JP2602435B2 - Ｌ―グロノラクトン酸化酵素のクローン化ｄｎａ、該クローン化ｄｎａの組込まれた遺伝子組換えベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞 - Google Patents
Ｌ―グロノラクトン酸化酵素のクローン化ｄｎａ、該クローン化ｄｎａの組込まれた遺伝子組換えベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＬ−グロノラクトン酸化酵素のクローン化DN
A、該クローン化DNAの組込まれた遺伝子組換えベクター
及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞に係り、
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素、延いてはアスコルビン
酸、即ちビタミンＣの大量生産に利用される。
A、該クローン化DNAの組込まれた遺伝子組換えベクター
及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞に係り、
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素、延いてはアスコルビン
酸、即ちビタミンＣの大量生産に利用される。
（従来の技術） Ｌ−グロノラクトン酸化酵素は、高等動物の肝臓及び
腎臓のミクロゾーム画分に局在している分子量51000の
フラビン酵素であって、生体内におけるＬ−アスコルビ
ン酸（ビタミンＣ）合成経路の最終段階で触媒作用を行
う物質である。即ち、この酵素はＬ−グロノラクトンを
基質として酸化反応を行ってＬ−キシロ−ヘキスロラク
トンを合成し、このＬ−キシロ−ヘキスロラクトンが引
続き異性化を受けてＬ−アスコルビン酸となるのであ
る。尚、このＬ−グロノラクトン酸化酵素は膜に結合し
た蛋白であり、その精製は容易ではなく、又その蛋白構
造や遺伝子と性質は未だ明らかになされていない。
腎臓のミクロゾーム画分に局在している分子量51000の
フラビン酵素であって、生体内におけるＬ−アスコルビ
ン酸（ビタミンＣ）合成経路の最終段階で触媒作用を行
う物質である。即ち、この酵素はＬ−グロノラクトンを
基質として酸化反応を行ってＬ−キシロ−ヘキスロラク
トンを合成し、このＬ−キシロ−ヘキスロラクトンが引
続き異性化を受けてＬ−アスコルビン酸となるのであ
る。尚、このＬ−グロノラクトン酸化酵素は膜に結合し
た蛋白であり、その精製は容易ではなく、又その蛋白構
造や遺伝子と性質は未だ明らかになされていない。
一方、アスコルビン酸は副作用を有しないビタミンで
あり、健康維持のためには、その接種の重要なことが判
明している。従って、アルコルビン酸は食品や飲料等に
おける添加物として大量の需要がある。更に、アルコル
ビン酸は還元力が強く、従って抗酸化剤としての需要も
高い。
あり、健康維持のためには、その接種の重要なことが判
明している。従って、アルコルビン酸は食品や飲料等に
おける添加物として大量の需要がある。更に、アルコル
ビン酸は還元力が強く、従って抗酸化剤としての需要も
高い。
このアスコルビン酸を製造するために、従来では高圧
水素添加によりブドウ糖をｄ−ソルビトールに変じ、こ
れを発酵させてｄ−ソルボースになし、アセトンと濃硫
酸とでヒドロキシ基を保護した後に過マンガン酸カリウ
ムで酸化し、次にアルコール性塩酸で処理してアセトン
の除去とエステル化を同時に行い、その後にナトリウム
アルコラートで処理することにより製造されてきた。
尚、近年では、所謂「バイオテクノロジー」を利用する
アスコルビン酸の製法も提案されており（特開昭60−70
073公報）、この方法によればコリネバクテリウムから
2,5−ジケト−Ｄ−グルコナート還元酵素の遺伝子を取
出し、この遺伝子をプラスミドに組込み、この遺伝子組
換えプラスミドをEruinia herbicolaに取込ませ、得ら
れた形質転換菌によりＤ−グルコースを直接的に2,5−
ジケトグルコン酸に変じ、酸又は塩基触媒の存在下に該
中間体を環化反応させてアスコルビン酸となしている。
水素添加によりブドウ糖をｄ−ソルビトールに変じ、こ
れを発酵させてｄ−ソルボースになし、アセトンと濃硫
酸とでヒドロキシ基を保護した後に過マンガン酸カリウ
ムで酸化し、次にアルコール性塩酸で処理してアセトン
の除去とエステル化を同時に行い、その後にナトリウム
アルコラートで処理することにより製造されてきた。
尚、近年では、所謂「バイオテクノロジー」を利用する
アスコルビン酸の製法も提案されており（特開昭60−70
073公報）、この方法によればコリネバクテリウムから
2,5−ジケト−Ｄ−グルコナート還元酵素の遺伝子を取
出し、この遺伝子をプラスミドに組込み、この遺伝子組
換えプラスミドをEruinia herbicolaに取込ませ、得ら
れた形質転換菌によりＤ−グルコースを直接的に2,5−
ジケトグルコン酸に変じ、酸又は塩基触媒の存在下に該
中間体を環化反応させてアスコルビン酸となしている。
（発明が解決しようとする課題及び発明の目的） アスコルビン酸は、その有用性を考慮する場合に、今
後需要が拡大することはあっても、減少するものとは考
えられず、従ってアルコルビン酸の有利な製法を開発す
ることは極めて重要である。
後需要が拡大することはあっても、減少するものとは考
えられず、従ってアルコルビン酸の有利な製法を開発す
ることは極めて重要である。
ブドウ糖等の糖類を原料とする汎用の方法は醗酵法と
合成法とを併用するものであり、合成工程数も比較的多
く、最適な方法とは必ずしも云えない。一方、特開昭60
−70073公報に開示されている方法に従ってアスコルビ
ン酸を製造するには、形質転換菌による2,5−ジケトグ
ルコン酸の産生に際して菌を適切に管理する必要性があ
り、又目的物質であるアスコルビン酸を得るためには産
