JP3694335B2 - Thermostable O-acetylserine sulfhydrylase and process for producing the same - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ、該酵素の製造方法、該酵素を産生するバチルス属に属する新規細菌株、該酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ活性は、一部の植物および微生物由来のものが知られており、例えば、ホウレンソウ由来（エフ・イケガミ（F.Ikegami）ら，フィトケミストリー（Phytochemistry），第２７巻，３３８５〜３３８９頁（１９８１年）、あるいはクロモバクテリウム（Chromobacterium）属細菌由来（エム・アン（M.Anne）およびジェー・ケイ・クリストファー（J.K.Christopher）、ビオキミア・エト・ビオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta），第７８６巻，１２３〜１３２頁（１９８４年）のもの等が精製され、性質が調べられている。
【０００３】
本酵素反応生成物β−シアノアラニンは、生物学的活性を有する種々のアミノ酸誘導体の合成中間体として有用であるが、これまで報告されてきたＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼはいずれも不安定で、特に熱安定性が低く、かかる有用物質の製造には適さなかった。従って、熱安定性の高いＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの検索が急務とされていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記状況の下、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、熱安定性が非常に高いＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを産生する耐熱性のバチルス属に属する細菌を見いだし、該細菌から耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離することに成功して本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１） 次の性質を有する耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ；
１．作用：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとシアン化物からβ−シアノアラニンを生成する
２．至適ｐＨ：７．０〜９．０
３．安定ｐＨ：６．０〜１０．０
４．至適温度：４０〜５０℃
５．熱安定性：ｐＨ７．５において３０分保持した場合、７０℃まで安定
６．分子量：ゲル濾過にて６０，０００〜８０，０００、
（２） 補酵素としてピリドリサルリン酸を要求する（１）記載の酵素、
（３） Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ホスホリル−Ｌ−セリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−セリンまたはβ−クロロ−Ｌ−アラニンを基質とする（１）記載の酵素、特に、
（４） 好温性のバチルス（Bacillus）属に属する細菌から得られる（１）ないし（３）いずれかに記載の酵素、
（５） 該細菌がバチルス・ステアロサーモフィルス（B.stearothermophilus）である（４）記載の酵素、
（６） 該細菌が工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株である（４）記載の酵素
を提供するものである。
【０００６】
また、本発明は、
（７） 請求項１記載のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの産生能を有する好温性のバチルス属に属する細菌をＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ誘導培地で培養し、ついで、該菌体から該Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離することを特徴とするＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの製造法、特に、
（８） 該Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ産生能を有する好温性のバチルス属に属する細菌がバチルス・ステアロサーモフィルスである（７）記載の方法、
（９） 該好温性のバチルス属に属する該Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの産生能を有する細菌が、工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株である（７）記載の方法を提供するものである。
【０００７】
さらに、本発明は、
（１０） 工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株
を提供するものである。
【０００８】
以下、さらに詳しく本発明を説明する。
本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼは、耐熱性のバチルス属に属するＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ産生能を有する細菌を培養することによって得ることができるが、該菌株の具体例としては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）ＣＮ３株等が挙げられる。バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株は、本発明者らが天然より単離したものであって、平成６年８月８日に工業技術院生命工学技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７３として寄託されている。この細菌の菌学的性質は以下の通りである。
【０００９】
（ａ）形態
１．細菌の形態：細い桿菌
２．運動性：−
３．胞子：＋（楕円形）
４．グラム染色性：−
【００１０】
（ｂ）コロニー形態：７２時間培養で５ｍｍ以下の円形で、不規則、淡黄色半透明、表面は滑らかで平坦
【００１１】
（ｃ）生理学的性質
１．生育：３７℃では生育せず、４５℃、５５℃および６７℃で生育
２．細胞内小球体：−
３．リトマスミルク：分解
４．３％ＮａＣｌでの生育：−
５．５％ＮａＣｌでの生育：−
６．７％ＮａＣｌでの生育：−
７．ｐＨ５．７での生育：−
８．グルコースからの酸生成：＋
９．グルコースからのガス生成：−
１０．卵黄反応：試験条件下で生育せず
１１．カゼイン分解：＋
１２．ゼラチン分解：−
１３．チロシン分解：−
１４．デンプン加水分解：＋
１５．ＮＯ₃ ^-からＮＯ₂ ^-への変換：＋
１６．コーザー培地でのクエン酸利用：−
