DE3331860A1 - Verfahren zur herstellung von tendamistat - Google Patents

Description

HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT " HOE 83/F 175 Dr.KL/mü Verfahren zur Herstellung von Tendamistat

Tendamistat ist ein^-Amylase-Inaktivator, der durch Fermentation von Streptomyces tendae gewonnen wird. In der deutschen Offenlegungsschrift 27 01 890 (bzw. den US-Patentschriften' 4 226 764, 4 282 318 und 4 339 436) ist

£Φ 5 ein Fermentationsverfahren beschrieben, bei dem der Stamm

S. tendae ATCC 31 210 eingesetzt wird. Gemäß der ver-OO öffentlichten europäischen Patentanmeldung (EP-A 2) 49 _c^ ist dieser Inaktivator ein Peptid aus 74 Aminosäuren (im Gemisch mit weiteren, partiell abgebauten Peptiden), der besonders vorteilhaft durch Fermentation mit S. tendae DSM 1912 (ATCC 31 969) gewonnen wird. In dieser Druckschrift wird der Inaktivator auch als HOE 46 7 bzw. die Komponenten als HOE 467-A und HOE 467-B bezeichnet. Isolierung und Reinigung erfolgen durch Absorption bzw. Chromatographie. Es wurdeauch schon ein Kristallisierverfahren vorgeschlagen (Deutsche Patentanmeldung P 33 09 059.9).

Es wurde nun gefunden, daß die Ausbeute von Tendamistat durch eine Stammverbesserung noch erheblich verbessert werden kann. Während nach den bekannten Verfahren mit dem Stamm DSM 1912 (ATCC 31 969) eine Tendamistat-Ausbeute von 0,07 g/l erreicht wird, wird diese durch die erfindungsgemäße Stammverbesserung auf mindestens 1, meistens sogar 1,5 bis 1,8 g/l erhöht. Die erfindungsgemäße Stammverbesserung v/ird durch Behandlung der Tendamistat produzierenden S. tendae-Stämme, vorzugsweise von S. tendae DSM 2727, mit dem Mutagen Acriflavin. in sublethalen Dosen erreicht. Der Stamm DSM 2727 wurde durch passive Selektion aus dem Stamm DSM .1912 isoliert. Als Selektionskriterium diente die Tendamistatbildung, wobei dieser Stamm ca. 0,0 9 g/l liefert.

Die Erfindung beLrifft weiterhin die verbesserten Stämme, ein diese Stämme charakterisierendes DNA-Segment von ca. 37 kb (Kilobasenpaare) Größe mit definiertem Fragracntmuster,

GOPY /

das Gen für Tendamistat, dieses Gen enthaltende Hybridplasmide und solche Hybridplasmide enthaltende Wirtsorganismen. Die verschiedenen Aspekte der Erfindung und ihre bevorzugten Ausgestaltungen sind in den Patentan-Sprüchen definiert. Im folgenden werden vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung näher erläutert:

Eine Stammverbesserung hinsichtlich der Überproduktion eines Proteins, wie es Tendamistat darstellt, kann durch Verbesserung der Durchlässigkeit des Proteins durch die Zellmembran sowie durch Erhöhung der Syntheserate oder durch Kombination von beiden erreicht werden (J. Mandelstam et al., Biochemistry of Bacterial Growth; Oxford, London, Edinburgh, Boston, Melbourne; Blackwell Scientific Publications, 1982). Eine Steigerung der Syntheserate läßt sich z.B. erreichen auf physiologischem Wege durch Induktion der Genaktivität mittels eines Induktors; auf genetischem Wege durch mutatives Entfernen eines die Ablesung des Gens blockierenden Repressors, durch strukturelle Veränderung regulatorischer Bereiche (Promotoren) vor dem Strukturgen, die eine erhöhte Ableserrate des Gens zur Folge haben, oder durch die Vermehrung der Kopienzahl eines Gens inclusive seiner regulatorischen Bereiche über Genmanipulation. Die Kombination dieser Möglichkeiten wird im Rahmen des genetic engineering in der Regel mit Hilfe von Plasmiden beschritten (R.E. Glass, Gene Function. London; Croom Helm, 1982) .