生した2,5−ジケトグルコン酸を菌体から分離した後に
環化反応に付さねばならない。
合成法とを併用するものであり、合成工程数も比較的多
く、最適な方法とは必ずしも云えない。一方、特開昭60
−70073公報に開示されている方法に従ってアスコルビ
ン酸を製造するには、形質転換菌による2,5−ジケトグ
ルコン酸の産生に際して菌を適切に管理する必要性があ
り、又目的物質であるアスコルビン酸を得るためには産
生した2,5−ジケトグルコン酸を菌体から分離した後に
環化反応に付さねばならない。
従って、本発明の背景となっている課題は、特開昭60
−70073公報に開示されている方法と同様にバイオテク
ノロジーを利用するものであるが、該公報に記載の方法
とは別の観点からアスコルビン酸の製法にアプローチす
ることにある。
−70073公報に開示されている方法と同様にバイオテク
ノロジーを利用するものであるが、該公報に記載の方法
とは別の観点からアスコルビン酸の製法にアプローチす
ることにある。
そこで、本発明者等はＬ−グロノラクトン酸化酵素に
着目した。蓋しＬ−グロノラクトン酸化酵素を用いれ
ば、その基質であるＬ−グロノラクトンと適当な条件下
で混和するだけでアスコルビン酸が生成するからであ
る。しかしながら、ここで留意すべきことは、Ｌ−グロ
ノラクトン酸化酵素が、既述のように、高等動物の肝臓
や腎臓に局在するのみであり、大量入手が困難であり且
つ膜蛋白であるために精製が困難なことである。
着目した。蓋しＬ−グロノラクトン酸化酵素を用いれ
ば、その基質であるＬ−グロノラクトンと適当な条件下
で混和するだけでアスコルビン酸が生成するからであ
る。しかしながら、ここで留意すべきことは、Ｌ−グロ
ノラクトン酸化酵素が、既述のように、高等動物の肝臓
や腎臓に局在するのみであり、大量入手が困難であり且
つ膜蛋白であるために精製が困難なことである。
従って、本発明の本質的な目的は高純度のＬ−グロノ
ラクトン酸化酵素を大量に且つ比較的容易に生産する途
を開き、アスコルビン酸の大量生産を可能にすることに
あり、その第１の目的はＬ−グロノラクトン酸化酵素の
クローン化DNAを提供することにある。
ラクトン酸化酵素を大量に且つ比較的容易に生産する途
を開き、アスコルビン酸の大量生産を可能にすることに
あり、その第１の目的はＬ−グロノラクトン酸化酵素の
クローン化DNAを提供することにある。
本発明の第２の目的は、Ｌ−グロノラクトン酸化酵素
のクローン化DNAが組込まれた遺伝子組換えベクターを
提供することにある。
のクローン化DNAが組込まれた遺伝子組換えベクターを
提供することにある。
本発明の第３の目的は、上記の遺伝子組換えベクター
により形質転換された宿主細胞を提供することにある。
により形質転換された宿主細胞を提供することにある。
（課題を解決し、目的を達成する手段及び作用） 本発明によれば、上記の第１の目的は、ラットＬ−グ
ロノラクトン酸化酵素のアミノ酸配列である をコードしているクローン化DNAにより達成される。
ロノラクトン酸化酵素のアミノ酸配列である をコードしているクローン化DNAにより達成される。
上記第２の目的は、式 （式中においてＡ、Ｃ、Ｇ及びＴはそれぞれアデニン、
シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリ
ボヌクレオチドを意味し、上記の式はアミノ酸に対応す
るコドン毎の配列として示されている） にて示されるヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列
が指定するアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指定す
る他のヌクレオチド配列を有するクローン化DNAが組込
まれている遺伝子組換えベクターにより達成される。
シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリ
ボヌクレオチドを意味し、上記の式はアミノ酸に対応す
るコドン毎の配列として示されている） にて示されるヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列
が指定するアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指定す
る他のヌクレオチド配列を有するクローン化DNAが組込
まれている遺伝子組換えベクターにより達成される。
上記の第３の目的は、上記の遺伝子組換えベクターに
より形質転換されている宿主大腸菌により達成される。
より形質転換されている宿主大腸菌により達成される。
付言すれば、既述の特定のアミノ酸配列を有している
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素は、基本的には、 ａ）ラット肝臓由来のＬ−グロノラクトン酸化酵素を自
体公知の方法で精製して高純度なものとなし、この精製
酵素をウサギに免疫させて抗血清を得る工程と、 ｂ）ラット肝臓のmRNAから作成された市販のλgt11ファ
ージのcDNA発現ライブラリを用い、このファージをEsch
erichia coli Y1090（r-）に感染させて培養し、イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドにより融合
蛋白を誘導させ、上記の抗血清を用いて該融合蛋白を酵
素免疫法により検出してスクリーニングすることにより
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素をコードしているクローン
化DNAの組込まれたλファージを得て、これを培養する
工程と、 ｃ）このλファージを制限酵素Bcl I及びSph Iで切断
し、このDNA断片の両端にBgl IIリンカーを付加してイ
