JP2987685B2 - 新規なグルコシル（α１→６）分岐水解酵素、該酵素の製造方法および利用方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、グルコシル（α１→
６）分岐水解酵素及び該酵素を産生するバチルス属新規
細菌を用いてグルコシル（α１→６）分岐水解酵素を生
産する方法、該細菌グルコシル（α１→６）分岐水解酵
素をグルコースと糖質の混合物に作用させることを特徴
とするグルコシル（α１→６）分岐糖の生産方法に関す
る。

【０００２】更に詳細には、グルコースのα-1,6結合の
枝をもつ糖質の枝を切断する酵素を産生する新規な細菌
とその培養による切断酵素の生産、生産された切断酵素
を逆にグルコースと各種糖質の混合物に作用させてグル
コースの枝をもつ分岐糖質を生産する方法に関する。

【０００３】以下、サイクロデキストリンをＣＤと略
す。また、ＣＤには普通環ＣＤ、大環状ＣＤ、分岐Ｃ
Ｄ、ＣＤ誘導体など各種のものがある。

【０００４】

【従来の技術】従来、グルコシル（α１→６）分岐水解
酵素としては、アミロ−1,6−グルコシダーゼが知ら
れ、ウサギの筋肉中に見い出された［J. Biol. Chem.,1
88巻, 17-29頁(1951)］。さらに、微生物では、酵母中
に存在することが見い出された［Arch. Biochem. Bioph
ys.,121巻, 245-246頁(1967)］。

【０００５】これら酵素の分析には、グルコースがマル
トテトラオースにα−1,6結合した基質B5が用いられて
いたが、α−アミラーゼが混在した酵素系では利用し難
い。

【０００６】そこで、1966年、Taylor, P. M. とWhela
n, W. J.はα−アミラーゼが混在した酵素系でもアミロ
−1,6−グルコシダーゼを定量できる基質として、グル
コシル−α−ＣＤ（G₁-α-ＣＤ）、グルコシル−β−Ｃ
Ｄ（G₁-β-ＣＤ）を調製した。

【０００７】これらの分岐ＣＤは水への溶解性が非常に
良好であるなど、非分岐ＣＤにはみられない特徴をもっ
ている。また、デキストランでは、３〜５グルコース単
位に一個、分岐をもつ構造のものに、抗腫瘍など高い機
能性が見い出され、同様に、キノコ由来の多糖でも３〜
５グルコース単位に一個のグルコースなどの分岐構造を
もつものに高い機能性が見い出され、糖質にグルコース
を分岐結合させる技術が強く求められてきた。

【０００８】ＣＤ類のグルコースの枝付け方法として
は、従来からいくつかの方法が提案されている。

【０００９】マルトースとＣＤを含む高濃度溶液に、
プルラナーゼあるいはイソアミラーゼ等の枝切り酵素を
作用させ、逆合成反応によってマルトシル−ＣＤ（G₂−
ＣＤ）を調製し、その後グルコアミラーゼを作用させて
マルトシル部分を加水分解し、G₁-ＣＤにする方法（特
開昭61-197602、特開昭61-287901）。この方法において
は、マルトース以外の基質、例えばマルトトリオース等
のオリゴ糖を用いても、その基質に応じた分岐ＣＤが得
られ、同様にグルコアミラーゼを作用させることにより
G₁-ＣＤにすることができる。

【００１０】兎の筋肉や酵母の菌体内から調製された
アミロ−1,6−グルコシダーゼを用いる方法（特開平4-1
79491）。この方法は、グルコースとＣＤを含む高濃度
溶液にアミロ−1,6−グルコシダーゼを作用させ、逆合
成反応によってG1-ＣＤを調製するものである。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、の方
法ではプルラナーゼ、イソアミラーゼ等の枝切り酵素を
作用させ、マルトース以上のマルトオリゴ糖を幹、核と
なる糖に結合させるが、反応後、グルコアミラーゼで処
理するので、幹となる糖質が該酵素の作用を受けないこ
とが必要である。

【００１２】また、のアミロ−1,6−グルコシダーゼ
を使用する方法の場合では、酵素剤が、動物筋肉由来或
いは酵母由来のものに限られ、酵素調製の簡便さから、
細菌由来酵素の開発が強く求められていた。

