JP2671260B2 - ストレプトミセス菌類における外来性タンパク質の製造法 - Google Patents
ストレプトミセス菌類における外来性タンパク質の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 公開番号第0,161,629号の欧州特許出願（EP−Ａ）明
細書および南アフリカ共和国特許第85/3672号明細書に
は、ストレプトミセス菌類（Streptomycetes）の細胞に
ポリペプチド、とくにテンダミスタット、を分泌させる
ための、α−アミラーゼ阻害剤テンダミスタットのシグ
ナルペプチド（プレペプチド）をコードするDNAの使用
が開示されている。適当なDNAは、原理的には、テンダ
ミスタットを産生するいかなる株からでも得ることがで
きるが、独国特許公開第3,331,860号明細書の例３と同
様にして得られるDNAを用いるのが好ましい。
細書および南アフリカ共和国特許第85/3672号明細書に
は、ストレプトミセス菌類（Streptomycetes）の細胞に
ポリペプチド、とくにテンダミスタット、を分泌させる
ための、α−アミラーゼ阻害剤テンダミスタットのシグ
ナルペプチド（プレペプチド）をコードするDNAの使用
が開示されている。適当なDNAは、原理的には、テンダ
ミスタットを産生するいかなる株からでも得ることがで
きるが、独国特許公開第3,331,860号明細書の例３と同
様にして得られるDNAを用いるのが好ましい。
特許出願（独国特許出願第p 37 07 150.5、1987年３
月６日出願のものに対応）には、コード配列（必要であ
れば修飾しておく）を取り込むこと、および組み込み遺
伝子をストレプトミセス菌類細胞で発現することからな
る、ストレプトミセス菌類からの融合タンパク質の分泌
法が既に提案されている。このように、この場合には、
テンダミスタット構造遺伝子は他の遺伝子のための「担
体（carrier）」として用いられて、得られる融合タン
パク質はテンダミスタットのアミノ酸配列の中に位置す
る他のタンパク質のアミノ酸配列を含有している。した
がって、この融合タンパク質を化学的または酸素的に切
断して他のタンパク質を遊離させると、２個のテンダミ
スタット部分配列物が得られる。上記の特許出願は、ま
た、テンダミスタット誘導体にも関し、著しく短絡され
たアミノ酸鎖を有する誘導体をも含んでいることが了解
される。このタイプの誘導体は、可逆的に、競合的阻害
メカニズムのかたちで特異的レセプターと反応すること
ができる。
月６日出願のものに対応）には、コード配列（必要であ
れば修飾しておく）を取り込むこと、および組み込み遺
伝子をストレプトミセス菌類細胞で発現することからな
る、ストレプトミセス菌類からの融合タンパク質の分泌
法が既に提案されている。このように、この場合には、
テンダミスタット構造遺伝子は他の遺伝子のための「担
体（carrier）」として用いられて、得られる融合タン
パク質はテンダミスタットのアミノ酸配列の中に位置す
る他のタンパク質のアミノ酸配列を含有している。した
がって、この融合タンパク質を化学的または酸素的に切
断して他のタンパク質を遊離させると、２個のテンダミ
スタット部分配列物が得られる。上記の特許出願は、ま
た、テンダミスタット誘導体にも関し、著しく短絡され
たアミノ酸鎖を有する誘導体をも含んでいることが了解
される。このタイプの誘導体は、可逆的に、競合的阻害
メカニズムのかたちで特異的レセプターと反応すること
ができる。
外来性タンパク質は、また、テンダミスタット遺伝子
（必要であれば修飾しておく）の（コード鎖の）３′末
端に所望のタンパク質の構造遺伝子を結合させた融合タ
ンパク質遺伝子を構築して、これを用いてストレプトミ
セス菌属中で調製されるということが、見出された。テ
ンダミスタット遺伝子の修飾としては、とくにＣ末端の
短縮などがある。
（必要であれば修飾しておく）の（コード鎖の）３′末
端に所望のタンパク質の構造遺伝子を結合させた融合タ
ンパク質遺伝子を構築して、これを用いてストレプトミ
セス菌属中で調製されるということが、見出された。テ
ンダミスタット遺伝子の修飾としては、とくにＣ末端の
短縮などがある。
テンダミスタットをコードするDNAは、EP−Ａ第0,16
1,629号明細書に示されている（DNA配列Ｃとして、添付
の表１に）。この構造遺伝子は、数個の制限酵素切断部
位を含んでおり、これを用いて、コードするアミノ酸配
列を修飾することができる。適当な切断部位としては、
トリプレット31および32領域のBstE II切断部位、トリ
プレット43および44の領域のStu I切断部位、およびト
リプレット52および53領域のSau3A切断部位がある。適
当なリンカーを組み入れることによってこれらの部位に
一つ以上の追加アミノ酸を挿入すること、これらの切断
部位間のDNAセグメントを削除すること、あるいは停止
コードンを組み入れることによって短縮したアミノ酸配
列をコードすることが可能である。さらに、部位特異的
（site−specific）突然変異によって、所望のアミノ酸
の挿入、置換または削除が可能である。このようにして
得られたタンパク質は、α−アミラーゼ阻害活性を有す
るか、あるいはこの活性は有しないけれども対応するレ
セプターとはなお反応する。
1,629号明細書に示されている（DNA配列Ｃとして、添付
の表１に）。この構造遺伝子は、数個の制限酵素切断部
位を含んでおり、これを用いて、コードするアミノ酸配
列を修飾することができる。適当な切断部位としては、
トリプレット31および32領域のBstE II切断部位、トリ
プレット43および44の領域のStu I切断部位、およびト
リプレット52および53領域のSau3A切断部位がある。適
当なリンカーを組み入れることによってこれらの部位に
一つ以上の追加アミノ酸を挿入すること、これらの切断
