JP2542699B2 - デオキシマルトオリゴ糖、その製造方法、このものを有効成分とするα―アミラ―ゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα―アミラ―ゼ活性の測定方法 - Google Patents
デオキシマルトオリゴ糖、その製造方法、このものを有効成分とするα―アミラ―ゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα―アミラ―ゼ活性の測定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規な6−デオキシマルトオリゴ糖、その
製造方法、このものを有効成分とするα−アミラーゼ活
性測定用試薬及び該6−デオキシマルトオリゴ糖を用い
て、α−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定す
る方法に関するものである。
製造方法、このものを有効成分とするα−アミラーゼ活
性測定用試薬及び該6−デオキシマルトオリゴ糖を用い
て、α−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定す
る方法に関するものである。
従来の技術 従来、血清、尿、膵液、唾液などの体液を対象とする
α−アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上極めて重要で
あり、特に急性や慢性の肝炎、膵臓がん、流行性耳下腺
炎などの鑑別診断においては必須の測定項目となってい
る。
α−アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上極めて重要で
あり、特に急性や慢性の肝炎、膵臓がん、流行性耳下腺
炎などの鑑別診断においては必須の測定項目となってい
る。
このα−アミラーゼ活性の測定方法については、従来
より種々の方法、例えば(1)デンプン又は色素結合デ
ンプンを基質とし、還元力あるいは吸光度を測定する方
法、(2)マルトテトラオース、マルトペンタオースな
どの一連のマルトオリゴ糖を基質として利用し、α−ア
ミラーゼにより切断したのち、共役酵素系を作用させ、
生成するマルトース、グルコース又はグルコース−6−
リン酸を定量する方法、(3)各種置換フェニルマルト
オリゴシド類を基質として利用し、α−アミラーゼによ
り切断したのち、共役酵素系を作用させ、生成する置換
フェノール類をそのまま、あるいは必要に応じpHを調整
したのちに、あるいは縮合反応させたのちに、比色定量
する方法、(4)非還元末端グルコースの6位又は4位
若しくはその両方のヒドロキシル基の水素原子を、アリ
ール基やアルキル基などで修飾した各種置換アリール又
はアルキルマルトオリゴシド類を基質として利用し、前
記(3)と同様に比色定量する方法などが知られてい
る。
より種々の方法、例えば(1)デンプン又は色素結合デ
ンプンを基質とし、還元力あるいは吸光度を測定する方
法、(2)マルトテトラオース、マルトペンタオースな
どの一連のマルトオリゴ糖を基質として利用し、α−ア
ミラーゼにより切断したのち、共役酵素系を作用させ、
生成するマルトース、グルコース又はグルコース−6−
リン酸を定量する方法、(3)各種置換フェニルマルト
オリゴシド類を基質として利用し、α−アミラーゼによ
り切断したのち、共役酵素系を作用させ、生成する置換
フェノール類をそのまま、あるいは必要に応じpHを調整
したのちに、あるいは縮合反応させたのちに、比色定量
する方法、(4)非還元末端グルコースの6位又は4位
若しくはその両方のヒドロキシル基の水素原子を、アリ
ール基やアルキル基などで修飾した各種置換アリール又
はアルキルマルトオリゴシド類を基質として利用し、前
記(3)と同様に比色定量する方法などが知られてい
る。
しかしながら、(1)の方法においては、基質に用い
られるデンプンの品質により、測定値にバラツキを生じ
るおそれがある上、酵素切断部位が多数存在するため、
α−アミラーゼ反応を正確に化学量論的反応として測定
できないなどの欠点がある。
られるデンプンの品質により、測定値にバラツキを生じ
るおそれがある上、酵素切断部位が多数存在するため、
α−アミラーゼ反応を正確に化学量論的反応として測定
できないなどの欠点がある。
これに対し、(2)及び(3)の方法は、均一な基質
を使用するために、前記(1)の欠点を克服することが
でき、好ましい方法として広く用いられているが、基質
が共役酵素により分解されるため、正の誤差を生じやす
く、またこの誤差をなくそうとして共役酵素量を減ずる
と測定に長時間を要するという欠点を有している。
を使用するために、前記(1)の欠点を克服することが
でき、好ましい方法として広く用いられているが、基質
が共役酵素により分解されるため、正の誤差を生じやす
く、またこの誤差をなくそうとして共役酵素量を減ずる
と測定に長時間を要するという欠点を有している。
そこで、このような(3)の方法における欠点を改良
するために、共役酵素で分解されない(4)の方法が開
発されている。しかしながら、この(4)の方法におい
ては、使用する基質の水に対する溶解度、α−アミラー
ゼに対する親和性及びα−アミラーゼによる分解速度が
低い上、化学的に不安定で長期間保存しにくいなどの欠
点がある。
するために、共役酵素で分解されない(4)の方法が開
発されている。しかしながら、この(4)の方法におい
ては、使用する基質の水に対する溶解度、α−アミラー
ゼに対する親和性及びα−アミラーゼによる分解速度が
低い上、化学的に不安定で長期間保存しにくいなどの欠
点がある。
発明が解決しようとする課題 本発明は、このような従来のα−アミラーゼ活性の測
定試薬及びそれを用いる測定方法が有する欠点を克服
し、α−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定し
うる試薬として好適な新規化合物及びその製造方法を提
供するとともに、これを試薬とした新規なα−アミラー
ゼ活性の測定方法を提供することを目的としてなされた
ものである。
定試薬及びそれを用いる測定方法が有する欠点を克服
し、α−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定し
うる試薬として好適な新規化合物及びその製造方法を提
供するとともに、これを試薬とした新規なα−アミラー
ゼ活性の測定方法を提供することを目的としてなされた
ものである。
課題を解決するための手段 本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を
重ねた結果、6−デオキシシクロデキストリンに特定の
理化学的性質を有するシクロデキストリナーゼと公知の
エキソ型糖化酵素類とを作用させて得られる、非還元末
端グルコースの6位水酸基が水素原子で置換された新規
な6−デオキシマルトオリゴ糖が、α−アミラーゼ活性
測定の際に用いる共役酵素のα−グルコシダーゼやグル
コアミラーゼの作用を受けず、α−アミラーゼ活性測定
用試薬として適しており、これを用いてα−アミラーゼ
活性を測定すれば、前記した欠点を克服しうることを見
出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
重ねた結果、6−デオキシシクロデキストリンに特定の
理化学的性質を有するシクロデキストリナーゼと公知の
エキソ型糖化酵素類とを作用させて得られる、非還元末
端グルコースの6位水酸基が水素原子で置換された新規
な6−デオキシマルトオリゴ糖が、α−アミラーゼ活性
測定の際に用いる共役酵素のα−グルコシダーゼやグル
コアミラーゼの作用を受けず、α−アミラーゼ活性測定
用試薬として適しており、これを用いてα−アミラーゼ
活性を測定すれば、前記した欠点を克服しうることを見
出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、一般式 (式中のnは2〜6の整数である) で表わされる6−デオキシマルトオリゴ糖、及びこのも
のを有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試薬を提
供するものである。
のを有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試薬を提
供するものである。
本発明に従えば、前記一般式(I)で表わされる6−
デオキシマルトオリゴ糖は、6−デオキシシクロデキス
トリンに、以下の理化学的性質(イ)〜(ト)によって
特定されるシクロデキストリナーゼを作用させると同時
に、又は作用させたのちに、エキソ型糖化酵素を作用さ
せることにより製造することができる。
デオキシマルトオリゴ糖は、6−デオキシシクロデキス
トリンに、以下の理化学的性質(イ)〜(ト)によって
特定されるシクロデキストリナーゼを作用させると同時
に、又は作用させたのちに、エキソ型糖化酵素を作用さ
せることにより製造することができる。
(イ) シクロデキストリンを開裂し、シクロデキスト
リンのグルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生
成させる作用を有する、 (ロ) シクロデキストリンに対する水解速度又は親和
性が、多糖類あるいはシクロデキストリンと同じグルコ
ース重合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基質特異性を有
する、 (ハ) β−シクロデキストリンを基質とした場合、pH
8.0近傍に至適pHを有し、かつ安定pH範囲が5.5〜9.5で
ある、 (ニ) 40℃近傍に作用適温を有する、 (ホ) 50℃以上の温度で15分間の処理により、ほぼ失
活する性質を有する、 (ヘ) Hg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+及びFe2+などにより90
%以上阻害され、Ca2+及びMg2+により10〜30%活性化さ
れる性質を有する、及び (ト) ゲルろ過法による分子量が144,000で、SDS PAG
E法による分子量が72,000である。
リンのグルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生
成させる作用を有する、 (ロ) シクロデキストリンに対する水解速度又は親和
性が、多糖類あるいはシクロデキストリンと同じグルコ
ース重合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基質特異性を有
する、 (ハ) β−シクロデキストリンを基質とした場合、pH
8.0近傍に至適pHを有し、かつ安定pH範囲が5.5〜9.5で
ある、 (ニ) 40℃近傍に作用適温を有する、 (ホ) 50℃以上の温度で15分間の処理により、ほぼ失
活する性質を有する、 (ヘ) Hg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+及びFe2+などにより90
%以上阻害され、Ca2+及びMg2+により10〜30%活性化さ
れる性質を有する、及び (ト) ゲルろ過法による分子量が144,000で、SDS PAG
E法による分子量が72,000である。
さらに、本発明に従えば、α−アミラーゼ活性含有試
料に、前記一般式(I)で表わされる6−デオキシマル
トオリゴ糖と、α−グルコシダーゼ又はグルコアミラー
ゼ若しくはその両方を添加し、酵素反応によって生成す
るグルコース又はマルトース若しくはその両方を定量す
ることにより、α−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正
確に求めることができる。
料に、前記一般式(I)で表わされる6−デオキシマル
トオリゴ糖と、α−グルコシダーゼ又はグルコアミラー
ゼ若しくはその両方を添加し、酵素反応によって生成す
るグルコース又はマルトース若しくはその両方を定量す
ることにより、α−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正
確に求めることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
前記一般式(I)で表わされる6−デオキシマルトオ
リゴ糖は、新規な化合物であって、具体例としては、α
又はβの64−デオキシ−D−マルトテトラオース、65−
デオキシ−D−マルトペンタオース、66−デオキシ−D
−マルトヘキサオース、67−デオキシ−D−マルトヘプ
タオース、68−デオキシ−D−マルトオクタオースなど
を挙げることができる。これらの化合物は、いずれもα
−アミラーゼ活性測定用試薬として有用であるが、これ
らの中で、酵素反応速度の点から、特に65−デオキシ−
D−マルトペンタオース、66−デオキシ−D−マルトヘ
キサオース及び67−デオキシ−D−マルトヘプタオース
が好適である。なお、ここでデオキシの前に付された64
−,65−,66−,67−の記号は、それぞれマルトオリゴ糖
を構成するグルコースの還元末端側から4番目、5番