Es wurde nun gefunden, daß - insbesondere ausgehend vom Stamm DSM 2727 - bedeutend leistungsfähigere Mutanten isoliert werden können nach einer für Streptomyceten bislang nicht beschriebenen Mutationstechnik. Das Mutationsprinzip . besteht darin, daß Acriflavin in niedriger Dosierung von etwa 5 bis 50, vorzugsweise 10 bis 30, ,ug pro ml Kulturlösung über den gesamten Zeitraum des Zellwachstums in einer Schüttelkultur einwirkt. Vorteilhaft ist die Verwendung des Fermentationsmediums als Schüttelkulturmedium. 12-24 Std. nach Erreichen der stationären Wachstumsphase werden die mutierten

Zeilverbände homogenisiert und die aus 5-10 Zellen bestehenden Mycelbruchstüeke auf einem Agarmedium ausplattiert. Die aus diesem ausgewachsenen, mutierten Zellklone werden auf Schrägagarröhrchen vermehrt und in der Schüttelkultur getestet. Die Selektion überproduzierender Stämme erfolgt über die Messung des (^-Amylasegehaltes im Fermentationsmedium. So selektionierte Mutanten, wie die Stämme 1-9353» 1-9362 und 1-9418, treten mit außergewöhnlich hohen Mutationsraten auf. Die Produktionserhohung gegenüber dem Stand der Technik'(DSM 1912) beträgt oft mehr als 2000 %.

Es wurde weiterhin gefunden, daß die Mutanten gegenüber dem Staiim DSM 1912 eine um weitere 60 % verringerte Bildung eines roten Pigmentes (vgl. EP-A 49 847) aufweisen. Die vermehrte Bildung an Tendamistat sowie der wesentlich geringere Verunreinigungsgrad der Kulturlösung erleichtern folglich die Aufarbeitung des inaktivators und stellen somit einen bedeutsamen verfahrenstechnischen Fortschritt dar.

Es wurde gefunden, daß die erhaltenen Mutanten genetisch stabil sind, d. h. ihre Produktivität bleibt über mehrere Generationen erhalten. Die Stämme und deren Abkömmlinge eignen sich somit zur Produktion von Inaktivator in großem Maßstab durch Fermentation.

Es wurde durch molekularbiologische Analyse bewiesen, daß die Überproduktion des Tendamistat auf die Vermehrung des entsprechenden Gens zurückzuführen ist. Diese Genmanipulation wurde aber nicht auf üblichem Wege durch Einführen eines MuIticopy-Plasmids, welches das Gen enthält, erreicht. Durch die hier beschriebene Art der Mutation wurde vielnehr eine tiefgreifende Umorientierung und Neuorganisation der DNA des Stammes bewirkt, in deren Rahmen ein genetisches,

offenbar chromosomales DNA-Element von ca. 37 kb Größe neu gestaltet und selektiv vermehrt wurde. Das Gen für Tendamistat wurde

im Rahmen dieses Genom-Rearrangements von seiner ursprüngliehen Lage auf einem 4,1 kb großen Pst I-Fragment auf der chromosomalen DNA der Ausgangsstamme auf das

37 kb-Element der Mutanten verlagert (transponiert) . Gleichzeitig mit der Vermehrung des 37 kb-Elements trat somit eine Amplifizierung des Tendamistat-Gens auf. Spontan auftretende Amplifikationen von DNA sind für Streptomyceten in neuester Literatur beschrieben (H. Schrempf, Mol. Gen. Genet. 189 (1983) 501), jedoch ist kein vergleichbarer Fall der Amplifikation eines definierten Gens und der damit verbundenen Überproduktion eines Proteins bislang gefunden worden.

Das amplifizierte DNA-Element aus den überprodusierenden Stämmen wird nach Spaltung der isolierten chromosomalen DNA mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen und nach elektrophoretischer Trennung in 0,5 - 1,5 % Agarosegelen durch Anfärbung mit Ethidiumbromid sichtbar. Molekulare Hybridisierungen unter Nutzung allgemein beschriebener Verfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning.A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, 1982) mit klonierten Sequenzen der amplifizierten DNA zeigen, daß lediglich Teilbereiche des

Elements in den Ausgangsstammen vorhanden

sind, aber nicht vermehrt vorliegen.