【００１３】しかし、細菌由来のアミロ−1,6−グルコ
シダーゼ、または類似の酵素剤は、これまで見い出され
ていない。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、細菌由来
のアミロ−1,6−グルコシダーゼ、または類似の酵素
（以下、グルコシル分岐水解酵素ともいう）を得るため
に広く自然界にその給源を求め、各種微生物起源の酵素
につき鋭意研究を重ねてきた。その過程で新たに土壌か
ら単離したバチルス（Bacillus）属に属する菌株を培養
することによって目的の酵素を得ることができ本発明を
完成した。

【００１５】即ち、本発明により、グルコシル分岐水解
酵素を産生するバチルス属菌、当該バチルス属菌を用い
てグルコシル分岐水解酵素を生産する方法、当該バチル
ス属菌由来のグルコシル分岐水解酵素をグルコースと糖
質の混合物に作用させることを特徴とするグルコシル分
岐糖の生産方法が提供される。

【００１６】本発明のバチルス属に属する細菌は、例え
ば以下のようにしてスクリーニングすることができる。
即ち、分離用培地の炭素源として、G₁-α-ＣＤを用い、
土壌の懸濁液を平板寒天培地に接種して、生育したコロ
ニーを選択して拾い、液体培養して、G₁-α-ＣＤを基質
とした反応液にグルコースとα-ＣＤを生成する株につ
いて、その活性を求め、有用と判定される細菌を選択す
ることができる。このようにして選択された２株（No.1
4及びNo.17）について、詳細に検討した。

【００１７】尚、硫化水素生成試験はＴＳＩ寒天培地
（ニッスイ）、ウレアーゼ試験はクリステンゼン尿素培
地（栄研）を用いた。嫌気下での生育試験は、普通寒天
培地（栄研）にグルコース（１％）添加と無添加のプレ
ートに接種し、ガスパック(BBL)で培養し、他はGordon
らの方法に従った。培養温度は、生育温度試験を除いて
は、30℃で行った。その結果を以下に示す。

【００１８】 No.14 No.17 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 細胞の形 桿菌 桿菌 細胞の大きさ 2.4〜6.4×0.6〜0.8μ 2.4〜4.8×0.6〜0.8μ 運動性 ＋（周毛） ＋（周毛） 胞子嚢の膨張 ＋ ＋ 胞子形成部位 準端立〜端立 準端立〜端立 胞子の形 楕円形〜円筒形 楕円形〜円筒形 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００１９】普通寒天培地（栄研）でNo.17はよく胞子
を形成するが、No.14は形成が悪く、普通寒天培地に酵
母エキス（0.1％）を添加した培地で胞子を形成させ
た。

【００２０】培養的性質は普通寒天培地"栄研"を用い、
48時間、30℃でのコロニーを観察した結果を次に示す。

【００２１】 No.14 No.17 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 形 円形 円形 表面 滑面 滑面 周縁 全縁 全縁 *** 凸円状 凸円状 光沢・色 半透明、湿光、無色 半透明、湿光、無色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００２２】どちらも培地表面がよく乾いていない時
は、薄く広がる（No.14が著しい）。培養が長くなる（1
0日間）と、No.14は半透明であるが、No.17は不透明で
ある。尚、図１乃至図６にNo.14及びNo.17の菌体と胞子
嚢及び周毛の顕微鏡写真を示す。

【００２３】生理学的性質は次に示す通りであった。

【００２４】 No.14 No.17 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− グラム染色性 − − カタラ−ゼ ＋ ＋ 嫌気的生育 ＋ ＋ ＶＰテスト − − pH（ＶＰブロス） pH4.7〜4.8 pH4.8〜4.9 酸の生成：グルコ−ス ＋ ＋ アラビノ−ス − − セロビオ−ス ＋ ＋ ガラクト−ス ＋ ＋ ラクト−ス 弱陽性 弱陽性 マンノ−ス ＋ ＋ マンニット − − メリビオ−ス ＋ ＋ メレジト−ス ＋ ＋ ラフィノ−ス ＋ ＋ キシロ−ス − − グルコ−スからのガスの生成 − − カゼインの分解 ＋ ＋ ゼラチンの分解 ＋ ＋ デンプンの分解 ＋ ＋ クエン酸塩の利用 − − チロシンの分解 − − フェニルアラニン脱アミノ反応 − − 卵黄反応 − − 硝酸塩の還元性 ＋ ＋ インド−ルの生成 ＋ ＋ ジヒドロキシアセトンの生成 − − 硫化水素の生成 ＋ ＋ ウレア−ゼ ＋ ＋ 馬尿酸塩の分解 ＋ ＋ pH6.8における生育 ＋ ＋ pH5.7における生育 − − 塩化ナトリウム耐性：２％ ＋ ＋ ５％ ＋ ＋ ７％ − 弱陽性 10％ − − 生育温度：10℃ − − 15℃ ＋ ＋ 30℃ ＋ ＋ 45℃ ＋ ＋ 50℃ 弱陽性 弱陽性 55℃ − −

