JP2681634B2 - 耐熱性液化型アミラーゼ生産能力の増強された細菌新菌株 - Google Patents
耐熱性液化型アミラーゼ生産能力の増強された細菌新菌株Info
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Description
【発明の詳細な説明】
イ．発明の目的
（産業上の利用分野）
本発明は、耐熱性液化型アミラーゼ生産能力の増強さ
れた細菌菌株、その育種方法、およびそれを用いた該ア
ミラーゼの生産方法に関する。 （従来の技術） デンプン利用工業において、耐熱性液化型アミラーゼ
は、有用で且つ不可欠の酵素であり、その供給源は専ら
微生物、特に細菌の生産するものに求められ、数多くの
菌株が用いられている。しかし酵素の生産性について
は、一層の向上が求められている。 遺伝子工学的技法により、酵素生産性の向上を図った
例には、特公昭58−11998（丸尾ら）などがあるが、こ
れは枯草菌（Bacillus subtilis）の、糖化型アミラー
ゼの生産能向上に、調節遺伝子を複数個導入するもの
で、本願発明の目的とする耐熱性液化型アミラーゼ、特
にバチルス・リチェニフォルミスの生産する酵素につい
ては、有効で安定な菌株の創出が望まれていた。 （発明が解決しようとする問題点） 前述のとおり、デンプン利用工業にとって、不可欠の
酵素である耐熱性液化型アミラーゼについて、本発明
は、生産能が従来のものに比し一層優れ、かつ安定な菌
株を提供することと、その育種方法を提供することを目
的とし、さらに他の目的は、該菌株を使用して、有効な
酵素生産を行なう方法を提供しようとするものである。 ロ．発明の構成 （問題を解決するための手段） 本発明においては、バチルス・リチェニフォルミスに
属す適当な耐熱性液化型アミラーゼ生産菌、例えば、Ba
cillus licheniformis No.74あるいはその変異株である
バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus licheniform
is）TY002株（微工研菌寄第9222号）を選び、その染色
体DNAから、耐熱性液化型アミラーゼ生産に関与する遺
伝子をクローニングし、この遺伝子を適宜なベクター、
例えばプラスミドpUB110に連結して、再びもとの耐熱性
液化型アミラーゼ生産菌B.licheniformis TY002株に形
質転換、即ちセルフクローニングし、当該菌の細胞内に
組換えプラスミドを導入して耐熱性液化型アミラーゼ遺
伝子を増強した菌株を得る。 また、特にセルフクローニングに用いる宿主には、耐
熱性液化型アミラーゼ高生産変異株であるTY002株を用
いることにより、極めて優位に高生産性を得ることが出
来る。 次に、この造成株を用いて培養を行ない、当該菌の保
持する在来の耐熱性液化型アミラーゼ生産能に加えて、
細胞内の染色体上に新たに組み込まれた該遺伝子の増幅
効果により、耐熱性液化型アミラーゼの増産の目的を達
するものである。 上述したように本発明は、バチルス・リチェニフォル
ミスよりクローニングした耐熱性液化型アミラーゼ遺伝
子を、耐熱性液化型アミラーゼ高生産変異株TY002株へ
形質転換することにより、生産上有用な酵素である耐熱
性液化型アミラーゼを、極めて優位に高生産することの
出来る菌株を分子育種により造成し、産業上、例えば澱
粉からのグルコース製造工業、に貢献できる手段を提供
するものである。しかしながら、組換え遺伝子を用いて
分子育種した菌株においては、導入した組換え遺伝子の
宿主内での安定性が問題となることがある。 本発明において造成した菌株B.licheniformis TY002
（pBA61）−20株においても、本菌株の培養に際して
は、組換えプラスミドの宿主菌体内からの脱落を防ぐ目
的のために、適当な薬剤、たとえばベクターにpUB110を
用いている場合ではカナマイシンを培養期間中を通じ
て、常に添加する必要があった。さらに、組換え遺伝子
をプラスミドの形態のまま保持させた組換え体では、菌
株の継代培養中に組換え遺伝子の分子内欠損による培養
活性の低下も問題となる。 この点を改良した菌株は、さらに産業上の有益な手段
を与えるものである。そこで本発明では上述の発明にさ
らに改良を加え、組換えプラスミドpBA61を形質転換し
た組換えTY002株から、導入した組換えプラスミドpBA61
が、TY002株染色体DNA上に導入された菌株B.lichenifor
mis TY002−57I株を分離し、上述の問題点をさらに改良
した菌株として造成した。 以下に、本発明の組換えプラスミドの作成、形質転
換、セルフクローニング、およびこれらによる耐熱性液
化型アミラーゼ生産について、さらに詳細に説明する。 耐熱性液化型アミラーゼ遺伝子のクローニング 耐熱性液化型アミラーゼ生産菌としては、バチルス・
リチェニフォルミスに属すものから、適当なものを選ぶ
ことができるが、本発明者らは、Bacillus licheniform
is No.74あるいはその変異株であるBacillus lichenifo
rmis TY002を選び、斎藤及び三浦ら（H.Saito ＆ K.Miu
ra:Biochim.Biophys.Acta 72,619（1963））の方法によ
り、染色体DNAを調製した。これを制限酵素EcoR Iで切
断し、ショ糖密度勾配遠心分離により、約2Kb以上の断
片を分離した。 一方、大腸菌用プラスミドpBR322を、制限酵素EcoR I
で切断し、両者をT4リガーゼで連結後、大腸菌HB101株
に常法に従って性質転換した。これをアンピシリン（20
μg/ml）、テトラサイクリン（20μg/ml）、ストレプト
マイシン（100μg/ml）および可溶性澱粉（１％）を含
有するLuria broth（LB）寒天平板培地に塗抹し、ヨウ
素デンプン反応でデンプン分解能（ハロー）を示すコロ
ニーの検出を行ない、形質転換細胞を得た。 これらの形質転換細胞の保有する組換えプラスミドを
抽出し、アガロースゲル電気泳動で調べたところ、3.02
Kbおよび9.44Kbの２種類のDNA挿入断片が検出された。
前者のDNA断片が組込まれた組換えプラスミドをpEA6の
命名した。 pEA6の制限酵素切断点地図を第１図に示す。 pEA6を保有する大腸菌［E.coli HB101（pEA6）］の生
産する耐熱性液化型アミラーゼを、DNA供与菌であるBac
illus licheniformis TY002株の生産する耐熱性液化型
アミラーゼと比較した結果、全く同一の耐熱性の作用様
式が確認されたので、組換えプラスミドpEA6は、TY002
株の耐熱性液化型アミラーゼ遺伝子をクローン化したも
のと確認できた。 次に、E.coli HB101（pEA6）株の大量培養を行なって
pEA6を調製した。 枯草菌の公知のベクターであるpUB110をプロトプラス
ト形質転換法に従ってTY002株に形質転換を行なった結
果、枯草菌（Bacillus subtilis 1012株）と同程度のカ
ナマイシン耐性形質転換細胞が得られた。 そこで、クローン化した耐熱性液化型アミラーゼ遺伝
子をDNA供与菌であるTY002株へセルフクローニングする
ためTY002株を高率に形質転換できるベクターpUB110に
再クローニングした。 すなわち、pEA6（第１図）およびpUB110を制限酵素Ec
oR Iで切断し、両者をT4リガーゼで連結後、枯草菌（Ba
cillus subtilis 1012株）に、赤松および関口ら（T.Ak
amatsu ＆ J.Sekiguchi:Agr.Biol.Chem.46, 1617（198
2））のプロトプラスト形質転換法に準じて形質転換
し、再生したコロニーをカナマイシンおよび可溶性澱粉
を含有するLB寒天平板培地にレプリカし、ヨウ素デンプ
ン反応でハローを形成するコロニーの検出を行ない、多
数の形質転換細胞を得た。 これらの形質転換細胞により組換えプラスミドを抽出
し、アガロースゲル電気泳動にかけ、3.02Kbの挿入DNA
断片を有するものを選択し、これをpBA61と命名した。p
BA61の制限酵素切断点地図を第２図に示す。 Bacillus subtilis 1012（pBA61）株の培養から大量
