JPH02104298A - １，５−アンヒドログルシトールの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔利用分野〕 本発明は１．５−アンヒドログルシトール（以下１．５
−ＡＣと言う）の正確、迅速でかつ自動分析装置にも応
用可能な測定方法に関するものである。

〔従来技術〕

１．５−ＡＣはヒト髄液及び血清中に存在し、ある種の
疾患特に糖尿病において血清中の量が低下することが報
告されている化合物である。

従来１．５−ＡＧを測定する方法は、主にガスクロマト
グラフィー法によって行われていた。最近、試料中の１
．５−ＡＧの測定に１．５−ＡＣ特異性酵素を用いた測
定法（特開昭６２−７９７８０）が開発された。

また、１．５−ＡＣをピラノースオキシダーゼ又はＬ−
ソルボースオキシダーゼを用いて測定する方法（特開昭
６３−１８５３９７）等が報告されている。しかし、後
者の方法においてはピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソ
ルボースオキシダーゼが基質特異性において厳密でない
ために健状人で通常、１００　ｍｇ／ａ、　Ｉ！尿病患
者テハｌｏ００１ｎｇ／ｃｌＪ！ニモ達するグルコース
等のような共存するＩ！頻に反応し、測定できない。そ
のため、グルコースの様なｔｉ類を除去する目的のため
イオン交換樹脂を充填したカラムに試料を通し、そのの
ちＬ５−ＡＧをピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボ
ースオキシダーゼを用いて測定する方法、または試料中
のグルコースをグルコースオキシダーゼで処理し、その
結果生成する過酸化水素をカタラーゼで分解後、残存す
る１、５−ＡＣ；をピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソ
ルボースオキシダーゼで測定する方法、さらには試料を
前処理した後、ヘキソキナーゼでグルコースをグルコー
ス−６−リン酸に変換後、残存する１、５−ＡＣをピラ
ノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼで
測定する方法がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、１．５−ＡＧ特異性酵素を使用する方法
はその基質特異性がそれ程厳密で無い事より測定の際に
は誤差の原因となりやすく、またカラムを使用して糖類
を除去したのちに、ピラノースオキシダーゼ又はし−ソ
ルボースオキシダーゼを作用させる方法は操作が繁雑で
あり、近年各種の臨床検査項目に対して実施されている
自動分析機器での自動化への適用が難しい。またグルコ
ースの除去のためにグルコースオキシダーゼを用いる方
法は、試料中の溶存酸素の消費が後のピラノースオキシ
ダーゼ又は１．−ソルボースオキシダーゼの反応を阻害
し、さらにグルコースオキシダーゼのＫｍ値が大きい為
、試料中のグルコースを完全に処理できない。グルコー
スの除去の為にヘキソキナーゼを用い、残存する１、５
−ＡＣをピラノースオキシダーゼで測定しようとした場
合、ヘキソキナーゼで完全にグルコースを除去できなか
ったり、ピラノースオキシダーゼの反応時間が長く、正
確な定量を迅速に行うことができないなどの問題点があ
った。

（問題点を解決するための手段およびその作用〕本発明
者等は、簡便で実用的な１．５−ＡＣの測定方法即ち自
動分析機器にも応用可能な方法を検討し、本発明を完成
した。

本発明は、試料中に共存するグルコースを効率良く除去
し、試料中の１．５−ＡＣを正確、迅速に測定する方法
を提供するものであり、詳細にはマグネシウムイオン、
アデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと言う）、ホスホエ
ノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナー
ゼ或いはグルコキナーゼと試料を反応させ、試料中のグ
ルコースをグルコース−６−リン酸に変換後、残存する
１、５−ＡＣにピラノースオキシダーゼまたは１．−ソ
ルボースオキシダーゼを反応させ、生成した過酸化水素
をパーオキシダーゼと各種の基質を使用して測定する方
法に関する。

ついで本発明の詳細な説明する。グルコースのグルコー
ス−６−リン酸への変換はマグネシウムイオン、ＡＴＰ
の存在下でヘキソキナーゼ或いはグルコキナーゼによっ
て行われるが、本発明者らの研究によればＡＴＰ１度が
反応に大きく影響することを見出した。つまりＡＴＰが
少量の場合、グルコースの変換が充分になされ難く、ま
た逆に多量の場合は以後のピラノースオキシダーゼ又は
Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、パーオキシダーゼ。