１７．メラーのアルギニンジヒドロラーゼ：−
１８．ＯＮＰＧ：＋
１９．酸キシロースＰＷＳ：＋
２０．ＤＮａｓｅ：−
２１．カタラーゼ：＋
２２．オキシダーゼ：＋
【００１２】
以上の菌学的性質に基づいて、バージーの細菌分類書（Bargy's Manual of Systematic Bacteriology）によって分類し、ＣＮ３株をバチルス・ステアロサーモフィルスと同定した。
【００１３】
上記菌株の培地としては、特別な培地を用いる必要はなく、通常の培地を用いればよい。炭素源としては、グルコース、マルトース、デンプン、デキストリン等の糖類、グルタミン酸等のアミノ酸類、あるいはフマル酸、リンゴ酸等の有機酸、もしくはグリセロール、窒素源としては、ポリペプトン、酵母エキス、大豆粉加水分解物等の天然窒素源、無機塩としてはＮａＣｌ、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等、また、微量金属成分としては塩化カルシウム、ホウ酸、硫酸銅、ヨウ化カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛等を使用することができる。
【００１４】
本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを得るための好適な培地組成の一例を次に示す。ポリペプトン１％、酵母エキス０．２５％、グリセロール０．１％、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ ０．１％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１％、およびＬ−セリン０．１％。
【００１５】
培養のｐＨは６．５約〜約７．５、好ましくは７．２、培養温度は約４０℃〜約７０℃、好ましくは５０〜６０℃であり、１２時間〜４８時間、好ましくは２４時間好気的または振盪しながら培養を行う。本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼは、このようにして培養した細菌から該酵素を単離することにより得ることができる。
【００１６】
上記培養液から本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離するには、既知の精製法を単独または併用して利用することができる。例えば、培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、これを超音波処理またはダイノミル（Dyno-mill）処理により破砕した後、遠心分離により無細胞抽出液を得る。これを硫安分画し、透析等による脱塩処理等を行い、ついで、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行って本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離することができる。また、本発明酵素が耐熱性酵素であるために、例えば７０℃、３０分の熱処理を行うことにより精製効率を高めることができる。
【００１７】
また、本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを用いてシステイン、Ｌ−セリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ホスホリル−Ｌ−セリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−セリンまたはβ−クロロ−Ｌ−アラニンと¹¹Ｃまたは¹³Ｃあるいは¹⁴Ｃで標識したシアン化物とを、例えばリン酸カリウム緩衝液等の水性媒体中で接触させて反応せしめ、臨床診断や生化学的研究に使用する¹¹Ｃまたは¹³Ｃあるいは¹⁴Ｃで標識されたβ−シアノアラニンまたはその誘導体あるいは塩を合成することができる。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株の培養
ポリペプトン１％、酵母エキス０．２５％，グリセロール０．１％、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ ０．１％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１％（ｐＨ７．２）からなる培地をそれぞれ８ｍｌずつ試験管（２．５Ｘ２０ｃｍ）２本に分注し、１２０℃、２０分殺菌、冷却後、バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株を一白金耳ずつ接種し、６０℃、２４時間振盪培養して、種培養液とした。前記と同じ組成の培地に消泡剤（旭電化社アデカノールＫＧ−１２６）０．０１％（ｖ／ｖ）を添加した培地１．６リットルを２リットル容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分殺菌、冷却後、これに上記の種培養液１６ｍｌ（試験管２本分）を接種し、６０℃、２７時間、１．６リットル／分の通気量と３００ｒｐｍの撹拌速度の条件で培養し、前培養液とした。次にポリペプトン１％、酵母エキス０．２５％、グリセロール０．１％、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ ０．１％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１％、Ｌ−セリン ０．１％（ｐＨ７．２）からなる培地１６０リットルを２００リットル容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、３０分殺菌、冷却後、上記の前培養液１．６リットルを接種し、６０℃、２４時間、１２０リットル／分の通気量と２００ｒｐｍの撹拌速度の条件で培養した。培養終了後、シャープレス（ＫＳ型超高速遠心分離機、（株）関西遠心分離機製作所製）による遠心分離により菌体を回収した。
得られた菌体を８等分し（２０リットル分ずつ）、それぞれ適当量の１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍＭジチオスレイトール含有）に懸濁して、−８０℃で凍結保存した。これを解凍し、以後の酵素の製造に用いた。
【００１９】
バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株からの耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの単離
凍結菌体６０リットル分を全量が約２０００ｍｌになるように上記緩衝液に懸濁した後、ダイノミルにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して菌体残渣を除き、無細胞抽出液２１００ｍｌを得た。
