ
とはできなかった。Means for Solving the Problems The present invention has been made to achieve the above object, and has focused on a method utilizing microorganisms in terms of establishing an efficient production method. Therefore, an attempt was made to isolate coryneform bacteria growing on a medium using histamine as a nitrogen carbon source.As a result, the only strain that was found to grow was a gram-negative bacterium thought to be of the genus Pseudomonas. Could not be separated, and the bacteria considered to be of the genus Pseudomonas had low histamine assimilation, and could not be put to practical use.

【０００９】そこで精力的にスクリーニングを行った結
果、本発明者らが当教室に保存維持している各種コリネ
ホルム細菌についてテストした結果、アースロバクター
・グロビホルミス（Arthrobacter globiformis）ＩＦＯ
１２１３７株がヒスタミンによく生育するという新知
見を得た。本発明は、この有用にして新しい知見に基づ
いてなされたものであって、アースロバクター属起源の
新規酵素ヒスタミンオキシダーゼ及びその製造方法に関
するものである。Therefore, as a result of vigorous screening, the present inventors tested various coryneform bacteria preserved and maintained in our classroom and found that Arthrobacter globiformis IFO
A new finding was obtained that the 12137 strain grows well on histamine. The present invention has been made based on this useful and new finding, and relates to a novel enzyme histamine oxidase derived from the genus Arthrobacter and a method for producing the same.

【００１０】本発明を実施するには、アースロバクター
属に属するヒスタミンオキシダーゼ生産菌を培養する。
ヒスタミンオキシダーゼ生産菌の１例としては、アース
ロバクター・グロビホルミス（Arthrobacter globiform
is）ＩＦＯ １２１３７（ＡＴＣＣ ８０１０）が挙げ
られる。（財）発酵研究所から入手することができる。
このような微生物を、好ましくはヒスタミンを含有した
培地で常法にしたがって通気攪拌培養等により培養した
後、培養物からヒスタミンオキシダーゼを分離、精製す
るのである。In practicing the present invention, a histamine oxidase-producing bacterium belonging to the genus Arthrobacter is cultured.
One example of a histamine oxidase producing bacterium is Arthrobacter globiformis (Arthrobacter globiformis).
is) IFO 12137 (ATCC 8010). It can be obtained from the Fermentation Research Institute.
Such a microorganism is preferably cultured in a medium containing histamine by aeration and agitation cultivation according to a conventional method, and then histamine oxidase is separated from the culture and purified.

【００１１】ヒスタミンオキシダーゼは、菌体及び培養
液の培養物中に分泌されるが、菌体内に生合成蓄積され
る。そこで、培養終了後に菌体を集め、これを緩衝液中
に懸濁させ、超音波処理等によって菌体を破壊する。菌
体破砕物を含む破砕液から細胞壁断片及び不純蛋白質を
除去する。得られた上清をイオン交換樹脂処理して粗酵
素液（部分精製酵素液）を得る。[0011] Histamine oxidase is secreted into the culture of cells and culture solution, but is biosynthesized and accumulated in the cells. Therefore, after completion of the culture, the cells are collected, suspended in a buffer, and destroyed by ultrasonic treatment or the like. Cell wall fragments and impure proteins are removed from the lysate containing the lysate. The obtained supernatant is treated with an ion exchange resin to obtain a crude enzyme solution (partially purified enzyme solution).

【００１２】このようにして得たヒスタミンオキシダー
ゼ粗酵素（ヒスタミンオキシダーゼ部分精製酵素液）に
ついて、次のようにして活性測定及び蛋白質定量を行っ
て、その理化学的性質を確認した。The histamine oxidase crude enzyme (histamine oxidase partially purified enzyme solution) thus obtained was subjected to activity measurement and protein quantification as follows to confirm its physicochemical properties.

【００１３】[0013]

【活性測定】オキシダーゼ活性によって生じた過酸化水
素をペルオキシダーゼ、フェノール、４−アミノアンチ
ピリンの存在下でキノンイミン分子に変換し、これを比
色定量することにより、ヒスタミンオキシダーゼ活性を
測定した。[Activity measurement] Histamine oxidase activity was measured by converting hydrogen peroxide generated by the oxidase activity into quinone imine molecules in the presence of peroxidase, phenol and 4-aminoantipyrine, and colorimetrically determining this.

