JP2590885B2 - DNA fragment - Google Patents
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- C12N2770/24011—Flaviviridae
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- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規なDNA断片に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Field of Industrial Application) The present invention relates to a novel DNA fragment.
詳しくは、非Ａ非Ｂ型肝炎発症時に特異的にみられる
非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質の遺伝子（Ｃ−DNA）を
含有するDNA断片に関する。More specifically, the present invention relates to a DNA fragment containing a gene (C-DNA) of a non-A non-B hepatitis-specific antigen protein which is specifically observed at the onset of non-A non-B hepatitis.
（従来の技術） ウイルス性肝炎のうち、Ａ型及びＢ型についてはその
ウイルスが見出され、免疫学的な方法による診断も可能
となっている。(Prior Art) Among viral hepatitis, viruses are found in A and B types, and diagnosis by immunological methods is also possible.
しかしながら、Ａ型でもＢ型でもなく、所謂、非Ａ非
Ｂ型といわれる肝炎は、輸血後肝炎の90％以上を占める
とされている〔日本臨牀、35:2724,1977、J.Biol.Med.
（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・メディソン）4
9:243,1976〕が、未だ原因ウイルスが同定されておら
ず、ヒトの非Ａ非Ｂ型肝炎がチンパンジーへの感染可能
であることが確認されているにすぎない〔Lancet I（ラ
ンセットＩ）:459,1978、同:463,1978〕。However, hepatitis, which is neither type A nor type B, and is so-called non-A non-B type, is considered to account for more than 90% of post-transfusion hepatitis [Nippon Rinsho, 35: 2724, 1977, J. Biol. Med. .
(Journal of Biological Medicine) 4
9: 243,1976], but the causative virus has not yet been identified, and it has only been confirmed that human non-A, non-B hepatitis can be transmitted to chimpanzees [Lancet I]. : 459,1978, id: 463,1978].
非Ａ非Ｂ型肝炎に関連した抗原抗体系の検索は、多く
の研究者によって患者の血清を中心になされているが、
まだ明確な系は見出されていない。そのため、非Ａ非Ｂ
型肝炎の診断は、Ａ型肝炎及びＢ型肝炎、更には、肝障
害をひきおこすことが知られている既知ウイルス、例え
ば、CMV、HSV、EBV等による肝炎か否かの診断を行な
い、それらの肝炎でない場合に非Ａ非Ｂ型肝炎と診断す
る、所謂、除外診断法によるため、手間がかかるのが現
状である。Although the search for antigen-antibody systems related to non-A non-B hepatitis has been conducted by many researchers mainly on the serum of patients,
No clear system has yet been found. Therefore, non-A non-B
Diagnosis of hepatitis A, hepatitis A and hepatitis B, further, a known virus that is known to cause liver damage, for example, CMV, HSV, make a diagnosis of hepatitis due to EBV, etc. At present, the diagnosis is based on the so-called exclusion diagnostic method in which non-A non-B hepatitis is diagnosed when hepatitis is not present.
本発明者らの一部は、非Ａ非Ｂ型肝炎を直接診断に有
用な非Ａ非Ｂ型抗原蛋白質をヒト及びチンパンジーの肝
細胞から精製し、更に、その治療に有用はモノクローナ
ル抗体を作成し、先に提案した（特開昭61−176856号、
同61−56196号）。Some of the present inventors purified a non-A non-B antigen protein useful for directly diagnosing non-A non-B hepatitis from human and chimpanzee hepatocytes, and produced a monoclonal antibody useful for the treatment. And proposed earlier (JP-A-61-176856,
No. 61-56196).
（発明の解決すべき問題点） しかしながら、例えば、診断試薬として使用する場合
には、多量の非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質を必要とす
るが、多量の抗原蛋白質を非Ａ非Ｂ型肝炎発症時のチン
パンジー等の肝細胞から精製することは必ずしも好適な
方法とはいえない。また核酸のハイブリダイゼーション
による非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原遺伝子の検出、さらに
は、組換えDNA技術により非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原の生
産には、非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコードする遺
伝子断片の収得が必須である。(Problems to be Solved by the Invention) However, for example, when used as a diagnostic reagent, a large amount of non-A non-B hepatitis-specific antigen protein is required. Purification from hepatocytes such as chimpanzees at the time of onset is not always a suitable method. For the detection of a non-A non-B hepatitis-specific antigen gene by nucleic acid hybridization, and for the production of a non-A non-B hepatitis-specific antigen by recombinant DNA technology, a non-A non-B hepatitis-specific antigen protein is encoded. Acquisition of a gene fragment to be performed is essential.
（問題点を解決するための手段） そこで本発明者らは、該抗原蛋白質を組換えDNA技術
により大量に生産すべく鋭意検討を重ね、かかる目的に
有用な非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコードする遺伝
子を初めて分離収得するに至り、本発明を完成した。(Means for Solving the Problems) Accordingly, the present inventors have conducted intensive studies to produce the antigen protein in large quantities by recombinant DNA technology, and have found that the non-A non-B hepatitis-specific antigen protein useful for this purpose. The present inventors have completed the present invention by isolating and obtaining the gene encoding for the first time.
即ち、本発明の要旨は、非Ａ非Ｂ型肝炎発症時の肝細
胞内に出現する非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコード
する核酸配列を含んで成るDNA断片に存する。That is, the gist of the present invention resides in a DNA fragment comprising a nucleic acid sequence encoding a non-A non-B hepatitis-specific antigen protein that appears in hepatocytes at the onset of non-A non-B hepatitis.
以下、本発明を説明するに、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎
特異抗原蛋白質（以下「本発明の抗原」という。）の遺
伝子は、例えば、次のような方法によって得られる。Hereinafter, to explain the present invention, the gene of the non-A, non-B hepatitis-specific antigen protein (hereinafter, referred to as “the antigen of the present invention”) of the present invention is obtained, for example, by the following method.
まず、ヒト又はチンパンジーの非Ａ非Ｂ型肝炎発症個
体（本発明においては、近年命名された所謂Ｄ型肝炎発
症個体を含む。）の肝組織をグアニジウムチオシアネー
ト水溶液等中でホモジナイズし、Chirgwinらの方法〔Bi
ochemistry（バイオケミストリー）185294−5299,197
9〕に従って、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心法によ
って全RNAを沈殿として分離する。分離後、フェノール
抽出、エタノール沈殿により全RNAを精製する。First, the liver tissue of a human or chimpanzee non-A non-B hepatitis developing individual (including a so-called hepatitis D developing individual recently named in the present invention) is homogenized in a guanidinium thiocyanate aqueous solution or the like, and Chirgwin Their method [Bi
ochemistry (biochemistry) 18 5294-5299,197
According to 9], total RNA is separated as a precipitate by cesium chloride equilibrium density gradient ultracentrifugation. After separation, total RNA is purified by phenol extraction and ethanol precipitation.
