JP2602435B2 - Cloned DNA of L-Glonolactone Oxidase, Genetically Modified Vector Incorporating the Cloned DNA, and Host Cell Transformed by the Vector - Google Patents
Cloned DNA of L-Glonolactone Oxidase, Genetically Modified Vector Incorporating the Cloned DNA, and Host Cell Transformed by the VectorInfo
- Publication number
- JP2602435B2 JP2602435B2 JP62247896A JP24789687A JP2602435B2 JP 2602435 B2 JP2602435 B2 JP 2602435B2 JP 62247896 A JP62247896 A JP 62247896A JP 24789687 A JP24789687 A JP 24789687A JP 2602435 B2 JP2602435 B2 JP 2602435B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- vector
- cloned dna
- oxidase
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明はL−グロノラクトン酸化酵素のクローン化DN
A、該クローン化DNAの組込まれた遺伝子組換えベクター
及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞に係り、
L−グロノラクトン酸化酵素、延いてはアスコルビン
酸、即ちビタミンCの大量生産に利用される。The present invention relates to a cloned DN of L-gulolactone oxidase.
A, relating to a recombinant vector incorporating the cloned DNA and a host cell transformed with the vector,
It is used for mass production of L-gulolactone oxidase, and eventually ascorbic acid, that is, vitamin C.
(従来の技術) L−グロノラクトン酸化酵素は、高等動物の肝臓及び
腎臓のミクロゾーム画分に局在している分子量51000の
フラビン酵素であって、生体内におけるL−アスコルビ
ン酸(ビタミンC)合成経路の最終段階で触媒作用を行
う物質である。即ち、この酵素はL−グロノラクトンを
基質として酸化反応を行ってL−キシロ−ヘキスロラク
トンを合成し、このL−キシロ−ヘキスロラクトンが引
続き異性化を受けてL−アスコルビン酸となるのであ
る。尚、このL−グロノラクトン酸化酵素は膜に結合し
た蛋白であり、その精製は容易ではなく、又その蛋白構
造や遺伝子と性質は未だ明らかになされていない。(Prior Art) L-Gulonolactone oxidase is a flavin enzyme having a molecular weight of 51,000, which is localized in the microsomal fraction of liver and kidney of higher animals, and is an L-ascorbic acid (vitamin C) synthesis pathway in vivo. Is a substance that acts as a catalyst in the final stage of That is, this enzyme performs an oxidation reaction using L-gulonolactone as a substrate to synthesize L-xylo-hexulolactone, and this L-xylo-hexulolactone is subsequently isomerized to L-ascorbic acid. . This L-gulonolactone oxidase is a protein bound to a membrane, its purification is not easy, and its protein structure, gene and properties have not been clarified yet.
一方、アスコルビン酸は副作用を有しないビタミンで
あり、健康維持のためには、その接種の重要なことが判
明している。従って、アルコルビン酸は食品や飲料等に
おける添加物として大量の需要がある。更に、アルコル
ビン酸は還元力が強く、従って抗酸化剤としての需要も
高い。On the other hand, ascorbic acid is a vitamin having no side effects, and it has been found that inoculation thereof is important for maintaining health. Therefore, there is a great demand for ascorbic acid as an additive in foods and beverages. Further, ascorbic acid has a strong reducing power, and therefore is in high demand as an antioxidant.
このアスコルビン酸を製造するために、従来では高圧
水素添加によりブドウ糖をd−ソルビトールに変じ、こ
れを発酵させてd−ソルボースになし、アセトンと濃硫
酸とでヒドロキシ基を保護した後に過マンガン酸カリウ
ムで酸化し、次にアルコール性塩酸で処理してアセトン
の除去とエステル化を同時に行い、その後にナトリウム
アルコラートで処理することにより製造されてきた。
尚、近年では、所謂「バイオテクノロジー」を利用する
アスコルビン酸の製法も提案されており(特開昭60−70
073公報)、この方法によればコリネバクテリウムから
2,5−ジケト−D−グルコナート還元酵素の遺伝子を取
出し、この遺伝子をプラスミドに組込み、この遺伝子組
換えプラスミドをEruinia herbicolaに取込ませ、得ら
れた形質転換菌によりD−グルコースを直接的に2,5−
ジケトグルコン酸に変じ、酸又は塩基触媒の存在下に該
中間体を環化反応させてアスコルビン酸となしている。Conventionally, in order to produce this ascorbic acid, glucose is converted into d-sorbitol by high-pressure hydrogenation, fermented into d-sorbose, protected with acetone and concentrated sulfuric acid to protect hydroxy groups, and then potassium permanganate. And then treated with alcoholic hydrochloric acid to simultaneously remove acetone and esterify, followed by treatment with sodium alcoholate.
In recent years, a method for producing ascorbic acid using so-called "biotechnology" has also been proposed (Japanese Patent Laid-Open No. 60-70).
073 publication), according to this method, from Corynebacterium
The gene of 2,5-diketo-D-gluconate reductase is taken out, this gene is integrated into a plasmid, this transgenic plasmid is taken up into Eruinia herbicola , and D-glucose is directly transferred to the resulting transformant. 2,5-
The intermediate is converted to diketogluconic acid, and the intermediate is cyclized in the presence of an acid or base catalyst to form ascorbic acid.
(発明が解決しようとする課題及び発明の目的) アスコルビン酸は、その有用性を考慮する場合に、今
後需要が拡大することはあっても、減少するものとは考
えられず、従ってアルコルビン酸の有利な製法を開発す
ることは極めて重要である。(Problems to be Solved by the Invention and Object of the Invention) Ascorbic acid is not expected to decrease in the future even if its usefulness is considered. It is very important to develop an advantageous process.