目、6番目、7番目のグルコースの6位の水酸基が水素
原子に置換されていることを意味する。
リゴ糖は、新規な化合物であって、具体例としては、α
又はβの64−デオキシ−D−マルトテトラオース、65−
デオキシ−D−マルトペンタオース、66−デオキシ−D
−マルトヘキサオース、67−デオキシ−D−マルトヘプ
タオース、68−デオキシ−D−マルトオクタオースなど
を挙げることができる。これらの化合物は、いずれもα
−アミラーゼ活性測定用試薬として有用であるが、これ
らの中で、酵素反応速度の点から、特に65−デオキシ−
D−マルトペンタオース、66−デオキシ−D−マルトヘ
キサオース及び67−デオキシ−D−マルトヘプタオース
が好適である。なお、ここでデオキシの前に付された64
−,65−,66−,67−の記号は、それぞれマルトオリゴ糖
を構成するグルコースの還元末端側から4番目、5番
目、6番目、7番目のグルコースの6位の水酸基が水素
原子に置換されていることを意味する。
これまで、前記一般式(I)nが1に相当する63−デ
オキシ−D−マルトトリオースはタカ−アミラーゼA1の
基質特異性の研究用変性マルトトリオースとして知られ
ているが〔「ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
(J.Biochem.)」第84巻、第835〜841ページ(1978
年)〕、酵素反応速度が小さいため、α−アミラーゼ活
性の測定用基質としては適当でない。
オキシ−D−マルトトリオースはタカ−アミラーゼA1の
基質特異性の研究用変性マルトトリオースとして知られ
ているが〔「ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
(J.Biochem.)」第84巻、第835〜841ページ(1978
年)〕、酵素反応速度が小さいため、α−アミラーゼ活
性の測定用基質としては適当でない。
次に、前記6−デオキシマルトオリゴ糖を製造する際
に用いられるシクロデキストリナーゼについて説明する
と、このものは本発明者らによって先に見出された酵素
であって、理化学的性質として、次に示す作用、基質特
異性、至適pH及び安定pH範囲、作用適温、失活性、阻害
及び活性化性、分子量を有している(特願平1−146891
号参照)。
に用いられるシクロデキストリナーゼについて説明する
と、このものは本発明者らによって先に見出された酵素
であって、理化学的性質として、次に示す作用、基質特
異性、至適pH及び安定pH範囲、作用適温、失活性、阻害
及び活性化性、分子量を有している(特願平1−146891
号参照)。
該シクロデキストリナーゼの理化学的性質 (イ) 作 用: シクロデキストリンを開裂し、そのシクロデキストリ
ンのグルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生成
させる作用を有する。
ンのグルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生成
させる作用を有する。
(ロ) 基質特異性: シクロデキストリンに対する水解速度又は親和性が、
多糖類あるいはシクロデキストリンと同じグルコース重
合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基失特異性を有する。
多糖類あるいはシクロデキストリンと同じグルコース重
合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基失特異性を有する。
第1表及び第2表に、それぞれ基質特異性の具体例及
びシクロデキストリン類とマルトオリゴ糖についての反
応速度のパラメーターを示す。
びシクロデキストリン類とマルトオリゴ糖についての反
応速度のパラメーターを示す。
(ハ) 至適pH及び安定pH範囲: β−シクロデキストリンを基質とした場合、pH8.0近
傍に至適pHを有し、かつ安定pH範囲が5.5〜9.5である。
傍に至適pHを有し、かつ安定pH範囲が5.5〜9.5である。
第1図は、100mM濃度の酢酸緩衝液、リン酸緩衝液及
びホウ酸緩衝液それぞれ0.48ml、2%(w/v)濃度のβ
−シクロデキストリン溶液0.50ml及び酵素液0.02mlを混
合し〔基質のβ−シクロデキストリン濃度1%(w/
v)〕、40℃で1時間反応を行った場合におけるpHと相
対活性との関係を示すグラフである。この図において、
破線は酢酸緩衝液、実線はリン酸緩衝液、点線はホウ酸
緩衝液を用いた場合である。この第1図から、pH8.0近
傍に至適pHを有することが分る。
びホウ酸緩衝液それぞれ0.48ml、2%(w/v)濃度のβ
−シクロデキストリン溶液0.50ml及び酵素液0.02mlを混
合し〔基質のβ−シクロデキストリン濃度1%(w/
v)〕、40℃で1時間反応を行った場合におけるpHと相
対活性との関係を示すグラフである。この図において、
破線は酢酸緩衝液、実線はリン酸緩衝液、点線はホウ酸
緩衝液を用いた場合である。この第1図から、pH8.0近
傍に至適pHを有することが分る。
第2図は、100mM濃度の酢酸緩衝液、リン酸緩衝液及
びホウ酸緩衝液それぞれ0.20ml及び酵素液0.05mlを混合
し、各pHにおいて、25℃で24時間処理を行い、この処理
液0.10ml、100mM濃度のリン酸緩衝液(pH7.5)0.40ml及
び2重量%濃度のβ−シクロデキストリン溶液0.50mlを
混合して、40℃で1時間反応を行った場合における処理
pHと相対活性との関係を示すグラフである。この図にお
いて、破線は酢酸緩衝液、実線はリン酸緩衝液、点線は
ホウ酸緩衝液を用いた場合である。この第2図から、安
定pH範囲は5.5〜9.5であることが分る。
びホウ酸緩衝液それぞれ0.20ml及び酵素液0.05mlを混合
し、各pHにおいて、25℃で24時間処理を行い、この処理
液0.10ml、100mM濃度のリン酸緩衝液(pH7.5)0.40ml及
び2重量%濃度のβ−シクロデキストリン溶液0.50mlを
混合して、40℃で1時間反応を行った場合における処理
pHと相対活性との関係を示すグラフである。この図にお
いて、破線は酢酸緩衝液、実線はリン酸緩衝液、点線は
ホウ酸緩衝液を用いた場合である。この第2図から、安
定pH範囲は5.5〜9.5であることが分る。
(ニ) 作用適温: 40℃近傍に作用適温を有する。
第3図は、2%(w/v)濃度のβ−シクロデキストリ
ン溶液0.50ml、100mM濃度のリン酸緩衝液(pH7.5)0.48
ml及び酵素液0.02mlを混合し、各温度で10分間反応させ
た場合における温度と相対活性との関係を示すグラフで
ある。この第3図から、40℃近傍に作用適温を有するこ
とが分る。
ン溶液0.50ml、100mM濃度のリン酸緩衝液(pH7.5)0.48
ml及び酵素液0.02mlを混合し、各温度で10分間反応させ
た場合における温度と相対活性との関係を示すグラフで
ある。この第3図から、40℃近傍に作用適温を有するこ
とが分る。
(ホ) 失活性: 50℃以上の温度で15分間の処理により、ほぼ失活する
性質を有する。
性質を有する。
第4図は酵素を含有する100mM濃度のリン酸緩衝液(p
H7.5)0.05mlを各温度で15分間処理したのち、この処理
液0.02ml、100mM濃度のリン酸緩衝液(pH7.5)0.48ml及
び2%(w/v)濃度のβ−シクロデキストリン溶液0.50m
lを混合し、40℃で1時間反応させた場合における処理
温度と相対活性との関係を示すグラフである。この第4
図から、100mM濃度のリン酸緩衝液(pH7.5)中、15分間
処理で、45℃まで活性は安定であるが、50℃以上ではほ
ぼ失活することが分る。
H7.5)0.05mlを各温度で15分間処理したのち、この処理
液0.02ml、100mM濃度のリン酸緩衝液(pH7.5)0.48ml及
び2%(w/v)濃度のβ−シクロデキストリン溶液0.50m
lを混合し、40℃で1時間反応させた場合における処理
温度と相対活性との関係を示すグラフである。この第4
図から、100mM濃度のリン酸緩衝液(pH7.5)中、15分間
処理で、45℃まで活性は安定であるが、50℃以上ではほ
ぼ失活することが分る。
(ヘ) 阻害及び活性化性: Hg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+及びFe2+により90%以上阻害
され、Ca2+及びMg2+により10〜30%活性化される性質を
有する。
され、Ca2+及びMg2+により10〜30%活性化される性質を
有する。
第3表に、金属イオンによる酵素活性への影響を示
す。
す。
この第3表から、二価の金属イオンであるHg2+、C
u2+、Zn2+、Ni2+及びFe2+により90%以上阻害され、Ca
2+及びMg2+により10〜30%活性化されることが分る。
u2+、Zn2+、Ni2+及びFe2+により90%以上阻害され、Ca
2+及びMg2+により10〜30%活性化されることが分る。
(ト) 分子量: ゲルろ過法による分子量が144,000で、SDS PAGE法に
よる分子量が72,000である。すなわち、該酵素は分子量
72,000のサブユニットから成る二量体である。
よる分子量が72,000である。すなわち、該酵素は分子量
72,000のサブユニットから成る二量体である。
なお、該酵素の力価は、2%(w/v)濃度のβ−シク
ロデキストリン溶液500μ及び適当量の該酵素を含有
する100mM濃度のリン酸緩衝液(pH7.5)500μを混和
し、温度40℃で適当時間反応させたのち、10分間煮沸す
ることにより反応を停止し、高速液体クロマトグラフィ
ー(以下、HPLCと略称する)法によって、生成したマル
トヘプタオースを定量することにより求めた。また、酵
素量が少量の場合には、グルコースを標準としたソモギ
ーネルソン法により還元力を定量することにより求め
た。
ロデキストリン溶液500μ及び適当量の該酵素を含有
する100mM濃度のリン酸緩衝液(pH7.5)500μを混和
し、温度40℃で適当時間反応させたのち、10分間煮沸す
ることにより反応を停止し、高速液体クロマトグラフィ
ー(以下、HPLCと略称する)法によって、生成したマル
トヘプタオースを定量することにより求めた。また、酵
素量が少量の場合には、グルコースを標準としたソモギ
ーネルソン法により還元力を定量することにより求め
た。
該酵素の酵素単位については、1分間に1マイクロモ
ルのマルトヘプタオースを生成する酵素量を1単位とし
た。
ルのマルトヘプタオースを生成する酵素量を1単位とし
た。
次に、本発明で用いる前記シクロデキストリナーゼの
製造方法について説明する。この酵素を産生する微生物
については、バチルス属に属し、該酵素を産生するもの
であればよく、特に制限されず、例えばバチルス・スフ
ェリカス(Bacillus sphaericus)E−244菌株を挙げる
ことができる。このバチルス・スフェリカスE−244菌
株は土壌中から取得した野生株であって、以下に示す菌
学的性質を有している。
製造方法について説明する。この酵素を産生する微生物
については、バチルス属に属し、該酵素を産生するもの
であればよく、特に制限されず、例えばバチルス・スフ
ェリカス(Bacillus sphaericus)E−244菌株を挙げる
ことができる。このバチルス・スフェリカスE−244菌
株は土壌中から取得した野生株であって、以下に示す菌
学的性質を有している。
バチルス・スフェリカスE−244菌株の菌学的性質 (a) 形 態 (1) 細胞の形及び大きさ:0.6〜0.8×1.6〜4.0μm
の桿菌である。
の桿菌である。
(2) 細胞の多形成の有無:認められない。
(3) 運動性の有無:周鞭毛を有し、運動性あり。
(4) 胞子の有無:あり 胞子嚢:膨出 大きさ:0.8〜0.9×1.1〜1.2μm 形:楕円形 位置:亜端立 (5) グラム染色性:陽性 (6) 抗酸性:陰性 (b) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養: 無色の拡散性集落を形成し、その集落は平滑で周縁は
なめらかであり、色素の産生は認められない。
なめらかであり、色素の産生は認められない。
(2) 肉汁寒天斜面培養: 菌苔は平滑で周縁はなめらかであり、色素の産生は認
められない。
められない。
(3) 肉汁液体培養: 培地全体に生育が認められるが、沈殿は認められな
い。
い。
(4) 肉汁ゼラチン穿刺培養: 培地上部にのみ生育し、液化は認められない。
(5) リトマス・ミルク: 凝固は認められず、酸、アルカリの産生も認められな
い。
い。
(c) 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元:還元しない (2) 脱窒反応:なし (3) MRテスト:陰性 (4) VPテスト:陰性 (5) インドールの生成:生成しない (6) 硫化水素の生成:生成しない (7) デンプンの加水分解:分解しない (8) クエン酸の利用:利用せず (9) 無機窒素源の利用:利用せず (10) 色素の生成:生成しない (11) ウレアーゼ:陰性 (12) オキシダーゼ:陽性 (13) カタラーゼ:陽性 (14) 生育の範囲 温度:13〜38℃ pH:6〜10.5 (15) 酸素に対する態度:好気性 (16) O−Fテスト:陰性(酸の産生を認めず) (17) 糖類に対する態度: L−アラビノース、D−キシロース、D−グルコー