抗原遺伝子のmRNAはpoly A部分を含むことが一般的で
あることから常法によりこれをオリゴ（dT）セルロース
カラムクロマトグラフィーにかけ精製し、ポリ（Ａ）含
有RNA（poly A＋RNA）を単離しmRNA原料とする。このmR
NA原料によりランダムプライマー法〔Yousuke Ebina
ら、Cell（セル），40,747−758（1980）〕によりこれ
らpoly A+RNAに対するcDNAライブラリーを得る。例え
ば、６塩基程度の任意のプライマーを用い逆転写酵素に
より上記mRNAに対するcDNAをランダムに合成する。さら
にこのcDNAをDNAメチラーゼ（例えばEcoR Iメチラー
ゼ）によりメチル化し、cDNA中に存在する該制限酵素切
断部位を保護した後、両端に該制限酵素切断部位入りDN
Aリンカー〔例えばEcoR Iリンカー（CGAATTCG）〕を付
加し、該制限酵素（例えばEcoR I）により消化を行う。Since the mRNA of the antigen gene generally contains a polyA portion, the mRNA is purified by an ordinary method using oligo (dT) cellulose column chromatography, and the poly (A) -containing RNA (polyA + RNA) is isolated and the mRNA source is prepared. And This mR
The random primer method [Yousuke Ebina
Cell, 40 , 747-758 (1980)] to obtain a cDNA library for these poly A + RNAs. For example, cDNA for the above mRNA is randomly synthesized by reverse transcriptase using an arbitrary primer of about 6 bases. Further, this cDNA is methylated with a DNA methylase (for example, EcoRI methylase) to protect the restriction enzyme cleavage site present in the cDNA, and then to both ends of the DN containing the restriction enzyme cleavage site.
An A linker (for example, EcoRI linker (CGAATTCG)) is added, and digestion is performed with the restriction enzyme (for example, EcoRI).
このものをプラスミドあるいはλファージ等のクロー
ニングベクターにクローニングする。例えば発現クロー
ニングベクターであるλgt11DNA〔Youg.R.A.ら、Pro.Na
tl.Acad.Sc.USA.（プロシーデングナショナルアカデミ
ーオブサイエンスUSA）80,P1194−1198（1983）〕のEco
R I.部位に導入することができる。This is cloned into a cloning vector such as a plasmid or phage λ. For example, an expression cloning vector λgt11 DNA (Youg. RA et al., Pro.
Eco. of tl.Acad.Sc.USA. (Proceeding National Academy of Sciences USA) 80 , P1194-1198 (1983)]
Can be introduced into the R I. site.
かかるλgt11ファージ内に組み込まれたcDNAはλgt11
ファージ上のβ−gal遺伝子の中に組み込まれるので該
ファージの大腸菌への感染後IPTG（イソプロピルβ−Ｄ
ガラクトピラノシド）等の物質添加による該ファージ上
のラクトースオペロンプロモーターの誘導によりβ−ガ
ラクトシダーゼとの融合タンパク質等として容易に発現
が確認される。The cDNA integrated into such λgt11 phage is λgt11
Since it is integrated into the β-gal gene on the phage, IPTG (isopropyl β-D
Induction of the lactose operon promoter on the phage by addition of a substance such as galactopyranoside) facilitates expression as a fusion protein with β-galactosidase.
この様にして、cDNAが組み込まれたλgt11ファージを
富沢らの方法（「バクテリオファージの実験法」99頁〜
174頁、岩波書店1970年５月30日発行）により大腸菌に
感染させ、IPTG等を含む培地で培養する。形成されたプ
ラークを非Ａ非Ｂ型肝炎特異モノクローナル抗体を使用
し、免疫スクリーニング等の方法によって選択すること
により容易に目的とするcDNAを得ることができる。In this way, the λgt11 phage into which the cDNA was incorporated was prepared according to the method of Tomisawa et al.
(174 pages, Iwanami Shoten, published May 30, 1970), and cultured in a medium containing IPTG and the like. The desired cDNA can be easily obtained by selecting the formed plaques by a method such as immunoscreening using a non-A non-B hepatitis-specific monoclonal antibody.
この免疫スクリーニング法に使用する抗体は特開昭61
−176856号公報、或いは同61−56196号公報に記載され
ている方法に従い調製することができる。スクリーニン
グ法もこれらに記載されているウエスタンプロッティン
グ法で行えばよい。The antibody used in this immunoscreening method is disclosed in
-176856 or 61-56196. The screening method may be performed by the Western plotting method described therein.
更に上記免疫スクリーニング陽性のプラークから富沢
らの方法によりファージを増殖させ、そのものからT.Ma
niatisらの方法〔Molecular Cloning（モレキュラー・
クローニング）,Cold Spring Harbor〕〔Laboratory PP
85（1982）〕によりDNAを精製し適切な制限酵素例えばE
coR I等で切断後、Maxam and Gilbertの方法（Methods
in Enzymology 65,499−560（1980））によって又は制
限酵素で切断後、更にM13ファージにクローンしSanger
らのジオキシ法（Proc.Natl,Acad,Sci,U.S.A.,74 5463
（1977））によって目的cDNAセグメントの塩基配列が決
定できる。Further, phage were grown from the plaques positive for immunoscreening by Tomizawa et al.
niatis et al. [Molecular Cloning
Cloning), Cold Spring Harbor] [Laboratory PP
85 (1982)] and use appropriate restriction enzymes such as E
After cutting with coR I etc., the method of Maxam and Gilbert (Methods
in Enzymology 65 , 499-560 (1980)) or after digestion with restriction enzymes, and further cloned into M13 phage and Sanger
Dioxy method (Proc. Natl, Acad, Sci, USA, 74 5463).
(1977)), the nucleotide sequence of the target cDNA segment can be determined.
この様にして非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原をコードするcD
NA断片が得られる。しかしながら、このようにして得ら
れるDNA断片は、通常非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原をコード
する遺伝子の部分cDNA断片として得られる。完全長のcD
NAは、上記と同様な方法でpoly A+−mRNAを単離、精製
し、このものから岡山−Bergのベクター・プライマーの
方法（Molecular and Cellular Biology ２,161−170,1
982）によりcDNAライブラリーを得る。この様にして調
製したcDNA含有プラスミドを常法、例えばD.Hanahanの
方法（J.Mol.Biol.（ジャーナルオブモレキュラーバイ
オロジー）166,557（1983））により大腸菌等に形質転
換し、アンピシリン耐性株を取得する。この形質転換体
を先の部分、DNA断片をプローブとしてコロニーハイブ
リダイゼーション法等によりスクリーニングする。Thus, cD encoding a non-A non-B hepatitis-specific antigen
An NA fragment is obtained. However, the DNA fragment thus obtained is usually obtained as a partial cDNA fragment of a gene encoding a non-A non-B hepatitis-specific antigen. Full length cD
NA was isolated and purified from poly A + -mRNA in the same manner as described above, and from this, Okayama-Berg vector primer method (Molecular and Cellular Biology 2 , 161-170, 1).