のpBA61を調製した。 pEA6およびpBA61の挿入DNA断片は、サザンブロティン
グにより、Bacillus licheniformis TY002株の染色体DN
A由来であることが確認された。 さらに、E.coli HB101（pEA6）およびBacillus subti
lis 1012（pBA61）の生産する耐熱性液化型アミラーゼ
は、DNA供与菌TY002株の生産する耐熱性液化型アミラー
ゼと、分子量、耐熱性および免疫学的に同等であること
も確認された。 TY002株へpBA61の導入による耐熱性液化型アミラーゼ高
生産株の造成 Bacillus licheniformis TY002株へ、赤松および関口
らの方法（T.Akamatsu ＆ J.Sekiguchi;Agr.Biol.Che
m.,46 1617（1982））によるプロトプラス形質転換法で
pBA61を形質転換した。 再生したコロニーを、カナマイシンを含有するLB寒天
平板培地で培養し、カナマイシン耐性を示す多数の形質
転換細胞を得た。 これを可溶性澱粉を含有するLB培地で振盪培養を行な
い、耐熱性液化型アミラーゼ生産性を調べ、もとのTY00
2株より生産性の高い株を選択した。 これらの形質転換細胞より組換えプラスミドを抽出
し、アガロースゲル電気泳動にかけ、完全鎖長のpBA61
が存在することを確認し、この形質転換細胞を、バチル
ス・リチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）TY
002（PBA61）−20と命名した。 この形質転換細胞の菌学的諸性質は、耐熱性液化型ア
ミラーゼの生産性が増大したことと、カナマイシン耐性
を示すこと以外は、DNA供与菌であるB.licheniformis T
Y002株と全く同一であり、その生産する耐熱性液化型ア
ミラーゼも、その分子量、耐熱性および免疫学的諸性質
は、DNA供与菌のものと同等であることが確認された。 TY002株の染色体へpBA61の組込みによる耐熱性液化型ア
ミラーゼ高生産株の造成 組換えプラスミドの導入により遺伝子に対応する産物
の増産を計る場合には、組換えプラスミドの欠失、脱落
などによる不安定性が問題となることがある。 組換えプラスミドpBA61をTY002株にセルフクローニン
グした株においても、継代培養中に、pBA61の分子内欠
失と思われる酵素生産性の低下が観察されることがあ
る。 本発明では、組換えプラスミドpBA61を前記TY002株の
染色体DNAを組み込ませて、耐熱性液化型アミラーゼの
生産性の増大とともに、安定性のある菌株を造成する。 即ち、pBA61を前述の赤松らのプロトプラスト形質転
換法に従って前記TY002株に形質転換し、再生したコロ
ニーをカナマイシンを含むLB寒天平板培地にレプリカを
行ない、カナマイシン耐性を示す形質転換株について、
耐熱性液化型アミラーゼ生産量、プラスミドの有無を調
べ、前記TY002株よりも、約２倍の安定した耐熱性液化
型アミラーゼ生産能を有し、しかも細胞内にプラスミド
が検出されない形質転換細胞の分離に成功した。 この形質転換細胞を、バチルス・リチェニフォルミス
（Bacillus licheniformis）TY002−57I株と命名して、
微生物工業技術研究所に寄託し、寄託番号は、微工研菌
寄第9224号である。 本菌株のカナマイシン耐性は、ベクターに使用したpU
B110のカナマイシン耐性遺伝子に由来すること、および
このカナマイシン耐性遺伝子は、本菌株の染色体DNA上
に存在することが、サザンブロティングにより、それぞ
れ確認された。 また、本菌株の菌学的諸性質は、カナマイシン耐性お
よび耐熱性液化型アミラーゼの生産性が高い以外は、TY
002株と全く同一である。 従って、本菌株ではpBA61が染色体DNAに組み込まれ
て、耐熱性液化型アミラーゼの生産が増強され、安定化
したものと判明した。 またさらに、本菌株の生産する耐熱性液化型アミラー
ゼは、DNA供与菌であるTY002株の生産する耐熱性液化型
アミラーゼと、その分子量、耐熱性および免疫学的諸性
質が、同一であることも確認された。 バチルス・リチェニフォルミスの異なる菌株を用いた形
質転換 TY002株を宿主とした場合と全く同様にして、TY002株
の親株であるNo.74株およびTY002株同様No.74株由来の
変異株であるYB304株を宿主として形質転換を行ない、
形質転換株からTY002−57I株と同様の染色体DNAへ、組
換えプラスミドpBA61が組み込まれた株の分離を試みた
が、No.74株およびYB304株の形質転換株からは、染色体
DNAへ組換えプラスミドpBA61が組み込まれた株を分離す
ることは出来なかった。従って、ここに示した方法にお
いて本組換えプラスミドpBA619を、バチルス・リチェニ
フォルミス染色体DNAに、高頻度に組換えられるのはTY0
02株の特性と考えられた。 各種菌株を宿主とした時の組換え耐熱性液化型アミラー
ゼ生産量の比較 バチルス・リチェニフォルミスによりクローニングし
た耐熱性液化型アミラーゼ生産遺伝子を用いて、形質転
換した各種菌株の組換え耐熱性液化型アミラーゼの生産
量を比較した。そのうち、B.subtilisを宿主とした例
は、これまでにいくつかの文献（Gregory L.G.et al.;
J.Bacteriol.,166 p.635（1986）、Stephen A.O.et a
l.;Gene,23 p.267（1983）およびRichard P.P.et al.;B
iochem.Biophys.Res.Comm,122 p.175（1984））に記載
はあるが、それらの菌株は本発明に使用した菌株と同一
ではなく、また、組換え耐熱性液化型アミラーゼの生産
量に関しても、直接比較し得る明瞭な記載はない。そこ
で本発明者らは、文献記載と同じB.subtilis Marburg株
由来である、B.subtilis 1012株とB.subtilis M15（pur
B6,metB5,amyE）株を以て、比較試験を試みた。B.subti
lis 1012株は、非耐熱性液化型アミラーゼ生産能につい
ては野生型株であり、B.subtilis M15（purB6,metB5,am
yE）株はアミラーゼ生産能欠損株であるが、上述した文
献記載の菌株と本質的な差異のない菌株であると考えら
れる。 数次にわたる培養について比較した結果は第３表の通
りであるが、明らかに遺伝子組換えの宿主に、バチルス
・リチェニフォルミスを用いたセルフクローニングで造
成した菌株が、他のどの菌種を宿主とする場合よりも優
位であった。 また、そのなかでも耐熱性液化型アミラーゼ高生産変
異株であるTY002株を組換え宿主として用いることが最
も有効であり、極めて高い生産性が得られることが判明
した。さらに、TY002−57I株はpBA61がプラスミド状態
で導入されているTY002（pBA61）−20株を凌ぐ生産性を
示した。 従って、組換えプラスミドが染色体へ組み込まれるこ
とで、組換え遺伝子が安定化され、安定に耐熱性液化型
アミラーゼの生産が増強されたTY002−57I株が工業上よ
り有用な菌株であることは明らかであった。 耐熱性液化型アミラーゼ活性測定法 一般的α−アミラーゼの活性の測定に用いられる測定
法に準じ、下記により行なった。なお、この測定法によ
る単位は、JIS−法によるデンプン液化力の単位と、ほ
ぼ1:1に対応する。 ［試薬の調製］ 基質： １％可溶性澱粉/50mM酢酸緩衝液（pH6.0） 基質の調製法： 可溶性澱粉（生化学用，和光製）1g（乾燥重量）を精
秤し、50〜70mlの蒸留水に懸濁し、加熱溶解する。冷却
後、1M酢酸緩衝液（pH6.0）5mlを加え、100mlにする。 ヨウ素希釈液： ヨウ素原液（１％ヨウ素液）を使用時に200倍に希釈
する。 ヨウ素原液の調製法： ヨウ素5gおよびヨウ化カリウム50gを50mlの蒸留水に
溶解した後、500mlに定容する。 酵素希釈液： 2mM−CaCl/10mM−NaCl/2mM−酢酸緩衝液（pH6.0） ［酵素反応］ 試験管（φ1.5×10.5cm）に基質液1.0mlを加え、40
℃、５分間予加熱後、これに酵素液100μｌを添加し、4
0℃、10分間反応を行なう。反応後、反応液100μｌを0.
