JP2610783B2

JP2610783B2 - ポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子およびそれを含有するベクター

Info

Publication number: JP2610783B2
Application number: JP6188238A
Authority: JP
Inventors: ポール・ポーウェン・ハング; ナレンダー・クマール・カルヤン; ショウグァング・リン・リー
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1985-08-14
Filing date: 1994-08-10
Publication date: 1997-05-14
Anticipated expiration: 2012-05-14
Also published as: DK175420B1; GB2179948A; CA1341449C; PH26199A; DK385686A; JPS62104577A; GB2179948B; AU596369B2; DE3676760D1; AU6110286A; US4916071A; GB8619154D0; EP0213794A1; IL79644A; GR862076B; JPH0829086B2; DK385686D0; IL79644A0; JPH07147984A; PT83170A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組換えＤＮＡ技術によ
り産生される非相同のポリペプチドクリングル（Ｋring
le）を３個またはそれ以上含有するハイブリッド第三世
代プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子およ
びそれを含有するベクターに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】プラ
スミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンをプラス
ミンに変換するセリンプロテアーゼの一種である。プラ
スミンは、血餅のフィブリンマトリックスを分解し、こ
れにより内部の血管障害により血栓症または血栓塞栓症
が起こった後の開放性血管系の動的血液状態を抑制す
る。プラスミノーゲンを活性化因子で治療し得る部分的
または全体的な血管閉塞を含む血管系の症病には、発
作、肺動脈塞栓症、心筋梗塞症、ならびに深部静脈およ
び末梢動脈の閉塞が含まれる。

【０００３】ヒト血漿および他の体液において、２種の
免疫学的に異なるプラスミノーゲン活性化因子、すなわ
ち、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性化因子
（ｕ-ＰＡ；Ｍｒ＝５５,０００）および組織タイププラ
スミノーゲン活性化因子（ｔ-ＰＡ；Ｍｒ＝６８,００
０）が知られている。組織プラスミノーゲン活性化因子
の活性は、フィブリンにより増加する。該酵素は、血栓
の部位で作用し、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化
因子よりも、フィブリンに対して高い親和力を示す（ヘ
イレリス（Ｈaylaeris）ら，ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.）257巻，29
12頁（1982年）を参照）。従って、組織プラスミノーゲ
ン活性化因子は、生理学的に適切な血栓溶解剤と考えら
れる。

【０００４】２つの活性化因子、ｕ-ＰＡおよびｔ-ＰＡ
はともに以下の共通の特徴を有する：１）両者とも、プ
ラスミンまたはトリプシンにより、ジスルフィド結合し
た２つの鎖状分子構造を壊さずに開裂し得る一本鎖プロ
酵素として合成される。還元により、各プラスミノーゲ
ン活性化因子は、Ｈ鎖およびＬ鎖に分解する（ｕ-Ｐ
Ａ；Ｍｒ＝３３,０００，ｔ-ＰＡ；Ｍｒ＝３５,００
０）；２）２つの酵素は、ともに、フルオロリン酸ジイ
ソプロピルなどのセリン特異性試薬により不活化するこ
とができるセリンプロテアーゼである；３）２つの酵素
は、ともに、分子内にループまたはクリングルを形成す
る３つのジスルフィド結合したアミノ酸配列を有する。
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子は、１つのク
リングルを有する。組織プラスミノーゲン活性化因子
は、ヘキサペプチドリンカー配列により結合した２つの
クリングルを有する。これらのクリングルは、酵素をフ
ィブリンに結合させるものであると考えられる（トルセ
ン（Ｔhorsen），バイオヒミカ・バイオフィジカ・アク
タ（Ｂiochem.Ｂiophys.Ａcta.）393巻，55頁（1975
年）を参照）。

【０００５】ｔ-ＰＡのＤＮＡ配列分析およびアミノ酸
配列は、ペニカ（Ｐennica）ら，ネイチャー（Ｎatur
e）301巻，214頁（1983年）；ニー（Ｎy）ら，プロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓ
ci.ＵＳＡ）81巻，5388頁（1984年）およびジエネンテ
ク・インコーポレイテッド（Ｇenentech Ｉnc.）のヨー
ロッパ特許出願第９３６１９号により開示されている。
ｕ-ＰＡのＤＮＡ配列分析およびアミノ酸配列は、ジエ
ネンテク・インコーポレイテッドのヨーロッパ特許出願
第９２１８２号に開示され、ウロキナーゼｃＤＮＡは、
ベルデ（Ｖerde）ら，プロシーディングズ・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス
・エイ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）81巻，4727
頁（1984年）に開示されている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明に従って、非相同
なポリペプチドクリングルを３個またはそれ以上有する
ハイブリッド第三世代プラスミノーゲン活性化因子をコ
ードする遺伝子およびそのキー・フラグメント、完全ポ
リペプチドのＤＮＡ産生用発現ベクターおよびそのキー
・フラグメント、該発現ベクターで形質転換される微生
物またはセル培養物が提供される。本発明のポリペプチ
ドは、好ましくは、３〜６個のクリングルを有する。非
相同なクリングルなる語は、異なる自然発生源において
見出されるクリングルに対応する少なくとも１つのクリ
ングルまたは天然のプラスミノーゲン活性化因子におい
てみられるクリングルと共通の他のクリングル構造およ
びその他のクリングル構造を有するポリペプチドを意味
する。天然のプラスミノーゲン活性化因子に共通のクリ
ングル構造を付与して本発明のハイブリッドプラスミノ
ーゲン活性化因子を調製する場合、ＤＮＡが化学的に合
成され、該共通のクリングル産生のためのＤＮＡコドン
の使用は、所望のアミノ酸配列のクリングルを生成する
際の組換え（ループの開裂）を避けるための天然のプラ
スミノーゲン活性化因子のＤＮＡコーディング配列とは
異なるものであると考えられる。本発明のハイブリッド
プラスミノーゲン活性化因子において存在するクリング
ルは、別々に相同領域を有するが、非相同であり、その
結果、本発明のプラスミノーゲン活性化因子は、アミノ
酸配列、数および／または大きさのいずれかに関して、
天然のプラスミノーゲン活性化因子とはそのクリングル
構造が異なっている。

【０００７】クリングル構造は、３つのジスルフィド結
合により形成される３つのループになったポリペプチド
構造である。クリングルの長さは、アミノ酸基約７９〜
８２個である。ヒトウロキナーゼの単一のクリングル
（グンツラー（Ｇunzler）ら，ホッペ-セイラーズ・ツ
ァイトシュリフト・フュア・フィジオロジッシェ・ヒエ
ミー（Ｈoppe-Ｓeyler's Ｚ.Ｐhysiol.Ｃhem.）363巻，
1155頁（1982年）を参照）、ヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子の２つのクリングル（ペニカ（Ｐennica）
ら，ネイチャー（Ｎature）301巻，214頁（1983年）を
参照），ヒトプロトロンビンの２つのクリングル（ワル
ツ（Ｗalz）ら，プロシーディングズ・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エ
イ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）74巻，1969頁（1
977年）を参照）およびヒトプラスミノーゲンの５つの
クリングル（ソトラップ-ジェンセン（Ｓottrup-Ｊense
n）ら，プログレス・イン・ケミカル・フィブリノリシ
ス・アンド・スロンボリシス（Ｐrogress in Ｃemical
Ｆibrinolysis and Ｔhrombolysis），タビッドソン
（Ｄavidson）ら編，３巻，191頁（1978年）を参照）の
間に高度の配列相同がある。クリングル内のジスルフィ
ド架橋に含まれる６個のシステインの相対的な位置は、
全ての小環において同じである。本明細書において用い
る小環なる語は、前記タンパク質中にかかる構造を有す
るものを意味する。また、これらのタンパク質のクリン
グル部分における多形体は、天然に存在し、その場合、
１以上のアミノ酸が付加、欠失または置換されている。
近年の遺伝子の点変異テクノロジーの出現とともに、ま
たは所望の配列を有する遺伝子の化学的合成により、イ
ンビトロでタンパク質において同様の変化が起こり得
る。従って、これらの修飾された構造も、本発明で用い
るクリングルなる語は包含される。

【０００８】以下に、３クリングル（トリス-クリング
ル）プラスミノーゲン活性化因子およびテトラ-クリン
グルプラスミノーゲン活性化因子の調製を説明する。用
いた方法は、本発明の他のポリペプチドの調製に応用し
得る代表的なものである。

【０００９】本発明のトリス-クリングルプラスミノー
ゲン活性化因子により、ウロキナーゼおよびｔ-ＰＡク
ローンの適当な遺伝子コーディング配列から組換ＤＮＡ
技術により組立てられた場合、天然のプラスミノーゲン
活性化因子のいずれと比較しても、インビトロで安定性
が増大し、フィブリンに対する結合親和力が増大し、半
減期が向上する利点がある。トリス-クリングルプラス
ミノーゲン活性化因子のこれらの性質により、生物学的
有効性が改善され、保存性も改善される。トリス-クリ
ングル-ＰＡ分子は、天然のｔ-ＰＡよりも、調製および
精製の際に取扱いが容易である。これは、後者のポリペ
プチドが、培養液および種々の精製段階でみられる様
に、低分子量で、Ｈ鎖およびＬ鎖を含むためである。テ
トラ-クリングルプラスミノーゲン活性化因子および他
のポリ-クリングルプラスミノーゲン活性化因子もこれ
らの性質を有する。

【００１０】本発明のトリス-クリングルプラスミノー
ゲン活性化因子は、ウロキナーゼのＮ末端部分からその
１つのクリングル領域を、適当なリンカーを介して、２
つのクリングル領域の開始点またはそれ以前から始まる
ｔ-ＰＡのＮ末端部分と結合させることにより組立てら
れる。ウロキナーゼの１つのクリングルは、１３１位の
アミノ酸のグリシン残基の前にあることが知られてい
る。ｔ-ＰＡの２つのクリングルは、９１位のトレオニ
ン残基に続くシステインから始まることが知られてい
る。従って、１３１位のグリシン残基で終わるウロキナ
ーゼのＮ-末端部は、所望により、ｔ-ＰＡの２つのクリ
ングル間のヘキサペプチド結合を模倣する適当なリンカ
ーを介して、最初の９１Ｎ-末端アミノ酸が欠失したｔ-
ＰＡ分子と結合する。得られたハイブリッド分子は、ｔ
-ＰＡよりもアミノ酸残基４６個分大きく、用いたリン
カーにより異なるが、分子量約７３,０００のタンパク
質が得られる（ｔ-ＰＡは、６８,０００の分子量を有す
る）。同様に、ウロキナーゼの１つのクリングル（ＵＫ
Ｋａａ５０〜１３１）は、クリングルリンカーととも
に、アミノ酸９１〜９２または２６１〜２６２間のｔ-
ＰＡポリマーに挿入され、トリス-クリングルプラスミ
ノーゲン活性化因子産生用の２つの異なる遺伝子を得
る。同様に、また標準的技術により、適当なリンカーを
用いて、ｕ-ＰＡクリングルを、２つのｔ-ＰＡクリング
ル間に挿入してもよい。さらに、プロトロンビンまたは
プラスミノーゲンにみられるクリングルを、単離し、前
記ｔ-ＰＡのどの位置に挿入してもよい。本発明のいず
れのポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子の組立
ては、前記タンパク質から、１または２クリングル領域
を単離し、これをｔ-ＰＡ分子に挿入する同様の基本的
操作に従って行なう。

