JPH02108969A - リポソームを用いる免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、リポソームを用いる免疫測定法に関し、更に
詳しくは、被検試料中に存在する補体または抗原を定性
的あるいは定量的に測定するリポソームを用いる免疫測
定法に関する。

〔従来技術と問題点〕

補体系はヒトなどの動物の新鮮血・ｌｕ中に含まれる２
０種類近いタンパク質より構成され、生体の感染防御等
各種の免疫反応に関与する重要な反応系である。補体系
は生体防御において欠くことのできない役目を果たして
いるが、種々の疾患において補体系の異常が認められる
ため、補体活性、すなわち補体価の測定が臨床診断とし
て利用されている。特に全身性エリテマトーデス等の如
く補体価の減少する疾患の場合、その補体価測定が重要
視されている。

現在最も一般的な補体価測定法としては、生体由来の赤
血球を用いる５０％溶血法が知られている〔例えば、［
役にたつ免疫実験法Ｊ、西岡、嶋田、真崎編、講談社す
イエンティフィク（１９８４）、９９〜１０４頁参照］
。この５０％溶血法は、至適条件下で、補体系を活性化
するような一定個数の赤血球のうち、その半数を溶血す
るのに必要な補体量を測定するもので、非常に煩雑な操
作を要し測定に長時間掛かる、生体由来の赤血球は不安
定で長期保存が不可能である、また遠心操作を要するた
め自動化が困難である、といった問題点を有している。

これに対して、近年、生体由来の赤血球に代わり人工の
脂質膜小胞であるリポソーム（ｌｉρｏｓｏｍ−ｅ）を
用いる補体測定法が開発されつつある。リポソームを用
いる補体測定法は、標識物質をその内部に封入しかつ補
体活性により膜損傷作用を受けるように調製したリポソ
ームを、被検試料中に存在する補体と作用させることに
より補体系を活性化し、被検試料中の補体活性に応じた
リポソームＭ　損傷反応を起こさせ、その結果リポソー
ムから遊離した標識物質を測定することによって、補体
または補体成分の活性測定を行うものである。

このリポソームを用いる補体測定法は、５０％溶血法と
比較して、生体由来の赤血球に比べて安定なリポソーム
を用い、簡単な操作で測定も短時間で済み、遠心操作等
の分離操作を要しないので自動化に適した測定法である
、といった利点を有している。

一方、抗原抗体反応を利用して、血液中などに微量に存
在するタンパク質ホルモン、活性ペプチド、オータコイ
ド、腫瘍マーカーなどの生体成分や薬剤等を検出する免
疫測定法は医療診断などに広く応用されている。

従来、この免疫測定法としては、一般に放射性同位元素
で標識した抗原または抗体を用いる放射免疫測定法（Ｒ
１へ）や、酵素などで標識した抗原または抗体を用いる
酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が用いられてきた。しかし乍
ら、Ｒ１へは取り扱いが面倒で廃棄処理も問題となり、
またＥＩＡは抗原抗体結合物と結合していない抗原ある
いは抗体をなんらかの方法で分離しなければならず、操
作が複雑であり自動化に適さないという欠点を有してい
た。

これに対して、近年、抗原抗体結合物と遊離物の分離を
要しない均−系の測定法として、補体測定と同様、リポ
ソームを用いる免疫測定法が開発されつつある。これは
、被検試料中の抗原に対する抗体を結合し標識物質をそ
の内部に封入したリポソームを被検試料に加え、更に補
体を添加することにより、リポソーム膜上に形成される
抗原抗体結合物によって補体系を活性化させ、被検試料
中の抗原量に応じた一連の補体依存性リポソーム膜損傷
反応を起こ、させ、その結果リポソーム内に封入した標
識物質が遊離するため、その量を測定するものである。

また、抗体を結合したリポソームと抗原を反応させてか
ら、もう−度抗原に特異的な抗体を添加し反応させ、二
次的に作られた抗原抗体結合物で補体系を活性化させる
測定法も開発されている。

このリポソームを用いる免疫測定法は、抗原抗体結合物
と遊離物の分離操作が不要な均−系の測定であるので、
操作が簡単で短時間で済み、自動化に適するなどの利点
を有している。