1N−HCl1.0mlを加えた試験管（φ1.5×10.5cm）に加
え、反応を停止させる。その500μｌを試験管（φ1.8×
1.3cm）に採り、そこに希釈ヨウ素液5.0mlを添加し発色
させ、660nmの吸光度を測定する（光路長:10MM,対照：
蒸留水）。 ［活性の算出法］ 上記の条件で、１分間に１％のヨード呈色を減少させ
る酵素量を１単位とする。 α−アミラーゼ活性（u/ml）＝ （（Eb−Ｅ）/Eb）×100×1/10×希釈率 Eb:Blankの吸光度,E:反応液の吸光度 ただし、（Eb−Ｅ）/Eb＝0.2〜0.2 の範囲で測定する。 （実施例） つぎに、実施例により本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明がこの実施例により限定されるものでないこ
とは言うまでもない。 実施例 １ （１） 染色体DNAの調製 バチルス・リチェニフォルミスTY002株を、バクトト
リプトン10g,バクト酵母エキス5g,塩化ナトリウム5g,お
よび蒸留水1L,pH7.0からなる培地（以下LB培地と略す）
1000ml中で、対数増殖期（OD660≒0.5）まで生育させた
菌体を遠沈回収し（湿菌体5g）、−80℃で凍結保存し
た。この凍結菌体を融解後、斎藤及び三浦らの方法（前
述）により、DNAを抽出精製し、1.9mg（純度OD260/OD
280＝2.047）の染色体DNAを得た。 （２） 染色体DNA断片のベクターへの挿入 （１）で得られたTY002株のDNA100μｇを、制限酵素E
coR I100単位を加えた反応液600μｌを37℃１時間処理
し、65℃で、５分間加熱後、ショ糖密度勾配遠心分離を
行ない、約2KbのDNA断片を分画した。 一方、大腸菌のベクターとして広く知られているプラ
スミドpBR322 5μｇを、同じ制限酵素EcoR Iで完全に消
化し、65℃で、５分間加熱処理を行なった。 次に、前者10μｇと後者５μｇを混合し、連係酵素T4
リガーゼ0.5単位を添加した反応液100μｌを、15℃で16
時間連続反応を行なった。反応液を65℃で５分間加熱処
理後、DNAエタノール沈澱により回収し、20μｌのTENバ
ッファー（10mM−トリス塩酸緩衝液pH7.5;10mM−塩化ナ
トリウム;1mM−EDTA）に溶解して形質転換に使用した。 （３） 組換えプラスミドによる形質転換 （２）で得られたDNA溶液４μｌを、大腸菌エシェリ
ヒア・コリ HB101株（pro，leu B,B1,lac Y,hsd R,hsd
M,ara，gal kz,xyl，mtl，sup 44,F-,endo I-,rec A-）
を常法に従って調製したコンピーテントセル200μｌに
添加し、形質転換を行なった。これに4mlのLB培地を加
え、37℃で３時間振盪培養後、適当に希釈して、アンピ
シリン20μg/ml,ストレプトマイシン100μg/mlおよび可
溶性澱粉１％を含有するLB寒天培地に塗布し、37℃で２
日間培養を行ない、アンピシリン及びストレプトマイシ
ン耐性を示す形質転換体1.7×104の中からヨウ素デンプ
ン反応でハローを示すコロニー10株を得た。 （４） 組換えプラスミド中の挿入DNA断片の検出及び
組換えプラスミドの大量調製 （３）で得たアミラーゼ産生陽性を示す10株を、アン
ピシリン20μg/ml,テトラサイクリン20μg/ml,およびス
トレプトマイシン100μg/mlを含有するLB培地3mlに植
え、37℃で16時間振盪培養後、生育した菌体を迅速なプ
ラスミド分離法（D.S.Holmes ＆ M.Quigley:Anal.Bioch
em.114,193（1981））に従ってプラスミドを分離し、制
限酵素EcoR Iで消化後、アガロースゲル電気泳動にか
け、挿入DNA断片の検出を行なったところ、５株中に3.0
2KbのDAN断片、および残りの５株に9.44KbのDNA断片が
それぞれ検出された。前者（3.02Kb）の挿入DNA断片を
もつ組換えプラスミドをpEA6と命名した。 エシュリヒア・コリHB101（pEA6）株をM9培地（カザ
ミノ酸0.4％，リン酸水素２ナトリウム・12水塩1.7％，
リン酸２水素カリウム0.3％，塩化ナトリウム0.05％，
塩化アンモニウム0.1％，グルコース0.4％，塩化カルシ
ウム0.1mM,硫酸マグネシウム1mM,サイアミン塩酸塩40μ
g/ml,pH7.2）を用い、1L培養により収得した菌体を常法
に従ってリゾチーム処理により溶菌後、フェノール抽出
法により除蛋白を行ない、塩化セシウム密度勾配遠心分
離によりプラスミドを分離し、透析後エタノール沈澱に
より回収し、精製プラスミドDNA1.2mgを得た（OD260/OD
280＝1.91）。 （５） pEA6の制限酵素切断点地図 pEA6の挿入DNA断片について、常法により制限酵素切
断部位を調べた結果を、第１表に示した。 さらに、２種および３種類の制限酵素の組合せによる
消化を行ない、アガロースゲル電気泳動により、切断部
位およびサイズを測定し、挿入DNA断片の制限酵素切断
点地図を作成し、第１図に示した。 （６） pEA6を保持する大腸菌の生産する耐熱性液化型
アミラーゼの性質 エシェリヒア・コリHB101（pEA6）株およびバチルス
・リチェニフォルミスTY002株を可溶性澱粉１％を含有
するLB培地で、37℃で３日間振盪培養を行ない、大腸菌
は培養液を超音波処理により菌小を破砕し、遠心分離に
より上清を調製した。一方、TY002株は、培養液を遠心
分離により菌体を除去した上清を調製した。両試料につ
いて最適反応温度および熱安定性を比較した。すなわ
ち、両試料を40℃,70℃,80℃，および90℃の各温度で酵
素反応を行ない、耐熱性液化型アミラーゼの最適作用温
度および両試料を10mMの塩化カルシウム存在下に、40
℃,70℃,80℃および90℃の各温度で、10分間加熱処理後
の残存活性を測定して熱安定性を調べたところ、両菌株
の生産した酵素の最適作用温度は共に90℃付近であり、
耐熱性は80℃における10分間の加熱処理で、100％の残
存活性が得られ、両者は全く同じ作用形式を示した。 なお、pEA6の挿入DNA断片の由来について、常法によ
りサザントランスファーとハイブリダイゼーションによ
り調べた結果、TY002株由来であることが確認された。 これらのことから、組換えプラスミドpEA6はTY002株
の耐熱性液化型アミラーゼ生産性染色体DNA断片をクロ
ーニングしたことが明白となった。 （７） ベクタープラスミドpUB110によるTY002株の形
質転換 枯草菌の公知のベクターであるプラスミドpUB110を用
いて、プロトプラスト形質転換法（前述）に従って、バ
チルス・リチェニフォルミスTY002株に、形質転換を行
なったところ、1.2×106/μgDNAの高い頻度で形質転換
されることが明かとなった。これは、比較のために行な
った枯草菌（バチルス・ズブチリス1012株）の形質転換
頻度と同じレベルであった。 （８） 耐熱性液化型アミラーゼ生産性DNA断片の再ク
ローニング （７）で枯草菌の公知のベクターであるプラスミドpU
B110がバチルス・リチェニフォルミスTY−002株に高頻
度で導入されることが明かとなった。 組換えプラスミドpEA6に挿入されたTY002株由来の耐
熱性液化型アミラーゼ生産性DNA断片をTY002株にセルフ
クローニングするためには、この挿入DNA断片を高頻度
でTY002株に形質転換できるベクターに組み入れること
が最も望ましい。そこでpUB110への再クローニングを行
なった。すなわち、pEA6 10μｇおよびpUB110をそれぞ
れ制限酵素EcoR Iで完全に消化し、65℃で５分間加熱処
理後、両者を混合し、連結酵素T4リガーゼ0.5単位を添
加した反応液100μｌを15℃で16時間連結反応を行なっ
た。反応液を65℃で５分間加熱処理後、エタノール沈澱
によりDNAを回収し20μｌのTENバッファーに溶解して、
バチルス・ズブチリス1012株（leu A8,met B5,hsr ME
（m+））に、プロトプラスト形質転換法（前述）に従っ
て形質転換した。 カナマイシン100μg/ml含有の再生培地で再生したコ
ロニーをカナマイシン10μg/mlおよび可溶性澱粉１％含
有するニュートリエント寒天平板培地にレプリカし、37
℃で24時間培養し、ヨウ素デンプン反応でハローを形成
するコロニーの検出を行なった。カナマイシン耐性を示
す750株中に耐熱性液化型アミラーゼ酸生陽性株53株が
検出された。その10株をカナマイシン10μg/ml含有する
3mlのLB培地で、37℃16時間振盪培養した菌体を、枯草
菌のプラスミドのミニスクリーニング法（D.S.Goldfar
b,R.L.Rodoriguez ＆ R.H.Doi:Proc.Natl.Acad.Sci.USA
79,5886（1982））に従って組換えプラスミドを分離
し、制限酵素EcoR Iで消化後、アガロースゲル電気泳動
で調べた結果、すべての形質転換株に組換えプラスミド
pEA6に組み入れられた同一サイズの3.02Kbの挿入DNA断
片が検出された。この組換えプラスミドをpBA61と命名
し、バチルス・ズブチリス1012（pBA61）をLB培地で1L
培養を行ない、常法によりリゾチームによる溶菌後遠心
分離による上清をフェノール抽出を３回くり返し、塩化
セシウム密度勾配遠心分離によりプラスミドを分離し、
透析後エタノール沈殿により回収し、精製プラスミドDN
A200μｇを得た。 pBA61の挿入DNA断片について、常法により制限酵素切
断部位を調べた結果、ベクターpUB110のEcoR I部位に挿
入されたDNA断片は、（５）で記載した組換えプラスミ
ドpEA6で、ベクターpBR322のEcoR I部位に挿入されたDN
A断片と全く同一の制限酵素切断点を有することが示さ
れ、pEA6の挿入DNA断片をそのまま、pUB110のEcoR I部
位に挿入したことが明らかとなった。 （９） TY002株の染色体DNAへのpBA61の組込みによる
耐熱性液化型アミラーゼ高生産株の造成pBA61のDNA0.9
μｇを、プロトプラスト形質転換法（前述）に従って、
TY002株に導入（セルフクローニング）し、カナマイシ
ン100μg/mlを含有する再生培地で再生したコロニー
を、カナマイシン10μg/mlを含有するLB寒天平板培地に
レプリカしてカナマイシン耐性を示す96株の形質転換体
を得た。 全分離株を、可溶性澱粉１％を含有するLB培地20mlを
分注した100ml容エルレンマイヤーフラスコを用いて、3
7℃で、72時間振盪培養（176rpm）し、遠心上清につい
て、耐熱性液化型アミラーゼ活性を測定したところ、TY
002株の約２倍の酵素生産性を示す３株を分離した。こ
れらの耐熱性液化型アミラーゼ高生産性形質転換株を、
10μl/mlのカナマイシンを含有する3mlのLB培地で16時
間振盪培養して得た菌体を、枯草菌プラスミドのミニス
クリーニング法（前述）に従ってプラスミドを分離し、
制限酵素EcoR Iで消化後、アガロースゲル電気泳動で調
べた結果、３株のうち、２株からはベクタープラスミド
pUB110のバンドと3.02kbの挿入DNA断片のバンドが検出
され、TY002株にpBA61が導入されて、耐熱性液化型アミ
ラーゼ生産能が約２倍に上昇したことが明らかになっ
た。この２株のうち有望な１株をTY002（pBA61）−20と
命名した。 一方、他の１株からはベクターpUB110のバンドも、3.