ブドウ糖等の糖類を原料とする汎用の方法は醗酵法と
合成法とを併用するものであり、合成工程数も比較的多
く、最適な方法とは必ずしも云えない。一方、特開昭60
−70073公報に開示されている方法に従ってアスコルビ
ン酸を製造するには、形質転換菌による2,5−ジケトグ
ルコン酸の産生に際して菌を適切に管理する必要性があ
り、又目的物質であるアスコルビン酸を得るためには産
生した2,5−ジケトグルコン酸を菌体から分離した後に
環化反応に付さねばならない。A general-purpose method using a saccharide such as glucose as a raw material uses a combination of a fermentation method and a synthesis method, and the number of synthesis steps is relatively large. On the other hand, JP
In order to produce ascorbic acid in accordance with the method disclosed in JP-A-70073, it is necessary to appropriately control the bacterium during production of 2,5-diketogluconic acid by the transformed bacterium. To obtain it, the produced 2,5-diketogluconic acid must be separated from the cells and then subjected to a cyclization reaction.
従って、本発明の背景となっている課題は、特開昭60
−70073公報に開示されている方法と同様にバイオテク
ノロジーを利用するものであるが、該公報に記載の方法
とは別の観点からアスコルビン酸の製法にアプローチす
ることにある。Therefore, the problem behind the present invention is disclosed in
This method utilizes biotechnology in the same manner as the method disclosed in Japanese Patent Publication No. -70073, but is to approach the method for producing ascorbic acid from a different viewpoint from the method described in the publication.
そこで、本発明者等はL−グロノラクトン酸化酵素に
着目した。蓋しL−グロノラクトン酸化酵素を用いれ
ば、その基質であるL−グロノラクトンと適当な条件下
で混和するだけでアスコルビン酸が生成するからであ
る。しかしながら、ここで留意すべきことは、L−グロ
ノラクトン酸化酵素が、既述のように、高等動物の肝臓
や腎臓に局在するのみであり、大量入手が困難であり且
つ膜蛋白であるために精製が困難なことである。Therefore, the present inventors have focused on L-gulolactone oxidase. This is because if the cap is used and L-gulolactone oxidase is used, ascorbic acid is produced only by mixing with L-gulonolactone as a substrate under appropriate conditions. However, what should be noted here is that L-gulolactone oxidase is localized only in the liver and kidney of higher animals, as described above, is difficult to obtain in large quantities, and is a membrane protein. It is difficult to purify.
従って、本発明の本質的な目的は高純度のL−グロノ
ラクトン酸化酵素を大量に且つ比較的容易に生産する途
を開き、アスコルビン酸の大量生産を可能にすることに
あり、その第1の目的はL−グロノラクトン酸化酵素の
クローン化DNAを提供することにある。Accordingly, an essential object of the present invention is to open the way to produce high-purity L-gulonolactone oxidase in large quantities and relatively easily, and to enable mass production of ascorbic acid. Is to provide a cloned DNA of L-gulonolactone oxidase.
本発明の第2の目的は、L−グロノラクトン酸化酵素
のクローン化DNAが組込まれた遺伝子組換えベクターを
提供することにある。A second object of the present invention is to provide a recombinant vector into which a cloned DNA of L-gulolactone oxidase has been incorporated.
本発明の第3の目的は、上記の遺伝子組換えベクター
により形質転換された宿主細胞を提供することにある。A third object of the present invention is to provide a host cell transformed with the above-mentioned gene recombinant vector.
(課題を解決し、目的を達成する手段及び作用) 本発明によれば、上記の第1の目的は、ラットL−グ
ロノラクトン酸化酵素のアミノ酸配列である をコードしているクローン化DNAにより達成される。(Means for Solving the Problems and Achieving the Object) According to the present invention, the first object is an amino acid sequence of rat L-gulolactone oxidase. Is achieved by the cloned DNA encoding
上記第2の目的は、式 (式中においてA、C、G及びTはそれぞれアデニン、
シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリ
ボヌクレオチドを意味し、上記の式はアミノ酸に対応す
るコドン毎の配列として示されている) にて示されるヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列
が指定するアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指定す
る他のヌクレオチド配列を有するクローン化DNAが組込
まれている遺伝子組換えベクターにより達成される。The second object is to use the formula (Where A, C, G and T are adenine,
Means the deoxyribonucleotide having cytosine, guanine and thymine bases, and the above formula is shown as a sequence for each codon corresponding to the amino acid) or the same as the amino acid sequence designated by the nucleotide sequence. This is achieved by a recombinant vector into which a cloned DNA having another nucleotide sequence specifying the amino acid sequence has been integrated.
上記の第3の目的は、上記の遺伝子組換えベクターに
より形質転換されている宿主大腸菌により達成される。The third object is achieved by a host Escherichia coli which has been transformed with the above-described genetic recombinant vector.
