JP2662556B2 - ハイブリダイゼーシヨンによる細菌ならびに他の生命体の核酸検出用のオリゴヌクレオチドプローブおよび方法 - Google Patents
ハイブリダイゼーシヨンによる細菌ならびに他の生命体の核酸検出用のオリゴヌクレオチドプローブおよび方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
医師、獣医師、植物病理学者、および一般に生物学者
は、しばしば、試料（ヒト、動物、野菜、食物等）中に
細菌または他の生命体が含まれていないかを測定しなけ
ればならないことがある。現実に、生存微生物の存在を
検出するために使用し得る方法は、顕微鏡検査（光学顕
微鏡または電子顕微鏡）、培養、免疫学的検出、および
特異的核酸プローブによる検出だけである。 免疫学的検出および特異的核酸プローブによる検出
は、現実に特殊な生命体、例えば、レジオネラ・ニュー
モフィラ（Legionella pneumophila）またはサルモネラ
菌（Salmonel-la）にのみ適用されている。１種類以上
の生命体を検出し得る試薬は、一般にその他の種または
属の生命体を検出することはできない（これが特異性を
きめる原理であり、試薬の存在理由はここにある）。 顕微鏡検査は、必然的に微小試料に限られ、細胞破砕
物などの粒子では生命体をその状態のまま同定し得るよ
うな映像化は不可能である。 培養は、いくつかの生命体（特に、細菌）、ならびに
一定の培地およびその生命体に適した条件（好気性細菌
または嫌気性細菌、なんらかの特別な増殖因子の要求性
等）に対してのみ適用することができる。１つで総ての
培養可能な細菌の増殖ができる培地はない。今日では、
まだ培養法が分かっていないために、知られておらず、
また検出し得ない細菌も存在する。研究を始めて１年以
上経ってから細菌の存在が証明された例もたくさんあ
る。例えば、在郷軍人病（フィラデルフィア流行病）で
は、後にヒトの検体中に含有されることが判明した病原
菌は、通常の染色では顕微鏡で認められなかったし、ま
た、当時知られていた細菌用培地上では培養することも
できなかった。同様に、植物の木部に感染する細菌も長
い間見つからなかった。それらの細菌は、顕微鏡下で微
細な観察をしてやっと発見された。上記の例と同様に、
これらの細菌は当時知られていた培地上で培養すること
はできなかった。従って、古典的手法によって検査した
媒質の細菌汚染が検出されなくても、必ずしもこの媒質
中に細菌の夾雑が全くないとは結論付けられないこと
が、上記の各例からわかる。 本発明は、この古典的検出法の難点を克服すること、
換言すれば、被検媒質（例えば、ヒトの検体）の無菌性
を確認でき、そして例えば、細菌の夾雑の有無を従来に
ない高い精度で調べられる方法を提供することを目的と
する。 そのような方法は、細菌または他の細胞による検体の
夾雑を検出でき、その上、細胞数の計測が可能であるた
め、極めて有用であることが容易に分かる。この種の検
出法によれば、例えば、病因の不明な感染（ヒト、動
物、植物）において、細菌検査の有効性を高めることが
できる。 本発明は、リボソームRNAの研究に対する本発明者の
関心から生まれたものである。生命体を構成するあらゆ
る巨大分子のなかで、リボソームのリボ核酸（RNA）
は、細菌の夾雑（生命体の存在）を示す信頼に足る先天
的な指標と見られており、細胞成分として重要な部分で
ある。そして、このようなRNAは、あらゆる公知の生細
胞の機能に欠くことができない。 現在、リボソームの小サブユニットを構成するRNA
（ショ糖密度勾配超遠心における沈降係数で表すと、16
S RNA）は、約20種の生命体についてヌクレオチドのレ
ベルで解明されている［完全なヌクレオチド配列の例
は、Weisburgら,J.Bacteriol.,vol.164,No.1,230〜236
（1985）、Frydenberg＆Christiansen,DNA,vol.4,No.2,
127〜137（1985）に記載されている］。これらのヌクレ
オチドは、習慣として16S RNA分子の５′末端から３′
末端に向って番号が付けられている。大腸菌（Escheric
hia coil.）の16S RNAは、1542個のヌクレオチドから成
っている。その他の生命体のヌクレオチド分子は、全ヌ
クレオチド数およびヌクレオチド配列において大腸菌の
それとは異なり得る。 本発明に至ったのは、既知のリボソームRNAのヌクレ
オチド配列を比較したところ、予期し得た配列保存の程
度を越えた著しい類似性のある場合は常に、ある程度の
同一性を有する共通部分がみつかったからである。そこ
で、異なった生命体間の変異は、16S RNAの配列全体に
分布しているのではなく、特定の場所（特に、ヘリック
ス構造の部分）に集中しているが、ある領域（特に、ル
ープ部分）では強い保存性が認められた。さらに、これ
らの変異は、大きな分類学的区分と良く一致している。
従って、16S RNA配列のなかに普遍的な部分、特に真核
細胞および細菌（原核細胞）に不変的な部分、ならびに
より限られた細胞群に特異的な部分を定義することがで
きる。 斯くの如く、16S RNAには、1492番目のヌクレオチド
から1506番目のヌクレオチド（大腸菌の16S RNA配列に
用いられる番号付けに従った）に亙る普遍領域（すなわ
ち、真核細胞および原核細胞に共通の部分）、および15
27番目のヌクレオチドから1541番目のヌクレオチドに亙
る細菌に特異的な領域（真正細菌、原始細菌archaebact
eria、メタン生成細菌および好塩性細菌）のあることが
示された。これに関して以降のページの表（A,T,C,Gの
記号は、DNA構成成分である４種の基本ヌクレオチド）
を参照することができる。そして、所定の参照番号で示
されたヌクレオチドは、番号の最初の数字の下にあるも
のに相当するものと理解される。例えば、1490番目は、
RNAに対するヌクレオチド配列でのウラシル（Ｕ）に当
たる。 多数の細菌のトランスファーRNAも、ある共通の配
列、特に、以下の配列を含むことが認められた。 UCAUAACCCGAAGGUC しかし、この配列は、1527番目のヌクレオチドから15
41番目のヌクレオチドに亙る、上記の細菌に特異的な領
域より不変性が低い。 同様に、原始細菌も、以下の構造を取るこの種のあら