ンサートDNAとなす工程と、 ｄ）プラスミドベクターを制限酵素Bgl IIで切断し、そ
の断点に上記のインサートDNAを接合することにより遺
伝子組換えベクターとして上記のプラスミドを再構築す
る工程と、 ｅ）この遺伝子組換えベクターを大腸菌又は動物細胞取
込ませて形質転換を行う工程と、 ｆ）得られた形質転換体を培養してＬ−グロノラクトン
酸化酵素を産生させる工程と、 ｇ）産生されたＬ−グロノラクトン酸化酵素を分離・精
製する工程 とを具備している方法により製造することができる。
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素は、基本的には、 ａ）ラット肝臓由来のＬ−グロノラクトン酸化酵素を自
体公知の方法で精製して高純度なものとなし、この精製
酵素をウサギに免疫させて抗血清を得る工程と、 ｂ）ラット肝臓のmRNAから作成された市販のλgt11ファ
ージのcDNA発現ライブラリを用い、このファージをEsch
erichia coli Y1090（r-）に感染させて培養し、イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドにより融合
蛋白を誘導させ、上記の抗血清を用いて該融合蛋白を酵
素免疫法により検出してスクリーニングすることにより
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素をコードしているクローン
化DNAの組込まれたλファージを得て、これを培養する
工程と、 ｃ）このλファージを制限酵素Bcl I及びSph Iで切断
し、このDNA断片の両端にBgl IIリンカーを付加してイ
ンサートDNAとなす工程と、 ｄ）プラスミドベクターを制限酵素Bgl IIで切断し、そ
の断点に上記のインサートDNAを接合することにより遺
伝子組換えベクターとして上記のプラスミドを再構築す
る工程と、 ｅ）この遺伝子組換えベクターを大腸菌又は動物細胞取
込ませて形質転換を行う工程と、 ｆ）得られた形質転換体を培養してＬ−グロノラクトン
酸化酵素を産生させる工程と、 ｇ）産生されたＬ−グロノラクトン酸化酵素を分離・精
製する工程 とを具備している方法により製造することができる。
（実施例等） 次に、参考例、製造例及び試験例により本発明を更に
詳細に説明する。
詳細に説明する。
参考例１（Ｌ−グロノラクトン酸化酵素のＮ−末端アミ
ノ酸配列の決定） ラット肝臓由来のＬ−グロノラクトン酸化酵素を自体
公知の方法［Nishikimi,M.等“Arch.Biochem.Biophy
s."」第175巻第427−435頁（1976年）］により精製して
高純度なものとなした。この精製Ｌ−グロノラクトン酸
化酵素100μｇをエドマン分解し、気相プロテインシー
クェンサー（Applied Biosystems社製のモデル470A）に
よりＮ末端部分のアミノ酸配列を解析した結果は下記と
通りであった。
ノ酸配列の決定） ラット肝臓由来のＬ−グロノラクトン酸化酵素を自体
公知の方法［Nishikimi,M.等“Arch.Biochem.Biophy
s."」第175巻第427−435頁（1976年）］により精製して
高純度なものとなした。この精製Ｌ−グロノラクトン酸
化酵素100μｇをエドマン分解し、気相プロテインシー
クェンサー（Applied Biosystems社製のモデル470A）に
よりＮ末端部分のアミノ酸配列を解析した結果は下記と
通りであった。
Val−His−Gly−Tyr−Lys−Gly−Val−Gln−Phe−Gln−
Asn−Trp−Ala−Lys−Thr−Tyr−Gly−Cys−Ser−Pro−
Glu−Val−Tyr−Tyr−Gln−Pro−Thr−Ser−Val−Glu−
Glu−Val−Arg 製造例１（Ｌ−グロノラクトン酸化酵素を含むクローン
化DNAの調製） ａ）抗Ｌ−グロノラクトン酸化酵素抗血清の調製 参考例１に記載の方法により得たラット由来の高純度
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素をウサギに対して免疫させ
ることにより抗血清を得た。
Asn−Trp−Ala−Lys−Thr−Tyr−Gly−Cys−Ser−Pro−
Glu−Val−Tyr−Tyr−Gln−Pro−Thr−Ser−Val−Glu−
Glu−Val−Arg 製造例１（Ｌ−グロノラクトン酸化酵素を含むクローン
化DNAの調製） ａ）抗Ｌ−グロノラクトン酸化酵素抗血清の調製 参考例１に記載の方法により得たラット由来の高純度
Ｌ−グロノラクトン酸化酵素をウサギに対して免疫させ
ることにより抗血清を得た。
ｂ）cDNAライブラリによるスクリーニング ラット肝臓のmRNAを用いて作成された、市販のλgt11
ファージのcDNA発現ライブラリ（Clontec Laboratories
社製）を利用し且つ上記の抗血清を用いた酵素免疫法に
よりＬ−グロノラクトン酸化酵素のクローンをスクリー
ニングした。
ファージのcDNA発現ライブラリ（Clontec Laboratories
社製）を利用し且つ上記の抗血清を用いた酵素免疫法に
よりＬ−グロノラクトン酸化酵素のクローンをスクリー
ニングした。
即ち、λgt11ファージをEscherichia coli Y1090（r
-）に感染させ、これを軟寒天培地と混合した後にLB寒
天培地（アンピシリン100μｇを含有）上に広げ固化さ
せた。これを42℃で３時間培養してプラークを形成させ
た後に、10mMのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）溶液を染み込ませたニトロセルロース
フィルターをプラークの上に載置して37℃で２時間培養
し、IPTGにより誘導された融合蛋白をフィルターに吸着
させた。このフィルターをTBST（50mM Tris−HCl,pH7.