この無細胞抽出液に硫安を４０％飽和になるように添加し、一晩放置後、析出した沈澱物を遠心分離により除き、得られた上澄液に再度硫安を９０％飽和になるように添加して５時間放置し遠心分離により沈澱物を得た。この沈澱物を、０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し透析膜を用いて同緩衝液にて脱塩した。脱塩液１０６５ｍｌに終濃度７０％になるようにあらかじめ−８０℃に冷却したエタノールを添加し、遠心分離により沈澱物を得た。これを同緩衝液に懸濁し、７０℃で３０分の熱処理を行った。遠心分離で沈澱を除去した後、上澄液をあらかじめ同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ５００カラム（直径６．０Ｘ高さ１８ｃｍ）に通して酵素を吸着させ、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液から０．１ｍＭジチオスレイトールと０．５Ｍ ＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出して活性画分を集めた。
この活性画分に硫安を８０％飽和になるように添加し、一晩放置後遠心分離により沈澱物を得た。この沈澱物を０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、調製電気泳動（７．５％ポリアクリルアミドゲル）にかけた。泳動後、ゲル中の活性のある部分を切り出し、これを磨砕して同緩衝液を用いて酵素を抽出した。
この活性画分に３０％飽和になるように硫安を添加し、あらかじめ３０％飽和硫安と０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径２．５Ｘ高さ１２ｃｍ）に通し、酵素を吸着させ、この平衡化緩衝液で洗浄後、この緩衝液から０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出して活性画分を集めた。
この活性画分に硫安を３０％飽和になるように添加し、あらかじめ３０％飽和硫安と０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したオクチルセファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径１．５Ｘ高さ１０ｃｍ）に通し、酵素を吸着させ、この平衡化緩衝液で洗浄後、この緩衝液から０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出して活性画分を集めた。ここで得られた酵素標品は電気泳動的に単一であることが確認された。上記精製結果を下記表１にまとめた。ステップ８において、当初の無細胞抽出液に比べて２１８倍に純化されていた。
【００２０】
【表１】

【００２１】
バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの諸性質
酵素活性測定：１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌ（終濃度５０ｍＭ）、水８０μｌ、０．８ｍＭピリドキサールリン酸２０μｌ（終濃度０．０８ｍＭ）、５０ｍＭ Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン２０μｌ（終濃度５．０ｍＭ）、１００ｍＭシアン化カリウム２０μｌ（終濃度１０ｍＭ）および酵素液５０μｌからなる反応液（全量２００μｌ）を４５℃で１０分インキュベートした後、沸騰水浴中に２分間置いて反応停止し、ついで、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液をＨＰＬＣにかけ、酵素反応で生成したβ−シアノアラニンを定量することにより行った。かかる条件下で、１分間に１μｍｏｌのβ−シアノアラニンを生成する酵素活性を１ユニットと定義する。ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（４．６Ｘ２５０ｍｍ）(ジーエルサイエンス株式会社製）、溶出液：１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）／ＣＨ₃ＣＮ（８５／１５）、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：蛍光検出機（Ｅｘ：３４５ｎｍ、Ｅｍ４５０ｎｍ）、カラム温度：４０℃、サンプルボリューム：１０μｌであった。
【００２２】
（１）至適ｐＨ
ｐＨ６．０から１０．０の範囲の各ｐＨ下で、上記活性測定法により活性測定を行った（活性測定用反応液における緩衝液を以下のものに代えて反応を行った）。使用緩衝液は、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０〜６．５）、２０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．０〜８．０）、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５〜７．５）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜９．０）および２０ｍＭ ＮＨ₄Ｃｌ−ＮＨ₄ＯＨ（ｐＨ８．５〜１０．０）であった。結果を図１に示す。図１より、本酵素の至適ｐＨは８．０であることがわかった。
【００２３】
（２）安定ｐＨ
また、本酵素を２０ｍＭ濃度の緩衝液に溶解し、６０℃、３０分保持した後、残存活性を測定した。使用緩衝液は、クエン酸／クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５〜５．５）、ＭＥＳ（ｐＨ６．０〜７．０）、ＫＨ₂ＰＯ₄−Ｋ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ６．０〜８．０）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜９．０）、ＮＨ₄Ｃｌ−ＮＨ₄ＯＨ（ｐＨ８．５〜１０．５）およびグリシン／ＫＣｌ−ＫＯＨ（ｐＨ１０．０〜１０．５）であった。結果を図２に示す。図２の結果より、本酵素の安定ｐＨは６．０〜１０．０であることがわっかった。
【００２４】
（３）至適温度
２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に本酵素を溶解し、２０℃から８０℃までの範囲で上記酵素活性測定法により活性測定した。結果を図３に示す。図３より、本酵素の至適温度は４５℃であることがわかった。
【００２５】
（４）熱安定性
２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に本酵素を溶解し、４０℃から９５℃までの各温度で３０分間酵素を処理し、残存活性を調べた。結果を図４に示す。図４より本酵素は熱安定性が非常に高く、７０℃まで安定であることがわかった。
【００２６】
（５）分子量およびサブユニット
液体クロマトグラフィーによるＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（２０Ｘ３００ｍｍ、東ソー株式会社製）カラムを用いたゲル濾過により、分子量は７０，０００と算出された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は３４，０００と算出され、本酵素は同一サブユニットの２量体酵素であると考えられた。
【００２７】
（６）基質特異性