付言すれば、既述の特定のアミノ酸配列を有している
L−グロノラクトン酸化酵素は、基本的には、 a)ラット肝臓由来のL−グロノラクトン酸化酵素を自
体公知の方法で精製して高純度なものとなし、この精製
酵素をウサギに免疫させて抗血清を得る工程と、 b)ラット肝臓のmRNAから作成された市販のλgt11ファ
ージのcDNA発現ライブラリを用い、このファージをEsch
erichia coli Y1090(r-)に感染させて培養し、イソ
プロピル−β−D−チオガラクトピラノシドにより融合
蛋白を誘導させ、上記の抗血清を用いて該融合蛋白を酵
素免疫法により検出してスクリーニングすることにより
L−グロノラクトン酸化酵素をコードしているクローン
化DNAの組込まれたλファージを得て、これを培養する
工程と、 c)このλファージを制限酵素Bcl I及びSph Iで切断
し、このDNA断片の両端にBgl IIリンカーを付加してイ
ンサートDNAとなす工程と、 d)プラスミドベクターを制限酵素Bgl IIで切断し、そ
の断点に上記のインサートDNAを接合することにより遺
伝子組換えベクターとして上記のプラスミドを再構築す
る工程と、 e)この遺伝子組換えベクターを大腸菌又は動物細胞取
込ませて形質転換を行う工程と、 f)得られた形質転換体を培養してL−グロノラクトン
酸化酵素を産生させる工程と、 g)産生されたL−グロノラクトン酸化酵素を分離・精
製する工程 とを具備している方法により製造することができる。In addition, L-gulolactone oxidase having the above-mentioned specific amino acid sequence is basically obtained by a) purifying L-gulolactone oxidase derived from rat liver by a method known per se to obtain high purity things without and, using this a step of the purified enzyme obtained antiserum by immunizing a rabbit, b) a commercially available λgt11 phage cDNA expression library made from rat liver mRNA, Esch the phage
erichia coli Y1090 (r -) were infected cultured, to induce fusion protein by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, and the fusion protein using antisera described above was detected by enzyme immunoassay Screening to obtain a λ phage into which the cloned DNA encoding L-gulonolactone oxidase has been integrated, and culturing the λ phage; c) cleaving the λ phage with restriction enzymes Bcl I and Sph I; A step of adding Bgl II linkers to both ends of this DNA fragment to form an insert DNA; and d) cutting the plasmid vector with the restriction enzyme Bgl II, and joining the insert DNA to the break to perform gene recombination. Reconstructing the above plasmid as a vector; e) transforming the transgenic vector into Escherichia coli or animal cells; and f) transforming the resulting plasmid. A step of producing a cultured L- gulonolactone oxidase the recombinants, g) can be prepared by methods produced are L- gulonolactone oxidase has and a step of separating and purifying.
(実施例等) 次に、参考例、製造例及び試験例により本発明を更に
詳細に説明する。(Examples, etc.) Next, the present invention will be described in more detail with reference examples, production examples, and test examples.
参考例1(L−グロノラクトン酸化酵素のN−末端アミ
ノ酸配列の決定) ラット肝臓由来のL−グロノラクトン酸化酵素を自体
公知の方法[Nishikimi,M.等“Arch.Biochem.Biophy
s."」第175巻第427−435頁(1976年)]により精製して
高純度なものとなした。この精製L−グロノラクトン酸
化酵素100μgをエドマン分解し、気相プロテインシー
クェンサー(Applied Biosystems社製のモデル470A)に
よりN末端部分のアミノ酸配列を解析した結果は下記と
通りであった。Reference Example 1 (Determination of N-terminal amino acid sequence of L-gulonolactone oxidase) L-gulonolactone oxidase derived from rat liver was prepared by a method known per se [Nishikimi, M. et al., "Arch. Biochem. Biophyl.
175: 427-435 (1976)] to obtain high purity. The purified L-gulolactone oxidase (100 μg) was subjected to Edman degradation, and the amino acid sequence of the N-terminal portion was analyzed using a gas-phase protein sequencer (Model 470A manufactured by Applied Biosystems) as follows.
Val−His−Gly−Tyr−Lys−Gly−Val−Gln−Phe−Gln−
Asn−Trp−Ala−Lys−Thr−Tyr−Gly−Cys−Ser−Pro−
Glu−Val−Tyr−Tyr−Gln−Pro−Thr−Ser−Val−Glu−
Glu−Val−Arg 製造例1(L−グロノラクトン酸化酵素を含むクローン
化DNAの調製) a)抗L−グロノラクトン酸化酵素抗血清の調製 参考例1に記載の方法により得たラット由来の高純度
L−グロノラクトン酸化酵素をウサギに対して免疫させ
ることにより抗血清を得た。Val-His-Gly-Tyr-Lys-Gly-Val-Gln-Phe-Gln-
Asn-Trp-Ala-Lys-Thr-Tyr-Gly-Cys-Ser-Pro-
Glu-Val-Tyr-Tyr-Gln-Pro-Thr-Ser-Val-Glu-
Glu-Val-Arg Production Example 1 (Preparation of cloned DNA containing L-gulonolactone oxidase) a) Preparation of anti-L-gulonolactone oxidase antiserum High-purity L from rat obtained by the method described in Reference Example 1 -Antiserum was obtained by immunizing rabbits with glonolactone oxidase.
b)cDNAライブラリによるスクリーニング ラット肝臓のmRNAを用いて作成された、市販のλgt11
ファージのcDNA発現ライブラリ(Clontec Laboratories
社製)を利用し且つ上記の抗血清を用いた酵素免疫法に
よりL−グロノラクトン酸化酵素のクローンをスクリー
ニングした。b) Screening with cDNA library Commercially available λgt11 prepared using rat liver mRNA
Phage cDNA Expression Library (Clontec Laboratories
L-Glonolactone oxidase clone was screened by the enzyme immunization method using the above-mentioned antiserum using the above-mentioned antiserum.
即ち、λgt11ファージをEscherichia coli Y1090(r
-)に感染させ、これを軟寒天培地と混合した後にLB寒
天培地(アンピシリン100μgを含有)上に広げ固化さ
せた。これを42℃で3時間培養してプラークを形成させ
た後に、10mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピ
ラノシド(IPTG)溶液を染み込ませたニトロセルロース
フィルターをプラークの上に載置して37℃で2時間培養
し、IPTGにより誘導された融合蛋白をフィルターに吸着
させた。このフィルターをTBST(50mM Tris−HCl,pH7.