02kbの挿入DNA断片のバンドも全く検出されなかった。
この株をTY002−57I株と命名した。 TY002株、TY002株にpUB110を形質転換したTY002（pUB
110）株およびTY002−57I株について、カナマイシン耐
性濃度を、5mlのLB培地を用いて、37℃で16時間培養後
の生育度により調べると、TY002株は、５μg/ml,TY002
（pUB110）株は200μg/ml,およびTY002−57I株では100
μg/mlの各濃度で生育が認められた。これらの結果か
ら、TY002−57I株のカナマイシン耐性の獲得は、自然突
然変異に起因するものではなく、pBA61がTY−002株の染
色体DNAへの組込みによると考えられるので、この確認
のため、TY002−57I株から染色体DNAを分離し、制限酵
素EcoR IあるいはBgL IIで消化後サザントランスファー
を行ない、pUB110をプローブとしてハイブリダイゼーシ
ョンを行なった結果、pBA61が、TY002−57I株の染色体D
NAの中に、組込まれていることが明かとなった。 すなわち、TY002−57I株は、自菌の染色体DNA上に存
在する耐熱性液化型アミラーゼ生産遺伝子のほかに、新
たにpBA61が染色体に組込まれ、自菌由来の耐熱性液化
型アミラーゼ遺伝子により補強され、これらの両遺伝子
の発現により耐熱性液化型アミラーゼの生産能が約２倍
に強化されたことは明白である。 また、TY002−57I株の当該酵素生産能は、極めて安定
していた。pBA61をTY002株の染色体外に形質転換（セル
フクローニング）して育種したTY002（pBA61）−20株で
は、耐熱性液化型アミラーゼの生産には、培養全期間を
通じてカナマイシンの選択圧（10μg/ml）を、かけた方
が好ましい結果を与えるが、TY002−57I株の場合には、
その必要はなく、例えば、培養開始前の平板培地での単
一細胞の分離あるいはその後の種培養時まで選択圧をか
ければ充分である。 第２表に、セルフクローニングにより、pBA61をTY002
株の染色体DNAに組込んだ造成株TY002−57I株の耐熱性
液化型アミラーゼの生産能をフラスコ培養で調べた結
果、および当該酵素の耐熱性について、TY002株と対比
して示した。TY002−57I株は、TY002株の約２倍の酵素
生産能を有し、耐熱性もTY002株と全く同様であること
が明かとなった。 さらに、TY002−57I株の生産する酵素は、蛋白質化学
的にも、免疫化学的にも、TY002株と同等であること
が、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子
量（60Kd）および家兎抗血清によるマイクロオクタロニ
ー法により確認された。 実施例 2. E.coli、B.subtilisおよびB.licheniformisの各菌株
を宿主とした時の耐熱性アミラーゼ生産量につき、それ
ぞれの組換え菌を１％可溶性澱粉を添加したLB培地で培
養し比較した。比較した菌株のうちB.subtilis 1012株
は非耐熱性アミラーゼ生産菌であり、B.subutilis M15
株はアミラーゼ非生産株である。また、B.licheniformi
s YB304株はTY002株同様No.74株から誘導した変異株で
ある。 数次の培養結果をまとめ第３表に示したが、バチルス
・リチェニフォルミスを宿主とした時に、最も優位に組
換え耐熱性アミラーゼを生産することが確認出来た。と
りわけ耐熱性アミラーゼ高生産変異株TY002株を宿主と
した時に、極めて優位な生産が可能になることが示さ
れ、また、本発明により造成したTY002−57I株は、pBA6
1がプラスミド状態で導入されているTY002（pBA61）−2
0株の結果をも凌ぐ生産性を示した。 実施例 3. 実施例1.の（９）で造成した耐熱性液化型アミラーゼ
高生産菌TY002−57I株を下記の培地中で、37℃70時間振
盪培養して、当該酵素の生産を経時的に測定し、TY002
株と比較して、第３図に示した。 培地：可溶性澱粉１％含有するLB培地 培地量:20ml培地/100ml容−エルレンマイヤーフラスコ 培養条件:37℃,176st/min. 両菌株とも生育度は変わらないが、TY002−57I株はTY
002株の２倍の耐熱性液化型アミラーゼの生産を示し
た。 実施例 4. 実施例1.の（９）で造成した耐熱性液化型アミラーゼ
高生産菌TY002−57I株を、工業生産用培地で培養し、酵
素の生産性を調べた。 すなわち、本菌株を、大豆粉３％，コーンスティープ
リカー３％，乳糖２％，リン酸２水素カリウム0.3％，
硫酸マグネシウム・７水塩0.03％，馬鈴薯澱粉１または
３％,pH7.0よりなる30mlの培地を含む500ml容エルレン
マイヤーフラスコに接種し、37℃で３日間開糖培養（21
0rpm）した。 結果を第４図（ＡおよびＢ）に示す。 図中、Ａは馬鈴薯澱粉１％,Bは同３％の例である。 また、馬鈴薯澱粉に替えて、白糖を5.3％を添加した
培地の例をＣに示した。 いずれの培地に於いても、TY002−57I株は、TY002株
の約２倍の酵素生産を示した。 ハ．発明の効果 本発明により、従来に比し耐熱性液化型アミラーゼ生
産能が一層優れ、かつ安定なバチルス・リチェニフォル
ミス菌株が造成され、さらにこの菌株を使用して、有効
な酵素生産を行なう方法が確立された。
れた細菌菌株、その育種方法、およびそれを用いた該ア
ミラーゼの生産方法に関する。 （従来の技術） デンプン利用工業において、耐熱性液化型アミラーゼ
は、有用で且つ不可欠の酵素であり、その供給源は専ら
微生物、特に細菌の生産するものに求められ、数多くの
菌株が用いられている。しかし酵素の生産性について
は、一層の向上が求められている。 遺伝子工学的技法により、酵素生産性の向上を図った
例には、特公昭58−11998（丸尾ら）などがあるが、こ
れは枯草菌（Bacillus subtilis）の、糖化型アミラー
ゼの生産能向上に、調節遺伝子を複数個導入するもの
で、本願発明の目的とする耐熱性液化型アミラーゼ、特
にバチルス・リチェニフォルミスの生産する酵素につい
ては、有効で安定な菌株の創出が望まれていた。 （発明が解決しようとする問題点） 前述のとおり、デンプン利用工業にとって、不可欠の
酵素である耐熱性液化型アミラーゼについて、本発明
は、生産能が従来のものに比し一層優れ、かつ安定な菌
株を提供することと、その育種方法を提供することを目
的とし、さらに他の目的は、該菌株を使用して、有効な
酵素生産を行なう方法を提供しようとするものである。 ロ．発明の構成 （問題を解決するための手段） 本発明においては、バチルス・リチェニフォルミスに
属す適当な耐熱性液化型アミラーゼ生産菌、例えば、Ba
cillus licheniformis No.74あるいはその変異株である
バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus licheniform
is）TY002株（微工研菌寄第9222号）を選び、その染色
体DNAから、耐熱性液化型アミラーゼ生産に関与する遺
伝子をクローニングし、この遺伝子を適宜なベクター、
例えばプラスミドpUB110に連結して、再びもとの耐熱性
液化型アミラーゼ生産菌B.licheniformis TY002株に形
質転換、即ちセルフクローニングし、当該菌の細胞内に
組換えプラスミドを導入して耐熱性液化型アミラーゼ遺
伝子を増強した菌株を得る。 また、特にセルフクローニングに用いる宿主には、耐
熱性液化型アミラーゼ高生産変異株であるTY002株を用
いることにより、極めて優位に高生産性を得ることが出
来る。 次に、この造成株を用いて培養を行ない、当該菌の保
持する在来の耐熱性液化型アミラーゼ生産能に加えて、
細胞内の染色体上に新たに組み込まれた該遺伝子の増幅
効果により、耐熱性液化型アミラーゼの増産の目的を達
するものである。 上述したように本発明は、バチルス・リチェニフォル
ミスよりクローニングした耐熱性液化型アミラーゼ遺伝
子を、耐熱性液化型アミラーゼ高生産変異株TY002株へ
形質転換することにより、生産上有用な酵素である耐熱
性液化型アミラーゼを、極めて優位に高生産することの