部位間のDNAセグメントを削除すること、あるいは停止
コードンを組み入れることによって短縮したアミノ酸配
列をコードすることが可能である。さらに、部位特異的
（site−specific）突然変異によって、所望のアミノ酸
の挿入、置換または削除が可能である。このようにして
得られたタンパク質は、α−アミラーゼ阻害活性を有す
るか、あるいはこの活性は有しないけれども対応するレ
セプターとはなお反応する。
本発明は、また、適当な遺伝子構造物、これら遺伝子
構造物を含有するベクター、これらベクターで形質転換
させたストレプトミセス菌類細胞、分泌された融合タン
パク質、および外来性タンパク質およびテンダミスタッ
ト誘導体の製造のためのこれらの使用、に関する。本発
明の好ましい態様は、以下に詳細に説明され、特許請求
の範囲に定義される通りである。
構造物を含有するベクター、これらベクターで形質転換
させたストレプトミセス菌類細胞、分泌された融合タン
パク質、および外来性タンパク質およびテンダミスタッ
ト誘導体の製造のためのこれらの使用、に関する。本発
明の好ましい態様は、以下に詳細に説明され、特許請求
の範囲に定義される通りである。
第１〜４図は、本発明に係るプラスミドのいくつかの
構築を示す、説明図である。
構築を示す、説明図である。
第１図は、複合プラスミドpKK310の調製過程を示す。
この複合プラスミドは、テンダミスタットアミノ酸配列
の部分に７個のアミノ酸のブリッジ員子が続き、その後
にモンキープロインシュリンのアミノ酸配列が続いてな
る、融合タンパク質をコードする。
この複合プラスミドは、テンダミスタットアミノ酸配列
の部分に７個のアミノ酸のブリッジ員子が続き、その後
にモンキープロインシュリンのアミノ酸配列が続いてな
る、融合タンパク質をコードする。
第２図は、プラスミドpKK310を出発材料とした発現プ
ラスミドpTF1の構築を示す。
ラスミドpTF1の構築を示す。
第３図は、テンダミスタット遺伝子の部分にpUC18か
らのポリリンカーが続いて位置しているプラスミドpRS1
0の構築、およびこのpRS10の発現プラスミドpTF10への
再構築を示す。「mcs」は、pUC18のポリリンカー領域
（マルチプルクロンーニングサイト）を表す。
らのポリリンカーが続いて位置しているプラスミドpRS1
0の構築、およびこのpRS10の発現プラスミドpTF10への
再構築を示す。「mcs」は、pUC18のポリリンカー領域
（マルチプルクロンーニングサイト）を表す。
最後に、第４図は、プラスミドpKK400の調製方法およ
びその発現プラスミドpGF1への再構築を示す。このプラ
スミドpKK400は、テンダミスタットの全アミノ酸配列に
11個のアミノ酸のブリッジ員子が続き、その後にモンキ
ープロインシュリンのアミノ酸配列が続いてなる、融合
タンパク質をコードする。
びその発現プラスミドpGF1への再構築を示す。このプラ
スミドpKK400は、テンダミスタットの全アミノ酸配列に
11個のアミノ酸のブリッジ員子が続き、その後にモンキ
ープロインシュリンのアミノ酸配列が続いてなる、融合
タンパク質をコードする。
なお、諸図面は、正しい比例尺で示されたものではな
い。
い。
本発明の方法によって細胞から放出されて得られる融
合タンパク質は、培養濾液から容易に単離することがで
きるという利点を有する。その単離は既知の方法で行う
ことができるが、吸着またはイオン交換クロマトグラフ
ィーおよび／またはゲル濾過によって行うのが有利であ
る。
合タンパク質は、培養濾液から容易に単離することがで
きるという利点を有する。その単離は既知の方法で行う
ことができるが、吸着またはイオン交換クロマトグラフ
ィーおよび／またはゲル濾過によって行うのが有利であ
る。
同様に、既知の方法で、所望の外来性タンパク質（融
合相手）を酸素的または化学的切断によって遊離させ
る。
合相手）を酸素的または化学的切断によって遊離させ
る。
この点については、切断のタイプは、とくに所望のタ
ンパク質のアミノ酸配列による。多くの場合、テンダミ
スタット配列と所望のタンパク質のアミノ酸配列との間
の切断部位に、連結員子すなわちブリッジ員子を組み入
れることが有利であろう。所望のタンパク質が、例え
ば、メチオニンを含有しない場合には、連結員子はMet
で表され、それから塩化シアンまたは臭化シアンによる
化学的切断が行われる。連結員子がカルボキシル末端シ
ステインを有する場合、または連結員子がCysである場
合には、システインに特異的な酵素による切断または、
例えば特異的Ｓ−シアニレーションの後に化学的切断を
行うことが可能である。ブリッジ員子がカルボキシル末
端トリプトファンを有する場合、または連結員子がTrp
である場合には、Ｎ−ブロモサクシンイミドによる化学
的切断を行うことができる。
ンパク質のアミノ酸配列による。多くの場合、テンダミ
スタット配列と所望のタンパク質のアミノ酸配列との間
の切断部位に、連結員子すなわちブリッジ員子を組み入
れることが有利であろう。所望のタンパク質が、例え
ば、メチオニンを含有しない場合には、連結員子はMet
で表され、それから塩化シアンまたは臭化シアンによる
化学的切断が行われる。連結員子がカルボキシル末端シ
ステインを有する場合、または連結員子がCysである場
合には、システインに特異的な酵素による切断または、
例えば特異的Ｓ−シアニレーションの後に化学的切断を
行うことが可能である。ブリッジ員子がカルボキシル末
端トリプトファンを有する場合、または連結員子がTrp
である場合には、Ｎ−ブロモサクシンイミドによる化学
的切断を行うことができる。
所望のタンパク質がそのアミノ酸配列中にAsp−Proを
含まず、かつ、酸に対して充分に安定である場合には、
このブリッジ員子でタンパク質を融合させれば既知の方
法にて蛋白分解反応で切断することができる。その結
果、Ｎ末端にプロリンを有し、Ｃ末端にアスパラギン酸