【００１４】すなわち、ミクロセル中で、１．０Ｍバイ
シンナトリウム緩衝液ｐＨ８．０、０．１ｍｌ（最終濃
度１００ｍＭ）、５ｍＭ ４−アミノアンチピリン０．
１ｍｇ（最終濃度０．５ｍＭ）、２０ｍＭ フェノール
０．１ｍｌ（最終濃度２ｍＭ）、０．５ｍｇ／ｍｌ ペ
ルオキシダーゼ０．０５ｍｌ（比活性１７０ｕｎｉｔｓ
／ｍｇ、２５μｇの蛋白質を含む：ベーリンガーマンハ
イム ｇｒａｄｅ II）、酵素（A．globiformisヒスタ
ミンオキシダーゼ標本、０．０８ｕｎｉｔｓ以内）、及
びイオン交換水で反応液量０．９ｍｌとした。これに１
０ｍＭヒスタミン塩酸塩０．１ｍｌ（最終濃度１ｍＭ）
を加えることにより酵素反応を開始させた（最終液量１
ｍｌ）。５０５ｎｍにおける吸光度の増大を１０秒毎に
モニターしながら２５℃で３分間反応を行った。なお、
反応の停止は、１２．５％トリクロル酢酸を０．２５ｍ
ｌ添加することにより行った。酵素活性は、下記する数
式１により算出した。That is, in a microcell, a 1.0 M sodium bicine buffer, pH 8.0, 0.1 ml (final concentration 100 mM), 5 mM 4-aminoantipyrine 0.
1 mg (final concentration 0.5 mM), 20 mM phenol 0.1 ml (final concentration 2 mM), 0.5 mg / ml peroxidase 0.05 ml (specific activity 170 units
/ Mg, containing 25 μg of protein: Boehringer Mannheim grade II), enzyme (A. globiformis histamine oxidase specimen, within 0.08 units), and ion exchange water to 0.9 ml. This one
0.1 ml of 0 mM histamine hydrochloride (final concentration 1 mM)
To start the enzyme reaction (final solution 1
ml). The reaction was carried out at 25 ° C. for 3 minutes while monitoring the increase in absorbance at 505 nm every 10 seconds. In addition,
The reaction was stopped by adding 12.5% trichloroacetic acid to 0.25 m
1 was added. The enzyme activity was calculated by the following equation 1.

【００１５】[0015]

【数１】 (Equation 1)

【００１６】[0016]

【蛋白質の定量法】蛋白質の定量は、以下に述べる
（１）紫外部吸収法、（２）Ｌｏｗｒｙらの方法によっ
た。[Protein quantification method] The protein was quantified by the following (1) ultraviolet absorption method and (2) the method of Lowry et al.

【００１７】[0017]

【（１）紫外部吸収法】試料の２８０ｎｍにおける吸光
度を測定し、吸光係数をＥ（１％、１ｃｍ）＝１０．０
と仮定し、蛋白濃度を算出した。[(1) Ultraviolet absorption method] The absorbance at 280 nm of a sample was measured, and the extinction coefficient was determined as E (1%, 1 cm) = 10.0.
And the protein concentration was calculated.

【００１８】[0018]

【（２）Ｌｏｗｒｙらの方法】２％（ｗ／ｖ）炭酸ナト
リウムを含む０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液５．０ｍｌ
に、１％（ｗ／ｖ）硫酸銅５水和物溶液と１％（ｗ／
ｖ）酒石酸カリウムナトリウム４水和物溶液との１：１
（体積比）混合液０．１ｍｌと、試料０．５ｍｌ（０．
０５〜０．２５μｇの蛋白質を含む）を加え、３０℃に
１０分間保温した。(2) Method of Lowry et al. 5.0 ml of 0.1 N sodium hydroxide solution containing 2% (w / v) sodium carbonate
In addition, 1% (w / v) copper sulfate pentahydrate solution and 1% (w / v)
v) 1: 1 with potassium sodium tartrate tetrahydrate solution
(Volume ratio) 0.1 ml of the mixture and 0.5 ml of the sample (0.
(Containing 0.5-0.25 μg of protein) and incubated at 30 ° C. for 10 minutes.

【００１９】次に１Ｎフェノール試薬（市販の１．８Ｎ
フェノール試薬をイオン交換水で１Ｎに希釈したもの）
０．５ｍｌを加え、３０℃で３０分間保温した後、６１
０ｎｍにおける吸光度を測定した。ウシ血清アルブミン
溶液を用いて検量線を作成し、吸光度より試料の蛋白濃
度を求めた。Next, a 1N phenol reagent (a commercially available 1.8N phenol reagent)
Phenol reagent diluted to 1N with ion exchanged water)
After adding 0.5 ml and keeping the temperature at 30 ° C. for 30 minutes, 61
The absorbance at 0 nm was measured. A calibration curve was prepared using a bovine serum albumin solution, and the protein concentration of the sample was determined from the absorbance.

【００２０】本発明に係るヒスタミンオキシダーゼ粗酵
素液の理化学的性質は次のとおりである。The physicochemical properties of the crude histamine oxidase enzyme solution according to the present invention are as follows.

【００２１】[0021]

【（１）粗酵素液の最適ｐＨ】酵素反応液中の各緩衝液
（最終濃度１００ｍＭ）のｐＨを４〜１１まで変化させ
て反応液のｐＨと酵素活性との関係を調べて、図１の結
果を得た。この結果から明らかなように、バイシンナト
リウム緩衝液ｐＨ８．０で最も高い活性を示した。[(1) Optimum pH of Crude Enzyme Solution] The relationship between the pH of the reaction solution and the enzyme activity was examined by changing the pH of each buffer solution (final concentration 100 mM) in the enzyme reaction solution from 4 to 11, and FIG. Was obtained. As is evident from the results, the highest activity was exhibited with the bicine sodium buffer solution pH 8.0.

【００２２】[0022]

【（２）粗酵素液の熱安定性】酵素を２０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液ｐＨ７．０中で０℃、３０℃、５０℃、６
０℃、７０℃、８０℃で、それぞれ１０分間保温した
後、残存活性を求め、図２の結果を得た。この結果から
明らかなように、本酵素は６０℃まではほぼ安定である
が、７０℃ではほぼ完全に失活した。[(2) Thermostability of crude enzyme solution] The enzyme was prepared at 0 ° C, 30 ° C, 50 ° C, 6 mM in 20 mM potassium phosphate buffer pH 7.0.
After incubating at 0 ° C., 70 ° C., and 80 ° C. for 10 minutes each, the residual activity was determined, and the results in FIG. 2 were obtained. As is clear from these results, the enzyme was almost stable up to 60 ° C, but was almost completely inactivated at 70 ° C.