982) to obtain a cDNA library. The cDNA-containing plasmid thus prepared is transformed into Escherichia coli or the like by a conventional method, for example, the method of D. Hanahan (J. Mol. Biol. (Journal of Molecular Biology) 166 , 557 (1983)), and ampicillin-resistant. Acquire shares. The transformant is screened by the colony hybridization method or the like using the DNA fragment as a probe.
かかるプローブの作成法としては、ストレプトアビジ
ン法、ホトビオチン核酸および32P核酸を使用したニッ
クトランスレーション法等が好ましい。As a method for preparing such a probe, a streptavidin method, a nick translation method using a photobiotin nucleic acid and a 32 P nucleic acid, and the like are preferable.
このようにして得られたcDNAクローンを含むコロニー
を培養しBirmboimらの方法〔Nucleic Acid Res.（ニュ
ークレイックアシッドリサーチ），７,1513（1979）〕
に従ってプラスミドDNAを得、適切な制限酵素で切断
後、上記のMaxam and Gilbertの方法によって又は、制
限酵素で切断後、更にM13ファージもしくはプラスミドp
VC12等にクローンし、上述のSangerらのジデオキシ法に
よって目的の完全長cDNAセグメントの塩基配列の決定を
行う。The colonies containing the cDNA clones thus obtained are cultured and the method of Birmboim et al. [Nucleic Acid Res. (New Clay Acid Research), 7 , 1513 (1979)]
After digestion with an appropriate restriction enzyme, followed by the above-described method of Maxam and Gilbert, or after digestion with a restriction enzyme, followed by addition of M13 phage or plasmid p.
The clone is cloned into VC12 or the like, and the nucleotide sequence of the desired full-length cDNA segment is determined by the dideoxy method of Sanger et al.
（実施例） 以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明は、その要旨を越えない限り以下の実施例に
よって限定されるものではない。(Examples) The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples as long as the gist of the present invention is not exceeded.
実施例１ 非Ａ非Ｂ型肝炎感染チンパンジー肝臓よりの
ポリ（Ａ）RNAの調製 肝臓よりチオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法
〔カサラ（Cathala）ら、ディーエヌエイ（DNA），２,3
29（1983）〕に従いポリ（Ａ）を有するRNAを下記の如
く調製した。Example 1 Non-A, Non-B hepatitis infection chimpanzee liver than poly (A) RNA guanidine thiocyanate by preparative liver - lithium chloride method [Kasara (Cathala) et al, DeNA Lee (DNA), 2, 3
29 (1983)], RNA having poly (A) was prepared as follows.
非Ａ非Ｂ型肝炎に感染したチンパンジーより感染肝5g
を摘出し、直ちに液体窒素にて凍結した。このものを液
体窒素とともにワーリングブレンダーに入れ3,000r.p.
m.2分間にて粉砕した。このものを5Mチオシアン酸グア
ニジン、10mMEDTA、50mMトリス−HCl（pH7）および８％
（V/V）β−メルカプトエタノールからなる溶液100ml中
でテフロンホモゲナイザー（5rpm）にてさらに粉砕し、
可溶化した。この可溶化物20mlを遠心管に入っている5.
7McsCl溶液10ml上に静かにのせ、Hitachi RPS28−２ロ
ーターにて27,000rpm、20時間遠心後RNAを沈殿として回
収した。このRNAの沈殿を0.1％ラウリル硫酸ナトリウ
ム、1mMEDTA、10mMトリス・HCl（pH7.5）からなる溶液1
0mlに溶解しフェノール−クロロホルムで抽出後、エタ
ノール沈殿により回収した。得られたRNA約3.95mgを10m
Mトリス−HCl（pH8.0）および1mMEDTAからなる溶液1ml
に溶かした。65℃、５分間インキュベートし0.1mlの5MN
aClを加えた。混合物をオリゴ〔dT〕セルロース・カラ
ム〔ピー・エル・バイオケミカル（Ｐ−L Biochemica
l）社製〕クロマトグラフィー（カラム体積0.5ml）にか
けた。吸着したポリ（Ａ）を有するmRNAを10mlMトリス
−HCl（pH7.5）および1mMEDTAからなる溶液で溶出し、
ポリ（Ａ）を有するmRNA約100μｇを得た。5g liver infected from chimpanzee infected with non-A non-B hepatitis
And immediately frozen in liquid nitrogen. Put this in a Waring blender with liquid nitrogen at 3,000 rp.
m. Milled for 2 minutes. This was combined with 5 M guanidine thiocyanate, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 7) and 8%
(V / V) further pulverized with a Teflon homogenizer (5 rpm) in 100 ml of a solution comprising β-mercaptoethanol,
Solubilized. 20 ml of this lysate is in a centrifuge tube 5.
The solution was gently placed on 10 ml of 7McsCl solution, centrifuged at 27,000 rpm for 20 hours with a Hitachi RPS28-2 rotor, and the RNA was recovered as a precipitate. This RNA precipitate was washed with a solution 1 consisting of 0.1% sodium lauryl sulfate, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5).
After dissolving in 0 ml and extracting with phenol-chloroform, it was recovered by ethanol precipitation. About 3.95 mg of obtained RNA is 10 m
1 ml of a solution consisting of M Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA
Melted into. Incubate 5 minutes at 65 ° C and 0.1 ml of 5MN
aCl was added. The mixture was treated with an oligo [dT] cellulose column [PL Biochemica
l) (Chromatography: 0.5 ml column volume). The mRNA having the adsorbed poly (A) is eluted with a solution consisting of 10 mlM Tris-HCl (pH 7.5) and 1 mM EDTA,
About 100 μg of mRNA having poly (A) was obtained.
まずポリ（Ａ）mRNA10μｇをRT緩衝液（20mMトリス−
HCl（pH8.8）、0.1MKCl、12mM MgCl2、2mM MnCl2）50μ
に溶かし、ランダムプライマーｄ（Ｎ）６〔ピー・エ
ル・バイオケミカル（Ｐ−L Biochemical）社製〕８μ
ｇを加え、95℃、３分間加熱し、変性させた。これを室
温まで徐冷し、ランダムプライマーをアニールさせた。
このものに10mM4NTP 10μ、逆転写酵素225u（宝酒造
社製）を加え、水を加えて計100μの系とし、42℃で
１時間反応させた。First, 10 μg of poly (A) mRNA was added to an RT buffer (20 mM Tris-
HCl (pH8.8), 0.1MKCl, 12mM MgCl 2, 2mM MnCl 2) 50μ
And random primer d (N) 6 (PL Biochemical) 8 μm
g was added and heated at 95 ° C. for 3 minutes to denature. This was gradually cooled to room temperature, and the random primer was annealed.
10 μm of 10 mM 4NTP and 225 u of reverse transcriptase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) were added to this, and water was added to make a total of 100 μ, and reacted at 42 ° C. for 1 hour.
