JP2590885B2 - Ｄｎａ断片 - Google Patents
Ｄｎａ断片Info
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- JP2590885B2 JP2590885B2 JP62140586A JP14058687A JP2590885B2 JP 2590885 B2 JP2590885 B2 JP 2590885B2 JP 62140586 A JP62140586 A JP 62140586A JP 14058687 A JP14058687 A JP 14058687A JP 2590885 B2 JP2590885 B2 JP 2590885B2
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- Japan
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- dna
- hepatitis
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規なDNA断片に関する。
詳しくは、非Ａ非Ｂ型肝炎発症時に特異的にみられる
非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質の遺伝子（Ｃ−DNA）を
含有するDNA断片に関する。
非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質の遺伝子（Ｃ−DNA）を
含有するDNA断片に関する。
（従来の技術） ウイルス性肝炎のうち、Ａ型及びＢ型についてはその
ウイルスが見出され、免疫学的な方法による診断も可能
となっている。
ウイルスが見出され、免疫学的な方法による診断も可能
となっている。
しかしながら、Ａ型でもＢ型でもなく、所謂、非Ａ非
Ｂ型といわれる肝炎は、輸血後肝炎の90％以上を占める
とされている〔日本臨牀、35:2724,1977、J.Biol.Med.
（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・メディソン）4
9:243,1976〕が、未だ原因ウイルスが同定されておら
ず、ヒトの非Ａ非Ｂ型肝炎がチンパンジーへの感染可能
であることが確認されているにすぎない〔Lancet I（ラ
ンセットＩ）:459,1978、同:463,1978〕。
Ｂ型といわれる肝炎は、輸血後肝炎の90％以上を占める
とされている〔日本臨牀、35:2724,1977、J.Biol.Med.
（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・メディソン）4
9:243,1976〕が、未だ原因ウイルスが同定されておら
ず、ヒトの非Ａ非Ｂ型肝炎がチンパンジーへの感染可能
であることが確認されているにすぎない〔Lancet I（ラ
ンセットＩ）:459,1978、同:463,1978〕。
非Ａ非Ｂ型肝炎に関連した抗原抗体系の検索は、多く
の研究者によって患者の血清を中心になされているが、
まだ明確な系は見出されていない。そのため、非Ａ非Ｂ
型肝炎の診断は、Ａ型肝炎及びＢ型肝炎、更には、肝障
害をひきおこすことが知られている既知ウイルス、例え
ば、CMV、HSV、EBV等による肝炎か否かの診断を行な
い、それらの肝炎でない場合に非Ａ非Ｂ型肝炎と診断す
る、所謂、除外診断法によるため、手間がかかるのが現
状である。
の研究者によって患者の血清を中心になされているが、
まだ明確な系は見出されていない。そのため、非Ａ非Ｂ
型肝炎の診断は、Ａ型肝炎及びＢ型肝炎、更には、肝障
害をひきおこすことが知られている既知ウイルス、例え
ば、CMV、HSV、EBV等による肝炎か否かの診断を行な
い、それらの肝炎でない場合に非Ａ非Ｂ型肝炎と診断す
る、所謂、除外診断法によるため、手間がかかるのが現
状である。
本発明者らの一部は、非Ａ非Ｂ型肝炎を直接診断に有
用な非Ａ非Ｂ型抗原蛋白質をヒト及びチンパンジーの肝
細胞から精製し、更に、その治療に有用はモノクローナ
ル抗体を作成し、先に提案した（特開昭61−176856号、
同61−56196号）。
用な非Ａ非Ｂ型抗原蛋白質をヒト及びチンパンジーの肝
細胞から精製し、更に、その治療に有用はモノクローナ
ル抗体を作成し、先に提案した（特開昭61−176856号、
同61−56196号）。
（発明の解決すべき問題点） しかしながら、例えば、診断試薬として使用する場合
には、多量の非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質を必要とす
るが、多量の抗原蛋白質を非Ａ非Ｂ型肝炎発症時のチン
パンジー等の肝細胞から精製することは必ずしも好適な
方法とはいえない。また核酸のハイブリダイゼーション
による非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原遺伝子の検出、さらに
は、組換えDNA技術により非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原の生
産には、非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコードする遺
伝子断片の収得が必須である。
には、多量の非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質を必要とす
るが、多量の抗原蛋白質を非Ａ非Ｂ型肝炎発症時のチン
パンジー等の肝細胞から精製することは必ずしも好適な
方法とはいえない。また核酸のハイブリダイゼーション
による非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原遺伝子の検出、さらに
は、組換えDNA技術により非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原の生
産には、非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコードする遺
伝子断片の収得が必須である。
（問題点を解決するための手段） そこで本発明者らは、該抗原蛋白質を組換えDNA技術
により大量に生産すべく鋭意検討を重ね、かかる目的に
有用な非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコードする遺伝
子を初めて分離収得するに至り、本発明を完成した。
により大量に生産すべく鋭意検討を重ね、かかる目的に
有用な非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコードする遺伝
子を初めて分離収得するに至り、本発明を完成した。
即ち、本発明の要旨は、非Ａ非Ｂ型肝炎発症時の肝細
胞内に出現する非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコード
する核酸配列を含んで成るDNA断片に存する。
胞内に出現する非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコード
する核酸配列を含んで成るDNA断片に存する。
以下、本発明を説明するに、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎
特異抗原蛋白質（以下「本発明の抗原」という。）の遺