出来る菌株を分子育種により造成し、産業上、例えば澱
粉からのグルコース製造工業、に貢献できる手段を提供
するものである。しかしながら、組換え遺伝子を用いて
分子育種した菌株においては、導入した組換え遺伝子の
宿主内での安定性が問題となることがある。 本発明において造成した菌株B.licheniformis TY002
（pBA61）−20株においても、本菌株の培養に際して
は、組換えプラスミドの宿主菌体内からの脱落を防ぐ目
的のために、適当な薬剤、たとえばベクターにpUB110を
用いている場合ではカナマイシンを培養期間中を通じ
て、常に添加する必要があった。さらに、組換え遺伝子
をプラスミドの形態のまま保持させた組換え体では、菌
株の継代培養中に組換え遺伝子の分子内欠損による培養
活性の低下も問題となる。 この点を改良した菌株は、さらに産業上の有益な手段
を与えるものである。そこで本発明では上述の発明にさ
らに改良を加え、組換えプラスミドpBA61を形質転換し
た組換えTY002株から、導入した組換えプラスミドpBA61
が、TY002株染色体DNA上に導入された菌株B.lichenifor
mis TY002−57I株を分離し、上述の問題点をさらに改良
した菌株として造成した。 以下に、本発明の組換えプラスミドの作成、形質転
換、セルフクローニング、およびこれらによる耐熱性液
化型アミラーゼ生産について、さらに詳細に説明する。 耐熱性液化型アミラーゼ遺伝子のクローニング 耐熱性液化型アミラーゼ生産菌としては、バチルス・
リチェニフォルミスに属すものから、適当なものを選ぶ
ことができるが、本発明者らは、Bacillus licheniform
is No.74あるいはその変異株であるBacillus lichenifo
rmis TY002を選び、斎藤及び三浦ら（H.Saito ＆ K.Miu
ra:Biochim.Biophys.Acta 72,619（1963））の方法によ
り、染色体DNAを調製した。これを制限酵素EcoR Iで切
断し、ショ糖密度勾配遠心分離により、約2Kb以上の断
片を分離した。 一方、大腸菌用プラスミドpBR322を、制限酵素EcoR I
で切断し、両者をT4リガーゼで連結後、大腸菌HB101株
に常法に従って性質転換した。これをアンピシリン（20
μg/ml）、テトラサイクリン（20μg/ml）、ストレプト
マイシン（100μg/ml）および可溶性澱粉（１％）を含
有するLuria broth（LB）寒天平板培地に塗抹し、ヨウ
素デンプン反応でデンプン分解能（ハロー）を示すコロ
ニーの検出を行ない、形質転換細胞を得た。 これらの形質転換細胞の保有する組換えプラスミドを
抽出し、アガロースゲル電気泳動で調べたところ、3.02
Kbおよび9.44Kbの２種類のDNA挿入断片が検出された。
前者のDNA断片が組込まれた組換えプラスミドをpEA6の
命名した。 pEA6の制限酵素切断点地図を第１図に示す。 pEA6を保有する大腸菌［E.coli HB101（pEA6）］の生
産する耐熱性液化型アミラーゼを、DNA供与菌であるBac
illus licheniformis TY002株の生産する耐熱性液化型
アミラーゼと比較した結果、全く同一の耐熱性の作用様
式が確認されたので、組換えプラスミドpEA6は、TY002
株の耐熱性液化型アミラーゼ遺伝子をクローン化したも
のと確認できた。 次に、E.coli HB101（pEA6）株の大量培養を行なって
pEA6を調製した。 枯草菌の公知のベクターであるpUB110をプロトプラス
ト形質転換法に従ってTY002株に形質転換を行なった結
果、枯草菌（Bacillus subtilis 1012株）と同程度のカ
ナマイシン耐性形質転換細胞が得られた。 そこで、クローン化した耐熱性液化型アミラーゼ遺伝
子をDNA供与菌であるTY002株へセルフクローニングする
ためTY002株を高率に形質転換できるベクターpUB110に
再クローニングした。 すなわち、pEA6（第１図）およびpUB110を制限酵素Ec
oR Iで切断し、両者をT4リガーゼで連結後、枯草菌（Ba
cillus subtilis 1012株）に、赤松および関口ら（T.Ak
amatsu ＆ J.Sekiguchi:Agr.Biol.Chem.46, 1617（198
2））のプロトプラスト形質転換法に準じて形質転換
し、再生したコロニーをカナマイシンおよび可溶性澱粉
を含有するLB寒天平板培地にレプリカし、ヨウ素デンプ
ン反応でハローを形成するコロニーの検出を行ない、多
数の形質転換細胞を得た。 これらの形質転換細胞により組換えプラスミドを抽出
し、アガロースゲル電気泳動にかけ、3.02Kbの挿入DNA
断片を有するものを選択し、これをpBA61と命名した。p
BA61の制限酵素切断点地図を第２図に示す。 Bacillus subtilis 1012（pBA61）株の培養から大量
のpBA61を調製した。 pEA6およびpBA61の挿入DNA断片は、サザンブロティン
グにより、Bacillus licheniformis TY002株の染色体DN
A由来であることが確認された。 さらに、E.coli HB101（pEA6）およびBacillus subti
lis 1012（pBA61）の生産する耐熱性液化型アミラーゼ
は、DNA供与菌TY002株の生産する耐熱性液化型アミラー
ゼと、分子量、耐熱性および免疫学的に同等であること
も確認された。 TY002株へpBA61の導入による耐熱性液化型アミラーゼ高
生産株の造成 Bacillus licheniformis TY002株へ、赤松および関口
らの方法（T.Akamatsu ＆ J.Sekiguchi;Agr.Biol.Che
m.,46 1617（1982））によるプロトプラス形質転換法で
pBA61を形質転換した。 再生したコロニーを、カナマイシンを含有するLB寒天
平板培地で培養し、カナマイシン耐性を示す多数の形質
転換細胞を得た。 これを可溶性澱粉を含有するLB培地で振盪培養を行な
い、耐熱性液化型アミラーゼ生産性を調べ、もとのTY00
2株より生産性の高い株を選択した。 これらの形質転換細胞より組換えプラスミドを抽出
し、アガロースゲル電気泳動にかけ、完全鎖長のpBA61
が存在することを確認し、この形質転換細胞を、バチル
ス・リチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）TY
002（PBA61）−20と命名した。 この形質転換細胞の菌学的諸性質は、耐熱性液化型ア
ミラーゼの生産性が増大したことと、カナマイシン耐性
を示すこと以外は、DNA供与菌であるB.licheniformis T
Y002株と全く同一であり、その生産する耐熱性液化型ア
ミラーゼも、その分子量、耐熱性および免疫学的諸性質
は、DNA供与菌のものと同等であることが確認された。 TY002株の染色体へpBA61の組込みによる耐熱性液化型ア
ミラーゼ高生産株の造成 組換えプラスミドの導入により遺伝子に対応する産物
の増産を計る場合には、組換えプラスミドの欠失、脱落
などによる不安定性が問題となることがある。 組換えプラスミドpBA61をTY002株にセルフクローニン
グした株においても、継代培養中に、pBA61の分子内欠
失と思われる酵素生産性の低下が観察されることがあ
る。 本発明では、組換えプラスミドpBA61を前記TY002株の
染色体DNAを組み込ませて、耐熱性液化型アミラーゼの
生産性の増大とともに、安定性のある菌株を造成する。 即ち、pBA61を前述の赤松らのプロトプラスト形質転
換法に従って前記TY002株に形質転換し、再生したコロ
ニーをカナマイシンを含むLB寒天平板培地にレプリカを
行ない、カナマイシン耐性を示す形質転換株について、
耐熱性液化型アミラーゼ生産量、プラスミドの有無を調
べ、前記TY002株よりも、約２倍の安定した耐熱性液化
型アミラーゼ生産能を有し、しかも細胞内にプラスミド
が検出されない形質転換細胞の分離に成功した。 この形質転換細胞を、バチルス・リチェニフォルミス
（Bacillus licheniformis）TY002−57I株と命名して、