【００１１】ウロキナーゼのシングルクリングル部（Ｕ
ＫＫ）を、ｔ-ＰＡのダブルクリングル領域（ｔ-ＰＡ１
およびｔ-ＰＡ２）と結合させるのに用いるクリングル
リンカーは、６〜１０個の天然のアミノ酸を含有するポ
リペプチドである。好ましくは、クリングルリンカー
は、ｔ-ＰＡの２つのクリングル間に存在するものに似
た配置を保持するように選択される。好ましいリンカー
は、Ｌ-Ｓｅｒ-Ｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｕ-Ｌ-Ａｓｎ-Ｌ-Ｓｅｒ
-Ｌ-Ａｓｐである。これは、ｔ-ＰＡにおいてｔ-ＰＡ１
をｔ-ＰＡ２に結合するものと同等だからである。しか
し、ヘキサペプチドＬ-Ｔｈｒ-Ｌ-Ａｓｐ-Ｌ-Ａｌａ-Ｌ
-Ｇｌｕ-Ｌ-Ｔｈｒ-Ｌ-Ｇｌｕも用い得るヘキサペプチ
ドリンカーであり、Ｌ-Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌ-Ｓｅｒ、Ｌ
-Ｇｌｕ、Ｌ-ＴｈｒおよびＬ-Ａｓｐのいかなる組合せ
も、ヘキサペプチドリンカーのＮ-末端またはＣ-末端に
用いて、ｔ-ＰＡクリングルおよびＵＫクリングル間
に、ヘプタ-、オクタ-、ノナ-またはデカ-ペプチド結合
等の、より間隔の大きい構造を得る。他のリンカーは公
知である。簡便のために、以下、本明細書では、クリン
グルリンカーとして、前記の好ましいリンカーを用いた
場合について記載する。

【００１２】トリス-クリングルプラスミノーゲン活性
化因子は、選択された制限酵素を用いてウロキナーゼお
よびｔ-ＰＡコーディング配列を制限的に消化すること
により調製され、所望のｕ-ＰＡおよびｔ-ＰＡフラグメ
ントを得る。該フラグメントは、アガロースまたはアク
リルアミドゲル上で分別することにより単離し、結紮
し、適当なベクターまたはクローニングおよびその後の
発現用ベクターに導入される。

【００１３】以下、図面について、簡単に説明する。

【００１４】図１は、本発明の方法により調製される３
つのトリス-クリングルプラスミノーゲン活性化因子お
よび１つのテトラ-クリングルプラスミノーゲン活性化
因子の配列図である。構造式１（ａ〜ｃ）の太線部分
は、ウロキナーゼクリングル（ＵＫＫ）を含むウロキナ
ーゼ部分を示す。構造式１（ｄ）の太線部分は、プロト
ロンビン（ＰＴＫ１およびＰＴＫ２）のダブルクリング
ル領域を示す。略号ｔＰＫ１およびｔＰＫ２は、各々、
組織プラスミノーゲン活性化因子クリングル１および２
を示す。

【００１５】図２は、組織プラスミノーゲン活性化因子
組換体クローンｐＷＰ-４２の制限地図である。

【００１６】図３は、ｐＷＰ-４２からプラスミドｐｔ
ＰＢＭ-１を産生するのに用いる技術を示すフローチャ
ートである。ｐｔＰＢＭは、完全ｔ-ＰＡ分子を産生す
るのに必要な遺伝子情報を有する。

【００１７】図４は、プラスミドｐＵＫ-５３からプラ
スミドｐＵＫＢＭを産生するのに用いる技術を示すフロ
ーチャートである。ｐＵＫＢＭは、完全なウロキナーゼ
タンパク質を産生するのに必要な遺伝子情報を担持す
る。

【００１８】図５は、図１（ａ）に示すトリス−クリン
グルをコードする遺伝子を産生するのに用いる方法のフ
ローチャートである。

【００１９】図６は、ウロキナーゼのアミノ酸５１〜１
３１（ｕ-ＰＡ^51-131）をコードする遺伝子を産生する
のに用いる方法のフローチャートである。

【００２０】図７は、図１（ｂ）に示すトリス-クリン
グルをコードする遺伝子を産生するのに用いる方法のフ
ローチャートである。

【００２１】図８は、図１（ｃ）に示すトリス-クリン
グルをコードする遺伝子を産生するのに用いる方法のフ
ローチャートである。

【００２２】図９および図１０は、ウロキナーゼシグナ
ルペプチド領域（アミノ酸２０個）、ＵＫＫ領域（ウロ
キナーゼのアミノ酸１〜１３１個）、ヘキサペプチドリ
ンカーおよびｔ-ＰＡ分子の残りの部分（アミノ酸９２
〜５２７個）に関する図１（ａ）の生成物をコードする
遺伝子のＤＮＡ配列図である。

【００２３】図１１〜１３は、ｔ-ＰＡシグナルペプチ
ド（アミノ酸３５個）、ｔ-ＰＡのＮ-末端部（アミノ酸
１〜９１個）、ＵＫＫ（ウロキナーゼのアミノ酸５０〜
１３１個）、ヘキサペプチドリンカーおよびｔ-ＰＡの
Ｃ-末端部（アミノ酸９２〜５２７個）に関する図１
（ｂ）の生成物をコードする遺伝子のＤＮＡ配列図であ
る。

【００２４】図１４および図１６は、ｔ-ＰＡシグナル
ペプチド（アミノ酸３５個）、ｔ-ＰＡのＮ-末端部（ア
ミノ酸１〜２６１個）、ヘキサペプチドリンカー、ＵＫ
Ｋ（ウロキナーゼのアミノ酸５０〜１３１個）およびｔ
-ＰＡのＣ-末端部（アミノ酸２６２〜５２７個）に関し
て図１（ｃ）の生成物をコードする遺伝子のＤＮＡ配列
図である。

【００２５】図１７は、プロトロンビンのダブルクリン
グル領域をコードする遺伝子を産生するのに用いる方法
のフローチャートである。

【００２６】図１８は、図１（ｄ）に示すテトラクリン
グル生成物をコードする遺伝子を産生するのに用いる方
法のフローチャートである。

【００２７】図１９および２０は、哺乳動物細胞系Ｃ-
１２７（マウス）におけるプラスミノーゲン活性化因子
ハイブリッドＡ（図１（ａ）参照）およびハイブリッド
Ｂ（図１（ｂ）参照）遺伝子の発現用の、ＢＰＶ-Ｉを
基本とする発現ベクター系を示す制限地図である。発現
されるベクターを、マウスメタロチオネイン転写プロモ
ーターエレメントおよびＳＶ４０初期転写プロセッシン
グシグナル間に挿入する。

【００２８】図２１は、フィブリンアガープレート上で
ウエルあたり培地１０μｌを加え、ウエルのまわりに透
明な領域が現れるまで（２〜７列）３７℃にてインキュ
ベートすることによるＰＡ産生セルまたはフォーカスの
スクリーニングを示す図である。第１列は、標準的なｔ
-ＰＡを示す（上部から底部の酵素濃度（単位／ｍ
ｌ）：５００、２５０、１００、５０、２５、０）。

【００２９】図２２は、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡ
ＧＥ）中電気泳動によりハイブリッド-ＰＡを分離した
後のハイブリッドＢ、ハイブリッドＡおよび組織タイプ
プラスミノーゲン活性化因子のフィブリンアガープレー
ト上のザイモグラムである。

【００３０】図２３は、抗ｔ-ＰＡ抗血清でラジオ−パ
ルス処理した培地を免疫沈降し、次いで非還元性ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／ＰＡＧＥ上電気泳動した
後の³⁵Ｓで標識したプラスミノーゲン活性化因子、ハイ
ブリッドＡおよびハイブリッドＢのオートラジオグラム
である。分子量が公知のタンパク質マーカー（右列）を
同時に実験した。

【００３１】図２４は、ｔ-ＰＡおよびｕ-ＰＡ遺伝子か
らのＤＮＡフラグメントのサブクローニングに用いられ
るｐＵＣプラスミドの多重クローニングまたは制限サイ
トを示す配列図である。

【００３２】図２５は、ホスホトリエステラーゼ法によ
り、ｔ-ＰＡのアミノ酸９１（Ｔｈｒ）およびウロキナ
ーゼクリングルのアミノ酸５０（Ｃｙｓ）をコードする
２つの補助オリゴヌクレオチド配列を合成する際に用い
られるオリゴヌクレオチドリンカーの配列図である。

【００３３】方法および材料ａ）酵素反応：制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素は、ニュ
ー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッ
ド（Ｎew Ｅngland Ｂiolabs Ｉnc.Ｂeverly，ＭＡ）ま
たはインターナショナル・バイオテクノロジーズ・イン
コーポレイテッド（Ｉnternational Ｂio-technologies
Ｉnc.Ｎew Ｈeaven，ＣＴ.）より入手した。代表的な
制限酵素反応は、該酵素の販売者の推奨する方法に従っ
て、全容積５０μlで行なった。

【００３４】接着末端ＤＮＡの結紮反応は、代表的に
は、ＤＮＡ１００〜２００ｎｇおよびＴ４ＤＮＡリガー
ゼ４００単位（ニュー・イングランド・バイオラブズ）
を含有する緩衝溶液２０μｌ中１５℃にて一夜行なう。
平滑末端に関しては、前記反応混合物にＴ４ＲＮＡリガ
ーゼ４単位（ニュー・イングランド・バイオラブズ）を
加える（グッドマン，エイチ・エム（Ｇoodman，Ｈ.
Ｍ.）およびマクドナルド，アール・ジェイ（ＭacＤona
ld，Ｒ.Ｊ.），メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍ
ethod.Ｅnzymol.）68巻，75頁（1979年）を参照）。用
いる緩衝溶液は、０.５Ｍトリス^R・ＨＣｌ（ｐＨ７.
６）、０.１ＭＭｇＣｌ₂および０.１ＭＤＴＴ（ジチ
オトレイトール）の１０×保存溶液として調製する。

【００３５】ｂ）オリゴヌクレオチドの合成：本発明に
おいて記載したオリゴヌクレオチドは全て、ホスフオト
リエステル法（クレア（Ｃrea）ら，プロシーディング
ズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）75巻，5765頁（1
978年）を参照）により、ジーン・マシーン・モデル
（Ｇene Ｍachine Ｍodel）３８０Ａ（アプライド・バ
イオシステムズ・インコーポレイテッド（Ａpplied Ｂi
o-systems Ｉnc.)，Ｆoster city，ＣＡ）を用いて合成
した。結紮反応で用いる前に、オリゴマーを、ＤＮＡ２
００〜５００ｎｇ、Ｔ４ＤＮＡキナーゼ１０単位、０.
５ｍＭＡＴＰおよびキナーゼ緩衝液（０.０５Ｍトリス
・ＨＣｌ、ｐＨ７.６、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭ
ＤＴＴ）を含有する容積５０μｌ中で、５'末端をホス
ホリル化し、３７℃にて半時間インキュベートした。ハ
イブリッド化プローブとして用いるために、オリゴマー
を１００μＣｉ γ³²Ｐ-ＡＴＰ（５０００Ｃｉ／ミリモ
ル、アマーシャム（Ａmersham、Ａrlington Ｈeights、
II）で、マキサム，エイ・エム（Ｍaxam，Ａ.Ｍ.）およ
びギルバート，ダブリュー（Ｇilbert，Ｗ.），メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー（Ｍethod Ｅnzymol.）65
巻，499頁（1980年）を参照）の方法に従って放射線標
識した。