伝子は、例えば、次のような方法によって得られる。
特異抗原蛋白質（以下「本発明の抗原」という。）の遺
伝子は、例えば、次のような方法によって得られる。
まず、ヒト又はチンパンジーの非Ａ非Ｂ型肝炎発症個
体（本発明においては、近年命名された所謂Ｄ型肝炎発
症個体を含む。）の肝組織をグアニジウムチオシアネー
ト水溶液等中でホモジナイズし、Chirgwinらの方法〔Bi
ochemistry（バイオケミストリー）185294−5299,197
9〕に従って、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心法によ
って全RNAを沈殿として分離する。分離後、フェノール
抽出、エタノール沈殿により全RNAを精製する。
体（本発明においては、近年命名された所謂Ｄ型肝炎発
症個体を含む。）の肝組織をグアニジウムチオシアネー
ト水溶液等中でホモジナイズし、Chirgwinらの方法〔Bi
ochemistry（バイオケミストリー）185294−5299,197
9〕に従って、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心法によ
って全RNAを沈殿として分離する。分離後、フェノール
抽出、エタノール沈殿により全RNAを精製する。
抗原遺伝子のmRNAはpoly A部分を含むことが一般的で
あることから常法によりこれをオリゴ（dT）セルロース
カラムクロマトグラフィーにかけ精製し、ポリ（Ａ）含
有RNA（poly A＋RNA）を単離しmRNA原料とする。このmR
NA原料によりランダムプライマー法〔Yousuke Ebina
ら、Cell（セル），40,747−758（1980）〕によりこれ
らpoly A+RNAに対するcDNAライブラリーを得る。例え
ば、６塩基程度の任意のプライマーを用い逆転写酵素に
より上記mRNAに対するcDNAをランダムに合成する。さら
にこのcDNAをDNAメチラーゼ（例えばEcoR Iメチラー
ゼ）によりメチル化し、cDNA中に存在する該制限酵素切
断部位を保護した後、両端に該制限酵素切断部位入りDN
Aリンカー〔例えばEcoR Iリンカー（CGAATTCG）〕を付
加し、該制限酵素（例えばEcoR I）により消化を行う。
あることから常法によりこれをオリゴ（dT）セルロース
カラムクロマトグラフィーにかけ精製し、ポリ（Ａ）含
有RNA（poly A＋RNA）を単離しmRNA原料とする。このmR
NA原料によりランダムプライマー法〔Yousuke Ebina
ら、Cell（セル），40,747−758（1980）〕によりこれ
らpoly A+RNAに対するcDNAライブラリーを得る。例え
ば、６塩基程度の任意のプライマーを用い逆転写酵素に
より上記mRNAに対するcDNAをランダムに合成する。さら
にこのcDNAをDNAメチラーゼ（例えばEcoR Iメチラー
ゼ）によりメチル化し、cDNA中に存在する該制限酵素切
断部位を保護した後、両端に該制限酵素切断部位入りDN
Aリンカー〔例えばEcoR Iリンカー（CGAATTCG）〕を付
加し、該制限酵素（例えばEcoR I）により消化を行う。
このものをプラスミドあるいはλファージ等のクロー
ニングベクターにクローニングする。例えば発現クロー
ニングベクターであるλgt11DNA〔Youg.R.A.ら、Pro.Na
tl.Acad.Sc.USA.（プロシーデングナショナルアカデミ
ーオブサイエンスUSA）80,P1194−1198（1983）〕のEco
R I.部位に導入することができる。
ニングベクターにクローニングする。例えば発現クロー
ニングベクターであるλgt11DNA〔Youg.R.A.ら、Pro.Na
tl.Acad.Sc.USA.（プロシーデングナショナルアカデミ
ーオブサイエンスUSA）80,P1194−1198（1983）〕のEco
R I.部位に導入することができる。
かかるλgt11ファージ内に組み込まれたcDNAはλgt11
ファージ上のβ−gal遺伝子の中に組み込まれるので該
ファージの大腸菌への感染後IPTG（イソプロピルβ−Ｄ
ガラクトピラノシド）等の物質添加による該ファージ上
のラクトースオペロンプロモーターの誘導によりβ−ガ
ラクトシダーゼとの融合タンパク質等として容易に発現
が確認される。
ファージ上のβ−gal遺伝子の中に組み込まれるので該
ファージの大腸菌への感染後IPTG（イソプロピルβ−Ｄ
ガラクトピラノシド）等の物質添加による該ファージ上
のラクトースオペロンプロモーターの誘導によりβ−ガ
ラクトシダーゼとの融合タンパク質等として容易に発現
が確認される。
この様にして、cDNAが組み込まれたλgt11ファージを
富沢らの方法（「バクテリオファージの実験法」99頁〜
174頁、岩波書店1970年５月30日発行）により大腸菌に
感染させ、IPTG等を含む培地で培養する。形成されたプ
ラークを非Ａ非Ｂ型肝炎特異モノクローナル抗体を使用
し、免疫スクリーニング等の方法によって選択すること
により容易に目的とするcDNAを得ることができる。
富沢らの方法（「バクテリオファージの実験法」99頁〜
174頁、岩波書店1970年５月30日発行）により大腸菌に
感染させ、IPTG等を含む培地で培養する。形成されたプ
ラークを非Ａ非Ｂ型肝炎特異モノクローナル抗体を使用
し、免疫スクリーニング等の方法によって選択すること
により容易に目的とするcDNAを得ることができる。
この免疫スクリーニング法に使用する抗体は特開昭61
−176856号公報、或いは同61−56196号公報に記載され
ている方法に従い調製することができる。スクリーニン
グ法もこれらに記載されているウエスタンプロッティン
グ法で行えばよい。
−176856号公報、或いは同61−56196号公報に記載され
ている方法に従い調製することができる。スクリーニン
グ法もこれらに記載されているウエスタンプロッティン
グ法で行えばよい。
更に上記免疫スクリーニング陽性のプラークから富沢
らの方法によりファージを増殖させ、そのものからT.Ma
niatisらの方法〔Molecular Cloning（モレキュラー・
クローニング）,Cold Spring Harbor〕〔Laboratory PP
85（1982）〕によりDNAを精製し適切な制限酵素例えばE
coR I等で切断後、Maxam and Gilbertの方法（Methods
in Enzymology 65,499−560（1980））によって又は制
限酵素で切断後、更にM13ファージにクローンしSanger
らのジオキシ法（Proc.Natl,Acad,Sci,U.S.A.,74 5463
（1977））によって目的cDNAセグメントの塩基配列が決
定できる。
らの方法によりファージを増殖させ、そのものからT.Ma
niatisらの方法〔Molecular Cloning（モレキュラー・
クローニング）,Cold Spring Harbor〕〔Laboratory PP
85（1982）〕によりDNAを精製し適切な制限酵素例えばE
coR I等で切断後、Maxam and Gilbertの方法（Methods
in Enzymology 65,499−560（1980））によって又は制
限酵素で切断後、更にM13ファージにクローンしSanger
らのジオキシ法（Proc.Natl,Acad,Sci,U.S.A.,74 5463
（1977））によって目的cDNAセグメントの塩基配列が決
定できる。
この様にして非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原をコードするcD