9,150mM NaCl,0.05％ Tween−20）で軽く洗浄し、20％
牛胎児血清含有TBSTを30分間作用させた。
-）に感染させ、これを軟寒天培地と混合した後にLB寒
天培地（アンピシリン100μｇを含有）上に広げ固化さ
せた。これを42℃で３時間培養してプラークを形成させ
た後に、10mMのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）溶液を染み込ませたニトロセルロース
フィルターをプラークの上に載置して37℃で２時間培養
し、IPTGにより誘導された融合蛋白をフィルターに吸着
させた。このフィルターをTBST（50mM Tris−HCl,pH7.
9,150mM NaCl,0.05％ Tween−20）で軽く洗浄し、20％
牛胎児血清含有TBSTを30分間作用させた。
これに、前記のａ）項に記載の抗Ｌ−グロノラクトン
酸化酵素抗血清を1000倍に稀釈させたTBSTを16時間作用
させた。次いで、フィルターをTBSTで充分に洗浄した後
に、ホースラディシュ由来のペルオキシダーゼにて標識
を施したヤギ抗ウサギIgG（Bio−Rad社製）を3000倍に
稀釈させたTBSTを２時間作用させた。TBSTからTween−2
0を除去した溶液でフィルターを充分に洗浄した後に、
過酸化水素と４−クロロ−１−ナフトールを基質として
発色させることによりポジティブクローンを検出した。
ポジティブクローンについて同様のスクリーニングを繰
り返して単一のクローンに純化させた。ファージはLB培
地で液体培養した後にポリエチレングリコールによる沈
殿法［Maniatis,T.等“Molecular Cloning"A Laborator
y Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York（1
982）］に従って調製された。
酸化酵素抗血清を1000倍に稀釈させたTBSTを16時間作用
させた。次いで、フィルターをTBSTで充分に洗浄した後
に、ホースラディシュ由来のペルオキシダーゼにて標識
を施したヤギ抗ウサギIgG（Bio−Rad社製）を3000倍に
稀釈させたTBSTを２時間作用させた。TBSTからTween−2
0を除去した溶液でフィルターを充分に洗浄した後に、
過酸化水素と４−クロロ−１−ナフトールを基質として
発色させることによりポジティブクローンを検出した。
ポジティブクローンについて同様のスクリーニングを繰
り返して単一のクローンに純化させた。ファージはLB培
地で液体培養した後にポリエチレングリコールによる沈
殿法［Maniatis,T.等“Molecular Cloning"A Laborator
y Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York（1
982）］に従って調製された。
ｃ）クローン化DNAの調製 上記ｂ）項で得られたλファージDNAを制限酵素EcoR
Iで切断すれば、Ｌ−グロノラクトン酸化酵素のアミノ
酸配列をコードしている塩基配列を包含する所望のクロ
ーン化DNAが得られる。
Iで切断すれば、Ｌ−グロノラクトン酸化酵素のアミノ
酸配列をコードしている塩基配列を包含する所望のクロ
ーン化DNAが得られる。
尚、このクローン化DNAに自体公知の適宜の制限酵素
を作用させて切断すれば、種々の鎖長を有するクローン
化DNA断片が得られ、これらの断片た各種の研究用に供
することができる。
を作用させて切断すれば、種々の鎖長を有するクローン
化DNA断片が得られ、これらの断片た各種の研究用に供
することができる。
製造例２（遺伝子組換えベクターの調製） 上記製造例１のｃ）項で得たＬ−グロノラクトン酸化
酵素をコードしているクローン化DNAの組込まれたλgt1
1ファージに、蛋白をコードする領域を切断しない制限
酵素であるBcl I及びSph Iを作用させて切断した後に、
このDNA断片をアガロースゲル電気泳動により回収し
た。大腸菌DNAポリメラーゼ（クレノウ フラグメン
ト）と各50μＭのdNTP（dATP,dCTP,dGTP,dTTP）を含有
する67mM燐酸カリウム（pH7.4）、6.7mM MgCl2、1mM 2
−メルカプトエタノール溶液を上記のDNA断片に作用さ
せることにより断片の末端を平滑になした。
酵素をコードしているクローン化DNAの組込まれたλgt1
1ファージに、蛋白をコードする領域を切断しない制限
酵素であるBcl I及びSph Iを作用させて切断した後に、
このDNA断片をアガロースゲル電気泳動により回収し
た。大腸菌DNAポリメラーゼ（クレノウ フラグメン
ト）と各50μＭのdNTP（dATP,dCTP,dGTP,dTTP）を含有
する67mM燐酸カリウム（pH7.4）、6.7mM MgCl2、1mM 2
−メルカプトエタノール溶液を上記のDNA断片に作用さ
せることにより断片の末端を平滑になした。
次いで、このDNA断片の両端に、DNAライゲーションキ
ット（宝酒造株式会社製）を用いて、Bgl IIリンカーを
付加した後に、アガロースゲル電気泳動によりBgl IIリ
ンカー付加DNAを回収した。
ット（宝酒造株式会社製）を用いて、Bgl IIリンカーを