【００２３】[0023]

【（３）粗酵素液の安定ｐＨ】酵素をｐＨ４〜１０の各
緩衝液（最終濃度１０ｍＭ）中で６０℃で１０分間保温
した後の残存活性を求めた。リン酸カリウム緩衝液ｐＨ
７．０で最も安定であった。（図３）[(3) Stable pH of Crude Enzyme Solution] The remaining activity of the enzyme after incubation at 60 ° C for 10 minutes in each buffer solution (final concentration 10 mM) at pH 4 to 10 was determined. Potassium phosphate buffer pH
It was most stable at 7.0. (Fig. 3)

【００２４】[0024]

【（４）粗酵素液のミカエリス定数】ヒスタミンの最終
濃度０．００１〜１．０ｍＭの範囲で酵素反応を行なわ
せて、基質濃度と反応速度の関係をLineweaver-Burkの
方法により作図した。ヒスタミンに対するミカエリス定
数は０．０３８ｍＭ、また基質濃度が１．０ｍＭ以上に
なるとヒスタミンによる基質阻害がおきると思われる
（図４）。なお、図４において、速度は、粗酵素液１ｍ
ｌ当りの活性として、１／速度をプロットした。[(4) Michaelis Constant of Crude Enzyme Solution] The enzyme reaction was carried out in the final histamine concentration range of 0.001 to 1.0 mM, and the relationship between the substrate concentration and the reaction rate was plotted by the Lineweaver-Burk method. The Michaelis constant for histamine is 0.038 mM, and when the substrate concentration is 1.0 mM or more, histamine seems to inhibit the substrate (FIG. 4). In FIG. 4, the speed was 1 m of the crude enzyme solution.
1 / rate was plotted as activity per liter.

【００２５】[0025]

【（５）粗酵素の基質特異性】本酵素の各種アミンに対
する分解活性を調べて、下記表２の結果を得た。なお、
基質は、いずれも酵素反応液中最終濃度１ｍＭとして行
った。[(5) Substrate Specificity of Crude Enzyme] The activity of the enzyme for decomposing various amines was examined, and the results shown in Table 2 below were obtained. In addition,
All substrates were used at a final concentration of 1 mM in the enzyme reaction solution.

【００２６】[0026]

【表２】 [Table 2]

【００２７】[0027]

【（６）安定化剤の検討】酵素溶液に安定化効果が期待
される各試薬を加え、６５℃で１０分間保温し、酵素の
残存活性を求め、図５の結果を得た。なお、ＥＤＴＡに
ついては、更に濃度を変えて実験を行い、図６の結果を
得た。(6) Investigation of stabilizing agent Each reagent expected to have a stabilizing effect was added to the enzyme solution, and the mixture was kept at 65 ° C. for 10 minutes to determine the residual activity of the enzyme. In addition, about EDTA, the experiment was performed by further changing the concentration, and the result of FIG. 6 was obtained.

【００２８】このようにして調製した粗酵素液を、常法
にしたがって、硫安分画、各種のクロマトグラフィー処
理等既知の精製処理を必要あればくり返し実施すること
により、精製することができる。なお精製した酵素の理
化学的性質は、以下の実施例において述べることとす
る。The crude enzyme solution thus prepared can be purified by repeating known purification processes such as ammonium sulfate fractionation and various chromatographic treatments, if necessary, in a conventional manner. The physicochemical properties of the purified enzyme will be described in the following examples.

【００２９】本発明に係る新規ヒスタミンオキシダーゼ
は、特異性が高いだけでなく、ヒスタミンを酸化分解す
る活性も非常にすぐれているので、分析用試薬、アレル
ギー（アレルゲン）診断）、魚等の鮮度センサー、抗ヒ
スタミン剤、抗アレルギー剤等各種の有用な用途に利用
することができる。The novel histamine oxidase according to the present invention not only has high specificity, but also has a very excellent activity of oxidatively decomposing histamine. Therefore, a freshness sensor for analytical reagents, diagnosis of allergy (allergen), fish, etc. It can be used for various useful applications such as antihistamines and antiallergic agents.

【００３０】以下、本発明の実施例について述べる。Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.

【００３１】[0031]

【実施例１】アースロバクター・グロビホルミス（Arth
robacter globiformis）ＩＦＯ １２１３７株を、ペプ
トン（０．０５％）及びグリセロール（０．５％）を主
成分とする液体培地で前培養した。得られた前培養物を
ヒスタミン培地（ヒスタミン二塩酸塩０．１％、リン酸
−水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水塩０．
０１％、酵母エキス０．０５％、ｐＨ７．０）１．５リ
ットルに加え、３０℃で通気攪拌培養した。静止期に達
した時点で、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）を用いて菌体を回収し、菌体を−２０℃に貯蔵し
た。[Example 1] Arthrobacter globiholmis (Arth
robacter globiformis) IFO 12137 strain was precultured in a liquid medium containing peptone (0.05%) and glycerol (0.5%) as main components. The obtained preculture was cultured in a histamine medium (histamine dihydrochloride 0.1%, potassium hydrogen phosphate 0.2%, magnesium sulfate heptahydrate 0.1%).
(01%, yeast extract 0.05%, pH 7.0) 1.5 liters, and cultured at 30 ° C. with aeration and stirring. When the stationary phase is reached, 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.
The cells were collected using 0), and the cells were stored at -20 ° C.