上記反応液50μを使用し10mMNAD 2μ、10mM4dNTP
10μ、RNase H 5u、大腸菌リカーゼ1u、大腸菌DNAポ
リメカラーゼI6.3u、10倍濃度のT4DNAリガーゼ緩衝液
（0.1Mトリス−HCl（pH7.5）0.1MDTT、60mM MgCl2）10
μを加え、計100μの系とし、37℃、１時間反応さ
せ、２本鎖DNAを合成した。Using the above reaction solution 50μ, 10mM NAD 2μ, 10mM 4dNTP
10 μ, RNase H 5 u, E. coli ligase 1 u, E. coli DNA polymechanase I6.3 u, 10-fold concentration of T4 DNA ligase buffer (0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) 0.1 MDTT, 60 mM MgCl 2 ) 10
was added to make a system of 100 μ in total, and reacted at 37 ° C. for 1 hour to synthesize double-stranded DNA.
上記の様にして得た２本鎖DNAを同量の水飽和フェノ
ールで抽出し、エーテルで水層のフェノールを除いた
後、エタノール沈殿を行った。The double-stranded DNA obtained as described above was extracted with the same amount of water-saturated phenol, the phenol in the aqueous layer was removed with ether, and ethanol precipitation was performed.
得られた沈殿を50μの水に溶かし、10倍濃度のT4DN
Aポリメラーゼ緩衝液（0.33Mトリス酢酸（pH7.9）、0.6
6M酢酸カリウム、0.1M酢酸マグネシウム、5mMDTT）10μ
、10mM4dNTD 10μ、T4DNAポリメラーゼ6uを加え、1
00μの系とし、37℃１時間反応させ、２本鎖の平滑末
端をもったDNAを得た。このものを上記したとおり、フ
ェノール抽出し、除タンパクした後、エタノール沈殿を
行ってDNAを精製後、風乾した。The resulting precipitate was dissolved in 50 μl of water, and the concentration of T4DN was 10 times higher.
A polymerase buffer (0.33M Tris acetic acid (pH7.9), 0.6
6M potassium acetate, 0.1M magnesium acetate, 5mMDTT) 10μ
, 10 mM 4dNTD 10 μ, T4 DNA polymerase 6 u, 1
The reaction was performed at 37 ° C. for 1 hour to obtain a double-stranded DNA having blunt ends. This was subjected to phenol extraction and protein removal as described above, followed by ethanol precipitation to purify DNA, followed by air drying.
このものに50mMトリス−HCl（pH7.5）1mM Na2EDTA、5
mMDTTA 20μ、100uMB−アデノシル−Ｌ−メチオニン
２μ、1.8mg/ml EcoR Iメチラーゼ0.2μを加え37℃
15分間反応させ、DNA断片上のEcoR I制限酵素切断部位
のメチル化を行ないその後70℃、15分熱処理を行って酵
素を失活させた。50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 1 mM Na 2 EDTA, 5 mM
Added 20 μm of mMDTTA, 2 μm of 100 μMB-adenosyl-L-methionine, and 0.2 μm of 1.8 mg / ml EcoRI methylase at 37 ° C.
The reaction was allowed to proceed for 15 minutes, methylation of the EcoRI restriction enzyme cleavage site on the DNA fragment was performed, and then heat treatment was performed at 70 ° C. for 15 minutes to inactivate the enzyme.
次に、３′リン酸化したEcoR Iリンカー（GGAATTCC）
を全合成DNA分子数の100倍になる様に加え、10倍濃度の
T4DNAリカーゼ緩衝液（0.5Mトリス−HCl（pH7.5）、60m
M MgCl2、10mMDTT）を５μを加え、0.1MATP 5μ、T
4DNAリガーゼ5uを加え計50μの系とし、４℃16時間反
応させた後、70℃、10分間加熱して酵素を失活させた。
次に10倍濃度のEcoR I緩衝液（15Mトリス−HCl（pH7.
5）、0.5M NaCl、60mM MgCl2）を10μ、EcoR I 100u
を加えて計100μの系とし37℃、２時間反応させ、余
分なリンカーを切除した。さらにBio Gel A−50（0.2cm
×32cm）（Bio RAD社製）にこの反応液を通し、10mMト
リス−HCl（pH7.5）6mM MgCl2緩衝液にて流出し、余分
なEcoR Iリンカーを除去し、EcoR Iリンカーの付いた二
本鎖cDNAを精製した。Next, 3 'phosphorylated EcoR I linker (GGAATTCC)
To 100 times the total number of synthetic DNA molecules,
T4 DNA lyase buffer (0.5M Tris-HCl (pH7.5), 60m
M MgCl 2 , 10 mM DTT) and add 5μ, 0.1MATP 5μ, T
After adding 5 u of 4DNA ligase to make a system of 50 μ in total, and reacting at 4 ° C. for 16 hours, the enzyme was inactivated by heating at 70 ° C. for 10 minutes.
Next, a 10-fold concentration of EcoRI buffer (15 M Tris-HCl (pH 7.
5), 0.5M NaCl, 60mM MgCl 2 ) 10μ, EcoR I 100u
Was added to make a total system of 100 μ, and reacted at 37 ° C. for 2 hours to remove excess linker. In addition, Bio Gel A-50 (0.2cm
(× 32 cm) (manufactured by Bio RAD), the reaction solution was passed through, and eluted with a 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 6 mM MgCl 2 buffer to remove excess EcoR I linker and attach an EcoR I linker. The double-stranded cDNA was purified.
得られたEcoR Iリンカー付二本鎖cDNA断片を用い、Ec
oR Iで切断したλgt11DNA 10μｇと10倍濃度のT4DNAリ
ガーゼ緩衝液（前述）10μ、0.1MATP 10μ、T4DNA
リガーゼ10uを加え計100μの反応系で４℃16時間反応
させλgt11DNAに上記二本鎖cDNA断片を挿入した。Using the obtained double-stranded cDNA fragment with EcoRI linker, Ec
10 μg of λgt11 DNA cleaved with oRI and a 10-fold concentration of T4 DNA ligase buffer (described above) 10 μ, 0.1 MATP 10 μ, T4 DNA
Ligase (10u) was added, and the mixture was reacted at 4 ° C for 16 hours in a total reaction system of 100µ to insert the double-stranded cDNA fragment into λgt11 DNA.
λファージパッケージングキット（プロメガBiotech
社製）を用い上記DNAをλファージ粒子中へ導入した。
パッケージングの手順はキットの説明書に従い行った。λ phage packaging kit (Promega Biotech
The above DNA was introduced into the λ phage particles using the following method.
The packaging procedure was performed according to the kit instructions.
このDNAパッケージングを終了したλgt11ファージを
常法（バクテリオファージ実験法99頁〜174頁、岩波書
店1970年５月30日発行）、富沢らの法により大腸菌Y109
0株に感染させプラークを形成させた。約20万個のプラ
ークより以下に示すような免疫スクリーニング法により
陽性のクローン１個を得た。この免疫スクリーニングに
使用した抗体は特開昭61−176856号公報に記載されてい
る方法で調製したものである。The λgt11 phage having completed the DNA packaging was subjected to a conventional method (bacteriophage experiment method, pp. 99-174, published by Iwanami Shoten, May 30, 1970) and Escherichia coli Y109 by the method of Tomizawa et al.