付加した後に、アガロースゲル電気泳動によりBgl IIリ
ンカー付加DNAを回収した。
一方、プラスミドpKSV−10（ファルマシア・ジャパン
株式会社製）をBgl IIで切断し、その断点に上記のBgl
IIリンカー付加DNAを結合させた。
株式会社製）をBgl IIで切断し、その断点に上記のBgl
IIリンカー付加DNAを結合させた。
得られたベクターを大腸菌に取込ませて大腸菌の形質
転換を行い、その形質転換体からアンピシリン耐性菌を
選択し、この菌からプラスミドを取出すことにより所望
の遺伝子組換えベクターを得た。
転換を行い、その形質転換体からアンピシリン耐性菌を
選択し、この菌からプラスミドを取出すことにより所望
の遺伝子組換えベクターを得た。
この遺伝子組換えベクターにおいてはpKSV−10のSV40
プロモータ下流にＬ−グロノラクトン酸化酵素をコード
するDNAが正しい方向で配置されており、従ってこのベ
クターはＬ−グロノラクトン酸化酵素を発現し得るベク
ターである。
プロモータ下流にＬ−グロノラクトン酸化酵素をコード
するDNAが正しい方向で配置されており、従ってこのベ
クターはＬ−グロノラクトン酸化酵素を発現し得るベク
ターである。
製造例３（形質転換宿主細胞の調製） マウスLKT-細胞をダルベッコ改良イーグル培地で培養
させた後に、60mm径のペトリ皿１枚当り1.5x106個の細
胞を入れた。
させた後に、60mm径のペトリ皿１枚当り1.5x106個の細
胞を入れた。
一方、50mM HEPES（pH7.1）、280mM NaCl及び15mM Na
2HPO4からなる溶液1.25mlに５μｇのプラスミドpKSVGO
（前記の製造例２において最終的に得られた遺伝子組換
えベクター）、2.5μｇのチミジンキナーゼ遺伝子及び
５μｇのサケ***DNA溶液1.1mlと2M CaCl2溶液0.15mlと
を混合し、室温で30分間放置して処理液を調製しておい
た。
2HPO4からなる溶液1.25mlに５μｇのプラスミドpKSVGO
（前記の製造例２において最終的に得られた遺伝子組換
えベクター）、2.5μｇのチミジンキナーゼ遺伝子及び
５μｇのサケ***DNA溶液1.1mlと2M CaCl2溶液0.15mlと
を混合し、室温で30分間放置して処理液を調製しておい
た。
この処理液0.5mlの上記の細胞収容ペトリ皿に添加
し、室温で30分間放置した後にダルベッコ改良イーグル
培地5mlを添加し、５％ CO2、37℃の条件下に５時間培
養を行った。ダルベッコ改良イーグル培地を交換後更に
24時間培養し、次いでヒポキサンチン（15μg/ml）、ア
ミノプテリン（１μg/ml）及びチミジン（５μg/ml）を
含有するHAT培地に培地を交換して培養を継続する。２
−４週間後に形成された細胞集落を分離して所望の形質
転換宿主細胞を得た。
し、室温で30分間放置した後にダルベッコ改良イーグル
培地5mlを添加し、５％ CO2、37℃の条件下に５時間培
養を行った。ダルベッコ改良イーグル培地を交換後更に
24時間培養し、次いでヒポキサンチン（15μg/ml）、ア
ミノプテリン（１μg/ml）及びチミジン（５μg/ml）を
含有するHAT培地に培地を交換して培養を継続する。２
−４週間後に形成された細胞集落を分離して所望の形質
転換宿主細胞を得た。
参考例２（Ｌ−グロノラクトン酸化酵素の製造） 製造例３により得られた形質転換宿主細胞をダルベッ
コ改良イーグル培地で培養することにより増殖させ、そ
の培養上清及び培養細胞を回収した。この培養上清につ
いては、これを直接にカラムクロマトグラフィーにか
け、又培養細胞については１％ Triton X−100溶液に懸
濁させた後にカラムクロマトグラフィーにかけることに
より、Ｌ−グロノラクトン酸化酵素を分離精製した。
コ改良イーグル培地で培養することにより増殖させ、そ
の培養上清及び培養細胞を回収した。この培養上清につ
いては、これを直接にカラムクロマトグラフィーにか
け、又培養細胞については１％ Triton X−100溶液に懸
濁させた後にカラムクロマトグラフィーにかけることに
より、Ｌ−グロノラクトン酸化酵素を分離精製した。
尚、本参考例では、参考例１において言及したように
ラット肝臓起源のＬ−グロノラクトン酸化酵素を原料と
して調製され且つ製造例１のｃ）項で言及した、λファ
ージDNAを制限酵素EcoR Iで切断することにより調製さ
れたＬ−グロノラクトン酸化酵素のクローン化遺伝子DN
Aが宿主細胞のプラスミドに組込まれているために、こ
の宿主細胞がＬ−グロノラクトン酸化酵素を産生してい
るが、ラット肝臓起源の配列とアミノ酸配列は等しいが
塩基配列が異なる、少なくとも一部が合成されたＬ−グ
ロノラクトン酸化酵素のクローン化DNAが宿主細胞のプ
ラスミドに組込まれていれば、宿主細胞はラット肝臓由
来のＬ−グロノラクトン酸化酵素ではなく、この酵素に
類する物質を産生することになる。
ラット肝臓起源のＬ−グロノラクトン酸化酵素を原料と
して調製され且つ製造例１のｃ）項で言及した、λファ
ージDNAを制限酵素EcoR Iで切断することにより調製さ
れたＬ−グロノラクトン酸化酵素のクローン化遺伝子DN
Aが宿主細胞のプラスミドに組込まれているために、こ
