JP2582112B2 - 耐熱性トレハラーゼ遺伝子ｄｎａ、該ｄｎａを含む組換え体プラスミド、形質転換体及び耐熱性トレハラーゼの製法 - Google Patents
耐熱性トレハラーゼ遺伝子ｄｎａ、該ｄｎａを含む組換え体プラスミド、形質転換体及び耐熱性トレハラーゼの製法Info
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は耐熱性トレハラーゼ遺伝子DNA、該DNAをベク
タープラスミドに連結した組換え体プラスミド、該プラ
スミドを導入した形質転換体及び該形質転換体による耐
熱性トレハラーゼの製法に関する。
タープラスミドに連結した組換え体プラスミド、該プラ
スミドを導入した形質転換体及び該形質転換体による耐
熱性トレハラーゼの製法に関する。
トレハラーゼは、高等動物、昆虫および微生物等に広
く自然界に分布している。特にトレハラーゼを生産する
微生物としてはアスペルギルス（Aspergillus）属（K.H
orikoshi,J.Bacteriol,1966,91,1883）、トリコデルマ
（Trichoderuma）属（P.Vijiyakuumar,Can.J.Microbil
o.,1978,24,1280）、サッカロマイセス（Saccharomyce
s）属（A.Panek,J.Biol.Chem.,1964,239,1671）などが
知られている。しかしこれらの生産するトレハラーゼは
生産量も少なく熱に不安定であるため精製には多大な労
力を要していた。
く自然界に分布している。特にトレハラーゼを生産する
微生物としてはアスペルギルス（Aspergillus）属（K.H
orikoshi,J.Bacteriol,1966,91,1883）、トリコデルマ
（Trichoderuma）属（P.Vijiyakuumar,Can.J.Microbil
o.,1978,24,1280）、サッカロマイセス（Saccharomyce
s）属（A.Panek,J.Biol.Chem.,1964,239,1671）などが
知られている。しかしこれらの生産するトレハラーゼは
生産量も少なく熱に不安定であるため精製には多大な労
力を要していた。
本発明者らは先にコリネバクテリウム属に属する好熱
性微生物が熱に安定なトレハラーゼ菌体内外に生産する
事を見いだし、該耐熱性トレハラーゼについて特許出願
した（特開昭62−275682号）。該トレハラーゼは熱に安
定であり菌体外にも生産するので精製が容易になった。
性微生物が熱に安定なトレハラーゼ菌体内外に生産する
事を見いだし、該耐熱性トレハラーゼについて特許出願
した（特開昭62−275682号）。該トレハラーゼは熱に安
定であり菌体外にも生産するので精製が容易になった。
ところが該耐熱性トレハラーゼは、通常50〜60℃の温
度でコリネバクテリウム属に属する微生物を培養するこ
とにより得ている。しかし、該微生物の培養をより低い
温度で行なうことはエネルギー的に好ましい。
度でコリネバクテリウム属に属する微生物を培養するこ
とにより得ている。しかし、該微生物の培養をより低い
温度で行なうことはエネルギー的に好ましい。
そこで本発明の目的は、より低い温度で培養して上記
耐熱性トレハラーゼを得ることができる方法を提供する
ことにある。
耐熱性トレハラーゼを得ることができる方法を提供する
ことにある。
本発明者らは、中温菌である大腸菌に上記コリネバク
テリウム属に属する微生物由来の耐熱性トレハラーゼの
遺伝子情報をになうDNAをベクターを介して導入させる
ことにより得られた大腸菌を培養して得られた菌体から
耐熱性トレハラーゼを工業的有利に取得することに成功
し本発明を完成するにいたった。
テリウム属に属する微生物由来の耐熱性トレハラーゼの
遺伝子情報をになうDNAをベクターを介して導入させる
ことにより得られた大腸菌を培養して得られた菌体から
耐熱性トレハラーゼを工業的有利に取得することに成功
し本発明を完成するにいたった。
本発明は、好熱性細菌コリネバクテリウム属菌（Cory
nebacterium sp.）に由来し、制限酵素Hind III認識部