Es wurde gefunden, daß man die chromosomale DNA von Streptomyces tendae sowie der Mutanten nach Zentrifugation im CsCl-Dichtegradienten isolieren kann, wenn die Zellen in Hauptkulturmedium angezüchtet, gewaschen, in Tris-EDTA-NaCl haltigem Puffer mit Lysozym behandelt und mit einem Detergenz (Natriumsalz von N-Lauroylsarcosin) lysiert werden. Die Kopienzahl des Inaktivator-Gens läßt sich abschätzen, wenn man eine dem Gen homologe Probe radioaktiv markiert und in einem Southern-Hybridisierungsexperiment (Southern, 1975) gegen äquivalente Mengen chromosomaler DNA von Ausgangsstamm

(z.B. DSM 2727) und isolierten Mutanten hybridisiert. Die Menge an gebundener Radioaktivität ist dann proportional zur Häufigkeit des Gens in den verglichenen DNA-Spezies. (F.C. Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1541). Die homologe Probe stellt entweder das isolierte Gen selbst dar oder einen chemisch synthetischen Teilbereich des Gens, dessen DNA-Sequenz abgeleitet wurde aus der Primärsequenz des Proteins. Danach hybridisiert die Probe zu einem 2,3kb großen Pst I-Fragment der amplifizierten DKA, z.B. der überproduzierenden Mutante 1-9362, jedoch zu einem 4,7kb großen Pst I-Fragment der _{DNA der} Ausgangsstamme· Die Hybridisierungsrate ist ca. 20 mal höher zur 1-9362 DNA, so daß eine Genaraplifikation um einen Faktor >20 geschlossen werden kann. Das entspricht der Steigerung der Produktbildung durch die neuen Mutanten.

Die das Tendamistat-Gen enthaltende DNA kann in bekannter Weise (Maniatis et al., a.a.O.) in Plasmide wie pBR 322 eingebaut und in Wirtsorganismen wie E. coil kloniert und vermehrt werden. Die vermehrte DNA kann für weitere Stammverbesserungen herangezogen werden.

Tendamistat ist von großem therpeutischen Interesse bei der Behandlung weitverbreiteter Stoffwechselkrankheiten wie Diabetes mellitus, Adipositas oder Hyperlipoproteinämie: Oral aufgenommen inhibiert der Inaktivator die intestinal vorkommende menschliche ts<-Amylase. Dosisabhängig kann durch den Inaktivator nun Einfluß genommen werden auf die Menge anfallender Glucose im Darm, die durch die *C-Amylase aus der Stärke gebildet wird, und damit auch direkt auf den Glucosegehalt im Blut. Durch Applikation des Inaktivators wird der gefürchtete, im Falle der o. g. Krankheiten unkontrollierte, Anstieg des Blutzuckerspiegels nach den Mahlzeiten reguliert und ein neuer Weg zur Theraphie rnetabolischer Krankheiten eröffnet (Meyer et al., The Lancet, April I983, 934).

In den folgenden Beispielen beziehen sich Prozentangaben auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist.

Charakterisierung des AusgangsStamms DSM 2727 Streptomyces tendae:

Morphologie der Sporenkette * - retxnaculum apertum

Sporenoberfläche - glatt Sporenform - kugelig Farbe Luftmycel - grau (e) Substratmycel - oliv-rotbraun

physiolog. Test: Melaninbildung negativ

Verwertung von

D-Glucose +

D-Arabinose +

D-Xylose +

Fructose +

Rhamnose +

Saccharose +

Raffinose +

Mannit +

Inosit -

Lactose +

Beispiel 1

Mutations-Verfahren: Ca. 0,25 cm versporten Mycels des Stammes DMS 2727, der auf Haferflockenagar angezüchtet wird (EP-A 49 847), werden in 100 ml Erlenmeyer-Kolben überimpft, die mit 25 ml des folgenden Kulturmediums gefüllt sind:

Sojamehl 2 %

Glucose 3 %

Maisstärke 0,2 %

Harnstoff 0,1 %

Ammoniumeitrat 0,1 %

Malzextrakt 0,5 %

KH₂PO₄ 0,2 %

τ - „

Das Medium wird 30 Minuten bei 121⁰C und 1 Bar autoklaviert, der pH-Wert beträgt 7,0. Die Impfkolben werden 2 Tage bei 30⁰C auf einer Schüttelmaschine inkubiert. Dann werden 2 ml der gewachsenen Vorkultur in 20 ml Hauptkulturmedium, das sich in 100 ml Erlenmeyer-Kolben befindet (EP-A 49 847), überimpft:

lösliche Stärke 2 - 4 %

Sojamehl 0,4 %

Q Cornsteep flüssig 0,4 %

Magermilchpulver 0,7 %

Glucose 1,0 %

^ pn 1 ? <£

Der pH-Wert des Mediums beträgt nach dem Autoklavieren pH 7,6.