ス、D−マンノース、D−フラクトース、D−ガラクト
ース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、D−ソル
ビット、D−マンニット、イノシット、グリセリン及び
デンプンからの酸生成及びガス生成はいずれも認められ
ない。
ス、D−マンノース、D−フラクトース、D−ガラクト
ース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、D−ソル
ビット、D−マンニット、イノシット、グリセリン及び
デンプンからの酸生成及びガス生成はいずれも認められ
ない。
(d) フェニルアラニンの脱アミノ反応:陽性 このバチルス・スフェリカスE−244菌株は、胞子を
形成するグラム陽性桿菌であることからバチルス属に属
する細菌であると同定した。さらに、糖からの酸及びガ
スの生成は認められないこと、VPブロスのpHが7.0以上
であること及びフェニルアラニンの脱アミノ反応が認め
られることからバージェイズ・マニュアル・オブ・シス
ティマティック・バクテリオロジー、第2巻(1984年)
に基づき、バチルス属のスフェリカス種に属する細菌で
あると同定した。
形成するグラム陽性桿菌であることからバチルス属に属
する細菌であると同定した。さらに、糖からの酸及びガ
スの生成は認められないこと、VPブロスのpHが7.0以上
であること及びフェニルアラニンの脱アミノ反応が認め
られることからバージェイズ・マニュアル・オブ・シス
ティマティック・バクテリオロジー、第2巻(1984年)
に基づき、バチルス属のスフェリカス種に属する細菌で
あると同定した。
なお、バチルス・スフェリカスE−244は、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第2458号(FERM B
P−2458)として寄託されている。
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第2458号(FERM B
P−2458)として寄託されている。
この菌株の培養は、原則的には一般微生物の好気的培
養で採用される方法と同じであるが、通常は、液体培地
による振とう培養法、又は通気かくはん培養法などが用
いられる。培地としては、適当な窒素源、炭素源、ビタ
ミン、ミネラルなど及び該酵素の誘導基質であるシクロ
デキストリンなどを含んだものが用いられる。pHは、前
記菌株が生育するpH域ならばいずれでもよいが、通常は
6〜8の範囲が好ましい。
養で採用される方法と同じであるが、通常は、液体培地
による振とう培養法、又は通気かくはん培養法などが用
いられる。培地としては、適当な窒素源、炭素源、ビタ
ミン、ミネラルなど及び該酵素の誘導基質であるシクロ
デキストリンなどを含んだものが用いられる。pHは、前
記菌株が生育するpH域ならばいずれでもよいが、通常は
6〜8の範囲が好ましい。
培養は、通常20〜40℃の範囲の温度において、16時間
ないし4日間程度振とう培養又は通気かくはん培養する
ことによって行われる。
ないし4日間程度振とう培養又は通気かくはん培養する
ことによって行われる。
このようにして得られた培養物から所望の酵素を得る
には、例えばまず遠心分離や膜濃縮などにより集菌した
のち、菌体を超音波処理又は界面活性剤処理などにより
破砕し、菌残渣を遠心分離などで除いて粗酵素液を得、
次いでこの粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過などのカラムクロマ
トグラフィーを適宜組み合わせて実施することにより、
該酵素の精製品を得る方法を用いることができる。
には、例えばまず遠心分離や膜濃縮などにより集菌した
のち、菌体を超音波処理又は界面活性剤処理などにより
破砕し、菌残渣を遠心分離などで除いて粗酵素液を得、
次いでこの粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過などのカラムクロマ
トグラフィーを適宜組み合わせて実施することにより、
該酵素の精製品を得る方法を用いることができる。
このようにして得られた本発明に係るシクロデキスト
リナーゼと従来公知のシクロデストリナーゼとの理化学
的性質の相違点を第4表に示す。
リナーゼと従来公知のシクロデストリナーゼとの理化学
的性質の相違点を第4表に示す。
第4表から分るように、本発明に係るシクロデキスト
リナーゼは、従来公知のシクロデキストリナーゼとはそ
の性質を異にし、特にシクロデキストリンに対して極め
てよく作用するという利点を有している。また、シクロ
デキストリンについては、シクロデキストリン骨格を有
しているものであればよく、特に制限されず、分枝体や
修飾体などの誘導体にも好適に作用する。
リナーゼは、従来公知のシクロデキストリナーゼとはそ
の性質を異にし、特にシクロデキストリンに対して極め
てよく作用するという利点を有している。また、シクロ
デキストリンについては、シクロデキストリン骨格を有
しているものであればよく、特に制限されず、分枝体や
修飾体などの誘導体にも好適に作用する。
前記一般式(I)で表わされる6−デオキシマルトオ
リゴ糖は、本発明に従えば次のようにして製造すること
ができる。
リゴ糖は、本発明に従えば次のようにして製造すること
ができる。
まず、例えば一般式 (式中のnは4〜6の整数である) で表わされる6−デオキシシクロデキストリンに、前記
のシクロデキストリナーゼを作用させることにより、一
般式 (式中のXは1個が水素原子で、残りのn+1個が水酸
基であり、nは4〜6である) で表わされる、種々の位置に6−デオキシグルコース残
基を有する6−デオキシマルトオリゴ糖の混合物を主成
分とする反応液を得る。
のシクロデキストリナーゼを作用させることにより、一
般式 (式中のXは1個が水素原子で、残りのn+1個が水酸
基であり、nは4〜6である) で表わされる、種々の位置に6−デオキシグルコース残
基を有する6−デオキシマルトオリゴ糖の混合物を主成
分とする反応液を得る。
出発物質として、好適な前記一般式(II)で表わされ
る6−デオキシシクロデキストリンは、例えば市販のα
−、β−、γ−シクロデキストリン(それぞれのグルコ
ース重合度は6、7、8である)などから、公知の方法
により製造することができる。この製造方法の好適な1
例について説明すると、まずシクロデキストリンをピリ
ジンなどの溶媒に溶解し、これに該シクロデキストリン
に対し、7〜14倍モル量のトシルクロライドを添加し、
通常15〜30℃の範囲の温度で4〜6時間程度反応させて
トシル化したのち、必要に応じ常法に従い精製して、6
−トシルシクロデキストリンを得る。次いでこれをジメ
チルスルホキシドやジメチルホルムアマイドなどの有機
溶媒に溶解し、これに水素化ホウ素ナトリウムなどの還
元剤を、該6−トシルシクロデキストリンに対し、通常
10〜30倍モル量を加え、好ましくは40〜60℃の範囲の温
度で10〜20時間程度反応させて還元したのち、必要に応
じ、常法に従い精製して6−デオキシシクロデキストリ
ンを得る。
る6−デオキシシクロデキストリンは、例えば市販のα
−、β−、γ−シクロデキストリン(それぞれのグルコ
ース重合度は6、7、8である)などから、公知の方法
により製造することができる。この製造方法の好適な1
例について説明すると、まずシクロデキストリンをピリ
ジンなどの溶媒に溶解し、これに該シクロデキストリン
に対し、7〜14倍モル量のトシルクロライドを添加し、
通常15〜30℃の範囲の温度で4〜6時間程度反応させて
トシル化したのち、必要に応じ常法に従い精製して、6
−トシルシクロデキストリンを得る。次いでこれをジメ
チルスルホキシドやジメチルホルムアマイドなどの有機
溶媒に溶解し、これに水素化ホウ素ナトリウムなどの還
元剤を、該6−トシルシクロデキストリンに対し、通常
10〜30倍モル量を加え、好ましくは40〜60℃の範囲の温
度で10〜20時間程度反応させて還元したのち、必要に応
じ、常法に従い精製して6−デオキシシクロデキストリ
ンを得る。
このようにして、出発物質として好適な、例えば6−
デオキシ−α−シクロデキストリン、6−デオキシ−β
−シクロデキストリン、6−デオキシ−γ−シクロデキ
ストリンを容易に製造することができるが、これらの中
で酵素反応速度の点から6−デオキシ−β−シクロデキ
ストリンが特に好適である。
デオキシ−α−シクロデキストリン、6−デオキシ−β
−シクロデキストリン、6−デオキシ−γ−シクロデキ
ストリンを容易に製造することができるが、これらの中
で酵素反応速度の点から6−デオキシ−β−シクロデキ
ストリンが特に好適である。
この酵素反応における6−デオキシシクロデキストリ
ンの基質濃度は、該シクロデキストリナーゼの基質に対
するKm値以上の濃度になるように調節することが好まし
い。また、酵素反応条件については、該シクロデキスト
リナーゼの作用pH及び作用温度の範囲であればよく、特
に制限はないが、通常pH7.5〜9.0、温度35〜45℃の条件
で反応が行われる。
ンの基質濃度は、該シクロデキストリナーゼの基質に対
するKm値以上の濃度になるように調節することが好まし
い。また、酵素反応条件については、該シクロデキスト
リナーゼの作用pH及び作用温度の範囲であればよく、特
に制限はないが、通常pH7.5〜9.0、温度35〜45℃の条件
で反応が行われる。
さらに、この酵素反応条件には、必要に応じ、エタノ
ール、アセトン、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒
を添加してもよい。反応時間は、反応生成物の安定性に
より異なるが、通常30分ないし48時間程度である。ま
た、酵素量については特に制限はないが、反応時間内に
生成物が最大となるように、適宜必要量を添加すればよ
く、通常0.5〜5単位/gの範囲で選ばれる。
ール、アセトン、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒
を添加してもよい。反応時間は、反応生成物の安定性に
より異なるが、通常30分ないし48時間程度である。ま
た、酵素量については特に制限はないが、反応時間内に
生成物が最大となるように、適宜必要量を添加すればよ
く、通常0.5〜5単位/gの範囲で選ばれる。
このようにして、前記一般式(III)で表わされる各
種6−デオキシマルトオリゴ糖の混合物を主成分とする
反応液が得られる。この反応液としては、例えば出発物
質が6−デオキシ−β−シクロデキストリンの場合に
は、67−デオキシマルトヘプタオース、66−デオキシマ
ルトヘプタオース、65−デオキシマルトヘプタオース、
64−デオキシマルトヘプタオース、63−デオキシマルト
ヘプタオース、62−デオキシマルトヘプタオース、61−
デオキシマルトヘプタオースの混合物を主成分とするも
のが得られ、6−デオキシ−α−シクロデキストリンの
場合には、同様に66−、65−、64−、63−、62−、6
1−、デオキシマルトヘキサオースの混合物を主成分と
するものが得られる。
種6−デオキシマルトオリゴ糖の混合物を主成分とする
反応液が得られる。この反応液としては、例えば出発物
質が6−デオキシ−β−シクロデキストリンの場合に
は、67−デオキシマルトヘプタオース、66−デオキシマ
ルトヘプタオース、65−デオキシマルトヘプタオース、
64−デオキシマルトヘプタオース、63−デオキシマルト
ヘプタオース、62−デオキシマルトヘプタオース、61−
デオキシマルトヘプタオースの混合物を主成分とするも
のが得られ、6−デオキシ−α−シクロデキストリンの
場合には、同様に66−、65−、64−、63−、62−、6
1−、デオキシマルトヘキサオースの混合物を主成分と
するものが得られる。
次に、このようにして得られた反応液に、エキソ型糖
化酵素類を作用させて、6−デオキシグルコースの残基
が非還元末端となるように非還元末端側のグルコース残
基を加水分解させる。この際用いられるエキソ型糖化酵
素類としては、例えば公知のα−グルコシダーゼやグル
コアミラーゼなどが挙げられるが、これらはそれぞれ単
独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよく、ま
た、所望に応じβ−アミラーゼを併用してもよい。
化酵素類を作用させて、6−デオキシグルコースの残基
が非還元末端となるように非還元末端側のグルコース残
基を加水分解させる。この際用いられるエキソ型糖化酵
素類としては、例えば公知のα−グルコシダーゼやグル
コアミラーゼなどが挙げられるが、これらはそれぞれ単
独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよく、ま
た、所望に応じβ−アミラーゼを併用してもよい。