ゆる細菌に共通の配列を有することが認められた。 UUCGACGAGRUGGGGCGC ただし、この中で、Ｒは、ＡまたはＧである。 本発明は、上記の事実に由来し、そして、上記の配列
に相補的であって同数のプローブを構成する特異的ヌク
レオチド配列を提供する。そのプローブの中では、いか
なる媒質中における細胞の夾雑の検出に対して普遍的に
適用できるのもあれば、以下の範疇として検出可能な細
胞の分類に適用できるものもある。◎ある種の原始細菌、特にメタン生成ならびに好塩性原
始細菌を含む細菌、 ◎原始細菌、およびその他総ての生命体。ここでは、
「普遍プローブ」を用いたハイブリダイゼーション試験
で陽性反応を示す場合、および検出された微生物を上記
の範疇に分類できるプローブを用いたハイブリダイゼー
ション試験で陰性反応を示す場合がある 問題とする種類の配列は、ヌクレオチド合成によって
容易に調製し得る。さらに詳悉すると、本発明は、16S
RNAの1492〜1506領域に相補性を示すペンタデカデオキ
シリボヌクレオチド（15個のヌクレオチドから成るデオ
キシリボ核酸の配列、または略号で15-mer）に関する。
この15-merは、総ての生命体の16S RNA中に存在する類
似断片とハイブリダイゼーションが可能である。同様
に、RNAのこの部分をコードし、総ての生命体のゲノム
に存在するデオキシリボ核酸（DNA）の一部とハイブリ
ダイゼーションし得る。 同様に本発明は、 ◎細菌に分類し得る微生物を検出するために、既述の配
列UCAUAACCCGAAGGUCに相補的なオリゴヌクレオチドから
成るプローブ、および ◎原始細菌に特徴的であって上記の配列UUCGACGAGRUGGG
GCGCに相補的なプローブにも関する。 最後に、本発明は、16S RNAの1527〜1541領域に相補
的であって、細菌または他の原核生物の16S RNAに存在
する相同的断片およびこれらの生命体のDNA中で対応す
る遺伝子とハイブリダイゼーションし得るが、真核細胞
（酵母、カビ、原生動物、ヒト、動物ならびに植物組
織）の対応するRNAまたはこれらの生命体のDNA中で対応
する遺伝子とは全くもしくはほとんどハイブリダイゼー
ションし得ない15個のヌクレオチド（15-mer）のDNA配
列に関する。 従って、尚詳細には、本発明は、以下の組成物に関す
る。《１》以降、「普遍プローブ」と称するプローブ。 このプローブはオリゴヌクレオチド合成によって調製
され、以下の配列を有する。 （５′）d-ACC TTG TTA CGA CTT（３′） ここで、（５′）および（３′）はこのポリマーの５′
および３′末端（従って、極性）を示し、英文字は次の
デオキシヌクレオチドを示す。A,アデニル残基;C,シチ
ジル残基;T,チミジル残基；およびG,グアニル残基；こ
れらは、15個のヌクレオチドを含む配列を読みやすくす
るためにのみ機能する。 このプローブは、大腸菌の16S RNAの1492〜1506領域
（この微生物に使用する番号付けに基づく）、ならびに
報告されている他のあらゆる細菌、原核および真核細胞
のRNAの対応する領域と完全に相補的であり、さらに程
度は低いがミトコンドリアのRNAと相補する。当該分野
の専門家ならば、このプローブが極めて高い確率で天然
に存在する総ての細胞のRNAとも対合することを推測し
得るであろう。さらに、このプローブは、上記16S RNA
および対応する真核生物RNAをコードする遺伝子のDNAの
相同部分とも対合する。 本発明が、上記の「普遍プローブ」に相補性を示し、
以下のヌクレオチド配列を有するプローブにも関するの
は当然である。 （５′）d-AAG TCG TAA CAA GGT（３′） これは、16S RNA（１本鎖だけで成る）とは対合し得な
いとしても、２本鎖特性によってゲノムDNAの同一部分
（16S RNAならびに相当のRNAをコードする遺伝子）と対
合し得る。 《２》以降、「真正細菌およびある種の原始細菌に特異
的な組成物」または「真正細菌プローブ」と称するプロ
ーブ。 オリゴヌクレオチド合成によって調製される好適なプ
ローブは、以下の配列を有する。 （５′）d-AAG GAG GTG ATC CAG（３′） ここで、（５′），（３′）,A,C,T,およびＧの意味
は、上記の通り。 この配列は、細菌、特に真正細菌の16S RNAの1527〜1
541領域（大腸菌に使用される番号付けに従う）である
共通配列の相補性に対応する。この配列は、細菌のデー
タとして報告されている総ての16S RNA配列に完全に相
補的ではないが、せいぜい１ないし２個のヌクレオチド
が異なっているだけである。これとは対照的に、この組
成物の配列は、今日までに真核細胞の18S RNA、および
ミトコンドリアの12S RNA（これは、細菌の16S RNAに対
応する）の相同領域と弱く対合し得る。 当然本発明は、UGGAUCACCUCCUUAの配列と対合すると
いう点で、RNAおよび／またはゲノムDNAの同一領域、特
に、上記の「真正細菌プローブ」に対してヌクレオチド
１個シフトした配列と対合し得る如何なるプローブにも
関する。（このようなプローブは、以下の配列を有す
る。 （３′）ACCTAGTGGAGGAAA（５′）、 または （読み取り方向が逆であれば） （５′）d-AAAGGAGGTGATCCA（３′） これらは、大部分の細菌に見いだされる。 さらに、本発明は、より小さいオリゴヌクレオチド・
プローブでその配列が上記の「真正細菌の特異的プロー
ブ」（または、「シフトした配列」を含むプローブ）に
含まれている総てのプローブにも関する。 しかし、このプローブは、少なくともTGGAGGAA
（５′）の配列を含む（16S RNAの1534番目と1541番目
間のヌクレオチドに亙る領域に相補的）。 特に、（５′）d-AAGGAGGT（３′） （５′）d-AAAGGAGGT（３′） （５′）d-AAGGAGGTG（３′） （５′）d-AAGGAGGTGA（３′） （５′）d-AAGGAGGTGAT（３′） （５′）d-AAGGAGGTGATC（３′） （５′）d-AAGGAGGTGATCC（３′） （５′）d-AAGGAGGTGATCCA（３′） 上記と相補的な配列も、本発明に基づくプローブ群の
一部を構成する。 しかし、対合の安定性の高さという点では、最も長い
プローブが好ましいことを強調したい。さらに、あるヌ
クレオチドを同一配列の別のヌクレオチドと置換する