このように、標識物質をその内部に封入し補体活性によ
り膜損傷作用を受けるリポソームと補体を用い、該リポ
ソームに補体を作用させ、補体活性または抗原量に応じ
て該リポソームから遊離した該標識物質を測定すること
により、被検試料中に存在する補体または抗原を測定す
る免疫測定法は、操作が間車で自動化に適した測定法と
して期待されているが、生体由来の物質と比べて安定と
はいえ、リポソームの構造はリポソームを構成する脂質
分子間の非結合性相互作用によって保たれているため、
補体や抗原の測定に際しリポソームを補体と作用させる
と、場合によっては、補体活性や抗原量に依存しないで
非特異的に標識物質のリポソームからの遊離が起こり、
補体や抗原の正確で定量性のある測定を行うことができ
ないという欠点を有していた。

本研究者らは前記の欠点を克服すべく鋭意研究を進めた
結果、標識物質をその内部に封入し補体活性により膜損
傷作用を受けるリポソームと補体を用い、該リポソーム
に補体を作用させ、補体活性または抗原量に応じて該リ
ポソームから遊離した該標識物質を測定することにより
、被検試料中に存在する補体または抗原を測定する免疫
測定法において、該リポソームを含む塩類溶液に補体系
を活性化しない高分子物質を含有せしめることにより、
安定でかつ正確な測定を行い得ることを見出し、本発明
を完成するに至った。

〔問題点を解決するための手段〕

即ち本発明は、標識物質をその内部に封入し補体活性に
より膜を員傷作用を受けるリポソームと補体を用い、該
リポソームに補体を作用させ、補体活性または抗原量に
応じて該リポソームから遊離した該標識物質を測定する
ことにより、被検試料中に存在する補体または抗原を測
定する免疫測定法において、該リポソームを含む塩類溶
液に補体系を活性化しない高分子物質を含有せしめるこ
とを特徴とするリポソームを用いる免疫測定法を内容と
するものである。

本発明のリポソームを用いる免疫測定法は、標識物質を
その内部に封入し補体活性により＋１９損傷作用を受け
るリポソームまたは被検試料を稀釈、保存するために用
いる塩類溶液に、補体系を活性化しないような高分子物
質を含有せしめ、これを測定に用いることにより、該リ
ポソームや補体を保護、安定化し、補体活性や抗原量に
依存しない非特異的な標識物質の該リポソームからの遊
離や補体の早急な失活を防ぎ、その結果、安定でかつ正
確な補体または抗原の測定ができるものである。

また、補体系を活性化しない高分子物質を含有せしめた
塩類溶液にて該リポソームを保存すると、リポソーム内
に封入する標識物質の保持能が改善され、またリポソー
ムどうしの融合を防止できるため、長期間安定に保存可
能である、といった利点も有する。

本発明で用いるリポソームを含む塩類ｉ８液に含有せし
める、補体系を活性化しない高分子物質としては、補体
系を活性化せず、またリポソーム膜表面に吸着されるこ
とのないものであればあらゆるものが適用可能である。

このようなものとしては、例えば、ゼラチン、アルブミ
ン、グロブリン、コラーゲン、ポリエチレングリコール
、ポリビニルアルコール、寒天、アガロース、アルギン
酸ナトリウム、キトサン、に−カラギーナン、デンプン
等が挙げられ、これらの単独又は２種以上を塩類溶液に
０．０２〜１．０重量％、好ましくは０．０５〜０．２
重量％程度含有せしめて使用する。

本発明の免疫測定法で用いるリポソームとは、リン脂質
等を水溶液中に分散すると得られる、脂質二分子膜によ
り囲まれた内水相をもつ人工の脂質膜小胞のことを指し
、その形状より、多重層リポソーム（ｍｕｌｔｉｌａｍ
ｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ　％以下、門ＬＶという）
、小さな一枚膜リポソーム（ｓｍａｌｌ　ｕｎｉｔ−ａ
ｌｌｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ　％以下、ＳＵνとい
う）、大きな一枚膜リポソーム（ｌａｒｇｅ　ｕｎｉｌ
ａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ　％以下、ＬｔｌＶと
いう）に大別されているが、これらはいずれも本発明に
応用可能である。

本発明の免疫測定法で用いるリポソームを作製する際に
使用できる脂質としては、リン脂質、糖脂質、コレステ
ロールなどが挙げられ、リン脂質としては、動物や微生
物などの細胞膜に広く存在するリン脂質、たとえばホス
ファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルコリン
類、ホスファチジルセリン類、スフィンゴミエリン類な
どの各種リン脂質が挙げられる。もちろん、天然の卵黄
、牛脳や大豆などから得られるホスファチジルコリンも
適用できる。