9,150mM NaCl,0.05% Tween−20)で軽く洗浄し、20%
牛胎児血清含有TBSTを30分間作用させた。That is, the λgt11 phage was transformed into Escherichia coli Y1090 (r
- ), Mixed with a soft agar medium, spread on an LB agar medium (containing 100 μg of ampicillin) and solidified. This was cultured at 42 ° C. for 3 hours to form a plaque, and a nitrocellulose filter impregnated with 10 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) solution was placed on the plaque. After culturing at 37 ° C for 2 hours, the fusion protein induced by IPTG was adsorbed to the filter. This filter was washed with TBST (50 mM Tris-HCl, pH7.
Wash gently with 9,150mM NaCl, 0.05% Tween-20), 20%
TBST containing fetal calf serum was allowed to act for 30 minutes.
これに、前記のa)項に記載の抗L−グロノラクトン
酸化酵素抗血清を1000倍に稀釈させたTBSTを16時間作用
させた。次いで、フィルターをTBSTで充分に洗浄した後
に、ホースラディシュ由来のペルオキシダーゼにて標識
を施したヤギ抗ウサギIgG(Bio−Rad社製)を3000倍に
稀釈させたTBSTを2時間作用させた。TBSTからTween−2
0を除去した溶液でフィルターを充分に洗浄した後に、
過酸化水素と4−クロロ−1−ナフトールを基質として
発色させることによりポジティブクローンを検出した。
ポジティブクローンについて同様のスクリーニングを繰
り返して単一のクローンに純化させた。ファージはLB培
地で液体培養した後にポリエチレングリコールによる沈
殿法[Maniatis,T.等“Molecular Cloning"A Laborator
y Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1
982)]に従って調製された。This was allowed to act for 16 hours with TBST prepared by diluting the anti-L-gulolactone oxidase antiserum described in the above section a) 1000 times. Next, after the filter was sufficiently washed with TBST, TBST diluted 3000-fold with goat anti-rabbit IgG (manufactured by Bio-Rad) labeled with peroxidase derived from horseradish was allowed to act for 2 hours. TBST to Tween-2
After thoroughly washing the filter with the solution from which 0 has been removed,
Positive clones were detected by developing color using hydrogen peroxide and 4-chloro-1-naphthol as substrates.
The same screening was repeated for positive clones to purify them into single clones. The phage were subjected to liquid culture in an LB medium and then precipitated by polyethylene glycol [Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning" A Laborator.
y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1
982)].
c)クローン化DNAの調製 上記b)項で得られたλファージDNAを制限酵素EcoR
Iで切断すれば、L−グロノラクトン酸化酵素のアミノ
酸配列をコードしている塩基配列を包含する所望のクロ
ーン化DNAが得られる。c) Preparation of cloned DNA The λ phage DNA obtained in b) above was subjected to restriction enzyme EcoR.
Cleavage with I yields the desired cloned DNA containing the base sequence encoding the amino acid sequence of L-gulolactone oxidase.
尚、このクローン化DNAに自体公知の適宜の制限酵素
を作用させて切断すれば、種々の鎖長を有するクローン
化DNA断片が得られ、これらの断片た各種の研究用に供
することができる。When the cloned DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme known per se, cloned DNA fragments having various chain lengths can be obtained, and these fragments can be used for various studies.
製造例2(遺伝子組換えベクターの調製) 上記製造例1のc)項で得たL−グロノラクトン酸化
酵素をコードしているクローン化DNAの組込まれたλgt1
1ファージに、蛋白をコードする領域を切断しない制限
酵素であるBcl I及びSph Iを作用させて切断した後に、
このDNA断片をアガロースゲル電気泳動により回収し
た。大腸菌DNAポリメラーゼ(クレノウ フラグメン
ト)と各50μMのdNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)を含有
する67mM燐酸カリウム(pH7.4)、6.7mM MgCl2、1mM 2
−メルカプトエタノール溶液を上記のDNA断片に作用さ
せることにより断片の末端を平滑になした。Production Example 2 (Preparation of Genetically Modified Vector) λgt1 into which cloned DNA encoding L-gulonolactone oxidase obtained in the above Production Example 1 section c) was incorporated.
After the phage is cleaved by the action of Bcl I and Sph I, which are restriction enzymes that do not cut the protein-coding region,
This DNA fragment was recovered by agarose gel electrophoresis. 67 mM potassium phosphate (pH 7.4), 6.7 mM MgCl 2 , 1 mM 2 containing E. coli DNA polymerase (Klenow fragment) and 50 μM each of dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
-The end of the fragment was made blunt by applying a mercaptoethanol solution to the above DNA fragment.
次いで、このDNA断片の両端に、DNAライゲーションキ
ット(宝酒造株式会社製)を用いて、Bgl IIリンカーを
付加した後に、アガロースゲル電気泳動によりBgl IIリ
ンカー付加DNAを回収した。Next, a Bgl II linker was added to both ends of the DNA fragment using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and the Bgl II linker-added DNA was recovered by agarose gel electrophoresis.
一方、プラスミドpKSV−10(ファルマシア・ジャパン
株式会社製)をBgl IIで切断し、その断点に上記のBgl
IIリンカー付加DNAを結合させた。On the other hand, plasmid pKSV-10 (manufactured by Pharmacia Japan Co., Ltd.) was digested with Bgl II.