と、恐らく、特定細菌群の16S RNAへのアフィニティー
は強まるであろうが、他の大部分の細菌に対する相補性
は弱まるであろう。一方、CCGCA単位の全部または一部
を用いて３′方向へヌクレオチドを伸長させても、特異
性は向上し得ないであろう。というのは、この単位の相
補性は、脊椎動物の18S RNA中にみられる。 《３》原始細菌に特異的なプローブ。 最後に詳悉すると、本発明は、原始細菌に特異的なプ
ローブであって、以下の配列（ここで、Ｒ′はＴまたは
Ｃを示す）中に含まれる少なくとも８個のヌクレオチ
ド。AAGCTGCTCR′ACCCCGCG およびこの配列の高々18個のヌクレオチドの配列を有す
るプローブに関する。 本発明のプローブの使用に関する一般的条件 普遍プローブ、および、一方では真正細菌に対してよ
り特異的なプローブ、他方では原始細菌に対してより特
異的なプローブ（および、相補的組成物）は標識するの
が有利である。従来からある如何なるマーカーも使用す
ることができる。最も一般的に利用されているトレーサ
ーをあげると32P、35S、125I、3H、または14C等がある
放射活性トレーサーを用いて組成物の標識を行うことが
できる。放射能標識は、例えば、放射能で標識したヌク
レオチド、ポリヌクレオチドキナーゼ（フォスファター
ゼによる脱リン酸反応を伴う場合と伴わない場合があ
る）、またはリガーゼ（標識すべき末端に応じて）を用
いた、３′または５′の末端標識等の如何なる方法によ
っても実施することができる。これらの場合、標識され
た組成物は、16個のヌクレオチドを含むであろう（３′
または５′末端に結合させる放射活性ヌクレオチドが如
何なる場合も）。本発明のプローブ（相補的組成物を含
む）の１つは、放射活性ヌクレオチド、または放射活性
ヌクレオチドと非放射活性ヌクレオチドとの両ヌクレオ
チドから成る（ヌクレオチド約15個）の短鎖合成のため
の鋳型の役割を果たし得る。本発明のプローブは、１種
以上の放射活性ヌクレオチドを用いた化学合成によって
も調製することができる。もう一つの放射標識法とし
て、本発明のプローブの化学的ヨウ素化によって、オリ
ゴマーに幾つかの125I原子を結合させる方法がある。本
発明のプローブ（または相補プローブ）の１つを、非放
射活性RNAまたはDNAとのハイブリダイゼーションに用い
るために放射活性にしたならば、ハイブリダイゼーショ
ンの検出法は、使用した放射活性トレーサーに応じて異
なるであろうが、オートラジオグラフィー、液体シンチ
レーション、ガンマ線計数、または放射活性トレーサー
より放出されたイオン化放射線を検出できるその他の如
何なる方法に基づいても行い得る。 非放射標識を使用することもとでき、これには本発明
のプローブに、免疫学的特性のある残基（抗原、ハプテ
ン）、ある種の試薬（リガンド）に特異的アフィニティ
ーのある残基、検出可能な酵素反応を完全に行わせる性
質のある残基（酵素もしくは補酵素、酵素基質、もしく
は酵素反応に関与するその他の物質）、または、蛍光、
何らかの波長の光の放射もしくは吸収等の適当な物理学
的特性を有する残基を結合させるがこれらは単なる例示
である。DNA/RNAハイブリッドを特異的に認識する抗体
も使用することができる。 ここで引用した化学的標識は、本発明のプローブの化
学合成時になし得る。すなわち、アデノシン、グアノシ
ン、シチジン、およびチミジン残基を組成物またはこの
組成物と相補的DNAまたはRNA断片との間で形成されたハ
イブリッドの検出を可能にする他の化学的残基に結合さ
せる。他の化学的残基への結合で修飾されたヌクレオチ
ドを使用する組成物の配列は、本発明のプローブのヌク
レオチド配列と同一のものとなろう。 本発明は、本発明に基づくプローブ自体を利用したハ
イブリダイゼーションによる検出法にも関するものであ
って、このプローブは前以て、標識しておくか、または
上記のようにして検出できるようにしておく。 本発明の各プローブの選択は、検査目的に応じて異な
る。例えば、原核細胞および真核細胞の検出（普遍組成
物）、16S系統のRNAをコードする遺伝子が存在するか、
もしくは原核細胞と真核細胞の別なくこれらに由来する
DNAならびにDNA断片の検出または位置決定（普遍組成
物、またはそれに相補的なプローブ）、細菌細胞の排他
的検出（真正細菌用の特異的プローブ）、細菌16S RNA
をコードする遺伝子を有するDNAまたはDNA断片の検出ま
たは位置決定（真正細菌用の特異的プローブもしくはそ
れらに相補的なプローブ）が挙げられる。 本発明の１種類以上のプローブの使用は、特定のハイ
ブリダイゼーション法に限定されるようなことはない。 生命体から由来した細胞（または生命体自体）の検出
に関しては、これらの細胞のRNAおよび／またはDNAを検
査しやすくなるように処理（化学的または物理学的手法
を用いた細胞の部分的または完全溶解）してから、本発
明のプローブでそれ自体検出可能にされている１種類以
上のプローブと接触させる。このような接触は、ニトロ
セルロース、セルロース（修飾または非修飾）もしくは
ナイロンのフィルター（通常の支持体の例示として挙げ
た）等の適切な支持体上、または組織学的切片もしくは
細胞塗抹標本上、または支持体を用いないで液体媒質中
にて行うことができる。接触は以下のような状態で生じ
る。温度およびイオン濃度の至適または制限条件下（す
なわち、条件がより「制限的」となるに従って大きさが
増す長さの分子上で、配列の完全な相同性がある時だ
け、ハイブリッド形成を可能にする）、核酸の対合にと
って至適温度を低下させる物質（ホルムアミド、ジメチ
ルスルホオキシド、尿素）の存在下または非存在下、見
掛けの反応容積を減少させる物質（デキストラン、デキ
ストラン硫酸）の存在下または非存在下である。 プローブの支持体上の未反応分子または断片の除去
は、適当な温度にて適切なイオン強度の緩衝液を用いた
洗浄によって行うことができる。この際、S1ヌクレアー
ゼ、または１本鎖DNAまたは１本鎖RNAを消化するが、DN
A/RNAハイブリッドまたは２本鎖DNAは消化しない別の酵
素による処理は行っても行わなくてもよい。液体媒質中
で、RNAもしくはDNA断片と対合したプローブ分子（また
は断片）を未反応のものから分離し得るが、この操作
は、ヒドロキシアパタイト上でクロマトグラフィーによ
り、また、S1ヌクレアーゼによる処理後では、遊離ヌク