微生物工業技術研究所に寄託し、寄託番号は、微工研菌
寄第9224号である。 本菌株のカナマイシン耐性は、ベクターに使用したpU
B110のカナマイシン耐性遺伝子に由来すること、および
このカナマイシン耐性遺伝子は、本菌株の染色体DNA上
に存在することが、サザンブロティングにより、それぞ
れ確認された。 また、本菌株の菌学的諸性質は、カナマイシン耐性お
よび耐熱性液化型アミラーゼの生産性が高い以外は、TY
002株と全く同一である。 従って、本菌株ではpBA61が染色体DNAに組み込まれ
て、耐熱性液化型アミラーゼの生産が増強され、安定化
したものと判明した。 またさらに、本菌株の生産する耐熱性液化型アミラー
ゼは、DNA供与菌であるTY002株の生産する耐熱性液化型
アミラーゼと、その分子量、耐熱性および免疫学的諸性
質が、同一であることも確認された。 バチルス・リチェニフォルミスの異なる菌株を用いた形
質転換 TY002株を宿主とした場合と全く同様にして、TY002株
の親株であるNo.74株およびTY002株同様No.74株由来の
変異株であるYB304株を宿主として形質転換を行ない、
形質転換株からTY002−57I株と同様の染色体DNAへ、組
換えプラスミドpBA61が組み込まれた株の分離を試みた
が、No.74株およびYB304株の形質転換株からは、染色体
DNAへ組換えプラスミドpBA61が組み込まれた株を分離す
ることは出来なかった。従って、ここに示した方法にお
いて本組換えプラスミドpBA619を、バチルス・リチェニ
フォルミス染色体DNAに、高頻度に組換えられるのはTY0
02株の特性と考えられた。 各種菌株を宿主とした時の組換え耐熱性液化型アミラー
ゼ生産量の比較 バチルス・リチェニフォルミスによりクローニングし
た耐熱性液化型アミラーゼ生産遺伝子を用いて、形質転
換した各種菌株の組換え耐熱性液化型アミラーゼの生産
量を比較した。そのうち、B.subtilisを宿主とした例
は、これまでにいくつかの文献（Gregory L.G.et al.;
J.Bacteriol.,166 p.635（1986）、Stephen A.O.et a
l.;Gene,23 p.267（1983）およびRichard P.P.et al.;B
iochem.Biophys.Res.Comm,122 p.175（1984））に記載
はあるが、それらの菌株は本発明に使用した菌株と同一
ではなく、また、組換え耐熱性液化型アミラーゼの生産
量に関しても、直接比較し得る明瞭な記載はない。そこ
で本発明者らは、文献記載と同じB.subtilis Marburg株
由来である、B.subtilis 1012株とB.subtilis M15（pur
B6,metB5,amyE）株を以て、比較試験を試みた。B.subti
lis 1012株は、非耐熱性液化型アミラーゼ生産能につい
ては野生型株であり、B.subtilis M15（purB6,metB5,am
yE）株はアミラーゼ生産能欠損株であるが、上述した文
献記載の菌株と本質的な差異のない菌株であると考えら
れる。 数次にわたる培養について比較した結果は第３表の通
りであるが、明らかに遺伝子組換えの宿主に、バチルス
・リチェニフォルミスを用いたセルフクローニングで造
成した菌株が、他のどの菌種を宿主とする場合よりも優
位であった。 また、そのなかでも耐熱性液化型アミラーゼ高生産変
異株であるTY002株を組換え宿主として用いることが最
も有効であり、極めて高い生産性が得られることが判明
した。さらに、TY002−57I株はpBA61がプラスミド状態
で導入されているTY002（pBA61）−20株を凌ぐ生産性を
示した。 従って、組換えプラスミドが染色体へ組み込まれるこ
とで、組換え遺伝子が安定化され、安定に耐熱性液化型
アミラーゼの生産が増強されたTY002−57I株が工業上よ
り有用な菌株であることは明らかであった。 耐熱性液化型アミラーゼ活性測定法 一般的α−アミラーゼの活性の測定に用いられる測定
法に準じ、下記により行なった。なお、この測定法によ
る単位は、JIS−法によるデンプン液化力の単位と、ほ
ぼ1:1に対応する。 ［試薬の調製］ 基質： １％可溶性澱粉/50mM酢酸緩衝液（pH6.0） 基質の調製法： 可溶性澱粉（生化学用，和光製）1g（乾燥重量）を精
秤し、50〜70mlの蒸留水に懸濁し、加熱溶解する。冷却
後、1M酢酸緩衝液（pH6.0）5mlを加え、100mlにする。 ヨウ素希釈液： ヨウ素原液（１％ヨウ素液）を使用時に200倍に希釈
する。 ヨウ素原液の調製法： ヨウ素5gおよびヨウ化カリウム50gを50mlの蒸留水に
溶解した後、500mlに定容する。 酵素希釈液： 2mM−CaCl/10mM−NaCl/2mM−酢酸緩衝液（pH6.0） ［酵素反応］ 試験管（φ1.5×10.5cm）に基質液1.0mlを加え、40
℃、５分間予加熱後、これに酵素液100μｌを添加し、4
0℃、10分間反応を行なう。反応後、反応液100μｌを0.
1N−HCl1.0mlを加えた試験管（φ1.5×10.5cm）に加
え、反応を停止させる。その500μｌを試験管（φ1.8×
1.3cm）に採り、そこに希釈ヨウ素液5.0mlを添加し発色
させ、660nmの吸光度を測定する（光路長:10MM,対照：
蒸留水）。 ［活性の算出法］ 上記の条件で、１分間に１％のヨード呈色を減少させ
る酵素量を１単位とする。 α−アミラーゼ活性（u/ml）＝ （（Eb−Ｅ）/Eb）×100×1/10×希釈率 Eb:Blankの吸光度,E:反応液の吸光度 ただし、（Eb−Ｅ）/Eb＝0.2〜0.2 の範囲で測定する。 （実施例） つぎに、実施例により本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明がこの実施例により限定されるものでないこ
とは言うまでもない。 実施例 １ （１） 染色体DNAの調製 バチルス・リチェニフォルミスTY002株を、バクトト
リプトン10g,バクト酵母エキス5g,塩化ナトリウム5g,お
よび蒸留水1L,pH7.0からなる培地（以下LB培地と略す）
1000ml中で、対数増殖期（OD660≒0.5）まで生育させた
菌体を遠沈回収し（湿菌体5g）、−80℃で凍結保存し
た。この凍結菌体を融解後、斎藤及び三浦らの方法（前
述）により、DNAを抽出精製し、1.9mg（純度OD260/OD
280＝2.047）の染色体DNAを得た。 （２） 染色体DNA断片のベクターへの挿入 （１）で得られたTY002株のDNA100μｇを、制限酵素E
coR I100単位を加えた反応液600μｌを37℃１時間処理
し、65℃で、５分間加熱後、ショ糖密度勾配遠心分離を
行ない、約2KbのDNA断片を分画した。 一方、大腸菌のベクターとして広く知られているプラ
スミドpBR322 5μｇを、同じ制限酵素EcoR Iで完全に消
化し、65℃で、５分間加熱処理を行なった。 次に、前者10μｇと後者５μｇを混合し、連係酵素T4
リガーゼ0.5単位を添加した反応液100μｌを、15℃で16
時間連続反応を行なった。反応液を65℃で５分間加熱処
理後、DNAエタノール沈澱により回収し、20μｌのTENバ
ッファー（10mM−トリス塩酸緩衝液pH7.5;10mM−塩化ナ
トリウム;1mM−EDTA）に溶解して形質転換に使用した。 （３） 組換えプラスミドによる形質転換 （２）で得られたDNA溶液４μｌを、大腸菌エシェリ
ヒア・コリ HB101株（pro，leu B,B1,lac Y,hsd R,hsd
M,ara，gal kz,xyl，mtl，sup 44,F-,endo I-,rec A-）
を常法に従って調製したコンピーテントセル200μｌに
添加し、形質転換を行なった。これに4mlのLB培地を加
え、37℃で３時間振盪培養後、適当に希釈して、アンピ
シリン20μg/ml,ストレプトマイシン100μg/mlおよび可
溶性澱粉１％を含有するLB寒天培地に塗布し、37℃で２
日間培養を行ない、アンピシリン及びストレプトマイシ
ン耐性を示す形質転換体1.7×104の中からヨウ素デンプ
ン反応でハローを示すコロニー10株を得た。 （４） 組換えプラスミド中の挿入DNA断片の検出及び