位を２箇所、制限酵素EcoR V認識部位を１箇所、制限酵
素BamH I認識部位を２箇所、制限酵素Sma I認識部位を
１箇所、制限酵素Nru I認識部位を３箇所及びEcoR I認
識部位を１箇所有する耐熱性トレハラーゼ遺伝子DNAに
関する。
nebacterium sp.）に由来し、制限酵素Hind III認識部
位を２箇所、制限酵素EcoR V認識部位を１箇所、制限酵
素BamH I認識部位を２箇所、制限酵素Sma I認識部位を
１箇所、制限酵素Nru I認識部位を３箇所及びEcoR I認
識部位を１箇所有する耐熱性トレハラーゼ遺伝子DNAに
関する。
さらに本発明は、好熱性細菌コリネバクテリウム属菌
（Corynebacterium sp.）に由来し、制限酵素Hind III
認識部位を２箇所、制限酵素EcoR V認識部位を１箇所、
制限酵素BamH I認識部位を２箇所、制限酵素Sma I認識
部位を１箇所、制限酵素Nru I認識部位を３箇所及びEco
R I認識部位を１箇所所有する耐熱性トレハラーゼ遺伝
子DNAをベクタープラスミドに連結した組換え体プラス
ミドに関する。
（Corynebacterium sp.）に由来し、制限酵素Hind III
認識部位を２箇所、制限酵素EcoR V認識部位を１箇所、
制限酵素BamH I認識部位を２箇所、制限酵素Sma I認識
部位を１箇所、制限酵素Nru I認識部位を３箇所及びEco
R I認識部位を１箇所所有する耐熱性トレハラーゼ遺伝
子DNAをベクタープラスミドに連結した組換え体プラス
ミドに関する。
さらに本発明は、好熱性細菌コリネバクテリウム属菌
（Corynebacterium sp.）に由来し、制限酵素Hind III
認識部位を２箇所、制限酵素EcoR V認識部位を１箇所、
制限酵素BamH I認識部位を２箇所、制限酵素Sma I認識
部位を１箇所、制限酵素Nru I認識部位を３箇所及びEco
R I認識部位を１箇所所有する耐熱性トレハラーゼ遺伝
子DNAをベクタープラスミドに連結した組換え体プラス
ミドで形質転換されたエッシェリヒア属の微生物に関す
る。
（Corynebacterium sp.）に由来し、制限酵素Hind III
認識部位を２箇所、制限酵素EcoR V認識部位を１箇所、
制限酵素BamH I認識部位を２箇所、制限酵素Sma I認識
部位を１箇所、制限酵素Nru I認識部位を３箇所及びEco
R I認識部位を１箇所所有する耐熱性トレハラーゼ遺伝
子DNAをベクタープラスミドに連結した組換え体プラス
ミドで形質転換されたエッシェリヒア属の微生物に関す
る。
以下本発明を詳細に説明する。
耐熱性トレハラーゼの遺伝子情報を担うDNA（以下染
色体DNAと称する）は、好熱性コリネバクテリウム属に
属する微生物から単離精製する。好熱性コリネバクテリ
ウム属に属する微生物としては、例えばＫ−502（FERM
P−8484）、Ｋ−512（FERM P−8485）及びＫ−522（FER
M P−8486）を用いることができる。上記コリネバクテ
リウム属に属する微生物からの耐熱性トレハラーゼの遺
伝子情報を担うDNAの単離精製は常法、例えばサイト
ウ．ミウラ（Saito＆Miura）の方法（Biochim.Biophys.
Acta72.p619〜629（1963））により行なうことができ
る。即ち、リドチーム（生化学工業社製品）により菌体
を溶菌後、SDS含有アルカリ性緩衝液とフェノールでDNA
を抽出する。更にRNAをRNアーゼで分解して染色体でDNA
を単離精製することができる。
色体DNAと称する）は、好熱性コリネバクテリウム属に
属する微生物から単離精製する。好熱性コリネバクテリ
ウム属に属する微生物としては、例えばＫ−502（FERM
P−8484）、Ｋ−512（FERM P−8485）及びＫ−522（FER
M P−8486）を用いることができる。上記コリネバクテ
リウム属に属する微生物からの耐熱性トレハラーゼの遺
伝子情報を担うDNAの単離精製は常法、例えばサイト
ウ．ミウラ（Saito＆Miura）の方法（Biochim.Biophys.