【００３２】菌体を解凍し、これを５０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、冷却しながら５
分間超音波処理した。遠心分離し、得られたペレットを
上記緩衝液に再懸濁し、再度１０分間超音波処理した。
上清を合せ、これにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
６０００を加えて室温で２０分間攪拌した後、遠心分離
し、上清を再度ＰＥＧ６０００処理して、蛋白質を沈殿
せしめた。沈殿した蛋白質を遠心分離して除去した。The cells were thawed, suspended in a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and cooled with cooling.
Sonicated for minutes. After centrifugation, the resulting pellet was resuspended in the above buffer and sonicated again for 10 minutes.
Combine the supernatant and add polyethylene glycol (PEG)
After adding 6000 and stirring at room temperature for 20 minutes, the mixture was centrifuged, and the supernatant was again treated with PEG6000 to precipitate the protein. The precipitated protein was removed by centrifugation.

【００３３】得られた上清に５０ｍＭリン酸カリウム溶
液（ｐＨ７．０）及びＤＥＡＥ-Sepharoseを加えて１時
間攪拌した後、遠心分離によりイオン交換樹脂を除去
し、沈殿を再度上記緩衝液に懸濁した。この懸濁スラリ
ーを上記イオン交換樹脂カラムに充填した後、０．５Ｍ
リン酸カリウム（ｐＨ７．０）を用い、流速１００ｍｌ
／ｈで酵素を溶出せしめた。溶出してきた酵素を該緩衝
液で透析した後、残留溶液を加圧濾過して濃縮し、粗酵
素（液）を得た。After adding 50 mM potassium phosphate solution (pH 7.0) and DEAE-Sepharose to the obtained supernatant and stirring for 1 hour, the ion exchange resin was removed by centrifugation, and the precipitate was suspended in the above buffer again. It became cloudy. After filling this suspension slurry into the ion exchange resin column, 0.5M
Using potassium phosphate (pH 7.0), flow rate 100 ml
/ H to elute the enzyme. After the eluted enzyme was dialyzed against the buffer, the remaining solution was filtered under pressure and concentrated to obtain a crude enzyme (liquid).

【００３４】[0034]

【実施例２】実施例１で得た粗酵素について、以下に示
す方法により精製処理を行った。Example 2 The crude enzyme obtained in Example 1 was purified by the following method.

【００３５】[0035]

【（１）硫安分別】実施例１で得た粗酵素に蛋白質濃度
１０ｍｇ／ｍｌになるように２０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液ｐＨ７．０を加え、これに２Ｎアンモニア溶液でｐ
Ｈを７．０に保ちながら、５０％飽和になるように硫安
を徐々に加え、すべて加え終ったところからさらに１時
間攪拌した後、遠心分離を行い、沈殿を集め、これを少
量の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に溶か
し、同緩衝液約２リットルにて３回（計１０時間）透析
を行った。透析終了後、再び遠心分離し、沈殿を除去し
た。上清はヒスタミンオキシダーゼ活性１４．７ｕｎｉ
ｔｓ、蛋白質１９１０ｍｇ、を含んでいた。（ローリー
らの方法）[(1) Ammonium sulfate fractionation] A 20 mM potassium phosphate buffer pH 7.0 was added to the crude enzyme obtained in Example 1 so that the protein concentration became 10 mg / ml, and the mixture was added with 2N ammonia solution.
While maintaining the H at 7.0, ammonium sulfate was gradually added to 50% saturation, and after the addition was completed, the mixture was further stirred for 1 hour, centrifuged, and the precipitate was collected. It was dissolved in a potassium phosphate buffer pH 7.0, and dialyzed three times (total of 10 hours) with about 2 liters of the same buffer. After completion of the dialysis, the mixture was centrifuged again to remove the precipitate. The supernatant has a histamine oxidase activity of 14.7 uni.
ts, 1910 mg of protein. (Laurey's method)

【００３６】[0036]