この酵素反応によって、64−デオキシマルトテトラオ
ース、65−デオキシマルトペンタオース、66−デオキシ
マルトヘキサオース、67−デオキシマルトヘプタオー
ス、68−デオキシマルトオクタオースなどの前記一般式
(I)で表わされる各種6−デオキシマルトオリゴ糖、
63−デオキシマルトトリオース、62−デオキシマルトー
ス、61−デオキシグルコースなどとの混合物として得ら
れる。なお、β−アミラーゼを併用した場合は、前記化
合物の他に61−デオキシマルトースも生成する。
ース、65−デオキシマルトペンタオース、66−デオキシ
マルトヘキサオース、67−デオキシマルトヘプタオー
ス、68−デオキシマルトオクタオースなどの前記一般式
(I)で表わされる各種6−デオキシマルトオリゴ糖、
63−デオキシマルトトリオース、62−デオキシマルトー
ス、61−デオキシグルコースなどとの混合物として得ら
れる。なお、β−アミラーゼを併用した場合は、前記化
合物の他に61−デオキシマルトースも生成する。
該エキソ型糖化酵素類は、前記のシクロデキストリナ
ーゼと共存させて、酵素反応を同時的に行わせてもよい
し、出発原料ににシクロデキストリナーゼを作用させた
のち、さらに該エキソ型糖化酵素類を作用させて酵素反
応を行わせてもよいが、後者の方が好ましい。特に好適
な態様においては、例えば出発原料に該シクロデキスト
リナーゼを作用させて、生成物が最大となった時点で、
酸処理や熱処理などにより、いったん反応を停止させた
のち、例えば反応液をオクタデシル化シリカゲル(OD
S)カラムなどに通液して、未反応の原料を吸着除去す
るなどの精製処理を施し、次いでこれにエキソ型糖化酵
素類を作用させる。
ーゼと共存させて、酵素反応を同時的に行わせてもよい
し、出発原料ににシクロデキストリナーゼを作用させた
のち、さらに該エキソ型糖化酵素類を作用させて酵素反
応を行わせてもよいが、後者の方が好ましい。特に好適
な態様においては、例えば出発原料に該シクロデキスト
リナーゼを作用させて、生成物が最大となった時点で、
酸処理や熱処理などにより、いったん反応を停止させた
のち、例えば反応液をオクタデシル化シリカゲル(OD
S)カラムなどに通液して、未反応の原料を吸着除去す
るなどの精製処理を施し、次いでこれにエキソ型糖化酵
素類を作用させる。
該シクロデキストリナーゼとエキソ型糖化酵素類とを
共存作用させる場合の反応条件としては、もちろん両酵
素の共通な作用pH及び作用温度範囲で適宜選択すればよ
いが、通常pH7.0〜9.0、温度35〜45℃において、0.5〜4
8時間程度反応が行われる。
共存作用させる場合の反応条件としては、もちろん両酵
素の共通な作用pH及び作用温度範囲で適宜選択すればよ
いが、通常pH7.0〜9.0、温度35〜45℃において、0.5〜4
8時間程度反応が行われる。
また、シクロデキストリナーゼを作用させたのち、エ
キソ型糖化酵素類を作用させる場合の反応条件として
は、用いる酵素の作用pH及び作用温度範囲で適宜選べば
よいが、通常pH4.0〜7.5、温度35〜45℃において、0.5
〜48時間程度反応が行われる。
キソ型糖化酵素類を作用させる場合の反応条件として
は、用いる酵素の作用pH及び作用温度範囲で適宜選べば
よいが、通常pH4.0〜7.5、温度35〜45℃において、0.5
〜48時間程度反応が行われる。
さらに、エキソ型糖化酵素類の使用量については特に
制限はないが、通常6−デオキシシクロデキストリンに
対し、10〜100単位/gの範囲で選ばれる。また、この酵
素反応は酸処理や熱処理などにより停止させることがで
きる。
制限はないが、通常6−デオキシシクロデキストリンに
対し、10〜100単位/gの範囲で選ばれる。また、この酵
素反応は酸処理や熱処理などにより停止させることがで
きる。
次に、このようにして得られた6−デオキシマルトオ
リゴ糖含有反応液から、所望の前記一般式(I)で表わ
される6−デオキシマルトオリゴ糖を分離精製するので
あるが、この分離精製方法については特に制限はなく、
従来オリゴ糖の分離精製に慣用されている方法を用いる
ことができる。例えば、反応液から未反応の6−デオキ
シシクロデキストリンを除いたのち、活性炭カラムクロ
マトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー、薄層クロマトグラフィーなどを用いて分画採取する
方法などを採用することができる。また、未反応の6−
デオキシシクロデキストリンの除去方法としては、例え
ば冷却処理、有機溶媒添加処理、吸着カラム処理などの
公知の方法が挙げられる。
リゴ糖含有反応液から、所望の前記一般式(I)で表わ
される6−デオキシマルトオリゴ糖を分離精製するので
あるが、この分離精製方法については特に制限はなく、
従来オリゴ糖の分離精製に慣用されている方法を用いる
ことができる。例えば、反応液から未反応の6−デオキ
シシクロデキストリンを除いたのち、活性炭カラムクロ
マトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー、薄層クロマトグラフィーなどを用いて分画採取する
方法などを採用することができる。また、未反応の6−
デオキシシクロデキストリンの除去方法としては、例え
ば冷却処理、有機溶媒添加処理、吸着カラム処理などの
公知の方法が挙げられる。
このようにして得られた前記一般式(I)で表わされ
る6−デオキシマルトオリゴ糖は、α−アミラーゼ活性
の測定に極めて有用であり、この6−デオキシマルトオ
リゴ糖を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試薬
及びこの試薬を用いてα−アミラーゼ活性を測定する方
法を提供することも本発明の目的の1つである。
る6−デオキシマルトオリゴ糖は、α−アミラーゼ活性
の測定に極めて有用であり、この6−デオキシマルトオ
リゴ糖を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試薬
及びこの試薬を用いてα−アミラーゼ活性を測定する方
法を提供することも本発明の目的の1つである。
α−アミラーゼ活性を測定するための有利な系として
は、例えば前記一般式(I)で表わされる6−デオキシ
マルトオリゴ糖1〜20mM及び緩衝剤2〜100mMを含有
し、かつ共役酵素として、α−グルコシダーゼ又はグル
コアミラーゼ若しくはその両方を、それぞれ15〜150単
位/ml含有するpH4〜10の系が挙げられる。この系に用い
られる緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸
塩、トリス−(ヒドロキシメチル)−アミノメタン、ホ
ウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタル酸塩などが挙げ
られる。
は、例えば前記一般式(I)で表わされる6−デオキシ
マルトオリゴ糖1〜20mM及び緩衝剤2〜100mMを含有
し、かつ共役酵素として、α−グルコシダーゼ又はグル
コアミラーゼ若しくはその両方を、それぞれ15〜150単
位/ml含有するpH4〜10の系が挙げられる。この系に用い
られる緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸
塩、トリス−(ヒドロキシメチル)−アミノメタン、ホ
ウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタル酸塩などが挙げ
られる。
該α−グルコシダーゼについては特に制限はなく、動
物、植物、微生物起源のいずれのものも用いることがで
きるが、特に酵母起源のものが、基質特異性の点から好
ましい。また、グルコアミラーゼについても特に制限は
なく、いずれの起源のものも用いることができるが、リ
ゾプス属sp.(Rhizopus sp.)に由来するものが好まし
い。
物、植物、微生物起源のいずれのものも用いることがで
きるが、特に酵母起源のものが、基質特異性の点から好
ましい。また、グルコアミラーゼについても特に制限は
なく、いずれの起源のものも用いることができるが、リ
ゾプス属sp.(Rhizopus sp.)に由来するものが好まし
い。
該測定系には、必要に応じ溶解補助剤、安定化剤とし
てのグリセリン、牛血清アルブミン、α−又はβ−シク
ロデキストリン、トリトンX100などを添加することもで
きるし、またα−アミラーゼ活性剤として、Cl-、C
a2+、Mg2+などのイオンをNaCl、MgCl2、MgSO4、CaCl2、
CaCl2・2H2Oなどの形で加えることもできる。
てのグリセリン、牛血清アルブミン、α−又はβ−シク
ロデキストリン、トリトンX100などを添加することもで
きるし、またα−アミラーゼ活性剤として、Cl-、C
a2+、Mg2+などのイオンをNaCl、MgCl2、MgSO4、CaCl2、
CaCl2・2H2Oなどの形で加えることもできる。
さらに、酵素反応によって生成するグルコースやマル
トースを吸光度測定法によって定量する場合には、通常
用いられるグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ
(例えばLeuconostoc mesenteroidesなどに由来するも
の)、マルトースホスホリラーゼ(例えばLactobacillu
s brevisなどに由来するもの)、ヘキソキナーゼ(例え
ば酵母などに由来するもの)、β−ホスホグルコムター
ゼ〔例えば兎筋肉(rabbitmuscle)などに由来するも
の〕、NADとATPなどを加えればよい。
トースを吸光度測定法によって定量する場合には、通常
用いられるグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ
(例えばLeuconostoc mesenteroidesなどに由来するも
の)、マルトースホスホリラーゼ(例えばLactobacillu
s brevisなどに由来するもの)、ヘキソキナーゼ(例え
ば酵母などに由来するもの)、β−ホスホグルコムター
ゼ〔例えば兎筋肉(rabbitmuscle)などに由来するも
の〕、NADとATPなどを加えればよい。
本発明の試薬は、乾燥物又は溶解した形で用いてもよ
いし、薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の紙などに
含浸させて用いてもよい。このような本発明の試薬を用
いることにより、各種の試料に含有されるα−アミラー
ゼ活性を、簡単な操作で正確に、かつ高感度で測定する
ことができる。
いし、薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の紙などに
含浸させて用いてもよい。このような本発明の試薬を用
いることにより、各種の試料に含有されるα−アミラー
ゼ活性を、簡単な操作で正確に、かつ高感度で測定する
ことができる。
次に、本発明のα−アミラーゼ活性の測定方法の好適
な1例について説明すると、まず、α−アミラーゼを含
む試料に、共役酵素としてのα−グルコシダーゼ又はグ
ルコアミラーゼ若しくはその両方を、それぞれ15〜150
単位/ml、好ましくは30〜70単位/mlになるように加え、
同時に又は順次に前記一般式(I)で表わされる6−デ
オキシマルトオリゴ糖1〜20mM、好ましくは3〜8mM及
び緩衝剤を添加したのち、温度25〜50℃、pH4〜10の条
件にて1分間以上、好ましくは2〜60分間酵素反応させ
る。次いで生成するグルコースやマルトースを、常法に
よりそのまま、例えばソモジ・ネルソン法、グルコスタ
ット法などを用いて定量するか、又は前記したように吸
光度測定法によって定量し、あらかじめ同方法で定量し
て作成したα−アミラーゼ標品の検量線を用いて、試料
中のα−アミラーゼ活性を算出する。
な1例について説明すると、まず、α−アミラーゼを含
む試料に、共役酵素としてのα−グルコシダーゼ又はグ
ルコアミラーゼ若しくはその両方を、それぞれ15〜150
単位/ml、好ましくは30〜70単位/mlになるように加え、
同時に又は順次に前記一般式(I)で表わされる6−デ
オキシマルトオリゴ糖1〜20mM、好ましくは3〜8mM及
び緩衝剤を添加したのち、温度25〜50℃、pH4〜10の条
件にて1分間以上、好ましくは2〜60分間酵素反応させ
る。次いで生成するグルコースやマルトースを、常法に
よりそのまま、例えばソモジ・ネルソン法、グルコスタ
ット法などを用いて定量するか、又は前記したように吸
光度測定法によって定量し、あらかじめ同方法で定量し
て作成したα−アミラーゼ標品の検量線を用いて、試料
中のα−アミラーゼ活性を算出する。
本発明に用いられるα−アミラーゼ活性含有試料につ
いては、α−アミラーゼ活性を含有するものであればよ
く、特に制限はないが、具体的には微生物の培養液、植
物の抽出液、あるいは動物の体液や組織及びそれらの抽
出液などを用いることができる。
いては、α−アミラーゼ活性を含有するものであればよ
く、特に制限はないが、具体的には微生物の培養液、植
物の抽出液、あるいは動物の体液や組織及びそれらの抽
出液などを用いることができる。