Diesem Medium wird Acriflavin in einer Konzentration von 10 25 /Ug/ml als mutagenes Agens zugesetzt. Die Kultur wird für 5 Tage bei 28°C und 220 U/min geschüttelt. Danach wird die Kulturlösung zentrifugiert (1 300 g, 5 Minuten) und das Zellpellet in Hauptkulturmedium gewaschen. Die gewaschenen Zellen v/erden mit einem Glashomogenisator fragmentiert und auf Agarplatten mit folgendem Medium ausplattiert:

25	Rohrzucker	0,3
	Dextrin '	1,5
	NaCl	0,05
	K2HPO4	0,05
	FeSO^ χ 7 H20	0,001
30	Tryptone Soja Broth (Fa. Oxoid)	0,5
	Fleischextrakt (Fa. Difco)	0,1
	•Hefeextrakt (Fa. Difco)	0,2
35	Agar (Fa. Merck)	1,5

Der pH-Viert der Lösung beträgt 7,1 (Autoklavierungsbe dingungcn wie oben).

Die Platten werden 5 Tage bei 28°C bebrütet und Einzelkolonien in Schrägröhrchen mit Haferflockenagar überimpft. Diese werden wie beschrieben bebrütet, bis das Mycel versport ist. Das versporte Mycel wird wie oben beschrieben in der Vor- und Hauptkultur vermehrt und das Kulturfiltrat nach 5-tägiger Hauptkultur auf seinen Gehalt an Tendamistat geprüft (vgl. EP-A 49 847). Auf diese Weise können die Stämme 1-9353, 1-9362, 1-9417, 1-9418 selektioniert werden, die in ihrer Wachstumsperiode unter den beschriebenen Bedingungen ca. 90 000 - 100 000 IE Tendamistat/1 Kulturlösung, entsprechend 1,5 - 1,8 g Inaktivator/1 produzieren.

Beispiel 2

Man arbeitet gemäß Beispiel 1, jedoch wird die Hauptfermentation in einem Fermeter von 10 1 Gesamtvolumen mit einer 7 1-Füllung mit Hauptkulturmedium wie unter Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Als Stämme werden die Stämme 1-9353 und 1-9362 fermentiert. Beimpft wird die Hauptkultur mit 100 - 300 ml der unter Beispiel 1 beschriebenen Vorkultur. Die Fermentation erfolgt bei 3O⁰C bei einer Belüftungsrate von 300 l/h und einer Rührung von 70 0 - 900 Upm.

Durch Probeentnahme wird der Fermentationsverlauf hinsichtlieh der Inaktivatoraktivität, des Substratabbaus und der Biomasseentwicklung überv/acht und verfolgt. Die Fermentation wird am Ende der exponentiellen Wachstumsphase abgebrochen. Die maximale Inhibitoraktivität wird nach ca. 60 -SO Stundep nut ca. 1,2 - ¹ >⁵ S^/:L erreicht. Danach wird der Fermentationsinhalt der Aufarbeitung zugeführt.

Beispiel 3

Isolation der Desoxyribonucleinsäure aus S. tendae und deren molekularbiologische Charakterisierung.