Acta72.p619〜629（1963））により行なうことができ
る。即ち、リドチーム（生化学工業社製品）により菌体
を溶菌後、SDS含有アルカリ性緩衝液とフェノールでDNA
を抽出する。更にRNAをRNアーゼで分解して染色体でDNA
を単離精製することができる。
得られた染色体DNAのベクターDNAの組み込みは以下の
ように行なうことができる。染色体DNA及びベクターDNA
を制限酵素で切断して染色体DNA断片及びベクターDNA断
片を調整する。次いで両者の混合物をDNAリガーゼ（東
洋紡社製品）で処理する。用いられるベクターDNAとし
ては、pBR322、pUC18、pUC19、pHSG398、pHSG399（宝酒
造社製品）、pDR540、pKK233−３、等（ファルマシア社
製品）があげられる。とりわけpHSG399が好適に用いら
れる。また制御酵素としてはHind III、EcoR I、Pst
I、BamH I等（東洋紡社製品）があげられる。さらにDNA
リガーゼとしては、T4ファージ由来のDNAリガーゼ（東
洋紡社製品）が好適に用いられる。
ように行なうことができる。染色体DNA及びベクターDNA
を制限酵素で切断して染色体DNA断片及びベクターDNA断
片を調整する。次いで両者の混合物をDNAリガーゼ（東
洋紡社製品）で処理する。用いられるベクターDNAとし
ては、pBR322、pUC18、pUC19、pHSG398、pHSG399（宝酒
造社製品）、pDR540、pKK233−３、等（ファルマシア社
製品）があげられる。とりわけpHSG399が好適に用いら
れる。また制御酵素としてはHind III、EcoR I、Pst
I、BamH I等（東洋紡社製品）があげられる。さらにDNA
リガーゼとしては、T4ファージ由来のDNAリガーゼ（東
洋紡社製品）が好適に用いられる。
得られた組換え体の大腸菌への導入は、例えばProc.N
atl.Acad.Sci.USA.69.p2110−2114（1972）に記載のカ
ルシウムイオン処理により行なうことができる。即ち30
mM CaCl2存在下でエッシェリヒア・コリJM101株（東洋
紡社製、商標EPICURIAN COLIJM1−01）のコンピテント
細胞に組換え体DNAを混合し、氷上に１時間置いたのち4
2℃で60〜75秒間ヒートショックを行なうことで外来DNA
を大腸菌に導入することができる。又このコンピテント
細胞は市販のものも用いることができる。
atl.Acad.Sci.USA.69.p2110−2114（1972）に記載のカ
ルシウムイオン処理により行なうことができる。即ち30
mM CaCl2存在下でエッシェリヒア・コリJM101株（東洋
紡社製、商標EPICURIAN COLIJM1−01）のコンピテント
細胞に組換え体DNAを混合し、氷上に１時間置いたのち4
2℃で60〜75秒間ヒートショックを行なうことで外来DNA
を大腸菌に導入することができる。又このコンピテント
細胞は市販のものも用いることができる。
耐熱性トレハラーゼの遺伝情報を担うDNA断片を組み
込んだベクターDNAを有する菌株の選択方法は、当該組
換え体DNAを調整するのに際して使用した制限酵素やベ
クターDNAの種類によっても異なるが例えば制限酵素と
してBamH I（東洋紡社製品）を用いベクターDNAとしてp
HSG399（宝酒造社製品）を用いた場合には次のようにし
て行なうことができる。即ち、エッシェリヒア・コリＫ
−12株例えばJM101（東洋紡社製、商標EPICURIAN COLI
JM1−01）株を宿主とした形質転換株を、トリプトン、
イーストエキストラクト、NaCl、クロラムフェニコー
ル、寒天を含む培地（以下TYC寒天培地という）に培養
し、平板上に出現したクロラムフェニコール耐性コロニ
ーのうち耐熱性トレハラーゼ生産株を選択する。
込んだベクターDNAを有する菌株の選択方法は、当該組
換え体DNAを調整するのに際して使用した制限酵素やベ
クターDNAの種類によっても異なるが例えば制限酵素と
してBamH I（東洋紡社製品）を用いベクターDNAとしてp
HSG399（宝酒造社製品）を用いた場合には次のようにし
て行なうことができる。即ち、エッシェリヒア・コリＫ