NA断片が得られる。しかしながら、このようにして得ら
れるDNA断片は、通常非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原をコード
する遺伝子の部分cDNA断片として得られる。完全長のcD
NAは、上記と同様な方法でpoly A+−mRNAを単離、精製
し、このものから岡山−Bergのベクター・プライマーの
方法（Molecular and Cellular Biology ２,161−170,1
982）によりcDNAライブラリーを得る。この様にして調
製したcDNA含有プラスミドを常法、例えばD.Hanahanの
方法（J.Mol.Biol.（ジャーナルオブモレキュラーバイ
オロジー）166,557（1983））により大腸菌等に形質転
換し、アンピシリン耐性株を取得する。この形質転換体
を先の部分、DNA断片をプローブとしてコロニーハイブ
リダイゼーション法等によりスクリーニングする。
NA断片が得られる。しかしながら、このようにして得ら
れるDNA断片は、通常非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原をコード
する遺伝子の部分cDNA断片として得られる。完全長のcD
NAは、上記と同様な方法でpoly A+−mRNAを単離、精製
し、このものから岡山−Bergのベクター・プライマーの
方法（Molecular and Cellular Biology ２,161−170,1
982）によりcDNAライブラリーを得る。この様にして調
製したcDNA含有プラスミドを常法、例えばD.Hanahanの
方法（J.Mol.Biol.（ジャーナルオブモレキュラーバイ
オロジー）166,557（1983））により大腸菌等に形質転
換し、アンピシリン耐性株を取得する。この形質転換体
を先の部分、DNA断片をプローブとしてコロニーハイブ
リダイゼーション法等によりスクリーニングする。
かかるプローブの作成法としては、ストレプトアビジ
ン法、ホトビオチン核酸および32P核酸を使用したニッ
クトランスレーション法等が好ましい。
ン法、ホトビオチン核酸および32P核酸を使用したニッ
クトランスレーション法等が好ましい。
このようにして得られたcDNAクローンを含むコロニー
を培養しBirmboimらの方法〔Nucleic Acid Res.（ニュ
ークレイックアシッドリサーチ），７,1513（1979）〕
に従ってプラスミドDNAを得、適切な制限酵素で切断
後、上記のMaxam and Gilbertの方法によって又は、制
限酵素で切断後、更にM13ファージもしくはプラスミドp
VC12等にクローンし、上述のSangerらのジデオキシ法に
よって目的の完全長cDNAセグメントの塩基配列の決定を
行う。
を培養しBirmboimらの方法〔Nucleic Acid Res.（ニュ
ークレイックアシッドリサーチ），７,1513（1979）〕
に従ってプラスミドDNAを得、適切な制限酵素で切断
後、上記のMaxam and Gilbertの方法によって又は、制
限酵素で切断後、更にM13ファージもしくはプラスミドp
VC12等にクローンし、上述のSangerらのジデオキシ法に
よって目的の完全長cDNAセグメントの塩基配列の決定を
行う。
（実施例） 以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明は、その要旨を越えない限り以下の実施例に
よって限定されるものではない。
が、本発明は、その要旨を越えない限り以下の実施例に
よって限定されるものではない。
実施例１ 非Ａ非Ｂ型肝炎感染チンパンジー肝臓よりの
ポリ（Ａ）RNAの調製 肝臓よりチオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法
〔カサラ（Cathala）ら、ディーエヌエイ（DNA），２,3
29（1983）〕に従いポリ（Ａ）を有するRNAを下記の如
く調製した。
ポリ（Ａ）RNAの調製 肝臓よりチオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法
〔カサラ（Cathala）ら、ディーエヌエイ（DNA），２,3
29（1983）〕に従いポリ（Ａ）を有するRNAを下記の如
く調製した。
非Ａ非Ｂ型肝炎に感染したチンパンジーより感染肝5g
を摘出し、直ちに液体窒素にて凍結した。このものを液
体窒素とともにワーリングブレンダーに入れ3,000r.p.
m.2分間にて粉砕した。このものを5Mチオシアン酸グア
ニジン、10mMEDTA、50mMトリス−HCl（pH7）および８％
（V/V）β−メルカプトエタノールからなる溶液100ml中
でテフロンホモゲナイザー（5rpm）にてさらに粉砕し、
可溶化した。この可溶化物20mlを遠心管に入っている5.
7McsCl溶液10ml上に静かにのせ、Hitachi RPS28−２ロ
ーターにて27,000rpm、20時間遠心後RNAを沈殿として回
収した。このRNAの沈殿を0.1％ラウリル硫酸ナトリウ
ム、1mMEDTA、10mMトリス・HCl（pH7.5）からなる溶液1
0mlに溶解しフェノール−クロロホルムで抽出後、エタ
ノール沈殿により回収した。得られたRNA約3.95mgを10m
Mトリス−HCl（pH8.0）および1mMEDTAからなる溶液1ml
に溶かした。65℃、５分間インキュベートし0.1mlの5MN
aClを加えた。混合物をオリゴ〔dT〕セルロース・カラ
ム〔ピー・エル・バイオケミカル（Ｐ−L Biochemica
l）社製〕クロマトグラフィー（カラム体積0.5ml）にか
けた。吸着したポリ（Ａ）を有するmRNAを10mlMトリス
−HCl（pH7.5）および1mMEDTAからなる溶液で溶出し、
ポリ（Ａ）を有するmRNA約100μｇを得た。
を摘出し、直ちに液体窒素にて凍結した。このものを液
体窒素とともにワーリングブレンダーに入れ3,000r.p.
m.2分間にて粉砕した。このものを5Mチオシアン酸グア
ニジン、10mMEDTA、50mMトリス−HCl（pH7）および８％
（V/V）β−メルカプトエタノールからなる溶液100ml中
でテフロンホモゲナイザー（5rpm）にてさらに粉砕し、
可溶化した。この可溶化物20mlを遠心管に入っている5.
7McsCl溶液10ml上に静かにのせ、Hitachi RPS28−２ロ
ーターにて27,000rpm、20時間遠心後RNAを沈殿として回
収した。このRNAの沈殿を0.1％ラウリル硫酸ナトリウ
ム、1mMEDTA、10mMトリス・HCl（pH7.5）からなる溶液1
0mlに溶解しフェノール−クロロホルムで抽出後、エタ
ノール沈殿により回収した。得られたRNA約3.95mgを10m
Mトリス−HCl（pH8.0）および1mMEDTAからなる溶液1ml
に溶かした。65℃、５分間インキュベートし0.1mlの5MN
aClを加えた。混合物をオリゴ〔dT〕セルロース・カラ
ム〔ピー・エル・バイオケミカル（Ｐ−L Biochemica
l）社製〕クロマトグラフィー（カラム体積0.5ml）にか
けた。吸着したポリ（Ａ）を有するmRNAを10mlMトリス
−HCl（pH7.5）および1mMEDTAからなる溶液で溶出し、
ポリ（Ａ）を有するmRNA約100μｇを得た。
まずポリ（Ａ）mRNA10μｇをRT緩衝液（20mMトリス−
HCl（pH8.8）、0.1MKCl、12mM MgCl2、2mM MnCl2）50μ