過酸化水素検出試薬の反応を抑制することが判明した。

この問題を解決するためホスホエノールピルビン酸、ピ
ルビン酸キナーゼを測定系に存在させた。即ち、ヘキソ
キナーゼまたはグルコキナーゼとグルコースの反応でＡ
ＴＰはＡＤＰへと変換されるが、ホスホエノールピルビ
ン酸、ヘキソキナーゼを存在させることによってＡＤＰ
は再びＡＴＰとして供給されるため、測定系でのＡＴＰ
濃度は一定の範囲内にコントロールされる。従って、測
定系でのＡＴＰ濃度を最適な範囲にコントロールする事
が可能となり、上記のような問題点は認められず、迅速
で簡便な測定が出来、さらに操作が簡便であるので自動
化測定をもたやすくなった。

本発明に使用するグルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピ
ルビン酸キナーゼ、ピラノースオキシダーゼ、Ｌ−ソル
ボースオキシダーゼ及びパーオキシダーゼは国際生化学
連合の分類に従い各々ＥＣ２，７，１，２、ＥＣ２，７
，１，１、ＥＣ２，７，１，４０、ＥＣ１，１，３，ｉ
ｏ　、ＥＣ１，１，３，１１及びＥＣ１，１１，１，７
と分類されるものであり、臨床検査に使用できるほどに
精製されたものが好ましい。またホスホエノールピルビ
ン酸等の試薬は反応に際して妨げとならない程度に精製
されたものが用いられる。各々の酵素及び試薬の使用量
は、反応温度、反応時間、反応ｐ）Ｉ、酵素の起源や試
薬の純度により左右されるが、概ね以下に示す量であれ
ばよい。グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼは４〜１
００　Ｕ／ｍｆｌ、ピルビン酸キナーゼは０．５〜１２
１１／厩、ホスホエノールビルピン酸は１〜１０ｍＭ、
ＡＴＰは０．３〜１．４ｍＭ、マグネシウムイオンは３
〜７０ｍＭ、ピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボー
スオキシダーゼはｌＯ〜５００Ｕ／　ｄが使用される。

反応温度は５〜４０°Ｃ１好ましくは２５〜４０″Ｃで
反応時間は１分〜６０分で好ましくは１分〜１０分であ
る。更に、グルコースを効率良く変換するためにムタロ
ターゼを共存させてもよく、その場合の使用量は概ね０
．２５〜４．ＯＵ／　ｍｌである。反応により生成した
過酸化水素の定量には高感度に定量できる方法であれば
いずれでもよいが、通常はペルオキシダーゼを使用して
、各種の基質を過酸化水素で酸化し、生成した色素を分
光光度計などで測定する方法が簡便でかつ自動測定装置
に好適である。又、生成する過酸化水素を測定する代わ
りに消費した酸素を適当な方法で検出してもよい。

次に本発明を試験例及び実施例で説明するが、本発明は
これらにより制限されるものではない。

試験例１　ヘキソキナーゼの１．５〜ＡＣへの反応性各
種濃度の１．５−Ａ−Ｇへのヘキソキナーゼの反応性を
下記条件で検討した。なお健常人の血漿１．５−ＡＧ濃
度の平均値は約２■／ｄ１〔日本臨床、４４巻夏期臨時
増刊号（１９８６）　）である。１．５−ＡＣ濃度とし
て　０．１．２．５．１０．１５及び２０■／ｄ１溶液
０．０５戒に１３ｍＭＯＭｇＣ１ｇを含有する５０ｍＭ
　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　２．６ｒｎ１に
５００ｕ／　ｒｒｄｌ濃度のヘキソキナーゼ溶液を０．
１ｍｌ、１６ｍＭのＡＴＰ溶液を０　、１　ｍｆｌ、４
ｈＭのホスホエノールピルビン酸溶液をｏ、ｉｒｄ。

６ｍＭのＮＡＤＨ溶液を０．１戚及び５０ｕ／戒のピル
ビン酸キナーゼと５０ｕ／　ｒｔｄｌのラフティトデヒ
ドロゲナーゼを含む溶液０．１ｄを加え、３７°Ｃで反
応させ、３４０ｎｍの吸光度変化を測定することにより
、ヘキソキナーゼの１．５−ＡＧの反応性を確かめた。