−12株例えばJM101（東洋紡社製、商標EPICURIAN COLI
JM1−01）株を宿主とした形質転換株を、トリプトン、
イーストエキストラクト、NaCl、クロラムフェニコー
ル、寒天を含む培地（以下TYC寒天培地という）に培養
し、平板上に出現したクロラムフェニコール耐性コロニ
ーのうち耐熱性トレハラーゼ生産株を選択する。
上記方法で得られた組換え体DNA含有菌株より、組換
え体DNAを単離する。
え体DNAを単離する。
本発明による耐熱性トレハラーゼの製造は次のように
して行う。
して行う。
まず上記のように得られた新規な遺伝子組換え大腸菌
をクロラムフェニコール50μg/ml含有Ｌ−ブロスを用い
37℃,5〜24時間培養後、集菌した後菌体を超音波壊域は
リゾチームで溶菌し、遠心分離する。遠心上清を60℃１
時間加熱処理し、さらに遠心分離を行なう。その後遠心
上清について市販のイオン交換樹脂、例えばDEAE−セフ
ァデックス、DEAE−セルローズ（ファルマシアＰ−LGバ
イオケミカルズ社製品）、DEAE−トヨパール650M（東ソ
ー社製品）等を用いてトレハラーゼ区分を分取する。更
にゲル濾過のカラムクロマトグラフィー、例えばセファ
クリルＳ−300（ファルマシア社製品）を用いることが
できる。このようにして目的とする耐熱性トレハラーゼ
を製造することができる。
をクロラムフェニコール50μg/ml含有Ｌ−ブロスを用い
37℃,5〜24時間培養後、集菌した後菌体を超音波壊域は
リゾチームで溶菌し、遠心分離する。遠心上清を60℃１
時間加熱処理し、さらに遠心分離を行なう。その後遠心
上清について市販のイオン交換樹脂、例えばDEAE−セフ
ァデックス、DEAE−セルローズ（ファルマシアＰ−LGバ
イオケミカルズ社製品）、DEAE−トヨパール650M（東ソ
ー社製品）等を用いてトレハラーゼ区分を分取する。更
にゲル濾過のカラムクロマトグラフィー、例えばセファ
クリルＳ−300（ファルマシア社製品）を用いることが
できる。このようにして目的とする耐熱性トレハラーゼ
を製造することができる。
本発明により、耐熱性トレハラーゼ遺伝子DNA、該DNA
を含む組換え体プラスミド、該組換え体プラスミドで形
質転換された形質転換体微生物及び該形質転換体微生物
を培養して耐熱性トレハラーゼ工業的に有利に製造する
方法が提供さた。
を含む組換え体プラスミド、該組換え体プラスミドで形
質転換された形質転換体微生物及び該形質転換体微生物
を培養して耐熱性トレハラーゼ工業的に有利に製造する
方法が提供さた。
以下本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。
実施例１ 耐熱性トレハラーゼ遺伝子の分類 コリネバクテリウム属菌Ｋ−512（FERM P−8485）の
染色体DNAはサイトウ、ミウラ（Saito.Miura）の方法
〔Biochim.Biophys.Acta72.p619〜629（1963）〕に準じ
て調整した。得られた染色体DNAのうち100μｇを制限酵
素Sau3A I（東洋紡社製品）で部分分解して染色体DNA断
片80μｇを得た。
染色体DNAはサイトウ、ミウラ（Saito.Miura）の方法
〔Biochim.Biophys.Acta72.p619〜629（1963）〕に準じ
て調整した。得られた染色体DNAのうち100μｇを制限酵
素Sau3A I（東洋紡社製品）で部分分解して染色体DNA断
片80μｇを得た。
それとは別にベクターpHSG399 1μｇ（宝酒造社製
品：第１図に示される）を制限酵素BamH Iで完全分解
し、細菌由来のアルカリファスファターゼ（宝酒造社製
品）処理してベクターDNA断片0.8μｇを得た。得られた
染色体DNA断片0.1μｇとベクターDNA断片0.28μｇと
を、T4ファージ由来のDNAリガーゼ（宝酒造社製品）を
用い16℃、30分間連結反応を行い、組換え体DNAを得
た。得られた組換え体を大腸菌JMIO Iコンピテントセル
200μ（東洋紡社製）に混合し、０℃下で１時間静置
する。さらに42℃、70秒間加温し、形質転換を行なっ
た。
品：第１図に示される）を制限酵素BamH Iで完全分解
し、細菌由来のアルカリファスファターゼ（宝酒造社製