【００３６】ｃ）ＤＮＡフラグメントの単離：ＤＮＡフ
ラグメントをまず０.５〜１.５％アガロースゲルで電気
泳動により分離する。電気泳動は、約１００ボルトにて
２〜４時間、トリス-ホウ酸-ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液
（０.０８９Ｍトリス、０.０８９Ｍホウ酸、２ｍＭＥ
ＤＴＡ、ｐＨ８.０）中で行なう。０.５μｇ／ｍｌ臭化
エチジウム溶液中ゲルを着色することによりＵＶライト
下で視覚化する（シャープ（Ｓharp）ら、バイオケミス
トリー（Ｂiochem.）12巻，3055頁（1973年）を参
照）。ＤＮＡバンドを含有するアガロースをかみそりで
切除する。該ＤＮＡをゲルから電気溶出する（マニアテ
ィス（Ｍaniatis）ら，モレキュラ・クローニング，ア
・ラボラトリー・マニュアル（Ｍolecular Ｃloning, a
Ｌaboratory Ｍanual）164頁（1982年）を参照）。Ｄ
ＮＡをエリューチップ-ｄ（Ｅlutip-ｄ^R)カラムを通す
ことによりさらに調製する（シュライヒャー（Ｓchleic
her）およびシュル（Ｓhuell），Ｋeene，ＮＨ）。ＤＮ
Ａをエタノールで沈降させる。エッペンドルフ・マイク
ロヒュージ（Ｅppendorf Ｍicrofuge）で１５分間遠心
分離した後、ペレットを７０％エタノールで一度洗浄
し、真空下で乾燥し、脱イオン水５０μｌに溶かす。

【００３７】ｄ）ミニプラスミドＤＮＡ調製：適当な抗
生物質を含有するＬＢ（ルリア・ベルタニ）培地約２ｍ
ｌを、単一のバクテリアのコロニーとともにインキュベ
ートし、激しく振とうしながら３７℃にて一夜インキュ
ベートする。約１.５ｍｌの培地を用いて、前記マニア
ティスら、366頁により記載されている沸騰法によりプ
ラスミドＤＮＡを単離する。残りの培地を後で使用する
ために−２０℃にて１５％グリセロール中で保存する。
該ＤＮＡを１０μｇＲＮアーゼ／ｍｌを含有するＨ₂Ｏ
４０μｌに溶かす。一回の制限酵素分析に関しては約８
μｌで十分である。

【００３８】ｅ）プラスミドＤＮＡの大規模な調製：代
表的には、ＬＢ培地１リットルを単一のバクテリアのコ
ロニーとともにインキュベートする。クロラムフェニコ
ールでプラスミドＤＮＡを増幅した後、バクテリアセル
を回収し、沸騰法に従って、溶解する（ホームズ，ディ
ー・エス（Ｈolmes，Ｄ.Ｓ.）およびクイグレイ，エム
（Ｑuigley，Ｍ.），アナリティカル・バイオケミスト
リー（Ａnal.Ｂiochem.）114巻，193頁（1981年）を参
照）。塩化セシウム勾配遠心分離によるか、または、前
記マニアティスら、93〜96頁により記載の如く、セファ
ロース（Ｓepharose）４Ｂカラム（ファルマシア（Ｐha
rmacia，Ｃlppsala，Ｓweden））上のカラムクロマトグ
ラフィーによるかのいずれかにより、プラスミドＤＮＡ
をさらに精製する。培養液１リットルにつき約４００μ
ｇのＤＮＡを回収する。

【００３９】ｆ）ベクター：ｄＧ末端を有するｐＢＲ３
２２プラスミドＤＮＡ（ベゼスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ・インコーポレイテッド（Ｂethesda Ｒesearch
Ｌaboratories，Ｉnc.，Ｇaithersburg，ＭＤ））を用
いて、ｔ-ＰＡおよびｕ-ＰＡのｃＤＮＡをクローンす
る。ｐＢＲ３２２の詳細な分子構造は、前記マニアティ
スら、５および488頁により記載されている。組換体ｐ
ＢＲ３２２を用いた形質転換に用いるイー・コリ（Ｅ.c
oli）株は、ＨＢ１０１またはＭＭ２９４（前記マニア
ティスら、504頁を参照）のいずれかである。

【００４０】ｔ-ＰＡおよびｕ-ＰＡ遺伝子からのＤＮＡ
フラグメントのサブクローニングは全て、ｐＵＣプラス
ミド（ｌａｃＺおよびアンピシリナーゼ遺伝子を含有す
る一連のｐＢＲ３２２由来のベクター（ビーリア，ジェ
イ（Ｖieria，Ｊ.）およびメシング，ジェイ（Ｍessin
g，Ｊ.），ジーン（Ｇene）19巻，259頁（1982年）を参
照）中で行なう。さらに、該プラスミドはまた、図２４
に示す如く、ｌａｃＺに多重クローニングまたは制限サ
イトの配列を有する：

【００４１】IIサイトのいずれかのクローニングは、Ｘ
-ｇａｌ（５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルβ-Ｄ-ガ
ラクトシド）を含有する指示プレート上、青色のベクタ
ーコロニー中に白色の組換体コロニーが出現することに
よりモニターできる（ルサー（Ｒuther），モレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍol.Ｇen.
Ｇenetics）178巻，475頁（1980年）を参照）。組換体
ｐＵＣプラスミドを用いた形質転換に用いるイー・コリ
株はＪＭ１０３である。ｐＵＣプラスミドおよびイー・
コリＪＭ１０３は、ファルマシア・ピー・エル・バイオ
ケミカルズ（Ｐharmacia Ｐ-ＬＢiochemicals，Ｍilwa
ukee，ＷＩ)より入手した。

【００４２】ｇ）宿主／ベクター系１．微生物系本明細書において記載した操作は、微生物イー・コリｋ
-１２ＪＭ１０３株（ピー・エル・バイオケミカルズ
（ＰＬＢiochemicals））およびイー・コリｋ-１２Ｍ
Ｍ２９４株（ＡＴＣＣＮo.３３６２５）を用いて行な
った。この方法において用い得る他の微生物としては、
他の有用なイー・コリ株およびバチルス・サタイリス
（Ｂacillus subtilis）などのバチルス属が挙げられ
る。これらの微生物は、全て、非相同な遺伝子配列を複
製および発現し得るブラスミドを利用するものである。

【００４３】酵母における発現には、イー・コリおよび
／または酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓacchar
omyces cereviciae））における選択および複製可能な
プラスミドを用いる。酵母における選択に関しては、該
プラスミドは、トリプトファンについては原栄養性の形
質転換ｔｒｐ^-酵母株（ＲＨ２１８）を与えるＴＲＰ１
遺伝子を含有する。酵母発現ベクターは、酵母およびイ
ー・コリ間で往復できる。プラスミドは以下の成分を有
する：１）複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を
含有するＰＢＲ３２２由来のＤＮＡセグメント、２）酵
母ＴＲＰ１遺伝子、３）酵母において高い安定性でプラ
スミドを複製し得る酵母２μ ＤＮＡ、４）アルコール
デヒドロゲナーゼ、α因子、グリセルアルデヒド-３-ホ
スフェートデヒドロゲナーゼなどの酵母遺伝子由来のプ
ロモーター領域、５）発現系において適当な終止および
ｍＲＮＡのポリアデニル化に用いることができる翻訳開
始および転写終止配列。

【００４４】２．哺乳動物細胞培養物系複製および非相同なタンパク質産生用のベクターの発現
が可能な哺乳動物細胞系を本発明において用いる。これ
らは、例えば、Ｃｏｓ-７、ＷＩ３８、３Ｔ３、ＣＨ
Ｏ、ヒーラセルおよびＣ１２７セルである。用いるベク
ターは、１）ウイルス（ＳＶ４０、アデノ、ポリオー
マ、ＢＰＶ）または細胞染色体ＤＮＡ由来の複製開始
点；２）プロモーター；３）リボソーム結合サイトなど
の翻訳開始シグナル；４）ＲＮＡプロセッシングシグナ
ル（ＲＮＡスプライシング、ポリアデニル化および転写
終止配列）を含む。本明細書に示した発現ベクターの具
体例では、ＢＰＶウイルス複製開始点、マウスメタロチ
オネインプロモーターおよびＳＶ４０ＲＮＡプロセッシ
ングシグナルを用いる。該ベクターも、哺乳動物細胞培
養物およびイー・コリの両方で増殖可能である。これ
は、イー・コリアンピシリン耐性の選択マーカーおよび
ＤＮＡ複製のイー・コリ起源を提供するＰＢＲ３２２配
列の誘導体を含む。これらの配列は、プラスミドｐＭＬ
-２ｄ由来である。

【００４５】ＢａｍＨＩ接着末端を有する修正ハイブリ
ッドプラスミノーゲン活性化因子をまずプラスミド３４
１-３（ロー，エム・エフ（Ｌaw，Ｍ.Ｆ.）ら，メディ
カル・セル・バイオロジィ・アンド・ファンクション
（Ｍd.Ｃell.Ｂiol.Ｆ）３巻，2110頁（1983年）を参
照）のＢｇｌIIサイトで、マウスメタロチオネイン転写
プロモーター・エレメントおよびＳＶ４０初期転写プロ
セッシングシグナル間に挿入する。プラスミド１４２-
６（ＡＴＣＣＮo.３７１３４）をＢａｍＨＩで消化し
た後得られる完全ＢＰＶゲノムを非反復ＢａｍＨＩサイ
トと結紮する。プラスミド３４１-３もｐＭＬ２、ｐＢ
Ｒ３２２誘導体を含有し、これにより、バクテリアセル
におけるプラスミド複製が可能になる。本明細書におい
て組立てる発現プラスミドは、マウスＣ-１２７セルに
おいて排他的に染色体外エピソームとして複製し得る。
トランスフェクトしたセルは、形質転換した表現型に関
して選択され得る。より高度な発現レベルを得るために
エンハンサーエレメントを添加したり、遺伝子に薬剤耐
性（ネオマイシン耐性など）を挿入することなどによ
り、発現ベクターをさらに修飾することも可能である。

【００４６】トリス-クリングルプラスミノーゲン活性
化因子組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ-ＰＡ）メッセンジャーＲＮＡイソチオシアネート法（前記マニアティスら、196頁を
参照)により、あらかじめ内皮細胞成長因子（ＥＣＧ
Ｆ）およびヘパリンで刺激した正常ヒト繊維芽細胞（Ｗ
Ｉ-３８セル）からＲＮＡを単離し、ｔ-ＰＡを得る。同
じ刺激したセルからウロキナーゼを得る。オリゴ-デオ
キシチミジン（ｄＴ）-セルロースカラム上クロマトグ
ラフィーにより、ＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡ（ｍ
ＲＮＡ）を得る（アビブ（Ａviv）ら，プロシーディン
グズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ・ユー・エス・エイ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ
ＳＡ）69巻，1408頁（1972年）を参照）。１５〜３０％
スクロース濃度勾配中遠心分離によりｍＲＮＡをさらに
分別し、各ｍＲＮＡフラクションを³²Ｐプローブでハイ
ブリッド化する（後記参照）。ｔ-ＰＡ情報を有するフ
ラクション（約２０〜２４Ｓ)を相補ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）の調製において用いるためにためる。

【００４７】相補ＤＮＡ前節に記載した、ためておいたｍＲＮＡ５μｇを用いて
二本鎖ｃＤＮＡを得、該ｃＤＮＡを末端ヌクレオチドト
ランスフェラーゼを用いて、ポリデオキシシチジレート
（ｐｏｌｙｄＣ）でホモポリマー末端にする。生成物
を、ＰｓｔＩ消化ポリデオキシグアニシート（ｐｏｌｙ
ｄＧ）末端ｐＢＲ３２２でアニールする。アニールし
たＤＮＡを用いて、コンピテント・イー・コリ２９４セ
ルを形質転換し、該セルを培養して、約１０⁵のバクテ
リアクローンを得る（前記マニアティスら、229頁を参
照）。

【００４８】ｔ-ＰＡクローンのスクリーニングおよび
同定以下に示す３つのオリゴヌクレオチドを、³²Ｐ-ＡＴＰ
で放射線標識した後用いて、組換体クローンのライブラ
リーをスクリーンする。これらのオリゴマーは、以下の
アミノ酸配列に対応する：