を有するタンパク質が得られる。このようにして、修飾
タンパク質を合成することも可能である。
含まず、かつ、酸に対して充分に安定である場合には、
このブリッジ員子でタンパク質を融合させれば既知の方
法にて蛋白分解反応で切断することができる。その結
果、Ｎ末端にプロリンを有し、Ｃ末端にアスパラギン酸
を有するタンパク質が得られる。このようにして、修飾
タンパク質を合成することも可能である。
このブリッジ員子を（Asp）ｎ−ProまたはGlu−（As
p）ｎ−Proにすることによって、Asp−Pro結合を酸に対
して一層不安定にすることができる。なお、ｎは１〜３
の整数を表す。
p）ｎ−Proにすることによって、Asp−Pro結合を酸に対
して一層不安定にすることができる。なお、ｎは１〜３
の整数を表す。
酵素的切断の例も開示されており、改善された特異性
を有する修飾された酵素を用いることも可能である（C.
S.Craikら:Science228（1985）291−297を参照された
い）。所望の真核細胞ペプチドがプロインシュリンの場
合には、トリプシンによって除かれるアミノ酸（Argま
たはLys）がプロインシュリンのＮ末端アミノ酸（Phe）
に結合しているペプチド配列物、例えばAla−Ser−Met
−Thr−Arg、を選択すれば、蛋白分解酵素トリプシンを
用いるアルギニン特異的切断を行うことができるので有
利である。
を有する修飾された酵素を用いることも可能である（C.
S.Craikら:Science228（1985）291−297を参照された
い）。所望の真核細胞ペプチドがプロインシュリンの場
合には、トリプシンによって除かれるアミノ酸（Argま
たはLys）がプロインシュリンのＮ末端アミノ酸（Phe）
に結合しているペプチド配列物、例えばAla−Ser−Met
−Thr−Arg、を選択すれば、蛋白分解酵素トリプシンを
用いるアルギニン特異的切断を行うことができるので有
利である。
所望タンパク質がアミノ酸配列 Ile−Glu−Gly−Arg を含まない場合には、この配列に対応するブリッジ員子
を含有する融合タンパク質を、因子Xaによって切断する
ことができる（EP−Ａ第0,025,190号明細書および第0,1
61,973号明細書）。
を含有する融合タンパク質を、因子Xaによって切断する
ことができる（EP−Ａ第0,025,190号明細書および第0,1
61,973号明細書）。
切断産物の単離法は、これらタンパク質の性質によ
る。テンダミスタットおよびその誘導体の単離法につい
ては、独国特許公開第3,331,860号明細書に引用された
文献が参照されよう。
る。テンダミスタットおよびその誘導体の単離法につい
ては、独国特許公開第3,331,860号明細書に引用された
文献が参照されよう。
本発明は、次の諸例によって詳細に説明される。とく
に記載がない限り、パーセント表示は重量表示である。
諸例中の番号は、それぞれ同番号を付した図面と対応す
る。
に記載がない限り、パーセント表示は重量表示である。
諸例中の番号は、それぞれ同番号を付した図面と対応す
る。
例1: 出発材料としては、プラスミドpKAI650を用いた。こ
のプラスミドについては、独国特許公開第3,536,182号
明細書およびEP−Ａ第0,218,204号明細書に記載があ
る。このプラスミドは、独国特許公開第3,331,861号明
細書に記載されているプラスミドpKAI1から、650bpHinc
II/Sst Iフラグメントの単離およびこれらの酵素で開
環しておいたプラスミドpUC19へのクローニングによっ
て、得ることができる。このプラスミド中の単一のHind
III切断部位を（この酵素による切断、突出末端の埋填
および連結反応によって）除去することによってプラス
ミドpKAI650a（１）が得られる。
のプラスミドについては、独国特許公開第3,536,182号
明細書およびEP−Ａ第0,218,204号明細書に記載があ
る。このプラスミドは、独国特許公開第3,331,861号明
細書に記載されているプラスミドpKAI1から、650bpHinc
II/Sst Iフラグメントの単離およびこれらの酵素で開
環しておいたプラスミドpUC19へのクローニングによっ
て、得ることができる。このプラスミド中の単一のHind
III切断部位を（この酵素による切断、突出末端の埋填
および連結反応によって）除去することによってプラス
ミドpKAI650a（１）が得られる。
CsC1濃度勾配遠心分離法によって精製した（１）のDN
Aの２μｇを、Stu Iを含む反応混合液50μｌ中で酵素製
造者の指示に従って２時間で完全消化させて、酵素はフ
ェノール抽出によって除去する。直線状にしたDNAをエ
タノールで沈澱させて、再溶解させて、５′末端を燐酸
化しておいた化学合成の二本鎖オリゴヌクレオチド
（２）0.1μｇを追加反応物として加えた連結反応混合
物に導入する。
Aの２μｇを、Stu Iを含む反応混合液50μｌ中で酵素製
造者の指示に従って２時間で完全消化させて、酵素はフ
ェノール抽出によって除去する。直線状にしたDNAをエ
タノールで沈澱させて、再溶解させて、５′末端を燐酸
化しておいた化学合成の二本鎖オリゴヌクレオチド
（２）0.1μｇを追加反応物として加えた連結反応混合
物に導入する。
大腸菌（Escherichia coli）JM109をこの連結反応混
合物で形質転換させて、組換えプラスミドpKK3a（３）
を取り込んだクローンを単離する。単離したプラスミド
DNAは、制限酵素Hind IIIの切断部位を有しているので
制限酵素による特徴づけをすることができる。pKK3a
（３）は、pKAI650a（１）よりも塩基対12個分だけ長
く、アミノ酸配列としてアミノ酸４個分が延長された次
の様なヌクレオチド配列を有する。
合物で形質転換させて、組換えプラスミドpKK3a（３）
を取り込んだクローンを単離する。単離したプラスミド