品）処理してベクターDNA断片0.8μｇを得た。得られた
染色体DNA断片0.1μｇとベクターDNA断片0.28μｇと
を、T4ファージ由来のDNAリガーゼ（宝酒造社製品）を
用い16℃、30分間連結反応を行い、組換え体DNAを得
た。得られた組換え体を大腸菌JMIO Iコンピテントセル
200μ（東洋紡社製）に混合し、０℃下で１時間静置
する。さらに42℃、70秒間加温し、形質転換を行なっ
た。
得られた形質転換体を3mlのＬ−ブロスに植菌し37℃
下で５時間培養後、培養液をTYC寒天平板に塗抹したと
ころクロラムフェニコール耐性菌株が得られた。この菌
株をクロラムフェニコール50μg/mlを含むＬ−ブロス植
菌後一晩培養し、集菌後生理的食塩水で洗浄した。少量
の10mMの燐酸緩衝液（pH7.0）に懸濁後超音波処理し、
さらに60℃で１時間加熱処理し、その遠心上清について
トレハラーゼ活性測定（55℃10分）を行ったところ23単
位/mlを示し、形質転換されていることが確認できた。
下で５時間培養後、培養液をTYC寒天平板に塗抹したと
ころクロラムフェニコール耐性菌株が得られた。この菌
株をクロラムフェニコール50μg/mlを含むＬ−ブロス植
菌後一晩培養し、集菌後生理的食塩水で洗浄した。少量
の10mMの燐酸緩衝液（pH7.0）に懸濁後超音波処理し、
さらに60℃で１時間加熱処理し、その遠心上清について
トレハラーゼ活性測定（55℃10分）を行ったところ23単
位/mlを示し、形質転換されていることが確認できた。
得られた形質転換株からプラスミドをアルカリ−SDS
法により調整し、このプラスミドをpKTR360と命名した
（第１図に示す）。
法により調整し、このプラスミドをpKTR360と命名した
（第１図に示す）。
pKTR360をPst I、及びKpn Iで切断後アガロースゲル
電気泳動にかけベクターに挿入されている断片を回収し
これをニックトランスレーションによりビオチンでラベ
ルしたサザンハイブリダイゼーションを行なった（バイ
オラッド社製品）。その結果、プラスミドpKTR360に挿
入されたDNA断片は確かにコリネバクテリウム属菌Ｋ−5
12の染色体DNAに由来することが示された。
電気泳動にかけベクターに挿入されている断片を回収し
これをニックトランスレーションによりビオチンでラベ
ルしたサザンハイブリダイゼーションを行なった（バイ
オラッド社製品）。その結果、プラスミドpKTR360に挿
入されたDNA断片は確かにコリネバクテリウム属菌Ｋ−5
12の染色体DNAに由来することが示された。
又、純化された耐熱性トレハラーゼ遺伝子は制限酵素
BamH I認識部位を２箇所、制限酵素Hind III認識部位を
２箇所、制限酵素EcoR V部位を１箇所、制限酵素Nru I
認識部位を３箇所、制限酵素Sma I認識部位を１箇所及
びEcoR I認識部位を１箇所所有していた。（制限酵素は
市販品を用いた）。
BamH I認識部位を２箇所、制限酵素Hind III認識部位を
２箇所、制限酵素EcoR V部位を１箇所、制限酵素Nru I
認識部位を３箇所、制限酵素Sma I認識部位を１箇所及
びEcoR I認識部位を１箇所所有していた。（制限酵素は
市販品を用いた）。
実施例２ 大腸菌での耐熱性トレハラーゼ製造法 実施例１に準じて調整されたプラスミドpKTR360をE.c
oli JM101に導入し得られた形質転換株E.coli JM101（p
KTR360）をクロラムフェニコール50μg/mlを含むＬ−ブ
ロス培地300mlに植菌後一晩培養を行なった。前培養液
をクロラムフェニコール50μg/mlを含むＬ−ブロス培地
5000mlに対して５％植菌後37℃で15時間培養後集菌し
た。得られた菌体は生理的食塩水で洗浄し100mlの50mM
燐酸緩衝液（pH7.0）に懸濁後超音波処理した。さらに6
0℃で１時間加熱処理後遠心分離して、菌体破砕物を除
いた上澄の耐熱性トレハラーゼ活性を測定した。その結
果、その活性は培養15時間後10万ユニットであった。そ
の後DEAE−トヨパール650Mを用いたイオン交換クロマト
グラフィー、アサヒパックGS−520P（旭化成社製品）を
用いたゲル濾過を行なったところ耐熱性トレハラーゼを
２万ユニット回収した。