の宿主細胞がＬ−グロノラクトン酸化酵素を産生してい
るが、ラット肝臓起源の配列とアミノ酸配列は等しいが
塩基配列が異なる、少なくとも一部が合成されたＬ−グ
ロノラクトン酸化酵素のクローン化DNAが宿主細胞のプ
ラスミドに組込まれていれば、宿主細胞はラット肝臓由
来のＬ−グロノラクトン酸化酵素ではなく、この酵素に
類する物質を産生することになる。
試験例１（制限酵素地図の作成） 製造例１のｃ）項で言及の、制限酵素EcoR Iで切断し
たλファージ（λgt11）のcDNA挿入部（インサート）断
片をアガロースゲル電気泳動により分画し、相当する部
分のゲルを切出し、これよりDNA断片を抽出した。このD
NA断片と、EcoR Iで切断したプラスミドpUC19とをDNAラ
イゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いてライ
ゲーションした。得られた組換えプラスミドを用い、製
造例３と同様にして、但し宿主細胞としてのEscherichi
a coli JM109の形質転換を行い、形質転換宿主細胞を
得た。この宿主細胞を培養し、アルカリ−SDSライセー
ト法（前出のManiatis,T.等の方法）によりプラスミドD
NAを調製した。得られたプラスミドDNA（インサートDNA
を含む）を各種の制限酵素で切断し、DNA断片の長さを
アガロースゲル電気泳動により調べて制限酵素地図を作
成した結果、このプラスミドDNAは第１図に示される通
りの制限酵素認識部位を有していることは判明した。
たλファージ（λgt11）のcDNA挿入部（インサート）断
片をアガロースゲル電気泳動により分画し、相当する部
分のゲルを切出し、これよりDNA断片を抽出した。このD
NA断片と、EcoR Iで切断したプラスミドpUC19とをDNAラ
イゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いてライ
ゲーションした。得られた組換えプラスミドを用い、製
造例３と同様にして、但し宿主細胞としてのEscherichi
a coli JM109の形質転換を行い、形質転換宿主細胞を
得た。この宿主細胞を培養し、アルカリ−SDSライセー
ト法（前出のManiatis,T.等の方法）によりプラスミドD
NAを調製した。得られたプラスミドDNA（インサートDNA
を含む）を各種の制限酵素で切断し、DNA断片の長さを
アガロースゲル電気泳動により調べて制限酵素地図を作
成した結果、このプラスミドDNAは第１図に示される通
りの制限酵素認識部位を有していることは判明した。
試験例２（プラスミドDNAの塩基配列の決定とＬ−グロ
ノラクトン酸化酵素部分のアミノ酸配列決定） 試験例１で言及したプラスミドDNAを制限酵素EcoR I
により切断して得た断片をファージM13 mp18にサブクロ
ーニングし、得られた遺伝子組換えベクターによりEsch
erichia coli JM109を形質転換させた。得られた形質
転換体のプラスミドを制限酵素EcoR Iで切断し、その内
で約1.3kbのインサートDNAを有するものについては、上
記ファージのRF DNAを調製し、キロシークェンス用デレ
ーションキット（宝酒造株式会社製）を用い且つエクソ
ヌクレアーゼIIIとマングビーンヌクレアーゼを用いる
方法［Henikoff,S.“Gene"第28巻第351−359頁（1984
年）及びYanisch−Perron,C.等“Gene"第33巻第103−11
9頁（1985年）］によりデレーションミュータントを作
成した。
ノラクトン酸化酵素部分のアミノ酸配列決定） 試験例１で言及したプラスミドDNAを制限酵素EcoR I
により切断して得た断片をファージM13 mp18にサブクロ
ーニングし、得られた遺伝子組換えベクターによりEsch
erichia coli JM109を形質転換させた。得られた形質
転換体のプラスミドを制限酵素EcoR Iで切断し、その内
で約1.3kbのインサートDNAを有するものについては、上
記ファージのRF DNAを調製し、キロシークェンス用デレ
ーションキット（宝酒造株式会社製）を用い且つエクソ
ヌクレアーゼIIIとマングビーンヌクレアーゼを用いる
方法［Henikoff,S.“Gene"第28巻第351−359頁（1984
年）及びYanisch−Perron,C.等“Gene"第33巻第103−11
9頁（1985年）］によりデレーションミュータントを作
成した。
一方、各種の制限酵素を用いて、DNAのEcoR I切断断
片を更に切断して種々の領域長さを有する断片となし、
この各断片をそれぞれファージM13 mp18にサブクローニ
ングした。
片を更に切断して種々の領域長さを有する断片となし、
この各断片をそれぞれファージM13 mp18にサブクローニ
ングした。
上記のデレーションミュータント及びサブクローンの
DNA断片について、それぞれジデオキシ−チェインター
ミネータ法［Sanger,F.“Science"第214巻第1205−1210
頁（1981年）］の改良法［Mizusawa,S.等“Nucleic Aci
ds Res."第14巻第1319−1324頁（1986年）］に準じて塩