また、α−アミラーゼ活性含有試料が固体の場合に
は、該試料をいったん緩衝剤に溶解又は懸濁させてか
ら、測定に供するのが有利である。この緩衝剤として
は、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス−(ヒド
ロキシメチル)−アミノメタン、ホウ酸塩、クエン酸
塩、ジメチルグルタル酸塩などが挙げられる。
は、該試料をいったん緩衝剤に溶解又は懸濁させてか
ら、測定に供するのが有利である。この緩衝剤として
は、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス−(ヒド
ロキシメチル)−アミノメタン、ホウ酸塩、クエン酸
塩、ジメチルグルタル酸塩などが挙げられる。
発明の効果 本発明は新規なα−アミラーゼ活性測定用試薬を用い
ることにより、共役酵素の影響を受けることなく、α−
アミラーゼ活性を自動分析法、用手法などにより、精度
よく、短時間で容易に測定することができる上、共役酵
素を共存させても長期間にわたって安定状態を維持しう
るという利点がある。
ることにより、共役酵素の影響を受けることなく、α−
アミラーゼ活性を自動分析法、用手法などにより、精度
よく、短時間で容易に測定することができる上、共役酵
素を共存させても長期間にわたって安定状態を維持しう
るという利点がある。
さらに、本発明の製造方法によれば、前記一般式
(I)で表わされる6−デオキシマルトオリゴ糖を効率
よく製造することができる。
(I)で表わされる6−デオキシマルトオリゴ糖を効率
よく製造することができる。
実施例 次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明はこれらの例によってなんら限定されるもの
ではない。
が、本発明はこれらの例によってなんら限定されるもの
ではない。
実施例1 65−デオキシマルトペンタオースの製造 (1) シクロデキストリナーゼの調製 1%(w/v)β−シクロデキストリン、1%(w/v)ペ
プトン、0.5%(w/v)NaCl及び0.1%(w/v)イーストエ
キスから成る液体培地(水道水使用、pH7.0)100mlを50
0ml容坂口フラスコに入れ、120℃で20分間、殺菌処理を
行った。これに、バチルス・スフェリカスE−244菌株
(FERM BP−2458)の保存スラントより1白金耳接種
し、30℃で1日間振とう培養した。この培養液50mlを前
記と同様の培地組織と殺菌条件により調製した2000mlの
培地を含有する3000ml容ミニジャーに接種して30℃、1v
vm、350rpmの条件で2日間通気かくはん培養を行い、培
養終了後、この培養液から8000rpm、20分間の遠心分離
処理により菌体を分離し、2%(w/v)トリトンX−100
を含有する10mMリン酸緩衝液(pH7.0)500mlに菌体を懸
濁して25℃で1日間かきまぜた。該懸濁液から12000rpm
で20分間の遠心分離処理により菌体残渣を除去したの
ち、上清液を10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に対して16時
間透析した。得られた透析物を12000rpmで20分間遠心分
離処理して不溶物を除去し、上清を粗酵素液(1)とし
た。
プトン、0.5%(w/v)NaCl及び0.1%(w/v)イーストエ
キスから成る液体培地(水道水使用、pH7.0)100mlを50
0ml容坂口フラスコに入れ、120℃で20分間、殺菌処理を
行った。これに、バチルス・スフェリカスE−244菌株
(FERM BP−2458)の保存スラントより1白金耳接種
し、30℃で1日間振とう培養した。この培養液50mlを前
記と同様の培地組織と殺菌条件により調製した2000mlの
培地を含有する3000ml容ミニジャーに接種して30℃、1v
vm、350rpmの条件で2日間通気かくはん培養を行い、培
養終了後、この培養液から8000rpm、20分間の遠心分離
処理により菌体を分離し、2%(w/v)トリトンX−100
を含有する10mMリン酸緩衝液(pH7.0)500mlに菌体を懸
濁して25℃で1日間かきまぜた。該懸濁液から12000rpm
で20分間の遠心分離処理により菌体残渣を除去したの
ち、上清液を10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に対して16時
間透析した。得られた透析物を12000rpmで20分間遠心分
離処理して不溶物を除去し、上清を粗酵素液(1)とし
た。
次いで、この粗酵素液(1)約500ml(総活性200単
位、タンパク量2083mg、比活性0.1、pH7.0)を10mMリン
酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したDEAEセファロース充填
カラム(φ34×170mm)に供し、酵素を吸着させたの
ち、0〜0.5M NaClのグラジエント勾配により溶出を行
った。このDEAEセファロースカラムクロマトグラフィー
の溶出パターンを第5図に示す。第5図において、◎印
は活性(U/ml)、○印はタンパク量(mg/ml)である。
また、この際の溶出条件は次のとおりである 溶出条件 溶離液:10mMリン酸緩衝液(pH7.0) 溶 出:0M−0.5M NaCl 分取量:12ml/フラクション 流 速:6ml/min 温 度:室温 このようにして得られた活性フラクションを集めて粗
酵素液(2)105ml(総活性145単位、比活性0.58、収率
72.5%)を得た。
位、タンパク量2083mg、比活性0.1、pH7.0)を10mMリン
酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したDEAEセファロース充填
カラム(φ34×170mm)に供し、酵素を吸着させたの
ち、0〜0.5M NaClのグラジエント勾配により溶出を行
った。このDEAEセファロースカラムクロマトグラフィー
の溶出パターンを第5図に示す。第5図において、◎印
は活性(U/ml)、○印はタンパク量(mg/ml)である。
また、この際の溶出条件は次のとおりである 溶出条件 溶離液:10mMリン酸緩衝液(pH7.0) 溶 出:0M−0.5M NaCl 分取量:12ml/フラクション 流 速:6ml/min 温 度:室温 このようにして得られた活性フラクションを集めて粗
酵素液(2)105ml(総活性145単位、比活性0.58、収率
72.5%)を得た。
次いでこの粗酵素液(2)20ml(総活性31単位、タン
パク量29mg)を1M硫酸ナトリウム含有100mMリン酸緩衝
液(pH7.0)で平衡化したエーテル5PW充填カラム(φ2
1.5×150mm)に供し、酵素を吸着させたのち、1M−0M硫
酸ナトリウムのグラジエント勾配により溶出を行った。
この溶出パターンを第6図に示す。第6図において、◎
印は活性(U/ml)、○印はタンパク量(mg/ml)であ
る。また、この際の溶出条件は次のとおりである。
パク量29mg)を1M硫酸ナトリウム含有100mMリン酸緩衝
液(pH7.0)で平衡化したエーテル5PW充填カラム(φ2
1.5×150mm)に供し、酵素を吸着させたのち、1M−0M硫
酸ナトリウムのグラジエント勾配により溶出を行った。
この溶出パターンを第6図に示す。第6図において、◎
印は活性(U/ml)、○印はタンパク量(mg/ml)であ
る。また、この際の溶出条件は次のとおりである。
溶出条件 溶離液:100mMリン酸緩衝液(pH7.0) 溶 出:1M−0M Na2SO4(1hr) 分取量:5ml/フラクション 流 速:5ml/min 圧 力:35〜50kg/cm2 温 度:室温 このようにして得られた活性フラクションを集めて粗
酵素液(3)50ml(総活性72単位、比活性2.93、収率36
%)を得た。
酵素液(3)50ml(総活性72単位、比活性2.93、収率36
%)を得た。
次いでこの粗酵素液(3)をコロジオンバッグにより
1.5mlにまで限外濃縮したのち、0.2ml(総活性8単位、
タンパク量1.2mg)をTSK gel G3000SW(カラムφ7.5×6
00mm×2)を用いたゲルろ過に供し、0.2M NaCl含有100
mMリン酸緩衝液(pH7.0)により溶出した。この溶出パ
ターンを第7図に示す。第7図において、◎印は活性
(U/ml)、○印はタンパク量(mg/ml)である。また、
この際の溶出条件は次のとおりである。
1.5mlにまで限外濃縮したのち、0.2ml(総活性8単位、
タンパク量1.2mg)をTSK gel G3000SW(カラムφ7.5×6
00mm×2)を用いたゲルろ過に供し、0.2M NaCl含有100
mMリン酸緩衝液(pH7.0)により溶出した。この溶出パ
ターンを第7図に示す。第7図において、◎印は活性
(U/ml)、○印はタンパク量(mg/ml)である。また、
この際の溶出条件は次のとおりである。
溶離液:100mMリン酸緩衝液(pH7.0)+0.2M NaCl 分取量:1ml/フラクション 流 速:0.7ml/min 圧 力:約70kg/cm2 温 度:室温 このようにして得られた活性フラクションを集めて精
製酵素液1.4ml(総活性2.2単位、タンパク量0.24mg、比
活性9.17、収率1%)を得た。第8図に、この酵素のSD
S PAGEの結果を示す。この図から分るように、該酵素は
SDS PAGE的に単一であった。
製酵素液1.4ml(総活性2.2単位、タンパク量0.24mg、比
活性9.17、収率1%)を得た。第8図に、この酵素のSD
S PAGEの結果を示す。この図から分るように、該酵素は
SDS PAGE的に単一であった。
(2) 出発物質の6−デオキシ−β−シクロデキスト
リンの製造 市販のβ−シクロデキストリン〔和光純薬工業(株)
製〕5.00g(4.41mmol)をピリジン50mlに溶解したの
ち、これにトシルクロリド10.0g(52.4mmol)を加え、
室温で5時間かきまぜながら反応させた。次いで、この
反応液のピリジンを減圧下に留去させたのち、残渣に水
100ml及びベンゼン150mlをかきまぜながら添加し、固形
物を析出させた。
リンの製造 市販のβ−シクロデキストリン〔和光純薬工業(株)
製〕5.00g(4.41mmol)をピリジン50mlに溶解したの
ち、これにトシルクロリド10.0g(52.4mmol)を加え、
室温で5時間かきまぜながら反応させた。次いで、この
反応液のピリジンを減圧下に留去させたのち、残渣に水
100ml及びベンゼン150mlをかきまぜながら添加し、固形
物を析出させた。
次に、この固形物をグラスフィルターでろ別し、アセ
トン50mlで2回洗浄したのち、ろ取物をODSカラムクロ
マトグラフィーにより精製し、エタノール−水混合液
(容量比1:9)で溶出した目的画分を濃縮して、水から
再結晶することにより、6−トシル−β−シクロデキス
トリン1.63g(1.26mmol、収率28.6%)が得られた。
トン50mlで2回洗浄したのち、ろ取物をODSカラムクロ
マトグラフィーにより精製し、エタノール−水混合液
(容量比1:9)で溶出した目的画分を濃縮して、水から
再結晶することにより、6−トシル−β−シクロデキス
トリン1.63g(1.26mmol、収率28.6%)が得られた。
このものの融点、赤外吸収スペクトル及び核磁気共鳴
スペクトルを次に示す。
スペクトルを次に示す。
融点(℃):172.0〜174.0(分解) 赤外吸収スペクトル(cm-1):3400,2930,1642,1632,160
0,1424,1360,1300,1178,1156,1078,1028 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm:(DMSO−d6)2.44
(3H,s),3.15〜4.45(m),4.76(2H,br,s),4.85(5
H,br,s),7.44(2H,d,J=8.8Hz),7.75(2H,d,J=8.8H
z) 次に、このようにして得られた前記6−トシル−β−
シクロデキストリン1.27g(0.985mmol)をジメチルスル
ホキシド(DMSO)20mlに溶解したのち、これに水素化ホ
ウ素ナトリウム(NaBH4)384mg(10.2mmol)を加え、50
℃で12時間反応させた。次いで、この反応液に水1000ml
を加え、ODSカラムクロマトグラフィーに供してDMSOを
除去したのち精製し、エタノール−水混合液(容量比1:
9)で溶出した目的画分を濃縮して、メタノールから再
結晶することにより、6−デオキシ−β−シクロデキス
トリン839.6mg(0.750mmol、収率76.1%)が得られた。
0,1424,1360,1300,1178,1156,1078,1028 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm:(DMSO−d6)2.44
(3H,s),3.15〜4.45(m),4.76(2H,br,s),4.85(5
H,br,s),7.44(2H,d,J=8.8Hz),7.75(2H,d,J=8.8H
z) 次に、このようにして得られた前記6−トシル−β−