組換えプラスミドの大量調製 （３）で得たアミラーゼ産生陽性を示す10株を、アン
ピシリン20μg/ml,テトラサイクリン20μg/ml,およびス
トレプトマイシン100μg/mlを含有するLB培地3mlに植
え、37℃で16時間振盪培養後、生育した菌体を迅速なプ
ラスミド分離法（D.S.Holmes ＆ M.Quigley:Anal.Bioch
em.114,193（1981））に従ってプラスミドを分離し、制
限酵素EcoR Iで消化後、アガロースゲル電気泳動にか
け、挿入DNA断片の検出を行なったところ、５株中に3.0
2KbのDAN断片、および残りの５株に9.44KbのDNA断片が
それぞれ検出された。前者（3.02Kb）の挿入DNA断片を
もつ組換えプラスミドをpEA6と命名した。 エシュリヒア・コリHB101（pEA6）株をM9培地（カザ
ミノ酸0.4％，リン酸水素２ナトリウム・12水塩1.7％，
リン酸２水素カリウム0.3％，塩化ナトリウム0.05％，
塩化アンモニウム0.1％，グルコース0.4％，塩化カルシ
ウム0.1mM,硫酸マグネシウム1mM,サイアミン塩酸塩40μ
g/ml,pH7.2）を用い、1L培養により収得した菌体を常法
に従ってリゾチーム処理により溶菌後、フェノール抽出
法により除蛋白を行ない、塩化セシウム密度勾配遠心分
離によりプラスミドを分離し、透析後エタノール沈澱に
より回収し、精製プラスミドDNA1.2mgを得た（OD260/OD
280＝1.91）。 （５） pEA6の制限酵素切断点地図 pEA6の挿入DNA断片について、常法により制限酵素切
断部位を調べた結果を、第１表に示した。 さらに、２種および３種類の制限酵素の組合せによる
消化を行ない、アガロースゲル電気泳動により、切断部
位およびサイズを測定し、挿入DNA断片の制限酵素切断
点地図を作成し、第１図に示した。 （６） pEA6を保持する大腸菌の生産する耐熱性液化型
アミラーゼの性質 エシェリヒア・コリHB101（pEA6）株およびバチルス
・リチェニフォルミスTY002株を可溶性澱粉１％を含有
するLB培地で、37℃で３日間振盪培養を行ない、大腸菌
は培養液を超音波処理により菌小を破砕し、遠心分離に
より上清を調製した。一方、TY002株は、培養液を遠心
分離により菌体を除去した上清を調製した。両試料につ
いて最適反応温度および熱安定性を比較した。すなわ
ち、両試料を40℃,70℃,80℃，および90℃の各温度で酵
素反応を行ない、耐熱性液化型アミラーゼの最適作用温
度および両試料を10mMの塩化カルシウム存在下に、40
℃,70℃,80℃および90℃の各温度で、10分間加熱処理後
の残存活性を測定して熱安定性を調べたところ、両菌株
の生産した酵素の最適作用温度は共に90℃付近であり、
耐熱性は80℃における10分間の加熱処理で、100％の残
存活性が得られ、両者は全く同じ作用形式を示した。 なお、pEA6の挿入DNA断片の由来について、常法によ
りサザントランスファーとハイブリダイゼーションによ
り調べた結果、TY002株由来であることが確認された。 これらのことから、組換えプラスミドpEA6はTY002株
の耐熱性液化型アミラーゼ生産性染色体DNA断片をクロ
ーニングしたことが明白となった。 （７） ベクタープラスミドpUB110によるTY002株の形
質転換 枯草菌の公知のベクターであるプラスミドpUB110を用
いて、プロトプラスト形質転換法（前述）に従って、バ
チルス・リチェニフォルミスTY002株に、形質転換を行
なったところ、1.2×106/μgDNAの高い頻度で形質転換
されることが明かとなった。これは、比較のために行な
った枯草菌（バチルス・ズブチリス1012株）の形質転換
頻度と同じレベルであった。 （８） 耐熱性液化型アミラーゼ生産性DNA断片の再ク
ローニング （７）で枯草菌の公知のベクターであるプラスミドpU
B110がバチルス・リチェニフォルミスTY−002株に高頻
度で導入されることが明かとなった。 組換えプラスミドpEA6に挿入されたTY002株由来の耐
熱性液化型アミラーゼ生産性DNA断片をTY002株にセルフ
クローニングするためには、この挿入DNA断片を高頻度
でTY002株に形質転換できるベクターに組み入れること
が最も望ましい。そこでpUB110への再クローニングを行
なった。すなわち、pEA6 10μｇおよびpUB110をそれぞ
れ制限酵素EcoR Iで完全に消化し、65℃で５分間加熱処
理後、両者を混合し、連結酵素T4リガーゼ0.5単位を添
加した反応液100μｌを15℃で16時間連結反応を行なっ
た。反応液を65℃で５分間加熱処理後、エタノール沈澱
によりDNAを回収し20μｌのTENバッファーに溶解して、
バチルス・ズブチリス1012株（leu A8,met B5,hsr ME
（m+））に、プロトプラスト形質転換法（前述）に従っ
て形質転換した。 カナマイシン100μg/ml含有の再生培地で再生したコ
ロニーをカナマイシン10μg/mlおよび可溶性澱粉１％含
有するニュートリエント寒天平板培地にレプリカし、37
℃で24時間培養し、ヨウ素デンプン反応でハローを形成
するコロニーの検出を行なった。カナマイシン耐性を示
す750株中に耐熱性液化型アミラーゼ酸生陽性株53株が
検出された。その10株をカナマイシン10μg/ml含有する
3mlのLB培地で、37℃16時間振盪培養した菌体を、枯草
菌のプラスミドのミニスクリーニング法（D.S.Goldfar
b,R.L.Rodoriguez ＆ R.H.Doi:Proc.Natl.Acad.Sci.USA
79,5886（1982））に従って組換えプラスミドを分離
し、制限酵素EcoR Iで消化後、アガロースゲル電気泳動
で調べた結果、すべての形質転換株に組換えプラスミド
pEA6に組み入れられた同一サイズの3.02Kbの挿入DNA断
片が検出された。この組換えプラスミドをpBA61と命名
し、バチルス・ズブチリス1012（pBA61）をLB培地で1L
培養を行ない、常法によりリゾチームによる溶菌後遠心
分離による上清をフェノール抽出を３回くり返し、塩化
セシウム密度勾配遠心分離によりプラスミドを分離し、
透析後エタノール沈殿により回収し、精製プラスミドDN
A200μｇを得た。 pBA61の挿入DNA断片について、常法により制限酵素切
断部位を調べた結果、ベクターpUB110のEcoR I部位に挿
入されたDNA断片は、（５）で記載した組換えプラスミ
ドpEA6で、ベクターpBR322のEcoR I部位に挿入されたDN
A断片と全く同一の制限酵素切断点を有することが示さ
れ、pEA6の挿入DNA断片をそのまま、pUB110のEcoR I部
位に挿入したことが明らかとなった。 （９） TY002株の染色体DNAへのpBA61の組込みによる
耐熱性液化型アミラーゼ高生産株の造成pBA61のDNA0.9
μｇを、プロトプラスト形質転換法（前述）に従って、
TY002株に導入（セルフクローニング）し、カナマイシ
ン100μg/mlを含有する再生培地で再生したコロニー
を、カナマイシン10μg/mlを含有するLB寒天平板培地に
レプリカしてカナマイシン耐性を示す96株の形質転換体
を得た。 全分離株を、可溶性澱粉１％を含有するLB培地20mlを
分注した100ml容エルレンマイヤーフラスコを用いて、3
7℃で、72時間振盪培養（176rpm）し、遠心上清につい
て、耐熱性液化型アミラーゼ活性を測定したところ、TY
002株の約２倍の酵素生産性を示す３株を分離した。こ
れらの耐熱性液化型アミラーゼ高生産性形質転換株を、
10μl/mlのカナマイシンを含有する3mlのLB培地で16時
間振盪培養して得た菌体を、枯草菌プラスミドのミニス
クリーニング法（前述）に従ってプラスミドを分離し、
制限酵素EcoR Iで消化後、アガロースゲル電気泳動で調
べた結果、３株のうち、２株からはベクタープラスミド
pUB110のバンドと3.02kbの挿入DNA断片のバンドが検出
され、TY002株にpBA61が導入されて、耐熱性液化型アミ
ラーゼ生産能が約２倍に上昇したことが明らかになっ
た。この２株のうち有望な１株をTY002（pBA61）−20と
命名した。 一方、他の１株からはベクターpUB110のバンドも、3.
