FI89185B - Oligonukleotidprober foer bestaemning av bakterier och andra levande organismer - Google Patents

Description

1 89185 OLIGONUKLEOTIDIKOETTIMIA BAKTEERIEN JA MUIDEN ELÄVIEN ORGANISMIEN MÄÄRITTÄMISTÄ VARTEN - OLIGONUKLEOTIDPROBER FÖR BESTÄMNING AV BAKTERIER OCH ANDRA LEVANDE ORGANIS-MER 5

Keksintö koskee oligonukleotidikoettimia, joita voidaan käyttää bakteerien ja muiden elävien organismien esiintymisen määrittämiseen hybridisaa-tiomenetelmien avulla.

10 Lääkärit, eläinlääkärit, kasvipatologit ja biologit joutuvat usein määrittämään, sisältääkö näyte (ihmis-, eläin-, kasvi-, elintarvike- tai muu näyte) bakteereita tai muita mahdollisia organismeja. Tällä hetkellä käytettävissä olevia menetelmiä elävien mik-15 ro-organismien esiintymisen määrittämiseksi ovat ainoastaan mikroskooppiset menetelmät (valo tai elektroni), viljelymenetelmät, immunologiset määritysmenetelmät ja määritysmenetelmät, joissa käytetään spesifisiä nukle-iinihappo-koettimia.

20 Immunologista määritysmenetelmää on kuvattu esim. julkaisussa WO 84/3716. Immunologinen määritys ja määritys spesifisten nukleiinihappo-koettimien avulla ovat soveltuneet vain tietyille organismeille, esim. Legionella pneumophila-organismille (ks. julkaisu EP 25 174226) tai Salmonella-organismeille. Reagenssi, joka mahdollistaa yhden tai useamman organismin määrityksen, on tavallisesti sopimaton muiden lajien tai sukujen määritykseen (mainittujen reagenssien käyttö perustuu tähän spesifisyysperiaatteeseen).

30 Mikroskooppinen toteaminen rajoittuu pieneen osaan näytteitä, sillä soludebris ja muut partikkelit estävät elävän organismin osoittamisen ja tunnistamisen sellaisenaan.

Viljely soveltuu vain tietylle määrälle orga-35 nismeja (erityisesti bakteereille). Lisäksi on käytettävä kullekin organismille tiettyä kasvualustaa ja tiettyjä olosuhteita (aerobiset tai anaerobiset baktee- 2 89185 rit, tiettyjen kasvutekijöiden tarve jne.)· Mikään kasvualusta itsessään ei pysty kasvattamaan kaikkia viljeltäviä bakteereja. Nykyisin on mahdollista, että bakteerit jäävät huomaamatta ja tunnistamatta, koska ei 5 tiedetä kuinka niitä kasvatetaan. On olemassa lukuisia esimerkkejä tapauksista, joissa bakteerien läsnäolo pystyttiin todistamaan vasta yhden tai useamman vuoden tutkimuksen jälkeen: legioonataudissa (Philadelphia epidemia) taudin aiheuttavat bakteerit, jotka lopulta 10 pystyttiin toteamaan ihmisnäytteistä, eivät tulleet esiin tavallisella värjäyksellä mikroskoopissa ja niitä ei kyetty kasvattamaan tuona ajankohtana tunnetuissa bakteriologisissa kasvualustoissa. Myös bakteerit, jotka infektoivat kasvien puuainetta olivat tunnista-15 mattomia pitkän aikaa. Ne havaittiin vasta pitkällisten mikroskooppitutkimusten jälkeen. Kuten edellisessä tapauksessa, näitä bakteereja ei kyetty kasvattamaan tuona ajankohtana tunnetuissa kasvualustoissa. Edellä olevista esimerkeistä havaitaan, että vaikka traditio-20 naalisin menetelmin tutkittavasta näytteestä ei todeta bakteerikontaminaatiota, niin silti ei välttämättä voida päätyä johtopäätökseen, että tämä näyte on vapaa kaikesta bakteerikontaminaatiosta.

Esillä olevan keksinnön kohteena on poistaa 25 traditionaalisten määritysmenetelmien puutteita. Toisin sanoen keksinnön tarkoituksena on tuoda esiin uudenlainen menetelmä, joka mahdollistaa tietyn näytteen, esim. ihmisnäytteen, steriiliyden tai kontaminaation, esim. bakteerikontaminaation, toteamisen ja joka mene-30 telmä on toteutettavissa aiempaa paremmalla luotettavuudella .

On ilmeistä, että tällainen menetelmä on erittäin hyödyllinen, sillä se mahdollistaa näytteen bakteeri- tai muiden solujen kontaminaation määrittämi-35 sen. Lisäksi, todetut bakteerit tai muut solut on mahdollista jopa laskea. Keksinnön mukainen määritysmenetelmä esim. edistää tehokkaasti bakteerin löytämistä 3 89185 tuntemattoman etiologisen infektion (ihmisen, eläimen, kasvin infektio) tapauksessa.