【００４９】ｔ-ＰＡ分子の３４〜３９（１７ｍｅr）、
２５３〜２５８（１８ｍｅｒ）および５２３〜５２７
（１５ｍｅｒ）（ペニカ，ディー（Ｐennica，Ｄ.）
ら，ネイチャー（Ｎature）301巻，214頁（1983年）を
参照）５'-ＣＣＡＣＴＧＴＴＧＣＡＣＣ-ＡＧＣＡ-
３'；１８ｍｅｒ：５'-ＣＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴ
ＣＣＣＡ-３'；１５ｍｅｒ：５'-ＣＧＧＴＣＧＣＡＴＧ
ＴＴＧＴＣ-３'。約２０コロニーが、ためておいたプロ
ーブに関して、中程度〜強度のホモロジーを示した。こ
れらのコロニーを再びプレーティングし、再びハイブリ
ッド形成して正のシグナルを有する１６のクローンを得
る。これらのクローンから調製したプラスミドＤＮＡを
ニトロセルロース濾紙上にしみこませ、各プローブでハ
イブリッド形成する。２つのクローン（４２および６２
ａ）は、中間（１８ｍｅｒ）および３'末端（１５ｍｅ
ｒ）プローブの両者とハイブリッド形成する。プラスミ
ドＤＮＡをＰｓｔＩを用いて酵素で消化すると、クロー
ンＮｏ.４２は、１.１、０.６および０.４Ｋｂの３つの
フラグメントの形態で、２キロベース（Ｋｂ）より大き
い最大の挿入部を有することが示される。該クローン
（ｐＷＰ４２）の完全な制限地図を図２に示す。このク
ローンは、５'-および３'-未翻訳領域を含む２６００ｂ
ｐを有するｔ-ＰＡ遺伝子に関する完全な長さの配列を
有する。

【００５０】ｔ-ＰＡ遺伝子の編整約１０μｇのｐＷＰ４２プラスミドＤＮＡを９単位のＸ
ｈｏIIで、３７℃にて２時間消化する。反応混合物を調
製用１.２％アガロースゲルに付し、アガロースゲル中
電気泳動により、１６１８ｂｐＤＮＡフラグメントを単
離する。接着末端をイー・コリポリメラーゼ１（クレノ
ウ・フラグメント（Ｋlenow fragment））およびｄＮＴ
Ｐ（４種のデオキシヌクレオチド三燐酸：ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）でうめた後、このよ
うにして修飾したＤＮＡを、ホスホリル化ＳａｌＩリン
カー３００ｎｇで一夜結紮する。フェノール／クロロホ
ルム抽出およびエタノール沈降の後、ＤＮＡをＳａｌＩ
５０Ｕで１時間消化し、反応混合物を調製用１％アガ
ロースゲルに付して、所望のＤＮＡフラグメントを単離
する。

【００５１】ＳａｌＩ末端を有するＤＮＡを、ＳａｌＩ
切断ｐＵＣ１３と結紮し、イー・コリＪＭ１０３セルを
形質転換するのに用い、該セルを、アンピシリンおよび
Ｘ-ｇａｌプレートに移す。８つのアンピシリン耐性の
白色コロニーを選択し、増殖させて、ミニプラスミド調
製物を得る。２つのクローン（ｐｔＰＳ３４Ｂおよびｐ
ｔＰＳ３９）が、所望のＤＮＡフラグメントを含有する
ことが判明した。ＢａｍＨＩおよびＮａｒＩで完全に消
化したｐｔＰＳ３９プラスミドＤＮＡ１０μｇを調製的
アガロースゲルに付し、ｔ-ＰＡのＣ-末端をコードする
１２８８ｂｐフラグメントを得る。

【００５２】ｔ-ＰＡ遺伝子の５'末端は、ｐＷＰ４２
１０μｇをＨｇａＩ４単位で３７℃にて８時間消化す
ることにより得られる。５１５ｂｐフラグメントを、１
％アガロースゲル中電気泳動により単離する。ＤＮＡフ
ラグメントの接着末端をＤＮＡポリメラーゼ１（クレノ
ウフラグメント）およびｄＮＴＰでうめ、生成物をＳｍ
ａＩ切断ｐＵＣ１３と結紮する。イー・コリＪＭ１０３
セルを形質転換した後、約７５のアンピシリン耐性白色
コロニーを得る。これらのうち２４コロニーを増殖し
て、ミニプラスミド調製物を得る。該ミニプラスミド調
製物をＮａｒＩで消化すると、１７クローンがいずれか
の順序で所望の挿入部を有することが判明した。１つの
クローン（ｐｔＰＨｇａ４）を、アンピシリンを含有
するＬＢ培地１.０リットル中で増殖させ、沸騰法を用
いて、多量のプラスミドＤＮＡを得る。該プラスミドＤ
ＮＡ（ｐｔＰＨｇａ４）をＢａｍＨＩおよびＮａｒＩ
で消化し、１.２％アガロースゲル上で電気泳動に付し
て、ｔ-ＰＡのＮ-末端をコードする４３４ｂｐＤＮＡフ
ラグメントを単離する。

【００５３】１２８８ｂｐＤＮＡ３００ｎｇおよび４
３４ｂｐＤＮＡ１００ｎｇを一夜結紮して１７２２ｂ
ｐＤＮＡフラグメントを得る。このＤＮＡを、Ｂａｍ
ＨＩ切断ｐＵＣ１３と結紮した後、イー・コリＪＭ１０
３セルを形質転換するのに用いる。１０００以上のアン
ピシリン耐性コロニーを得る。沸騰法により、１２コロ
ニーからプラスミドＤＮＡを調製する。プラスミドＤＮ
Ａを、ＢａｍＨＩ、ＮａｒＩおよびＸｈｏIIの各々で切
断することにより同定する。得られたプラスミドは全て
所望の１７２２ｂｐＤＮＡフラグメントを含有するこ
とが判明した。１つのプラスミド（ｐｔＰＢＭＩ）
を、大規模なプラスミドＤＮＡ調製に用いる。このプラ
スミドは、ＢａｍＨＩで切断した場合、完全なｔ-ＰＡ
分子をコードする１７２２ｂｐＤＮＡを生成する。ｐ
ｔＰＢＭ１クローン制限地図およびその調製法のフロ
ーチャートを図３に示す。

【００５４】ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子
（ｕ-ＰＡ）ｕ-ＰＡクローンのスクリーニングおよび同定前記のｔ-ＰＡ遺伝子を生成する１０⁵組換体バクテリア
クローンのライブラリーを、グルンシュタイン（Ｇruns
tein）ら，プロシーディングズ・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓ
ci.ＵＳＡ）72巻，3961頁（1975年）の方法により、放
射線標識した１８ｍｅｒプローブでスクリーンする。ジ
ーン・マシーン（Ｇene Ｍachine）（アプライド・バイ
オシステムズ（Ａpplied Ｂiosystems））を用いて標準
的ホスホトリエステル法により合成したプローブから、
ウロキナーゼ遺伝子（ａａ^173-179）の中間部に対応す
るオリゴマー配列５'-ＧＴＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＡＡＡ
ＣＣＡ-３'が得られる。約１３クローンが、中程度〜強
度のハイブリッド形成シグナルを示した。これらのクロ
ーンを、テトラサイクリンを含有するＬＢ培地２ｍｌ中
で増殖させ、ミニプラスミド調製物を得る。該ミニプラ
スミド調製物を１０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼを含有する
Ｈ₂Ｏ４０μｌに溶かす。このようにして得られたＤＮ
Ａ約８μｌをＰｓｔＩ１単位で消化し、生成物を１％
アガロースゲル上電気泳動により分離する。１つのクロ
ーン（ｐＵＫ５３）は、１.２、０.４および０.１Ｋｂ
の長さの３つのフラグメントの形態で１.７ｋｂの最大
の挿入部を有することが判明した。ウロキナーゼの完全
な３'-末端ヌクレオチド配列からＰｓｔＩ切断１.２Ｋ
ｂＤＮＡフラグメントを得る。マキサム（Ｍaxam）お
よびギルバート（Ｇilbert）法、メソッズ・イン・エン
ザイモロジー（Ｍethods Ｅnzymol.）65巻，1499頁（19
80年）によるヌクレオチド配列決定により、遺伝子の
５'-末端配列は、ウロキナーゼタンパク質のシグナルペ
プチドコーディング領域のはじめの１０アミノ酸に対応
する約３０ヌクレオチドが欠失していることが判明し
た。従って、欠失したヌクレオチドに対応する二重鎖Ｄ
ＮＡ配列を合成し、存在する遺伝子と結紮する。

【００５５】ウロキナーゼ遺伝子の編整ウロキナーゼプラスミド（ｐＵＫ５３）ＤＮＡをＮｃｏ
ＩおよびＭｓｔIIで切断し、生成物を１％アガロースゲ
ル上電気泳動により分離する。１１９８ｂｐのＤＮＡフ
ラグメントを電気溶出により単離する。ＮｃｏＩ切断片
に対応するＤＮＡフラグメントの突出した５'-末端を、
ｄＮＴＰおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼ（クレノ
ウ・フラグメント）でうめることにより平滑末端にす
る。ＤＮＡを次いでＳｍａＩ切断ｐＵＣ１３と結紮し、
この修正したプラスミドを用いてコンピテントイー・コ
リＪＭ１０３セルを形質転換する。ＤＮＡをｐＵＣ１３
のＳｍａＩサイトと結紮すると、挿入部のＮｃｏＩサイ
トが再生する。該セルをアンピシリンおよびＸ-ｇａｌ
プレートに移し、白色コロニーからミニプラスミド調製
物を得る。該ミニプラスミドＤＮＡ調製物をＮｃｏＩお
よびＳａｌＩで消化して、約１２００ｂｐのＤＮＡフラ
グメントを得る。陽性クローン由来の大規模なプラスミ
ドＤＮＡ調製物（ｐＵＫＮＭ-３'）を調製し、ＮｃｏＩ
およびＳａｌＩで消化して、多量の約１２００ｂｐのＤ
ＮＡフラグメントを得、これを調製用アガロースゲル電
気泳動により分離する。

【００５６】ウロキナーゼタンパク質の５'シグナルペ
プチドコーディング領域の最初の１０のアミノ酸に対応
する約３０ヌクレオチドを得るために、ｐＵＫ５３プラ
スミドＤＮＡをまずＰｓｔＩで消化して、４００ｂｐの
ＤＮＡフラグメントを単離する。このＤＮＡを次いでＳ
ｃｒＦＩで処理して、ＤＮＡの２４２ｂｐフラグメント
を得る。ＤＮＡの突出した末端を、ｄＮＴＰおよびイー
・コリＤＮＡポリメラーゼ１（クレノウ・フラグメン
ト）でうめる。

【００５７】３２および４２塩基の長さの２つの相補オ
リゴヌクレオチド配列をジーン・マシーンで合成し、ア
ミノ酸が欠失し（−９〜−２０）、かつ適当な翻訳解読
フレームを保持し、ＳａｌＩ切断ｐＵＣ１３におけるサ
ブクローニングのためにＤＮＡの両端にＳａｌＩ配列を
付与する。２つのオリゴマーを等モル量のリガーゼ緩衝
液（５０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７.６、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオトレイトール）中で混合
し、５分間８０℃に加熱し、約１時間室温に冷却する。
このようにして形成した２つの相補ヌクレオチド配列の
二重鎖（約１μｇ）をＴ４ＤＮＡリガーゼ４００単位を
用いて、リガーゼ緩衝液中４℃にて１６時間２４２ｂｐ
ＤＮＡフラグメント約３００ｎｇと結紮する。結紮混
合物を１.２％アガロースゲル上電気泳動により分離
し、電気溶出により約３２０ｂｐＤＮＡフラグメント
を単離する。このフラグメント約２０ｎｇをＳａｌＩ切
断ｐＵＣ１３１００ｎｇと結紮し、該ベクターを用い
てコンピテントイー・コリＪＭ１０３セルを形質転換す
る。該セルを、アンピシリンＸ-ｇａｌプレートに移
す。１２個の白色コロニーを選択し、増殖させて、ミニ
プラスミド調製物を得る。該ミニプラスミド調製物をＳ
ａｌＩで切断する。所望の３２０ｂｐＤＮＡ挿入部を
有するクローンを、大規模なプラスミドＤＮＡ調製のた
めに増殖させる。該ＤＮＡをＳａｌＩおよびＮｃｏＩで
切断して、調製用アガロースゲル電気泳動に付して、２
６０ｂｐＤＮＡフラグメントを得る。