に溶かし、ランダムプライマーｄ（Ｎ）６〔ピー・エ
ル・バイオケミカル（Ｐ−L Biochemical）社製〕８μ
ｇを加え、95℃、３分間加熱し、変性させた。これを室
温まで徐冷し、ランダムプライマーをアニールさせた。
このものに10mM4NTP 10μ、逆転写酵素225u（宝酒造
社製）を加え、水を加えて計100μの系とし、42℃で
１時間反応させた。
HCl（pH8.8）、0.1MKCl、12mM MgCl2、2mM MnCl2）50μ
に溶かし、ランダムプライマーｄ（Ｎ）６〔ピー・エ
ル・バイオケミカル（Ｐ−L Biochemical）社製〕８μ
ｇを加え、95℃、３分間加熱し、変性させた。これを室
温まで徐冷し、ランダムプライマーをアニールさせた。
このものに10mM4NTP 10μ、逆転写酵素225u（宝酒造
社製）を加え、水を加えて計100μの系とし、42℃で
１時間反応させた。
上記反応液50μを使用し10mMNAD 2μ、10mM4dNTP
10μ、RNase H 5u、大腸菌リカーゼ1u、大腸菌DNAポ
リメカラーゼI6.3u、10倍濃度のT4DNAリガーゼ緩衝液
（0.1Mトリス−HCl（pH7.5）0.1MDTT、60mM MgCl2）10
μを加え、計100μの系とし、37℃、１時間反応さ
せ、２本鎖DNAを合成した。
10μ、RNase H 5u、大腸菌リカーゼ1u、大腸菌DNAポ
リメカラーゼI6.3u、10倍濃度のT4DNAリガーゼ緩衝液
（0.1Mトリス−HCl（pH7.5）0.1MDTT、60mM MgCl2）10
μを加え、計100μの系とし、37℃、１時間反応さ
せ、２本鎖DNAを合成した。
上記の様にして得た２本鎖DNAを同量の水飽和フェノ
ールで抽出し、エーテルで水層のフェノールを除いた
後、エタノール沈殿を行った。
ールで抽出し、エーテルで水層のフェノールを除いた
後、エタノール沈殿を行った。
得られた沈殿を50μの水に溶かし、10倍濃度のT4DN
Aポリメラーゼ緩衝液（0.33Mトリス酢酸（pH7.9）、0.6
6M酢酸カリウム、0.1M酢酸マグネシウム、5mMDTT）10μ
、10mM4dNTD 10μ、T4DNAポリメラーゼ6uを加え、1
00μの系とし、37℃１時間反応させ、２本鎖の平滑末
端をもったDNAを得た。このものを上記したとおり、フ
ェノール抽出し、除タンパクした後、エタノール沈殿を
行ってDNAを精製後、風乾した。
Aポリメラーゼ緩衝液（0.33Mトリス酢酸（pH7.9）、0.6
6M酢酸カリウム、0.1M酢酸マグネシウム、5mMDTT）10μ
、10mM4dNTD 10μ、T4DNAポリメラーゼ6uを加え、1
00μの系とし、37℃１時間反応させ、２本鎖の平滑末
端をもったDNAを得た。このものを上記したとおり、フ
ェノール抽出し、除タンパクした後、エタノール沈殿を
行ってDNAを精製後、風乾した。
このものに50mMトリス−HCl（pH7.5）1mM Na2EDTA、5
mMDTTA 20μ、100uMB−アデノシル−Ｌ−メチオニン
２μ、1.8mg/ml EcoR Iメチラーゼ0.2μを加え37℃
15分間反応させ、DNA断片上のEcoR I制限酵素切断部位
のメチル化を行ないその後70℃、15分熱処理を行って酵
素を失活させた。
mMDTTA 20μ、100uMB−アデノシル−Ｌ−メチオニン
２μ、1.8mg/ml EcoR Iメチラーゼ0.2μを加え37℃
15分間反応させ、DNA断片上のEcoR I制限酵素切断部位
のメチル化を行ないその後70℃、15分熱処理を行って酵
素を失活させた。
次に、３′リン酸化したEcoR Iリンカー（GGAATTCC）
を全合成DNA分子数の100倍になる様に加え、10倍濃度の
T4DNAリカーゼ緩衝液（0.5Mトリス−HCl（pH7.5）、60m
M MgCl2、10mMDTT）を５μを加え、0.1MATP 5μ、T
4DNAリガーゼ5uを加え計50μの系とし、４℃16時間反
応させた後、70℃、10分間加熱して酵素を失活させた。
次に10倍濃度のEcoR I緩衝液（15Mトリス−HCl（pH7.
5）、0.5M NaCl、60mM MgCl2）を10μ、EcoR I 100u
を加えて計100μの系とし37℃、２時間反応させ、余
分なリンカーを切除した。さらにBio Gel A−50（0.2cm
×32cm）（Bio RAD社製）にこの反応液を通し、10mMト
リス−HCl（pH7.5）6mM MgCl2緩衝液にて流出し、余分
なEcoR Iリンカーを除去し、EcoR Iリンカーの付いた二
本鎖cDNAを精製した。
を全合成DNA分子数の100倍になる様に加え、10倍濃度の
T4DNAリカーゼ緩衝液（0.5Mトリス−HCl（pH7.5）、60m
M MgCl2、10mMDTT）を５μを加え、0.1MATP 5μ、T
4DNAリガーゼ5uを加え計50μの系とし、４℃16時間反
応させた後、70℃、10分間加熱して酵素を失活させた。
次に10倍濃度のEcoR I緩衝液（15Mトリス−HCl（pH7.
5）、0.5M NaCl、60mM MgCl2）を10μ、EcoR I 100u
を加えて計100μの系とし37℃、２時間反応させ、余
分なリンカーを切除した。さらにBio Gel A−50（0.2cm
×32cm）（Bio RAD社製）にこの反応液を通し、10mMト
リス−HCl（pH7.5）6mM MgCl2緩衝液にて流出し、余分
なEcoR Iリンカーを除去し、EcoR Iリンカーの付いた二
本鎖cDNAを精製した。
得られたEcoR Iリンカー付二本鎖cDNA断片を用い、Ec
oR Iで切断したλgt11DNA 10μｇと10倍濃度のT4DNAリ
ガーゼ緩衝液（前述）10μ、0.1MATP 10μ、T4DNA
リガーゼ10uを加え計100μの反応系で４℃16時間反応
させλgt11DNAに上記二本鎖cDNA断片を挿入した。
oR Iで切断したλgt11DNA 10μｇと10倍濃度のT4DNAリ
ガーゼ緩衝液（前述）10μ、0.1MATP 10μ、T4DNA
リガーゼ10uを加え計100μの反応系で４℃16時間反応
させλgt11DNAに上記二本鎖cDNA断片を挿入した。
λファージパッケージングキット（プロメガBiotech
社製）を用い上記DNAをλファージ粒子中へ導入した。
パッケージングの手順はキットの説明書に従い行った。
社製）を用い上記DNAをλファージ粒子中へ導入した。
パッケージングの手順はキットの説明書に従い行った。
このDNAパッケージングを終了したλgt11ファージを
常法（バクテリオファージ実験法99頁〜174頁、岩波書
店1970年５月30日発行）、富沢らの法により大腸菌Y109
0株に感染させプラークを形成させた。約20万個のプラ
ークより以下に示すような免疫スクリーニング法により
陽性のクローン１個を得た。この免疫スクリーニングに
使用した抗体は特開昭61−176856号公報に記載されてい
る方法で調製したものである。
常法（バクテリオファージ実験法99頁〜174頁、岩波書
店1970年５月30日発行）、富沢らの法により大腸菌Y109
0株に感染させプラークを形成させた。約20万個のプラ
ークより以下に示すような免疫スクリーニング法により
陽性のクローン１個を得た。この免疫スクリーニングに
使用した抗体は特開昭61−176856号公報に記載されてい
る方法で調製したものである。
まずλgt11に感染したY1090〔Young R.A.ら;Pro.Nat