Die Anzucht der Zellen erfolgt entsprechend Beispiel 1. Nach 3-tägigem Wachstum im Hauptkulturmedium werden die Zellen eines Erlenmeyer-Kolbens durch 5-minütige Zentrifugation bei 3000 g bei ¹J⁰C geerntet und zweimal mit 50 ml einer Lösung aus 50 mM Tris/HCl-Puffer, 100 mM NaCl und 25 mM EDTA gewaschen. Bei einer typischen Präparation werden 3 g fest-zentrifugierter Zellen in flüssigem Stickstoff bei -198°C schockartig tiefgefroren und anschließend mit einem Schneidmesserhomogenisator (Warring Commercial Blender) in Gegenwart von N_?

zu einem.feinen Pulver homogenisiert. Dieses Pulver wird in 10 ml des genannten Puffers aufgenommen, auf Eis gelöst und mit 0,8 ml Lysozymlösung (30 mg/ml) 20 Minuten bei 28°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Der Suspension wird dann 0,8 ml einer Proteinase K-Lösung (15 mg/ml) und 0,8 ml einer 20 % Lösung des Natriumsalzes von N-Lauroylsarcosin zugefügt. Nach vorsichtigem Mischen wird das Gemisch 30 Minuten auf Eis und weitere 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach Zugabe und Lösung von 22 g festem Caesiumchlorid wird das Volumen mit dem obengenannten Puffer auf 22 ml eingestellt und aie Suspension bei 12 000 g und 4⁰C 25 Minuten zentrifugiert. Das klare Zentrifugat wird mit Ethidiumbromid versetzt und der Brechungsindex mit CsCl refraktometrisch auf n= 1 , 3920 eingestellt. Nach präparativer Ultrazentrifugation (120 000 g, 36 Std., 15⁰C) wird die Bande ehromosomaler DNA aus den Zentrifugenröhrchen entnommen und unter denselben Bedingungen rezentrifugiert. Die isolierte Bande wird durch Ausschütteln mit n-Butanol vom Ethidiumbromid befreit und zur restlosen Entfernung des CsCl dialysiert. Die so gewonnene DNA ist schneidbar z.B. mit den Enzymen Pst I, Bam H I, Sau 3a ,q j BgI II und Xho I, und nicht schneidbar z.B. mit den Endonukleasen Eco R I und Hind III.

Die beispielsweise aus den Mutanten 1-9353 und 1-9362 gewonnene DNA ist gegenüber der DNA von ATCC 31210 bzw.DSM 2727 charakterisiert durch ein amplifiziertes genetisches Element, dessen Einzelfragmente deutlich sichtbar nach Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid aus

dem Hintergrund nicht selektiv vermehrter Fragmente hervortreten. Die Größe des amplifizierten Elementes sowie die charakteristischen Einzelfragmente nach Verdauung mit Restriktionsendonukleasen sind nachfolgend wiedergegeben:

Fragment	Pst I	Fragmentgröße	(kbp)	Bam H I
Nr.	9,0	Xho I	7,2
1	7,0	13,5	6,1
2	6,8	11,5	5,3
3	4,6	9,3	2,9
4	3,4	2,8	2,6
5	3,1	0,7	2,5
6	2,3		2,15
7	' υ		2,1
8			1,5
9			1,2
10			1,1
11			1,0
12			0,8
13			0,5
14			0,48
15	37,3		37,43
Gesamt	37,8

Beispiel 4

Klonierung von Teilsequenzen des amplifizierten genetischen Elements aus der Mutante 1-9362.

100 ,ug der nach Beispiel 3 isolierten DNA.aus 1-9362 werden vollständig mit der Restriktionsendonuklease Pst I verdaut. Die bei der Verdauung entstandenen DNA-Fragmente werden in einem 0,8 #-Gel aus niedrigschmelzender (low melting point) Agarose gelelektrophoretisch aufgetrennt und nach Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht. Bereiche des Gels, die

durch ihre intensive Fluoreszenz auffallende, amplifizierte DNA-Fragmente enthalten, werden sorgfältig ausgeschnitten und die DNA nach Schmelzen des Gels bei 68⁰C (2 Minuten) durch zweimalige Extraktion mit wassergesattigtem Phenol und anschließender Etherextraktion isoliert. Die DNA wird aus der so erhaltenen wäßrigen Phase durch Ammoniumacetat-Fällung konzentriert und zur weiteren Reinigung mit N,N'-Bis-(3-aminopropyl)-1,4-butandiamin (spermin) umgefällt. Die so erhaltene DNA wird in einem 25 /Ul Reaktionsansatz mit der DNA des gereinigten, Pst I-verdauten und mit dem Enzym Alkalische Phosphatase behandelten Plasmids, z.B.pBR 322, mit Hilfe des Enzyms T4 DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsgemisch wird in für die Aufnahme von DNA mit CaCl„ kompetent gemachten Zellen von Escherichia coli HB 101 transformiert.