いずれの濃度においても１．５−ＡＣを含まないものと
反応に差は認められなかった。即ちヘキソキナーゼは１
．５−ＡＣに反応しないことが判明した。

試験例２　グルコキナーゼの１．５−ＡＣ；への反応性
ヘキソキナーゼ溶液に代わり、１０００ｕ／ｍｌ濃度の
グルコキナーゼ溶液を使用した点以外は、試験側上と同
様に検討した。その結果、ヘキソキナーゼの場合と同様
、グルコキナーゼは１．５−ＡＧに反応しないことが判
明した。

ｆｉ　　ヘキソキナーゼによりグルコースを処理する際
のＡＴＰ濃度の影響 試料として５００ｍｇ／　ａのグルコース溶液或いは水
０．０５ｍ１に１．１５ｕ／ｍＩｔのムタロターゼ、　
４．６ｕ／　ｒｔｒｌのパーオキシダーゼ、　０．０５
８ｍｇ／ｄ１の４−アミノアンチピリン、　０．３７ｍ
ｇ／戚のＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジン＋　１３ｍＭのＭｇＣ１
ｇを含有する５０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）を２．８ｍｉ、　　５００ｕ／−濃度のヘキソキナ
ーゼ溶液を０．１成及び各種濃度のＡＴＰ溶液０．１ｄ
　゛を加え、３７°Ｃで１０分間反応させた後、５００
ｕ／　ｒｏｌｌ濃度のピラノースオキシダーゼ０．１ｄ
を添加し、３７°Ｃで１０分間反応させ、５５０ｔｖの
吸光度を測定した。

グルコース溶液を含有する試料と含有しない試料との吸
光度の差を第１表に示す。ＡＴＰ濃度が高まるに従い、
５５０ｎｍの吸光度の差は減少する。

＾ＴＰ濃度としては３３０ｍＭ以上を必要とすることが
判明した。

試験例４　グルコキナーゼによりグルコースを処理する
際のＡＴＰ濃度の影響 ヘキソキナーゼ溶液に代わり、１０００ｕ／ｍ１度のグ
ルコキナーゼ溶液を使用した点以外は拭駁桝主と同様に
操作した。

結果を第２表に示す。νＪ創例」−と同様に３３０＋＋
Ｍ以上のＡＴＰ濃度を必要とすることが判明した。

（以下余白） 第２表 試験例５　ピラノースオキシダーゼ、パーオキシダーゼ
、過酸化水素検出試薬によって１．５−ＡＧを測定する
際のＡＴＰの濃度の影響２０ｍｇ／ｄの１．５−ＡＣ？
容ン夜０．０５ｄに４．６ｕ／蔵のパーオキシダーゼ、
　０．０５８ｎ＋ｇ／ｉｆの４−アミノアンチピリン、
　０．３１ｍｇ／ｍｌのＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−ｍ〜トルイジン、　１３
ｍＭのＭｇＣｌ□を含有する５０ｍＭ　）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）　２．８ｍＡと、各種濃度のＡＴＰ
溶液を０．１ｍ、　１ｏｏＯｕ／ｍ１ｆ１度のピラノー
スオキシダーゼ０．１ｍｆｌを加え、３７°Ｃで反応さ
せ５５０ｎｍの吸光度の変化を測定した。第１図に示す
ようにＡＴＰ１度が高濃度の場合、吸光度の上昇が抑制
されることが判明した。都３先例」ユや試験例４に示し
た様に試料中のグルコースを除去するには、ＡＴＰ濃度
として３３０ｍＭ以上を必要とするが］の結果ではこの
ような高い濃度ではピラノースオキシダーゼの反応を阻
害し、正確な測定ができないことが判明した。

２　　ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ
を都４先例」−の試薬に加えた時の１．５−ＡＣを測定
する際のＡＴＰの濃度の影響 Ｕ例」−のＡＴＰ溶液として、１６．５ｍＦＩのＡＴＰ
。