【００５８】２６０ｂｐＤＮＡおよび遺伝子の３３３
ｂｐに共通のＮｃｏＩ制限部位を含有する１２００ｂｐ
ＤＮＡを等モル量混合して結紮する。結紮生成物をＳ
ａｌＩで切断し、反応混合物をプレパラテイブ１％アガ
ロースゲル電気泳動で分離する。１４６０ｂｐＤＮＡ
フラグメントを電気溶出により単離する。このＤＮＡを
ＳａｌＩ切断ｐＵＣ１３と結紮し、このプラスミドを、
アンピシリンおよびＸ-ｇａｌプレート上で増殖したコ
ンピテントイー・コリＪＭ１０３の形質転換に用いる。
１２個の白色コロニーを選択し、増殖させてボイリング
法によりミニプラスミド調製物を得る。このミニプラス
ミド調製物をＳａｌＩで切断し、１つのクローン（ｐＵ
ＫＢＭ）が所望の１４６０ｂｐＤＮＡインサートを含
有していることを見出した。該合成リンカーを含有する
５'端からのオリゴヌクレオチド配列をマキシマ-ギルバ
ート法により配列づけして、この確認を行なう。

【００５９】ｐＵＫＢＭプラスミド中のＤＮＡインサー
トは、これにより、翻訳開始コドンＡＵＧ（ｍｅｔ，リ
ーダー配列中、−２０ａａ）ならびに終止コドンＴＧＡ
を含有することが証明された。この完全遺伝子はシグナ
ルペプチドの２０個のアミノ酸（−１〜−２０）および
成熟したウロキナーゼ蛋白の４１１個のアミノ酸をコー
ドする。

【００６０】実施例１（ＵＫａａ^1-131-Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-Ｓｅｒ
-Ａｓｐ）^1-91ｔ-ＰＡ図１に示す物質（ａ）において、
シグナルペプチド（ａａ（アミノ酸）−３５〜−１）を
含有するｔ-ＰＡ配列およびＮ-末端ペプチド（ａａ１〜
９０）域はシグナルペプチド（ａａ−２０〜−１）およ
びウロキナーゼの最初の１３１個のアミノ酸を含有する
アミノ酸配列で置換されている。u-ＰＡ配列は、ヘキサ
ペプチド、Ｌ-Ｓｅｒ-Ｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｌ-Ａｓｎ-Ｌ-
Ｓｅｒ-Ｌ-Ａｓｐをコードするオリゴヌクレオチド配列
を介してｔ-ＰＡの最初のクリングル（ｔ-ＰＫ１）と連
結している。

【００６１】プラスミドｐＵＫＢＭの約１０μｇを標準
的条件下、ＥｃｏＲＩおよびＭｓｔＩで消化する。反応
混合物を１.２％アガロースゲルを通し、１５０ボルト
で３時間電気泳動させる。ゲルを臭化エチジウムで染色
してＤＮＡバンドを可視化した後、４５２ｂｐＤＮＡ
フラグメントを単離し、精製する。このＤＮＡフラグメ
ントは、リーダーまたはシグナルペプチド（２０個のア
ミノ酸）およびウロキナーゼ遺伝子のＮ-末端およびク
リングル域（ａａ１〜１３１）についてのコード情報を
含有している。

【００６２】ｔ-ＰＡ-デスａａ１〜９１配列を得るた
め、約１０μｇの組換体プラスミドｐｔＰＢＭ-１をＡ
ｖａIIで消化して仕上げ、１.２％アガロースゲル上で
電気泳動に付して７４７ｂｐＤＮＡフラグメントを単
離する。このフラグメントにオリゴマーリンカーを加
え、ついで、ＥｃｏＲＩで消化して、実施例２に記載
し、図７に示した３５４ｂｐＤＮＡフラグメントを得
る。この３５４ｂｐＤＮＡはヘキサペプチドリンカー
およびｔ-ＰＡペプチド（ａａ９２〜２０４）の１１８
個のアミノ酸配列をコードする。前記で得られた４５２
ｂｐＤＮＡフラグメントとこの３５４ｂｐＤＮＡフラ
グメントの等モル量をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い、１５
℃で１６時間結紮する。反応混合物を１.２％アガロー
スゲル上で電気泳動により分離し、８０６ｂｐのサイズ
に対応するＤＮＡバンドを溶出させ、精製する。８０６
ｂｐＤＮＡフラグメントの約１００ｎｇを、約２０μ
ｌの反応容量中、ＢＡＰ（細菌性アルカリホスファター
ゼ）処理ＥｃｏＲＩｐＵＣ１３（ファルマシア・ピー
・エル・バイオケミカルス・インコーポレーテッド、米
国ウイスコンシン州、ミルウォーキー）約３００ｎｇで
結紮する。この溶液の約１／４を、ジェイ・ビエラ
（Ｊ.Ｖiera）およびジェイ・メッシング（Ｊ．Ｍessin
g），ジーン（Ｇene）19巻，259頁（1982年）の方法に
従い、コンピテントイー・コリＪＭ１０３セルの形質転
換に用いる。１２個の組換体白色コロニーから調製した
ミニプラスミドＤＮＡを標準条件下、ＥｃｏＲＩで消化
する。必要なインサートを含有する１つのクローン、ｐ
ｔＰＵＫ-８０６をＢａｍＨＩおよびＮａｒＩで消化
し、１.２％アガロースゲル上で電気泳動により分離す
る。５１９ｂｐフラグメントに対応するＤＮＡバンドを
切断し、溶出し、精製する。同じ操作により、ＢａｍＨ
ＩおよびＮａｒＩでｐｔＰＢＭ-１を消化して１３００
ｂｐＤＮＡフラグメントを得る。５１９ｂｐと１３０
０ｂｐのＤＮＡフラグメントの等モル量を、グッドマ
ン，エイチ・エム（Ｇoodman，Ｈ.Ｍ.）およびマクドナ
ルド，アール・ジェイ（ＭacＤonald，Ｒ.Ｊ.），メソ
ッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍethod.Ｅnzymol）68
巻，75頁（1979年）の標準的な方法に従って結紮する。
結紮混合物をフェノール：クロロホルム（１：１）混液
で２回抽出し、２容の無水エタノールでＤＮＡを沈澱さ
せる。ペレットを水５０μｌに溶解した後、ＤＮＡを標
準検定条件下、ＢａｍＨＩで消化し、１％アガロースゲ
ル上で電気泳動に付して分離する。１８１９ｂｐを含有
するＤＮＡフラグメントを切断し、ゲルから溶出させ、
精製する。このＤＮＡフラグメントはシグナルペプチド
（２０アミノ酸）および図１（ａ）に示した（ＵＫａａ
^1-131-Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ）
^1-91-ｔ-ＰＡに対応する５７３個のアミノ酸の成熟ハイ
ブリッドまたはトリス-クリングルＰＡ分子についての
必要な全てのコード情報を含んでいる。

【００６３】ついで、このトリス-クリングル遺伝子
を、完全表現ベクターとして役立つ、ＢｇｌII切断表現
ベクター、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）に結紮する。
通常の培養により、図１（ａ）のトリス-クリングルプ
ラスミノーゲン活性化因子を得る。

【００６４】ウロキナーゼクリングル配列の組立実施例２および３において、ウロキナーゼのクリングル
部分（ａａ５０〜１３１）のみを利用し、ｔ-ＰＡの二
重クリングル域の前または後に挿入する。図６は組換体
プラスミドｐＵＫ５３からａａ５１〜１３１をコードす
るヌクレオチド配列の組立を示す。アミノ酸１３１に対
応するヌクレオチド鎖の直後に都合よい制限部位Ｍｓｔ
Ｉがある。しかし、ａａ５０付近には何もない。かくし
て、ａａ５０付近に制限部位を作る（この例ではＮｄｅ
Ｉ）チャートを図６に示す。ウロキナーゼのクリングル
域はｂｐ２８４（ａａ５０）〜ｂｐ５３０（ａａ１３
１）のヌクレオチド配列に対応する。

【００６５】約１０μｇのｐＵＫ５３プラスミドＤＮＡ
を、ウロキナーゼ配列におけるｂｐ２０４を切断するＳ
ｃａＩで消化する。フェノール抽出およびエタノール沈
澱の後、ＤＮＡペレットを緩衝液（１０ｍＭＣａＣ
l₂、１２ｍＭＭｇＣｌ₂、０.２ＭＮａＣｌ、２０ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭＥＤＴＡ）５０μ
ｌ中に溶解する。反応混合物にヌクレアーゼＢａｌ３
１１μｌ（２単位）を加え、混合物を３０℃で１５秒間
インキュベートする(レガースキイ，アール・ジェイ
（Ｌegerski，Ｒ.Ｊ.）、ジェイ・エル・ホドネット
（Ｊ.Ｌ.Ｈodnett）、エイチ・ビイ・グレイ・ジュニア
（Ｈ.Ｂ.Ｇray，Ｊr.）、ニュークレイック・アシド・
リサーチ(Ｎucleic Ａcid Ｒes.）５巻，145頁，1978
年）。０.４ＭＥＧＴＡ５μｌを添加して反応を停止さ
せる。この反応時間は、ＤＮＡフラグメントの各端から
約８０ｂｐを除去するのに充分であることが判明した。
フェノール抽出およびエタノール沈澱後、標準的反応条
件下、ＤＮＡをオリゴヌクレオチド・リンカー（１０ｂ
ｐ）に結紮する。配列ＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡを有するオ
リゴマーリンカー（ＥｃｏＲＩ／ＮｄｅＩリンカー）
を、配列ＴＡＴＧ（ａａ５１に対応）を含有するＤＮＡ
フラグメント端と結紮させてＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴ
Ｇ）を作り出す。さらに、リンカー中に制限部位Ｅｃｏ
ＲＩを作り、ｐＵＣ１３ベクター中でクローンする。フ
ェノール抽出、エタノール沈澱後、ＤＮＡをＥｃｏＲＩ
で消化し、１％プレパラテイブ・アガロース・ゲル上で
電気泳動によって分離する。３４０ｂｐに対応するＤＮ
Ａバンドを切断し、溶出し、エタノール沈澱を行なう。
このＤＮＡ約４０ｎｇをＥｃｏＲＩの切断ｐＵＣ１３ベ
クターＤＮＡ約０.４μｇと結紮し、コンピテントイー
・コリＪＭ１０３セルの形質転換に用いる（マニアティ
ス（Ｍaniatis），前出，250頁）。１０平板から約１０
００個の組換体コロニーを得る。細菌コロニーをニトロ
セルロース紙上でレプリカ-プレーティングし、放射性
オリゴヌクレオチドプローブを用いる特定部間ハイブリ
ッド形成によりスクリーニングする（グランスタイン
（Ｇrunstein）ら，プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・
エイ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）72巻，3961
頁，1975年）。用いたオリゴヌクレオチドプローブは１
８ｂｐの長さで（ＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＧＧＧＡＡＴ
Ｇ）、ＥｃｏＲＩ／ＮｄｅＩリンカーからの最初の５個
のヌクレオチドおよびａａ５１〜５４に対応するウロキ
ナーゼ配列からのつぎの１３個の塩基を含有する。約１
２のクローンがＸ線フイルム上に中程度〜強いシグナル
を示した。これらの１２クローンから調製したミニプラ
スミドＤＮＡをＮｄｅＩで消化し、１％アガロースゲル
上の電気泳動で分離する。１つのクローン、ｐＵＫＫＮ
ｄ１６は新たに生じたＮｄｅＩ部位を有することが判明
した。このプラスミドＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＭｓｔ
Ｉで消化後、１.４％アガロースゲル上の電気泳動によ
り分離し、２４６ｂｐのＤＮＡフラグメントを得る。こ
のＤＮＡフラグメントはａａ５１〜１３１をコードする
ウロキナーゼヌクレオチド配列を含有する。欠損アミノ
酸５０（Ｃｙｓ）についてのＤＮＡ配列を図７および図
８に示すごとくオリゴマーリンカーに組み込む。