レオチドから２本鎖断片を分離する総ての方法（最も一
般的な方法として例示すると、ヒドロキシアパタイトも
しくはDEAE−セルロース上でのクロマトグラフィー、排
除クロマトグラフィー、分別沈澱、透析）によって行う
ことができる。 次に、使用した組成物の分子（または断片）を、選択
した標識の種類に応じて最も適切な方法によって検出す
る。 様々な出版物［Maniatisら,1982,「分子クローニング
実験手技（Molecular Cloning,A laboratory manua
l）」,Cold Spring Harbor Laboratory;Grimontら,J.Cl
in.Microbiol.vol.21,No.3,431〜437（1985）］、また
は特許［フランス：第8412250号、第7810975号、第8124
631号、ヨーロッパ：第0133288号、第0063879号］に記
載された詳細な手法は、本発明の組成物に対して有利に
適用することができる。 16S RNA（または相当のRNA）をコードする遺伝子の乗
った染色体DNA断片の位置を決定するのであれば、１種
類以上の制限酵素を用いてDNAを処理し、電気泳動もし
くはクロマトグラフィーにより断片を分離し、かつ断片
を変性（すなわち、２本鎖を分離）した後、ハイブリダ
イゼーションに都合の良い条件下において本発明のプロ
ーブの１つをDNA断片と接触させ、完全なハイブリダイ
ゼーションに必要な時間の後、組成物のハイブリッドし
なかった断片をハイブリッドした断片から分離し、細胞
の検出について上で記述したようにして標識を測定す
る。 ヨーロッパ特許第0120658（Jhon A.Webster Jr）、ま
たはManiatisらの著書、またはGrimontらの論文（上記
に引用）は、本発明の如何なるプローブにも適用でき
る。16S RNAをコードする遺伝子が乗った染色体DNA断片
の位置決定には、本発明の１つのプローブを用いてもそ
れに極めて相補性の高いプローブを用いても殆ど同一の
結果が得られることに注意すべきである。 一般に、本発明の様々なプローブは、異種DNAの存在
によって適用プローブの特異性の障害が見込まれなけれ
ば、プローブをクローニングし得るDNA中に入れて、組
み換えDNAを調製することもできる。 最後に、チミジン残基をウラシル残基に換えたプロー
ブ（これらのプローブは、特に請求の範囲で挙げたプロ
ーブと厳密に等価であると見なすべきである）も、その
合成がより困難であっても、本発明の一部を構成するこ
とは理解に難くない。
は、しばしば、試料（ヒト、動物、野菜、食物等）中に
細菌または他の生命体が含まれていないかを測定しなけ
ればならないことがある。現実に、生存微生物の存在を
検出するために使用し得る方法は、顕微鏡検査（光学顕
微鏡または電子顕微鏡）、培養、免疫学的検出、および
特異的核酸プローブによる検出だけである。 免疫学的検出および特異的核酸プローブによる検出
は、現実に特殊な生命体、例えば、レジオネラ・ニュー
モフィラ（Legionella pneumophila）またはサルモネラ
菌（Salmonel-la）にのみ適用されている。１種類以上
の生命体を検出し得る試薬は、一般にその他の種または
属の生命体を検出することはできない（これが特異性を
きめる原理であり、試薬の存在理由はここにある）。 顕微鏡検査は、必然的に微小試料に限られ、細胞破砕
物などの粒子では生命体をその状態のまま同定し得るよ
うな映像化は不可能である。 培養は、いくつかの生命体（特に、細菌）、ならびに
一定の培地およびその生命体に適した条件（好気性細菌
または嫌気性細菌、なんらかの特別な増殖因子の要求性
等）に対してのみ適用することができる。１つで総ての
培養可能な細菌の増殖ができる培地はない。今日では、
まだ培養法が分かっていないために、知られておらず、
また検出し得ない細菌も存在する。研究を始めて１年以
上経ってから細菌の存在が証明された例もたくさんあ
る。例えば、在郷軍人病（フィラデルフィア流行病）で
は、後にヒトの検体中に含有されることが判明した病原
菌は、通常の染色では顕微鏡で認められなかったし、ま
た、当時知られていた細菌用培地上では培養することも
できなかった。同様に、植物の木部に感染する細菌も長
い間見つからなかった。それらの細菌は、顕微鏡下で微
細な観察をしてやっと発見された。上記の例と同様に、
これらの細菌は当時知られていた培地上で培養すること
はできなかった。従って、古典的手法によって検査した
媒質の細菌汚染が検出されなくても、必ずしもこの媒質
中に細菌の夾雑が全くないとは結論付けられないこと
が、上記の各例からわかる。 本発明は、この古典的検出法の難点を克服すること、
換言すれば、被検媒質（例えば、ヒトの検体）の無菌性
を確認でき、そして例えば、細菌の夾雑の有無を従来に
ない高い精度で調べられる方法を提供することを目的と
する。 そのような方法は、細菌または他の細胞による検体の
夾雑を検出でき、その上、細胞数の計測が可能であるた
め、極めて有用であることが容易に分かる。この種の検
出法によれば、例えば、病因の不明な感染（ヒト、動
物、植物）において、細菌検査の有効性を高めることが
できる。 本発明は、リボソームRNAの研究に対する本発明者の
関心から生まれたものである。生命体を構成するあらゆ
る巨大分子のなかで、リボソームのリボ核酸（RNA）
は、細菌の夾雑（生命体の存在）を示す信頼に足る先天
的な指標と見られており、細胞成分として重要な部分で
ある。そして、このようなRNAは、あらゆる公知の生細
胞の機能に欠くことができない。 現在、リボソームの小サブユニットを構成するRNA
（ショ糖密度勾配超遠心における沈降係数で表すと、16
S RNA）は、約20種の生命体についてヌクレオチドのレ
ベルで解明されている［完全なヌクレオチド配列の例
は、Weisburgら,J.Bacteriol.,vol.164,No.1,230〜236
（1985）、Frydenberg＆Christiansen,DNA,vol.4,No.2,
127〜137（1985）に記載されている］。これらのヌクレ
オチドは、習慣として16S RNA分子の５′末端から３′
末端に向って番号が付けられている。大腸菌（Escheric
hia coil.）の16S RNAは、1542個のヌクレオチドから成
っている。その他の生命体のヌクレオチド分子は、全ヌ