【（２）１回目ＤＥＡＥ−Toyopearl ６５０Ｍカラム
クロマトグラフィー】上記で得た硫安分別後の酵素液を
予じめ基本緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ-Toyopearl ６
５０Ｍカラム（径３．１×２６．５ｃｍ、ゲル容量２０
０ｃｍ³）にのせ、０．０５Ｍ塩化カリウムを含む２０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、１０００ｍｌに
て非吸着蛋白質を除去した。次に０．０５Ｍ塩化カリウ
ムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、１
０００ｍｌを混合槽に、０．４Ｍ塩化カリウムを含む２
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液１０００ｍｌを補給槽に入
れ、塩化カリウム濃度による直線濃度勾配法で酵素を１
７ｍｌ／ｃｍ²／ｈｒの流速で溶出させた。フラクショ
ンコレクターで約１５ｍｌ程度ずつ分取し、これらの中
から活性のあるフラクションを集め、これを１回目ＤＥ
ＡＥ-Toyopearl６５０Ｍカラムクロマトグラフィー後の
サンプルとした。このサンプルは、ヒスタミンオキシダ
ーゼ活性１２ ｕｎｉｔｓ、蛋白質２９４ｍｇを含んで
いた。[(2) First DEAE-Toyopearl 650M column chromatography] The DEAE-Toyopearl 6 obtained by preliminarily equilibrating the enzyme solution obtained above after the ammonium sulfate fractionation with a basic buffer solution.
50M column (3.1 × 26.5 cm in diameter, gel capacity 20
0 cm ³ ) and containing 0.05 M potassium chloride
Unadsorbed proteins were removed with 1000 ml of mM potassium phosphate buffer pH 7.0. Next, 20 mM potassium phosphate buffer containing 0.05 M potassium chloride, pH 7.0, 1
2,000 ml in a mixing tank containing 0.4 M potassium chloride
1000 ml of 0 mM potassium phosphate buffer was placed in the replenishing tank, and the enzyme was subjected to a linear concentration gradient method using potassium chloride concentration.
Elution was performed at a flow rate of 7 ml / cm ² / hr. Approximately 15 ml was collected by a fraction collector, and active fractions were collected from these fractions.
The sample was subjected to AE-Toyopearl 650M column chromatography. This sample contained 12 units of histamine oxidase activity and 294 mg of protein.

【００３７】[0037]

【（３）２回目ＤＥＡＥ-Toyopearl ６５０Ｍカラムク
ロマトグラフィー】上記で得た１回目ＤＥＡＥ-Toyopea
rl ６５０Ｍカラムクロマトグラフィー後の酵素をあら
かじめ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で平衡
化したＤＥＡＥ-Toyopearl ６５０Ｍカラム（径１．４
６ｃｍ×２４ｃｍ、ゲル容量４０ｃｍ³）にのせ、０．
０５Ｍ塩化カリウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液ｐＨ７．０、２００ｍｌにて非吸着蛋白質を除去し
た。次に０．１５Ｍ塩化カリウムを含む２０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液ｐＨ７．０、２００ｍｌ、０．２５Ｍ塩
化カリウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ
７．０、２００ｍｌで２段階に塩化カリウム濃度を上
げ、流速１７ｍｌ／ｃｍ²／ｈｒで溶出させた。フラク
ションコレクターで３ｍｌずつ分取し、活性の高いフラ
クション７２〜７５を集めた。この酵素液はヒスタミン
オキシダーゼ活性８．７５ ｕｎｉｔｓ、蛋白質３８．
４ｍｇを含んでいた。（図７）[(3) Second DEAE-Toyopearl 650M column chromatography] First DEAE-Toyopea obtained above
rl 650 M column chromatography A DEAE-Toyopearl 650 M column (1.4 in diameter) in which the enzyme after chromatography was previously equilibrated with 20 mM potassium phosphate buffer pH 7.0.
6 cm × 24 cm, gel volume 40 cm ³ ).
Unadsorbed proteins were removed with 200 ml of 20 mM potassium phosphate buffer pH 7.0 containing 05 M potassium chloride. Next, 200 ml of 20 mM potassium phosphate buffer containing 0.15 M potassium chloride, pH 7.0, 200 mM potassium phosphate buffer containing 0.25 M potassium chloride, pH
The concentration of potassium chloride was increased in two steps at 7.0 and 200 ml, and eluted at a flow rate of 17 ml / cm ² / hr. Fractions of 3 ml were collected by a fraction collector to collect highly active fractions 72 to 75. This enzyme solution had a histamine oxidase activity of 8.75 units and a protein of 38.
4 mg. (FIG. 7)

【００３８】[0038]

【（４）Butyl-Toyopearl ６５０Ｍカラムクロマトグ
ラフィー】上記で得た２回目ＤＥＡＥ-Toyopearl ６５
０Ｍ後の酵素を、あらかじめ１．２Ｍ硫安を含む２０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したButyl-
Toyopearl ６５０Ｍカラム（径１．４６ｃｍ×２４ｃ
ｍ、ゲル容量４０ｃｍ³）にのせ、１．２Ｍ硫安を含む
２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、２００ｍｌ
で非吸着蛋白質を洗浄し、混合槽に１．２Ｍ硫安を含む
２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、２００ｍ
ｌ、補給槽に２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．
０、２００ｍｌを硫安濃度による逆直線濃度勾配法によ
り酵素を１７ｍｌ／ｃｍ²／ｈｒの流速で溶出させた。
次いで、溶出液をフラクションコレクターにより、３．
５ｍｌずつ分取した。（図８）活性の高いフラクション
３１〜３６を集めた。この酵素液は活性４．４ ｕｎｉ
ｔｓ、蛋白質３．９ｍｇを含んでいた。[(4) Butyl-Toyopearl 650M column chromatography] The second DEAE-Toyopearl 65 obtained above
The enzyme after 0M was added to 20m containing 1.2M ammonium sulfate in advance.
Butyl- equilibrated with M potassium phosphate buffer pH 7.0
Toyopearl 650M column (diameter 1.46cm x 24c)
m, gel volume 40 cm ³ ), 20 mM potassium phosphate buffer pH 7.0 containing 1.2 M ammonium sulfate, 200 ml
The non-adsorbed protein is washed with a 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0, 200 m) containing 1.2 M ammonium sulfate in the mixing tank.
l, 20 mM potassium phosphate buffer pH7.
0 and 200 ml of the enzyme were eluted at a flow rate of 17 ml / cm ² / hr by the inverse linear concentration gradient method based on ammonium sulfate concentration.
Next, the eluate was collected by a fraction collector.
Aliquots of 5 ml were taken. (FIG. 8) Fractions 31 to 36 having high activity were collected. This enzyme solution has an activity of 4.4 uni.
ts, containing 3.9 mg of protein.