oli JM101に導入し得られた形質転換株E.coli JM101（p
KTR360）をクロラムフェニコール50μg/mlを含むＬ−ブ
ロス培地300mlに植菌後一晩培養を行なった。前培養液
をクロラムフェニコール50μg/mlを含むＬ−ブロス培地
5000mlに対して５％植菌後37℃で15時間培養後集菌し
た。得られた菌体は生理的食塩水で洗浄し100mlの50mM
燐酸緩衝液（pH7.0）に懸濁後超音波処理した。さらに6
0℃で１時間加熱処理後遠心分離して、菌体破砕物を除
いた上澄の耐熱性トレハラーゼ活性を測定した。その結
果、その活性は培養15時間後10万ユニットであった。そ
の後DEAE−トヨパール650Mを用いたイオン交換クロマト
グラフィー、アサヒパックGS−520P（旭化成社製品）を
用いたゲル濾過を行なったところ耐熱性トレハラーゼを
２万ユニット回収した。
得られたトレハラーゼについて至適作用温度、至適作
用pHを測定したところ、前者は55℃、後者はpH7.0であ
り、これらは、コリネバクテリウム属細菌Ｋ−512FERM
P−8485由来の酵素と同じ至適作用１度、至適作用pHで
あることが認識された。
用pHを測定したところ、前者は55℃、後者はpH7.0であ
り、これらは、コリネバクテリウム属細菌Ｋ−512FERM
P−8485由来の酵素と同じ至適作用１度、至適作用pHで
あることが認識された。
尚、トレハラーゼの活性測定法並びに活性表示法は以
下の通りである。
下の通りである。
即ち、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解させた１％
（W/V）のトレハロース溶液1.0mlに酵素液0.1mlを混合
し、55℃で10分間反応させた後、沸騰水浴中で10分間加
熱して酵素を失活させる。次いで、加水分解により生成
するＤ−グルコースをグルコース測定用試液、イアトロ
クロムGLU−LQ（ヤトロン社製）によって定量する。ま
た、酵素活性の単位は前述の条件下で１分間に１μmol
のグルコースを生成するのに要する酵素量を１単位とし
て表示する。
（W/V）のトレハロース溶液1.0mlに酵素液0.1mlを混合
し、55℃で10分間反応させた後、沸騰水浴中で10分間加
熱して酵素を失活させる。次いで、加水分解により生成
するＤ−グルコースをグルコース測定用試液、イアトロ
クロムGLU−LQ（ヤトロン社製）によって定量する。ま
た、酵素活性の単位は前述の条件下で１分間に１μmol
のグルコースを生成するのに要する酵素量を１単位とし
て表示する。
【図面の簡単な説明】 図はベクターとして用いたプラスミドpHSG399とプラス
ミドpHSG399に取り込まれた耐熱性トレハラーゼ遺伝子
を含むプラスミドpKTR360を示す。図中太線はコリネバ
クテリウム属菌Ｋ−512FERM P−8485由来のDNAであり、
図中略字は次の制限酵素を示す。 HI:Hind III、SM:Sma I、SP:Sph I、EV:EcoR V PS:Pst I、NR:Nru I、SL:Sal I、SA:Sau3A I XB:Xba I、KP:Kpn I、EL:EcoR I、SC:Sac I BA:BamH I
ミドpHSG399に取り込まれた耐熱性トレハラーゼ遺伝子
を含むプラスミドpKTR360を示す。図中太線はコリネバ
クテリウム属菌Ｋ−512FERM P−8485由来のDNAであり、
図中略字は次の制限酵素を示す。 HI:Hind III、SM:Sma I、SP:Sph I、EV:EcoR V PS:Pst I、NR:Nru I、SL:Sal I、SA:Sau3A I XB:Xba I、KP:Kpn I、EL:EcoR I、SC:Sac I BA:BamH I
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:15）
Claims (8)
- 【請求項１】好熱性細菌コリネバクテリウム属菌（Cory
nebacterium sp.）に由来し、制限酵素Hind III認識部
位を２箇所、制限酵素EcoR V認識部位を１箇所、制限酵
素BamH I認識部位を２箇所、制限酵素Sma I認識部位を
１箇所、制限酵素Nru I認識部位を３箇所及びEcoR I認