クレオチド数およびヌクレオチド配列において大腸菌の
それとは異なり得る。 本発明に至ったのは、既知のリボソームRNAのヌクレ
オチド配列を比較したところ、予期し得た配列保存の程
度を越えた著しい類似性のある場合は常に、ある程度の
同一性を有する共通部分がみつかったからである。そこ
で、異なった生命体間の変異は、16S RNAの配列全体に
分布しているのではなく、特定の場所（特に、ヘリック
ス構造の部分）に集中しているが、ある領域（特に、ル
ープ部分）では強い保存性が認められた。さらに、これ
らの変異は、大きな分類学的区分と良く一致している。
従って、16S RNA配列のなかに普遍的な部分、特に真核
細胞および細菌（原核細胞）に不変的な部分、ならびに
より限られた細胞群に特異的な部分を定義することがで
きる。 斯くの如く、16S RNAには、1492番目のヌクレオチド
から1506番目のヌクレオチド（大腸菌の16S RNA配列に
用いられる番号付けに従った）に亙る普遍領域（すなわ
ち、真核細胞および原核細胞に共通の部分）、および15
27番目のヌクレオチドから1541番目のヌクレオチドに亙
る細菌に特異的な領域（真正細菌、原始細菌archaebact
eria、メタン生成細菌および好塩性細菌）のあることが
示された。これに関して以降のページの表（A,T,C,Gの
記号は、DNA構成成分である４種の基本ヌクレオチド）
を参照することができる。そして、所定の参照番号で示
されたヌクレオチドは、番号の最初の数字の下にあるも
のに相当するものと理解される。例えば、1490番目は、
RNAに対するヌクレオチド配列でのウラシル（Ｕ）に当
たる。 多数の細菌のトランスファーRNAも、ある共通の配
列、特に、以下の配列を含むことが認められた。 UCAUAACCCGAAGGUC しかし、この配列は、1527番目のヌクレオチドから15
41番目のヌクレオチドに亙る、上記の細菌に特異的な領
域より不変性が低い。 同様に、原始細菌も、以下の構造を取るこの種のあら
ゆる細菌に共通の配列を有することが認められた。 UUCGACGAGRUGGGGCGC ただし、この中で、Ｒは、ＡまたはＧである。 本発明は、上記の事実に由来し、そして、上記の配列
に相補的であって同数のプローブを構成する特異的ヌク
レオチド配列を提供する。そのプローブの中では、いか
なる媒質中における細胞の夾雑の検出に対して普遍的に
適用できるのもあれば、以下の範疇として検出可能な細
胞の分類に適用できるものもある。◎ある種の原始細菌、特にメタン生成ならびに好塩性原
始細菌を含む細菌、 ◎原始細菌、およびその他総ての生命体。ここでは、
「普遍プローブ」を用いたハイブリダイゼーション試験
で陽性反応を示す場合、および検出された微生物を上記
の範疇に分類できるプローブを用いたハイブリダイゼー
ション試験で陰性反応を示す場合がある 問題とする種類の配列は、ヌクレオチド合成によって
容易に調製し得る。さらに詳悉すると、本発明は、16S
RNAの1492〜1506領域に相補性を示すペンタデカデオキ
シリボヌクレオチド（15個のヌクレオチドから成るデオ
キシリボ核酸の配列、または略号で15-mer）に関する。
この15-merは、総ての生命体の16S RNA中に存在する類
似断片とハイブリダイゼーションが可能である。同様
に、RNAのこの部分をコードし、総ての生命体のゲノム
に存在するデオキシリボ核酸（DNA）の一部とハイブリ
ダイゼーションし得る。 同様に本発明は、 ◎細菌に分類し得る微生物を検出するために、既述の配
列UCAUAACCCGAAGGUCに相補的なオリゴヌクレオチドから
成るプローブ、および ◎原始細菌に特徴的であって上記の配列UUCGACGAGRUGGG
GCGCに相補的なプローブにも関する。 最後に、本発明は、16S RNAの1527〜1541領域に相補
的であって、細菌または他の原核生物の16S RNAに存在
する相同的断片およびこれらの生命体のDNA中で対応す
る遺伝子とハイブリダイゼーションし得るが、真核細胞
（酵母、カビ、原生動物、ヒト、動物ならびに植物組
織）の対応するRNAまたはこれらの生命体のDNA中で対応
する遺伝子とは全くもしくはほとんどハイブリダイゼー
ションし得ない15個のヌクレオチド（15-mer）のDNA配
列に関する。 従って、尚詳細には、本発明は、以下の組成物に関す
る。《１》以降、「普遍プローブ」と称するプローブ。 このプローブはオリゴヌクレオチド合成によって調製
され、以下の配列を有する。 （５′）d-ACC TTG TTA CGA CTT（３′） ここで、（５′）および（３′）はこのポリマーの５′
および３′末端（従って、極性）を示し、英文字は次の
デオキシヌクレオチドを示す。A,アデニル残基;C,シチ
ジル残基;T,チミジル残基；およびG,グアニル残基；こ
れらは、15個のヌクレオチドを含む配列を読みやすくす
るためにのみ機能する。 このプローブは、大腸菌の16S RNAの1492〜1506領域
（この微生物に使用する番号付けに基づく）、ならびに
報告されている他のあらゆる細菌、原核および真核細胞
のRNAの対応する領域と完全に相補的であり、さらに程
度は低いがミトコンドリアのRNAと相補する。当該分野
の専門家ならば、このプローブが極めて高い確率で天然
に存在する総ての細胞のRNAとも対合することを推測し
得るであろう。さらに、このプローブは、上記16S RNA
および対応する真核生物RNAをコードする遺伝子のDNAの
相同部分とも対合する。 本発明が、上記の「普遍プローブ」に相補性を示し、
以下のヌクレオチド配列を有するプローブにも関するの
は当然である。 （５′）d-AAG TCG TAA CAA GGT（３′） これは、16S RNA（１本鎖だけで成る）とは対合し得な
いとしても、２本鎖特性によってゲノムDNAの同一部分
（16S RNAならびに相当のRNAをコードする遺伝子）と対
合し得る。 《２》以降、「真正細菌およびある種の原始細菌に特異
的な組成物」または「真正細菌プローブ」と称するプロ
ーブ。 オリゴヌクレオチド合成によって調製される好適なプ
ローブは、以下の配列を有する。 （５′）d-AAG GAG GTG ATC CAG（３′） ここで、（５′），（３′）,A,C,T,およびＧの意味
は、上記の通り。 この配列は、細菌、特に真正細菌の16S RNAの1527〜1
541領域（大腸菌に使用される番号付けに従う）である
