JP2542699B2

JP2542699B2 - デオキシマルトオリゴ糖、その製造方法、このものを有効成分とするα―アミラ―ゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα―アミラ―ゼ活性の測定方法

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Publication number: JP2542699B2
Application number: JP1224844A
Authority: JP
Inventors: 昌一徳武; 哲哉小熊; 光一朗戸辺; 護菊地; 清水澤; 信幸山次
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1989-08-31
Filing date: 1989-08-31
Publication date: 1996-10-09
Anticipated expiration: 2011-10-09
Also published as: JPH0386701A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、新規な６−デオキシマルトオリゴ糖、その
製造方法、このものを有効成分とするα−アミラーゼ活
性測定用試薬及び該６−デオキシマルトオリゴ糖を用い
て、α−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定す
る方法に関するものである。

従来の技術従来、血清、尿、膵液、唾液などの体液を対象とする
α−アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上極めて重要で
あり、特に急性や慢性の肝炎、膵臓がん、流行性耳下腺
炎などの鑑別診断においては必須の測定項目となってい
る。

このα−アミラーゼ活性の測定方法については、従来
より種々の方法、例えば（１）デンプン又は色素結合デ
ンプンを基質とし、還元力あるいは吸光度を測定する方
法、（２）マルトテトラオース、マルトペンタオースな
どの一連のマルトオリゴ糖を基質として利用し、α−ア
ミラーゼにより切断したのち、共役酵素系を作用させ、
生成するマルトース、グルコース又はグルコース−６−
リン酸を定量する方法、（３）各種置換フェニルマルト
オリゴシド類を基質として利用し、α−アミラーゼによ
り切断したのち、共役酵素系を作用させ、生成する置換
フェノール類をそのまま、あるいは必要に応じpHを調整
したのちに、あるいは縮合反応させたのちに、比色定量
する方法、（４）非還元末端グルコースの６位又は４位
若しくはその両方のヒドロキシル基の水素原子を、アリ
ール基やアルキル基などで修飾した各種置換アリール又
はアルキルマルトオリゴシド類を基質として利用し、前
記（３）と同様に比色定量する方法などが知られてい
る。

しかしながら、（１）の方法においては、基質に用い
られるデンプンの品質により、測定値にバラツキを生じ
るおそれがある上、酵素切断部位が多数存在するため、
α−アミラーゼ反応を正確に化学量論的反応として測定
できないなどの欠点がある。

これに対し、（２）及び（３）の方法は、均一な基質
を使用するために、前記（１）の欠点を克服することが
でき、好ましい方法として広く用いられているが、基質
が共役酵素により分解されるため、正の誤差を生じやす
く、またこの誤差をなくそうとして共役酵素量を減ずる
と測定に長時間を要するという欠点を有している。

そこで、このような（３）の方法における欠点を改良
するために、共役酵素で分解されない（４）の方法が開
発されている。しかしながら、この（４）の方法におい
ては、使用する基質の水に対する溶解度、α−アミラー
ゼに対する親和性及びα−アミラーゼによる分解速度が
低い上、化学的に不安定で長期間保存しにくいなどの欠
点がある。

発明が解決しようとする課題本発明は、このような従来のα−アミラーゼ活性の測
定試薬及びそれを用いる測定方法が有する欠点を克服
し、α−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定し
うる試薬として好適な新規化合物及びその製造方法を提
供するとともに、これを試薬とした新規なα−アミラー
ゼ活性の測定方法を提供することを目的としてなされた
ものである。

課題を解決するための手段本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を
重ねた結果、６−デオキシシクロデキストリンに特定の
理化学的性質を有するシクロデキストリナーゼと公知の
エキソ型糖化酵素類とを作用させて得られる、非還元末
端グルコースの６位水酸基が水素原子で置換された新規
な６−デオキシマルトオリゴ糖が、α−アミラーゼ活性
測定の際に用いる共役酵素のα−グルコシダーゼやグル
コアミラーゼの作用を受けず、α−アミラーゼ活性測定
用試薬として適しており、これを用いてα−アミラーゼ
活性を測定すれば、前記した欠点を克服しうることを見
出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、一般式（式中のｎは２〜６の整数である）で表わされる６−デオキシマルトオリゴ糖、及びこのも
のを有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試薬を提
供するものである。

本発明に従えば、前記一般式（Ｉ）で表わされる６−
デオキシマルトオリゴ糖は、６−デオキシシクロデキス
トリンに、以下の理化学的性質（イ）〜（ト）によって
特定されるシクロデキストリナーゼを作用させると同時
に、又は作用させたのちに、エキソ型糖化酵素を作用さ
せることにより製造することができる。

（イ）シクロデキストリンを開裂し、シクロデキスト
リンのグルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生
成させる作用を有する、（ロ）シクロデキストリンに対する水解速度又は親和
性が、多糖類あるいはシクロデキストリンと同じグルコ
ース重合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基質特異性を有
する、（ハ） β−シクロデキストリンを基質とした場合、pH
8.0近傍に至適pHを有し、かつ安定pH範囲が5.5〜9.5で
ある、（ニ） 40℃近傍に作用適温を有する、（ホ） 50℃以上の温度で15分間の処理により、ほぼ失
活する性質を有する、（ヘ） Hg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺及びFe²⁺などにより90
％以上阻害され、Ca²⁺及びMg²⁺により10〜30％活性化さ
れる性質を有する、及び（ト）ゲルろ過法による分子量が144,000で、SDS PAG
E法による分子量が72,000である。

さらに、本発明に従えば、α−アミラーゼ活性含有試
料に、前記一般式（Ｉ）で表わされる６−デオキシマル
トオリゴ糖と、α−グルコシダーゼ又はグルコアミラー
ゼ若しくはその両方を添加し、酵素反応によって生成す
るグルコース又はマルトース若しくはその両方を定量す
ることにより、α−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正
確に求めることができる。

以下、本発明を詳細に説明する。

前記一般式（Ｉ）で表わされる６−デオキシマルトオ
リゴ糖は、新規な化合物であって、具体例としては、α
又はβの6⁴−デオキシ−Ｄ−マルトテトラオース、6⁵−
デオキシ−Ｄ−マルトペンタオース、6⁶−デオキシ−Ｄ
−マルトヘキサオース、6⁷−デオキシ−Ｄ−マルトヘプ
タオース、6⁸−デオキシ−Ｄ−マルトオクタオースなど
を挙げることができる。これらの化合物は、いずれもα
−アミラーゼ活性測定用試薬として有用であるが、これ
らの中で、酵素反応速度の点から、特に6⁵−デオキシ−
Ｄ−マルトペンタオース、6⁶−デオキシ−Ｄ−マルトヘ
キサオース及び6⁷−デオキシ−Ｄ−マルトヘプタオース
が好適である。なお、ここでデオキシの前に付された6⁴
−,6⁵−,6⁶−,6⁷−の記号は、それぞれマルトオリゴ糖
を構成するグルコースの還元末端側から４番目、５番
目、６番目、７番目のグルコースの６位の水酸基が水素
原子に置換されていることを意味する。