基配列の決定を行った。結果は第１図に示されている通
りであり、この図において、点線矢印はデレーションミ
ュータントのDNA断片に関する塩基配列の決定方向と領
域とを示し、実線矢印はサブクローンのDNA断片に関す
る塩基配列の決定方向と領域とを示している。
DNA断片について、それぞれジデオキシ−チェインター
ミネータ法［Sanger,F.“Science"第214巻第1205−1210
頁（1981年）］の改良法［Mizusawa,S.等“Nucleic Aci
ds Res."第14巻第1319−1324頁（1986年）］に準じて塩
基配列の決定を行った。結果は第１図に示されている通
りであり、この図において、点線矢印はデレーションミ
ュータントのDNA断片に関する塩基配列の決定方向と領
域とを示し、実線矢印はサブクローンのDNA断片に関す
る塩基配列の決定方向と領域とを示している。
各断片について決定された塩基配列を繋ぎ合わせるこ
とにより最終的に決定された塩基配列は第２図に示され
ている通りであり、2120bpの領域長さを有していた。こ
の塩基配列において、塩基番号４番から1320番迄の領域
がＬ−グロノラクトン酸化酵素をコードする領域であっ
て、開始コドンであるATGから始まり、終止コドンであ
るTAAにより終了するオープンリーディングフレーム内
に存在し、アミノ酸数は439個であった。このクローン
化DNAのＮ末端における塩基配列が指定するアミノ酸配
列（第２図においてアンダーラインの付されているアミ
ノ酸配列部分）は、ラットＬ−グロノラクトン酸化酵素
のＮ末端アミノ酸配列（参考例１における解析結果）と
一致するので、このクローン化DNA塩基配列はラットＬ
−グロノラクトン酸化酵素のものと同定された。
とにより最終的に決定された塩基配列は第２図に示され
ている通りであり、2120bpの領域長さを有していた。こ
の塩基配列において、塩基番号４番から1320番迄の領域
がＬ−グロノラクトン酸化酵素をコードする領域であっ
て、開始コドンであるATGから始まり、終止コドンであ
るTAAにより終了するオープンリーディングフレーム内
に存在し、アミノ酸数は439個であった。このクローン
化DNAのＮ末端における塩基配列が指定するアミノ酸配
列（第２図においてアンダーラインの付されているアミ
ノ酸配列部分）は、ラットＬ−グロノラクトン酸化酵素
のＮ末端アミノ酸配列（参考例１における解析結果）と
一致するので、このクローン化DNA塩基配列はラットＬ
−グロノラクトン酸化酵素のものと同定された。
（発明の効果） 本発明によりラット由来のＬ−グロノラクトン酸化酵
素もクローン化DNA、該クローン化DNAの組込まれた発現
ベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞
が提供される。
素もクローン化DNA、該クローン化DNAの組込まれた発現
ベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞
が提供される。
従って、この形質転換細胞を培養すればＬ−グロノラ
クトン酸化酵素を容易に且つ大量に産生させることがで
きる。尚、アミノ酸配列が判明したために、ラットＬ−
グロノラクトン酸化酵素とアミノ酸配列が共通であり且
つ塩基配列が異なる種々のDNAも作成でき、これらのDNA
を用いてラットＬ−グロノラクトン酸化酵素と同様の作
用を示す種々の物質を製造することができる。
クトン酸化酵素を容易に且つ大量に産生させることがで
きる。尚、アミノ酸配列が判明したために、ラットＬ−
グロノラクトン酸化酵素とアミノ酸配列が共通であり且
つ塩基配列が異なる種々のDNAも作成でき、これらのDNA
を用いてラットＬ−グロノラクトン酸化酵素と同様の作
用を示す種々の物質を製造することができる。
更に、上記の産生されたＬ−グロノラクトン酸化酵素
をＬ−グロノラクトンに対して作用させれば、極めて容
易にアスコルビン酸（ビタミンＣ）が生成するので、本
発明はアスコルビン酸の製造を飛躍的に容易にする。
をＬ−グロノラクトンに対して作用させれば、極めて容
易にアスコルビン酸（ビタミンＣ）が生成するので、本
発明はアスコルビン酸の製造を飛躍的に容易にする。
第１図はラットＬ−グロノラクトン酸化酵素のアミノ酸
配列をコードしている塩基配列を包含する、本発明によ
りクローン化されたDNA領域並びに該領域の塩基配列決
定のために用いられた制限酵素と、塩基配列決定のため
のストラテジーとを示す図面、第２図は第１図に示され
ているクローン化DNA領域内においてオープンリーディ
ングフレームを構成する塩基配列及びアミノ酸配列を示
す図面である。
配列をコードしている塩基配列を包含する、本発明によ
りクローン化されたDNA領域並びに該領域の塩基配列決
定のために用いられた制限酵素と、塩基配列決定のため
のストラテジーとを示す図面、第２図は第１図に示され
ているクローン化DNA領域内においてオープンリーディ
ングフレームを構成する塩基配列及びアミノ酸配列を示
す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】ラットＬ−グロノラクトン酸化酵素のアミ