共通配列の相補性に対応する。この配列は、細菌のデー
タとして報告されている総ての16S RNA配列に完全に相
補的ではないが、せいぜい１ないし２個のヌクレオチド
が異なっているだけである。これとは対照的に、この組
成物の配列は、今日までに真核細胞の18S RNA、および
ミトコンドリアの12S RNA（これは、細菌の16S RNAに対
応する）の相同領域と弱く対合し得る。 当然本発明は、UGGAUCACCUCCUUAの配列と対合すると
いう点で、RNAおよび／またはゲノムDNAの同一領域、特
に、上記の「真正細菌プローブ」に対してヌクレオチド
１個シフトした配列と対合し得る如何なるプローブにも
関する。（このようなプローブは、以下の配列を有す
る。 （３′）ACCTAGTGGAGGAAA（５′）、 または （読み取り方向が逆であれば） （５′）d-AAAGGAGGTGATCCA（３′） これらは、大部分の細菌に見いだされる。 さらに、本発明は、より小さいオリゴヌクレオチド・
プローブでその配列が上記の「真正細菌の特異的プロー
ブ」（または、「シフトした配列」を含むプローブ）に
含まれている総てのプローブにも関する。 しかし、このプローブは、少なくともTGGAGGAA
（５′）の配列を含む（16S RNAの1534番目と1541番目
間のヌクレオチドに亙る領域に相補的）。 特に、（５′）d-AAGGAGGT（３′） （５′）d-AAAGGAGGT（３′） （５′）d-AAGGAGGTG（３′） （５′）d-AAGGAGGTGA（３′） （５′）d-AAGGAGGTGAT（３′） （５′）d-AAGGAGGTGATC（３′） （５′）d-AAGGAGGTGATCC（３′） （５′）d-AAGGAGGTGATCCA（３′） 上記と相補的な配列も、本発明に基づくプローブ群の
一部を構成する。 しかし、対合の安定性の高さという点では、最も長い
プローブが好ましいことを強調したい。さらに、あるヌ
クレオチドを同一配列の別のヌクレオチドと置換する
と、恐らく、特定細菌群の16S RNAへのアフィニティー
は強まるであろうが、他の大部分の細菌に対する相補性
は弱まるであろう。一方、CCGCA単位の全部または一部
を用いて３′方向へヌクレオチドを伸長させても、特異
性は向上し得ないであろう。というのは、この単位の相
補性は、脊椎動物の18S RNA中にみられる。 《３》原始細菌に特異的なプローブ。 最後に詳悉すると、本発明は、原始細菌に特異的なプ
ローブであって、以下の配列（ここで、Ｒ′はＴまたは
Ｃを示す）中に含まれる少なくとも８個のヌクレオチ
ド。AAGCTGCTCR′ACCCCGCG およびこの配列の高々18個のヌクレオチドの配列を有す
るプローブに関する。 本発明のプローブの使用に関する一般的条件 普遍プローブ、および、一方では真正細菌に対してよ
り特異的なプローブ、他方では原始細菌に対してより特
異的なプローブ（および、相補的組成物）は標識するの
が有利である。従来からある如何なるマーカーも使用す
ることができる。最も一般的に利用されているトレーサ
ーをあげると32P、35S、125I、3H、または14C等がある
放射活性トレーサーを用いて組成物の標識を行うことが
できる。放射能標識は、例えば、放射能で標識したヌク
レオチド、ポリヌクレオチドキナーゼ（フォスファター
ゼによる脱リン酸反応を伴う場合と伴わない場合があ
る）、またはリガーゼ（標識すべき末端に応じて）を用
いた、３′または５′の末端標識等の如何なる方法によ
っても実施することができる。これらの場合、標識され
た組成物は、16個のヌクレオチドを含むであろう（３′
または５′末端に結合させる放射活性ヌクレオチドが如
何なる場合も）。本発明のプローブ（相補的組成物を含
む）の１つは、放射活性ヌクレオチド、または放射活性
ヌクレオチドと非放射活性ヌクレオチドとの両ヌクレオ
チドから成る（ヌクレオチド約15個）の短鎖合成のため
の鋳型の役割を果たし得る。本発明のプローブは、１種
以上の放射活性ヌクレオチドを用いた化学合成によって
も調製することができる。もう一つの放射標識法とし
て、本発明のプローブの化学的ヨウ素化によって、オリ
ゴマーに幾つかの125I原子を結合させる方法がある。本
発明のプローブ（または相補プローブ）の１つを、非放
射活性RNAまたはDNAとのハイブリダイゼーションに用い
るために放射活性にしたならば、ハイブリダイゼーショ
ンの検出法は、使用した放射活性トレーサーに応じて異
なるであろうが、オートラジオグラフィー、液体シンチ
レーション、ガンマ線計数、または放射活性トレーサー
より放出されたイオン化放射線を検出できるその他の如
何なる方法に基づいても行い得る。 非放射標識を使用することもとでき、これには本発明
のプローブに、免疫学的特性のある残基（抗原、ハプテ
ン）、ある種の試薬（リガンド）に特異的アフィニティ
ーのある残基、検出可能な酵素反応を完全に行わせる性
質のある残基（酵素もしくは補酵素、酵素基質、もしく
は酵素反応に関与するその他の物質）、または、蛍光、
何らかの波長の光の放射もしくは吸収等の適当な物理学
的特性を有する残基を結合させるがこれらは単なる例示
である。DNA/RNAハイブリッドを特異的に認識する抗体
も使用することができる。 ここで引用した化学的標識は、本発明のプローブの化
学合成時になし得る。すなわち、アデノシン、グアノシ
ン、シチジン、およびチミジン残基を組成物またはこの
組成物と相補的DNAまたはRNA断片との間で形成されたハ
イブリッドの検出を可能にする他の化学的残基に結合さ
せる。他の化学的残基への結合で修飾されたヌクレオチ
ドを使用する組成物の配列は、本発明のプローブのヌク
レオチド配列と同一のものとなろう。 本発明は、本発明に基づくプローブ自体を利用したハ
イブリダイゼーションによる検出法にも関するものであ
って、このプローブは前以て、標識しておくか、または
上記のようにして検出できるようにしておく。 本発明の各プローブの選択は、検査目的に応じて異な
る。例えば、原核細胞および真核細胞の検出（普遍組成
物）、16S系統のRNAをコードする遺伝子が存在するか、
もしくは原核細胞と真核細胞の別なくこれらに由来する
DNAならびにDNA断片の検出または位置決定（普遍組成
物、またはそれに相補的なプローブ）、細菌細胞の排他
的検出（真正細菌用の特異的プローブ）、細菌16S RNA