これまで、前記一般式（Ｉ）ｎが１に相当する6³−デ
オキシ−Ｄ−マルトトリオースはタカ−アミラーゼA¹の
基質特異性の研究用変性マルトトリオースとして知られ
ているが〔「ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（J.Biochem.）」第84巻、第835〜841ページ（1978
年）〕、酵素反応速度が小さいため、α−アミラーゼ活
性の測定用基質としては適当でない。

次に、前記６−デオキシマルトオリゴ糖を製造する際
に用いられるシクロデキストリナーゼについて説明する
と、このものは本発明者らによって先に見出された酵素
であって、理化学的性質として、次に示す作用、基質特
異性、至適pH及び安定pH範囲、作用適温、失活性、阻害
及び活性化性、分子量を有している（特願平１−146891
号参照）。

該シクロデキストリナーゼの理化学的性質（イ）作用：シクロデキストリンを開裂し、そのシクロデキストリ
ンのグルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生成
させる作用を有する。

（ロ）基質特異性：シクロデキストリンに対する水解速度又は親和性が、
多糖類あるいはシクロデキストリンと同じグルコース重
合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基失特異性を有する。

第１表及び第２表に、それぞれ基質特異性の具体例及
びシクロデキストリン類とマルトオリゴ糖についての反
応速度のパラメーターを示す。

（ハ）至適pH及び安定pH範囲： β−シクロデキストリンを基質とした場合、pH8.0近
傍に至適pHを有し、かつ安定pH範囲が5.5〜9.5である。

第１図は、100mM濃度の酢酸緩衝液、リン酸緩衝液及
びホウ酸緩衝液それぞれ0.48ml、２％（w/v）濃度のβ
−シクロデキストリン溶液0.50ml及び酵素液0.02mlを混
合し〔基質のβ−シクロデキストリン濃度１％（w/
v）〕、40℃で１時間反応を行った場合におけるpHと相
対活性との関係を示すグラフである。この図において、
破線は酢酸緩衝液、実線はリン酸緩衝液、点線はホウ酸
緩衝液を用いた場合である。この第１図から、pH8.0近
傍に至適pHを有することが分る。

第２図は、100mM濃度の酢酸緩衝液、リン酸緩衝液及
びホウ酸緩衝液それぞれ0.20ml及び酵素液0.05mlを混合
し、各pHにおいて、25℃で24時間処理を行い、この処理
液0.10ml、100mM濃度のリン酸緩衝液（pH7.5）0.40ml及
び２重量％濃度のβ−シクロデキストリン溶液0.50mlを
混合して、40℃で１時間反応を行った場合における処理
pHと相対活性との関係を示すグラフである。この図にお
いて、破線は酢酸緩衝液、実線はリン酸緩衝液、点線は
ホウ酸緩衝液を用いた場合である。この第２図から、安
定pH範囲は5.5〜9.5であることが分る。

（ニ）作用適温： 40℃近傍に作用適温を有する。

第３図は、２％（w/v）濃度のβ−シクロデキストリ
ン溶液0.50ml、100mM濃度のリン酸緩衝液（pH7.5）0.48
ml及び酵素液0.02mlを混合し、各温度で10分間反応させ
た場合における温度と相対活性との関係を示すグラフで
ある。この第３図から、40℃近傍に作用適温を有するこ
とが分る。

（ホ）失活性： 50℃以上の温度で15分間の処理により、ほぼ失活する
性質を有する。

第４図は酵素を含有する100mM濃度のリン酸緩衝液（p
H7.5）0.05mlを各温度で15分間処理したのち、この処理
液0.02ml、100mM濃度のリン酸緩衝液（pH7.5）0.48ml及
び２％（w/v）濃度のβ−シクロデキストリン溶液0.50m
lを混合し、40℃で１時間反応させた場合における処理
温度と相対活性との関係を示すグラフである。この第４
図から、100mM濃度のリン酸緩衝液（pH7.5）中、15分間
処理で、45℃まで活性は安定であるが、50℃以上ではほ
ぼ失活することが分る。

（ヘ）阻害及び活性化性： Hg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺及びFe²⁺により90％以上阻害
され、Ca²⁺及びMg²⁺により10〜30％活性化される性質を
有する。

第３表に、金属イオンによる酵素活性への影響を示
す。

この第３表から、二価の金属イオンであるHg²⁺、C
u²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺及びFe²⁺により90％以上阻害され、Ca
²⁺及びMg²⁺により10〜30％活性化されることが分る。

（ト）分子量：ゲルろ過法による分子量が144,000で、SDS PAGE法に
よる分子量が72,000である。すなわち、該酵素は分子量
72,000のサブユニットから成る二量体である。

なお、該酵素の力価は、２％（w/v）濃度のβ−シク
ロデキストリン溶液500μ及び適当量の該酵素を含有
する100mM濃度のリン酸緩衝液（pH7.5）500μを混和
し、温度40℃で適当時間反応させたのち、10分間煮沸す
ることにより反応を停止し、高速液体クロマトグラフィ
ー（以下、HPLCと略称する）法によって、生成したマル
トヘプタオースを定量することにより求めた。また、酵
素量が少量の場合には、グルコースを標準としたソモギ
ーネルソン法により還元力を定量することにより求め
た。

該酵素の酵素単位については、１分間に１マイクロモ
ルのマルトヘプタオースを生成する酵素量を１単位とし
た。

次に、本発明で用いる前記シクロデキストリナーゼの
製造方法について説明する。この酵素を産生する微生物
については、バチルス属に属し、該酵素を産生するもの
であればよく、特に制限されず、例えばバチルス・スフ
ェリカス（Bacillus sphaericus）Ｅ−244菌株を挙げる
ことができる。このバチルス・スフェリカスＥ−244菌
株は土壌中から取得した野生株であって、以下に示す菌
学的性質を有している。

バチルス・スフェリカスＥ−244菌株の菌学的性質（ａ）形態（１）細胞の形及び大きさ:0.6〜0.8×1.6〜4.0μｍ
の桿菌である。

（２）細胞の多形成の有無：認められない。

（３）運動性の有無：周鞭毛を有し、運動性あり。

（４）胞子の有無：あり胞子嚢：膨出大きさ:0.8〜0.9×1.1〜1.2μｍ形：楕円形位置：亜端立（５）グラム染色性：陽性（６）抗酸性：陰性（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養：無色の拡散性集落を形成し、その集落は平滑で周縁は
なめらかであり、色素の産生は認められない。