DNAは、制限酵素Hind IIIの切断部位を有しているので
制限酵素による特徴づけをすることができる。pKK3a
（３）は、pKAI650a（１）よりも塩基対12個分だけ長
く、アミノ酸配列としてアミノ酸４個分が延長された次
の様なヌクレオチド配列を有する。
出発材料としては、他に、プラスミドpYE24（４）を
用いる。このプラスミドは、ベクターpUC8をEcoR Iおよ
びHind IIIで開環して、直線状にしたプラスミドにモン
キープロインシュリンの遺伝子を連結して、得られる
（表２、Watekamら:Gene19（1982）179−183を参照され
たい）。
用いる。このプラスミドは、ベクターpUC8をEcoR Iおよ
びHind IIIで開環して、直線状にしたプラスミドにモン
キープロインシュリンの遺伝子を連結して、得られる
（表２、Watekamら:Gene19（1982）179−183を参照され
たい）。
２μｇのプラスミドpYE24（４）を制限酵素EcoR Iお
よびHind IIIと反応させて、モンキープロインシュリン
の遺伝子を電気溶出によって単離し、エタノール沈澱に
よる精製濃縮の後に、これを合成DNAリンカー（５）と
連結させる。
よびHind IIIと反応させて、モンキープロインシュリン
の遺伝子を電気溶出によって単離し、エタノール沈澱に
よる精製濃縮の後に、これを合成DNAリンカー（５）と
連結させる。
連結反応産物（６）を、ここで、Hind IIIで開環して
おいたプラスミドpKK3a（３）に挿入して、その結果、
プラスミドpKK31（７）を得る。この構造物は、テンダ
ミスタット遺伝子のアミノ酸Gly43のコードンの下流に
次のようなブリッジ員子を有することになる。
おいたプラスミドpKK3a（３）に挿入して、その結果、
プラスミドpKK31（７）を得る。この構造物は、テンダ
ミスタット遺伝子のアミノ酸Gly43のコードンの下流に
次のようなブリッジ員子を有することになる。
上記のおよび表２の「B1」は、モンキープロインシュ
リンのＢ鎖の開始点を表す。
リンのＢ鎖の開始点を表す。
プラスミド（７）において、プロインシュリン配列は
テンダミスタット遺伝子中に位置している。このプラス
ミドを本発明のプラスミドに再構築するために、（７）
をSph IおよびSal Iで消化して、フラグメント（８）を
単離する。ベクターpUC19をSph IおよびSal Iで開環し
て得た直線状のプラスミドを、フラグメント（８）と連
結させる。その結果得られるプラスミドpKK310（９）
は、短縮したテンダミスタット配列および上記のリンカ
ーにプロインシュリン配列のみが続いてなる融合タンパ
ク質をコードする。
テンダミスタット遺伝子中に位置している。このプラス
ミドを本発明のプラスミドに再構築するために、（７）
をSph IおよびSal Iで消化して、フラグメント（８）を
単離する。ベクターpUC19をSph IおよびSal Iで開環し
て得た直線状のプラスミドを、フラグメント（８）と連
結させる。その結果得られるプラスミドpKK310（９）
は、短縮したテンダミスタット配列および上記のリンカ
ーにプロインシュリン配列のみが続いてなる融合タンパ
ク質をコードする。
全構築の過程を第１図に示す。
例2: 発現プラスミド中にプラスミドpKK310（９）を再構築
するために、（９）をSst IおよびSph Iと反応させて、
フラグメント（10）を単離する。
するために、（９）をSst IおよびSph Iと反応させて、
フラグメント（10）を単離する。
市販の発現ベクターpIJ702（11）（John Innes Found
ation,Norwich（英国）から入手可能）をSph IおよびSs
t Iで開環して得た直線状のプラスミド（12）を、フラ
グメント（10）と連結させる。ストレプトミセス・リビ
ダンス（Streptomyces lividans）TK24株（John lnnes
Foundation）の形質転換の後、所望のクローンをチオス
トレプトン耐性を選択指標として同定する。チオストレ
プトン耐性クローンからのプラスミドDNAを単離して、
制限酵素分析によって調べる。遺伝子を所望の位置方向
に有しているプラスミドを、pTF1（13）と称する。この
組換えプラスミドを含むクローンは、分子量16kDのタン
パク質を培養培地中に分泌する。このタンパク質は、イ
ンシュリン抗体との「イムノブロッティング」反応で陽
性を示す（例５を参照されたい）。
ation,Norwich（英国）から入手可能）をSph IおよびSs
t Iで開環して得た直線状のプラスミド（12）を、フラ
グメント（10）と連結させる。ストレプトミセス・リビ
ダンス（Streptomyces lividans）TK24株（John lnnes
Foundation）の形質転換の後、所望のクローンをチオス
トレプトン耐性を選択指標として同定する。チオストレ
プトン耐性クローンからのプラスミドDNAを単離して、
制限酵素分析によって調べる。遺伝子を所望の位置方向
に有しているプラスミドを、pTF1（13）と称する。この
組換えプラスミドを含むクローンは、分子量16kDのタン
パク質を培養培地中に分泌する。このタンパク質は、イ
ンシュリン抗体との「イムノブロッティング」反応で陽
性を示す（例５を参照されたい）。
pTF1（13）の構築の過程を第２図に示す。
例3: プラスミドpKK3a（３）およびベクターpUC18の各々を
別個にHind IIIで開環したものを、一緒に連結させる。
連結反応混合物を大腸菌JM109株の形質転換に用いる。
クローニングが成功したことが、イソプロピル−β−チ
オ−ガラクトピラノシド（IPTG）および５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド（Ｘ−Gal）の存在下で形成される無色のコロニーに
よって示される。結果として得られた組換えプラスミド