Esillä oleva keksintö sai alkunsa, eräiden esillä olevan keksinnön keksijöiden, ribosomaalisen 5 RNA:iden tutkimuksesta. Elävien organismien kaikista makromolekulaarisista yhdisteistä ribosomaaliset ri-bonukleiinihapot (RNA) ovat osoittautuneet ensisijassa luotettaviksi biologisen kontaminaation indikaattoreiksi (elävien organismien esiintyminen). Nämä RNA:t muo-10 dostavat huomattavan osan solumateriaalista. Ne ovat välttämättömiä kaikkien tunnettujen elävien solujen toiminnoissa.

Pienen ribosomaalisen alayksikön RNA (tunnetaan 16S RNA:na, joka viittaa sen sedimentaatiovakioon 15 ultrasentrifugoitaessa sukroosigradientilla) tunnetaan tällä hetkellä nukleotiditasolla n. 20 organismilla (esimerkkejä täydellisistä nukleotidisekvensseistä on esitetty julkaisuissa Weisburg at ai. (1985), J. Bacte-riol., voi. 164, no 1, s. 230 - 236; Frydenberg ja 20 Christiansen (1985) DNA, voi. 4, no 2, s. 127 - 137). Nukleotidit numeroidaan tavallisesti 16S RNA-molekyylin 5’ päästä 3' päähän. Escherichia coli -bakteerin 16S RNA käsittää 1542 nukleotidia. Vastaavat molekyylit muissa elävissä organismeissa voivat poiketa E. colin 25 vastaavasta molekyylistä niiden nukleotidien kokonaislukumäärän ja järjestyksen suhteen.

Tunnettujen ribosomaalisten RNA:iden nukleoti-disekvenssien vertailu ja sellaisten kohtien löytäminen, jotka ovat näille RNA:ille yhteisiä samankaltai-.. . 30 suus-asteena, joka kaikissa tapauksissa osoitti erit täin suurta samankaltaisuutta yli odotettavissa olevan sekvenssien konservaatiotason, olivat ne tekijät, jotka johtivat keksintöön. Siten on havaittu, että vaihtelut eri organismien välillä eivät ole levinneet yli koko 35 16S RNA -sekvenssin, vaan ne ovat keskittyneet tiettyi hin paikkoihin (erityisesti rakenteen kierteisiin) kun *: taas tietyt alueet (erityisesti silmukat) näyttävät 4 89185 olevan huomattavasti paremmin säilyneet. Erityisesti nämä vaihtelut esiintyvät johdonmukaisella tavalla suurissa taksonomisissa jaotteluissa. Tämän vuoksi 16S RNA -sekvensseissä voidaan määrittää universaaleja 5 yksikköjä, erityisesti eukarioottisia ja bakteriaalisia (prokarioottinen) yksikköjä, sekä yksikköjä, jotka ovat spesifisiä rajoittuneemmille bakteeriryhmille.

16S RNA:t ovat siten osoittautuneet sisältävän universaalin alueen (so. yhteinen eukariooteille ja 10 prokariooteille), joka ulottuu nukleotidista 1492 nukleotidiin 1506 (numerointi sama kuin E. colin 16S RNA sekvenssille käytetty numerointi) ja bakteereille spe-sifisnen alueen (eubakteerit, arkebakteerit (archaebak-teria) ja metanogeeniset sekä halofiiliset bakteerit), 15 joka ulottuu nukleotidista 1527 nukleotidiin 1541. Tässä yhteydessä voidaan viitata seuraavalla sivulla olevaan taulukkoon, jossa A, T, C ja G tarkoittavat neljää standardinukleotidia, jotka muodostavat DNA:itä. Nukleotidi, jota merkitään annetulla referenssinumerolla, 20 vastaa nukleotidiä, joka sijaitsee numeron ensimmäisen merkin alapuolella. Esim. numero 1490 tarkoittaa ura-siiliä (U) RNA:ta vastaavassa nukleotidisekvenssissä.

Suuri joukko bakteerien siirtäjä RNA:ista ovat myös osoittautuneet sisältävän yhteisiä sekvenssejä, 25 erityisesti seuraavan: UCAUAACCCGAAGGUC.

5 89185

-P

< z O? __W—---v / i 2 r> a M 3 E-t ΓΙ C I 3

Cm . <r 3 3 3 o in ΒΊ u u <r « — <T 3 3 3 3' 3 3 <r--3 3 3 3 ^-3-a ----- 2 <X 3333 3 33 .33 W ID uuuuu u u u u <x 2 CD UUUUU UU UUU 3 t-t <r 33333 33 333 3<t<r <r · tJ ID UUUUU UU UUU 333 3·

< CD -UUUUU UU UUU 333 3U

< e— iidnatt <rc <r <r <x <r <x <r <r <r w CO c UUUUU UU UUU UUU <x <t

P3 <r K> 3 <X . 3 3 3 33 333 333 ID ID

w j- bi d c cr a: <1 <t <x <x <r <x s <x <r 3U

H u — CD to ID a ID CD 3 3 3 3 3 3 3 <X <

^ U 3 0 3 3 3 CDID CD 3 3 ID tD 12 tDtD

33333 33 333 . 3 <T <t 3 CD

W CD-3 U U < U-U U-U U --<t <X «X-ID 3 R I CD CD CD CD CD CDCD CD CD CD CDCDCD U3

-a > CD CD CD CD CD CDCD CDCDCD CDCDCD <C U

U U U U 3 UU UUU UUU U <X

·“· CD CD CD CD CD CD 3 CDCDCD CDCDCD CDU

rn:3T3 33 333 3 3 3 3 tD

XJUaaCDCD CDCD UUU UUU 33 — U CD CD U CD CDCD U3U UUU ¢0 <E<I<t<t« C <X <t c <t <t <t <x <x«x c<tst<t<r <t <r c«<r c<r<t <t<£