シクロデキストリン1.27g(0.985mmol)をジメチルスル
ホキシド(DMSO)20mlに溶解したのち、これに水素化ホ
ウ素ナトリウム(NaBH4)384mg(10.2mmol)を加え、50
℃で12時間反応させた。次いで、この反応液に水1000ml
を加え、ODSカラムクロマトグラフィーに供してDMSOを
除去したのち精製し、エタノール−水混合液(容量比1:
9)で溶出した目的画分を濃縮して、メタノールから再
結晶することにより、6−デオキシ−β−シクロデキス
トリン839.6mg(0.750mmol、収率76.1%)が得られた。
このものの融点、赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴ス
ペクトル及び元素分析値を次に示す。
ペクトル及び元素分析値を次に示す。
融点(℃):280.0〜281.0(分解) 赤外吸収スペクトル(cm-1):3370,2920,1152,1080,102
0 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm(DMSO−d6):1.20
(3H,d,J=6.1Hz),2.80〜4.05(m),4.84(7H,br.s) 元素分析値:C42H70O34として C H 理論値(%) 45.08 6.31 実測値(%) 44.99 6.45 (3) 65−デオキシ−D−マルトペンタオースの製造 前記(2)と同様にして得た6−デオキシ−β−シク
ロデキストリン15gを100mMリン酸緩衝液(pH7.0)1000m
lに溶解したのち、前記(1)と同様にして得た粗酵素
液を約24単位添加して、40℃で48時間酵素反応を行わ
せ、反応液を得た。
0 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm(DMSO−d6):1.20
(3H,d,J=6.1Hz),2.80〜4.05(m),4.84(7H,br.s) 元素分析値:C42H70O34として C H 理論値(%) 45.08 6.31 実測値(%) 44.99 6.45 (3) 65−デオキシ−D−マルトペンタオースの製造 前記(2)と同様にして得た6−デオキシ−β−シク
ロデキストリン15gを100mMリン酸緩衝液(pH7.0)1000m
lに溶解したのち、前記(1)と同様にして得た粗酵素
液を約24単位添加して、40℃で48時間酵素反応を行わ
せ、反応液を得た。
この反応液に塩酸を添加してpHを約2.0にすることに
より反応を停止させたのち、水酸化ナトリウム溶液を加
えて中和し、次いで、これをODSカラムに通液して、未
反応の6−デオキシ−β−シクロデキストリンを吸着さ
せ、通液画分を得た。この操作を4回繰り返して、合計
63gの6−デオキシ−β−シクロデキストリンを処理し
た。
より反応を停止させたのち、水酸化ナトリウム溶液を加
えて中和し、次いで、これをODSカラムに通液して、未
反応の6−デオキシ−β−シクロデキストリンを吸着さ
せ、通液画分を得た。この操作を4回繰り返して、合計
63gの6−デオキシ−β−シクロデキストリンを処理し
た。
この通液画分を1/10の液量の100mM酢酸緩衝液(pH4.
5)と混合したのち、さらに100mM酢酸によりpHを4.5に
調整した。次いで、これにグルコアミラーゼ2500単位を
添加して40℃で8時間酵素反応を行わせたのち、この反
応液に塩酸を添加してpHを約2.0にすることにより反応
を停止させ、次いで水酸化ナトリウム溶液を加えて中和
した。
5)と混合したのち、さらに100mM酢酸によりpHを4.5に
調整した。次いで、これにグルコアミラーゼ2500単位を
添加して40℃で8時間酵素反応を行わせたのち、この反
応液に塩酸を添加してpHを約2.0にすることにより反応
を停止させ、次いで水酸化ナトリウム溶液を加えて中和
した。
次に、この液を活性炭カラムに通液したのち、0〜35
%のエタノールグラジエントにより6−デオキシマルト
オリゴ糖を溶出させ、次いで約25%のエタノール溶出画
分を凍結乾燥して、純度約98%の65−デオキシ−D−マ
ルトペンタオース約2.5gを得た。
%のエタノールグラジエントにより6−デオキシマルト
オリゴ糖を溶出させ、次いで約25%のエタノール溶出画
分を凍結乾燥して、純度約98%の65−デオキシ−D−マ
ルトペンタオース約2.5gを得た。
このものの赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクト
ル、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。
ル、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。
赤外吸収スペクトル(cm-1):3420,2925,1628,1412,136
8,1150,1080,1040 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm(D2O):1.27(3H,
d,J=6.3Hz),3.16(1H,t,J=9.0Hz),3.29(1H,t,J=
9.0Hz),3.50〜4.10(m),4.65(0.5H,d,J=8.1Hz,α
−H),5.23(0.5H,d,J=3.4Hz,β−H),5.27(1H,d,J
=3.2Hz),5.35(3H,d,J=3.9Hz) 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー(株)製TSK gel
Amide−80カラム(4.6mmID×250mm)、RI検出、溶離
液:アセトニトリル/水=3/2(V/V),流速:1.0ml/mi
n〕:tR=8.7min 元素分析値:C30H52O25として C H 理論値(%) 44.34 6.45 実測値(%) 44.45 6.45 実施例2 64−デオキシ−D−マルトテトラオースの製
造 実施例1の(3)において、エタノールグラジエント
による約23%エタノール溶出画分を採取した以外は、実
施例1と同様な操作を行い、純度99.5%の64−デオキシ
−D−マルトテトラオース約2.4gを得た。
8,1150,1080,1040 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm(D2O):1.27(3H,
d,J=6.3Hz),3.16(1H,t,J=9.0Hz),3.29(1H,t,J=
9.0Hz),3.50〜4.10(m),4.65(0.5H,d,J=8.1Hz,α
−H),5.23(0.5H,d,J=3.4Hz,β−H),5.27(1H,d,J
=3.2Hz),5.35(3H,d,J=3.9Hz) 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー(株)製TSK gel
Amide−80カラム(4.6mmID×250mm)、RI検出、溶離
液:アセトニトリル/水=3/2(V/V),流速:1.0ml/mi
n〕:tR=8.7min 元素分析値:C30H52O25として C H 理論値(%) 44.34 6.45 実測値(%) 44.45 6.45 実施例2 64−デオキシ−D−マルトテトラオースの製
造 実施例1の(3)において、エタノールグラジエント
による約23%エタノール溶出画分を採取した以外は、実
施例1と同様な操作を行い、純度99.5%の64−デオキシ
−D−マルトテトラオース約2.4gを得た。
このものの赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクト
ル、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。
ル、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。
赤外吸収スペクトル(cm-1):3420,2930,1636,1410,136
6,1148,1078,1038 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm(D2O):1.27(3H,
d,J=6.3Hz),3.14(1H,t,J=9.0Hz),3.26(1H,t,J=
9.0Hz),3.50〜4.10(m),4.63(0.5H,d,J=8.1Hz,α
−H),5.22(0.5H,d,J=3.4Hz,β−H),5.25(1H,d,J
=2.9Hz),5.33(2H,br.d,J=1.5Hz) 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー(株)製TSK gel
Amide−80カラム(4.6mmID×250mm)、RI検出、溶離
液:アセトニトリル/水=3/2(V/V),流速:1.0ml/mi
n〕:tR=7.2min 元素分析値:C24H42O20として C H 理論値(%) 44.31 6.51 実測値(%) 44.33 6.49 実施例3 公知化合物の63−デオキシ−D−マルトトリオースと
本発明の新規化合物である64−デオキシ−D−マルトテ
トラオース及び65−デオキシ−D−マルトペンタオース
とのα−アミラーゼによる加水分解速度の比較を行っ
た。
6,1148,1078,1038 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm(D2O):1.27(3H,
d,J=6.3Hz),3.14(1H,t,J=9.0Hz),3.26(1H,t,J=
9.0Hz),3.50〜4.10(m),4.63(0.5H,d,J=8.1Hz,α
−H),5.22(0.5H,d,J=3.4Hz,β−H),5.25(1H,d,J
=2.9Hz),5.33(2H,br.d,J=1.5Hz) 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー(株)製TSK gel
Amide−80カラム(4.6mmID×250mm)、RI検出、溶離
液:アセトニトリル/水=3/2(V/V),流速:1.0ml/mi
n〕:tR=7.2min 元素分析値:C24H42O20として C H 理論値(%) 44.31 6.51 実測値(%) 44.33 6.49 実施例3 公知化合物の63−デオキシ−D−マルトトリオースと
本発明の新規化合物である64−デオキシ−D−マルトテ
トラオース及び65−デオキシ−D−マルトペンタオース
とのα−アミラーゼによる加水分解速度の比較を行っ
た。
(1) 63−デオキシ−D−マルトトリオースの製造 実施例1の(3)において、エタノールグラジエント
による約21%エタノール溶出画分を採取した以外は、実
施例1と同様な操作を行い、純度98.6%の63−デオキシ
−D−マルトトリオース約1.1gを得た。
による約21%エタノール溶出画分を採取した以外は、実
施例1と同様な操作を行い、純度98.6%の63−デオキシ
−D−マルトトリオース約1.1gを得た。
このものの赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクト
ル、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。
ル、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。
赤外吸収スペクトル(cm-1):3400,2950,1690,1146,104
2 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm(D2O):1.28(3H,
d,J=6.1Hz),3.17(1H,t,J=8.9Hz),3.29(1H,t,J=
8.9Hz),3.50〜4.05(m),4.65(Ca.0.5H,d,J=7.8Hz,
α−H),5.35(Ca.0.5H,d,J=3.7Hz,β−H),5.27(1
H,d,J=3.0Hz),5.36(1H,d,J=3.9Hz) 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー(株)製TSK gel
Amide−80カラム(4.6mmID×250mm)、RI検出、溶離
液:アセトニトリル/水=3/2(V/V),流速:1.0ml/mi
n〕:tR=5.9min 元素分析値:C18H32O15として C H 理論値(%) 44.26 6.60 実測値(%) 44.28 6.58 (2) 希釈液の調製 CaCl・2H2O及びNaClを、それぞれ0.029%(w/v)及び
0.117%(w/v)の濃度になるように10mMリン酸緩衝液
(pH7.0)で溶解し、これを希釈液とする。
2 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm(D2O):1.28(3H,
d,J=6.1Hz),3.17(1H,t,J=8.9Hz),3.29(1H,t,J=
8.9Hz),3.50〜4.05(m),4.65(Ca.0.5H,d,J=7.8Hz,
α−H),5.35(Ca.0.5H,d,J=3.7Hz,β−H),5.27(1