（２）肉汁寒天斜面培養：菌苔は平滑で周縁はなめらかであり、色素の産生は認
められない。

（３）肉汁液体培養：培地全体に生育が認められるが、沈殿は認められな
い。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：培地上部にのみ生育し、液化は認められない。

（５）リトマス・ミルク：凝固は認められず、酸、アルカリの産生も認められな
い。

（ｃ）生理学的性質（１）硝酸塩の還元：還元しない（２）脱窒反応：なし（３） MRテスト：陰性（４） VPテスト：陰性（５）インドールの生成：生成しない（６）硫化水素の生成：生成しない（７）デンプンの加水分解：分解しない（８）クエン酸の利用：利用せず（９）無機窒素源の利用：利用せず（10）色素の生成：生成しない（11）ウレアーゼ：陰性（12）オキシダーゼ：陽性（13）カタラーゼ：陽性（14）生育の範囲温度:13〜38℃ pH:6〜10.5 （15）酸素に対する態度：好気性（16）Ｏ−Ｆテスト：陰性（酸の産生を認めず）（17）糖類に対する態度：Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクト
ース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソル
ビット、Ｄ−マンニット、イノシット、グリセリン及び
デンプンからの酸生成及びガス生成はいずれも認められ
ない。

（ｄ）フェニルアラニンの脱アミノ反応：陽性このバチルス・スフェリカスＥ−244菌株は、胞子を
形成するグラム陽性桿菌であることからバチルス属に属
する細菌であると同定した。さらに、糖からの酸及びガ
スの生成は認められないこと、VPブロスのpHが7.0以上
であること及びフェニルアラニンの脱アミノ反応が認め
られることからバージェイズ・マニュアル・オブ・シス
ティマティック・バクテリオロジー、第２巻（1984年）
に基づき、バチルス属のスフェリカス種に属する細菌で
あると同定した。

なお、バチルス・スフェリカスＥ−244は、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第2458号（FERM B
P−2458）として寄託されている。

この菌株の培養は、原則的には一般微生物の好気的培
養で採用される方法と同じであるが、通常は、液体培地
による振とう培養法、又は通気かくはん培養法などが用
いられる。培地としては、適当な窒素源、炭素源、ビタ
ミン、ミネラルなど及び該酵素の誘導基質であるシクロ
デキストリンなどを含んだものが用いられる。pHは、前
記菌株が生育するpH域ならばいずれでもよいが、通常は
６〜８の範囲が好ましい。

培養は、通常20〜40℃の範囲の温度において、16時間
ないし４日間程度振とう培養又は通気かくはん培養する
ことによって行われる。

このようにして得られた培養物から所望の酵素を得る
には、例えばまず遠心分離や膜濃縮などにより集菌した
のち、菌体を超音波処理又は界面活性剤処理などにより
破砕し、菌残渣を遠心分離などで除いて粗酵素液を得、
次いでこの粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過などのカラムクロマ
トグラフィーを適宜組み合わせて実施することにより、
該酵素の精製品を得る方法を用いることができる。

このようにして得られた本発明に係るシクロデキスト
リナーゼと従来公知のシクロデストリナーゼとの理化学
的性質の相違点を第４表に示す。

第４表から分るように、本発明に係るシクロデキスト
リナーゼは、従来公知のシクロデキストリナーゼとはそ
の性質を異にし、特にシクロデキストリンに対して極め
てよく作用するという利点を有している。また、シクロ
デキストリンについては、シクロデキストリン骨格を有
しているものであればよく、特に制限されず、分枝体や
修飾体などの誘導体にも好適に作用する。

前記一般式（Ｉ）で表わされる６−デオキシマルトオ
リゴ糖は、本発明に従えば次のようにして製造すること
ができる。

まず、例えば一般式（式中のｎは４〜６の整数である）で表わされる６−デオキシシクロデキストリンに、前記
のシクロデキストリナーゼを作用させることにより、一
般式（式中のＸは１個が水素原子で、残りのｎ＋１個が水酸
基であり、ｎは４〜６である）で表わされる、種々の位置に６−デオキシグルコース残
基を有する６−デオキシマルトオリゴ糖の混合物を主成
分とする反応液を得る。

出発物質として、好適な前記一般式（II）で表わされ
る６−デオキシシクロデキストリンは、例えば市販のα
−、β−、γ−シクロデキストリン（それぞれのグルコ
ース重合度は６、７、８である）などから、公知の方法
により製造することができる。この製造方法の好適な１
例について説明すると、まずシクロデキストリンをピリ
ジンなどの溶媒に溶解し、これに該シクロデキストリン
に対し、７〜14倍モル量のトシルクロライドを添加し、
通常15〜30℃の範囲の温度で４〜６時間程度反応させて
トシル化したのち、必要に応じ常法に従い精製して、６
−トシルシクロデキストリンを得る。次いでこれをジメ
チルスルホキシドやジメチルホルムアマイドなどの有機
溶媒に溶解し、これに水素化ホウ素ナトリウムなどの還
元剤を、該６−トシルシクロデキストリンに対し、通常
10〜30倍モル量を加え、好ましくは40〜60℃の範囲の温
度で10〜20時間程度反応させて還元したのち、必要に応
じ、常法に従い精製して６−デオキシシクロデキストリ
ンを得る。

このようにして、出発物質として好適な、例えば６−
デオキシ−α−シクロデキストリン、６−デオキシ−β
−シクロデキストリン、６−デオキシ−γ−シクロデキ
ストリンを容易に製造することができるが、これらの中
で酵素反応速度の点から６−デオキシ−β−シクロデキ
ストリンが特に好適である。

この酵素反応における６−デオキシシクロデキストリ
ンの基質濃度は、該シクロデキストリナーゼの基質に対
するKm値以上の濃度になるように調節することが好まし
い。また、酵素反応条件については、該シクロデキスト
リナーゼの作用pH及び作用温度の範囲であればよく、特
に制限はないが、通常pH7.5〜9.0、温度35〜45℃の条件
で反応が行われる。

さらに、この酵素反応条件には、必要に応じ、エタノ
ール、アセトン、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒
を添加してもよい。反応時間は、反応生成物の安定性に
より異なるが、通常30分ないし48時間程度である。ま
た、酵素量については特に制限はないが、反応時間内に
生成物が最大となるように、適宜必要量を添加すればよ
く、通常0.5〜５単位/gの範囲で選ばれる。