【００２５】以上の結果から後述する文献を参考にして
考察する。 NO.14とNO.17とは胞子形成条件、培養が長くなった時
の生育状態、塩化ナトリウム耐性（７％）等にやや違い
があるが、多くの性質が一致するので同一の種である。

【００２６】好気下で生育する。胞子を形成する。周
毛により運動する。カタラ−ゼ陽性であること等からバ
チルス属に分類される。

【００２７】Bergey's manual（文献２）を検索する
と、胞子嚢が膨張、胞子形成部位が準端立〜端立、胞子
の形が楕円形、インド−ルの生成が陽性である種は，Ba
cillus alvei、 Bacillus thiaminolyticus及びBacillu
s laterosporusの３種である。

【００２８】しかし，本発明の菌は，Bacillus alveiと
はＶＰテスト、ジヒドロキシアセトンの生成等で、Baci
llus thiaminolyticusとはチロシン分解性、クエン酸塩
利用性で、Bacillus laterosporusとはチロシン分解
性、デンプン分解性等で異なる。これらを違いを表１に
まとめる。

【００２９】

【表１】 NO.14 NO.17 B.alvei B.thiamino- B.latero- lyticus sporus ＶＰテスト − − ＋ − − シ゛ヒト゛ロキシアセトンの生成 − − ＋ − − インド−ルの生成 ＋ ＋ ＋ ＋ d 硝酸塩の還元性 ＋ ＋ − ＋ ＋ チロシンの分解 − − d ＋ ＋ デンプンの分解 ＋ ＋ ＋ ＋ − 酸生成：アラビノ−ス − − − V − マンニット − − − V ＋ クエン酸塩の利用性 − − − ＋ −

【００３０】d：11-89％の株が陽性 V：菌株により異なる B. alveiとB. laterosporusのデ−タは文献２より引
用。 B. thiaminolyticusのデ−タ−は文献３より引用。

【００３１】文献１：R. E.Gordon, W. C. Haynes, and
C. H. Pang, 1973.The genus Bacillus. Agriculture
Handbook No.427.U.S.Department of Agriculture, Was
hington.D.C.

【００３２】文献２：D. Claus and R. C. W. Berkley,
1986.Genus Bacillus Cohn 1872, 174^AL,p.1105-1139.
In P. H. A. Sneath, N.S.Mair, M.E.Sharpe and J.G.H
olt(ed.)Bergey's manual of systematic bacteriolog
y, vol.2.The williams & Wilkins Co., Baltimore.

【００３３】文献３：L. K. Nakamura, 1990.Bacillus
thiaminolyticus sp. nov., nom. rev. lnt.J. Syst, B
acteriol, 40巻, 242-246.

【００３４】従って，本発明の菌株は既知菌種の中で一
致するものは無く、No.14をバチルス エスピー（Bacil
lus sp.）KW-14と命名し、No.17をバチルス エスピー
（Bacillus sp.）KW-17と命名した。尚、バチルス エ
スピー KW-14及びバチルスエスピー KW-17は、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に各々、FERM P
-15314及びFERM P-15315として寄託されている。

【００３５】本発明に使用できる細菌としては、上述し
たバチルス属に属する２株以外にも同様にして自然界か
らスクリーニングすることができる。

【００３６】バチルス属に属する菌株を用いて新規なグ
ルコシル分岐水解酵素を製造するための菌株の培養法と
しては、液体培養、固体培養のいずれでも良いが、より
好ましくは液体培養が利用できる。液体培養法としては
例えば、以下のようにして行うことができる。

【００３７】使用できる培地としては、新規なグルコシ
ル分岐水解酵素を生産する微生物が生育可能な培地であ
れば、如何なるものでも良い。例えば、グルコース、シ
ュクロース、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸
等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、或いは、
ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼ
イン加水分解物、肉エキス等の窒素源、更にカリウム
塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガ
ン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いる
ことができる。また、グルコシル分岐をもつ、G₁−Ｃ
Ｄ、イソマルトース系の糖質のような基質を培地に添加
してもよい。