0 strains were infected to form plaques. One positive clone was obtained from about 200,000 plaques by the immunoscreening method described below. The antibody used for this immunoscreening was prepared by the method described in JP-A-61-176856.
まずλgt11に感染したY1090〔Young R.A.ら;Pro.Nat
l.Acad.Sci.USA（プロシーデング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンスUSA）,80,1194−1198（1
983）〕を42℃に保温した上層軟寒天とともにシャーレ
まき、42℃に５時間放置した。次に10mMIPTGを含んだニ
トロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ社製BA−83ポアサイ
ズ0.2μｍ）をその上に置き37℃にて３〜４時間培養し
た。このニトロセルロースフィルターをTBS緩衝液（10m
Mトリス−HCl（pH7.5）50mM NaCl）で軽く洗い、３％ゼ
ラチンを含むTBS緩衝液400mlに浸し、40℃、１時間振と
うを行ってニトロセルロースフィルターのプロッキング
を行った。次に非Ａ非Ｂ肝炎特異抗原に対するモノクロ
ーナル抗体（OD280＝4.3）を１％ゼラチンを含むTBS緩
衝液に400分の１希釈になるように加え、フィルター１
枚につき2mlになる様にビニール袋にフィルターととも
に入れ、室温で16時間反応させた。次に005％Tween20を
含むTBS緩衝液400mlにて10分間３回洗浄し標識２次抗体
である抗マウスIgG−PAP（フォースラディシュペルオキ
シダーゼ）（バイオ・ラッド社製）を１％ゼラチンを含
むTBS緩衝液に1000分の１希釈に加え、フィルター１枚
につき2mlになる様にビニール袋にフィルターとともに
入れ、室温で２時間反応させ、同様に0.05％Tween20を
含むTBS緩衝液400mlにて10分間３回洗浄した。発色はフ
ィルターを４−Chloro−１−naphthol（バイオ−ラッド
社製）12mgを過酸化水素水を含む20mlのTBS緩衝液に浸
して行った。発色終了後、フィルターは水でよく洗い水
を入れたビニール袋に入れて冷暗所に保存した。First, Y1090 infected with λgt11 [Young RA et al .; Pro.Nat
l.Acad.Sci.USA (Proceedings of National
Academy of Science USA), 80, 1194-1198 (1
983)] was sprinkled with an upper soft agar kept at 42 ° C, and left at 42 ° C for 5 hours. Next, a nitrocellulose filter containing 10 mM IPTG (BA-83 pore size: 0.2 μm, manufactured by S & S) was placed thereon and cultured at 37 ° C. for 3 to 4 hours. This nitrocellulose filter was washed with TBS buffer (10m
The plate was washed gently with M Tris-HCl (pH 7.5) 50 mM NaCl), immersed in 400 ml of a 3% gelatin-containing TBS buffer, shaken at 40 ° C. for 1 hour, and blocking the nitrocellulose filter. Next, a monoclonal antibody against non-A non-B hepatitis-specific antigen (OD 280 = 4.3) was added to a TBS buffer solution containing 1% gelatin to a dilution of 1/400, and a filter 1 was added.
Each filter was put in a plastic bag together with a filter so that the volume became 2 ml, and reacted at room temperature for 16 hours. Next, the plate was washed three times for 10 minutes with 400 ml of a TBS buffer solution containing 005% Tween 20, and an anti-mouse IgG-PAP (Forsradish peroxidase) (manufactured by Bio-Rad), a labeled secondary antibody, was added to a TBS buffer containing 1% gelatin. Add 1/1000 dilution to the solution, put the filter in a plastic bag together with the filter so that the volume of each filter becomes 2 ml, and allow to react at room temperature for 2 hours. Similarly, 3 times for 10 minutes with 400 ml of TBS buffer containing 0.05% Tween 20 Washed. Color development was performed by immersing the filter in 12 mg of 4-Chloro-1-naphthol (manufactured by Bio-Rad) in 20 ml of a TBS buffer solution containing hydrogen peroxide solution. After color development, the filter was washed well with water and placed in a plastic bag filled with water and stored in a cool and dark place.
このようにしてポジティブなプラークを１個得た。こ
のポジティブプラークのシングルプラークアイソレーシ
ョンを３度行った。３度とも免疫スクリーニングを同様
に行いポジティブであることを確認した。Thus, one positive plaque was obtained. Single plaque isolation of this positive plaque was performed three times. All three times were subjected to the same immunoscreening to confirm that they were positive.
次にこのファージを大量に培養し、そのDNAを精製し
た。まずY1090菌をNZ培地（NZアミン10g、NaCl5g、5mM
MgCl2を水１に加え、pH7.2に調整）10mlで一晩培養し
た。このもの1mlにm.o.i（マルチプリシティ オブ イ
ンフェクション）0.1になる様にファージを感染させ、3
7℃10分間放置後、NZ培地１に移し溶菌するまで７〜
８時間37℃にて振とう培養を行いクロロホルム5mlを加
え、さらに30分間振とうを続けた。次に菌体残査を650
r.p.m.10分間の遠心分離により除去し、上清にNaCl29
g、ポリエチレングリコール70gを加えよく溶かしてから
４℃で一晩放置した。6500r.p.m.20分の遠心分離で沈殿
を集め、よく水滴を切り沈殿を20mlのTM緩衝液（10mMト
リス−HCl（pH7.5）・5mM MgCl2）に溶かしDNase I、RN
ase Aをともに10μg/mlの濃度になる様に加え、37℃１
時間反応させた。Next, the phage was cultured in large quantities and the DNA was purified. First, Y1090 bacteria were added to NZ medium (NZ amine 10 g, NaCl 5 g, 5 mM
MgCl 2 was added to water 1 to adjust to pH 7.2), and cultured overnight in 10 ml. Infect 1 ml of this phage to a moi (Multiplicity of Infection) of 0.1.
After standing at 7 ℃ for 10 minutes, transfer to NZ medium 1 and wait 7 ~
Shaking culture was carried out at 37 ° C. for 8 hours, 5 ml of chloroform was added, and shaking was continued for another 30 minutes. Next, the cell residue is
Remove by centrifugation at rpm for 10 minutes and add NaCl29 to the supernatant.
g and 70 g of polyethylene glycol were added and dissolved well, and then left at 4 ° C. overnight. The precipitate was collected by centrifugation at 6500 rpm for 20 minutes, water droplets were well removed, and the precipitate was dissolved in 20 ml of TM buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 5 mM MgCl 2 ), and DNase I, RN
Add ase A together to a concentration of 10 μg / ml, and add
Allowed to react for hours.