このようにして、前記一般式（III）で表わされる各
種６−デオキシマルトオリゴ糖の混合物を主成分とする
反応液が得られる。この反応液としては、例えば出発物
質が６−デオキシ−β−シクロデキストリンの場合に
は、6⁷−デオキシマルトヘプタオース、6⁶−デオキシマ
ルトヘプタオース、6⁵−デオキシマルトヘプタオース、
6⁴−デオキシマルトヘプタオース、6³−デオキシマルト
ヘプタオース、6²−デオキシマルトヘプタオース、6¹−
デオキシマルトヘプタオースの混合物を主成分とするも
のが得られ、６−デオキシ−α−シクロデキストリンの
場合には、同様に6⁶−、6⁵−、6⁴−、6³−、6²−、6
¹−、デオキシマルトヘキサオースの混合物を主成分と
するものが得られる。

次に、このようにして得られた反応液に、エキソ型糖
化酵素類を作用させて、６−デオキシグルコースの残基
が非還元末端となるように非還元末端側のグルコース残
基を加水分解させる。この際用いられるエキソ型糖化酵
素類としては、例えば公知のα−グルコシダーゼやグル
コアミラーゼなどが挙げられるが、これらはそれぞれ単
独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよく、ま
た、所望に応じβ−アミラーゼを併用してもよい。

この酵素反応によって、6⁴−デオキシマルトテトラオ
ース、6⁵−デオキシマルトペンタオース、6⁶−デオキシ
マルトヘキサオース、6⁷−デオキシマルトヘプタオー
ス、6⁸−デオキシマルトオクタオースなどの前記一般式
（Ｉ）で表わされる各種６−デオキシマルトオリゴ糖、
6³−デオキシマルトトリオース、6²−デオキシマルトー
ス、6¹−デオキシグルコースなどとの混合物として得ら
れる。なお、β−アミラーゼを併用した場合は、前記化
合物の他に6¹−デオキシマルトースも生成する。

該エキソ型糖化酵素類は、前記のシクロデキストリナ
ーゼと共存させて、酵素反応を同時的に行わせてもよい
し、出発原料ににシクロデキストリナーゼを作用させた
のち、さらに該エキソ型糖化酵素類を作用させて酵素反
応を行わせてもよいが、後者の方が好ましい。特に好適
な態様においては、例えば出発原料に該シクロデキスト
リナーゼを作用させて、生成物が最大となった時点で、
酸処理や熱処理などにより、いったん反応を停止させた
のち、例えば反応液をオクタデシル化シリカゲル（OD
S）カラムなどに通液して、未反応の原料を吸着除去す
るなどの精製処理を施し、次いでこれにエキソ型糖化酵
素類を作用させる。

該シクロデキストリナーゼとエキソ型糖化酵素類とを
共存作用させる場合の反応条件としては、もちろん両酵
素の共通な作用pH及び作用温度範囲で適宜選択すればよ
いが、通常pH7.0〜9.0、温度35〜45℃において、0.5〜4
8時間程度反応が行われる。

また、シクロデキストリナーゼを作用させたのち、エ
キソ型糖化酵素類を作用させる場合の反応条件として
は、用いる酵素の作用pH及び作用温度範囲で適宜選べば
よいが、通常pH4.0〜7.5、温度35〜45℃において、0.5
〜48時間程度反応が行われる。

さらに、エキソ型糖化酵素類の使用量については特に
制限はないが、通常６−デオキシシクロデキストリンに
対し、10〜100単位/gの範囲で選ばれる。また、この酵
素反応は酸処理や熱処理などにより停止させることがで
きる。

次に、このようにして得られた６−デオキシマルトオ
リゴ糖含有反応液から、所望の前記一般式（Ｉ）で表わ
される６−デオキシマルトオリゴ糖を分離精製するので
あるが、この分離精製方法については特に制限はなく、
従来オリゴ糖の分離精製に慣用されている方法を用いる
ことができる。例えば、反応液から未反応の６−デオキ
シシクロデキストリンを除いたのち、活性炭カラムクロ
マトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー、薄層クロマトグラフィーなどを用いて分画採取する
方法などを採用することができる。また、未反応の６−
デオキシシクロデキストリンの除去方法としては、例え
ば冷却処理、有機溶媒添加処理、吸着カラム処理などの
公知の方法が挙げられる。

このようにして得られた前記一般式（Ｉ）で表わされ
る６−デオキシマルトオリゴ糖は、α−アミラーゼ活性
の測定に極めて有用であり、この６−デオキシマルトオ
リゴ糖を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試薬
及びこの試薬を用いてα−アミラーゼ活性を測定する方
法を提供することも本発明の目的の１つである。

α−アミラーゼ活性を測定するための有利な系として
は、例えば前記一般式（Ｉ）で表わされる６−デオキシ
マルトオリゴ糖１〜20mM及び緩衝剤２〜100mMを含有
し、かつ共役酵素として、α−グルコシダーゼ又はグル
コアミラーゼ若しくはその両方を、それぞれ15〜150単
位/ml含有するpH4〜10の系が挙げられる。この系に用い
られる緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸
塩、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ホ
ウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタル酸塩などが挙げ
られる。

該α−グルコシダーゼについては特に制限はなく、動
物、植物、微生物起源のいずれのものも用いることがで
きるが、特に酵母起源のものが、基質特異性の点から好
ましい。また、グルコアミラーゼについても特に制限は
なく、いずれの起源のものも用いることができるが、リ
ゾプス属sp.（Rhizopus sp.）に由来するものが好まし
い。

該測定系には、必要に応じ溶解補助剤、安定化剤とし
てのグリセリン、牛血清アルブミン、α−又はβ−シク
ロデキストリン、トリトンX100などを添加することもで
きるし、またα−アミラーゼ活性剤として、Cl^-、C
a²⁺、Mg²⁺などのイオンをNaCl、MgCl₂、MgSO₄、CaCl₂、
CaCl₂・2H₂Oなどの形で加えることもできる。

さらに、酵素反応によって生成するグルコースやマル
トースを吸光度測定法によって定量する場合には、通常
用いられるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（例えばLeuconostoc mesenteroidesなどに由来するも
の）、マルトースホスホリラーゼ（例えばLactobacillu
s brevisなどに由来するもの）、ヘキソキナーゼ（例え
ば酵母などに由来するもの）、β−ホスホグルコムター
ゼ〔例えば兎筋肉（rabbitmuscle）などに由来するも
の〕、NADとATPなどを加えればよい。

本発明の試薬は、乾燥物又は溶解した形で用いてもよ
いし、薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の紙などに
含浸させて用いてもよい。このような本発明の試薬を用
いることにより、各種の試料に含有されるα−アミラー
ゼ活性を、簡単な操作で正確に、かつ高感度で測定する
ことができる。