3 3 3 3 3 33 333 3CD3 3 <E

33333 33 333 333 33

-3UU3U 33 333 333 3 O

3o3UU UU 333 333 <C3 ö c <r <x <r c <<x <z <z <z *x <r <r <cy -33333 33 333 333 3« 111 3 3 3 3 3 33 33 3 333 33 — UUUUU UU UUU UUU 33 - UUUUU UU UUU UUU 33 in <r 3 3 3 3 33 333 333 U 3 2 C <t <X <X C _<t C C C «X «ta3 3 5 M <T-3 3 3 3 3--3 3-333- 333-3« =-< U - 33333 33 333 333 33 3 U 33333 33 333 333 33 o >- e c c <x <x c <r <r <t Ία 3 · « h octscc <2 c dcx a <c ¢. <r · 3 'Π UUUUU u U UUU UUU 3· h h — <c c <x c <r <. «t c α i « <r <t <t u i_ <x<t<r<cc <t c <x <x <r <t <c c <t

3 <X 33333 33 333 333 <X

«5 u 33333 33 333 333 3 3(0 UUUUU UU UUU UUU u « C 3 3-3 3 3 33 ’3 33 333 3

Wu (03333 33 333 333 3 >i_ occ<t<rc cc ¢¢4 ccc <t h I--e—c <x d <i ¢--<r < --< <r <t-ddd-<t S I <r 3 3 3 3 3’ 33 333 3<t<X 3 3 Ό — 3 U 3 3 3 33 3 3 <X <T <T <t 3 ... 33333 33 3U3 333 3 «···· f * · · · ··· · ····· I * · · · ··· · ·««·· ·· · · · ··· · t m e* 3 H ** J-> (£ u a) r. rj <β E (! 10 f

UI R Η— Ό E-IDO-HOW

E-l m Λ «J C U Fh — — — H tt-ιβ HC

h g a E äo —— m— ui <c — Cu O — ·— C Q — _ R — — OD j (0 CQ Si 4 0 O 0 > <0 2 3 jjj — tJ S-ηλ; ω — u Ό huo>-i Οτ>α> ^ — <5 fl Q. ·« n m <C C — — P5iflL.:icJ § — 5 ^OlDOC «tote koOu < — aiji p CD >-Cjfldei 3 guiiDai Ed Se-P <£13 WQ3tn 2<t-p 6 89185 Tämä sekvenssi on osoittautunut kuitenkin vähemmän universaaliksi, kuin yllämainittu bakteereille spesifinen alue, joka ulottuu nukleotidistä 1527 nukleotidiin 1541.

5 Arkebakteerit ovat myös osoittautuneet omaavan kaikille tämän tyyppisille bakteereille yhteisen sekvenssin, joka sekvenssi on seuraavanlainen: UUCGACGAGRUGGGGCGC, missä R on A tai G.

Esillä oleva keksintö perustuu täten edellä 10 mainittuihin havaintoihin ja keksintö tuo esiin spesifisiä nukleotidisekvenssejä, jotka ovat komplementaarisia yllä mainituille sekvensseille ja jotka muodostavat vastaavan määrän koettimia, joista osalla pystytään universaalisesti määrittämään minkä tahansa näytteen 15 sellulaarinen kontaminaatio ja osalla pystytään luokittelemaan solut, jotka voidaan määritellä seuraaviin luokkiin: bakteereihin, joihin kuuluu tietyt arkebakteerit, erityisesti metanogeeniset ja halofiiliset arkebakteerit; arkebakteereihin; ja kaikkiin muihin or-20 ganismien luokkiin silloin, kun hybridisaatiotestit antavat positiivisen vasteen "universaaleilla koettimilla" ja negatiivisen vasteen koettimilla, joilla pystytään määrittämään edellä mainittuihin luokkiin luokitellut mikro-organismit.

25 Kyseisenlaiset sekvenssit voidaan valmistaa helposti nukleotidisynteeseillä. Esillä oleva keksintö siten liittyy erityisesti pentadekadeoksiribonukleoti-diin (deoksiribonukleiinihapposekvenssi, jossa on 15 nukleotidia, lyhennettynä 15-meeri), joka on komplemen-30 taarinen 16S RNAriden 1492 - 1506 alueelle, tämän 15--meerin kyetessä hybridisoitumaan kaikkien elävien organismien 16S RNA:ssa esiintyvän homologisen fragmentin kanssa, kuin myös deoksiribonukleiinihapon (DNA) sellaisen osan kanssa, joka koodaa tällaista RNA-osaa ja 35 joka esiintyy kaikkien elävien organismien genomissa.