pRS1（14）を既知の方法で単離する。このプラスミド１
μｇを制限酵素Sst Iで消化して再連結させると、ポリ
リンカー配列（mcs）およびテンダミスタット遺伝子の
残りの部分以外の、pUC18部分が欠失する。このように
してプラスミドpRS10（15）が得られる。
別個にHind IIIで開環したものを、一緒に連結させる。
連結反応混合物を大腸菌JM109株の形質転換に用いる。
クローニングが成功したことが、イソプロピル−β−チ
オ−ガラクトピラノシド（IPTG）および５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド（Ｘ−Gal）の存在下で形成される無色のコロニーに
よって示される。結果として得られた組換えプラスミド
pRS1（14）を既知の方法で単離する。このプラスミド１
μｇを制限酵素Sst Iで消化して再連結させると、ポリ
リンカー配列（mcs）およびテンダミスタット遺伝子の
残りの部分以外の、pUC18部分が欠失する。このように
してプラスミドpRS10（15）が得られる。
プラスミド（15）は、ポリリンカー部分を含有してい
るので、いかなる所望の構造遺伝子のクローニングにも
適している。結果として、短縮したテンダミスタット配
列を含有する対応融合タンパク質をコードするプラスミ
ドができる。
るので、いかなる所望の構造遺伝子のクローニングにも
適している。結果として、短縮したテンダミスタット配
列を含有する対応融合タンパク質をコードするプラスミ
ドができる。
pRS10（15）をSph IおよびSst Iで消化して、単離し
た小さい方のフラグメントを例２と同様にして発現ベク
ターpIJ702に連結することができる。このようにして、
発現ベクターpTF10（16）が得られる。同様にこのプラ
スミドもポリリンカー部分を含有するので、多能な構造
物となっている。
た小さい方のフラグメントを例２と同様にして発現ベク
ターpIJ702に連結することができる。このようにして、
発現ベクターpTF10（16）が得られる。同様にこのプラ
スミドもポリリンカー部分を含有するので、多能な構造
物となっている。
pTF10（16）の構築の過程を第３図に示す。
例4: プラスミドpYE24（４）をEcoR Iで開環して、リンカ
ー を挿入して、プラスミドpYE241を得る。これをHind III
で切断し、Hind IIIで切断しておいたpKK3a（３）に連
結して、例１と同様にしてプラスミドpKK32を得る。こ
のプラスミドは、テンダミスタット配列物が次のような
ブリッジ員子によってプロインシュリンに結合してなる
融合タンパク質をコードする。
ー を挿入して、プラスミドpYE241を得る。これをHind III
で切断し、Hind IIIで切断しておいたpKK3a（３）に連
結して、例１と同様にしてプラスミドpKK32を得る。こ
のプラスミドは、テンダミスタット配列物が次のような
ブリッジ員子によってプロインシュリンに結合してなる
融合タンパク質をコードする。
例１と同様にして、pKK32をSph IおよびSst Iで切断
し、約650bpの大きさのフラグメントを、これら酵素に
よって開環しておいたpUC19でクローニングする。結果
として得られるpKK320は、上記のブリッジ員子を別にす
ると、プラスミドpKK310（９）（リンカーによって導入
された配列は太線で強調されている）に対応するもので
ある。
し、約650bpの大きさのフラグメントを、これら酵素に
よって開環しておいたpUC19でクローニングする。結果
として得られるpKK320は、上記のブリッジ員子を別にす
ると、プラスミドpKK310（９）（リンカーによって導入
された配列は太線で強調されている）に対応するもので
ある。
例２と同様にして、pKK320からの組換え遺伝子を有す
るSst I−Sph IフラグメントをpIJ702でクローニングし
て、その結果、発現プラスミドpTF2が得られる。16kDの
融合タンパク質が、ストレプトミセス・リビダンスTK24
で発現されて分泌される。このタンパク質はインシュリ
ン抗体と反応する（例５を参照されたい）。
るSst I−Sph IフラグメントをpIJ702でクローニングし
て、その結果、発現プラスミドpTF2が得られる。16kDの
融合タンパク質が、ストレプトミセス・リビダンスTK24
で発現されて分泌される。このタンパク質はインシュリ
ン抗体と反応する（例５を参照されたい）。
pTF2の構築は、第１図および第２図に示したpTF1（1
3）の構築と相似しているために、図示されなかった。
3）の構築と相似しているために、図示されなかった。
例5: pKK310（９）の２個のEcoR I切断部位のうちの１個の
みを開環させるように、EcoR Iにて部分消化を行う。突
出末端をクレノウポリメラーゼを用いて埋填した後、プ
ラスミドを再連結して、その結果を制限酵素分析にて調
べる。プロインシュリン遺伝子の末端に位置しているEc
oR I部位が除去されてなる所望のプラスミドを、pKK310
a（17）と称する。したがって、このプラスミドは、短
縮したテンダミスタット遺伝子とプロインシュリン遺伝
子との間のリンカー領域に、EcoR Iの唯一の切断部位を
含有している。
みを開環させるように、EcoR Iにて部分消化を行う。突
出末端をクレノウポリメラーゼを用いて埋填した後、プ
ラスミドを再連結して、その結果を制限酵素分析にて調
べる。プロインシュリン遺伝子の末端に位置しているEc
oR I部位が除去されてなる所望のプラスミドを、pKK310
a（17）と称する。したがって、このプラスミドは、短
縮したテンダミスタット遺伝子とプロインシュリン遺伝
子との間のリンカー領域に、EcoR Iの唯一の切断部位を
含有している。
完全なテンダミスタット配列を有する融合タンパク質
をコードするプラスミドを構築するために、テンダミス