次に、20mlのクロロホルムを加えて撹拌し、ポリエチ
レングリコールをクロロホルムに溶解させて水層からと
り除去した。この水層をさらに2800r.p.m.で60分の超遠
心分離にかけファージ粒子のペレットを得た。このペレ
ットを1mlのTM緩衝液にとかし、CsCl密度勾配遠心（330
00r.p.m.20時間）によりρ＝1.45〜1.50のファージ粒子
を含んだ分画を得た。TM緩衝液に対し一晩、透析を行っ
た後、プロティンアーゼＫを100μg/mlになる様加え、3
7℃で１時間反応させた。その後、同量の水飽和フェノ
ールを加えゆるやかにフェノール抽出を行った。6500r.
p.m.10分間の遠心分離の後、水層をとり出し、透析チュ
ーブに入れて水に対して４℃で一晩透析を行った。この
様にして、約5mgのDNAが得られた。Next, 20 ml of chloroform was added and stirred, and polyethylene glycol was dissolved in chloroform and removed from the aqueous layer and removed. This aqueous layer was further subjected to ultracentrifugation at 2800 rpm for 60 minutes to obtain a phage particle pellet. Dissolve the pellet in 1 ml of TM buffer and centrifuge with CsCl density gradient (330
(00r.pm for 20 hours) to obtain a fraction containing phage particles with ρ = 1.45 to 1.50. After dialysis against TM buffer overnight, proteinase K was added to a concentration of 100 μg / ml.
The reaction was performed at 7 ° C. for 1 hour. Thereafter, the same amount of water-saturated phenol was added and phenol extraction was performed slowly. 6500r.
After centrifugation at pm for 10 minutes, the aqueous layer was removed, placed in a dialysis tube, and dialyzed against water overnight at 4 ° C. In this way, about 5 mg of DNA was obtained.
このDNA100μｇをEcoR I 100uで前述の緩衝液系100μ
中にて37℃反応して切断したところ390bpと345bpのcD
NAセグメントがファージDNAに挿入されていることが判
明した。この２つのEcoR Iフラグメントをクローニング
ベクターであるpUC119のEcoR I部位に再度クローニング
し、ジデオキシ法にて市販のプライマーCAGGAAACAGCTAT
GACおよびAGTCACGACGTTGTAを用いて夫々についてその塩
基配列を決定した。２つのDNAの結合部分の塩基配列は
このcDNA断片の内部にあるBamH I、EcoR V部位を同部位
に特異的な制限酵素で切断し、得られるBamH I−EcoR V
DNAフラグメントpUc119のBamH I、Sma I部位に挿入し
て同様にジデオキシ法にてそのフラグメントの塩基配列
を決定した。該cDNA断片は、図−１に示す通りの塩基配
列を有する。これは非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質をコ
ードする遺伝子の部分cDNA断片であった。100 μg of this DNA was mixed with 100 μl of the aforementioned buffer
390bp and 345bp cD
It was found that the NA segment was inserted into the phage DNA. These two EcoRI fragments were cloned again into the cloning vector EcoRI site of pUC119, and the commercially available primer CAGGAAACAGCTAT was prepared by the dideoxy method.
The nucleotide sequence was determined for each of GAC and AGTCACGACGTTGTA. The base sequence of the binding portion between the two DNAs is obtained by cleaving the BamH I and EcoR V sites inside this cDNA fragment with a restriction enzyme specific to the same site, and obtaining the BamH I-EcoR V
The DNA fragment was inserted into the BamH I and Sma I sites of pUc119, and the nucleotide sequence of the fragment was determined by the dideoxy method in the same manner. The cDNA fragment has a base sequence as shown in FIG. This was a partial cDNA fragment of the gene encoding the non-A non-B hepatitis-specific antigen protein.
実施例２ 完全長の遺伝子を持ったcDNAの取得 実施例１記載のとおりにしてmRNAを調製し、岡山ベク
ターにより常法（Molecular cloning,PP211,1982）に従
いcDNAを合成する。以下にcDNAの合成法を記す。Example 2 Acquisition of cDNA having full-length gene mRNA is prepared as described in Example 1, and cDNA is synthesized using Okayama vector according to a conventional method (Molecular cloning, PP211, 1982). The method for cDNA synthesis is described below.
pCDV1〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama ＆ Ber
g〕：モレキュラー・アンド・セルラー・アイオロジイ
（Mol.Cell.Biol.），３,280（1983）〕400μｇを10mM
トリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2および10mM NaClから
なる溶液300μに加え、さらに500uのKpn I（宝酒造社
製）を加えて、37℃で６時間反応させ、プラスミド中の
Kpn I部位で切断した。フェノール−クロロホルム抽出
後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。Kpn I切断し
た該DNA約200μｇを40mMカコジル酸ナトリウム、30mMト
リス−HCl（pH6.8）、1mM CaCl2および0.1mMジチオスレ
イトール（以下DTTと略記する）からなる緩衝液（以下T
dT緩衝液と略記する）にdTTPを0.25mMとなるように加え
た溶液200μに加え、さらに81uのターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（以下TdTと略記す
る）（Ｐ−L Biochemicals社製）を加え37℃、11分間反
応させた。ここでpCDV1のKpn I切断部位の３′末端ポリ
（dT）鎖が約67個付加された。該溶液からフェノール−
クロロホルム抽出、エタノール沈殿によりポリ（dT）鎖
の付加したpCVD1 DNA約100μｇを回収した。該DNAを10m
Mトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2および100mM NaClか
らなる緩衝液150μに加え、さらに360uのHpa Iを加
え、37℃２時間反応させた。該反応物をアガロースゲル
電気泳動かけ、約3.1KpのDNA断片を分離、回収し、約60
μｇのポリ（dT）鎖付加pCDV1を得た。該DNAを10mMトリ
ス−HCl（pH8.0）および1mMEDTAからなる溶液500μに
溶解し65℃５分間インキュベート後、氷冷して50μの
5M NaClを加えた。混合物をオリゴ（dA）セルロースカ
ラム（コラボラティブリサーチ社製）クロマトグラフィ
にかけた。ポリ（dT）鎖長が充分なものはカラムに吸着
し、これを10mMトリス−HCl（pH8.0）および1mMEDTAか
らなる溶液で溶出し、ポリ（dT）鎖の付加したpCVD1
（以下ベクタープライマーと略記する）27μｇを得た。pCDV1 [Okayama & Ber
g]: (. Mol.Cell.Biol) Molecular and Cellular Aiorojii, 3, 280 (1983)] 10mM the 400μg
To a solution of Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl 2 and 10 mM NaCl (300 μm) was added 500 μl of Kpn I (Takara Shuzo), and the mixture was reacted at 37 ° C. for 6 hours.
Cleavage at the Kpn I site. After phenol-chloroform extraction, DNA was recovered by ethanol precipitation. About 200 μg of the DNA digested with KpnI was subjected to a buffer solution (hereinafter referred to as TTT) comprising 40 mM sodium cacodylate, 30 mM Tris-HCl (pH 6.8), 1 mM CaCl 2 and 0.1 mM dithiothreitol (hereinafter abbreviated as DTT).