をコードする遺伝子を有するDNAまたはDNA断片の検出ま
たは位置決定（真正細菌用の特異的プローブもしくはそ
れらに相補的なプローブ）が挙げられる。 本発明の１種類以上のプローブの使用は、特定のハイ
ブリダイゼーション法に限定されるようなことはない。 生命体から由来した細胞（または生命体自体）の検出
に関しては、これらの細胞のRNAおよび／またはDNAを検
査しやすくなるように処理（化学的または物理学的手法
を用いた細胞の部分的または完全溶解）してから、本発
明のプローブでそれ自体検出可能にされている１種類以
上のプローブと接触させる。このような接触は、ニトロ
セルロース、セルロース（修飾または非修飾）もしくは
ナイロンのフィルター（通常の支持体の例示として挙げ
た）等の適切な支持体上、または組織学的切片もしくは
細胞塗抹標本上、または支持体を用いないで液体媒質中
にて行うことができる。接触は以下のような状態で生じ
る。温度およびイオン濃度の至適または制限条件下（す
なわち、条件がより「制限的」となるに従って大きさが
増す長さの分子上で、配列の完全な相同性がある時だ
け、ハイブリッド形成を可能にする）、核酸の対合にと
って至適温度を低下させる物質（ホルムアミド、ジメチ
ルスルホオキシド、尿素）の存在下または非存在下、見
掛けの反応容積を減少させる物質（デキストラン、デキ
ストラン硫酸）の存在下または非存在下である。 プローブの支持体上の未反応分子または断片の除去
は、適当な温度にて適切なイオン強度の緩衝液を用いた
洗浄によって行うことができる。この際、S1ヌクレアー
ゼ、または１本鎖DNAまたは１本鎖RNAを消化するが、DN
A/RNAハイブリッドまたは２本鎖DNAは消化しない別の酵
素による処理は行っても行わなくてもよい。液体媒質中
で、RNAもしくはDNA断片と対合したプローブ分子（また
は断片）を未反応のものから分離し得るが、この操作
は、ヒドロキシアパタイト上でクロマトグラフィーによ
り、また、S1ヌクレアーゼによる処理後では、遊離ヌク
レオチドから２本鎖断片を分離する総ての方法（最も一
般的な方法として例示すると、ヒドロキシアパタイトも
しくはDEAE−セルロース上でのクロマトグラフィー、排
除クロマトグラフィー、分別沈澱、透析）によって行う
ことができる。 次に、使用した組成物の分子（または断片）を、選択
した標識の種類に応じて最も適切な方法によって検出す
る。 様々な出版物［Maniatisら,1982,「分子クローニング
実験手技（Molecular Cloning,A laboratory manua
l）」,Cold Spring Harbor Laboratory;Grimontら,J.Cl
in.Microbiol.vol.21,No.3,431〜437（1985）］、また
は特許［フランス：第8412250号、第7810975号、第8124
631号、ヨーロッパ：第0133288号、第0063879号］に記
載された詳細な手法は、本発明の組成物に対して有利に
適用することができる。 16S RNA（または相当のRNA）をコードする遺伝子の乗
った染色体DNA断片の位置を決定するのであれば、１種
類以上の制限酵素を用いてDNAを処理し、電気泳動もし
くはクロマトグラフィーにより断片を分離し、かつ断片
を変性（すなわち、２本鎖を分離）した後、ハイブリダ
イゼーションに都合の良い条件下において本発明のプロ
ーブの１つをDNA断片と接触させ、完全なハイブリダイ
ゼーションに必要な時間の後、組成物のハイブリッドし
なかった断片をハイブリッドした断片から分離し、細胞
の検出について上で記述したようにして標識を測定す
る。 ヨーロッパ特許第0120658（Jhon A.Webster Jr）、ま
たはManiatisらの著書、またはGrimontらの論文（上記
に引用）は、本発明の如何なるプローブにも適用でき
る。16S RNAをコードする遺伝子が乗った染色体DNA断片
の位置決定には、本発明の１つのプローブを用いてもそ
れに極めて相補性の高いプローブを用いても殆ど同一の
結果が得られることに注意すべきである。 一般に、本発明の様々なプローブは、異種DNAの存在
によって適用プローブの特異性の障害が見込まれなけれ
ば、プローブをクローニングし得るDNA中に入れて、組
み換えDNAを調製することもできる。 最後に、チミジン残基をウラシル残基に換えたプロー
ブ（これらのプローブは、特に請求の範囲で挙げたプロ
ーブと厳密に等価であると見なすべきである）も、その
合成がより困難であっても、本発明の一部を構成するこ
とは理解に難くない。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 グリモン，パトリツク
フランス国、75015・パリ、リユ・ド
ウ・ボジラール・207
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．検体中における細菌及び原始細菌等の原核生物又は
真核生物の細胞を検出するためのプローブ、又は電気永
動もしくはクロマトグラフィーで分離したDNA断片の中
から前記生物の16S RNAをコードする遺伝子を有するも
のの位置を決定するためのプローブであって、該プロー
ブが、以下の配列群 （５′）d-AAGGAGGT（３′）； （５′）d-AAAGGAGGT（３′）； （５′）d-AAGGAGGTG（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGA（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGAT（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATC（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATCC（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATCCA（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATCCAG（３′）； （５′）d-AAAGGAGGTGATCCA（３′）； （５′）d-ACCTTGTTACGACTT（３′）； AAGCTGCTCR′ACCCCGCG（ここで、Ｒ′はＴ又はＣを示