【００３９】[0039]

【（５）Toyopearl ＨＷ５５Ｆカラムクロ
マトグラフィー（ゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ー）】上記で得たButyl-Toyopearl ６５０Ｍカラムク
ロマトグラフィー後の酵素液をアミコン限外濾過器、及
びコロジオンパックにより約１ｍｌにまで濃縮した。２
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７によりあらかじめ平
衡化したToyopearl ＨＷ５５Ｆカラム（径１．０×１２
８ｃｍ、１００ｍｌ）に酵素液をのせ、同緩衝液で酵素
を溶出した。流速は４．５ｍｌ／ｃｍ²／ｈｒであっ
た。溶出液をフラクションコレクターにより１ｍｌずつ
分取し、活性の高いフラクションをそのままフラクショ
ンごとに保存した。（図９）[(5) Toyopearl HW55F column chromatography (gel filtration column chromatography)] The enzyme solution obtained above from the Butyl-Toyopearl 650M column chromatography was concentrated to about 1 ml using an Amicon ultrafilter and a collodion pack. 2
Toyopearl HW55F column (diameter 1.0 × 12) pre-equilibrated with 0 mM potassium phosphate buffer pH7
(8 cm, 100 ml), and the enzyme was eluted with the same buffer. The flow rate was 4.5 ml / cm ² / hr. The eluate was fractionated by 1 ml by a fraction collector, and fractions with high activity were stored as they were for each fraction. (FIG. 9)

【００４０】[0040]

【（６）ヒスタミンオキシダーゼの純度検定】上記で得
たToyopearl ＨＷ５５Ｆカラムクロマトグラフィー後の
保存フラクション６４、６５、６６、６７の精製酵素標
品について、ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動
による純度検定及びオキシダーゼ活性染色を行った。そ
の結果、フラクション６５、６６、６７はほぼ単一バン
ドを示し、ディスク電気泳動的にほぼ均一であることが
わかった。活性染色により、ゲル上に茶色のバンドが出
現し、蛋白質染色バンドの位置とほぼ一致した。[(6) Purity assay of histamine oxidase] Purity assay by polyacrylamide gel disk electrophoresis and oxidase activity staining of the purified enzyme preparations of the preserved fractions 64, 65, 66, and 67 obtained after the Toyopearl HW55F column chromatography obtained above. Was done. As a result, it was found that the fractions 65, 66, and 67 showed almost a single band, and were almost uniform by disc electrophoresis. By the activity staining, a brown band appeared on the gel, which almost coincided with the position of the protein staining band.

【００４１】得られた結果を下記表３に示す。なお、蛋
白質染色液及びオキシダーゼ活性染色液は、次のように
して調製した。The results obtained are shown in Table 3 below. The protein staining solution and the oxidase activity staining solution were prepared as follows.

【００４２】[0042]

【表３】 [Table 3]

【００４３】[0043]

【蛋白質染色液】０．２５％（ｗ／ｖ）クーマシーブリ
リアントブルーＧ２５０／１．４％過塩素酸染色液にゲ
ルを浸し、３７℃で２時間染色した後、５％（ｗ／ｖ）
酢酸で脱色した。[Protein staining solution] The gel was immersed in 0.25% (w / v) Coomassie brilliant blue G250 / 1.4% perchloric acid staining solution, stained at 37 ° C for 2 hours, and then 5% (w / v).
Decolorized with acetic acid.

【００４４】[0044]

【オキシダーゼ活性染色液】１Ｍリン酸カリウム緩衝液
ｐＨ７．０／ｍｌ、３．７５ｍｇ／ｍｌジアミノベンシ
ジン・４塩酸塩／０．２５Ｍ酢酸ナトリウム、４ｍｌ、
０．５ｍｇ／ｍｌペルオキシダーゼ１ｍｌ、１０ｍＭヒ
スタミン・二塩酸塩、１ｍｌ、イオン交換水３ｍｌを混
合したものを活性染色液とした。上記の染色液にゲルを
浸し、３０℃で１時間染色した。[Oxidase activity staining solution] 1 M potassium phosphate buffer pH 7.0 / ml, 3.75 mg / ml diaminobensidine tetrahydrochloride / 0.25 M sodium acetate, 4 ml,
A mixture of 1 ml of 0.5 mg / ml peroxidase, 1 ml of 10 mM histamine dihydrochloride, and 3 ml of ion-exchanged water was used as an activity staining solution. The gel was immersed in the above staining solution and stained at 30 ° C. for 1 hour.

【００４５】上記した各種精製処理の結果を、まとめて
下記表４に示した。すなわち、表４は、培養したA. glo
biformis菌体１６８ｇを超音波処理、硫安分画処理した
後、二等分し、一方を電気泳動にかけ、他方を液体クロ
マトグラフィーによる精製にもちこんだ。下記表４は、
後者の結果をまとめて示したものである。The results of the various purification processes described above are shown in Table 4 below. That is, Table 4 shows that the cultured A. glo
After 168 g of the Biformis cells were subjected to ultrasonic treatment and ammonium sulfate fractionation, they were bisected, one was subjected to electrophoresis, and the other was subjected to purification by liquid chromatography. Table 4 below shows
The latter result is shown together.