タットをコードするDNA配列（表１）のアミノ酸68/69の
コードン領域に、単一のKpn I切断部位を導入する。す
なわち、pKAI650a（１）をSst IおよびSph Iで消化して
DNAフラグメントを単離して、650bpの大きさのフラグメ
ントを、これら２種の酵素で同様に消化しておいたファ
ージM13mp18RF DNAでクローニングして、既知の方法に
て一本鎖DNAを調製する。このssDNA1μｇを、変異原性
「プライマー」 ５′C GAG GTA CCG GGC GT 3′ 0.1μｇとともに部位特異性突然変異に用いる（M.J.Zol
lerおよびJ.Smith:Nucleic Acid Res.10（1982）6487−
6500）。
をコードするプラスミドを構築するために、テンダミス
タットをコードするDNA配列（表１）のアミノ酸68/69の
コードン領域に、単一のKpn I切断部位を導入する。す
なわち、pKAI650a（１）をSst IおよびSph Iで消化して
DNAフラグメントを単離して、650bpの大きさのフラグメ
ントを、これら２種の酵素で同様に消化しておいたファ
ージM13mp18RF DNAでクローニングして、既知の方法に
て一本鎖DNAを調製する。このssDNA1μｇを、変異原性
「プライマー」 ５′C GAG GTA CCG GGC GT 3′ 0.1μｇとともに部位特異性突然変異に用いる（M.J.Zol
lerおよびJ.Smith:Nucleic Acid Res.10（1982）6487−
6500）。
突然変異遺伝子を有する単離M13クローンから単離し
たRF DNAは、追加のKpn I切断部位によって選択するこ
とができ、また、塩基の交換（Arg68のコードンの３番
目のＧがＣに）が配列決定によって確認される。このよ
うに、ヌクレオチドの交換は、アミノ酸配列には変化を
及ぼさないが、所望の新たな単一切断部位をテンダミス
タット構造遺伝子中に導入する。
たRF DNAは、追加のKpn I切断部位によって選択するこ
とができ、また、塩基の交換（Arg68のコードンの３番
目のＧがＣに）が配列決定によって確認される。このよ
うに、ヌクレオチドの交換は、アミノ酸配列には変化を
及ぼさないが、所望の新たな単一切断部位をテンダミス
タット構造遺伝子中に導入する。
Sst I−Sph I消化の後、突然変異配列物はM13mp18RF
DNAからプラスミドpUC19に移されてそこでクローニング
されて、その結果、pKAI651（18）が得られる。
DNAからプラスミドpUC19に移されてそこでクローニング
されて、その結果、pKAI651（18）が得られる。
例２と同様にして、（18）からの650bp Sst I−Sph I
挿入物がプラスミドpIJ702に組み込まれているのを確認
して、その結果、プラスミドpAX651が得られる。このプ
ラスミドを用いてストレプトミセス・リビダンスTK24を
形質転換させる。得られたテンダミスタットの発現収率
は、非修飾のテンダミスタット遺伝子を含有するプラス
ミドpAX650（独国特許公開第3,536,182号明細書の第３
図）と同じである。
挿入物がプラスミドpIJ702に組み込まれているのを確認
して、その結果、プラスミドpAX651が得られる。このプ
ラスミドを用いてストレプトミセス・リビダンスTK24を
形質転換させる。得られたテンダミスタットの発現収率
は、非修飾のテンダミスタット遺伝子を含有するプラス
ミドpAX650（独国特許公開第3,536,182号明細書の第３
図）と同じである。
本発明の方法によって、テンダミスタットの全アミノ
酸配列を含有する融合タンパク質のためのプラスミドを
調製するために、プラスミドpKAI651（18）をSsh Iおよ
びKpn Iで消化して、小さい方のフラグメントを、リン
カー（19） およびSph IおよびEcoR Iで開環しておいたプラスミドp
KK310a（17）に連結させる。
酸配列を含有する融合タンパク質のためのプラスミドを
調製するために、プラスミドpKAI651（18）をSsh Iおよ
びKpn Iで消化して、小さい方のフラグメントを、リン
カー（19） およびSph IおよびEcoR Iで開環しておいたプラスミドp
KK310a（17）に連結させる。
連結反応混合物を用いて大腸菌JM109を形質転換させ
て、プラスミドDNAを単離して、正しい融合をDNA配列決
定によって検出する。正しい配列を有するプラスミドを
pKK400（20）と称する。
て、プラスミドDNAを単離して、正しい融合をDNA配列決
定によって検出する。正しい配列を有するプラスミドを
pKK400（20）と称する。
リンカー（19）は、テンダミスタットの残りのアミノ
酸だけではなくテンダミスタットおよびプロインシュリ
ン遺伝子を互いに分離させるスペーサー部分もコードす
るものであって、表２に示すような５′末端の遺伝子を
含む次の11個のアミノ酸のコードンを全体で包含してい
る。
酸だけではなくテンダミスタットおよびプロインシュリ
ン遺伝子を互いに分離させるスペーサー部分もコードす
るものであって、表２に示すような５′末端の遺伝子を
含む次の11個のアミノ酸のコードンを全体で包含してい
る。
Phe−Asn−Ala−Met−Ala−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−
Arg このように、融合タンパク質はこのスペーサー中に、
なかでもハロゲン化シアンまたはトリプシンによって切
断することができるアミノ酸メチオニンおよびアルギニ
ンを含有している。
Arg このように、融合タンパク質はこのスペーサー中に、
なかでもハロゲン化シアンまたはトリプシンによって切
断することができるアミノ酸メチオニンおよびアルギニ
ンを含有している。
約1090bpの挿入物をプラスミドpKK400（20）からSst
IおよびSph Iの二重消化によって単離して、そのDNA