次に、本発明のα−アミラーゼ活性の測定方法の好適
な１例について説明すると、まず、α−アミラーゼを含
む試料に、共役酵素としてのα−グルコシダーゼ又はグ
ルコアミラーゼ若しくはその両方を、それぞれ15〜150
単位/ml、好ましくは30〜70単位/mlになるように加え、
同時に又は順次に前記一般式（Ｉ）で表わされる６−デ
オキシマルトオリゴ糖１〜20mM、好ましくは３〜8mM及
び緩衝剤を添加したのち、温度25〜50℃、pH4〜10の条
件にて１分間以上、好ましくは２〜60分間酵素反応させ
る。次いで生成するグルコースやマルトースを、常法に
よりそのまま、例えばソモジ・ネルソン法、グルコスタ
ット法などを用いて定量するか、又は前記したように吸
光度測定法によって定量し、あらかじめ同方法で定量し
て作成したα−アミラーゼ標品の検量線を用いて、試料
中のα−アミラーゼ活性を算出する。

本発明に用いられるα−アミラーゼ活性含有試料につ
いては、α−アミラーゼ活性を含有するものであればよ
く、特に制限はないが、具体的には微生物の培養液、植
物の抽出液、あるいは動物の体液や組織及びそれらの抽
出液などを用いることができる。

また、α−アミラーゼ活性含有試料が固体の場合に
は、該試料をいったん緩衝剤に溶解又は懸濁させてか
ら、測定に供するのが有利である。この緩衝剤として
は、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス−（ヒド
ロキシメチル）−アミノメタン、ホウ酸塩、クエン酸
塩、ジメチルグルタル酸塩などが挙げられる。

発明の効果本発明は新規なα−アミラーゼ活性測定用試薬を用い
ることにより、共役酵素の影響を受けることなく、α−
アミラーゼ活性を自動分析法、用手法などにより、精度
よく、短時間で容易に測定することができる上、共役酵
素を共存させても長期間にわたって安定状態を維持しう
るという利点がある。

さらに、本発明の製造方法によれば、前記一般式
（Ｉ）で表わされる６−デオキシマルトオリゴ糖を効率
よく製造することができる。

実施例次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明はこれらの例によってなんら限定されるもの
ではない。

実施例１ 6⁵−デオキシマルトペンタオースの製造（１）シクロデキストリナーゼの調製１％（w/v）β−シクロデキストリン、１％（w/v）ペ
プトン、0.5％（w/v）NaCl及び0.1％（w/v）イーストエ
キスから成る液体培地（水道水使用、pH7.0）100mlを50
0ml容坂口フラスコに入れ、120℃で20分間、殺菌処理を
行った。これに、バチルス・スフェリカスＥ−244菌株
（FERM BP−2458）の保存スラントより１白金耳接種
し、30℃で１日間振とう培養した。この培養液50mlを前
記と同様の培地組織と殺菌条件により調製した2000mlの
培地を含有する3000ml容ミニジャーに接種して30℃、1v
vm、350rpmの条件で２日間通気かくはん培養を行い、培
養終了後、この培養液から8000rpm、20分間の遠心分離
処理により菌体を分離し、２％（w/v）トリトンＸ−100
を含有する10mMリン酸緩衝液（pH7.0）500mlに菌体を懸
濁して25℃で１日間かきまぜた。該懸濁液から12000rpm
で20分間の遠心分離処理により菌体残渣を除去したの
ち、上清液を10mMリン酸緩衝液（pH7.0）に対して16時
間透析した。得られた透析物を12000rpmで20分間遠心分
離処理して不溶物を除去し、上清を粗酵素液（１）とし
た。

次いで、この粗酵素液（１）約500ml（総活性200単
位、タンパク量2083mg、比活性0.1、pH7.0）を10mMリン
酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したDEAEセファロース充填
カラム（φ34×170mm）に供し、酵素を吸着させたの
ち、０〜0.5M NaClのグラジエント勾配により溶出を行
った。このDEAEセファロースカラムクロマトグラフィー
の溶出パターンを第５図に示す。第５図において、◎印
は活性（U/ml）、○印はタンパク量（mg/ml）である。
また、この際の溶出条件は次のとおりである溶出条件溶離液:10mMリン酸緩衝液（pH7.0）溶出:0M−0.5M NaCl 分取量:12ml/フラクション流速:6ml/min 温度：室温このようにして得られた活性フラクションを集めて粗
酵素液（２）105ml（総活性145単位、比活性0.58、収率
72.5％）を得た。

次いでこの粗酵素液（２）20ml（総活性31単位、タン
パク量29mg）を1M硫酸ナトリウム含有100mMリン酸緩衝
液（pH7.0）で平衡化したエーテル5PW充填カラム（φ2
1.5×150mm）に供し、酵素を吸着させたのち、1M−0M硫
酸ナトリウムのグラジエント勾配により溶出を行った。
この溶出パターンを第６図に示す。第６図において、◎
印は活性（U/ml）、○印はタンパク量（mg/ml）であ
る。また、この際の溶出条件は次のとおりである。

溶出条件溶離液:100mMリン酸緩衝液（pH7.0）溶出:1M−0M Na₂SO₄（1hr）分取量:5ml/フラクション流速:5ml/min 圧力:35〜50kg/cm² 温度：室温このようにして得られた活性フラクションを集めて粗
酵素液（３）50ml（総活性72単位、比活性2.93、収率36
％）を得た。

次いでこの粗酵素液（３）をコロジオンバッグにより
1.5mlにまで限外濃縮したのち、0.2ml（総活性８単位、
タンパク量1.2mg）をTSK gel G3000SW（カラムφ7.5×6
00mm×２）を用いたゲルろ過に供し、0.2M NaCl含有100
mMリン酸緩衝液（pH7.0）により溶出した。この溶出パ
ターンを第７図に示す。第７図において、◎印は活性
（U/ml）、○印はタンパク量（mg/ml）である。また、
この際の溶出条件は次のとおりである。

溶離液:100mMリン酸緩衝液（pH7.0）＋0.2M NaCl 分取量:1ml/フラクション流速:0.7ml/min 圧力：約70kg/cm² 温度：室温このようにして得られた活性フラクションを集めて精
製酵素液1.4ml（総活性2.2単位、タンパク量0.24mg、比
活性9.17、収率１％）を得た。第８図に、この酵素のSD
S PAGEの結果を示す。この図から分るように、該酵素は
SDS PAGE的に単一であった。

（２）出発物質の６−デオキシ−β−シクロデキスト
リンの製造市販のβ−シクロデキストリン〔和光純薬工業（株）
製〕5.00g（4.41mmol）をピリジン50mlに溶解したの
ち、これにトシルクロリド10.0g（52.4mmol）を加え、
室温で５時間かきまぜながら反応させた。次いで、この
反応液のピリジンを減圧下に留去させたのち、残渣に水
100ml及びベンゼン150mlをかきまぜながら添加し、固形
物を析出させた。