前記活性測定用反応液において、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンに代えて種々の化合物を用いて活性を測定することにより、基質特異性を調べた。本酵素の基質特異性は高く、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン以外にはＬ−システインに対してわずかに作用した（Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを１００％とした場合の相対活性は４．８％）。なお、以下のアミノ酸は基質にならなかった。ＤＬ−ホモセリン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−セリン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸。
【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、熱安定性の非常に高いＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ、該酵素を産生する細菌株、該酵素の製造法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図２】 バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図３】 バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの至適温度を示す図である。
【図４】 バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの熱安定性を示す図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to O-acetylserine sulfhydrylase, a method for producing the enzyme, a novel bacterial strain belonging to the genus Bacillus that produces the enzyme, and a method for producing the enzyme.
[0002]
[Background Art and Problems to be Solved by the Invention]
O-acetylserine sulfhydrylase activity is known to be derived from some plants and microorganisms, for example, from spinach (F. Ikegami et al., Phytochemistry, Vol. 27). , 3385-3389 (1981), or from the genus Chromobacterium (M.Anne and JKChristopher, Biochimica et Biophysica) Acta), 786, 123-132 (1984), etc. have been refined and their properties have been investigated.
[0003]
The enzyme reaction product β-cyanoalanine is useful as an intermediate for the synthesis of various amino acid derivatives having biological activity, but all of the O-acetylserine sulfhydrylases reported so far are unstable. In particular, the thermal stability is low and it is not suitable for the production of such useful substances. Therefore, there has been an urgent need to search for O-acetylserine sulfhydrylase having high thermostability.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
Under the above circumstances, as a result of intensive research, the present inventors have found a thermostable bacterium belonging to the genus Bacillus that produces O-acetylserine sulfhydrylase having a very high thermal stability. The present invention was completed by succeeding in isolating thermostable O-acetylserine sulfhydrylase.
[0005]
That is, the present invention
(1) a thermostable O-acetylserine sulfhydrylase having the following properties;
1. Action: produces β-cyanoalanine from O-acetyl-L-serine and cyanide Optimum pH: 7.0-9.0
3. Stable pH: 6.0 to 10.0
4). Optimal temperature: 40-50 ° C
5. Thermal stability: stable to 70 ° C. when held at pH 7.5 for 30 minutes Molecular weight: 60,000-80,000 by gel filtration
(2) The enzyme according to (1), which requires pyridosarlic acid as a coenzyme,
(3) O-acetyl-L-serine, L-cysteine, L-serine, O-methyl-L-serine, O-phosphoryl-L-serine, O-succinyl-L-serine or β-chloro-L-alanine The enzyme according to (1), in particular,
(4) The enzyme according to any one of (1) to (3), which is obtained from a thermophilic bacterium belonging to the genus Bacillus,
(5) The enzyme according to (4), wherein the bacterium is B. stearothermophilus,
(6) The bacterium is Bacillus stearothermophilus CN3 strain deposited under the accession number FERM BP-4773 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. .