を、同じ酵素によって開環しておいたプラスミドpIJ702
（12）に連結させる。その結果、プラスミドpGF1（21）
が得られる。連結反応物でストレプトミセス・リビダン
スTK24を形質転換させて、プラスミドDNAをテンダミス
タット活性を有するチオストレプトン耐性形質転換体か
ら単離する。全ての陽性クローンは、1090bpの大きさの
pGF1 Sst I−Sph I挿入物を含有している。
IおよびSph Iの二重消化によって単離して、そのDNA
を、同じ酵素によって開環しておいたプラスミドpIJ702
（12）に連結させる。その結果、プラスミドpGF1（21）
が得られる。連結反応物でストレプトミセス・リビダン
スTK24を形質転換させて、プラスミドDNAをテンダミス
タット活性を有するチオストレプトン耐性形質転換体か
ら単離する。全ての陽性クローンは、1090bpの大きさの
pGF1 Sst I−Sph I挿入物を含有している。
PGF1（21）の構築の過程を第４図に示す。
テンダミスタット活性は、EP−A1第0,161,629号明細
書の例３および独国特許公開第3,536,182号明細書の例
２に記載されているプレートアッセイ法によって決定す
る。
書の例３および独国特許公開第3,536,182号明細書の例
２に記載されているプレートアッセイ法によって決定す
る。
pGF1によってコードされている融合タンパク質は、既
知の方法にて発現させることができる。形質転換させた
ストレプトミセス・リビダンスTK24株を振とうフラスコ
にて28℃で４日間培養して、遠心分離によって菌糸体を
培養液から除去して、上澄溶液の融合タンパク質を次の
ようにして検出することができる。
知の方法にて発現させることができる。形質転換させた
ストレプトミセス・リビダンスTK24株を振とうフラスコ
にて28℃で４日間培養して、遠心分離によって菌糸体を
培養液から除去して、上澄溶液の融合タンパク質を次の
ようにして検出することができる。
10〜100μｌの溶液を20〜200μｌの15％トリクロル酢
酸と混合し、沈澱したタンパク質を遠心分離によって濃
縮し、洗浄して、SDSを含む試料緩衝液（U.Laemmli:Nat
ure227（1970）680−685）に移す。90℃で２分間インキ
ュベートした後、試料を10〜17％SDSポリアクリルアミ
ドゲル上の電気泳動によって分離する。分子量19kD、す
なわち、テンダミスタットおよびプロインシュリンから
なる融合タンパク質に期待される分子量範囲の分子量を
有するタンパク質が得られる。この融合タンパク質は、
テンダミスタットに対する抗体およびインシュリンに対
する抗体の両方と反応する。
酸と混合し、沈澱したタンパク質を遠心分離によって濃
縮し、洗浄して、SDSを含む試料緩衝液（U.Laemmli:Nat
ure227（1970）680−685）に移す。90℃で２分間インキ
ュベートした後、試料を10〜17％SDSポリアクリルアミ
ドゲル上の電気泳動によって分離する。分子量19kD、す
なわち、テンダミスタットおよびプロインシュリンから
なる融合タンパク質に期待される分子量範囲の分子量を
有するタンパク質が得られる。この融合タンパク質は、
テンダミスタットに対する抗体およびインシュリンに対
する抗体の両方と反応する。
第１図は、複合プラスミドpKK310の構築を図示する、説
明図である。 第２図は、発現プラスミドpTF1の構築を図示する、説明
図である。 第３図は、プラスミドpRS10の構築およびこのプラスミ
ドの発現プラスミドpTF10への再構築を図示する、説明
図である。 第４図は、プラスミドpKK400の構築およびこのプラスミ
ドの発現プラスミドpGF1への再構築を図示する、説明図
である。
明図である。 第２図は、発現プラスミドpTF1の構築を図示する、説明
図である。 第３図は、プラスミドpRS10の構築およびこのプラスミ
ドの発現プラスミドpTF10への再構築を図示する、説明
図である。 第４図は、プラスミドpKK400の構築およびこのプラスミ
ドの発現プラスミドpGF1への再構築を図示する、説明図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (8)
- 【請求項１】所望のタンパク質の構造遺伝子をテンダミ
スタット遺伝子（テンダミスタット遺伝子は修飾された
ものでもよい）のコード鎖の３′末端に結合させ、この
遺伝子構造物の発現をストレプトミセス菌類（Streptom
ycetes）の宿主細胞で行わせ、分泌された融合タンパク
質を上澄液から分離することを特徴とする、融合タンパ
ク質の製造法。 - 【請求項２】結合を、短縮したテンダミスタット遺伝子
の３′末端で行わせる、請求項１に記載の製造法。 - 【請求項３】３′末端に追加の他のタンパク質の構造遺
伝子が結合してなるテンダミスタット遺伝子（修飾され
たものでもよい）を含む、遺伝子構造物。 - 【請求項４】テンダミスタット遺伝子がその３′末端に
おいて短縮されている、請求項３に記載の遺伝子構造
物。 - 【請求項５】請求項３または４に記載の遺伝子構造物を
含む、ベクター。 - 【請求項６】請求項５に記載のベクターを含む、ストレ
プトミセス菌類の細胞。 - 【請求項７】テンダミスタット（修飾されたものでもよ
い）部分のＮ末端部分のみを有する、融合タンパク質。 - 【請求項８】請求項７に記載の融合タンパク質を切断す
ることを特徴とするテンダミスタットまたは修飾された
テンダミスタットおよび追加の他のタンパク質の製造
法、または、追加の他のタンパク質が該融合タンパク質
の融合相手である、請求項１または２に記載のようにし
て得られてなる融合タンパク質の製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873714866 DE3714866A1 (de) | 1987-05-05 | 1987-05-05 | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