200 μl of a solution obtained by adding dTTP to dT buffer to 0.25 mM to 200 μl, and further adding 81 u of terminal deoxynucleotidyl transferase (hereinafter abbreviated as TdT) (manufactured by P-L Biochemicals) to 37 ° C. For 11 minutes. Here, about 67 3′-terminal poly (dT) chains at the KpnI cleavage site of pCDV1 were added. Phenol from the solution
About 100 μg of pCVD1 DNA to which the poly (dT) chain was added was recovered by chloroform extraction and ethanol precipitation. 10m of the DNA
M Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM of a buffer solution consisting of 6 mM MgCl 2 and 100 mM NaCl were added, and 360 u of Hpa I was further added, followed by reaction at 37 ° C for 2 hours. The reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 3.1 Kp was separated and recovered.
μg of poly (dT) chain-added pCDV1 was obtained. The DNA was dissolved in 500 μl of a solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA, incubated at 65 ° C. for 5 minutes, and cooled on ice to 50 μl.
5M NaCl was added. The mixture was subjected to oligo (dA) cellulose column (Collaborative Research) chromatography. Those having a sufficient poly (dT) chain length are adsorbed to the column and eluted with a solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA, and pCVD1 with poly (dT) chain added.
27 μg (hereinafter abbreviated as vector primer) was obtained.
次にリンカーDNAの調製を行った。pL1〔オカヤマ・ア
ンド・バーグ（Okayama ＆ Berg）、モレキュラー・ア
ンド・セルラー・バイオロジイ（Mol.Cell.Biol）、３,
280（1983）〕約14μｇを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6
mM MgCl2および50mM NaClからなる溶液200μを加えさ
らに50uのPst Iを加え、37℃で４時間反応させ、pL1 DN
A中のPst I部位で切断した。該反応物をフェノール−ク
ロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、Pst Iで切
断したpL1 DNA約13μｇを回収した。該DNA約13μｇをTd
T緩衝液には終濃度0.25mMのdGTPを含む溶液50μに加
え、さらにTdT（Ｐ−L Biochemicals社製）54単位を加
えて37℃13分間インキュベートし、pL1のPst I切断部位
３′末端に（dG）鎖を約14個付加した。フェノール−ク
ロロホルム抽出後エタノール沈殿にてDNAを回収した。
該DNAを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2および60
mM NaClからなる緩衝液100μに加え、さらに80uのHin
d IIIを加えて37℃３時間インキュベートし、pL1 DNAの
Hind III部位で切断した。該反応物をアガロースゲル電
気泳動にて分画し、約0.5KbのDNA断片をDEAEペーパー法
〔ドレツエン（Dretzen）ら、アナリティカル・バイオ
ケミストリイ（Anal.Biochem.），112,295（1981）〕に
て回収し、オリゴ（dG）鎖付きのリンカーDNA（以下単
にリンカーDNAと略記する）を得た。Next, linker DNA was prepared. pL1 [Okayama & Berg, Molecular & Cellular Biology (Mol. Cell. Biol), 3 ,
280 (1983)] about 14 μg in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6
200 μl of a solution composed of mM MgCl 2 and 50 mM NaCl was added, 50 μl of Pst I was further added, and the mixture was allowed to react at 37 ° C. for 4 hours.
Cleavage at Pst I site in A. After extracting the reaction product with phenol-chloroform, ethanol precipitation was performed, and about 13 μg of pL1 DNA digested with PstI was recovered. About 13 μg of the DNA is Td
The T buffer was added to 50 μl of a solution containing 0.25 mM dGTP at a final concentration, and 54 units of TdT (manufactured by P-L Biochemicals) was further added thereto. The mixture was incubated at 37 ° C. for 13 minutes. About 14 (dG) chains were added. DNA was recovered by ethanol precipitation after phenol-chloroform extraction.
The DNA was treated with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl 2 and 60 mM.
100 μM of buffer consisting of mM NaCl, and 80 μL of Hin
Add dIII and incubate at 37 ° C for 3 hours to obtain pL1 DNA.
Cleavage at Hind III site. The reaction product was fractionated by agarose gel electrophoresis, and the DNA fragment of about 0.5 Kb was subjected to the DEAE paper method [Dretzen et al., Analytical Biochemistry., 112 , 295 (1981)]. To obtain a linker DNA with an oligo (dG) chain (hereinafter simply referred to as linker DNA).
上記で調製したポリ（Ａ）RNA約２μｇ、ベクタープ
ライマー約1.4μｇを50mMトリス−HCl（pH8.3）、8mM M
gCl2、30mM KCl、0.3mMDTT、2mMDNTP（dATP、dTTP、dGT
PおよびdcTP）および10uのリボヌクレアーゼインヒビタ
ー（Ｐ−L Biochemicals社製）からなる溶液22.3μに
溶解し、10uの逆転写酵素（生化学工業社製）を加え、3
7℃で40分間インキュベートし、mRNAに相補的なDNAを合
成させた。該DNAをフェノール−クロロホルム抽出、エ
タノール沈殿を行いRNA−DNA二重鎖の付加したベクター
−プライマーDNAを回収した。該DNAを60μmdCTPおよび
0.2μｇポリ（Ａ）を含むTdT緩衝液20μに溶かし、14
uのTdT（Ｐ−L Biochemicals社製）を加えて37℃で８時
間インキュベートし、cDNA3′末端に12個の（dC）鎖を
付加した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出
し、エタノール沈殿により（dC）鎖の付加したcDNA−ベ
クター−プライマーDNAを回収した。該DNAを10mMトリス
−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2および60mM NaClからなる液
400μに溶かし、20uのHind IIIを加え、37℃２時間イ
ンキュベートし、Hind III部位で切断した、該反応物を
フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して0.
5pmoleの（dC）鎖付加cDNA−ベクタ−プライマーDNAを
得た。該DNA0.08pmoleと前記のリンカーDNA0.16pmoleを
10mMトリス−HCl（pH7.5）、0.1M NaClおよび1mMEDTAか
らなる溶液40μに溶かし、65℃、42℃、０℃でそれぞ
れ10分、25分、30分間インキュベートした。20mMトリス
−HCl（pH7.5）4mM MgCl2、10mM（NH4）2SO4、0.1M KCl
および0.1mMβ−NADの組成で全量400μとなるよう反
応液を調製した。該反応液に10uの大腸菌DNAリガーゼ
（New England Biolabe社製）を加え、11℃一夜インキ
ュベートした。該反応液を約40μＭのdNTP、015mMβ−N
ADとなるよう同成分を追加調製し、5uの大腸菌DNAリガ
ーゼ、7uの大腸菌DNAポリメラーゼＩ（ｐ−L Biochemic
als社製）および2uの大腸菌リボヌクレアーゼＨ（ｐ−L
Biochemicals社製）を加え、12℃、25℃で順次１時間
ずつインキューベートした。About 2 μg of the poly (A) RNA prepared above and about 1.4 μg of the vector primer were mixed with 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 8 mM M
gCl 2 , 30 mM KCl, 0.3 mM TTT, 2 mM NTP (dATP, dTTP, dGT
P and dcTP) and 10 u of ribonuclease inhibitor (manufactured by P-L Biochemicals) were dissolved in 22.3 μ, and 10 u of reverse transcriptase (manufactured by Seikagaku Corporation) was added.