Esillä oleva keksintö tuo edelleen esiin koettimia, jotka koostuvat oligonukleotideista, jotka ovat 7 89185 komplementaarisia edellä mainitulle sekvenssille UCAUAACCCGAAGGUC, ja joita voidaan käyttää sellaisten mikro-organismien määrityksessä, jotka voidaan luokitella bakteereihin. Keksintö tuo edelleen esiin koetti-5 mia, jotka ovat komplementaarisia edellä mainitulle sekvenssille UUCGACGAGRUGGGGCGC, näiden koettimien ollessa itsessään karakteristisia arkebakteereille.

Edelleen esillä oleva keksintö tuo esiin 15-nukleotidin (15-meeri) DNA-sekvenssin, joka on komple-10 mentaarinen 16S RNA:iden 1527 - 1541 alueelle. Tämä 15-meeri kykenee hybridisoitumaan bakteerien ja muiden prokarioottien 16S RNAriden sisältämän homologisen fragmentin kanssa, kuin myös näiden organismien DNAzssa olevien vastaavien geenien kanssa, mutta se ei kykene 15 lainkaan tai kykenee vain hyvin heikosti hybridisoitumaan eukarioottisolujen (hiivat, sienet, alkueläimet, ihmisen ja kasvien kudokset) vastaavan RNA:n kanssa tai näiden organismien DNArssa olevien vastaavien geenien kanssa.

20 Esillä oleva keksintö tuo erityisesti esiin seuraavat kompositiot: 1/ Koetin, jota tässä hakemuksessa myöhemmin kutsutaan "universaaliksi koettimeksi" 25

Koetin valmistetaan oligonukleotidisynteesillä ja sillä on seuraavanlainen sekvenssi: (5')d - ACC TTG TTA CGA CTT (3'), jossa (5') ja (3') tarkoittavat polymeerin 5'- ja 3'-30 päitä (ja siten polymeerin polaarisuutta) ja jossa kirjaimet tarkoittavat seuraavia deoksinukleotidejä: A, adenyyli-tähde; C, sytidyyli-tähde; T, tymidyyli-tähde; ja G, guanidyyli-tähde; välilyöntejä käytetään vain sekvenssin, joka sisältää 15 nukleotidia, luettavuuden 35 helpottamiseksi.

Tämä koetin on täysin komplementaarinen (Escherichia colin numeroinnin mukaisesti) ko. mikro-or- 8 89185 ganismin 16S RNA:n 1492 - 1506 osalle ja vastaaville, kaikkien muiden bakteerien julkaistujen RNA:iden osille, prokarioottisille ja eukarioottisille soluille, sekä, vaikkakin vähemmissä määrin, mitokondrioiden 5 RNA:ille. Ammattimies voi päätellä tästä, että käytännössä voidaan täysin olettaa, että tämä koetin toimii myös kaikkien luonnossa olevien solujen RNA:iden kanssa. Tämä koetin voi myös muodostaa parin DNA:iden niiden geenien homologisen osan kanssa, jotka koodaavat 10 näitä 16S RNA:ita ja vastaavia eukarioottisia RNA:ita.

Luonnollisesti keksintö tuo esiin myös koettimen, joka on komplementaarinen edellä mainitulle "universaalille koettimelle" ja joka omaa seuraavan nukleo-tidisekvenssin: (5')d - AAG TCG TAA CAA GGT (3'), 15 joka pystyy muodostamaan parin genomisen DNA:n (geenit, jotka koodaavat 16S RNArita ja vastaavia RNA:ita) vastaavan osan kanssa johtuen sen kaksoissäieluonteesta, vaikkakin se ei enää pysty muodostamaan paria 16S RNA:-iden (joka sisältää vain yhden säikeen) kanssa.

20 2/ Koetin, jota tässä yhteydessä myöhemmin kutsu taan "eubakteereille ja tietyille arkebakteereille spesifinen kompositio" tai "eubakteriaalinen koetin".

Eräs edullinen koetin valmistetaan oligonukle-25 otidisynteesisillä ja sillä on seuraavanlainen sekvenssi : (5')d - AAG GAG GTG ATC CAG (3'), missä (5'), (3'), A, C, T ja G tarkoittavat samaa kuin edellä.

30 Tämä sekvenssi on komplementaarinen bakteeri en, erityisesti eubakteerien, 16S RNA:iden 1527 - 1541 osaa myötäilevän (konsensus) sekvenssin kanssa (Escherichia colin numeroinnin mukaisesti). Tämä sekvenssi ei ole täysin komplementaarinen kaikille tähän mennessä 35 julkaistujen bakteerien 16S RNA-sekvensseille, mutta se eroaa edellisistä enintään vain yhden tai kahden nukleotidin verran. Toisaalta tämän komposition sekvenssi 9 89185 voi muodostaa vain heikosti parin eukarioottien 18S RNA:iden ja mitokondrion 12S RNA:iden (nämä RNA:t vastaavat bakteerien 16S RNA:itä) homologisen alueen kanssa .

5 Keksintö liittyy luonnollisesti myös mihin tahansa koettimeen, joka pystyy muodostamaan parin RNA:iden ja/tai genomisen DNA:iden vastaavien alueiden kanssa, erityisesti sekvenssiin, joka poikkeaa yhden nukleotidin verran edellä kuvatusta "eubakteriaalisesta 10 koettimesta" siten, että se muodostaa parin sekvenssin UGGAUCACCUCCUUA kanssa, jolloin koetin sisältää seuraa-van sekvenssin: (3') ACCTAGTGGAGGAAA (5') tai (jos lukusuunta on käänteinen) 15 (5')d - AAAGGAGGTGATCCA (3'), jotka sekvenssit esiinty vät suurimmassa osassa bakteereja.