[0006]
The present invention also provides:
(7) A bacterium belonging to the genus thermophilic Bacillus having the ability to produce O-acetylserine sulfhydrylase according to claim 1 is cultured in an O-acetylserine sulfhydrylase-inducing medium; A method for producing O-acetylserine sulfhydrylase, characterized in that said O-acetylserine sulfhydrylase is isolated from
(8) The method according to (7), wherein the thermophilic bacterium belonging to the genus Bacillus having the ability to produce O-acetylserine sulfhydrylase is Bacillus stearothermophilus,
(9) Bacteria having the ability to produce the O-acetylserine sulfhydrylase belonging to the thermophilic Bacillus genus have been deposited at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERMBP-4773 The method according to (7), which is a Bacillus stearothermophilus CN3 strain.
[0007]
Furthermore, the present invention provides
(10) Provided with the Bacillus stearothermophilus CN3 strain deposited under the accession number FERM BP-4773 at the Institute of Biotechnology, AIST.
[0008]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The thermostable O-acetylserine sulfhydrylase of the present invention can be obtained by culturing a bacterium having the ability to produce O-acetylserine sulfhydrylase belonging to the thermostable Bacillus genus. Examples include Bacillus stearothermophilus CN3 strain and the like. The Bacillus stearothermophilus CN3 strain was isolated from nature by the present inventors and was assigned to the National Institute of Biotechnology, August 8, 1994 under the accession number FERM BP-4773. It has been deposited. The bacteriological properties of this bacterium are as follows.
[0009]
(A) Form 1. 1. Bacterial morphology: fine gonococci Mobility:-
3. Spore: + (oval)
4). Gram staining:-
[0010]
(B) Colony morphology: circular shape of 5 mm or less after 72 hours of culture, irregular, pale yellow translucent, smooth and flat surface
(C) Physiological properties Growth: Not grown at 37 ° C, grown at 45 ° C, 55 ° C and 67 ° C Intracellular microspheres:-
3. Litmus milk: Decomposition 4. Growth with 3% NaCl:-
Growth with 5.5% NaCl: −
Growth with 6.7% NaCl: −
7. Growth at pH 5.7:-
8). Acid production from glucose: +
9. Gas production from glucose:-
10. Egg yolk reaction: not growing under test conditions Casein degradation: +
12 Gelatin degradation:-
13. Tyrosine degradation: −
14 Starch hydrolysis: +
15. NO ₃ ^- from NO ₂ ^- Conversion to: +
16. Use of citric acid in Coser medium:-
17. Meller's arginine dihydrolase:-
18. ONPG: +
19. Acid xylose PWS: +
20. DNase:-
21. Catalase: +
22. Oxidase: +
[0012]
Based on the above bacteriological properties, classification was made according to Bargy's Manual of Systematic Bacteriology, and the CN3 strain was identified as Bacillus stearothermophilus.
[0013]
As the culture medium for the strain, it is not necessary to use a special culture medium, and a normal culture medium may be used. As carbon sources, sugars such as glucose, maltose, starch and dextrin, amino acids such as glutamic acid, organic acids such as fumaric acid and malic acid, or glycerol, nitrogen sources include polypeptone, yeast extract, soybean flour hydrolysis Natural nitrogen sources such as NaCl, inorganic salts such as NaCl, potassium phosphate, magnesium sulfate, and trace metal components such as calcium chloride, boric acid, copper sulfate, calcium iodide, ferrous sulfate, manganese sulfate, sulfuric acid Zinc or the like can be used.
[0014]
An example of a suitable medium composition for obtaining the thermostable O-acetylserine sulfhydrylase of the present invention is shown below. 1% polypeptone, 0.25% yeast extract, 0.1% glycerol, 0.1% (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.05% MgSO ₄ .7H ₂ O, 0.1% K ₂ HPO ₄ , and L-serine 0.1%.
[0015]
The culture pH is about 6.5 to about 7.5, preferably 7.2, the culture temperature is about 40 ° C. to about 70 ° C., preferably 50 to 60 ° C., and 12 to 48 hours, preferably 24 hours. Cultivate aerobically or with shaking. The thermostable O-acetylserine sulfhydrylase of the present invention can be obtained by isolating the enzyme from the thus cultured bacteria.
[0016]
In order to isolate the thermostable O-acetylserine sulfhydrylase of the present invention from the culture solution, known purification methods can be used alone or in combination. For example, the cells are collected by centrifuging the culture solution, disrupted by sonication or Dyno-mill treatment, and then cell-free extract is obtained by centrifugation. This was subjected to ammonium sulfate fractionation, desalting treatment such as dialysis, etc., and then subjected to ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, hydroxylapatite chromatography, gel filtration chromatography, etc., and the heat-resistant O-acetylserine of the present invention. Sulfhydrylase can be isolated. Further, since the enzyme of the present invention is a thermostable enzyme, purification efficiency can be increased by performing a heat treatment at 70 ° C. for 30 minutes, for example.