| DE3714866.4 | 1987-05-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63301793A JPS63301793A (ja) | 1988-12-08 |
| JP2671260B2 true JP2671260B2 (ja) | 1997-10-29 |
Family
ID=6326841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63110295A Expired - Lifetime JP2671260B2 (ja) | 1987-05-05 | 1988-05-06 | ストレプトミセス菌類における外来性タンパク質の製造法 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0289936B1 (ja) |
| JP (1) | JP2671260B2 (ja) |
| KR (1) | KR970001235B1 (ja) |
| CN (1) | CN1029989C (ja) |
| AR (1) | AR241658A1 (ja) |
| AT (1) | ATE94905T1 (ja) |
| AU (1) | AU612144B2 (ja) |
| CA (1) | CA1338338C (ja) |
| DE (2) | DE3714866A1 (ja) |
| DK (1) | DK175525B1 (ja) |
| ES (1) | ES2045004T3 (ja) |
| FI (1) | FI97549C (ja) |
| HU (1) | HU204094B (ja) |
| IE (1) | IE62522B1 (ja) |
| IL (1) | IL86277A0 (ja) |
| NO (1) | NO178036C (ja) |
| NZ (1) | NZ224464A (ja) |
| PT (1) | PT87400B (ja) |
| ZA (1) | ZA883168B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4012818A1 (de) * | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
| US5426036A (en) * | 1987-05-05 | 1995-06-20 | Hoechst Aktiengesellschaft | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes |
| EP0367163B1 (de) * | 1988-11-03 | 1996-01-03 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten |
| DE3844211A1 (de) * | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| DE3936876A1 (de) * | 1989-11-06 | 1991-05-23 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3331860A1 (de) * | 1983-09-03 | 1985-03-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von tendamistat |
| DE3418274A1 (de) * | 1984-05-17 | 1985-11-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten |
| EP0196056B1 (en) * | 1985-03-28 | 1991-05-22 | Chiron Corporation | Improved expression using fused genes providing for protein product |
| DE3707150A1 (de) * | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Hoechst Ag | Tendamistat-derivate |
| EP0367163B1 (de) * | 1988-11-03 | 1996-01-03 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten |
-
1987
- 1987-05-05 DE DE19873714866 patent/DE3714866A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-04-28 AT AT88106786T patent/ATE94905T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-04-28 ES ES88106786T patent/ES2045004T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 DE DE88106786T patent/DE3884261D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 EP EP88106786A patent/EP0289936B1/de not_active Expired - Lifetime
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