II linker-added DNA was bound.
得られたベクターを大腸菌に取込ませて大腸菌の形質
転換を行い、その形質転換体からアンピシリン耐性菌を
選択し、この菌からプラスミドを取出すことにより所望
の遺伝子組換えベクターを得た。Escherichia coli was transformed with the obtained vector to transform Escherichia coli, ampicillin-resistant bacteria were selected from the transformants, and a plasmid was removed from the bacteria to obtain a desired genetically modified vector.
この遺伝子組換えベクターにおいてはpKSV−10のSV40
プロモータ下流にL−グロノラクトン酸化酵素をコード
するDNAが正しい方向で配置されており、従ってこのベ
クターはL−グロノラクトン酸化酵素を発現し得るベク
ターである。In this recombinant vector, SV40 of pKSV-10 was used.
DNA encoding L-gulolactone oxidase is arranged in the correct direction downstream of the promoter, and therefore, this vector is a vector capable of expressing L-gulonolactone oxidase.
製造例3(形質転換宿主細胞の調製) マウスLKT-細胞をダルベッコ改良イーグル培地で培養
させた後に、60mm径のペトリ皿1枚当り1.5x106個の細
胞を入れた。Production Example 3 (Preparation of Transformed Host Cells) After mouse LKT - cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium, 1.5 × 10 6 cells were placed per 60 mm diameter petri dish.
一方、50mM HEPES(pH7.1)、280mM NaCl及び15mM Na
2HPO4からなる溶液1.25mlに5μgのプラスミドpKSVGO
(前記の製造例2において最終的に得られた遺伝子組換
えベクター)、2.5μgのチミジンキナーゼ遺伝子及び
5μgのサケ***DNA溶液1.1mlと2M CaCl2溶液0.15mlと
を混合し、室温で30分間放置して処理液を調製しておい
た。On the other hand, 50 mM HEPES (pH 7.1), 280 mM NaCl and 15 mM NaCl
2 5 μg of plasmid pKSVGO in 1.25 ml of a solution consisting of HPO 4
(Genetically recombinant vector finally obtained in Production Example 2), 2.5 μg of the thymidine kinase gene, 5 μg of a salmon sperm DNA solution (1.1 ml) and a 2M CaCl 2 solution (0.15 ml) were mixed, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The treatment liquid was prepared by leaving it to stand.
この処理液0.5mlの上記の細胞収容ペトリ皿に添加
し、室温で30分間放置した後にダルベッコ改良イーグル
培地5mlを添加し、5% CO2、37℃の条件下に5時間培
養を行った。ダルベッコ改良イーグル培地を交換後更に
24時間培養し、次いでヒポキサンチン(15μg/ml)、ア
ミノプテリン(1μg/ml)及びチミジン(5μg/ml)を
含有するHAT培地に培地を交換して培養を継続する。2
−4週間後に形成された細胞集落を分離して所望の形質
転換宿主細胞を得た。0.5 ml of the treated solution was added to the above-mentioned cell-containing petri dish, left at room temperature for 30 minutes, 5 ml of Dulbecco's modified Eagle's medium was added, and the cells were cultured for 5 hours under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. After replacing Dulbecco's modified Eagle medium,
After culturing for 24 hours, the medium is replaced with a HAT medium containing hypoxanthine (15 μg / ml), aminopterin (1 μg / ml) and thymidine (5 μg / ml), and the culture is continued. 2
After 4 weeks, the cell colonies formed were separated to obtain the desired transformed host cells.
参考例2(L−グロノラクトン酸化酵素の製造) 製造例3により得られた形質転換宿主細胞をダルベッ
コ改良イーグル培地で培養することにより増殖させ、そ
の培養上清及び培養細胞を回収した。この培養上清につ
いては、これを直接にカラムクロマトグラフィーにか
け、又培養細胞については1% Triton X−100溶液に懸
濁させた後にカラムクロマトグラフィーにかけることに
より、L−グロノラクトン酸化酵素を分離精製した。Reference Example 2 (Production of L-gulolactone oxidase) The transformed host cells obtained in Production Example 3 were grown by culturing in Dulbecco's modified Eagle medium, and the culture supernatant and the cultured cells were collected. The culture supernatant is directly subjected to column chromatography, and the cultured cells are suspended in 1% Triton X-100 solution and then subjected to column chromatography to separate and purify L-gulonolactone oxidase. did.
尚、本参考例では、参考例1において言及したように
ラット肝臓起源のL−グロノラクトン酸化酵素を原料と
して調製され且つ製造例1のc)項で言及した、λファ
ージDNAを制限酵素EcoR Iで切断することにより調製さ
れたL−グロノラクトン酸化酵素のクローン化遺伝子DN
Aが宿主細胞のプラスミドに組込まれているために、こ
の宿主細胞がL−グロノラクトン酸化酵素を産生してい
るが、ラット肝臓起源の配列とアミノ酸配列は等しいが
塩基配列が異なる、少なくとも一部が合成されたL−グ
ロノラクトン酸化酵素のクローン化DNAが宿主細胞のプ
ラスミドに組込まれていれば、宿主細胞はラット肝臓由
来のL−グロノラクトン酸化酵素ではなく、この酵素に
類する物質を産生することになる。In this reference example, as described in reference example 1, L-gulolactone oxidase derived from rat liver was prepared as a raw material, and λ phage DNA described in section c) of production example 1 was treated with restriction enzyme EcoRI. Cloned gene DN of L-gulonolactone oxidase prepared by cleavage
Since A is integrated into the plasmid of the host cell, this host cell produces L-gulolactone oxidase, but the amino acid sequence is the same as that of rat liver, but the nucleotide sequence is different. If the cloned DNA of the synthesized L-gulolactone oxidase is integrated into the plasmid of the host cell, the host cell will produce a substance similar to this enzyme instead of L-gulonolactone oxidase derived from rat liver. .