[0017]
Further, using the heat-resistant O-acetylserine sulfhydrylase of the present invention, cysteine, L-serine, O-acetyl-L-serine, O-methyl-L-serine, O-phosphoryl-L-serine, O- Clinical diagnosis by contacting succinyl-L-serine or β-chloro-L-alanine with cyanide labeled with ¹¹ C, ¹³ C, or ¹⁴ C in an aqueous medium such as potassium phosphate buffer. Alternatively, β-cyanoalanine or a derivative or salt thereof labeled with ¹¹ C, ¹³ C, or ¹⁴ C used for biochemical research can be synthesized.
[0018]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Bacillus stearothermophilus CN3 strain cultured polypeptone 1%, yeast extract 0.25%, glycerol 0.1%, (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 0.1%, MgSO ₄ .7H ₂ O 0.05%, Dispense 8 ml each of K ₂ HPO ₄ 0.1% (pH 7.2) medium into two test tubes (2.5 × 20 cm), sterilize at 120 ° C. for 20 minutes, cool, and then Bacillus stearothermophilus The CN3 strain was inoculated one platinum ear at a time, and cultured with shaking at 60 ° C. for 24 hours to obtain a seed culture solution. 1.6 liters of a medium prepared by adding 0.01% (v / v) antifoaming agent (Asahi Denka Co., Ltd. Adecanol KG-126) to a medium having the same composition as described above was placed in a 2 liter jar fermenter, 120 ° C., After sterilization for 20 minutes and cooling, inoculate 16 ml of the above seed culture solution (for 2 test tubes) and culture under conditions of 60 ° C., 27 hours, aeration rate of 1.6 liters / minute and stirring speed of 300 rpm. And used as a preculture. Next, polypeptone 1%, yeast extract 0.25%, glycerol 0.1%, (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 0.1%, MgSO ₄ .7H ₂ O 0.05%, K ₂ HPO ₄ 0.1% , 160 liters of medium consisting of 0.1% L-serine (pH 7.2) was placed in a 200 liter jar fermenter, sterilized at 120 ° C. for 30 minutes, cooled, and inoculated with 1.6 liters of the above preculture Then, the cells were cultured at 60 ° C. for 24 hours under the conditions of an aeration rate of 120 liters / minute and a stirring speed of 200 rpm. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation with a sharp press (KS ultra-high speed centrifuge, manufactured by Kansai Centrifuge Co., Ltd.).
The obtained cells are divided into 8 equal parts (each 20 liters), suspended in appropriate amounts of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0, containing 0.1 mM dithiothreitol), and frozen at −80 ° C. saved. This was thawed and used for subsequent enzyme production.
[0019]
Isolation of thermostable O-acetylserine sulfhydrylase from Bacillus stearothermophilus CN3 strain 60 liters of frozen cells were suspended in the above buffer solution to a total volume of about 2000 ml, and then sterilized by dynomill. The body was crushed. The disrupted solution was centrifuged to remove the cell residue, and 2100 ml of cell-free extract was obtained.
To this cell-free extract, ammonium sulfate was added to 40% saturation, and after standing overnight, the deposited precipitate was removed by centrifugation, and the resulting supernatant was again saturated with ammonium sulfate to 90%. The mixture was added and allowed to stand for 5 hours, and a precipitate was obtained by centrifugation. This precipitate was dissolved in 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 0.1 mM dithiothreitol and desalted with the same buffer using a dialysis membrane. Ethanol that had been cooled to -80 ° C. in advance to a final concentration of 70% was added to 1065 ml of the desalted solution, and a precipitate was obtained by centrifugation. This was suspended in the same buffer and heat-treated at 70 ° C. for 30 minutes. After removing the precipitate by centrifugation, the supernatant was passed through a DEAE-Cellulofine A500 column (diameter 6.0 × height 18 cm) previously equilibrated with the same buffer, and washed with the same buffer. The active fractions were collected by elution of the enzyme from the same buffer by a gradient elution method into 100 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 0.1 mM dithiothreitol and 0.5 M NaCl.