【００３８】培地のｐＨは例えば約３〜９、好ましくは
約７．０〜８．０程度に調製し、培養温度は通常約１０
〜５０℃、好ましくは約２５〜３７℃程度で、１〜２０
日間、好ましくは３〜１２日間程度好気的条件下で培養
する。例えば振盪培養法、ジャーファーメンターによる
好気的深部培養法が利用できる。

【００３９】得られた培養液から新規なグルコシル分岐
水解酵素を通常の手段で単離し、本発明の新規なグルコ
シル分岐水解酵素を得ことができる。

【００４０】例えば培養液から、グルコシル分岐水解酵
素を単離精製するには、硫安塩析、アルコール沈降、イ
オン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを組み合わ
せ、常法により処理して、精製グルコシル分岐水解酵素
を得ることができる。

【００４１】更に、より具体的に本発明を詳述する。即
ち、新規なグルコシル分岐水解酵素を生産する菌株とし
て上述した、バチルス エスピー KW-17（FERM P-1531
5）を使用し、液体培地で培養し、当該酵素の産生と該
酵素の精製、酵素の諸性質について検討した。

【００４２】新鮮なスラントから１白金耳の菌をとり、
下記の液体培地に接種し、培養した。

【００４３】 液体培地 （100ml、pH8.0） Polypeptone 1.5 g NH₄Cl 0.1 g MgSO₄・7H₂O 0.01 g G₁-α-ＣＤ 1.0 g 1M KH₂PO₄-K₂HPO₄ buffer 20 ml

【００４４】培養条件は、37℃、145rpm、３日間、ロー
タリーシェーカーでの攪拌培養であり、本条件では、該
酵素は菌体外に産生された。これは、培地として加えた
G₁-α-ＣＤが該酵素の産生を誘導したものとも考えら
れ、G₁-ＣＤ、イソマルトースなどのα-1,6結合をもつ
基質および／またはそれらの混合物、それらを含む混合
物でも該酵素の産生を誘導できた。

【００４５】培養経過は図７に示したように、菌体の増
殖が24時間で最高に達した後、酵素の生産量が増加し、
42時間で最大となった。

【００４６】また、該酵素を菌体内に蓄積させる場合
は、液体培地を用い、菌体外産生の場合と同様にして
培養した。

【００４７】 液体培地 （100ml、pH7.5） Bacto Tryptone 0.5 g NH₄Cl 0.1 g MgSO₄・7H₂O 0.01 g Glucose 0.5 g 1M KH₂PO₄-K₂HPO₄ buffer 20 ml

【００４８】液体培地を用いた培養では、菌が生育し
難く、菌体の生育を良好にする窒素源を十分に加える
と、酵素産生量が低下するので、炭素源と窒素源の組合
せと量比を制御して培養することが必要である。

【００４９】酵素の精製方法は、菌体外産生酵素につい
ては、培養終了後、培養液を遠心分離（1000rpm、20分
間）し、上清を粗酵素液として得、α-ＣＤ Sepharose
カラムに通して、該酵素を吸着させて、濃縮、部分精製を
行った。このように、菌体外産生酵素の精製は容易であ
る。

【００５０】菌体内酵素の場合、培養終了後、培養液を
遠心分離（1000rpm、20分間）することによって菌体を
得た。得られた菌体を、生理食塩水に懸濁し、再度遠心
分離して洗浄菌体を得た。菌体を50mM phosphate buffe
r（pH6.5、２mM EDTA、１mM２-メルカプトエタノール、
0.1mM Phenylmethylsulfonyl Fluorideを含む）に懸濁
し、超音波破砕機で５分間処理し、遠心分離後、上清を
粗酵素抽出液とした。

【００５１】精製は、表２のように、硫安塩析(30-70%
硫安飽和)、α-ＣＤ Sepharose chromatography、DEAE-
Toyopearl 650Mを用いて行なった。特に、α-ＣＤ Seph
arosechromatographyでの精製効果が大きく（図８）、
比活性が3,000倍以上にも高まった。

【００５２】

【表２】 総蛋白量 総活性 比活性 回収率 mg U U/mg % 粗酵素抽出液 1520 8.8 0.0058 100 硫安塩析 61 5.0 0.083 57 α-ＣＤ Sepharose 0.952 3.8 4.0 43 DEAE-Toyopearl 0.083 1.7 22.7 19

【００５３】一般的な酵素的性質について検討した結果
は以下のようである。

【００５４】活性測定方法：20mM G₁-α-ＣＤを含む5
0mMリン酸緩衝液（pH6.5）50μlに酵素溶液50μlを添加
して、40℃、１時間インキュベートし加熱失活後、グル
コースCIIテストワコーにてGlucoseを定量した。１単位
は１分間に１μmolのグルコースを遊離する酵素量とし
た。