l.Acad.Sci.USA（プロシーデング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンスUSA）,80,1194−1198（1
983）〕を42℃に保温した上層軟寒天とともにシャーレ
まき、42℃に５時間放置した。次に10mMIPTGを含んだニ
トロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ社製BA−83ポアサイ
ズ0.2μｍ）をその上に置き37℃にて３〜４時間培養し
た。このニトロセルロースフィルターをTBS緩衝液（10m
Mトリス−HCl（pH7.5）50mM NaCl）で軽く洗い、３％ゼ
ラチンを含むTBS緩衝液400mlに浸し、40℃、１時間振と
うを行ってニトロセルロースフィルターのプロッキング
を行った。次に非Ａ非Ｂ肝炎特異抗原に対するモノクロ
ーナル抗体（OD280＝4.3）を１％ゼラチンを含むTBS緩
衝液に400分の１希釈になるように加え、フィルター１
枚につき2mlになる様にビニール袋にフィルターととも
に入れ、室温で16時間反応させた。次に005％Tween20を
含むTBS緩衝液400mlにて10分間３回洗浄し標識２次抗体
である抗マウスIgG−PAP（フォースラディシュペルオキ
シダーゼ）（バイオ・ラッド社製）を１％ゼラチンを含
むTBS緩衝液に1000分の１希釈に加え、フィルター１枚
につき2mlになる様にビニール袋にフィルターとともに
入れ、室温で２時間反応させ、同様に0.05％Tween20を
含むTBS緩衝液400mlにて10分間３回洗浄した。発色はフ
ィルターを４−Chloro−１−naphthol（バイオ−ラッド
社製）12mgを過酸化水素水を含む20mlのTBS緩衝液に浸
して行った。発色終了後、フィルターは水でよく洗い水
を入れたビニール袋に入れて冷暗所に保存した。
l.Acad.Sci.USA（プロシーデング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンスUSA）,80,1194−1198（1
983）〕を42℃に保温した上層軟寒天とともにシャーレ
まき、42℃に５時間放置した。次に10mMIPTGを含んだニ
トロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ社製BA−83ポアサイ
ズ0.2μｍ）をその上に置き37℃にて３〜４時間培養し
た。このニトロセルロースフィルターをTBS緩衝液（10m
Mトリス−HCl（pH7.5）50mM NaCl）で軽く洗い、３％ゼ
ラチンを含むTBS緩衝液400mlに浸し、40℃、１時間振と
うを行ってニトロセルロースフィルターのプロッキング
を行った。次に非Ａ非Ｂ肝炎特異抗原に対するモノクロ
ーナル抗体（OD280＝4.3）を１％ゼラチンを含むTBS緩
衝液に400分の１希釈になるように加え、フィルター１
枚につき2mlになる様にビニール袋にフィルターととも
に入れ、室温で16時間反応させた。次に005％Tween20を
含むTBS緩衝液400mlにて10分間３回洗浄し標識２次抗体
である抗マウスIgG−PAP（フォースラディシュペルオキ
シダーゼ）（バイオ・ラッド社製）を１％ゼラチンを含
むTBS緩衝液に1000分の１希釈に加え、フィルター１枚
につき2mlになる様にビニール袋にフィルターとともに
入れ、室温で２時間反応させ、同様に0.05％Tween20を
含むTBS緩衝液400mlにて10分間３回洗浄した。発色はフ
ィルターを４−Chloro−１−naphthol（バイオ−ラッド
社製）12mgを過酸化水素水を含む20mlのTBS緩衝液に浸
して行った。発色終了後、フィルターは水でよく洗い水
を入れたビニール袋に入れて冷暗所に保存した。
このようにしてポジティブなプラークを１個得た。こ
のポジティブプラークのシングルプラークアイソレーシ
ョンを３度行った。３度とも免疫スクリーニングを同様
に行いポジティブであることを確認した。
のポジティブプラークのシングルプラークアイソレーシ
ョンを３度行った。３度とも免疫スクリーニングを同様
に行いポジティブであることを確認した。
次にこのファージを大量に培養し、そのDNAを精製し
た。まずY1090菌をNZ培地（NZアミン10g、NaCl5g、5mM
MgCl2を水１に加え、pH7.2に調整）10mlで一晩培養し
た。このもの1mlにm.o.i（マルチプリシティ オブ イ
ンフェクション）0.1になる様にファージを感染させ、3
7℃10分間放置後、NZ培地１に移し溶菌するまで７〜
８時間37℃にて振とう培養を行いクロロホルム5mlを加
え、さらに30分間振とうを続けた。次に菌体残査を650
r.p.m.10分間の遠心分離により除去し、上清にNaCl29
g、ポリエチレングリコール70gを加えよく溶かしてから
４℃で一晩放置した。6500r.p.m.20分の遠心分離で沈殿
を集め、よく水滴を切り沈殿を20mlのTM緩衝液（10mMト
リス−HCl（pH7.5）・5mM MgCl2）に溶かしDNase I、RN
ase Aをともに10μg/mlの濃度になる様に加え、37℃１
時間反応させた。
た。まずY1090菌をNZ培地（NZアミン10g、NaCl5g、5mM
MgCl2を水１に加え、pH7.2に調整）10mlで一晩培養し
た。このもの1mlにm.o.i（マルチプリシティ オブ イ
ンフェクション）0.1になる様にファージを感染させ、3
7℃10分間放置後、NZ培地１に移し溶菌するまで７〜
８時間37℃にて振とう培養を行いクロロホルム5mlを加
え、さらに30分間振とうを続けた。次に菌体残査を650
r.p.m.10分間の遠心分離により除去し、上清にNaCl29
g、ポリエチレングリコール70gを加えよく溶かしてから
４℃で一晩放置した。6500r.p.m.20分の遠心分離で沈殿
を集め、よく水滴を切り沈殿を20mlのTM緩衝液（10mMト
リス−HCl（pH7.5）・5mM MgCl2）に溶かしDNase I、RN
ase Aをともに10μg/mlの濃度になる様に加え、37℃１
時間反応させた。
次に、20mlのクロロホルムを加えて撹拌し、ポリエチ
レングリコールをクロロホルムに溶解させて水層からと
り除去した。この水層をさらに2800r.p.m.で60分の超遠
心分離にかけファージ粒子のペレットを得た。このペレ
ットを1mlのTM緩衝液にとかし、CsCl密度勾配遠心（330
00r.p.m.20時間）によりρ＝1.45〜1.50のファージ粒子
を含んだ分画を得た。TM緩衝液に対し一晩、透析を行っ
た後、プロティンアーゼＫを100μg/mlになる様加え、3
7℃で１時間反応させた。その後、同量の水飽和フェノ
ールを加えゆるやかにフェノール抽出を行った。6500r.
p.m.10分間の遠心分離の後、水層をとり出し、透析チュ
ーブに入れて水に対して４℃で一晩透析を行った。この
様にして、約5mgのDNAが得られた。
レングリコールをクロロホルムに溶解させて水層からと
り除去した。この水層をさらに2800r.p.m.で60分の超遠
心分離にかけファージ粒子のペレットを得た。このペレ
ットを1mlのTM緩衝液にとかし、CsCl密度勾配遠心（330
00r.p.m.20時間）によりρ＝1.45〜1.50のファージ粒子
を含んだ分画を得た。TM緩衝液に対し一晩、透析を行っ
た後、プロティンアーゼＫを100μg/mlになる様加え、3
7℃で１時間反応させた。その後、同量の水飽和フェノ
ールを加えゆるやかにフェノール抽出を行った。6500r.