Ammonium sulfate was added to this active fraction so as to be 80% saturated, and the mixture was left overnight and then centrifuged to obtain a precipitate. This precipitate was dissolved in 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 0.1 mM dithiothreitol and subjected to preparative electrophoresis (7.5% polyacrylamide gel). After the electrophoresis, the active portion in the gel was cut out, ground, and the enzyme was extracted using the same buffer.
Phenyl Sepharose CL- was added to this active fraction to 30% saturation and equilibrated in advance with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 30% saturated ammonium sulfate and 0.1 mM dithiothreitol. The enzyme was adsorbed through a 4B column (diameter 2.5 × height 12 cm), washed with this equilibration buffer, and 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 0.1 mM dithiothreitol from this buffer. The active fraction was collected by eluting the enzyme by the gradient elution method.
Octyl Sepharose CL- was added to this active fraction to 30% saturation, and equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 30% saturated ammonium sulfate and 0.1 mM dithiothreitol in advance. The enzyme was adsorbed through a 4B column (diameter 1.5 × height 10 cm), washed with this equilibration buffer, and then washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 0.1 mM dithiothreitol. The active fraction was collected by eluting the enzyme by the gradient elution method. It was confirmed that the enzyme preparation obtained here was electrophoretically single. The purification results are summarized in Table 1 below. In step 8, it was purified 218 times compared to the original cell-free extract.
[0020]
[Table 1]

[0021]
Various properties of thermostable O-acetylserine sulfhydrylase of Bacillus stearothermophilus CN3 strain Enzyme activity measurement: 1 μL potassium phosphate buffer (pH 7.5) 10 μl (final concentration 50 mM), water 80 μl, 0.8 mM A reaction solution (total volume 200 μl) comprising 20 μl of pyridoxal phosphate (final concentration 0.08 mM), 20 μl of 50 mM O-acetyl-L-serine (final concentration 5.0 mM), 20 μl of 100 mM potassium cyanide (final concentration 10 mM) and 50 μl of enzyme solution. After incubating at 45 ° C. for 10 minutes, the reaction was stopped by placing in a boiling water bath for 2 minutes, and then centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was subjected to HPLC to quantify β-cyanoalanine produced in the enzyme reaction. Was done. Under such conditions, the enzyme activity that produces 1 μmol of β-cyanoalanine per minute is defined as 1 unit. HPLC conditions are as follows: Column: Inertsil ODS-2 (4.6 × 250 mm) (manufactured by GL Sciences Inc.), eluent: 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) / CH ₃ CN (85/15), flow rate: 1 ml / min, detection: fluorescence detector (Ex: 345 nm, Em450 nm), column temperature: 40 ° C., sample volume: 10 μl.
[0022]
(1) Optimum pH
Activity was measured by the above activity measurement method under each pH in the range of pH 6.0 to 10.0 (reaction was performed by replacing the buffer in the reaction solution for activity measurement with the following). The buffer used was 20 mM MES (pH 6.0 to 6.5), 20 mM KPB (pH 6.0 to 8.0), 20 mM MOPS (pH 6.5 to 7.5), 20 mM Tris-HCl (pH 7.5 to 7.5). 9.0) and was _{20mM NH 4 Cl-NH 4 OH} (pH8.5~10.0). The results are shown in FIG. From FIG. 1, it was found that the optimum pH of the enzyme was 8.0.
[0023]
(2) Stable pH
Moreover, this enzyme was melt | dissolved in the buffer solution of a 20 mM density | concentration, The residual activity was measured after hold | maintaining for 30 minutes at 60 degreeC. The buffer used was citric acid / sodium citrate (pH 3.5 to 5.5), MES (pH 6.0 to 7.0), KH ₂ PO ₄ -K ₂ HPO ₄ (pH 6.0 to 8.0). Tris-HCl (pH 7.5 to 9.0), NH ₄ Cl—NH ₄ OH (pH 8.5 to 10.5) and glycine / KCl—KOH (pH 10.0 to 10.5). The results are shown in FIG. From the results of FIG. 2, it was found that the stable pH of this enzyme is 6.0 to 10.0.
[0024]
(3) Optimum temperature The enzyme was dissolved in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), and the activity was measured in the range from 20 ° C. to 80 ° C. by the above enzyme activity measurement method. The results are shown in FIG. From FIG. 3, it was found that the optimum temperature of this enzyme was 45 ° C.
[0025]
(4) Thermostability This enzyme was dissolved in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), and the enzyme was treated at each temperature from 40 ° C. to 95 ° C. for 30 minutes, and the residual activity was examined. The results are shown in FIG. From FIG. 4, it was found that this enzyme has very high thermostability and is stable up to 70 ° C.