【００４６】[0046]

【表４】 [Table 4]

【００４７】[0047]

【（７）精製酵素の理化学的性質】上記で精製した精製
酵素について、以下により分子量測定、サブユニットの
分子量測定、基質特異性の検討を行った。[(7) Physicochemical properties of purified enzyme] The purified enzyme purified above was subjected to measurement of molecular weight, measurement of molecular weight of subunits, and examination of substrate specificity as follows.

【００４８】[0048]

【ｉ）精製酵素の分子量測定】酵素の分子量をＴＳＫゲ
ルＧ３０００ＳＷカラムを用いる高速液体クロマトグラ
フィーにより測定した。標準蛋白質（分子量既知）のク
ロマトグラム上の溶出時間（分）を分子量の対数に対し
プロットした検量線を作成し、この検量線を用いて本酵
素の分子量を求めた（図１０）。ＲＴ値７．９３より、
本酵素の分子量は７３，０００と求められた。[I) Measurement of molecular weight of purified enzyme] The molecular weight of the enzyme was measured by high performance liquid chromatography using a TSK gel G3000SW column. A calibration curve was prepared by plotting the elution time (min) on the chromatogram of the standard protein (of known molecular weight) against the logarithm of the molecular weight, and the molecular weight of the present enzyme was determined using this calibration curve (FIG. 10). From RT value 7.93,
The molecular weight of this enzyme was determined to be 73,000.

【００４９】[0049]

【ii）精製酵素のサブユニット分子量の測定】ＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動法により本酵素のサブユニ
ット分子量を求めた。分離ゲルは９％濃縮ゲルは３％を
用いた。分子量マーカーとして馬心筋チトクロームＣ
（モノマー分子量１２，０００）を架橋したものを使用
した。標準蛋白質のＢＰＢに対する相対移動度（Ｒｍ
値）を測定し、蛋白質の分子量の対数に対してプロット
した検量線を作成し、この検量線より本酵素のサブユニ
ット分子量を求めた（図１１）。Ｒｍ値０．１１８よ
り、本酵素のサブユニット分子量は７９５００と求めら
れた。[Ii) Measurement of subunit molecular weight of purified enzyme] SDS-
The subunit molecular weight of this enzyme was determined by polyacrylamide electrophoresis. The separation gel used was 9% and the concentrated gel was 3%. Horse cardiac cytochrome C as a molecular weight marker
(Monomer molecular weight 12,000) was used. Relative mobility of standard protein to BPB (Rm
Value) was measured, and a calibration curve plotted against the logarithm of the molecular weight of the protein was prepared. From this calibration curve, the molecular weight of the subunit of the present enzyme was determined (FIG. 11). From the Rm value of 0.118, the subunit molecular weight of this enzyme was determined to be 79,500.

【００５０】[0050]

【iii）精製酵素の基質特異性】精製酵素の各種アミン
に対する分解活性を調べ、下記表５の結果を得た。測定
方法は粗酵素液の基質特異性の実験とすべて同じとし
た。[Iii] Substrate specificity of purified enzyme] The activity of the purified enzyme for decomposing various amines was examined, and the results shown in Table 5 below were obtained. The measurement method was the same as that used in the experiment for the substrate specificity of the crude enzyme solution.

【００５１】[0051]

【表５】 [Table 5]

【００５２】[0052]

【発明の効果】本発明によりはじめてアースロバクター
属細菌より新しいヒスタミンオキシダーゼを製造するの
に成功した。この新規酵素は、分析用試薬、アレルギー
（アレルゲン）診断薬、魚等の鮮度センサー、抗ヒスタ
ミン剤等に利用することができる。According to the present invention, a new histamine oxidase has been successfully produced for the first time from a bacterium belonging to the genus Arthrobacter. This novel enzyme can be used as an analytical reagent, a diagnostic agent for allergy (allergen), a freshness sensor for fish and the like, an antihistamine, and the like.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】酵素活性とｐＨとの関係を示す。FIG. 1 shows the relationship between enzyme activity and pH.

【図２】残存酵素活性と温度との関係を示す。FIG. 2 shows the relationship between residual enzyme activity and temperature.

【図３】酵素の安定ｐＨ域を示す。FIG. 3 shows a stable pH range of an enzyme.

【図４】基質濃度（ヒスタミン）と本酵素の反応速度と
の関係を示す。FIG. 4 shows the relationship between the substrate concentration (histamine) and the reaction rate of the present enzyme.

【図５】残存酵素活性と安定化剤との関係を示す。FIG. 5 shows the relationship between residual enzyme activity and stabilizer.

【図６】残存酵素活性と安定化剤（ＥＤＴＡ）との関係
を示す。FIG. 6 shows the relationship between residual enzyme activity and stabilizer (EDTA).

【図７】本酵素の２回目ＤＥＡＥ-Toyopearl ６５０Ｍ
カラムクロマトグラムである。FIG. 7: Second DEAE-Toyopearl 650M of this enzyme
It is a column chromatogram.

【図８】本酵素のButyl-Toyopearl ６５０Ｍカラムク
ロマトグラムである。FIG. 8 is a Butyl-Toyopearl 650M column chromatogram of the present enzyme.