次に、この固形物をグラスフィルターでろ別し、アセ
トン50mlで２回洗浄したのち、ろ取物をODSカラムクロ
マトグラフィーにより精製し、エタノール−水混合液
（容量比1:9）で溶出した目的画分を濃縮して、水から
再結晶することにより、６−トシル−β−シクロデキス
トリン1.63g（1.26mmol、収率28.6％）が得られた。

このものの融点、赤外吸収スペクトル及び核磁気共鳴
スペクトルを次に示す。

融点（℃）:172.0〜174.0（分解）赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3400,2930,1642,1632,160
0,1424,1360,1300,1178,1156,1078,1028 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm:（DMSO−d₆）2.44
（3H,s）,3.15〜4.45（ｍ）,4.76（2H,br,s）,4.85（5
H,br,s）,7.44（2H,d,J＝8.8Hz）,7.75（2H,d,J＝8.8H
z）次に、このようにして得られた前記６−トシル−β−
シクロデキストリン1.27g（0.985mmol）をジメチルスル
ホキシド（DMSO）20mlに溶解したのち、これに水素化ホ
ウ素ナトリウム（NaBH₄）384mg（10.2mmol）を加え、50
℃で12時間反応させた。次いで、この反応液に水1000ml
を加え、ODSカラムクロマトグラフィーに供してDMSOを
除去したのち精製し、エタノール−水混合液（容量比1:
9）で溶出した目的画分を濃縮して、メタノールから再
結晶することにより、６−デオキシ−β−シクロデキス
トリン839.6mg（0.750mmol、収率76.1％）が得られた。

このものの融点、赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴ス
ペクトル及び元素分析値を次に示す。

融点（℃）:280.0〜281.0（分解）赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3370,2920,1152,1080,102
0 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（DMSO−d₆）:1.20
（3H,d,J＝6.1Hz）,2.80〜4.05（ｍ）,4.84（7H,br.s）元素分析値:C₄₂H₇₀O₃₄としてＣＨ理論値（％） 45.08 6.31 実測値（％） 44.99 6.45 （３） 6⁵−デオキシ−Ｄ−マルトペンタオースの製造前記（２）と同様にして得た６−デオキシ−β−シク
ロデキストリン15gを100mMリン酸緩衝液（pH7.0）1000m
lに溶解したのち、前記（１）と同様にして得た粗酵素
液を約24単位添加して、40℃で48時間酵素反応を行わ
せ、反応液を得た。

この反応液に塩酸を添加してpHを約2.0にすることに
より反応を停止させたのち、水酸化ナトリウム溶液を加
えて中和し、次いで、これをODSカラムに通液して、未
反応の６−デオキシ−β−シクロデキストリンを吸着さ
せ、通液画分を得た。この操作を４回繰り返して、合計
63gの６−デオキシ−β−シクロデキストリンを処理し
た。

この通液画分を1/10の液量の100mM酢酸緩衝液（pH4.
5）と混合したのち、さらに100mM酢酸によりpHを4.5に
調整した。次いで、これにグルコアミラーゼ2500単位を
添加して40℃で８時間酵素反応を行わせたのち、この反
応液に塩酸を添加してpHを約2.0にすることにより反応
を停止させ、次いで水酸化ナトリウム溶液を加えて中和
した。

次に、この液を活性炭カラムに通液したのち、０〜35
％のエタノールグラジエントにより６−デオキシマルト
オリゴ糖を溶出させ、次いで約25％のエタノール溶出画
分を凍結乾燥して、純度約98％の6⁵−デオキシ−Ｄ−マ
ルトペンタオース約2.5gを得た。

このものの赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクト
ル、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。

赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3420,2925,1628,1412,136
8,1150,1080,1040 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（D₂O）:1.27（3H,
d,J＝6.3Hz）,3.16（1H,t,J＝9.0Hz）,3.29（1H,t,J＝
9.0Hz）,3.50〜4.10（ｍ）,4.65（0.5H,d,J＝8.1Hz,α
−Ｈ）,5.23（0.5H,d,J＝3.4Hz,β−Ｈ）,5.27（1H,d,J
＝3.2Hz）,5.35（3H,d,J＝3.9Hz）高速液体クロマトグラフィー〔東ソー（株）製TSK gel
Amide−80カラム（4.6mmID×250mm）、RI検出、溶離
液：アセトニトリル／水＝3/2（V/V），流速:1.0ml/mi
n〕:^tR＝8.7min 元素分析値:C₃₀H₅₂O₂₅としてＣＨ理論値（％） 44.34 6.45 実測値（％） 44.45 6.45 実施例２ 6⁴−デオキシ−Ｄ−マルトテトラオースの製
造実施例１の（３）において、エタノールグラジエント
による約23％エタノール溶出画分を採取した以外は、実
施例１と同様な操作を行い、純度99.5％の6⁴−デオキシ
−Ｄ−マルトテトラオース約2.4gを得た。

赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3420,2930,1636,1410,136
6,1148,1078,1038 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（D₂O）:1.27（3H,
d,J＝6.3Hz）,3.14（1H,t,J＝9.0Hz）,3.26（1H,t,J＝
9.0Hz）,3.50〜4.10（ｍ）,4.63（0.5H,d,J＝8.1Hz,α
−Ｈ）,5.22（0.5H,d,J＝3.4Hz,β−Ｈ）,5.25（1H,d,J
＝2.9Hz）,5.33（2H,br.d,J＝1.5Hz）高速液体クロマトグラフィー〔東ソー（株）製TSK gel
Amide−80カラム（4.6mmID×250mm）、RI検出、溶離
液：アセトニトリル／水＝3/2（V/V），流速:1.0ml/mi
n〕:^tR＝7.2min 元素分析値:C₂₄H₄₂O₂₀としてＣＨ理論値（％） 44.31 6.51 実測値（％） 44.33 6.49 実施例３公知化合物の6³−デオキシ−Ｄ−マルトトリオースと
本発明の新規化合物である6⁴−デオキシ−Ｄ−マルトテ
トラオース及び6⁵−デオキシ−Ｄ−マルトペンタオース
とのα−アミラーゼによる加水分解速度の比較を行っ
た。

（１） 6³−デオキシ−Ｄ−マルトトリオースの製造実施例１の（３）において、エタノールグラジエント
による約21％エタノール溶出画分を採取した以外は、実
施例１と同様な操作を行い、純度98.6％の6³−デオキシ
−Ｄ−マルトトリオース約1.1gを得た。

赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3400,2950,1690,1146,104
2 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（D₂O）:1.28（3H,
d,J＝6.1Hz）,3.17（1H,t,J＝8.9Hz）,3.29（1H,t,J＝
8.9Hz）,3.50〜4.05（ｍ）,4.65（Ca.0.5H,d,J＝7.8Hz,
α−Ｈ）,5.35（Ca.0.5H,d,J＝3.7Hz,β−Ｈ）,5.27（1
H,d,J＝3.0Hz）,5.36（1H,d,J＝3.9Hz）高速液体クロマトグラフィー〔東ソー（株）製TSK gel
Amide−80カラム（4.6mmID×250mm）、RI検出、溶離
液：アセトニトリル／水＝3/2（V/V），流速:1.0ml/mi
n〕:^tR＝5.9min 元素分析値:C₁₈H₃₂O₁₅としてＣＨ理論値（％） 44.26 6.60 実測値（％） 44.28 6.58 （２）希釈液の調製 CaCl・2H₂O及びNaClを、それぞれ0.029％（w/v）及び
0.117％（w/v）の濃度になるように10mMリン酸緩衝液
（pH7.0）で溶解し、これを希釈液とする。

（３）基質液の調製前記（１）で得た6³−デオキシ−Ｄ−マルトトリオー
ス、実施例２で得た6⁴−デオキシ−Ｄ−マルトテトラオ
ース及び実施例１で得た6⁵−デオキシ−Ｄ−マルトペン
タオースをそれぞれ7.74mM濃度になるように、前記希釈
液で溶解して、基質液とする。

（４）共役酵素液の調製酵母由来のα−グルコシダーゼを69.44U/ml濃度にな
るように前記希釈液で溶解して共役酵素液とする。

（５） α−アミラーゼ液の調製ヒト由来の国際試薬社製標品α−アミラーゼ（キャブ
リザイム・AMY）（P:S＝1:1）を300U/の濃度となるよ
うに前記希釈液で溶解してα−アミラーゼ液とする。

（６）酵素反応共役酵素液1.8ml及びα−アミラーゼ液0.2mlをよく混
合したのち、ただちに、これに基質液0.5mlを加えてよ
く混合し、40℃で30分間反応を行い、次いで遊離したグ
ルコースをグルコスタット法により定量した。その結果
を第５表に示す。

第５表から、本発明の6⁴−デオキシ−Ｄ−マルトテト
ラオース及び6⁵−デオキシ−Ｄ−マルトペンタオース
は、従来公知の6³−デオキシ−Ｄ−マルトトリオースに
比べて、α−アミラーゼによる加水分解反応速度が著し
く速いことが分かる。

実施例４ 6⁶−デオキシ−Ｄ−マルトヘキサオースの製
造実施例１の（３）において、エタノールグラジエント
による約27％のエタノール溶出画分を採取した以外は、
実施例１と同様な操作を行い、純度約97％の6⁶−デオキ
シ−Ｄ−マルトヘキサオース約2.2gを得た。

このものの赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペク
ト、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。

赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3400,2930,1640,1412,136
0,1150,1078,1036 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（D₂O）:1.27（3H,
d,J＝6.1Hz）,3.16（1H,t,J＝8.7Hz）,3.28（1H,t,J＝
8.7Hz）,3.45〜4.15（ｍ）,4.65（0.5H,d,J＝8.3Hz,α
−Ｈ）,5.22（0.5H,d,J＝3.9Hz,β−Ｈ）,5.27（1H,d,J
＝2.9Hz）,5.35（4H,d,J＝2.9Hz）高速液体クロマトグラフィー〔東ソー（株）製TSK gel
Amide−80カラム（4.6mmID×250mm）、RI検出、溶離
液：アセトニトリル／水＝3/2（v/v），流速:1.0ml/mi
n〕:^tR＝10.1min 元素分析値:C₃₆H₆₂O₃₀としてＣＨ理論値（％） 44.35 6.41 実測値（％） 44.29 6.44 実施例５ 6⁷−デオキシ−Ｄ−マルトヘプタオースの製
造実施例１の（３）において、エタノールグラジエント
による約29％エタノール溶出画分を採取した以外は、実
施例１と同様な操作を行い、純度99.5％の6⁷−デオキシ
−Ｄ−マルトヘプタオース約2.7gを得た。

赤外吸収スペクトル（cm^-1）:3420,2930,1628,1412,136
4,1150,1078,1022 核磁気共鳴スペクトル（200MHz）ppm（D₂O）:1.25（3H,
d,J＝6.4Hz）,3.16（1H,t,J＝8.7Hz）,3.27（1H,t,J＝
8.7Hz）,3.45〜4.10（ｍ）,4.64（0.5H,d,J＝8.0Hz,α
−Ｈ）,5.20（0.5H,d,J＝3.5Hz,β−Ｈ）,5.26（1H,d,J
＝3.1Hz）,5.35（5H,d,J＝3.9Hz）高速液体クロマトグラフィー〔東ソー（株）製TSK gel
Amide−80カラム（4.6mmID×250mm）、RI検出、溶離
液：アセトニトリル／水＝3/2（v/v），流速:1.0ml/mi
n〕:^tR＝12.1min 元素分析値:C₄₂H₇₂O₃₅としてＣＨ理論値（％） 44.37 6.38 実測値（％） 44.40 6.35 実施例６ 6⁵−デオキシ−Ｄ−マルトペンタオースを用いて、α
−アミラーゼ活性の測定を行った。

（１）希釈液の調製 CaCl・2H₂O及びNaClを、それぞれ0.029％（w/v）及び
0.117％（w/v）の濃度になるように、10mMリン酸緩衝液
（pH7.0）で溶解して、希釈液とする。

（２）基質液の調製 6⁵−デオキシ−Ｄ−マルトペンタオースを7.74mM濃度
になるように前記希釈液で溶解して、基質液とする。

（３）共役酵素液の調製酵母由来のα−グルコシダーゼを69.44U/mlの濃度に
なるように前記希釈液で溶解して、共役酵素液とする。

（４）標品α−アミラーゼ液の調製市販のヒト由来の国際試薬社製標品α−アミラーゼ
（キャブリザイム・AMY）（P:S＝1:1）を０、10、25、5
0、100、200、400、600、800、1000U/の濃度となるよ
うに、前記希釈液で溶解して標品α−アミラーゼ液とす
る。

（５）試料液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのま
ま試料液とする。固体の場合は試料500mgを正確に秤量
し、前記希釈液を加えて全量を5mlとして試料液とす
る。