【００５５】至適pHの測定：100mM G₁-α-ＣＤ 10μl
に100mMの各種緩衝液を40μl添加し、酵素溶液を加えた
後に、40℃、１時間インキュベートし加熱失活後、グル
コースCIIテストワコーにてGlucoseを定量した。その結
果、図９に示すように、至適pHは6.5でTris-HCl緩衝液
では活性が測定できなかった。ウサギ筋肉由来のアミロ
−1,6−グルコシダーゼもトリスで阻害されることが報
告されており、当該酵素も類似した性質をもつものと考
えられる。

【００５６】至適温度の測定：20mM G₁-α-ＣＤを含
む50mM phosphate buffer（pH6.5）50μlに酵素溶液50
μlを添加して、各温度で１時間インキュベートし加熱
失活後、グルコースCIIテストワコーにてGlucoseを定量
した。その結果、至適温度は45℃であった。（図１０に
示す）

【００５７】温度安定性の測定：pH 6.5 50mM phosph
ate buffer 中で10分間、各温度で放置した後、酵素活
性を測定した。その結果、温度安定性は50℃までであっ
た。（図１１に示す）

【００５８】基質特異性：基質として、各種マルトオ
リゴ糖、各種分岐ＣＤ及び各種イソマルトオリゴ糖［こ
れらは20mM溶液（50mMリン酸緩衝液：pH6.5］とし、更
に短鎖長アミロース、可溶性澱粉、アミロペクチン、グ
リコーゲン、デキストラン及びプルラン［これらは0.5%
溶液］の各種溶液を用いて、40℃、１時間振盪反応して
遊離するグルコースを定量した。その結果、G₁-α-ＣＤ
よりのグルコースの遊離速度を100とした場合、G₁-β-
ＣＤは約58であった。又、他の基質に対しては僅かに作
用するのみであった。

【００５９】次いで、本発明である上記した新規なグル
コシル分岐水解酵素を用いたグルコシル分岐糖の製造法
について詳述する。

【００６０】各種糖とグルコースの混合物に本発明のグ
ルコシル分岐水解酵素を作用させる。各種糖としては例
えば、ＣＤ、マルトース、イソマルトース、セロビオー
ス、トレハロース、ショ糖、ラクトース、澱粉、デキス
トラン、プルラン、セルロース系の多糖、多糖分解物等
を用いることができる。

【００６１】反応条件として、通常各種糖及びグルコー
スの総濃度として１０〜７０％で行うことができ、その
場合のグルコースと各種糖との比率は１：１〜１００：
１（ｇ）で行うことができる。また、反応温度は３０〜
６０℃、反応時間は２４〜１２０時間で行うことができ
る。また、これらの条件は、使用する酵素の純度や基質
純度などに応じて適宜変更して行うことができる。

【００６２】上記条件で生成したグルコシル分岐糖の分
析は低濃度基質下で、主として、グルコース分岐を切断
するアミロ−1,6−グルコシダーゼを用いて調べること
ができる。以下にその検討結果の詳細を記載する。

【００６３】α−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ、可溶性澱
粉及びSCA（Short Chain Amylose、平均重合度＝23）に
ついては、基質0.05gとグルコース0.2gを100μlの50mM
リン酸緩衝液（pH6.5）に加熱溶解後、酵素を100μl
（0.02U）添加し、45℃で3日間反応させた。反応終了
後、酵素を加熱失活させ、ODSカラム（ＣＤ類）又はG30
00PW XLで分析した。

【００６４】分析条件は以下に示す通りである。（Dete
ction: RI） α-ＣＤ、γ-ＣＤ Column temperature: 20℃ Column: Inertsile ODS-3 (4.7φ×150 mm) Eluent, Flow rate: 2% EtOH, 0.9 ml/min. β-ＣＤ Column temperature: 20℃ Column: Inertsile ODS-3 (4.7φ×150 mm) Eluent, Flow rate: 7% MeOH, 0.7 ml/min. 可溶性澱粉及びSCA Column temperature: 20℃ Column : TSK-GEL G3000PW XL Eluent, Flow rate: water, 0.5 ml/min オリゴ糖 Column temperature 85℃ Column: MCI GEL CK04S(10mmφ×200mm) Pre-column: CK10SG(6mmφ×50mm) Eluent, Flow rate: water, 0.4ml/min