試験例1(制限酵素地図の作成) 製造例1のc)項で言及の、制限酵素EcoR Iで切断し
たλファージ(λgt11)のcDNA挿入部(インサート)断
片をアガロースゲル電気泳動により分画し、相当する部
分のゲルを切出し、これよりDNA断片を抽出した。このD
NA断片と、EcoR Iで切断したプラスミドpUC19とをDNAラ
イゲーションキット(宝酒造株式会社製)を用いてライ
ゲーションした。得られた組換えプラスミドを用い、製
造例3と同様にして、但し宿主細胞としてのEscherichi
a coli JM109の形質転換を行い、形質転換宿主細胞を
得た。この宿主細胞を培養し、アルカリ−SDSライセー
ト法(前出のManiatis,T.等の方法)によりプラスミドD
NAを調製した。得られたプラスミドDNA(インサートDNA
を含む)を各種の制限酵素で切断し、DNA断片の長さを
アガロースゲル電気泳動により調べて制限酵素地図を作
成した結果、このプラスミドDNAは第1図に示される通
りの制限酵素認識部位を有していることは判明した。Test Example 1 (Preparation of Restriction Enzyme Map) The cDNA insert (insert) fragment of λ phage (λgt11) cut with the restriction enzyme EcoRI described in section c) of Production Example 1 was fractionated by agarose gel electrophoresis. The corresponding portion of the gel was cut out and a DNA fragment was extracted therefrom. This D
The NA fragment and the plasmid pUC19 cut with EcoRI were ligated using a DNA ligation kit (Takara Shuzo). Using the obtained recombinant plasmid, in the same manner as in Production Example 3, except that Escherichia
and the cells of a coli JM109, to obtain a transformed host cell. This host cell is cultured, and the plasmid D is lysed by the alkali-SDS lysate method (the method of Maniatis, T., supra).
NA was prepared. Obtained plasmid DNA (insert DNA
Was cleaved with various restriction enzymes, and the length of the DNA fragment was examined by agarose gel electrophoresis to create a restriction enzyme map. It turned out to have.
試験例2(プラスミドDNAの塩基配列の決定とL−グロ
ノラクトン酸化酵素部分のアミノ酸配列決定) 試験例1で言及したプラスミドDNAを制限酵素EcoR I
により切断して得た断片をファージM13 mp18にサブクロ
ーニングし、得られた遺伝子組換えベクターによりEsch
erichia coli JM109を形質転換させた。得られた形質
転換体のプラスミドを制限酵素EcoR Iで切断し、その内
で約1.3kbのインサートDNAを有するものについては、上
記ファージのRF DNAを調製し、キロシークェンス用デレ
ーションキット(宝酒造株式会社製)を用い且つエクソ
ヌクレアーゼIIIとマングビーンヌクレアーゼを用いる
方法[Henikoff,S.“Gene"第28巻第351−359頁(1984
年)及びYanisch−Perron,C.等“Gene"第33巻第103−11
9頁(1985年)]によりデレーションミュータントを作
成した。Test Example 2 (Determination of Base Sequence of Plasmid DNA and Determination of Amino Acid Sequence of L-Gulonolactone Oxidase Part) Plasmid DNA mentioned in Test Example 1 was subjected to restriction enzyme EcoRI.
The fragment obtained by cleavage and subcloned into phage M13 mp18 by, Esch by the resulting recombinant vector
E. coli JM109 was transformed. The plasmid of the obtained transformant is digested with the restriction enzyme EcoRI, and among those having an insert DNA of about 1.3 kb, the RF DNA of the above phage is prepared, and a deletion kit for kilosequence (Takara Shuzo Co., Ltd.) Using a exonuclease III and a mung bean nuclease [Henikoff, S. "Gene" 28: 351-359 (1984)
Yanisch-Perron, C. et al., "Gene" Vol. 33, No. 103-11.
9 (1985)].
一方、各種の制限酵素を用いて、DNAのEcoR I切断断
片を更に切断して種々の領域長さを有する断片となし、
この各断片をそれぞれファージM13 mp18にサブクローニ
ングした。On the other hand, using various restriction enzymes, the EcoRI cut fragment of DNA is further cut into fragments having various region lengths,
Each of these fragments was subcloned into phage M13 mp18.
上記のデレーションミュータント及びサブクローンの
DNA断片について、それぞれジデオキシ−チェインター
ミネータ法[Sanger,F.“Science"第214巻第1205−1210
頁(1981年)]の改良法[Mizusawa,S.等“Nucleic Aci
ds Res."第14巻第1319−1324頁(1986年)]に準じて塩
基配列の決定を行った。結果は第1図に示されている通
りであり、この図において、点線矢印はデレーションミ
ュータントのDNA断片に関する塩基配列の決定方向と領
域とを示し、実線矢印はサブクローンのDNA断片に関す
る塩基配列の決定方向と領域とを示している。The above-mentioned deletion mutant and subclone
For the DNA fragments, the dideoxy-chain terminator method [Sanger, F. "Science" Vol. 214, No. 1205-1210]
(1981)] [Mizusawa, S. et al. “Nucleic Aci
ds Res., Vol. 14, pp. 1319-1324 (1986)]. The results are as shown in FIG. 1, in which the dotted arrows indicate The determination direction and the region of the base sequence for the DNA fragment of the translation mutant are shown, and the solid arrow indicates the determination direction and the region of the base sequence for the DNA fragment of the subclone.