識部位を１箇所所有する耐熱性トレハラーゼ遺伝子DN
A。 - 【請求項２】好熱性細菌コリネバクテリウム属菌（Cory
nebacterium sp.）がＫ−502（FERM P−8484）、Ｋ−51
2（FERM P−8485）又はＫ−522（FERM P−8486）である
請求項１記載のDNA。 - 【請求項３】請求項１記載の耐熱性トレハラーゼ遺伝子
DNAをベクタープラスミドに連結した組換え体プラスミ
ド。 - 【請求項４】ベクタープラスミドがエッシェリヒア・コ
リのベクタープラスミドである請求項３記載の組換え体
プラスミド。 - 【請求項５】ベクタープラスミドがpDR540、pUC18、pUC
19、pBR322、pHSG398、pHSG399、又はpKK233−３である
請求項３記載の組換え体プラスミド。 - 【請求項６】請求項3,4又は５記載の組換え体プラスミ
ドで形質転換されたエッシェリヒア属の微生物。 - 【請求項７】微生物がエッシェリヒア・コリである請求
項６記載の微生物。 - 【請求項８】請求項６又は７記載の微生物を培地中で培
養し、培養物から耐熱性トレハラーゼを採取することを
特徴とする耐熱性トレハラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5177988A JP2582112B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-03-07 | 耐熱性トレハラーゼ遺伝子ｄｎａ、該ｄｎａを含む組換え体プラスミド、形質転換体及び耐熱性トレハラーゼの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5177988A JP2582112B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-03-07 | 耐熱性トレハラーゼ遺伝子ｄｎａ、該ｄｎａを含む組換え体プラスミド、形質転換体及び耐熱性トレハラーゼの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01225485A JPH01225485A (ja) | 1989-09-08 |
| JP2582112B2 true JP2582112B2 (ja) | 1997-02-19 |
Family
ID=12896439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5177988A Expired - Fee Related JP2582112B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-03-07 | 耐熱性トレハラーゼ遺伝子ｄｎａ、該ｄｎａを含む組換え体プラスミド、形質転換体及び耐熱性トレハラーゼの製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2582112B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2747131B1 (fr) * | 1996-04-09 | 1998-06-26 | Orsan | Procede de production d'amino acide par fermentation de corynebacterie exprimant une activite trehalase |
| US20110008864A1 (en) * | 2008-03-28 | 2011-01-13 | Novozymes North America, Inc. | Processes for Producing Fermentation Products |
-
1988
- 1988-03-07 JP JP5177988A patent/JP2582112B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01225485A (ja) | 1989-09-08 |
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