ノ酸配列である をコードしていることを特徴とする、クローン化DNA。 - 【請求項２】式 （式中においてＡ、Ｃ、Ｇ及びＴはそれぞれアデニン、
シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリ
ボヌクレオチドを意味し、上記の式はアミノ酸に対応す
るコドン毎の配列として示されている） にて示されるヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列
が指定するアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指定す
る他のヌクレオチド配列を有していることを特徴とす
る、特許請求の範囲第１項に記載のクローン化DNA。 - 【請求項３】式 （式中においてＡ、Ｃ、Ｇ及びＴはそれぞれアデニン、
シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリ
ボヌクレオチドを意味し、上記の式はアミノ酸に対応す
るコドン毎の配列として示されている） にて示されるヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列
が指定するアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指定す
る他のヌクレオチド配列を有しているクローン化DNAの
組込まれていることを特徴とする、遺伝子組換えベクタ
ー。 - 【請求項４】ベクターが宿主細胞内で該ベクターに組込
まれたDNAのコードしている蛋白質を発現する発現ベク
ターであることを特徴とする、特許請求の範囲第３項に
記載の遺伝子組換えベクター。 - 【請求項５】式 （式中においてＡ、Ｃ、Ｇ及びＴはそれぞれアデニン、
シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリ
ボヌクレオチドを意味し、上記の式はアミノ酸に対応す
るコドン毎の配列として示されている） にて示されるヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列
が指定するアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指定す
る他のヌクレオチド配列を有しているクローン化DNAの
組込まれた遺伝子組換えベクターにより形質転換されて
いる大腸菌又は動物細胞であることを特徴とする。宿主
細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62247896A JP2602435B2 (ja) | 1987-10-02 | 1987-10-02 | Ｌ―グロノラクトン酸化酵素のクローン化ｄｎａ、該クローン化ｄｎａの組込まれた遺伝子組換えベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62247896A JP2602435B2 (ja) | 1987-10-02 | 1987-10-02 | Ｌ―グロノラクトン酸化酵素のクローン化ｄｎａ、該クローン化ｄｎａの組込まれた遺伝子組換えベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0191785A JPH0191785A (ja) | 1989-04-11 |
| JP2602435B2 true JP2602435B2 (ja) | 1997-04-23 |
Family
ID=17170178
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62247896A Expired - Lifetime JP2602435B2 (ja) | 1987-10-02 | 1987-10-02 | Ｌ―グロノラクトン酸化酵素のクローン化ｄｎａ、該クローン化ｄｎａの組込まれた遺伝子組換えベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2602435B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19604798A1 (de) * | 1996-02-09 | 1997-08-14 | Herbstreith & Fox Kg Pektin Fa | Herstellung von L-Ascorbinsäure |
| AU7765398A (en) * | 1997-05-07 | 1998-11-27 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Production of ascorbic acid in plants |
-
1987
- 1987-10-02 JP JP62247896A patent/JP2602435B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0191785A (ja) | 1989-04-11 |
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