Transformierte Zellen, die ein rekombinantes Plasmid mit einem in die Pst I-Schnittstelle insertierten DNA-Fragment enthalten, sind resistent gegen das Antibiotikum Tetracyclin, jedoch sensitiv gegen das Antibiotikum Ampicillin. Die Selektion von Klonen mit dem Hybridplasmid erfolgt demnach durch Replika-Plattieren von Agarplatten mit Tetracyclin auf Agarplatten mit Ampicillin.

Um zu prüfen, in welchem E. coli-Klon sich ein rekombinantes Plasmid mit einem Insert aus der amplifizierten DNA befindet, wird die Plasmid-DNA aus den einzelnen E. coli-Klonen mit Hilfe der "Rapid Boiling"-Methode (Holmes und Quigley, Analyt. Biochem. 114 (I98I) 193) isoliert und mit dem Enzym Pst I verdaut. Alternativ wird die DNA beispielsweise mit den Endonukleasen Bam H I und Sal I nachverdaut, da Schnittstellen dieser Enzyme für das jeweilige klonierte Fragment spezifisch sind. Die erhaltenen Fragmentmuster werden nach Auftrennung in Agarose-Gelen mit den Fragmentmustern der entsprechend verdauten DNA aus der niedrigschmelzenden Agarose verglichen. Im Falle übereinstimmender Größe und Anzahl der Teilfragmente wird die Plasmid-DNA" dann zusätzlich mittels Nick-Translation radioaktiv markiert

333*880

und in einem Southern-Hybridisierungsexperiment gegen die Restriktionsfragmente der Gesamt-DNA aus 1-9362 nach Verdauung mit den o. a. Enzymen hybridisiert. Die Identifizierung eines klonierten Fragments als Bestandteil des amplifizierten genetischen Elementes gilt dann als gesichert, wenn a) die Fragmentmuster identisch sind mit denen der DNA aus 1-9362 nach Anwendung verschiedener Restriktionsenzyme und wenn b) das klonierte Fragment ausschließlich gegen das homologe Fragment aus der amplifizierten DNA des 1-9362 TO hybridisiert.

Auf diesem Wege wurde ein 2,3 kb großes Fragment der amplifizierten DNA in E. coli kloniert, welches gemäß Beispiel 3 das komplette Gen für Tendamistat enthält. Das 2,3 kb große Pst I-Fragment mit dem Tendamistat-Gen ist charakterisiert durch die Reihenfolge, die Lage und die Größe einzelner Teilfragmente, produziert durch die Restriktionsenzyme Pst I, Bam H I und Sal I. Die Struktur des rekombinanten Plasmids pKAI 1 ist in Figur 1, die Struktur des klonierten 2,3 kb Fragments in der Figur 2 wiedergegeben. Die einzelnen hier angewandten molekularbiologischen Arbeitsmethoden sind bei Maniatis et al. (a.a.O.) beschrieben.

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Claims (10)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Tendamistat durch Fermentation von Streptomyces tendae, dadurch gekennzeichnet, daß Tendamistat produzierende S. tendae-Stämme eingesetzt werden, die mit sublethalen Dosen

Acriflavin behandelt wurden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 5 bi-s 50 ug Acriflavin pro ml Kulturlösung eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß 10 bis 3.0 μg Acriflavin pro ml Kulturlösung eingesetzt werden.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Acriflavin über den gesamten Zeitraum des Zellwachstums einwirkt.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der S. tendae-Stamm DSM 2727 eingesetzt wird.

6. Tendamistat produzierende Stämme der Art S. tendae,
die mit sublethalen Dosen Acriflavin behandelt wurden und deren Tendamistat-Produktion auf mindestens 1 g/l erhöht wurde.

7. Streptomyces tendae-Starnm DSM 2727.

8. DNA-Fragment mit dem Gen für Tendamistat, erhältlich
aus Stämmen gemäß Anspruch 6.

9. Hybridplasmido, enthaltend die DNA gemäß Anspruch 8.

10. Wirtsorganismus, enthaltend ein Plasmid gemäß Anspruch

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