H,d,J=3.0Hz),5.36(1H,d,J=3.9Hz) 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー(株)製TSK gel
Amide−80カラム(4.6mmID×250mm)、RI検出、溶離
液:アセトニトリル/水=3/2(V/V),流速:1.0ml/mi
n〕:tR=5.9min 元素分析値:C18H32O15として C H 理論値(%) 44.26 6.60 実測値(%) 44.28 6.58 (2) 希釈液の調製 CaCl・2H2O及びNaClを、それぞれ0.029%(w/v)及び
0.117%(w/v)の濃度になるように10mMリン酸緩衝液
(pH7.0)で溶解し、これを希釈液とする。
(3) 基質液の調製 前記(1)で得た63−デオキシ−D−マルトトリオー
ス、実施例2で得た64−デオキシ−D−マルトテトラオ
ース及び実施例1で得た65−デオキシ−D−マルトペン
タオースをそれぞれ7.74mM濃度になるように、前記希釈
液で溶解して、基質液とする。
ス、実施例2で得た64−デオキシ−D−マルトテトラオ
ース及び実施例1で得た65−デオキシ−D−マルトペン
タオースをそれぞれ7.74mM濃度になるように、前記希釈
液で溶解して、基質液とする。
(4) 共役酵素液の調製 酵母由来のα−グルコシダーゼを69.44U/ml濃度にな
るように前記希釈液で溶解して共役酵素液とする。
るように前記希釈液で溶解して共役酵素液とする。
(5) α−アミラーゼ液の調製 ヒト由来の国際試薬社製標品α−アミラーゼ(キャブ
リザイム・AMY)(P:S=1:1)を300U/の濃度となるよ
うに前記希釈液で溶解してα−アミラーゼ液とする。
リザイム・AMY)(P:S=1:1)を300U/の濃度となるよ
うに前記希釈液で溶解してα−アミラーゼ液とする。
(6) 酵素反応 共役酵素液1.8ml及びα−アミラーゼ液0.2mlをよく混
合したのち、ただちに、これに基質液0.5mlを加えてよ
く混合し、40℃で30分間反応を行い、次いで遊離したグ
ルコースをグルコスタット法により定量した。その結果
を第5表に示す。
合したのち、ただちに、これに基質液0.5mlを加えてよ
く混合し、40℃で30分間反応を行い、次いで遊離したグ
ルコースをグルコスタット法により定量した。その結果
を第5表に示す。
第5表から、本発明の64−デオキシ−D−マルトテト
ラオース及び65−デオキシ−D−マルトペンタオース
は、従来公知の63−デオキシ−D−マルトトリオースに
比べて、α−アミラーゼによる加水分解反応速度が著し
く速いことが分かる。
ラオース及び65−デオキシ−D−マルトペンタオース
は、従来公知の63−デオキシ−D−マルトトリオースに
比べて、α−アミラーゼによる加水分解反応速度が著し
く速いことが分かる。
実施例4 66−デオキシ−D−マルトヘキサオースの製
造 実施例1の(3)において、エタノールグラジエント
による約27%のエタノール溶出画分を採取した以外は、
実施例1と同様な操作を行い、純度約97%の66−デオキ
シ−D−マルトヘキサオース約2.2gを得た。
造 実施例1の(3)において、エタノールグラジエント
による約27%のエタノール溶出画分を採取した以外は、
実施例1と同様な操作を行い、純度約97%の66−デオキ
シ−D−マルトヘキサオース約2.2gを得た。
このものの赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペク
ト、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。
ト、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。
赤外吸収スペクトル(cm-1):3400,2930,1640,1412,136
0,1150,1078,1036 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm(D2O):1.27(3H,
d,J=6.1Hz),3.16(1H,t,J=8.7Hz),3.28(1H,t,J=
8.7Hz),3.45〜4.15(m),4.65(0.5H,d,J=8.3Hz,α
−H),5.22(0.5H,d,J=3.9Hz,β−H),5.27(1H,d,J
=2.9Hz),5.35(4H,d,J=2.9Hz) 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー(株)製TSK gel
Amide−80カラム(4.6mmID×250mm)、RI検出、溶離
液:アセトニトリル/水=3/2(v/v),流速:1.0ml/mi
n〕:tR=10.1min 元素分析値:C36H62O30として C H 理論値(%) 44.35 6.41 実測値(%) 44.29 6.44 実施例5 67−デオキシ−D−マルトヘプタオースの製
造 実施例1の(3)において、エタノールグラジエント
による約29%エタノール溶出画分を採取した以外は、実
施例1と同様な操作を行い、純度99.5%の67−デオキシ
−D−マルトヘプタオース約2.7gを得た。
0,1150,1078,1036 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm(D2O):1.27(3H,
d,J=6.1Hz),3.16(1H,t,J=8.7Hz),3.28(1H,t,J=
8.7Hz),3.45〜4.15(m),4.65(0.5H,d,J=8.3Hz,α
−H),5.22(0.5H,d,J=3.9Hz,β−H),5.27(1H,d,J
=2.9Hz),5.35(4H,d,J=2.9Hz) 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー(株)製TSK gel
Amide−80カラム(4.6mmID×250mm)、RI検出、溶離
液:アセトニトリル/水=3/2(v/v),流速:1.0ml/mi
n〕:tR=10.1min 元素分析値:C36H62O30として C H 理論値(%) 44.35 6.41 実測値(%) 44.29 6.44 実施例5 67−デオキシ−D−マルトヘプタオースの製
造 実施例1の(3)において、エタノールグラジエント
による約29%エタノール溶出画分を採取した以外は、実
施例1と同様な操作を行い、純度99.5%の67−デオキシ
−D−マルトヘプタオース約2.7gを得た。
このものの赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクト
ル、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。
ル、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に
示す。
赤外吸収スペクトル(cm-1):3420,2930,1628,1412,136
4,1150,1078,1022 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm(D2O):1.25(3H,
d,J=6.4Hz),3.16(1H,t,J=8.7Hz),3.27(1H,t,J=
8.7Hz),3.45〜4.10(m),4.64(0.5H,d,J=8.0Hz,α
−H),5.20(0.5H,d,J=3.5Hz,β−H),5.26(1H,d,J
=3.1Hz),5.35(5H,d,J=3.9Hz) 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー(株)製TSK gel
Amide−80カラム(4.6mmID×250mm)、RI検出、溶離
液:アセトニトリル/水=3/2(v/v),流速:1.0ml/mi
n〕:tR=12.1min 元素分析値:C42H72O35として C H 理論値(%) 44.37 6.38 実測値(%) 44.40 6.35 実施例6 65−デオキシ−D−マルトペンタオースを用いて、α
−アミラーゼ活性の測定を行った。
4,1150,1078,1022 核磁気共鳴スペクトル(200MHz)ppm(D2O):1.25(3H,
d,J=6.4Hz),3.16(1H,t,J=8.7Hz),3.27(1H,t,J=
8.7Hz),3.45〜4.10(m),4.64(0.5H,d,J=8.0Hz,α
−H),5.20(0.5H,d,J=3.5Hz,β−H),5.26(1H,d,J
=3.1Hz),5.35(5H,d,J=3.9Hz) 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー(株)製TSK gel
Amide−80カラム(4.6mmID×250mm)、RI検出、溶離
液:アセトニトリル/水=3/2(v/v),流速:1.0ml/mi
n〕:tR=12.1min 元素分析値:C42H72O35として C H 理論値(%) 44.37 6.38 実測値(%) 44.40 6.35 実施例6 65−デオキシ−D−マルトペンタオースを用いて、α
−アミラーゼ活性の測定を行った。
(1) 希釈液の調製 CaCl・2H2O及びNaClを、それぞれ0.029%(w/v)及び
0.117%(w/v)の濃度になるように、10mMリン酸緩衝液
(pH7.0)で溶解して、希釈液とする。
0.117%(w/v)の濃度になるように、10mMリン酸緩衝液
(pH7.0)で溶解して、希釈液とする。
(2) 基質液の調製 65−デオキシ−D−マルトペンタオースを7.74mM濃度
になるように前記希釈液で溶解して、基質液とする。
になるように前記希釈液で溶解して、基質液とする。
(3) 共役酵素液の調製 酵母由来のα−グルコシダーゼを69.44U/mlの濃度に
なるように前記希釈液で溶解して、共役酵素液とする。
なるように前記希釈液で溶解して、共役酵素液とする。
(4) 標品α−アミラーゼ液の調製 市販のヒト由来の国際試薬社製標品α−アミラーゼ
(キャブリザイム・AMY)(P:S=1:1)を0、10、25、5
0、100、200、400、600、800、1000U/の濃度となるよ
うに、前記希釈液で溶解して標品α−アミラーゼ液とす
る。
(キャブリザイム・AMY)(P:S=1:1)を0、10、25、5
0、100、200、400、600、800、1000U/の濃度となるよ
うに、前記希釈液で溶解して標品α−アミラーゼ液とす
る。
(5) 試料液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのま
ま試料液とする。固体の場合は試料500mgを正確に秤量
し、前記希釈液を加えて全量を5mlとして試料液とす
る。
ま試料液とする。固体の場合は試料500mgを正確に秤量
し、前記希釈液を加えて全量を5mlとして試料液とす
る。
(6) 検量線の作成 前記基質液0.5mlと共役酵素液1.8mlとを混合したの
ち、これにただちに標品α−アミラーゼ液0.2mlを加え
てかきまぜ、40℃で30分間加温し、次いでグルコスタッ
ト法を用いて遊離グルコースを定量する。標品α−アミ
ラーゼ液活性と遊離グルコース量との関係より、検量線
を作成する。この検量線の式は U=12.26・G−5.30 〔ただし、Uは酵素活性(U/)、Gは遊離グルコース
量μg/ml〕 となる。この検量線を第9図に直線グラフで示す。
ち、これにただちに標品α−アミラーゼ液0.2mlを加え
てかきまぜ、40℃で30分間加温し、次いでグルコスタッ
ト法を用いて遊離グルコースを定量する。標品α−アミ
ラーゼ液活性と遊離グルコース量との関係より、検量線
を作成する。この検量線の式は U=12.26・G−5.30 〔ただし、Uは酵素活性(U/)、Gは遊離グルコース
量μg/ml〕 となる。この検量線を第9図に直線グラフで示す。
(7) 試料液中のα−アミラーゼ活性の測定 前記の基質液0.5mlと共役酵素液1.8mlとを混合したの
ち、これにただちに試料液を加えてかきまぜ、40℃で30
分間加温し、次いでグルコスタット法を用いて遊離した
グルコースを定量する。この定量値と前記(6)で作成
した検量線から試料液中のα−アミラーゼ活性を求める
ことができる。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線
の適用範囲(0〜1000U/)を超えた場合には、希釈液
を用いて相当する倍数の希釈を行ったのち、再測定を行
う。
ち、これにただちに試料液を加えてかきまぜ、40℃で30
分間加温し、次いでグルコスタット法を用いて遊離した
グルコースを定量する。この定量値と前記(6)で作成
した検量線から試料液中のα−アミラーゼ活性を求める
ことができる。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線
の適用範囲(0〜1000U/)を超えた場合には、希釈液
を用いて相当する倍数の希釈を行ったのち、再測定を行
う。
実施例7 (1) 試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度になるように溶解す