p.m.10分間の遠心分離の後、水層をとり出し、透析チュ
ーブに入れて水に対して４℃で一晩透析を行った。この
様にして、約5mgのDNAが得られた。
このDNA100μｇをEcoR I 100uで前述の緩衝液系100μ
中にて37℃反応して切断したところ390bpと345bpのcD
NAセグメントがファージDNAに挿入されていることが判
明した。この２つのEcoR Iフラグメントをクローニング
ベクターであるpUC119のEcoR I部位に再度クローニング
し、ジデオキシ法にて市販のプライマーCAGGAAACAGCTAT
GACおよびAGTCACGACGTTGTAを用いて夫々についてその塩
基配列を決定した。２つのDNAの結合部分の塩基配列は
このcDNA断片の内部にあるBamH I、EcoR V部位を同部位
に特異的な制限酵素で切断し、得られるBamH I−EcoR V
DNAフラグメントpUc119のBamH I、Sma I部位に挿入し
て同様にジデオキシ法にてそのフラグメントの塩基配列
を決定した。該cDNA断片は、図−１に示す通りの塩基配
列を有する。これは非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコ
ードする遺伝子の部分cDNA断片であった。
中にて37℃反応して切断したところ390bpと345bpのcD
NAセグメントがファージDNAに挿入されていることが判
明した。この２つのEcoR Iフラグメントをクローニング
ベクターであるpUC119のEcoR I部位に再度クローニング
し、ジデオキシ法にて市販のプライマーCAGGAAACAGCTAT
GACおよびAGTCACGACGTTGTAを用いて夫々についてその塩
基配列を決定した。２つのDNAの結合部分の塩基配列は
このcDNA断片の内部にあるBamH I、EcoR V部位を同部位
に特異的な制限酵素で切断し、得られるBamH I−EcoR V
DNAフラグメントpUc119のBamH I、Sma I部位に挿入し
て同様にジデオキシ法にてそのフラグメントの塩基配列
を決定した。該cDNA断片は、図−１に示す通りの塩基配
列を有する。これは非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコ
ードする遺伝子の部分cDNA断片であった。
実施例２ 完全長の遺伝子を持ったcDNAの取得 実施例１記載のとおりにしてmRNAを調製し、岡山ベク
ターにより常法（Molecular cloning,PP211,1982）に従
いcDNAを合成する。以下にcDNAの合成法を記す。
ターにより常法（Molecular cloning,PP211,1982）に従
いcDNAを合成する。以下にcDNAの合成法を記す。
pCDV1〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama ＆ Ber
g〕：モレキュラー・アンド・セルラー・アイオロジイ
（Mol.Cell.Biol.），３,280（1983）〕400μｇを10mM
トリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2および10mM NaClから
なる溶液300μに加え、さらに500uのKpn I（宝酒造社
製）を加えて、37℃で６時間反応させ、プラスミド中の
Kpn I部位で切断した。フェノール−クロロホルム抽出
後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。Kpn I切断し
た該DNA約200μｇを40mMカコジル酸ナトリウム、30mMト
リス−HCl（pH6.8）、1mM CaCl2および0.1mMジチオスレ
イトール（以下DTTと略記する）からなる緩衝液（以下T
dT緩衝液と略記する）にdTTPを0.25mMとなるように加え
た溶液200μに加え、さらに81uのターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（以下TdTと略記す
る）（Ｐ−L Biochemicals社製）を加え37℃、11分間反
応させた。ここでpCDV1のKpn I切断部位の３′末端ポリ
（dT）鎖が約67個付加された。該溶液からフェノール−
クロロホルム抽出、エタノール沈殿によりポリ（dT）鎖
の付加したpCVD1 DNA約100μｇを回収した。該DNAを10m
Mトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2および100mM NaClか
らなる緩衝液150μに加え、さらに360uのHpa Iを加
え、37℃２時間反応させた。該反応物をアガロースゲル
電気泳動かけ、約3.1KpのDNA断片を分離、回収し、約60
μｇのポリ（dT）鎖付加pCDV1を得た。該DNAを10mMトリ
ス−HCl（pH8.0）および1mMEDTAからなる溶液500μに
溶解し65℃５分間インキュベート後、氷冷して50μの
5M NaClを加えた。混合物をオリゴ（dA）セルロースカ
ラム（コラボラティブリサーチ社製）クロマトグラフィ
にかけた。ポリ（dT）鎖長が充分なものはカラムに吸着
し、これを10mMトリス−HCl（pH8.0）および1mMEDTAか
らなる溶液で溶出し、ポリ（dT）鎖の付加したpCVD1
（以下ベクタープライマーと略記する）27μｇを得た。
g〕：モレキュラー・アンド・セルラー・アイオロジイ
（Mol.Cell.Biol.），３,280（1983）〕400μｇを10mM
トリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2および10mM NaClから
なる溶液300μに加え、さらに500uのKpn I（宝酒造社
製）を加えて、37℃で６時間反応させ、プラスミド中の
Kpn I部位で切断した。フェノール−クロロホルム抽出
後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。Kpn I切断し
た該DNA約200μｇを40mMカコジル酸ナトリウム、30mMト
リス−HCl（pH6.8）、1mM CaCl2および0.1mMジチオスレ
イトール（以下DTTと略記する）からなる緩衝液（以下T
dT緩衝液と略記する）にdTTPを0.25mMとなるように加え
た溶液200μに加え、さらに81uのターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（以下TdTと略記す
る）（Ｐ−L Biochemicals社製）を加え37℃、11分間反
応させた。ここでpCDV1のKpn I切断部位の３′末端ポリ
（dT）鎖が約67個付加された。該溶液からフェノール−
クロロホルム抽出、エタノール沈殿によりポリ（dT）鎖
の付加したpCVD1 DNA約100μｇを回収した。該DNAを10m
Mトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2および100mM NaClか
らなる緩衝液150μに加え、さらに360uのHpa Iを加
え、37℃２時間反応させた。該反応物をアガロースゲル
電気泳動かけ、約3.1KpのDNA断片を分離、回収し、約60
μｇのポリ（dT）鎖付加pCDV1を得た。該DNAを10mMトリ
ス−HCl（pH8.0）および1mMEDTAからなる溶液500μに
溶解し65℃５分間インキュベート後、氷冷して50μの
5M NaClを加えた。混合物をオリゴ（dA）セルロースカ
ラム（コラボラティブリサーチ社製）クロマトグラフィ
にかけた。ポリ（dT）鎖長が充分なものはカラムに吸着
し、これを10mMトリス−HCl（pH8.0）および1mMEDTAか
らなる溶液で溶出し、ポリ（dT）鎖の付加したpCVD1
（以下ベクタープライマーと略記する）27μｇを得た。
次にリンカーDNAの調製を行った。pL1〔オカヤマ・ア