【００６５】各種オリゴ糖の分岐化も同様にして検討
し、MCI GELで分析した結果、元のオリゴ糖よりHPLC保
持時間の短い生成物（元のオリゴ糖より高分子の領域）
が得られた。高速液体クロマトで分離した後、アミロ−
1,6−グルコシダーゼを作用させたところ、グルコース
と元のオリゴ糖が生成することから、元のオリゴ糖のグ
ルコース残基にグルコースがα−1,6結合したものであ
ると認められた。

【００６６】図１２には、ＣＤを基質としたときの分岐
化糖質の生成例を示した。図に示したように、環が大き
い場合、枝の数が１個以上のものも生成する。δ以上の
大環状ＣＤの場合も同様に、複数の枝をもつＣＤが生成
した。また、分岐ＣＤを基質として作用させることによ
り、さらに枝を付けることもできる。

【００６７】マルトースとグルコースの反応ではパノー
スまたはイソパノースが微量であるが生成し、マルトー
スに替えてセロビオース、トレハロース、ショ糖、ラク
トースを用いた場合でも、僅かながら生成物が得られ
た。

【００６８】澱粉、プルラン系の多糖では、グルコース
との混合物を該酵素に作用させた後、有機溶媒沈殿によ
り洗浄してグルコースを除去し、再度、水に溶解して、
ウサギ筋肉のアミロ−1,6−グルコシダーゼを作用させ
てグルコースが生成することから、分岐化反応を認め
た。

【００６９】セルロース系多糖については、懸濁液で反
応し、反応終了後、沈殿を集めて水洗した後、同様にし
てグルコースが生成することから分岐化反応を認めた。

【００７０】このように、本発明で生産されるグルコシ
ル分岐水解酵素は従来のアミロ−1,6−グルコシダーゼ
と同様に、ＣＤ、α−1,4グルカンにα−1、6結合したグ
ルコースの枝を切断することができるが、大過剰のグル
コース存在下では、より効率的にグルコシル分岐型糖質
が生産でき、極めて基質特異性が広い。

【００７１】このようにして生産された酵素はＣＤに高
濃度グルコースの存在下で作用させればグルコースの枝
を一個以上もつグルコシル−ＣＤを生産することがで
き、特に大環状ＣＤの場合、グルコースの枝を付けるこ
とにより安定化し、通常の澱粉水解酵素の作用に抵抗性
が付与されるので有用であり、酵素活性により、δ-Ｃ
Ｄの場合、１〜４個の枝を付けることが可能である。

【００７２】ショ糖にグルコースをα−1,6結合させた
ものはテアンダロースとも呼称され、一般にイソマルト
ース、パノース、パラチノース、などα−1,6結合をも
つ糖質は抗・難う蝕性であり、ビフィズス菌増殖作用も
認められることから、これらオリゴ糖の生産にも本発明
の酵素は利用できる。

【００７３】デキストリンに枝を付けると通常の澱粉分
解酵素の作用に抵抗性を示し、利用範囲が広がる。すな
わち、澱粉分解酵素の作用を受けやすい糖質の分岐化に
より安定性の高い糖質とすることも可能である。

【００７４】内分岐ＣＤにも枝を付けることにより、枝
切り酵素の作用に抵抗性の糖質とすることも可能であ
り、最近開発されたグルコース10数個以上のサイクロア
ミロース、アミロペクチン環状化糖質にも作用させ、通
常の澱粉分解酵素の作用に抵抗をもたせることも可能と
考えられる。

【００７５】プルラナーゼなど枝切り酵素の逆反応で、
マルトオリゴ糖から内分岐環状糖ができると予想もされ
ているが、この場合、枝切り酵素の正反応で、生成した
内分岐環状糖が再び切断される可能性がある。

【００７６】そこで、生成した内分岐環状糖にグルコシ
ルの枝を付けることにより、切断を抑制して内分岐環状
糖を効率的に生産することが可能である。また、本発明
のグルコシル分岐水解酵素と枝切り酵素を混合して反応
させる方法も考えられる。

【００７７】以下、本発明を実施例を用いて詳述するが
本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に
明記しない限り％はW/V％で示した。

【００７８】

【実施例】

実施例１ バチルス エスピー KW-17（FERM P-15315）を前述し
た液体培地で、37℃、145rpm、２日間、ロータリーシ
ェーカー培養したところ、約0.008単位/mlの培養液が得
られた。

【００７９】実施例２ 実施例１と同様にしてバチルス エスピー KW-14（FER
M P-15314）を液体培養したところ、約0.004単位/mlの
酵素活性を示した。