各断片について決定された塩基配列を繋ぎ合わせるこ
とにより最終的に決定された塩基配列は第2図に示され
ている通りであり、2120bpの領域長さを有していた。こ
の塩基配列において、塩基番号4番から1320番迄の領域
がL−グロノラクトン酸化酵素をコードする領域であっ
て、開始コドンであるATGから始まり、終止コドンであ
るTAAにより終了するオープンリーディングフレーム内
に存在し、アミノ酸数は439個であった。このクローン
化DNAのN末端における塩基配列が指定するアミノ酸配
列(第2図においてアンダーラインの付されているアミ
ノ酸配列部分)は、ラットL−グロノラクトン酸化酵素
のN末端アミノ酸配列(参考例1における解析結果)と
一致するので、このクローン化DNA塩基配列はラットL
−グロノラクトン酸化酵素のものと同定された。The nucleotide sequence finally determined by joining the nucleotide sequences determined for each fragment was as shown in FIG. 2 and had a region length of 2120 bp. In this base sequence, the region from base number 4 to base 1320 is a region encoding L-gulonolactone oxidase, which starts from the start codon ATG and ends with the stop codon TAA within the open reading frame. It was present and had 439 amino acids. The amino acid sequence designated by the base sequence at the N-terminus of the cloned DNA (the underlined amino acid sequence in FIG. 2) is the N-terminal amino acid sequence of rat L-gulolactone oxidase (as analyzed in Reference Example 1). This cloned DNA nucleotide sequence was
-Glonolactone oxidase.
(発明の効果) 本発明によりラット由来のL−グロノラクトン酸化酵
素もクローン化DNA、該クローン化DNAの組込まれた発現
ベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞
が提供される。(Effects of the Invention) The present invention provides a cloned DNA of rat-derived L-gulonolactone oxidase, an expression vector into which the cloned DNA has been incorporated, and a host cell transformed with the vector.
従って、この形質転換細胞を培養すればL−グロノラ
クトン酸化酵素を容易に且つ大量に産生させることがで
きる。尚、アミノ酸配列が判明したために、ラットL−
グロノラクトン酸化酵素とアミノ酸配列が共通であり且
つ塩基配列が異なる種々のDNAも作成でき、これらのDNA
を用いてラットL−グロノラクトン酸化酵素と同様の作
用を示す種々の物質を製造することができる。Therefore, by culturing the transformed cells, L-gulolactone oxidase can be produced easily and in large quantities. Since the amino acid sequence was determined, rat L-
Various DNAs having the same amino acid sequence as glonolactone oxidase and different nucleotide sequences can be prepared.
Can be used to produce various substances having the same action as rat L-gulolactone oxidase.
更に、上記の産生されたL−グロノラクトン酸化酵素
をL−グロノラクトンに対して作用させれば、極めて容
易にアスコルビン酸(ビタミンC)が生成するので、本
発明はアスコルビン酸の製造を飛躍的に容易にする。Furthermore, ascorbic acid (vitamin C) is produced very easily when the produced L-gulolactone oxidase is allowed to act on L-gulonolactone. Therefore, the present invention greatly facilitates the production of ascorbic acid. To
第1図はラットL−グロノラクトン酸化酵素のアミノ酸
配列をコードしている塩基配列を包含する、本発明によ
りクローン化されたDNA領域並びに該領域の塩基配列決
定のために用いられた制限酵素と、塩基配列決定のため
のストラテジーとを示す図面、第2図は第1図に示され
ているクローン化DNA領域内においてオープンリーディ
ングフレームを構成する塩基配列及びアミノ酸配列を示
す図面である。FIG. 1 shows the DNA region cloned according to the present invention, including the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of rat L-glonolactone oxidase, and the restriction enzymes used for sequencing the region; FIG. 2 is a drawing showing a strategy for determining a nucleotide sequence, and FIG. 2 is a drawing showing a nucleotide sequence and an amino acid sequence constituting an open reading frame in the cloned DNA region shown in FIG.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:19) (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12N 9/04 C12R 1:19) (C12N 9/04 C12R 1:91) ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Agency reference number FI Technical display location C12R 1:19) (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12N 9/04 C12R 1:19) (C12N 9/04 C12R 1:91)
Claims (5)
ノ酸配列である をコードしていることを特徴とする、クローン化DNA。1. The amino acid sequence of rat L-gulolactone oxidase A cloned DNA, which encodes
シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリ
ボヌクレオチドを意味し、上記の式はアミノ酸に対応す
るコドン毎の配列として示されている) にて示されるヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列
が指定するアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指定す
る他のヌクレオチド配列を有していることを特徴とす
る、特許請求の範囲第1項に記載のクローン化DNA。(2) (Where A, C, G and T are adenine,
Means the deoxyribonucleotide having cytosine, guanine and thymine bases, and the above formula is shown as a sequence for each codon corresponding to the amino acid) or the same as the amino acid sequence designated by the nucleotide sequence. 2. The cloned DNA according to claim 1, wherein the cloned DNA has another nucleotide sequence specifying an amino acid sequence.
シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリ
ボヌクレオチドを意味し、上記の式はアミノ酸に対応す
るコドン毎の配列として示されている) にて示されるヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列
が指定するアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指定す
る他のヌクレオチド配列を有しているクローン化DNAの
組込まれていることを特徴とする、遺伝子組換えベクタ
ー。3. The expression (Where A, C, G and T are adenine,
Means the deoxyribonucleotide having cytosine, guanine and thymine bases, and the above formula is shown as a sequence for each codon corresponding to the amino acid) or the same as the amino acid sequence designated by the nucleotide sequence. A genetically modified vector comprising a cloned DNA having another nucleotide sequence specifying an amino acid sequence.