Edelleen, esillä oleva keksintö liittyy luonnollisesti myös mihin tahansa pienempään oligonukleoti-dikoettimeen, jonka sekvenssi sisältyy edellä mainit-20 tuun "eubakteereille spesifiseen koettimeen" tai koettimeen, jossa on "muutettu sekvenssi".

Tämä koetin sisältää ainakin sekvenssin TGGAGGAA (5') (joka on komplementaarinen 16S RNA:n alueelle, joka sijaitsee nukleotidien 1534 ja 1541 25 välissä), erityisesti (5')d - AAGGAGGT (3') (5’)d - AAAGGAGGT (3’) (5')d - AAGGAGGTG (3') (5’)d - AAGGAGGTGA (3') 30 (5’)d - AAGGAGGTGAT (3') (5’)d - AAGGAGGTGATC (3') (5')d - AAGGAGGTGATCC (3') (5')d - AAGGAGGTGATCCA (3').

35 Myös sekvenssit, jotka ovat komplementaarisia edellä mainittujen kanssa, kuuluvat keksinnön mukaisten • ' koettimien ryhmään.

ίο B 91 8 5

On kuitenkin syytä painottaa, että pisimmät koettimet ovat edullisia johtuen niiden parinmuodostus-stabiilisuudesta. Lisäksi sekvenssissä yhden nukleotidin korvaaminen toisella voi mahdollisesti lisätä af-5 finiteettiä tietyn bakteriaalisen ryhmän 16S RNA:ille, mutta mahdollisesti heikentää niiden komplementaari-suutta muihin nähden. Toisaalta pidennys 3'-päässä kokonaisella tai osittaisella CCGCA-yksiköllä ei lisäisi spesifisyyttä, sillä sen yksikön komplementti esiin-10 tyy selkärankaisten 18S RNAsissa.

3/ Arkebakteereille spesifinen koetin

Edelleen esillä oleva keksintö tuo esiin erityisesti arkebakteereille spesifisen koettimen. Tämä 15 koetin omaa sekvenssin, jossa on ainakin 8 peräkkäistä nukleotidia, jotka esiintyvät seuraavassa sekvenssissä: AAGCTGCTCR’ACCCCGCG, ja jossa sekvenssissä on enintään nämä 18 nukleotidiä R':n ollessa T tai C.

20 Keksinnön mukaisten koettimien valmistusta ja käyttösovellutuksia kuvataan seuraavassa yksityiskohtaisemmin.

Universaalit koettimet ja spesifisemmät koettimet eubakteereille ja arkebakteereille (ja komple-25 mentaarisille kompositioille) on edullisesti leimattu. Mitä tahansa sinänsä tunnettua leimausta voidaan käyttää. Kompositiot voidaan leimata käyttäen radioaktiivisia aineita, kuten 32P, 35S, 125I, 3H tai 14C, jotka ovat tavallisimmin käytettyjä aineita. Radioaktiivinen lei-30 maus voidaan suorittaa millä tahansa menetelmällä, esim. terminaalisella leimauksella 3'- tai 51-päähän käyttäen radioleimattua nukleotidiä, polynukleotidi-kinaasia (yhdessä tai ilman defosforylaatiota fosfataa-sin kanssa) tai ligaasia (riippuen leimattavasta pääs-35 tä). Näissä tapauksissa leimattu kompositio sisältäisi 16 nukleotidiä (radioaktiivinen nukleotidi lisättynä 3'- tai 5'-päähän ja ollen minkä tahansa tyyppinen).

11 8 91 C 5

Jokin keksinnön mukaisista koettimista (myös komplimen-taarinen kompositio) voi toimia templaattina lyhyen säikeen synteesille (n. 15 nukleotidiä) koostuen radioaktiivisista nukleotideistä tai radioaktiivisten ja 5 ei-radioaktiivisten nukleotidien yhdistelmästä. Keksinnön mukaiset koettimet voidaan valmistaa myös kemiallisilla synteeseillä käyttäen yhtä tai useampaa radioaktiivista nukleotidiä. Eräs edullinen radioaktiivinen leimausmenetelmä on keksinnön mukaisten koettimien 10 kemiallinen jodinaatio, jolloin oligomeereihin sitoutuu useita I-atomeja. Jos keksinnön mukainen koetin (tai komplementaarinen koetin) on tehty radioaktiiviseksi ja sitä käytetään hybridisaatiossa ei-radioaktiivisen RNA:n tai DNA:n kanssa, niin hybridisaation määritys-15 menetelmä riippuu käytetystä radioaktiivisesta aineesta ja voi pohjautua autoradiografiaan, nestetuiketekniik-kaan, gammalaskuritekniikkaan tai muuhun tekniikkaan, joka mahdollistaa radioaktiivisen aineen emittoiman ionisoivan säteilyn määrittämisen.