（６）検量線の作成前記基質液0.5mlと共役酵素液1.8mlとを混合したの
ち、これにただちに標品α−アミラーゼ液0.2mlを加え
てかきまぜ、40℃で30分間加温し、次いでグルコスタッ
ト法を用いて遊離グルコースを定量する。標品α−アミ
ラーゼ液活性と遊離グルコース量との関係より、検量線
を作成する。この検量線の式はＵ＝12.26・Ｇ−5.30 〔ただし、Ｕは酵素活性（U/）、Ｇは遊離グルコース
量μg/ml〕となる。この検量線を第９図に直線グラフで示す。

（７）試料液中のα−アミラーゼ活性の測定前記の基質液0.5mlと共役酵素液1.8mlとを混合したの
ち、これにただちに試料液を加えてかきまぜ、40℃で30
分間加温し、次いでグルコスタット法を用いて遊離した
グルコースを定量する。この定量値と前記（６）で作成
した検量線から試料液中のα−アミラーゼ活性を求める
ことができる。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線
の適用範囲（０〜1000U/）を超えた場合には、希釈液
を用いて相当する倍数の希釈を行ったのち、再測定を行
う。

実施例７（１）試薬の調製精製水に以下の成分を以下の濃度になるように溶解す
ることにより、試薬Ａ、Ｂ及びＣを調製した。

成分濃度試薬A:6⁵−デオキシ−Ｄ−マルトペンタオース10 m
M ウシ血清アルブミン 0.05 ％試薬B:α−グルコシダーゼ 40 U/ml グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ 2 U/ml ヘキソキナーゼ 2 U/ml ATP 1.3 mM NAD 2.0 mM リン酸緩衝液（pH＝7.0） 50 mM NaCl 50 mM MgSO₄ 50 mM ウシ血清アルブミン 0.05 ％試薬C:リン酸緩衝液（pH＝7.0） 10 mM ウシ血清アルブミン 0.05 ％（２）測定法測定用試料が液体の場合はそのまま試料液とする。固
体の場合は試料500mgを正確に秤量し、試薬Ｃを加えて
全量を5mlとして試料液とする。次いで試薬A0.2ml及び
試薬B2.0mlをよく混合して37℃で５分間加温したのち、
試料液200μを加えてかきまぜ、37℃で10分間加温後
からの３分間の340nmにおける吸光度の増加量を測定す
る。この吸光度の増加量とあらかじめ作成した検量線か
ら算出して試料液中のα−アミラーゼ活性の測定を行う
ことができる。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線
の適用範囲を超えた場合は試薬Ｃを用いて相当する倍数
の希釈を行ったのち、再測定を行う。

実施例８当該物質が測定系内で安定に存在することを実証する
ために、非還元末端非修飾マルトオリゴ糖を対照として
下記の方法に従って、共役酵素との反応を行った。

（１）当該基質液の調製実施例１及び実施例５において、それぞれ得た6⁵−デ
オキシ−Ｄ−マルトペンタオース（以下デオキシG5とい
う）及び6⁷−デオキシ−Ｄ−マルトヘプタオース（以下
デオキシG7という）が、それぞれ2mg/mlの濃度になるよ
うに、10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を加え、溶解して当
該基質液とする。

（２）対照基質液の調製市販のマルトペンタオース〔盛進製薬（株）製〕（以
下G5という）及びマルトヘプタオース（ナカライテスク
（株）社製）（以下G7という）が、それぞれ2mg/mlの濃
度になるように、10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を加え、
溶解して対照基質液とする。

（３）共役酵素液の調製市販の酵母由来のα−グルコシダーゼが1872U/ml濃度
になるように、10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を加え、溶
解して共役酵素液とする。

（４）共役酵素反応前記の基質液及び共役酵素液を40℃で３分間加温した
のち、該基質液と共役酵素液とを容量比1:1でよく混合
したのち、この混合液0.5mlを用いて０、60、120分後に
生成するグルコース量を、グルコスタット法（グルコー
スＢテストワコー法）により、あらかじめ作成しておい
て検量線を用いて定量した。

反応時間と遊離グルコース量との関係を第10図にグラ
フで示す。第10図において、○印実線はG5、○印破線は
デオキシG5、△印実線はG7、△印破線はデオキシG7の場
合である。

第10図から、当該物質は共役酵素と反応することな
く、測定系内で安定に存在することが分かる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図及び第４図は、それぞれ本発明
に係るシクロデキストリナーゼにおける至適pH、安定pH
範囲、作用温度及び温度に対する失活性を示すグラフ、
第５図、第６図及び第７図は、それぞれ該シクロデキス
トリナーゼのDEAEセファロースによるカラムクロマトグ
ラフィー、TSK gelエーテル5PWによるHPLC及びTSK gelG
3000SWによるHPLCの結果を示すグラフ、第８図は該シク
ロデキストリナーゼのSDS PAGEの結果を示す説明図、第
９図は、実施例６におけるα−アミラーゼ活性と生成す
る遊離グルコース量との関係を示すグラフ、第10図は実
施例８における反応時間と遊離グルコース量との関係を
示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者水澤清千葉県野田市野田339番地キッコーマン株式会社内 (72)発明者山次信幸千葉県野田市野田339番地キッコーマン株式会社内

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（式中のｎは２〜６の整数である）で表わされる６−デオキシマルトオリゴ糖。
【請求項２】６−デオキシシクロデキストリンに、以下
の理化学的性質により特定されるシクロデキストリナー
ゼを作用させると同時に、又は作用させたのちに、エキ
ソ型糖化酵素類を作用させることを特徴とする請求項１
記載の６−デオキシマルトオリゴ糖の製造方法。（イ）シクロデキストリンを開裂し、シクロデキスト
リンのグルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生
成させる作用を有する、（ロ）シクロデキストリンに対する水解速度又は親和
性が、多糖類あるいはシクロデキストリンと同じグルコ
ース重合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基質特異性を有
する、（ハ） β−シクロデキストリンを基質とした場合、pH
8.0近傍に至適pHを有し、かつ安定pH範囲が5.5〜9.5で
ある、（ニ） 40℃近傍に作用適温を有する、（ホ） 50℃以上の温度で15分間の処理により、ほぼ失
活する性質を有する、（ヘ） Hg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺及びFe²⁺などにより90
％以上阻害され、Ca²⁺及びMg²⁺により10〜30％活性化さ
れる性質を有する、及び（ト）ゲルろ過法による分子量が144,000で、SDS PAG
E法による分子量が72,000である。
【請求項３】請求項１記載の６−デオキシマルトオリゴ
糖を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試薬。
【請求項４】α−アミラーゼ活性含有試薬に、請求項１
記載の６−デオキシマルトオリゴ糖と、α−グルコシダ
ーゼ又はグルコアミラーゼ若しくはその両方を添加し、
酵素反応によって生成するグルコース又はマルトース若
しくはその両方を定量することを特徴とするα−アミラ
ーゼ活性の測定方法。