【００６６】実施例２９１-（ＵＫａａ^50-131-Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-
Ｓｅｒ-Ａｓｐ）-９２-ｔ-ＰＡ図１（ｂ）に示したウロキナーゼクリングル配列をｔ-
ＰＡの二重クリングル領域の前、すなわち、アミノ酸９
１および９２の間に挿入する。前記のごとく、ｐＵＫＫ
Ｎｄ１６プラスミドＤＮＡのＮｄｅＩおよびＭｓｔＩ消
化により、ウロキナーゼのａａ５１〜１３１に対応する
２４６ｂｐ配列を作成する。ＵＫクリングル配列（２４
６ｂｐ）の２つの端を、２つのオリゴヌクレオチドリン
カーを用い、ヌクレオチドＮo.４６２（ａａ９１）およ
び４６３（ａａ９２）の間でｔ-ＰＡ遺伝子に挿入す
る。用いた操作を図７に示す。

【００６７】ｐｔＰＢＭ-１プラスミドＤＮＡ約５０μ
ｇをＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲル中での電
気泳動で７４０ｂｐＤＮＡフラグメントを単離する。
このＤＮＡをＳａｕ９６１（ＡｓｕＩのイソスキゾマ
ー）で部分的に消化し、３８５ｂｐＤＮＡフラグメン
トを単離、精製する。

【００６８】ホスホトリエステラーゼ法（クレア（Ｃre
a）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐro
c.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）75巻，5765頁，1978年）
により、ｔ-ＰＡのアミノ酸９１（Ｔｈｒ）およびウロ
キナーゼクリングルのアミノ酸５０（Ｃｙｓ）をコード
する２つの補助オリゴヌクレオチド配列を合成する。

【００６９】図２５に示すオリゴヌクレオチドリンカー
は、ＡｓｕＩおよびＮｄｅＩ制限部位によりフランキン
グされる。上流のオリゴヌクレオチド（ＧＧＣＣＡＣＣ
ＴＧＣ）のみがその５'端でホスホリル化される。

【００７０】３８５ｂｐＤＮＡフラグメント約１μｇ
をオリゴマーリンカー約１μｇと一夜結紮する。フェノ
ール抽出およびエタノール沈澱後、ＤＮＡをＥｃｏＲＩ
で２時間消化し、１.２％アガロースゲル上で電気泳動
により分離して３９４ｂｐＤＮＡフラグメントを得
る。このＤＮＡフラグメントはシグナルペプチド（３５
ａａ）およびｔ-ＰＡのＮ末端ペプチドアミノ酸１〜９
１をコードするヌクレオチド配列を含有する。さらに、
ＤＮＡフラグメントはその２４６ｂｐＤＮＡフラグメ
ント中には存在しないＵＫクリングルのアミノ酸５０
（Ｃys）についてのＤＮＡ配列を復元する。

【００７１】ｔ-ＰＡ配列のＣ-末端、アミノ酸９２以前
を得るため、ｐｔＰＢＭ-１プラスミドＤＮＡ約５０μ
ｇをＡｖａIIで消化し、１％アガロースゲルから７４７
ｂｐＤＮＡフラグメントを単離する。ホスホトリエステ
ル法により、２７ｂｐおよび３０ｂｐの長さの２つの補
助ＤＮＡフラグメントを合成する。図７に示すごとく、
このＤＮＡリンカーはヘキサペプチドＳｅｒ-Ｇｌｕ-Ｇ
ｌｙ-Ａｓｎ-Ｓｅｒ-Ａｓｐをコードし、また、ＡｖａI
I切断７４７ｂｐＤＮＡにおける欠損アミノ酸９２〜９
４（Ｃｙｓ-Ｔｙｒ-Ｇｌｕ）を復元する。低級オリゴマ
ー（３０ｍｅｒ）のみがその５'端でホスホリル化され
る。７４７ｂｐＤＮＡ約１μｇおよびオリゴマーリン
カー１μｇを一夜１５℃で結紮する。フェノール抽出お
よびエタノール沈澱の後、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで２時間
消化して、１.４％アガロースゲルから３５４ｂｐＤＮ
Ａフラグメントを得る。３つのＤＮＡフラグメント、３
９４ｂｐ、２４６ｂｐ（ＵＫクリングル）および３５４
ｂｐ各々約５００ｎｇを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い一
夜結紮する。フェノール抽出およびエタノール沈澱後、
ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲルから
９９４ｂｐＤＮＡフラグメントを単離、精製する。等
モル量のＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ１３ベクターと結紮後、
このＤＮＡを用いてコンピテントイー・コリＪＭ１０３
セルを形質転換する。１２の組換体クローンからのミニ
プラスミド調製物をＥｃｏＲＩで消化する。所望の９９
４ｂｐインサートを含有する１つのクローンを１リット
ルのＬＢ培地中で増殖させてプラスミドＤＮＡの大規模
調製を行なう。このプラスミドＤＮＡ約１０μｇをＢａ
ｍＨＩおよびＮａｒＩで消化し、７００ｂｐサイズに対
応するＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲルから精
製する。

【００７２】ｐｔＰＢＭ-１プラスミドＤＮＡをＢａｍ
ＨＩおよびＮａｒＩ約１０μｇで消化してｔ-ＰＡ遺伝
子の３'末端を得る。反応混合物を１％アガロースゲル
上の電気泳動で分離した後、電気溶出で約１３００ｂｐ
ＤＮＡフラグメントを単離し、精製する。

【００７３】ほぼ等モル量の２つのＤＮＡフラグメン
ト、７００ｂｐおよび１３００ｂｐを一夜結紮し、１％
アガロースゲルから２０００ｂｐＤＮＡフラグメント
を回収する。制限酵素ＢａｍＨＩ配列でフランキングし
たＤＮＡをＢＰＶ表現ベクターのＢｇｌII部位に挿入す
る。このＤＮＡは合計６５０のアミノ酸（シグナルペプ
チド用の３５個のアミノ酸、成熟蛋白用の６１５個のア
ミノ酸）を含有する蛋白をコードする。通常の培養、回
収、単離および精製技術により図１（ｂ）のトリス-ク
リングルプラスミノーゲン活性化因子を得る。

【００７４】実施例３２６１-（Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ
-ＵＫａａ^50-131）-２６２-ｔ-ＰＡこの実施例においては、ウロキナーゼクリングル配列を
ｔ-ＰＡの二重クリングル領域の直後、すなわち、アミ
ノ酸２６１（Ｃｙｓ）と２６２（Ｓｅｒ）に対応する配
列の間に挿入する。図８は、このトリス-クリングルＰ
Ａの製造の種々の工程を説明するフローチャートを示
す。

【００７５】ｐＷＰ４２プラスミドＤＮＡ約１０μｇを
ＨｇａＩで消化し、４００ｂｐＤＮＡフラグメントを
１％アガロースゲルから単離する。このＤＮＡフラグメ
ントはｔ-ＰＡのクリングル域の一部分、すなわち、ア
ミノ酸１３５〜２６１に対応する配列を含有する。ｔ-
ＰＡの二重クリングル域はアミノ酸９２〜２６１の範囲
にわたり、２つのクリングルを連結するヘキサペプチド
（アミノ酸１７４〜１７９）を有する。図８に示す２つ
のＤＮＡ配列２４ｍｅｒおよび２１ｍｅｒからなるオリ
ゴヌクレオチドリンカーはホスホトリエステル法を用い
て合成する。このオリゴマーリンカーはヘキサペプチド
リンカーおよびＵＫクリングルの欠損アミノ酸５０（Ｃ
ｙｓ）をコードし、ＨｇａＩおよびＮｄｅＩについての
制限酵素配列でフランキングされる。上流のオリゴヌク
レオチド、２３ｍｅｒのみがその５'末端でホスホリル
化し、ｔ-ＰＡからの４００ｂｐＤＮＡフラグメントの
ＨｇａＩ端に結紮する。４２１ｂｐＤＮＡ生成物をプ
レパラティブ１％アガロースゲルから単離する。

【００７６】ｔ-ＰＡの後クリングル部はｐＷＰ４２プ
ラスミド１０μｇをＲｓａＩで消化し、ついで１.２％
アガロースゲルから５０１ｂｐＤＮＡを単離する。こ
のＤＮＡはｔ-ＰＡ分子のアミノ酸２６９〜４３５を表
わす。図８に示すように２２塩基の２つの補助オリゴヌ
クレオチドをホスホトリエステル法により合成する。こ
のＤＮＡリンカーは、その５'末端で５０１ｂｐＤＮＡ
と結紮すると、欠損アミノ酸２６２〜２６８を復元す
る。

【００７７】５０１ｂｐＤＮＡ約１μｇおよびリンカ
ーＤＮＡ１μｇを一夜結紮し、５２３ｂｐサイズに対応
するＤＮＡバンドを１％アガロースゲルから精製する。

【００７８】サイズ４２１ｂｐ、２４６ｂｐ（ＵＫクリ
ングル）および５２３ｂｐの３つのＤＮＡフラグメント
をほぼ等モル量で１５℃にて１６時間結紮する。フェノ
ール抽出およびエタノール沈澱後、ＤＮＡをＥｃｏＲＩ
で切断し、７４１ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離す
る。２つのＥｃｏＲＩ制限部位でフランキングされたこ
のＤＮＡを前記のごとくｐＵＣ１３ベクター系中で増殖
させる。

【００７９】複クローニング部におけるＥｃｏＲＩ部を
除去したｐｔＰＢＭ-１プラスミドＤＮＡ１０μｇをＥ
ｃｏＲＩで消化し、約４.０Ｋｂの大きい方のベクター
ＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲルから単離す
る。ほぼ等モル量のＥｃｏＲＩ切断ベクターＤＮＡおよ
び７４１ｂｐＤＮＡを結紮し、生成物をコンピテント
イー・コリＪＭ１０３セルの形質転換に用いる。１２個
の組換体クローンから調製したミニプラスミドＤＮＡを
ＢａｍＨＩで消化し、約１.８Ｋｂの所望のインサート
を探す。インサートにおける７４１ｂｐＤＮＡの正し
い配向をプラスミドＤＮＡのＮａｒＩおよびＭｓｔＩの
消化によって決定する。１つのクローン、ｐｔＰＵＨＹ
Ｃは、ＮａｒＩおよびＭｓｔＩで消化した場合、正しい
配合の約７００ｂｐのフラグメントを含有していること
が判明した。

【００８０】ｐｔＰＵＨＹＣプラスミドＤＮＡのＢａｍ
ＨＩ消化により得た１.８ＫｂＤＮＡは、６５０個のア
ミノ酸のペプチド（シグナルペプチド用の３５個のアミ
ノ酸および図１（ｃ）の生成物に対応する成熟蛋白につ
いての６１５個のアミノ酸）をコードするヌクレオチド
配列を含有する。

【００８１】ついで、このトリス-クリングル遺伝子
を、完全表現ベクターとして役立つＢｇｌII切断ウシ乳
頭腫ウイルス（ＢＰＶ）に結紮する。通常の培養によ
り、図１（ｃ）のトリス-クリングルプラスミノーゲン
活性化因子を得る。