このようなリン脂質中の脂肪酸の種類には各種の飽和ま
たは不飽和脂肪酸が含まれ、たとえばホスファチジルコ
リンについて挙げれば、ジヘプタノイルー、シカブロイ
ル−、ジデカノイルー、ジラウロイル−、ジヘプクデカ
ノイルー、ジベヘノイルー、シミリストイル−、ジパル
ミトイル−ホスファチジルコリン等の脂肪酸が挙げられ
、前述のその他のリン脂質も同様に各種飽和および不飽
和脂肪酸が含まれる。

標識物質を封入したリポソームの調製法としては、従来
公知のリポソーム調製法を応用することができる。たと
えば（１）有機溶媒に溶解したリン脂質を容器に入れ、
減圧下にエバポレータまたは窒素ガスの吹きつけにより
溶媒を除去して薄い脂質膜を形成さゼ、次いで、あらか
じめ封入したい標識物質を含む適当な塩類？８液やあら
かじめ標識物質を溶解した水溶液を加え振盪する方法〔
ニー・デイ−・パンガム（＾、　Ｄ、　Ｒａｎｇｈａ鋼
）ら、ジャーナル・オプ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、１３Ｓ、２３８頁（１９６５
）およびデイ−・パパジョボウラス（Ｄ、　Ｐａｐａｈ
ａｄｊｏｐ。

ｕｌｏｓ）　　ら、バイオケミカル・バイオフィジカル
・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃ
Ｌａ）　、１３５巻、６３９頁（１９６７）やポルテッ
クスミキサーで振盪攪拌する方法Ｃケー・イノウニ（Ｋ
、　Ｉｎｏｕａ）、バイオケミカル・バイオフィジカル
・アクタ、３３９巻、３９０頁（１９７４）およびニス
・シー・キンスキー（Ｓ、　Ｃ，Ｋ１ｎ５ｋｙ）　　ら
、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ１ｓｔｒｙ）
　、８巻、４１４９頁（１９６９）参照〕、（２）前記
（１）の方法で得たＭＬＶをさらに超音波発振装置で超
音波処理しＳＵｖを作製する方法〔デイ−・パパジョボ
ウラスら、バイオケミカル・バイオフィジカル・アクタ
、３１、１巻、３１０頁（１９７３）参照〕、（３）有
機溶媒に溶解したリン脂質を急激に標識物質を含む塩類
溶液と混和する方法〔ニス・バツィーリ（Ｓ、　Ｂａｔ
ｚｒｉ）ら、バイオケミカル・バイオフィジカル・アク
タ、２９８巻、１０１５頁（Ｉ９７３）参照〕、く４）
エーテルに溶解したリン脂質をエーテルの沸点より高く
した、あらかじめ標識物質を溶解した水溶液にゆっくり
と吹き出させる方法（デイ−・ダブリュー・デイ−マー
（Ｄ、　Ｗ。

Ｄｅａｍｅｒ、アニュアル・ニューヨーク・アカデミ−
・オブ・サイエンス（Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ
、　５ｃｉ）、３０８Ｓ、２５９頁（１９７８）参照）
、（５）ホスファチジルセリン単独あるいは等量のホス
ファチジルセリンとコレステロールからなるリポソーム
を超音波発振装置で超音波処理してＳＵｖを作成し、カ
ルシウム処理の後、４！識物質を含む塩類溶液とＥＯＴ
Ａを加えＬＩＪＶを作成する方法〔デイ−・パパジョボ
ウラス、アニエアル・ニューヨーク・アカデミ−・オブ
・サイエンス、３０８Ｓ、２５９頁（１９７８）参照〕
、および（６）脂質を含む有機溶媒に標識物質を熔解し
た水溶液を加え超音波発振装置で超音波処理した後、ロ
ータリーエバポレータで有機溶媒を除去し逆相リポソー
ムとする方法Ｃエフ・ズオカ・ジュニア（Ｆ、　５ｚｏ
ｋａ。

Ｊｒ、）ら、プロシーディング・オブ・ナンヨナル・ア
カデミ−・オプ・サイエンス・イン・ニー・ニス・ニー
（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ）　、７５巻、４１４９頁（１９７８）参照〕などの
種々の方法を利用することができる。