まれたDNAのコードしている蛋白質を発現する発現ベク
ターであることを特徴とする、特許請求の範囲第3項に
記載の遺伝子組換えベクター。4. The genetic recombination according to claim 3, wherein the vector is an expression vector that expresses a protein encoded by the DNA incorporated in the vector in a host cell. vector.
シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリ
ボヌクレオチドを意味し、上記の式はアミノ酸に対応す
るコドン毎の配列として示されている) にて示されるヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列
が指定するアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指定す
る他のヌクレオチド配列を有しているクローン化DNAの
組込まれた遺伝子組換えベクターにより形質転換されて
いる大腸菌又は動物細胞であることを特徴とする。宿主
細胞。(5) (Where A, C, G and T are adenine,
Means the deoxyribonucleotide having cytosine, guanine and thymine bases, and the above formula is shown as a sequence for each codon corresponding to the amino acid) or the same as the amino acid sequence designated by the nucleotide sequence. It is characterized by being Escherichia coli or an animal cell transformed by a recombinant vector into which a cloned DNA having another nucleotide sequence specifying the amino acid sequence has been integrated. Host cells.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62247896A JP2602435B2 (en) | 1987-10-02 | 1987-10-02 | Cloned DNA of L-Glonolactone Oxidase, Genetically Modified Vector Incorporating the Cloned DNA, and Host Cell Transformed by the Vector |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62247896A JP2602435B2 (en) | 1987-10-02 | 1987-10-02 | Cloned DNA of L-Glonolactone Oxidase, Genetically Modified Vector Incorporating the Cloned DNA, and Host Cell Transformed by the Vector |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0191785A JPH0191785A (en) | 1989-04-11 |
JP2602435B2 true JP2602435B2 (en) | 1997-04-23 |
Family
ID=17170178
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62247896A Expired - Lifetime JP2602435B2 (en) | 1987-10-02 | 1987-10-02 | Cloned DNA of L-Glonolactone Oxidase, Genetically Modified Vector Incorporating the Cloned DNA, and Host Cell Transformed by the Vector |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2602435B2 (en) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19604798A1 (en) * | 1996-02-09 | 1997-08-14 | Herbstreith & Fox Kg Pektin Fa | Production of L-ascorbic acid |
CA2288739A1 (en) * | 1997-05-07 | 1998-11-12 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie | Production of ascorbic acid in plants |
-
1987
- 1987-10-02 JP JP62247896A patent/JP2602435B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0191785A (en) | 1989-04-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kagawa et al. | High guanine plus cytosine content in the third letter of codons of an extreme thermophile. DNA sequence of the isopropylmalate dehydrogenase of Thermus thermophilus. | |
JPS63267292A (en) | Novel polypeptide | |
KR101200571B1 (en) | Ginsenoside glycosidase from terrabacter sp and use thereof | |
JPS61275223A (en) | Microbiological preparation of human blood serum albumin | |
US5182367A (en) | 5-lipoxygenase activating protein | |
KR101005821B1 (en) | Mutated Nucleotide Sequences of Batroxobin, Mutated ??Factor Secretion Signal Sequence and Processes for Preparing Batroxobin Using the Same | |
AU727281B2 (en) | Alpha2 subunit of prolyl-4-hydroxylase nucleic acid sequences encoding such subunit and methods for producing the same | |
JPH06509229A (en) | Cycloheximide resistance protein and nucleotide sequence | |
JP2602435B2 (en) | Cloned DNA of L-Glonolactone Oxidase, Genetically Modified Vector Incorporating the Cloned DNA, and Host Cell Transformed by the Vector | |
US5248599A (en) | Achromobacter protease i gene and gene product thereof | |
JP3095183B2 (en) | Novel enzyme and DNA encoding it | |
EP0280407B1 (en) | Process for the production of recombinant polypeptides with porcine growth hormone activity | |
JPH1017600A (en) | Blood platelet activating factor acetyl hydrolase and its gene | |
HU197939B (en) | Process for producing deoxyribonucleic acid, or its precursor, determining human growth hormone releasing factor | |
CA1339736C (en) | Method for preparing fusion proteins | |
JPH0638771A (en) | Expression of human protein disulfide isomerase gene and production of polypeptide by co-expression with the gene | |
KR100981294B1 (en) | Mutated Nucleotide Sequences of Batroxobin, Mutated α-Factor Secretion Signal Sequence and Processes for Preparing Batroxobin Using the Same | |
CN113913414B (en) | Double-base enzyme Kex2 mutant with high stability and high catalytic efficiency | |
JP3014159B2 (en) | DNA sequence encoding human epidermal transglutaminase | |
JP3549551B2 (en) | S. DNA compound encoding riboflavin synthetase activity of cerevisiae and recombinant DNA expression vector | |
CN113564195B (en) | Fructosamine descarbohydrase pichia pastoris expression vector, genetically engineered bacterium, construction method and protein expression method | |
JPH0568548A (en) | Gene fragment encoding human alt | |
US6222028B1 (en) | Polynucleotides encoding cellulase enzymes from Piromyces rhizinflata | |
JP3071437B2 (en) | Method for producing T3-exonuclease | |
KR970009082B1 (en) | MICROBIOLOGICAL PROCESS FOR PREPARATION OF HUMAN Ñß- ARTERIAL NATRIURETIC FACTOR |