【図９】本酵素のToyopearl ＨＷ５５Ｆカラムクロマ
トグラム（ゲル濾過カラムクロマトグラム）である。FIG. 9 is a Toyopearl HW55F column chromatogram (gel filtration column chromatogram) of the present enzyme.

【図１０】本酵素の分子量測定図である。FIG. 10 is a diagram for measuring the molecular weight of the present enzyme.

【図１１】本酵素のサブユニット分子量の測定図であ
る。FIG. 11 is a diagram showing the measurement of the molecular weight of the subunit of the present enzyme.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

（１）Ｎａ−Ａｃｅｔａｔｅ：ナトリウム酢酸緩衝液 （２）Ｋ−ＰＯ₄ ：リン酸カリウム緩衝液 （３）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ：トリス塩酸緩衝液 （４）Ｂｉｃｉｎｅ−Ｎａ ：バイシンナトリウム緩衝
液 （５）Ｎａ−ＣＯ₃ ：ナトリウム炭酸緩衝液(1) Na-Acetate: sodium acetate buffer (2) K-PO ₄ : potassium phosphate buffer (3) Tris-HCl: Tris-HCl buffer (4) Bicine-Na: bicine sodium buffer (5) Na -CO ₃ : sodium carbonate buffer

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (58) Fields surveyed (Int. Cl. ⁷ , DB name) C12N 9/00-9/99 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 下記に示す理化学的性質を有するヒスタ
ミンオキシダーゼ。 ヒスタミンオキシダーゼの理化学的性質 （１）作用 ヒスタミンを酸化分解する。 （２）基質特異性 ヒスタミンを分解するが、ベンジルアミン、フェニルプ
ロピルアミン、プトレッシン、カダベリン、へプタメチ
レンジアミン、メチルアミン、エチルアミン、ブチルア
ミン、ヒスチジンは分解しない。 （３）至適及び安定ｐＨ範囲（粗酵素液） 至適ｐＨ：８．０（バイシンナトリウム緩衝液） 安定ｐＨ：７．０（リン酸カリウム緩衝液） （４）分子量 ７３，０００（ＴＳＫゲルＧ3000ＳＷカラムを用いる高
速液体クロマトグラフィーによる）1. A histamine oxidase having the following physicochemical properties. Physicochemical properties of histamine oxidase (1) Action Oxidative degradation of histamine. (2) Substrate specificity Histamine is decomposed, but benzylamine, phenylpropylamine, putrescine, cadaverine, heptamethylenediamine, methylamine, ethylamine, butylamine, and histidine are not decomposed. (3) Optimum and stable pH range (crude enzyme solution) Optimum pH: 8.0 (baicin sodium buffer) Stable pH: 7.0 (potassium phosphate buffer) (4) Molecular weight 73,000 (TSK gel) High performance liquid chromatography using G3000SW column) 【請求項２】 アースロバクター属に属するヒスタミン
オキシダーゼ生産菌を培地に培養して下記に示す理化学
的性質を有するヒスタミンオキシダーゼを生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とするヒスタミンオキシ
ダーゼの製造方法。 ヒスタミンオキシダーゼの理化学的性質 （１）作用 ヒスタミンを酸化分解する。 （２）基質特異性 ヒスタミンを分解するが、ベンジルアミン、フェニルプ
ロピルアミン、プトレッシン、カダベリン、へプタメチ
レンジアミン、メチルアミン、エチルアミン、ブチルア
ミン、ヒスチジンは分解しない。 （３）至適及び安定ｐＨ範囲（粗酵素液） 至適ｐＨ：８．０（バイシンナトリウム緩衝液） 安定ｐＨ：７．０（リン酸カリウム緩衝液） （４）分子量 ７３，０００（ＴＳＫゲルＧ3000ＳＷカラムを用いる高
速液体クロマトグラフィーによる）2. A method for producing histamine oxidase, comprising culturing a histamine oxidase-producing bacterium belonging to the genus Arthrobacter in a medium to produce and accumulate histamine oxidase having the following physicochemical properties, and collecting the histamine oxidase. . Physicochemical properties of histamine oxidase (1) Action Oxidative degradation of histamine. (2) Substrate specificity Histamine is decomposed, but benzylamine, phenylpropylamine, putrescine, cadaverine, heptamethylenediamine, methylamine, ethylamine, butylamine, and histidine are not decomposed. (3) Optimum and stable pH range (crude enzyme solution) Optimum pH: 8.0 (baicin sodium buffer) Stable pH: 7.0 (potassium phosphate buffer) (4) Molecular weight 73,000 (TSK gel) High performance liquid chromatography using G3000SW column) 【請求項３】 アースロバクター属に属するヒスタミン
オキシダーゼ生産菌をヒスタミン含有培地で培養するこ
とを特徴とする請求項２に記載のヒスタミンオキシダー
ゼの製造方法。3. The method for producing histamine oxidase according to claim 2, wherein a histamine oxidase-producing bacterium belonging to the genus Arthrobacter is cultured in a histamine-containing medium. 【請求項４】 アースロバクター属に属するヒスタミン
オキシダーゼ生産菌がアースロバクター・グロビホルミ
スであることを特徴とする請求項２又は請求項３に記載
のヒスタミンオキシダーゼの製造方法。4. The method for producing histamine oxidase according to claim 2, wherein the histamine oxidase-producing bacterium belonging to the genus Arthrobacter is Arthrobacter gloviformis.