また、脂質やシアルギルリン酸、ジアルキルアンモニウ
ム塩などにアクリル基、メタクリル基、ジアセチレン基
、ジエン基などの重合可能な官能基を導入し、前記の方
法に基づき少なくとも一部にこの重合性の脂質などを含
んだリポソームを作製し、その後に紫外線を照射したり
重合開始剤を加えるなどの方法により、リポソーム膜中
で重合を起こさせリポソームを安定化する方法〔たとえ
ば、エイチ・オオノ　（Ｈ，０ｈｎｏ）ら、マクロモレ
キュールズ（Ｍａｃｒｏ＋＊ｏｌｅｃｕｌｅｓ）　、　
２０！、９２９頁（１９８７）、およびイー・ツチダ（
Ｅ、　Ｔｓｕｃｈｉｄ−ａ）ら、マクロモレキュラー・
ヘミ−（Ｍａｋｒｏｍｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）、１８７頁、１３５１頁（１９８６）参照
〕も利用することができる。リポソームの重合を行うと
、膜の物理的強度が増大し、リポソーム内に封入する標
識物質の保持能が改善され、またリポソームどうしの融
合を防止できるため、長期間安定に保存可能であり、ま
た測定の高感度化を図ることができるため極めて好都合
である。また重合性化合物と非重合性の脂質等からなる
混合リポソームの場合、それらの組合せにより、相溶性
のものおよび相溶性がなくリポソーム膜内で相分離を起
こすものを選択することができ、これらはまた重合性化
合物と非重合性の脂質等の組成の割合を変えることによ
って、膜の物理的強度、安定性を制御することもできる
。リポソーム膜内で相分離が起こるような混合リポソー
ムの場合、ある特定の濃度以上の補体あるいは抗原が存
在すると、補体の作用によりステップ状に標識物質の遊
離が起こるようなものを作製することも可能であり、こ
れを用いると補体あるいは抗原の存在を簡単に定性的に
知ることができる。

リポソーム内に封入する標識物質としては、親水性であ
って、リポソーム外に遊離した際に定量可能な物質であ
ればよく、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、金属、色
素類などリポソームに封入できるものは適用可能である
。たとえば、ラジオイムノアッセイで用いられる１に５
１や１ｆｉｌｌなどの放射性同位元素、蛍光免疫測定法
で用いられるカルボキシフルオレセイン、フルオレセイ
ンイソチオシアネート、フルオレセインイソシアネート
、テトラローダミンイソチオシアネート、５−ジメチル
アミノ−１−ナフタレンスルフォニルクロリドなどの蛍
光物質、およびエオシンＹ、オーラミン０、ルミノール
、ルシフェリンなどの発光物質などが使用できる。

特に、酵素免疫測定法などで用いられるβ−Ｄガラクト
シダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素などの酵素また
はカルシウムイオンなどの金属をリポソームに封入すれ
ば、補体の作用によりリポソームが破壊されることによ
りこれらの物質が外部に流出した際に、それぞれの酵素
に対する基質として、４−メチルウムベリフェリルβ−
Ｄ−ガラクトシド、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン
酸、４−メチルウムベリフェリルフォスフヱート、クル
コース−６−リン酸、エタノールなどを用いたり、カル
シウムイオンに対するカルシウム依存性酵素、たとえば
、カルパイン、プロティンキナーゼＣ，）ランスグルタ
ミナーゼを反応液中に入れておけばいずれも生化学的増
幅反応を構成し、極微量の抗原に対して高感度に応答す
るので好都合である。

上記のリポソームは、補体あるいは抗原の測定のために
それらに応じた機能が付与されて調製される。補体測定
のためのリポソームは、たとえば、補体系を活性化する
物質をその膜内に組込むがあるいはその膜表面上に結合
することにより、補体活性に応じて膜損傷反応を受ける
ように調製される。抗原測定のためのリポソームは、た
とえば、測定する抗原に対する抗体をその膜表面上に結
合される０本発明方法は、このように補体あるいは抗原
の測定のためにそれらに応した機能が付与されて調製さ
れたあらゆるリポソームに対して適用可能である。