[0026]
(5) Molecular weight The molecular weight was calculated to be 70,000 by gel filtration using a TSKgel G3000SW (20 × 300 mm, manufactured by Tosoh Corporation) column by subunit liquid chromatography. Moreover, the molecular weight by SDS-PAGE was calculated to be 34,000, and this enzyme was considered to be a dimeric enzyme of the same subunit.
[0027]
(6) Substrate specificity In the reaction liquid for activity measurement, the substrate specificity was examined by measuring the activity using various compounds instead of O-acetyl-L-serine. The enzyme has a high substrate specificity and acted slightly on L-cysteine other than O-acetyl-L-serine (relative activity is 4.8 when O-acetyl-L-serine is taken as 100%). %). The following amino acids did not become substrates. DL-homoserine, L-cystine, L-homoserine, L-serine, L-homoserine, L-methionine, L-asparagine, L-aspartic acid.
[0028]
【The invention's effect】
According to the present invention, O-acetylserine sulfhydrylase having very high thermal stability, a bacterial strain producing the enzyme, and a method for producing the enzyme are provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the optimum pH of O-acetylserine sulfhydrylase of Bacillus stearothermophilus CN3 strain.
FIG. 2 is a graph showing the pH stability of O-acetylserine sulfhydrylase of Bacillus stearothermophilus CN3 strain.
FIG. 3 is a graph showing the optimum temperature of O-acetylserine sulfhydrylase of Bacillus stearothermophilus CN3 strain.
FIG. 4 is a diagram showing the thermal stability of O-acetylserine sulfhydrylase of Bacillus stearothermophilus CN3 strain.

Claims (7)

バチルス・ステアロサーモフィルス（ B.stearothermophilus ）細菌により産生され、次の性質を有する耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ；
１．作用：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとシアン化物からβ−シアノアラニンを生成する
２．至適ｐＨ：７．０〜９．０
３．安定ｐＨ：６．０〜１０．０
４．至適温度：４０〜５０℃
５．熱安定性：ｐＨ７．５において３０分保持した場合、７０℃まで安定
６．分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分子量３４，０００のサブユニットの二量体。 Produced by Bacillus stearothermophilus (B. stearothermophilus) bacteria, heat-resistant O- acetyl sulfhydrylase having the following properties;
1. Action: produces β-cyanoalanine from O-acetyl-L-serine and cyanide Optimum pH: 7.0-9.0
3. Stable pH: 6.0 to 10.0
4). Optimal temperature: 40-50 ° C
5. Thermal stability: stable to 70 ° C. when held at pH 7.5 for 30 minutes Molecular weight: A dimer of subunits having a molecular weight of 34,000 by SDS-PAGE . 補酵素としてピリドキサルリン酸を要求する請求項１記載の酵素。  The enzyme according to claim 1, which requires pyridoxal phosphate as a coenzyme. Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ホスホリル−Ｌ−セリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−セリンまたはβ−クロロ−Ｌ−アラニンを基質とする請求項１記載の酵素。  O-acetyl-L-serine, L-cysteine, L-serine, O-methyl-L-serine, O-phosphoryl-L-serine, O-succinyl-L-serine or β-chloro-L-alanine as a substrate The enzyme according to claim 1. 該細菌が工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株である請求項１ないし３のいずれか１項記載の酵素。 The enzyme according to any one of claims 1 to 3, wherein the bacterium is Bacillus stearothermophilus CN3 strain deposited at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERMBP-4773 . Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの産生能を有するバチルス・ステアロサーモフィルス細菌をＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ誘導培地で培養し、ついで、該菌体から該Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離することを特徴とするＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの製造法。 Bacillus stearothermophilus bacterium having the ability to produce O-acetylserine sulfhydrylase is cultured in an O-acetylserine sulfhydrylase-inducing medium, and then the O-acetylserine sulfhydrylase is produced from the cells. A process for producing O-acetylserine sulfhydrylase, characterized in that 該細菌が、工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株である請求項５記載の方法。 6. The method according to claim 5, wherein the bacterium is Bacillus stearothermophilus CN3 strain deposited under the accession number FERM BP-4773 at the Institute of Biotechnology, AIST . 工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株。 Bacillus stearothermophilus CN3 strain deposited under the accession number FERM BP-4773 at the Institute of Biotechnology, AIST .

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