ンド・バーグ（Okayama ＆ Berg）、モレキュラー・ア
ンド・セルラー・バイオロジイ（Mol.Cell.Biol）、３,
280（1983）〕約14μｇを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6
mM MgCl2および50mM NaClからなる溶液200μを加えさ
らに50uのPst Iを加え、37℃で４時間反応させ、pL1 DN
A中のPst I部位で切断した。該反応物をフェノール−ク
ロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、Pst Iで切
断したpL1 DNA約13μｇを回収した。該DNA約13μｇをTd
T緩衝液には終濃度0.25mMのdGTPを含む溶液50μに加
え、さらにTdT（Ｐ−L Biochemicals社製）54単位を加
えて37℃13分間インキュベートし、pL1のPst I切断部位
３′末端に（dG）鎖を約14個付加した。フェノール−ク
ロロホルム抽出後エタノール沈殿にてDNAを回収した。
該DNAを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2および60
mM NaClからなる緩衝液100μに加え、さらに80uのHin
d IIIを加えて37℃３時間インキュベートし、pL1 DNAの
Hind III部位で切断した。該反応物をアガロースゲル電
気泳動にて分画し、約0.5KbのDNA断片をDEAEペーパー法
〔ドレツエン（Dretzen）ら、アナリティカル・バイオ
ケミストリイ（Anal.Biochem.），112,295（1981）〕に
て回収し、オリゴ（dG）鎖付きのリンカーDNA（以下単
にリンカーDNAと略記する）を得た。
ンド・バーグ（Okayama ＆ Berg）、モレキュラー・ア
ンド・セルラー・バイオロジイ（Mol.Cell.Biol）、３,
280（1983）〕約14μｇを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6
mM MgCl2および50mM NaClからなる溶液200μを加えさ
らに50uのPst Iを加え、37℃で４時間反応させ、pL1 DN
A中のPst I部位で切断した。該反応物をフェノール−ク
ロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、Pst Iで切
断したpL1 DNA約13μｇを回収した。該DNA約13μｇをTd
T緩衝液には終濃度0.25mMのdGTPを含む溶液50μに加
え、さらにTdT（Ｐ−L Biochemicals社製）54単位を加
えて37℃13分間インキュベートし、pL1のPst I切断部位
３′末端に（dG）鎖を約14個付加した。フェノール−ク
ロロホルム抽出後エタノール沈殿にてDNAを回収した。
該DNAを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2および60
mM NaClからなる緩衝液100μに加え、さらに80uのHin
d IIIを加えて37℃３時間インキュベートし、pL1 DNAの
Hind III部位で切断した。該反応物をアガロースゲル電
気泳動にて分画し、約0.5KbのDNA断片をDEAEペーパー法
〔ドレツエン（Dretzen）ら、アナリティカル・バイオ
ケミストリイ（Anal.Biochem.），112,295（1981）〕に
て回収し、オリゴ（dG）鎖付きのリンカーDNA（以下単
にリンカーDNAと略記する）を得た。
上記で調製したポリ（Ａ）RNA約２μｇ、ベクタープ
ライマー約1.4μｇを50mMトリス−HCl（pH8.3）、8mM M
gCl2、30mM KCl、0.3mMDTT、2mMDNTP（dATP、dTTP、dGT
PおよびdcTP）および10uのリボヌクレアーゼインヒビタ
ー（Ｐ−L Biochemicals社製）からなる溶液22.3μに
溶解し、10uの逆転写酵素（生化学工業社製）を加え、3
7℃で40分間インキュベートし、mRNAに相補的なDNAを合
成させた。該DNAをフェノール−クロロホルム抽出、エ
タノール沈殿を行いRNA−DNA二重鎖の付加したベクター
−プライマーDNAを回収した。該DNAを60μmdCTPおよび
0.2μｇポリ（Ａ）を含むTdT緩衝液20μに溶かし、14
uのTdT（Ｐ−L Biochemicals社製）を加えて37℃で８時
間インキュベートし、cDNA3′末端に12個の（dC）鎖を
付加した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出
し、エタノール沈殿により（dC）鎖の付加したcDNA−ベ
クター−プライマーDNAを回収した。該DNAを10mMトリス
−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2および60mM NaClからなる液
400μに溶かし、20uのHind IIIを加え、37℃２時間イ
ンキュベートし、Hind III部位で切断した、該反応物を
フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して0.
5pmoleの（dC）鎖付加cDNA−ベクタ−プライマーDNAを
得た。該DNA0.08pmoleと前記のリンカーDNA0.16pmoleを
10mMトリス−HCl（pH7.5）、0.1M NaClおよび1mMEDTAか
らなる溶液40μに溶かし、65℃、42℃、０℃でそれぞ
れ10分、25分、30分間インキュベートした。20mMトリス
−HCl（pH7.5）4mM MgCl2、10mM（NH4）2SO4、0.1M KCl
および0.1mMβ−NADの組成で全量400μとなるよう反
応液を調製した。該反応液に10uの大腸菌DNAリガーゼ
（New England Biolabe社製）を加え、11℃一夜インキ
ュベートした。該反応液を約40μＭのdNTP、015mMβ−N
ADとなるよう同成分を追加調製し、5uの大腸菌DNAリガ
ーゼ、7uの大腸菌DNAポリメラーゼＩ（ｐ−L Biochemic
als社製）および2uの大腸菌リボヌクレアーゼＨ（ｐ−L
Biochemicals社製）を加え、12℃、25℃で順次１時間
ずつインキューベートした。
ライマー約1.4μｇを50mMトリス−HCl（pH8.3）、8mM M
gCl2、30mM KCl、0.3mMDTT、2mMDNTP（dATP、dTTP、dGT
PおよびdcTP）および10uのリボヌクレアーゼインヒビタ
ー（Ｐ−L Biochemicals社製）からなる溶液22.3μに
溶解し、10uの逆転写酵素（生化学工業社製）を加え、3
7℃で40分間インキュベートし、mRNAに相補的なDNAを合
成させた。該DNAをフェノール−クロロホルム抽出、エ
タノール沈殿を行いRNA−DNA二重鎖の付加したベクター
−プライマーDNAを回収した。該DNAを60μmdCTPおよび
0.2μｇポリ（Ａ）を含むTdT緩衝液20μに溶かし、14
uのTdT（Ｐ−L Biochemicals社製）を加えて37℃で８時
間インキュベートし、cDNA3′末端に12個の（dC）鎖を
付加した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出
し、エタノール沈殿により（dC）鎖の付加したcDNA−ベ
クター−プライマーDNAを回収した。該DNAを10mMトリス
−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2および60mM NaClからなる液
400μに溶かし、20uのHind IIIを加え、37℃２時間イ
ンキュベートし、Hind III部位で切断した、該反応物を
フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して0.