【００８０】実施例３ 液体培地２を用い、バチルス エスピー KW-17（FERM
P-15315）を実施例１と同様にして培養し、菌体内にグ
ルコシル分岐水解酵素の産生を認めた。菌体内酵素は氷
水中で超音波破砕して、遠心分離した上清より得られ、
産生量は実施例１と比較して10分の１程度であった。

【００８１】実施例４ 液体培地のG₁−α−ＣＤに代えて、G₁−β−ＣＤとイ
ソマルトースの等量混合物を用いた以外は実施例１と同
様にして培養したところ、約0.003単位/mlの酵素活性が
得られた。

【００８２】実施例５ 液体培地のグルコースに代えて、イソマルトースとグ
ルコースの等量混合物を用いた以外は実施例３と同様に
して培養したところ、菌体内酵素が、液体培地換算約0.
001単位/mlの酵素活性が得られた。

【００８３】実施例６ 実施例１で得られた、培養液を遠心分離した上清を、α
−ＣＤ Sepharose カラムに通し、濃縮、部分精製し
て、0.21単位/mlの酵素液とし、α−ＣＤ 0.5ｇとグル
コース２gを１mlの50mMリン酸緩衝液（pH6.5）に溶解
し、酵素液１mlを添加して45℃、３日間反応させたとこ
ろ、16％の収率でG₁−α−ＣＤ（α−ＣＤ換算）が得ら
れた。

【００８４】実施例７ α−ＣＤをβ−ＣＤに代えた以外は実施例６と同様にし
て操作した。その結果、G₁−β−ＣＤが12％、(G₁)₂−
β−ＣＤが７％の収率が得られた。また、β−ＣＤは溶
解性が低いため、懸濁液の状態で反応させたが、分岐化
により溶解性が向上し、溶解した部分を連続的に取り出
し、膜分離により酵素を回収して、反応槽に戻すことに
より、連続的にグルコシル分岐β−ＣＤが生産できる。

【００８５】実施例８ 実施例７とと同様にして、δ−ＣＤを用いて反応した。
その結果、(G₁)_n−δ−ＣＤ（n=1〜4）を収率16％で得
た。ε以上の大環状ＣＤについては、それらの混合物を
用いて同様に行い、(G₁)_n−ＣＤを得ることができた。

【００８６】実施例９ α−ＣＤをマルトースに替えた以外は実施例６と同様に
して、パノース様（パノースとHPLCの保持時間が等しい
もので、パノースとイソパノースの混合物の可能性があ
る）糖質が３％得られた。なお、マルトースは本酵素標
品により分解作用を受けるが、過剰量のグルコースの添
加でその作用が押さえることができる。

【００８７】実施例10 α−ＣＤをショ糖に替えた以外は実施例６と同様にし
て、テアンダロース様（テアンダロースとHPLCの保持時
間が等しいもの）糖質が２％得られた。ラクトースの場
合も同程度の生成率であった。

【００８８】実施例11 α−ＣＤをトレハロースに替えた以外は実施例６と同様
にして、トレハロースより重合度の大きい糖質が５％得
られた。

【００８９】実施例12 α−ＣＤを可溶性澱粉に替えた以外は実施例６と同様に
して反応し、反応終了後、80％濃度エタノール沈殿−水
溶解によりグルコースを除去し、得られた糖質を0.5％
濃度に水に溶解してアミロ−1,6−グルコシダーゼに作
用させたところグルコースが生成し、また、HPLCでも元
の基質より大きい分子を検出できた。この結果より、分
岐化していることを確認した。プルランも同様にして確
認した。

【００９０】実施例13 可溶性澱粉をセルロースに替え、80％濃度エタノール沈
殿−水溶解を水洗に替えた以外は実施例12と同様にし
て、セルロースにも分岐化していることを確認した。

【００９１】

【発明の効果】α−1,6結合したグルコシルの枝を切る
酵素として、細菌より初めて見い出され、本酵素は広い
基質特異性を有する。また、逆合成反応を利用すること
により、各種の分岐をもつ糖質を製造することができ
る。また、培養条件により、菌体内外に該酵素を産生す
ることができ、精製も容易である。

【図面の簡単な説明】

【図１】生物の形態を表す写真であり、バチルス エス
ピー ＫＷ−１４（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１４）の菌体
と胞子嚢を示す。条件：普通寒天培地（栄研）十酵母エ
キス０．１％で４日、３０℃で培養したもの。クリスタ
ルバイオレット染色、×１２５０