After incubation at 7 ° C. for 40 minutes, a DNA complementary to the mRNA was synthesized. The DNA was subjected to phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation to recover a vector-primer DNA to which an RNA-DNA duplex was added. The DNA was transferred to 60 μm CTP and
Dissolve in 20 μl of TdT buffer containing 0.2 μg poly (A) and add
uTdT (manufactured by P-L Biochemicals) was added and incubated at 37 ° C. for 8 hours to add 12 (dC) chains to the 3 ′ end of cDNA. The reaction product was extracted with phenol-chloroform, and the cDNA-vector-primer DNA to which the (dC) chain was added was recovered by ethanol precipitation. A solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl 2 and 60 mM NaCl
Dissolved in 400μ, added 20u of Hind III, incubated at 37 ° C for 2 hours, cut at the Hind III site, extracted the reaction with phenol-chloroform, precipitated with ethanol and added 0.1%.
5 pmole of (dC) -strand-added cDNA-vector-primer DNA was obtained. The DNA 0.08 pmole and the linker DNA 0.16 pmole
It was dissolved in 40 μm of a solution composed of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 M NaCl and 1 mM EDTA, and incubated at 65 ° C., 42 ° C., and 0 ° C. for 10, 25, and 30 minutes, respectively. 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 4 mM MgCl 2 , 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1 M KCl
A reaction solution was prepared so as to have a total amount of 400 μm with a composition of 0.1 mM β-NAD. 10 u of E. coli DNA ligase (New England Biolabe) was added to the reaction solution, and the mixture was incubated at 11 ° C overnight. The reaction solution was added with about 40 μM dNTP, 015 mM β-N
The same components were additionally prepared to become AD, and 5u of E. coli DNA ligase and 7u of E. coli DNA polymerase I (p-L Biochemic
als) and 2u of E. coli ribonuclease H (p-L
Biochemicals) and incubated at 12 ° C. and 25 ° C. for 1 hour.
上記反応でcDNAを含む組換えDNAの環状化とRNA−DNA
二重鎖のRNA部分がDNAに置換され、完全な二重鎖DNAの
組換えプラスミドが生成した。Circularization of recombinant DNA including cDNA and RNA-DNA in the above reaction
The double-stranded RNA portion was replaced by DNA, producing a complete double-stranded DNA recombinant plasmid.
このものを使用し、常法により作成した大腸菌MC1064
株のコンピテント細胞を形質転換した。形質転換体約５
万個をニトロセルロース上に固定した。これらのコロニ
ーをコロニー・ハイブリダイゼーション法〔Molecular
Cloning Cold Spring harbor laboratory PP 329（198
2）〕により、常法に従い実施例１で得たcDNA断片を32P
標識してプローブとして用い、スクリーニングした結
果、42℃で強く会合した３個の陽性なクローンが得られ
た。Escherichia coli MC1064 prepared by using this
Strain competent cells were transformed. About 5 transformants
Ten thousand were fixed on nitrocellulose. These colonies are used for colony hybridization [Molecular
Cloning Cold Spring harbor laboratory PP 329 (198
By 2)], cDNA fragments of 32 P obtained in Example 1 in a conventional manner
As a result of screening after labeling and using as a probe, three positive clones strongly associated at 42 ° C. were obtained.
これらのクローンをサザン（Southen）の方法（ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bi
ol）98,503（1975）〕により詳しく解析した結果、図２
に示す非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原蛋白質コードする遺伝子
の完全長のcDNAが得られた。These clones were prepared according to the Southern method (Journal of Molecular Biology (J. Mol. Bi).
ol) 98 , 503 (1975)].
The full-length cDNA of the gene encoding the non-A non-B hepatitis-specific antigen protein shown in FIG.
（発明の効果） 大腸菌、枯草菌、酵母、哺乳動物細胞等の公知の宿主
中、プロモータを含有する公知の発現制御配列の制御下
本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎特異高原性蛋白質をコードする
遺伝子を発現させ、非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原を大量に得
ることができる。同抗原から得られる抗体は、免疫反応
による同抗体の検出に応用される。(Effect of the Invention) In a known host such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, or mammalian cells, the present invention encodes the non-A non-B hepatitis-specific plateau protein of the present invention under the control of a known expression control sequence containing a promoter. By expressing the gene, a large amount of non-A, non-B hepatitis-specific antigen can be obtained. An antibody obtained from the antigen is applied to the detection of the antibody by an immune reaction.
また、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原性蛋白質
をコードする遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーションに
よる同抗原性蛋白質遺伝子の検出のためのプローブとし
て有用である。Further, the gene encoding the non-A non-B hepatitis virus antigenic protein of the present invention is useful as a probe for detecting the antigenic protein gene by nucleic acid hybridization.
図−１は、実施例１で得たcDNAの塩基配列を表わす。 図−２は、実施例２で得たcDNAの塩基配列を表わす。 図中、第57番から第1388番までが非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗
原蛋白質をコードする塩基部分を表わす。FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the cDNA obtained in Example 1. FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the cDNA obtained in Example 2. In the figure, No. 57 to No. 1388 represent the nucleotide portion encoding the non-A non-B hepatitis-specific antigen protein.
フロントページの続き (72)発明者 紅林 理恵 横浜市緑区鴨志田町1000番地 三菱化成 工業株式会社総合研究所内 (72)発明者 寺西 豊 横浜市緑区鴨志田町1000番地 三菱化成 工業株式会社総合研究所内 (72)発明者 中西 重忠 京都市左京区岩倉長谷町517−116 (72)発明者 喜多村 直美 京都市左京区高野上竹屋町31Continuing from the front page (72) Inventor Rie Kobayashi 1000 Kamoshita-cho, Midori-ku, Yokohama-shi, Mitsubishi Chemical Industry Co., Ltd. (72) Inventor Shigetada Nakanishi 517-116, Iwakura Hase-cho, Sakyo-ku, Kyoto-shi
Claims (2)
肝炎特異抗原蛋白質をコードする塩基配列を含んで成る
DNA断片。 The present invention comprises a base sequence encoding a non-A non-B hepatitis-specific antigen protein represented by the following amino acid sequence:
DNA fragments.
る塩基配列が下記の塩基配列であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載のDNA断片。 （配列中、「−」はその上に示された塩基に相補的な塩
基を表わす。）2. The DNA fragment according to claim 1, wherein the nucleotide sequence encoding the non-A non-B hepatitis-specific antigen protein is the following nucleotide sequence. (In the sequence, "-" represents a base complementary to the base indicated above.)
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