上記のようにして調製したリポソームは勿論そのままの
状態で使用できるが、さらにリポソームを一般的に用い
られる担体結合法、架橋法、包括法などの固定化法を用
いることによって得られた固定化物として利用すること
もできる。担体結合法の担体としては、セルロース、デ
キストラン、アガロース、デンプンなどの多糖類の誘導
体、多孔性の合成樹脂、金属酸化物などの無機物質など
が、また包括法の担体としては、合成高分子物質のポリ
アクリルアミド、光硬化性樹脂（ＥＮＴ膜など）、ウレ
タンプレポリマーおよび天然高分子物質のアルギン酸、
カラギーナン、デンプン、ゼラチン、キトサンなどが適
用である。また固定化物の形状は、固定化法の種類によ
っても異なるが膜状、ビーズ状あるいはその他の形状の
ものが適用できる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に詳しく説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ ウサギＴ−グロブリン結合リポソームの調製二Ｎ−サク
シンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレー
ト（ＳＭＰＢ）　　２８．１　μ＋＊ｏｌ　とジパルミ
トイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）
　　２０μｍｏｌをクロロホルム４．５　ｍｌと無水メ
タノール０．５−とのン昆／＆に７容解した。これにト
リエチルアミン２０μｌｌ１ｏｌを添加し、窒素封入上
室温で２時間撹拌し反応させた。反応終了後、メタノー
ル３．５１ｄ、蒸留水２−を加え、よく振盪した。これ
を静置し、クロロホルム相をとり、溶媒を蒸発させた後
、約５−のクロロホルムを添加し溶解した。この）８液
を、１５０℃で１２時間以上乾燥させクロロホルムで平
衡化したｌｏｄ容量のシリカゲル（讐ａｋｏｇｅｌ　Ｃ
−１００、和光純薬工業■製）カラムに負荷し、クロロ
ホルム−メタノール（２０：ｌ　Ｖ／Ｖ）４０〜５０−
で洗浄した。

クロロホルム−メタノール（５：　１．Ｖ／Ｖ）により
溶出する両分を集め、溶媒を蒸発させた後、あらたに５
−のクロロホルムに溶解した。以上の操作により、Ｎ−
（４−＜ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル〕ジパルミ
トイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＢ−ＤＰ
ＰＥ）を調製した。

１００ｍ１ナス型フラスコに、ジパルミトイルホスファ
チジルコリン（ＤＰＰＣ）　　７５μｍｏｌ−，コレス
チロール７５　μｍｏｌ　、リン酸ジセチルＣＤＣＰ）
　７．５／Ｊｍｏｌ　、　ＭＰＢ−ＤＰＰＥ７．５　μ
ｍｏｌをとり、約１０１Ｒ１のクロロホルムに溶解し、
４２℃以上の水浴中にてロータリーエバポレーターで溶
媒を除去した後、残った脂質薄膜に、標識物質溶液とし
て自己消光性の蛍光物質である０、　２　Ｍカルボキシ
フルオレセイン（ＣＦ）１５−を加えポルテックス（Ｖ
ｏｒｔｅｘ）ミキサーで１０分間振優撹拌しＭＬＶを調
製した。

これを１５分間プローブ型超音波発振装置（■日本精機
製作断裂、ｕｓ−３００）で超音波処理することによっ
て均一化しＳＵｖにした。ついでリポソームに封入され
なかったＣＦを除去するために５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２
５（商品名、ファルマシア社製）カラムにてクロマト分
離し、反応性リポソームを得た。

５　ｎｖ　／　ｒａｔのウサギＴ−グロブリンリン酸緩
衝生理食塩水溶液５−に１ＱｄＮ−サクシンイミジル３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネイト（ＳＰ［ｌＰ
）エタノール溶液を０．１ｄ加え、室温で１５分間攪拌
し反応させた。未反応の５ＰＤＰ等を除くために、０．
１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液＋０゜１５　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１（ｐＨ４，５）で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ
２５カラムでクロマト分離した。最初のピーク部分を集
め、これに５０ＩＩＩＭになるようにジチオスライトー
ル（ＤＴＴ）を固体のまま加え溶解し、窒素封入上室温
で３０分間放置した０反応終了後、リン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）　（ｐＨ７，４）で平衡化した５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ｇ　−２５でクロマト分離し、最初のピーク部
分を集めた。以上の操作により５ＰＤＰを通じてウサギ
γ−グロブリンにＳＲ基を導入し、ＳＨＩ導入Ｔ−グロ
ブリンを調製した。