【００８２】テトラ-クリングルプラスミノーゲン活性
化因子プロトロンビンcＤＮＡプロトロンビン遺伝子用のcＤＮＡクローンを、フリー
ツナー（Ｆriezner）ら，バイオケミストリー（Ｂioche
mistry）22巻，2087頁，1983年の方法に従ってヒト肝臓
ｃＤＮＡライブラリーから単離する。このクローン、ｐ
ＰＴＲは５７９個のアミノ酸の成熟蛋白についての完全
コード情報を含有している。プロトロンビンの二重クリ
ングル領域はアミノ酸６５（ｂｐ３１９）からアミノ酸
２４８（ｂｐ８４０）に延長する１８４個のアミノ酸の
ペプチドである。２つのクリングルＰＴＫ１（アミノ酸
６５〜１４３）およびＰＴＫ２（アミノ酸１７０〜２４
８）の各々は７９個のアミノ酸の長さであり、２６個の
アミノ酸の長さのペプチド（アミノ酸１４４〜１６９）
で連結されている。

【００８３】プロトロンビン二重クリングル配列の調製二重クリングル領域を表わすＤＮＡ配列を２工程でプロ
トロンビンｃＤＮＡから単離する（図１７）。

【００８４】第１工程において、ｐＰＴＲプラスミドＤ
ＮＡ１０μｇをＡｖａＩで消化し、１％アガロースゲル
から７６０ｂｐＤＮＡを単離する。このＤＮＡをＢａ
ｌ３１で７.５秒間処理してＤＮＡの一端から約３８ｂ
ｐを除去する（レガスキー（Ｌegerski）ら，ニューク
レイック・アシッド・リサーチ（Ｎucleic Ａcid Ｒe
s.）５巻，145頁，1978年）。フェノール抽出およびエ
タノール沈澱後、ＤＮＡをＥｃｏＲＩリンカー、ＧＧＡ
ＡＴＴＣＣに４℃で１５時間結紮する。このリンカー
は、ＣＴＧＡＧまたはＴＧＡＧ（アミノ酸６７、Ｇｌ
ｕ）配列で終わるＤＮＡと結紮し、二重クリングルのＮ
-末端（アミノ酸６７）において、ＭｓｔIIに対する新
しい制限配列（ＣＣＴＧＡＧＧ）を生じる。ＥｃｏＲＩ
で切断後、６３０ｂｐサイズのＤＮＡフラグメントを単
離する。このＤＮＡは、等モル量でＥｃｏＲＩ／ｐＵＣ
１３と結紮後、コンピテントイー・コリＪＭ１０３セル
の形質転換に用いる。所望のクローンについての最初の
スクリーニングを、アミノ酸６６〜６８に対するヌクレ
オチド配列を含有する³²Ｐラベルプローブ、ＧＡＡＴＴ
ＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧを用い特定部間ハイブリッド
形成により行なう。Ｘ線フイルム上に強いシグナルを示
す１２個のクローンをミニプラスミド調製用に増殖させ
る。ＭｓｔIIおよびＢａｍＨＩでプラスミドＤＮＡを消
化後、１つのクローン、ｐＰＴＫ-５'が約６３０ｂｐの
所望のインサートと、３２２ｂｐのところに新たに作成
されたＭｓｔII部位を有することが判明した。

【００８５】第２の工程は前記と同様にして、およそア
ミノ酸２４８のクリングル領域の３'末端を編整するこ
とを包含する。ｐＰＴＫ-５'プラスミドＤＮＡ約１０μ
ｇをＢａｍＨＩで完全に消化する。ついで、ＤＮＡをＢ
ａｌで３０℃にて１５秒間処理し、ＤＮＡの両端から約
８２ｂｐを除去する。フェノール抽出およびエタノール
沈澱後、ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＦｓｐＩリンカー、ＣＧ
ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＧに結紮する。このリンカーは
その名のとおり、ＴＧ-で終わるいずれのＤＮＡ配列に
おいてもＦｓｐＩ配列（ＴＧＣＧＣＡ）を生じる。Ｅｃ
ｏＲＩで完全に切断後、１.２％アガロースゲルから５
４６ｂｐＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ１３
に結紮する。この組換体プラスミドをコンピテントイー
・コリＪＭ１０３セルの形質転換に用いる。約１０００
の組換体クローンを、配列ＣＴＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣＧ
ＣＡＧＡＡ（アミノ酸２４５〜２４８）を有する³²Ｐラ
ベルオリゴマーを用いる特定部間ハイブリッド形成でス
クリーニングする。１２個の有力なクローンから調製し
たプラスミドＤＮＡをＭｓｔIIおよびＦｓｐＩで切断
し、１％アガロースゲル上で泳動させる。１つのクロー
ン、ｐＰＴ２Ｋは所望の５４６ｂｐサイズのインサート
を含有していることが判明した。このＤＮＡは二重クリ
ングル域の合計１８２のアミノ酸、アミノ酸６７〜２４
８をコードする。６５位（Ｃｙｓ）および６６位（Ａｌ
ａ）の残りの２つのアミノ酸についてのヌクレオチド配
列は図１８に示すようなオリゴマーリンカーを介して加
える。

【００８６】実施例４９１（ＰＴＫａａ^65-248-Ｓｅｒ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ
-Ｓｅｒ-Ａｓｐ）-９２-ｔ-ＰＡプロトロンビンの二重クリングル配列、アミノ酸６５〜
２４８をｔ-ＰＡの二重クリングル域の前（すなわち、
アミノ酸９１と９２の間）に挿入し、テトラクリングル
-ＰＡを得る。前記のごとく、ＭｓｔII＋ＦｓｐＩまた
はＥｃｏＲＩによるｐＰＴ２ＫプラスミドＤＮＡの消化
はプロトロンビンの６７〜２４８のアミノ酸をコードす
る５４６ｂｐＤＮＡフラグメントを与える。２つのオ
リゴヌクレオチドの使用により、５４６ｂｐＤＮＡの
２つの端をヌクレオチド４６２（アミノ酸９１）および
４６３（アミノ酸９２）の間でｔ-ＰＡ遺伝子中に挿入
する。図１８にフローチャートを示す。

【００８７】ペプチドリンカーＳｅｒ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-
Ａｓｎ-Ｓｅｒ-Ａｓｐおよびｔ-ＰＡのアミノ酸９２〜
２０４用のヌクレオチド配列を含有する３５４ｂｐＤ
ＮＡを実施例２および図７に示すごとくして調製する。
等モル量の３５４ｂｐＤＮＡおよび５４６ｂｐＤＮＡ
（プロトロンビンクリングル）を４℃で１６時間結紮す
る。このＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル
から９００ｂｐＤＮＡフラグメントを単離する。Ｅｃ
ｏＲＩ切断ｐＵＫ１３ベクターに結紮後、このＤＮＡを
イー・コリＪＭ１０３セルの形質転換に用いる。１２個
の組換体クローンから得られたミニプラスミド調製物を
ＥｃｏＲＩおよびＭｓｔIIで消化する。１つのクロー
ン、ｐＰＴ２ＫＴＰＫは所望の９００ｂｐのインサー
トを含有することが判明した。このＤＮＡは合計３００
のアミノ酸（プロトロンビンに対応する１８２アミノ酸
（アミノ酸６７〜２４８）、ヘキサペプチド配列および
ｔ-ＰＡの１１２アミノ酸（アミノ酸９２〜２０４））
をコードする。

【００８８】ｐｔＰＢＭ-１プラスミドをＥｃｏＲＩお
よびＡｓｕＩで消化して得られる３８５ｂｐＤＮＡの調
製を図７に記載する。各々１２ｂｐの２つの補助オリゴ
ヌクレオチド配列をホスホトリエステル法で合成する。
このリンカーはプロトロンビンクリングル域の欠損アミ
ノ酸、ＣｙｓおよびＡｌａを復元し、ＡｓｕＩおよびＭ
ｓｔII認識配列によってフランキングされる。ＤＮＡ
（３８５ｂｐ）約５００ｎｇを図１８に示すようにホス
ホリル化リンカー１μｇと結紮する。ＥｃｏＲＩで切断
後、４０２ｂｐＤＮＡフラグメントを単離する。ほぼ
等モル量の４０２ｂｐＤＮＡおよび９００ｂｐＤＮＡ
を結紮し、ＥｃｏＲＩで切断し、１３０２ｂｐＤＮＡ
フラグメントを１％アガロースゲルで単離する。このＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ１３ベクター中でサブクロ
ーンする。１２個の組換体クローンから単離したプラス
ミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化する。１つのクローン、
所望のインサートを含有するｐＮＰＴ２ＫＰＡＫをプラ
スミドＤＮＡの大規模調製用に増殖させる。このプラス
ミドＤＮＡをＢａｍＨＩで完全に、ついで、ＮａｒＩで
部分的に消化し、９８６ｂｐＤＮＡフラグメントを得
る。同様に、ｐｔＰＢＭ-１をＢａｍＨＩおよびＮａｒ
Ｉで消化して１３００ｂｐＤＮＡフラグメントを得
る。２つのフラグメント、９８６ｂｐおよび１３００ｂ
ｐを等モル量で結紮し、ＢａｍＨＩで切断し、２２８６
ｂｐＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲル電気泳
動で単離する。ＢａｍＨＩ配列でフランキングされたＤ
ＮＡをＢＰＶ表現ベクターのＢｇｌII部位に挿入する。
このＤＮＡは合計７５２のアミノ酸（シグナルペプチド
の３５アミノ酸および成熟蛋白の７１７アミノ酸）をコ
ードする。成熟蛋白は概算分子量約９２,０００で、プ
ロトロンビン二重クリングル領域からの１８４アミノ
酸、ヘキサペプチドリンカーおよび５２７アミノ酸の完
全ｔ-ＰＡ配列を含有する。

【００８９】ハイブリッド・プラスミノーゲン活性化因
子の発現および生化学的特徴図１（ａ）および図１（ｂ）に示す２つのハイブリッド
・プラスミノーゲン活性化因子（ｈ-ＰＡ）を調製しＢ
ＰＶ-１ベース表現ベクター系に発現させる。これらの
ｈ-ＰＡを、各々、本明細書を通してハイブリッドＡお
よびハイブリッドＢと称する。

【００９０】ハイブリッドＡ（１.８Ｋｂ、図５）およ
びハイブリッドＢ（２.０Ｋｂ、図７）について、Ｂａ
ｍＨＩでフランキングした完全遺伝子配列をＢｇｌII切
断プラスミドｐ３４１-３に挿入する（詳細は方法およ
び材料参照）。１２個の組換体クローンからミニプラス
ミド調製物を調製し、ＮａｒＩ、ＢｇｌIIまたはＢａｍ
ＨＩおよびＡｖａＩで消化する。これをハイブリッド遺
伝子の存在の確認、インサートの配向の決定に用いる。
遺伝子のただ１つの配向、すなわち、メタロチオネイン
・プロモーターの配列方向は、該プロモータの制御下、
遺伝子の発現を行なうので望ましい。さらに、遺伝子の
直後に位置するＳＶ４０ポリ-Ａ配列は、その３'末端に
おけるポリアデニレーションによる遺伝子のＲＮＡ転写
を加工し、遺伝子の翻訳を効率よくする。２つの組換体
クローンｐＨｙｂＡＭＴ-４３（ハイブリッドＡ）およ
びｐＨｙｂＢＭＴ-５０（ハイブリッドＢ）を得る。

【００９１】前記のクローンから得られたプラスミドＤ
ＮＡ約１μｇをＢａｍＨＩで消化し、細菌性アルカリホ
スファターゼで脱ホスホリル化する。これに完全８.０
ＫｂＢａｍＨＩ切断ＢＰＶ-１ゲノムを挿入する。各
々、ハイブリッドＡおよびハイブリッドＢをコードする
遺伝子を含有する２つの発現プラスミドｐＨｙｂ-ＡＭ
ＴＢＰＶ-４３８およびｐＨｙｂ-ＢＭＴＢＰＶ-５０４
（以下、ｐ４３８およびｐ５０４と略す）を得る。発現
プラスミドの種々の成分の相対位置を示す完全地図を図
１９〜２０に示す。