5pmoleの（dC）鎖付加cDNA−ベクタ−プライマーDNAを
得た。該DNA0.08pmoleと前記のリンカーDNA0.16pmoleを
10mMトリス−HCl（pH7.5）、0.1M NaClおよび1mMEDTAか
らなる溶液40μに溶かし、65℃、42℃、０℃でそれぞ
れ10分、25分、30分間インキュベートした。20mMトリス
−HCl（pH7.5）4mM MgCl2、10mM（NH4）2SO4、0.1M KCl
および0.1mMβ−NADの組成で全量400μとなるよう反
応液を調製した。該反応液に10uの大腸菌DNAリガーゼ
（New England Biolabe社製）を加え、11℃一夜インキ
ュベートした。該反応液を約40μＭのdNTP、015mMβ−N
ADとなるよう同成分を追加調製し、5uの大腸菌DNAリガ
ーゼ、7uの大腸菌DNAポリメラーゼＩ（ｐ−L Biochemic
als社製）および2uの大腸菌リボヌクレアーゼＨ（ｐ−L
Biochemicals社製）を加え、12℃、25℃で順次１時間
ずつインキューベートした。
上記反応でcDNAを含む組換えDNAの環状化とRNA−DNA
二重鎖のRNA部分がDNAに置換され、完全な二重鎖DNAの
組換えプラスミドが生成した。
二重鎖のRNA部分がDNAに置換され、完全な二重鎖DNAの
組換えプラスミドが生成した。
このものを使用し、常法により作成した大腸菌MC1064
株のコンピテント細胞を形質転換した。形質転換体約５
万個をニトロセルロース上に固定した。これらのコロニ
ーをコロニー・ハイブリダイゼーション法〔Molecular
Cloning Cold Spring harbor laboratory PP 329（198
2）〕により、常法に従い実施例１で得たcDNA断片を32P
標識してプローブとして用い、スクリーニングした結
果、42℃で強く会合した３個の陽性なクローンが得られ
た。
株のコンピテント細胞を形質転換した。形質転換体約５
万個をニトロセルロース上に固定した。これらのコロニ
ーをコロニー・ハイブリダイゼーション法〔Molecular
Cloning Cold Spring harbor laboratory PP 329（198
2）〕により、常法に従い実施例１で得たcDNA断片を32P
標識してプローブとして用い、スクリーニングした結
果、42℃で強く会合した３個の陽性なクローンが得られ
た。
これらのクローンをサザン（Southen）の方法（ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bi
ol）98,503（1975）〕により詳しく解析した結果、図２
に示す非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質コードする遺伝子
の完全長のcDNAが得られた。
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bi
ol）98,503（1975）〕により詳しく解析した結果、図２
に示す非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質コードする遺伝子
の完全長のcDNAが得られた。
（発明の効果） 大腸菌、枯草菌、酵母、哺乳動物細胞等の公知の宿主
中、プロモータを含有する公知の発現制御配列の制御下
本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎特異高原性蛋白質をコードする
遺伝子を発現させ、非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原を大量に得
ることができる。同抗原から得られる抗体は、免疫反応
による同抗体の検出に応用される。
中、プロモータを含有する公知の発現制御配列の制御下
本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎特異高原性蛋白質をコードする
遺伝子を発現させ、非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原を大量に得
ることができる。同抗原から得られる抗体は、免疫反応
による同抗体の検出に応用される。
また、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原性蛋白質
をコードする遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーションに
よる同抗原性蛋白質遺伝子の検出のためのプローブとし
て有用である。
をコードする遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーションに
よる同抗原性蛋白質遺伝子の検出のためのプローブとし
て有用である。
図−１は、実施例１で得たcDNAの塩基配列を表わす。 図−２は、実施例２で得たcDNAの塩基配列を表わす。 図中、第57番から第1388番までが非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗
原蛋白質をコードする塩基部分を表わす。
原蛋白質をコードする塩基部分を表わす。
フロントページの続き (72)発明者 紅林 理恵 横浜市緑区鴨志田町1000番地 三菱化成 工業株式会社総合研究所内 (72)発明者 寺西 豊 横浜市緑区鴨志田町1000番地 三菱化成 工業株式会社総合研究所内 (72)発明者 中西 重忠 京都市左京区岩倉長谷町517−116 (72)発明者 喜多村 直美 京都市左京区高野上竹屋町31
Claims (2)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列で示される非Ａ非Ｂ型
肝炎特異抗原蛋白質をコードする塩基配列を含んで成る
DNA断片。 - 【請求項２】非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコードす
る塩基配列が下記の塩基配列であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載のDNA断片。 （配列中、「−」はその上に示された塩基に相補的な塩
基を表わす。）
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62140586A JP2590885B2 (ja) | 1987-03-31 | 1987-06-04 | Ｄｎａ断片 |
| US07/168,357 US5032511A (en) | 1987-03-31 | 1988-03-15 | DNA fragments coding for antigens specific to non-A non-B hepatitis, expression vectors containing said DNA fragments, transformants and process for producing said antigens |
| KR1019880003585A KR880011342A (ko) | 1987-03-31 | 1988-03-31 | 비a 비b형 간염 특이 항원을 코딩하는 dna 단편, 이 dna 단편을 함유하는 발현 벡터, 형질전환체 및 이 항원의 제조방법 |
| EP88400790A EP0293274B1 (en) | 1987-03-31 | 1988-03-31 | Dna molecules encoding non-a, non-b hepatitis antigens, and their use in producing said antigens |
| CN88101758A CN1031717A (zh) | 1987-03-31 | 1988-03-31 | 为非甲非乙型肝炎特异性抗原编码的dna片段，含该dna片段的表达载体，其转化体及生产该抗原的方法 |
| DE8888400790T DE3864585D1 (de) | 1987-03-31 | 1988-03-31 | Dns-molekule, codierend fuer non-a-non-b-hepatitis-antigene und ihre verwendung zur herstellung dieser antigene. |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-78313 | 1987-03-31 | ||
| JP7831387 | 1987-03-31 | ||
| JP62140586A JP2590885B2 (ja) | 1987-03-31 | 1987-06-04 | Ｄｎａ断片 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS642576A JPS642576A (en) | 1989-01-06 |
| JPH012576A JPH012576A (ja) | 1989-01-06 |
| JP2590885B2 true JP2590885B2 (ja) | 1997-03-12 |
Family
ID=26419397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62140586A Expired - Lifetime JP2590885B2 (ja) | 1987-03-31 | 1987-06-04 | Ｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2590885B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3156200B2 (ja) * | 1989-09-15 | 2001-04-16 | 国立予防衛生研究所長 | 新規のｈｃｖ分離株 |
| JP3549201B2 (ja) * | 1990-10-24 | 2004-08-04 | 中外製薬株式会社 | 非ａ非ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法及び検出用試薬組成物 |
| KR100456284B1 (ko) * | 2002-07-09 | 2004-11-09 | 학교법인 인하학원 | 미생물로부터의 신속한 핵산의 분리방법 |
-
1987
- 1987-06-04 JP JP62140586A patent/JP2590885B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS642576A (en) | 1989-01-06 |
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