20 Ei-radioaktiivista leimausta voidaan myös käyttää yhdistelemällä keksinnön mukaiset koettimet sellaisten tähteiden kanssa, joilla on immunologisia ominaisuuksia (antigeenit, hapteenit), spesifistä affiniteettia tiettyihin reagensseihin (ligandit), ominai-25 suuksia, jotka mahdollistavat todettavien entsyymireak-tioiden tapahtumisen (entsyymit tai koentsyymit, ent-syymisubstraatit tai muu aine, joka liittyy entsymaat-tiseen reaktioon), tai karakteristisia fysikaalisia ominaisuuksia, kuten fluoresenssia tai valon emissiota 30 tai absorbtiota jollakin aallonpituudella, näiden ollessa vain muutamia mainittuja esimerkkejä. Vasta-aineita, jotka tunnistavat spesifisesti DNA/RNA-hybridit, voidaan myös käyttää.

Edellä mainittu kemiallinen leimaus voidaan 35 suorittaa keksinnön mukaisten koettimien kemiallisen synteesin aikana, jolloin adenosiini-, guanosiini-, sytidiini- ja tymidiini-tähteet voidaan yhdistää muihin 12 891 05 kemiallisiin tähteisiin, joilla mahdollistetaan komposition tai hybridin, joka on muodostettu komposition ja komplementaarisen DNA- tai RNA-fragmentin välille, määrittäminen. Kuitenkin, komposition sekvenssi, jossa 5 on modifioitu nukleotidejä yhdistämällä niitä muihin kemiallisiin tähteisiin, tulee tällöin olla sama kuin jonkin keksinnön mukaisen koettimen nukleotidisekvens-si.

Esillä oleva keksintö liittyy myös hybridisaa-10 tioon perustuviin määritysmenetelmiin, joissa menetelmissä käytetään keksinnön mukaisia koettimia, jotka on aikaisemmin leimattu tai saatettu edellä mainitun mukaisesti määritettävään muotoon.

Keksinnön mukaisten koettimien valinta riippuu 15 tutkittavasta kohteesta: prokarioottisten ja eukarioot-tisten solujen määritys (universaalikompositio), DNA:iden tai DNA-fragmenttien, jotka sisältävät 16S--sarjojen RNA:ita koodaavia geenejä ja jotka ovat peräisin prokariootti- tai eukarioottisoluista ilman 20 erottelua (universaalikompositio tai koetin, joka on tälle komplementaarinen), yksinomaan bakteerisolujen määritys (eubakteereille spesifinen koetin), DNAsiden tai DNA-fragmenttien, jotka sisältävät bakteriaalisia 16S RNA:ita koodaavat geenit, määritys- tai paikallis-25 taminen (eubakteereille spesifinen koetin tai sille komplementaarinen koetin). Yhden tai useamman keksinnön mukaisen koettimen käyttöä ei voida rajoittaa tiettyyn hybridisaatiotekniikkaan.

Jos täytyy määrittää elävistä organismeista 30 olevia soluja (tai jotka itsessään ovat eläviä organismeja), niin näiden solujen RNA:t ja/tai DNA täytyy tehdä käsiteltäväksi (osittaisella tai täydellisellä solujen lyysillä käyttäen kemiallisia tai fysikaalisia menetelmiä) ja ne on saatettava kosketuksiin yhden tai 35 useamman keksinnön mukaisen koettimen kanssa koetti-men/koettimien itsessään ollessa tehty määritettäväksi. Tämä kosketuksiin saattaminen voidaan suorittaa 13 89 1 85 sopivassa kantajassa, kuten nitroselluloosa-, selluloosa-, (modifioitu tai modifioimaton) tai nailonsuodatti-messa (vain tavalliset kantajat mainittaessa) tai ku-dosleikkeessä tai solupreparaatissa; tai ilman kantajaa 5 nestemäisessä väliaineessa. Tämä kosketuksiin saattaminen suoritetaan optimaalisissa tai rajoittavissa olosuhteissa (so. olosuhteissa, jotka sallivat hybridien muodostuksen vain, jos sekvenssit ovat täydellisen homologisia molekyylin koko pituudella, joka pituus 10 kasvaa olosuhteiden tullessa enemmän "rajoittaviksi") lämpötilaan ja ionikonsentraatioon nähden, yhdessä tai ilman aineita, jotka alentavat nukleiinihappojen parinmuodostukselle optimaalista lämpötilaa (formamidi, di-methyylisulfoksidi, urea), ja yhdessä tai ilman ainei-15 ta, jotka pienentävät oleellisesti reaktiotilavuutta (dekstraani, dekstraanisulfaatti).