次に、反応性リポソームを二倍に希釈したものとＥ記の
操作で得たＳＨ基導入γ−グロブリンを二倍に希釈した
ものを１　：　１　　（Ｖ／Ｖ）の割合で混合し、窒素
封入下４℃で１２時間放置し反応させた後、リポソーム
に結合しなかったγ−グロブリンを除くために５ｅｐｈ
ａｃｒｙｌ　Ｓ−１０００（商品名、ファルマシア社製
）カラムでクロマト分離し、ウサギγ−グロブリン結合
リポソームを得た。

補体活性の測定： 上記のウサギｒ−グロブリン結合リポソームを、その初
期蛍光強度が適当なものとなるように、ゼラチンを０．
１重量％含み０．５　ｍＭ　ＭｇＣＩｚ及び０．１５ｄ
　ＣａＣ１ｚを含有したリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７
゜４）で１００倍程度に希釈したちの４艷に、あらかし
め既知の濃度となるようＰＢＳで稀釈したモルモット全
補体（方性製薬（ｌ菊製）を被検試料として０、２　ｘ
ｓｌ加え、３７℃で６０分間放置して反応させた後、各
試料の蛍光強度を分光蛍光光度計（■島津製作所製、Ｒ
Ｆ−５０００）で測定した（励起波長：４９０ｎｍ、蛍
光波長５１８ｎｍ）　、尚、測定値は、測定終了後測定
試料に１−プロパツール（ｎプロピルアルコール）を４
．２　ｄ加えリポソームを完全に破壊した後の蛍光強度
を２倍したちの（１−プロパツールで２倍稀釈したため
）と、モルモット全補体の代わりにＰＢＳ−ｔ−０，２
−添加したものの差を１００％として、各被検試料の蛍
光強度を相対的に換算したものを標識物質遊離率（％）
とした。結果を第１図に示す。

同図かられかるように、低濃度から高濃度にかけて補体
濃度に依存した標識物質の遊離が認められる。このこと
から、第１図に示した線を検量線として用いることによ
り、補体の測定が低濃度から高濃度まで安定に行えるこ
とがわかる。

比較例１ 実施例１と同様にして得たウサギγ−グロブリン結合リ
ポソームを、０．５１１ＭＭｇｃ１．及びＯ，１５ｍＭ
ＣａＣ１１を含有したリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７゜
４）で希釈したちの４−に、あらかじめ既知の濃度とな
るようＰＢＳで稀釈したモルモット全補体（方性製薬■
製）０．２−を加え、３７℃で６０分間放置して反応さ
せた後、実施例１と同様に蛍光強度の測定を行った。結
果を第１図に示す。尚、標識物質遊離率の表示は実施例
１にしたがった。

補体濃度の低いところで補体濃度に依存しない標識物質
のｍ、４１が見られ、実施例１で見られたような低濃度
から高濃度にかけての補体濃度に依存した標識物質の遊
離は認められなかった。

〔発明の効果〕

本発明によれば、＋！織動物質その内部に封入し補体活
性により膜…傷作用を受けるリポソームと補体を用い、
該リポソームに補体を作用させ、補体活性または抗原量
に応じて該リポソームから遊離した該標識物質を測定す
ることにより、被検試料中に存在する補体または抗原を
測定する免疫測定法において、該リポソームを含む塩類
溶液に補体系を活性化しない高分子物質を含有せしめる
ことにより、該リポソームや補体が保護、安定化され、
補体活性や抗原量に依存しない非特異的な標識物質の該
リポソームからの遊離や補体の早急な失活が防止され、
安定でかつ正確な補体または抗原の測定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１及び比較例１で測定したモルモット
補体濃度と標識物質遊離率との関係を示すグラフである
。 枯′３不簾崖 Ｓ　　　　＋。 （ＣＨＢｏ　／４ＩＱ　：］

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、標識物質をその内部に封入し補体活性により膜損傷
   作用を受けるリポソームと補体を用い、該リポソームに
   補体を作用させ、補体活性または抗原量に応じて該リポ
   ソームから遊離した該標識物質を測定することにより、
   被検試料中に存在する補体または抗原を測定する免疫測
   定法において、該リポソームを含む塩類溶液に補体系を
   活性化しない高分子物質を含有せしめることを特徴とす
   るリポソームを用いる免疫測定法。