02kbの挿入DNA断片のバンドも全く検出されなかった。
この株をTY002−57I株と命名した。 TY002株、TY002株にpUB110を形質転換したTY002（pUB
110）株およびTY002−57I株について、カナマイシン耐
性濃度を、5mlのLB培地を用いて、37℃で16時間培養後
の生育度により調べると、TY002株は、５μg/ml,TY002
（pUB110）株は200μg/ml,およびTY002−57I株では100
μg/mlの各濃度で生育が認められた。これらの結果か
ら、TY002−57I株のカナマイシン耐性の獲得は、自然突
然変異に起因するものではなく、pBA61がTY−002株の染
色体DNAへの組込みによると考えられるので、この確認
のため、TY002−57I株から染色体DNAを分離し、制限酵
素EcoR IあるいはBgL IIで消化後サザントランスファー
を行ない、pUB110をプローブとしてハイブリダイゼーシ
ョンを行なった結果、pBA61が、TY002−57I株の染色体D
NAの中に、組込まれていることが明かとなった。 すなわち、TY002−57I株は、自菌の染色体DNA上に存
在する耐熱性液化型アミラーゼ生産遺伝子のほかに、新
たにpBA61が染色体に組込まれ、自菌由来の耐熱性液化
型アミラーゼ遺伝子により補強され、これらの両遺伝子
の発現により耐熱性液化型アミラーゼの生産能が約２倍
に強化されたことは明白である。 また、TY002−57I株の当該酵素生産能は、極めて安定
していた。pBA61をTY002株の染色体外に形質転換（セル
フクローニング）して育種したTY002（pBA61）−20株で
は、耐熱性液化型アミラーゼの生産には、培養全期間を
通じてカナマイシンの選択圧（10μg/ml）を、かけた方
が好ましい結果を与えるが、TY002−57I株の場合には、
その必要はなく、例えば、培養開始前の平板培地での単
一細胞の分離あるいはその後の種培養時まで選択圧をか
ければ充分である。 第２表に、セルフクローニングにより、pBA61をTY002
株の染色体DNAに組込んだ造成株TY002−57I株の耐熱性
液化型アミラーゼの生産能をフラスコ培養で調べた結
果、および当該酵素の耐熱性について、TY002株と対比
して示した。TY002−57I株は、TY002株の約２倍の酵素
生産能を有し、耐熱性もTY002株と全く同様であること
が明かとなった。 さらに、TY002−57I株の生産する酵素は、蛋白質化学
的にも、免疫化学的にも、TY002株と同等であること
が、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子
量（60Kd）および家兎抗血清によるマイクロオクタロニ
ー法により確認された。 実施例 2. E.coli、B.subtilisおよびB.licheniformisの各菌株
を宿主とした時の耐熱性アミラーゼ生産量につき、それ
ぞれの組換え菌を１％可溶性澱粉を添加したLB培地で培
養し比較した。比較した菌株のうちB.subtilis 1012株
は非耐熱性アミラーゼ生産菌であり、B.subutilis M15
株はアミラーゼ非生産株である。また、B.licheniformi
s YB304株はTY002株同様No.74株から誘導した変異株で
ある。 数次の培養結果をまとめ第３表に示したが、バチルス
・リチェニフォルミスを宿主とした時に、最も優位に組
換え耐熱性アミラーゼを生産することが確認出来た。と
りわけ耐熱性アミラーゼ高生産変異株TY002株を宿主と
した時に、極めて優位な生産が可能になることが示さ
れ、また、本発明により造成したTY002−57I株は、pBA6
1がプラスミド状態で導入されているTY002（pBA61）−2
0株の結果をも凌ぐ生産性を示した。 実施例 3. 実施例1.の（９）で造成した耐熱性液化型アミラーゼ
高生産菌TY002−57I株を下記の培地中で、37℃70時間振
盪培養して、当該酵素の生産を経時的に測定し、TY002
株と比較して、第３図に示した。 培地：可溶性澱粉１％含有するLB培地 培地量:20ml培地/100ml容−エルレンマイヤーフラスコ 培養条件:37℃,176st/min. 両菌株とも生育度は変わらないが、TY002−57I株はTY
002株の２倍の耐熱性液化型アミラーゼの生産を示し
た。 実施例 4. 実施例1.の（９）で造成した耐熱性液化型アミラーゼ
高生産菌TY002−57I株を、工業生産用培地で培養し、酵
素の生産性を調べた。 すなわち、本菌株を、大豆粉３％，コーンスティープ
リカー３％，乳糖２％，リン酸２水素カリウム0.3％，
硫酸マグネシウム・７水塩0.03％，馬鈴薯澱粉１または
３％,pH7.0よりなる30mlの培地を含む500ml容エルレン
マイヤーフラスコに接種し、37℃で３日間開糖培養（21
0rpm）した。 結果を第４図（ＡおよびＢ）に示す。 図中、Ａは馬鈴薯澱粉１％,Bは同３％の例である。 また、馬鈴薯澱粉に替えて、白糖を5.3％を添加した
培地の例をＣに示した。 いずれの培地に於いても、TY002−57I株は、TY002株
の約２倍の酵素生産を示した。 ハ．発明の効果 本発明により、従来に比し耐熱性液化型アミラーゼ生
産能が一層優れ、かつ安定なバチルス・リチェニフォル
ミス菌株が造成され、さらにこの菌株を使用して、有効
な酵素生産を行なう方法が確立された。
【図面の簡単な説明】
第１図は、pEA6の制限酵素切断点地図を示す。
第２図は、pEA61の制限酵素切断点地図を示す。
第３図は、可溶性澱粉１％含有LB培地における生育度
（点線）と、酵素の生産状況（実線）を示す。図中横軸
は培養時間を、左縦軸は生育度（OD660）を、右縦軸は
酵素活性（u/ml）を，また、曲線の○，●印はTY002
株、□，■印はTY002−57I株を示す。 第４図は、工業用培地における酵素の生産状況を示し、
Ａは馬鈴薯澱粉１％、Ｂは同３％,Cは白糖5.3％の例で
ある。横軸は培養日数を、縦軸は酵素活性（u/ml）を、
また、曲線の●印はTY002株、■印はTY002−57I株を示
す。
（点線）と、酵素の生産状況（実線）を示す。図中横軸
は培養時間を、左縦軸は生育度（OD660）を、右縦軸は
酵素活性（u/ml）を，また、曲線の○，●印はTY002
株、□，■印はTY002−57I株を示す。 第４図は、工業用培地における酵素の生産状況を示し、
Ａは馬鈴薯澱粉１％、Ｂは同３％,Cは白糖5.3％の例で
ある。横軸は培養日数を、縦軸は酵素活性（u/ml）を、
また、曲線の●印はTY002株、■印はTY002−57I株を示
す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
(Ｃ１２Ｎ 9/30
Ｃ１２Ｒ 1:10）
(Ｃ１２Ｎ 15/09
Ｃ１２Ｒ 1:10）
(72)発明者 丸尾 文治
埼玉県浦和市北浦和１―12―６
審査官 鵜飼 健
(56)参考文献 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，166（２)
（1986）Ｐ．635−643
Ｇｅｎｅ，23（1983）Ｐ．267−276
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，122（１)
（1984）Ｐ．175−183
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，168（２)
（1986）Ｐ．973−981
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus licheni
formis）に属する耐熱性液化型アミラーゼ生産菌の、耐
熱性液化型アミラーゼ生産性染色体DNA断片をクローニ
ングし、これを耐熱性液化型アミラーゼ高生産性変異株
であるTY002株に形質転換することにより、耐熱性液化
型アミラーゼ生産能を増強し、さらに導入した組換えプ
ラスミドが染色体に組み込まれることにより、耐熱性液
化型アミラーゼ生産能力を安定に増強したバチルス・リ
チェニフォルミス菌体が、バチルス・リチェニフォルミ
ス（Bacillus licheniformis）TY002−57I（微工研菌寄
第9224号）である、バチルス・リチェニフォルミス菌
体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62052041A JP2681634B2 (ja) | 1987-03-09 | 1987-03-09 | 耐熱性液化型アミラーゼ生産能力の増強された細菌新菌株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62052041A JP2681634B2 (ja) | 1987-03-09 | 1987-03-09 | 耐熱性液化型アミラーゼ生産能力の増強された細菌新菌株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63219370A JPS63219370A (ja) | 1988-09-13 |
| JP2681634B2 true JP2681634B2 (ja) | 1997-11-26 |
Family
ID=12903734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62052041A Expired - Fee Related JP2681634B2 (ja) | 1987-03-09 | 1987-03-09 | 耐熱性液化型アミラーゼ生産能力の増強された細菌新菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2681634B2 (ja) |
-
1987
- 1987-03-09 JP JP62052041A patent/JP2681634B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２２（１）（１９８４）Ｐ．１７５−１８３ |
| Ｇｅｎｅ，２３（１９８３）Ｐ．２６７−２７６ |
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６６（２）（１９８６）Ｐ．６３５−６４３ |
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６８（２）（１９８６）Ｐ．９７３−９８１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63219370A (ja) | 1988-09-13 |
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