Koettimen reagoimattomien molekyylien tai molekyylifragmenttien poisto kantajasta voidaan suorittaa pesemällä puskuriliuoksella, jolla on sopiva ioni-20 vahvuus, sopivassa lämpötilassa, käsittelemällä tai ei-käsittelemällä Sl-nukleaasilla tai muilla entsyymeillä, jotka pilkkovat yksisäikeistä DNA:ta tai yksisäikeistä RNA:ta mutta ovat pilkkomatta DNA/RNA-hybridejä tai kaksoissäikeistä DNA:ta. Nestemäisessä väliaineessa 25 koetinmolekyylit (tai -fragmentit), jotka ovat muodostaneet parin RNA- tai DNA-fragmenttien kanssa, voidaan erottaa vastaavasta reagoimattomasta materiaalista kromatografisesti hydroksiapatiitilla tai Sl-nukleaasi-* käsittelyn jälkeen millä tahansa erotusmenetelmällä, 30 joka soveltuu kaksoissäikeisten fragmenttien erotukseen vapaista nukleotideista (kromatografisesti hydroksiapatiitilla tai DEAE-selluloosalla; ekskluusiokromatogra-fisesti, jakokiteytyksellä tai dialyysillä vain tavallisimmat menetelmät mainittaessa.) 35 Käytetyn komposition molekyylit (tai fragmen tit) määritetään sitten kaikkein edullisimmalla menetelmällä riippuen valitusta leimaustyypistä.

14 891 8 5

Teknisistä yksityiskohdista on selostettu erilaisissa julkaisuissa (Maniatis et ai. (1982), "Molecular cloning, A Laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory; Grimont et al. (1985), J. Clin. Mlc-5 robiol. (vol. 21, No. 3, s. 431 - 437) tai patenttijulkaisuissa (FR: 84/12,250, 78/10,975, 81/24,631; EP: 0,133,288, 0,063,879). Ko. teknisiä yksityiskohtia voidaan soveltaa edullisesti keksinnön mukaisille kompositioille.

10 Mikäli kromosomaalisia DNA-fragmentteja, jot ka sisältävät 16S RNArita (tai vastaavia RNA:ita) koo-daavia geenejä on tarkoitus paikallistaa DNA:n yhdellä tai useammalla restriktioentsyymillä käsittelyn, fragmenttien erotuksen elektroforeettisesti tai kromato-15 grafisesti ja DNA-fragmenttien denaturaation, so. kahden säikeen erotus, jälkeen, niin jokin keksinnön mukaisista koettimista saatetaan yhteyteen DNA-fragment-tien kanssa olosuhteissa, jotka suosivat hybridisaatiota. Tämän jälkeen, kun on kulunut riittävä aika 20 hybridisaation loppuun viemiseksi, komposition ei-hyb-ridisoituneet fragmentit erotetaan hybridoiduista fragmenteista ja leimaus visualisoidaan edellä esitetyn mukaisesti solujen toteamiseksi.

Teknillisiä yksityiskohtia, joita on kuvattu 25 patentissa EP 0,120,658 (John A. Webster Jr.) tai

Maniatis et ai. työssä tai julkaisussa Grimont et ai. (mainittu aikaisemmin tekstissä), voidaan soveltaa mille tahansa keksinnön mukaiselle koettimelle. Tulee huomata, että sellaisten kromosomaalisten DNA-fragment-30 tien, jotka sisältävät 16S RNA:ita koodaavat geenit, paikallistamisessa antaa jokin keksinnön mukainen koetin ja sille komplementaarinen koetin täsmälleen samat tulokset.

Tavallisesti, keksinnön mukaiset erilaiset 35 koettimet voidaan myös sisällyttää rekombinaatti DNA- rekombinantteihin, jotka mahdollistavat koettimien kloonauksen, edellyttäen, että heterologisen DNA:n is 89185 läsnäolo ei huononna koettamien spesifisyyttä edellä esitetyissä sovellutuksissa.

Lopuksi halutaan sanoa, että koettimet, joissa tymidiiniryhmät on korvattu urasiiliryhmillä (nämä 5 koettimet katsotaan siten täysin selityksessä tarkemmin suojattuja koettimia vastaaviksi), myös muodostavat osan keksintöä vaikkakin niiden synteesi on vaikeampi suorittaa.

Claims (10)

1. Koetin bakteerien määrittämiseksi näytteestä; tai DNA-fragmenttien, jotka sisältävät baktee- 5 rien 16S RNA:ita koodaavat geenit, paikallistamiseksi elektroforeettisesti tai kromatografisesti erotetuista DNA-fragmenteista, tunnettu siitä, että koetin koostuu joko pentadekadeoksiribonukleotidista, jolla on sekvenssi: 10 (5’)d - AAG GAG GTG ATC CAG (3’), jossa (5') ja (3') tarkoittavat polymeerin 5’- ja 3'-päitä ja kirjaimet tarkoittavat seuraavia tähteitä (nukleotidejä): A, adenyyli-tähde; C, sytidyyli-tähde; T, tymidyyli-tähde; ja G, guanidyyli-tähde; tai penta-15 dekadeoksiribonukieotidista, jolla on komplementaarinen sekvenssi: (5')d - CTG GAT CAC CTC CTT (3’).

2. Koetin bakteerien määrittämiseksi näytteestä; tai DNA-fragmenttien, jotka sisältävät baktee- 20 rien 16S RNA:ita koodaavat geenit, paikallistamiseksi elektroforeettisesti tai kromatografisesti erotetuista DNA-fragmenteista, tunnettu siitä, että koetin koostuu sekvenssistä: (3') ACCTAGTGGAGGAAA (5'), 25 tai vastaavasta komplementaarisesta sekvenssistä.