ることにより、試薬A、B及びCを調製した。
ることにより、試薬A、B及びCを調製した。
成分 濃 度 試薬A:65−デオキシ−D−マルトペンタオース10 m
M ウシ血清アルブミン 0.05 % 試薬B:α−グルコシダーゼ 40 U/ml グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ 2 U/ml ヘキソキナーゼ 2 U/ml ATP 1.3 mM NAD 2.0 mM リン酸緩衝液(pH=7.0) 50 mM NaCl 50 mM MgSO4 50 mM ウシ血清アルブミン 0.05 % 試薬C:リン酸緩衝液(pH=7.0) 10 mM ウシ血清アルブミン 0.05 % (2) 測定法 測定用試料が液体の場合はそのまま試料液とする。固
体の場合は試料500mgを正確に秤量し、試薬Cを加えて
全量を5mlとして試料液とする。次いで試薬A0.2ml及び
試薬B2.0mlをよく混合して37℃で5分間加温したのち、
試料液200μを加えてかきまぜ、37℃で10分間加温後
からの3分間の340nmにおける吸光度の増加量を測定す
る。この吸光度の増加量とあらかじめ作成した検量線か
ら算出して試料液中のα−アミラーゼ活性の測定を行う
ことができる。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線
の適用範囲を超えた場合は試薬Cを用いて相当する倍数
の希釈を行ったのち、再測定を行う。
M ウシ血清アルブミン 0.05 % 試薬B:α−グルコシダーゼ 40 U/ml グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ 2 U/ml ヘキソキナーゼ 2 U/ml ATP 1.3 mM NAD 2.0 mM リン酸緩衝液(pH=7.0) 50 mM NaCl 50 mM MgSO4 50 mM ウシ血清アルブミン 0.05 % 試薬C:リン酸緩衝液(pH=7.0) 10 mM ウシ血清アルブミン 0.05 % (2) 測定法 測定用試料が液体の場合はそのまま試料液とする。固
体の場合は試料500mgを正確に秤量し、試薬Cを加えて
全量を5mlとして試料液とする。次いで試薬A0.2ml及び
試薬B2.0mlをよく混合して37℃で5分間加温したのち、
試料液200μを加えてかきまぜ、37℃で10分間加温後
からの3分間の340nmにおける吸光度の増加量を測定す
る。この吸光度の増加量とあらかじめ作成した検量線か
ら算出して試料液中のα−アミラーゼ活性の測定を行う
ことができる。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線
の適用範囲を超えた場合は試薬Cを用いて相当する倍数
の希釈を行ったのち、再測定を行う。
実施例8 当該物質が測定系内で安定に存在することを実証する
ために、非還元末端非修飾マルトオリゴ糖を対照として
下記の方法に従って、共役酵素との反応を行った。
ために、非還元末端非修飾マルトオリゴ糖を対照として
下記の方法に従って、共役酵素との反応を行った。
(1) 当該基質液の調製 実施例1及び実施例5において、それぞれ得た65−デ
オキシ−D−マルトペンタオース(以下デオキシG5とい
う)及び67−デオキシ−D−マルトヘプタオース(以下
デオキシG7という)が、それぞれ2mg/mlの濃度になるよ
うに、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を加え、溶解して当
該基質液とする。
オキシ−D−マルトペンタオース(以下デオキシG5とい
う)及び67−デオキシ−D−マルトヘプタオース(以下
デオキシG7という)が、それぞれ2mg/mlの濃度になるよ
うに、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を加え、溶解して当
該基質液とする。
(2) 対照基質液の調製 市販のマルトペンタオース〔盛進製薬(株)製〕(以
下G5という)及びマルトヘプタオース(ナカライテスク
(株)社製)(以下G7という)が、それぞれ2mg/mlの濃
度になるように、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を加え、
溶解して対照基質液とする。
下G5という)及びマルトヘプタオース(ナカライテスク
(株)社製)(以下G7という)が、それぞれ2mg/mlの濃
度になるように、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を加え、
溶解して対照基質液とする。
(3) 共役酵素液の調製 市販の酵母由来のα−グルコシダーゼが1872U/ml濃度
になるように、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を加え、溶
解して共役酵素液とする。
になるように、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を加え、溶
解して共役酵素液とする。
(4) 共役酵素反応 前記の基質液及び共役酵素液を40℃で3分間加温した
のち、該基質液と共役酵素液とを容量比1:1でよく混合
したのち、この混合液0.5mlを用いて0、60、120分後に
生成するグルコース量を、グルコスタット法(グルコー
スBテストワコー法)により、あらかじめ作成しておい
て検量線を用いて定量した。
のち、該基質液と共役酵素液とを容量比1:1でよく混合
したのち、この混合液0.5mlを用いて0、60、120分後に
生成するグルコース量を、グルコスタット法(グルコー
スBテストワコー法)により、あらかじめ作成しておい
て検量線を用いて定量した。
反応時間と遊離グルコース量との関係を第10図にグラ
フで示す。第10図において、○印実線はG5、○印破線は
デオキシG5、△印実線はG7、△印破線はデオキシG7の場
合である。
フで示す。第10図において、○印実線はG5、○印破線は
デオキシG5、△印実線はG7、△印破線はデオキシG7の場
合である。
第10図から、当該物質は共役酵素と反応することな
く、測定系内で安定に存在することが分かる。
く、測定系内で安定に存在することが分かる。
第1図、第2図、第3図及び第4図は、それぞれ本発明
に係るシクロデキストリナーゼにおける至適pH、安定pH
範囲、作用温度及び温度に対する失活性を示すグラフ、
第5図、第6図及び第7図は、それぞれ該シクロデキス
トリナーゼのDEAEセファロースによるカラムクロマトグ
ラフィー、TSK gelエーテル5PWによるHPLC及びTSK gelG
3000SWによるHPLCの結果を示すグラフ、第8図は該シク
ロデキストリナーゼのSDS PAGEの結果を示す説明図、第
9図は、実施例6におけるα−アミラーゼ活性と生成す
る遊離グルコース量との関係を示すグラフ、第10図は実
施例8における反応時間と遊離グルコース量との関係を
示すグラフである。
に係るシクロデキストリナーゼにおける至適pH、安定pH
範囲、作用温度及び温度に対する失活性を示すグラフ、
第5図、第6図及び第7図は、それぞれ該シクロデキス
トリナーゼのDEAEセファロースによるカラムクロマトグ
ラフィー、TSK gelエーテル5PWによるHPLC及びTSK gelG
3000SWによるHPLCの結果を示すグラフ、第8図は該シク
ロデキストリナーゼのSDS PAGEの結果を示す説明図、第
9図は、実施例6におけるα−アミラーゼ活性と生成す
る遊離グルコース量との関係を示すグラフ、第10図は実
施例8における反応時間と遊離グルコース量との関係を
示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 水澤 清 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社内 (72)発明者 山次 信幸 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社内
Claims (4)
- 【請求項1】一般式 (式中のnは2〜6の整数である) で表わされる6−デオキシマルトオリゴ糖。
- 【請求項2】6−デオキシシクロデキストリンに、以下
の理化学的性質により特定されるシクロデキストリナー
ゼを作用させると同時に、又は作用させたのちに、エキ
ソ型糖化酵素類を作用させることを特徴とする請求項1
記載の6−デオキシマルトオリゴ糖の製造方法。 (イ) シクロデキストリンを開裂し、シクロデキスト
リンのグルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生
成させる作用を有する、 (ロ) シクロデキストリンに対する水解速度又は親和
性が、多糖類あるいはシクロデキストリンと同じグルコ
ース重合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基質特異性を有
する、 (ハ) β−シクロデキストリンを基質とした場合、pH
8.0近傍に至適pHを有し、かつ安定pH範囲が5.5〜9.5で
ある、 (ニ) 40℃近傍に作用適温を有する、 (ホ) 50℃以上の温度で15分間の処理により、ほぼ失
活する性質を有する、 (ヘ) Hg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+及びFe2+などにより90
%以上阻害され、Ca2+及びMg2+により10〜30%活性化さ
れる性質を有する、及び (ト) ゲルろ過法による分子量が144,000で、SDS PAG
E法による分子量が72,000である。 - 【請求項3】請求項1記載の6−デオキシマルトオリゴ
糖を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試薬。 - 【請求項4】α−アミラーゼ活性含有試薬に、請求項1
記載の6−デオキシマルトオリゴ糖と、α−グルコシダ
ーゼ又はグルコアミラーゼ若しくはその両方を添加し、
酵素反応によって生成するグルコース又はマルトース若
しくはその両方を定量することを特徴とするα−アミラ
ーゼ活性の測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1224844A JP2542699B2 (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | デオキシマルトオリゴ糖、その製造方法、このものを有効成分とするα―アミラ―ゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα―アミラ―ゼ活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1224844A JP2542699B2 (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | デオキシマルトオリゴ糖、その製造方法、このものを有効成分とするα―アミラ―ゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα―アミラ―ゼ活性の測定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0386701A JPH0386701A (ja) | 1991-04-11 |
JP2542699B2 true JP2542699B2 (ja) | 1996-10-09 |
Family
ID=16820058
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1224844A Expired - Fee Related JP2542699B2 (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | デオキシマルトオリゴ糖、その製造方法、このものを有効成分とするα―アミラ―ゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα―アミラ―ゼ活性の測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2542699B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3124435B2 (ja) * | 1993-10-20 | 2001-01-15 | キッコーマン株式会社 | α‐アミラーゼアイソザイム活性の分別定量法 |
-
1989
- 1989-08-31 JP JP1224844A patent/JP2542699B2/ja not_active Expired - Fee Related
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---|---|
JPH0386701A (ja) | 1991-04-11 |
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