す）に含まれる少なくとも８個、最大18個のヌクレオチ
ド配列； 及びそれらの相補的配列からなる群から選択されること
を特徴とするプローブ。 ２．細菌用のプローブが、以下の配列群 （５′）d-AAGGAGGT（３′）； （５′）d-AAAGGAGGT（３′）； （５′）d-AAGGAGGTG（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGA（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGAT（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATC（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATCC（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATCCA（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATCCAG（３′）； （５′）d-AAAGGAGGTGATCCA（３′）； 及びそれらの相補的配列からなる群から選択されること
を特徴とする請求項１に記載のプローブ。 ３．真核生物もしくは原核生物（細菌を含む）の細胞用
のプローブが、 （５′）ｄ−ACCTTGTTACGACTT（３′）、 又はその相補的配列であることを特徴とする請求項１に
記載のプローブ。 ４．原始細菌用のプローブが、 AAGCTGCTCR′ACCCCGCG（ここで、Ｒ′はＴ又はＣを示
す）に含まれる少なくとも８個、最大18個のヌクレオチ
ド配列、 及びそれらの相補的配列からなる群から選択されること
を特徴とする請求項１に記載のプローブ。 ５．プローブが放射能で（特に、１つもしくは２つの放
射性ヌクレオチドによって末端の片側もしくは両側に）
標識されているか、またはマーカー特に、酵素、リガン
ド、ルミネッセンス、もしくは蛍光で標識されているこ
とを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のプロー
ブ。 ６．細菌の核酸を近づきやすい１本鎖にした後、ハイブ
リダイゼーションの起きやすい条件下で、以下の配列群 （５′）d-AAGGAGGT（３′）； （５′）d-AAAGGAGGT（３′）； （５′）d-AAGGAGGTG（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGA（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGAT（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATC（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATCC（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATCCA（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATCCAG（３′）； （５′）d-AAAGGAGGTGATCCA（３′）； 及びそれらの相補的配列からなる群から選択されるプロ
ーブに接触させ、形成したハイブリッドを検出すること
を特徴とする検体中の細菌の検出法。 ７．真核生物又は原核生物（細菌を含む）の細胞の核酸
を近づきやすい１本鎖にした後、ハイブリダイゼーショ
ンの起きやすい条件で、配列 （５′）d-ACCTTGTTACGACTT（３′） 又はその相補的配列であるプローブに接触させ、形成し
たハイブリッドを検出することを特徴とする検体中の前
記細胞の検出法。 ８．原始細菌の核酸を近づきやすい１本鎖にした後、ハ
イブリダイゼーションの起きやすい条件下で、 配列AAGCTGCTCR′ACCCCGCG（ここで、Ｒ′はＴ又はＣを
示す）に含まれる少なくとも８個、最大18個のヌクレオ
チド配列、 及びそれらの相補的配列からなる群から選択されるプロ
ーブに接触させ、形成したハイブリッドを検出すること
を特徴とする検体中の原始細菌の検出法。 ９．可能なハイブリダイゼーションを起こさせる条件下
で、分離及び変性させたDNA断片を、以下の配列群 （５′）d-AAGGAGGT（３′）； （５′）d-AAAGGAGGT（３′）； （５′）d-AAGGAGGTG（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGA（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGAT（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATC（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATCC（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATCCA（３′）； （５′）d-AAGGAGGTGATCCAG（３′）； （５′）d-AAAGGAGGTGATCCA（３′）； （５′）ｄ−ACCTTGTTACGACTT（３′）； AAGCTGCTCR′ACCCCGCG（ここで、Ｒ′はＴ又はＣを示
す）に含まれる少なくとも８個、最大18個のヌクレオチ
ド配列； 及びそれらの相補的配列からなる群から選択されるプロ
ーブに接触させ、形成したハイブリッドを検出すること
を特徴とする、16S RNA系統のRNAをコードする遺伝子を
有するDNA断片を、電気永動又はクロマトグラフィーに
よって分離したDNA断片の中から位置を決定する方法。
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|---|---|---|---|
| JP62502233A Expired - Lifetime JP2662556B2 (ja) | 1986-04-04 | 1987-04-03 | ハイブリダイゼーシヨンによる細菌ならびに他の生命体の核酸検出用のオリゴヌクレオチドプローブおよび方法 |
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