【図２】生物の形態を表す写真であり、バチルス エス
ピー ＫＷ−１４（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１４）の菌体
と胞子嚢を示す。条件：普通寒天培地（栄研）十酵母エ
キス０．１％で４日、３０℃で培養したもの。×１２５
０．

【図３】生物の形態を表す写真であり、バチルス エス
ピー ＫＷ−１４（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１４）の周毛
を示す。条件：普通寒天培地（栄研）で２０時間、３０
℃で培養し、西沢・菅原染色したもの。×１２５０

【図４】生物の形態を表す写真であり、バチルス エス
ピー ＫＷ−１７（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１５）の菌体
と胞子嚢を示す。条件：普通寒天培地（栄研）十酵母エ
キス０．１％で３日、３０℃で培養したもの。クリスタ
ルバイオレット染色、×１２５０

【図５】生物の形態を表す写真であり、バチルス エス
ピー ＫＷ−１７（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１５）の菌体
と胞子嚢を示す。条件：普通寒天培地（栄研）で３日、
３０℃で培養したもの。×１２５０

【図６】生物の形態を表す写真であり、バチルス エス
ピー ＫＷ−１７（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１５）の周毛
を示す。条件：普通寒天培地（栄研）で４８時間、３０
℃で培養し、Ｒｙｕ染色したもの。×１２５０

【図７】バチルス エスピー ＫＷ−１７（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５３１５）の液体培地を用いたときの培養経時
変化を示す。

【符号の説明】

黒四角は６６０ｎｍでの吸光度を示し、黒丸は酵素活性
を示す。

【図８】α−ＣＤセファロースカラムクロマトグラフィ
ーによるグルコシル分岐水解酵素の精製例を示す。

【符号の説明】実線は蛋白質の紫外線吸収、黒丸は酵素
活性を示す。

【図９】グルコシル分岐水解酵素の至適ｐＨを示す図で
ある。

【符号の説明】

黒四角は酢酸緩衝液、黒丸はリン酸緩衝液、黒三角はト
リス一塩酸緩衝液、黒菱形はグリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液を用いた結果を示す

【図１０】グルコシル分岐水解酵素の至適温度を示す図
である。

【図１１】グルコシル分岐水解酵素の温度安定性を示す
図である。

【図１２】グルコースと各種ＣＤを用いたグルコシル分
岐水解酵素による各種グルコシル分岐ＣＤの生成を示す
ＨＰＬＣの分析結果を示す。

【符号の説明】

図中で１、２および３のピークは各々もとのＣＤ、Ｇ_１
−ＣＤ及び（Ｇ_１）_２−ＣＤを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 横江 正明 岐阜県可児市長坂４丁目161 (72)発明者 大矢 隆一 愛知県西春日井郡西春町野崎乾出15 審査官 冨永 みどり (56)参考文献 特開 昭62−25（ＪＰ，Ａ) 米国特許5194284（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/44 - 9/46 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】バチルス属細菌由来の、至適ｐＨが約６．
   ５であり、至適温度が約４５℃であり、温度安定性が約
   ５０℃までであり、トリス緩衝液で活性が阻害され、グ
   ルコシル−α−サイクロデキストリン及びグルコシル−
   β−サイクロデキストリンに作用してグルコースを遊離
   するが、デキストラン及びプルランにはわずかに作用す
   るのみである性質を有する新規なグルコシル（α１→
   ６）分岐水解酵素。
2. 【請求項２】バチルス属に属する細菌を培養し、培養液
   に請求項１記載の新規なグルコシル（α１→６）分岐水
   解酵素を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
   新規なグルコシル（α１→６）分岐水解酵素の製造法。
3. 【請求項３】バチルス属に属する細菌が、バチルス エ
   スピーＫＷ−１４（ＦＥＲＭＰ−１５３１４）或いはバ
   チルス エスピー ＫＷ−１７（ＦＥＲＭＰ−１５３１
   ５）より選ばれる請求項２記載の製造法。
4. 【請求項４】バチルス属細菌由来の請求項１記載の新規
   なグルコシル（α１→６）分岐水解酵素をグルコースと
   糖質の混合物に作用させることを特徴とするグルコシル
   （α１→６）分岐糖の製造法。
5. 【請求項５】糖質がサイクロデキストリン、澱粉、デキ
   ストラン、プルラン、セルロース系の多糖、多糖分解
   物、トレハロース、ショ糖、ラクトースである請求項４
   記載の製造法。