3. Koetin bakteerien määrittämiseksi näytteestä; tai DNA-fragmenttien, jotka sisältävät bakteerien 16S RNA:ita koodaavat geenit, paikallistamiseksi elektroforeettisesti tai kromatografisesti erotetuista

30 DNA-fragmenteista, tunnettu siitä, että koetin koostuu sekvenssistä, joka valitaan seuraavien sekvenssien ryhmästä: (5’)d - AAGGAGGT (3 ' ); (5')d - AAAGGAGGT ( 3 ' ) ; (5')d - AAGGAGGTG (3'); (5')d - AAGGAGGTGA (3'); 35 (5')d - AAGGAGGTGAT (3 ' ); (5')d - AAGGAGGTGATC (3'); (51)d - AAGGAGGTGATCC (3'); (5')d - AAGGAGGTGATCCA (3 ' ) tai vastaavista komplementaarisista sekvensseistä. 17 891 85

4. Koetin eukarioottisten tai prokarioottis-ten organismien solujen, bakteerit mukaanlukien, määrittämiseksi näytteestä; tai DNA-fragmenttien, jotka sisältävät näiden solujen 16S sarjojen RNA:ita koodaa- 5 vat geenit, paikallistamiseksi elektroforeettisesti tai kromatografisesti erotetuista DNA-fragmenteista, tunnettu siitä, että koetin koostuu joko penta-dekadeoksiribonukleotidista, jolla on sekvenssi: (5’)d - ACC TTG TTA CGA CTT (3'), 10 jossa (5’) ja (3') tarkoittavat polymeerin 5'- ja 3'-päitä ja kirjaimet tarkoittavat seuraavia tähteitä (nukleotideja): A, adenyyli-tähde; C, sytidyyli-tähde; T, tymidyyli-tähde; ja G, guanidyyli-tähde; tai penta-dekadeoksiribonukleotidistä, jolla on komplementaarinen 15 sekvenssi: (5')d - AAG TCG TAA CAA GGT (31)

5. Koetin arkebakteerien (archaebacteria) määrittämiseksi näytteestä; tai DNA-fragmenttien, jotka sisältävät arkebakteerien 16S RNA:ita koodaavat geenit, 20 paikallistamiseksi elektroforeettisesti tai kromatografisesti erotetuista DNA-fragmenteista, tunnettu siitä, että koetin koostuu sekvenssistä, jossa on ainakin 8 peräkkäistä nukleotidia, jotka sisältyvät seuraavaan sekvenssiin:

25 AAGCTGCTCR'ACCCCGCG, ja enintään mainitusta 18 nukleotidin sekvenssistä, jossa R’ on T tai C; tai yllä mainituille komplementaarisesta sekvenssistä.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukai-30 nen koetin, tunnettu siitä, että oligonukle- otidikoetin, jolla on patenttivaatimuksissa 1-5 mainittu sekvenssi, on leimattu radioaktiivisesti, erityisesti minkä tahansa tyyppisellä yhdellä tai kahdella radioaktiivisella nukleotidilla, yhdessä tai molemmissa 35 päissä, tai leimattu, erityisesti entsyymi-, ligandi-, luminoivilla tai fluorisoivilla, leimoilla.

7. Menetelmä bakteerien määrittämiseksi näyt- ie 89185 teestä, jolloin bakteerien nukleiinihappojen käsiteltäväksi ja yksisäikeiseksi saattamisen jälkeen nukleiinihapot saatetaan yhteyteen koettimen kanssa olosuhteissa, jotka suosivat hybridisaatiota, ja mahdollisesti 5 muodostuneet hybridit määritetään, tunnettu siitä, että koettimena käytetään patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukaista koetinta.

8. Menetelmä eukarioottisten tai prokarioot-tisten organismien, bakteerit mukaanlukien, solujen 10 määrittämiseksi näytteestä, jolloin solujen nukleiinihappojen käsiteltäväksi ja yksisäikeiseksi saattamisen jälkeen nukleiinihapot saatetaan yhteyteen koettimen kanssa olosuhteissa, jotka suosivat hybridisaatiota, ja mahdollisesti muodostuneet hybridit määritetään, 15 tunnettu siitä, että koettimena käytetään patenttivaatimuksen 4 mukaista koetinta.

9. Menetelmä arkebakteerien (archaebacteria) määrittämiseksi näytteestä, jolloin arkebakteerien nukleiinihappojen käsiteltäväksi ja yksisäikeiseksi 20 saattamisen jälkeen nukleiinihapot saatetaan yhteyteen koettimen kanssa olosuhteissa, jotka suosivat hybridisaatiota, ja kaikki mahdollisesti muodostuvat hybridit määritetään, tunnettu siitä, että koettimena käytetään patenttivaatimuksen 5 mukaista koetinta.

10. Menetelmä DNA- fragmenttien, jotka sisäl tävät 16S sarjojen RNA:ita koodaavat geenit, paikallistamiseksi elektroforeettisesti tai kromatografisesti eroitetuista DNA-fragmenteista, jolloin erotetut ja denaturoidut DNA-fragmentit saatetaan yhteyteen koetti- 30 men kanssa olosuhteissa, jotka sallivat mahdollisen hybridisaation, ja mahdollisesti muodostuneet hybridit määritetään, tunnettu siitä, että koettimena käytetään minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukaista koetinta. 19 891 Π 5