【００９２】ｔ-ＰＡ／ウロキナーゼ分子をコードする
遺伝子を含有する２つの表現プラスミドをリン酸カルシ
ウム沈澱法（グラハム（Ｇraham）ら，バイロロジー
（Ｖirology）52巻，456頁（1973））によりマウスＣ１
２７セルにトランスフェクションした。形態学的に形質
転換したセルのフォーカスを二次培養し、遺伝子発現に
ついてスクリーニングする。培地中におけるフィブリン
溶解活性についての最初のスクリーニングは図２１に示
すようにフィブリン寒天平板上で行なった（プラウグ
（Ｐloug）ら，バイオシミカ・バイオフィジカ・アクタ
（Ｂiochim.Ｂiophys.Ａcta）24巻，278頁（1957
年））。各トランスフェクションから、ｐ５０４（ハイ
ブリッドＢ）で形質転換したフォーカスの平均５０％お
よびｐ４３８（ハイブリッドＡ）で形質転換したフォー
カスの５％が培地中で陽性のフィブリン溶解活性を示し
た。いくつかの高生産株を選択し、個々のフォーカスか
らセル・ラインを展開させた。遺伝子産生の予備的生化
学的および免疫学的特徴づけの大部分を行なった２つの
セル・ラインをハイブリッドＢについてクローン５Ａ
５、ハイブリッドＡについてクローン１６Ｃ１と表示す
る。

【００９３】生化学的特徴づけハイブリッド分子の酵素活性を、フィブリン寒天検定お
よび合成基質Ｓ-２４４４およびＳ-２２５１を用いるア
ミド分解活性検定（シモダ（Ｓhimoda）ら，トロンボシ
ス・アンド・ヘモスタシス（Ｔhromb．Ｈaemostas.）46
巻，507頁（1981年））により評価した。約１〜５単位
／μｌの活性酵素が１６〜１８時間で培地中に分泌され
た。シグナル配列を切断し、成熟蛋白となった後、天然
のｔ-ＰＡおよびウロキナーゼが前駆体として合成さ
れ、細胞から分泌される。さらに、ｔ-ＰＡおよびウロ
キナーゼの両方ともグリコシル化される。トランスフェ
クションしたマウス細胞からｈ-ＰＡが分泌されている
か否かの判断は天然ｔ-ＰＡおよびウロキナーゼと同様
に行なわれ、ハイブリッド分子をＳＯＳ／ポリアクリル
アミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動、ついで、フィブリン
寒天重層（グラネリ-ピペルノ（Ｇranelli-Ｐiperno）
ら，ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジィシ
ン（Ｊ.Ｅxp.Ｍed.）148巻，223頁（1978年））により
行なった。図２２に示すように、ハイブリッドＢ含有培
地からの活性酵素は７６,０００の分子量を有し、ハイ
ブリッドＡでは７１,０００である。これらは挿入遺伝
子から計算した分子量とよく一致した。

【００９４】ｔ-ＰＡ精製に用いたと同様な方法で収穫
培地からハイブリッドＢを精製した。アミノ酸配列分析
はハイブリッドＢのＮ-末端が正しく加工され、成熟ｔ-
ＰＡのＮ-末端域と同じ配列、Ｓｅｒ-Ｔｈｒ-Ｇｌｎ-を
有することを示し、さらに、活性化開裂部位、Ａｒｇ-
Ｉｌｅにおけるアミノ酸に対応するＮ-末端配列、Ｉｌ
ｅ-Ｌｙｓ-Ｇｌｙ-が存在した。収穫培地から精製した
ハイブリッドＢは、主として、活性化二本鎖型で存在す
ると結論された。収穫培地へのプロテアーゼ阻害剤（ア
プロチニン）の添加により、一本鎖ｈ-ＰＡ分子が得ら
れる。³⁵Ｓ-ラベル収穫培地の免疫沈降、ついで、ＳＯ
Ｓ／ＰＡＧＥは、非還元条件下、見かけ分子量７１,０
００〜７６,０００に対応する位置に、各々、セル・ラ
イン５Ａ５（ハイブリッドＢ）および１６Ｃ１（ハイブ
リッドＡ）からの試料にはバンドが見られるが、対照試
料には見られないことを示した。５Ａ５セルの培養培地
のフィブリン溶解活性および精製ｔ-ＰＡ（アメリカン
・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド、グ
リニッチ、ＣＴ）は、抗ｔ-ＰＡ抗血清で中和される
が、抗ウロキナーゼ抗血清では中和されず、ハイブリッ
ドＢはｔ-ＰＡに加えてウロキナーゼリングルを含有す
るが、ハイブリッドＢのプロテアーゼ領域は抗-ｔ-ＰＡ
で認識され、中和されることを示唆している。抗ウロキ
ナーゼ抗体はハイブリッド分子のウロキナーゼクリング
ル部に結合しうるが、この結合はあるとしても、該ハイ
ブリッド分子のＣ-末端におけるプロテアーゼ領域によ
り与えられる蛋白分解活性を干渉しない。

【００９５】本発明のポリクリングルプラスミノーゲン
活性化因子はｔ-ＰＡ自体と同じ方法で、同じ送達賦形
剤により、哺乳類における血管障害の治療に用いられ
る。かくして、本発明のポリクリングルプラスミノーゲ
ン活性化因子は、該ポリペプチドをｔ-ＰＡへの適用で
公知の医薬上許容される適当な賦形剤に溶解または分散
させることにより、医薬組成物に処方できる。投与の必
要な哺乳類への静脈内注射または注入による投与は、ｔ
-ＰＡ自体ですでに確立された方法に従って行なわれ
る。ｔ-ＰＡを用いる場合、４４０ＩＵ／ｋｇ体重の静
脈内第１回投与が一般的であり、ついで、約４４０Ｉ
Ｕ／ｋｇ時間の連続注入を約６〜１２時間行なうのが通
常のプラクティスである。

【００９６】なお、本発明における組換体プラスミド物
質を含有する次のイー・コリ３株は、ブダペスト条約の
下、１９８６年８月５日にアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。

【００９７】（１）図１（ａ）のポリペプチドをコード
するＤＮＡを含有するＡＴＣＣ６７１７５-ｐ４３８／
イー・コリＭＭ２９４（２）図１（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡを
含有するＡＴＣＣ６７１７４-ｐ５０４／イー・コリＭ
Ｍ２９４（３）図１（ｃ）のポリペプチドをコードするＤＮＡを
含有するＡＴＣＣ６７１７６-p１１３／イー・コリＭＭ
２９４イー・コリＭＭ２９４株はＡＴＣＣ３３６２５として入
手可能なものである。

【００９８】

【発明の効果】本発明によれば、天然のプラスミノーゲ
ン活性化因子と比較して、インビボでの安定性が増大
し、フィブリンに対する結合親和力が増大し、半減期が
向上し、しかも調製および生成の際に取り扱いが容易な
ハイブリッドプラスミノーゲン活性化因子をコードする
遺伝子が得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のポリクリングルプラスミノーゲン活性
化因子の代表例の配列図である。

【図２】クローンｐＷＰ-４２の制限地図である。

【図３】プラスミドｐｔＰＢＭ-１産生のフローチャー
トである。

【図４】プラスミドｐＵＫＢＭ産生のフローチャートで
ある。

【図５】図１（ａ）のトリス-クリングルをコードする
遺伝子産生のフローチャートである。

【図６】ウロキナーゼのアミノ酸５１〜１３１（ｕ-Ｐ
Ａ^51-131）をコードする遺伝子産生のフローチャートで
ある。

【図７】図１（ｂ）のトリス-クリングルをコードする
遺伝子産生のフローチャートである。

【図８】図１（ｃ）のトリス-クリングルをコードする
遺伝子産生のフローチャートである。

【図９】図１（ａ）の生成物をコードする遺伝子のＤＮ
Ａ配列図である。

【図１０】図１（ａ）の生成物をコードする遺伝子のＤ
ＮＡ配列図（図９のつづき）である。

【図１１】図１（ｂ）の生成物をコードする遺伝子のＤ
ＮＡ配列図である。

【図１２】図１（ｂ）の生成物をコードする遺伝子のＤ
ＮＡ配列図（図１１のつづき）である。

【図１３】図１（ｂ）の生成物をコードする遺伝子のＤ
ＮＡ配列図（図１２のつづき）である。

【図１４】図１（ｃ）の生成物をコードする遺伝子のＤ
ＮＡ配列図である。

【図１５】図１（ｃ）の生成物をコードする遺伝子のＤ
ＮＡ配列図（図１４のつづき）である。

【図１６】図１（ｃ）の生成物をコードする遺伝子のＤ
ＮＡ配列図（図１５のつづき）である。

【図１７】プロトロンビンのダブルクリングル領域をコ
ードする遺伝子産生のフローチャートである。

【図１８】図１（ｄ）の生成物をコードする遺伝子産生
のフローチャートである。

【図１９】ハイブリッドＡ遺伝子発現用の発現ベクター
系を示す制限地図である。

【図２０】ハイブリッドＢ遺伝子発現用の発現ベクター
系を示す制限地図である。

【図２１】フィブリン寒天平板上でスクリーニングにお
ける生物の形態を示す図面代用写真である。

【図２２】ハイブリッドＡおよびＢのザイモグラムであ
る。

【図２３】ハイブリッドＡおよびＢのオートラジオグラ
ムである。

【図２４】ｐＵＣプラスミドの多重クローニングまたは
制限サイトの配列図である。

【図２５】オリゴヌクレオチドリンカーの配列図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ナレンダー・クマール・カルヤンアメリカ合衆国ペンシルベニア州、キング・オブ・プルッシア、マリー・ドライブ304エイ (72)発明者ショウグァング・リン・リーアメリカ合衆国ペンシルベニア州、ビラノーバ、サウス・スプリング・ミル・ロード155番 (56)参考文献特開昭59−42321（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】非相同のポリペプチドクリングルを３個
またはそれ以上含有するハイブリッド・プラスミノーゲ
ン活性化因子をコードするヌクレオチド配列を有するＤ
ＮＡユニット。
【請求項２】非相同のポリペプチドクリングルを３個
またはそれ以上含有するハイブリッド・プラスミノーゲ
ン活性化因子をコードするヌクレオチド配列を有するＤ
ＮＡユニットを含有する複製可能な発現ベクター。
【請求項３】ウロキナーゼのアミノ酸１〜１３１に対
応するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有
する請求項１記載のＤＮＡユニット。
【請求項４】ウロキナーゼのアミノ酸１〜１３１に対
応するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有
するＤＮＡユニットを含有する請求項２記載のクローニ
ングベクター。
【請求項５】ウロキナーゼのアミノ酸５１〜１３１に
対応するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
有する請求項１記載のＤＮＡユニット。
【請求項６】ウロキナーゼのアミノ酸５１〜１３１に
対応するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
有するＤＮＡユニットを含有する請求項２記載のクロー
ニングベクター。
【請求項７】ｔ-ＰＡのアミノ酸１〜２６１に対応す
るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する
請求項１記載のＤＮＡユニット。
【請求項８】ｔ-ＰＡのアミノ酸１〜２６１に対応す
るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する
ＤＮＡユニットを含有する請求項２記載のクローニング
ベクター。
【請求項９】ｔ-ＰＡのアミノ酸９２〜５２７に対応
するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有す
る請求項１記載のＤＮＡユニット。
【請求項１０】ｔ-ＰＡのアミノ酸９２〜５２７に対
応するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有
するＤＮＡユニットを含有する請求項２記載のクローニ
ングベクター。
【請求項１１】プロトロンビンのアミノ酸６５〜２４
８に対応するポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を有する請求項１記載のＤＮＡユニット。
【請求項１２】プロトロンビンのアミノ酸６５〜２４
８に対応するポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を有するＤＮＡユニットを含有する請求項２記載のク
ローニングベクター。