４９ｍＭのホスホエノールピルビン酸及び５０ｕ／ｄの
ピルビン酸キナーゼ溶液を含む試液０．１　ｄを使用し
た結果、第２表の３３０ｍＭのＡＴＰ溶液の場合と同様
にグルコースを含有した試料と含有しない試料との吸光
度差は認められず、少量のＡＴＰ濃度で完全にグルコー
スと反応することが判明した。このことはヘキソキナー
ゼによってＡＴＰがＡＤＰに変換したのち、ホスホエノ
ールピルビン酸及びピルビン酸キナーゼを共存させるこ
とによって、ＡＤＰがＡＴＰとしてリサイクルで供給さ
れるためＡＴＰの欠乏をもたらさないためである。

裏施拠土　血清中１．５−ＡＣの測定 ■グルコース処理にヘキソキナーゼを用いた場合試薬Ａ
　　１．２５ｕ／ｍｊ！ムタロターゼ。

４．９２ｕ／成パーオキシダーゼ。

０．０６２ｍｇ／ｍ１４−アミノアンチピリン。

１９．９ｕ／−ヘキソキナーゼ。

０．６６ｍＭ　　Ａ　Ｔ　Ｐ　。

１　、９６ｍＭホスホエノールピルビン酸。

２．４ｕ／ｍｌ　　ピルビン酸キナーゼ。

試薬Ｂ　　２００ｕ／＋＋ｊ！ピラノースオキシダーゼ
ヒト血清０．０５ｍｆに試薬Ａ２．５ｒｎｌを添加し、
３７°Ｃで５分間反応させた。その後試薬Ｂ−ｔ−０．
５ｄ添加し、５分後の５５０ｎｍでの吸光度を測定した
。なお、同時にヒト血清の代わりに精製水を用いたブラ
ンクも測定した。あらかじめ作製した１、５−ＡＣ標準
検量線を用いて、血清中１，５〜ＡＣ濃度を測定すると
２．３ｍｇ／ｄ１と判明した。

■グルコース処理にグルコキナーゼを用いた場合ヘキソ
キナーゼに代わり３３ｕ／ｄグルコギナーゼを使用した
以外は■と同様に操作した。

血清中Ｌ５−ＡＣ濃度は２．１ｍｇ／ｄ１と判明した。

プ」１例」−ガスクロマトグラフィー法と末法との比較 ヒト血清３０検体について従来より行われているガスク
ロマトグラフィーによる方法と裏片」Ｉ　１の■及び■
の方法を用いて１．５−ＡＧｉ１度を定量した。

自動分析装置としては島津製作所製のＣＬ−７０００型
を使用し、）艷１例」２に使用した試薬Ａを２５０　μ
！、試薬Ｂを５０ｕｆ使用し、試料としての血清は５μ
！使用した。

■グルコース処理にヘキソキナーゼを用いた場合ガスク
ロマトグラフィーによる方法と末法による結果は第２図
に示す。相関係数は０．８９で両定量法間には、高い相
関性が認められた。

■グルコース処理にグルコキナーゼを用いた場合相関係
数は０．９１でヘキソキナーゼを用いた場合と同様にガ
スクロマトグラフィー法との間には、高い相関性が認め
られた。

〔発明の効果］ 本発明は、正確かつ自動化測定可能な１．５−ＡＣの測
定法に関するものである。即ち、本性により近年各種の
臨床検査項目に対して実施されている自動分析機器での
測定が可能となり、多数検体を同時に処理出来るように
なった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＡＴＰの濃度の差による反応の差を示し、第２
図はグルコース処理にヘキソキナーゼを用いた本発明の
方法とガスクロマトグラフィーによる方法の各種血清に
おける相関図であり、第３図はグルコース処理にグルコ
キナーゼを用いた本発明の方法とガスクロマトグラフィ
ーによる方法の各種血清における相関図である。 特許出願人　　天野製薬株式会社 第　　ｌ　　図 す 反応時間（分） 第　　２　　図 本発明（加ｇ、／ｄｌｌ 第　　３　　図 本発明（ｍｇ／ｄｌ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）１，５−アンヒドログルシトールをピラノースオ
   キシダーゼまたはＬ−ソルボースオキシダーゼを用いて
   測定する方法において、予め試料にグルコキナーゼまた
   はヘキソキナーゼ及びアデノシン三リン酸、ピルビン酸
   キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸を含む試薬を作用
   させることを特徴とする１，５−アンヒドログルシトー
   ルの定量法。