JP2538597B2 - Novel ring enzyme - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、例えばγ−置換アセト酢酸エステルから医
薬の合成中間体として重要な（Ｒ）−γ−置換−β−ヒ
ドロキシ酪酸エステルの製造などに利用できる新規な還
元酵素に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Field of Industrial Application) The present invention is, for example, the production of (R) -γ-substituted-β-hydroxybutyric acid ester, which is important as a synthetic intermediate for pharmaceuticals, from γ-substituted acetoacetic acid ester. The present invention relates to a novel reductase that can be used for.

（従来の技術） 近年、還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ
チドリン酸を補酵素とする酵素的不斉還元反応による光
学活性生理活性物質およびその合成中間体の製造の重要
性が増しつつある。これまでにγ−置換アセト酢酸エス
テルに作用し、（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸
エステルを生成する酵素としては酵母由来のＬ−β−ヒ
ドロキシ・アシルCoAデヒドロゲナーゼ〔EC1.1.1.35〕
（特開昭59−118093号公報）およびサーモアネアロビウ
ムブロキイ（Thermoanaerobium brockii）由来のアルコ
ールデヒドロゲナーゼ〔EC1.1.1.2〕（J.Am.Chem.So
c.、1985、107、4028）が知られている。(Prior Art) In recent years, the importance of producing optically active physiologically active substances and their synthetic intermediates by an enzymatic asymmetric reduction reaction using reduced nicotinamide / adenine / dinucleotide phosphate as a coenzyme has been increasing. As an enzyme that acts on γ-substituted acetoacetic acid ester to produce (R) -γ-substituted-β-hydroxybutyric acid ester, yeast-derived L-β-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] ]
(JP-A 59-118093) and Thermoanaerobium brockii-derived alcohol dehydrogenase [EC 1.1.1.2] (J. Am. Chem. So.
c., 1985, 107 , 4028) are known.

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、前者は反応性と温度安定性が劣り、後
者は嫌気培養であるため菌の増殖性が劣り、また培養装
置が複雑になるという問題があつた。(Problems to be Solved by the Invention) However, the former has a problem of poor reactivity and temperature stability, and the latter has a problem of poor microbial growth due to anaerobic culture and a complicated culture apparatus.

その他、次の既知還元酵素類についてγ−置換−アセ
ト酢酸エステルに対する活性を検討した結果、いずれも
活性は認められなかつた。In addition, as a result of examining the activity of the following known reductases against γ-substituted-acetoacetic acid ester, no activity was observed.

既知還元酵素類…グリセロール・デハイドロゲナナー
ゼ〔EC1.1.1.6〕、グルタメート・デハイドロゲナーゼ
〔EC1.4.1.3〕、アルコール・デハイドロゲナーゼ〔EC
1.1.1.1〕、ベータ・ガラクトース・デハイドロゲナー
ゼ〔EC1.1.1.48〕、ラクテート・デハイドロゲナーゼ
〔EC1.1.1.27〕、グルコース・デハイドロゲナーゼ〔EC
1.1.1.47〕、ホルムアルデヒド・デハイドロゲナーゼ
〔EC1.2.1.1〕、アルフア・グリセロフオスフエート・
デハイドロゲナーゼ〔EC1.1.1.8〕。Known reductases ... Glycerol dehydrogenase [EC1.1.1.6], glutamate dehydrogenase [EC1.4.1.3], alcohol dehydrogenase [EC
1.1.1.1], beta-galactose dehydrogenase [EC 1.1.1.48], lactate dehydrogenase [EC 1.1.1.27], glucose dehydrogenase [EC
1.1.1.47], formaldehyde dehydrogenase [EC 1.2.1.1], alpha glycerophosphate
Dehydrogenase [EC 1.1.1.8].

この発明はγ−置換アセト酢酸エステルに作用し、
（Ｒ）−γ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルを生成
し、かつ前記欠点を改良した酵素を提供することを目的
とする。This invention acts on γ-substituted acetoacetates,
It is an object of the present invention to provide an enzyme that produces (R) -γ-substituted-β-hydroxybutyric acid ester and has the above-mentioned drawbacks improved.

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは前記目的を達成するために多数の酵素の
スクリーニングを行なつた結果、スポロボロマイセス
（Sporobolomyces）属に属する菌株、たとえばスポロボ
ロマイセス・サルモニカラー（Sporobolomyces salmoni
color）IFO−1038がγ−置換アセト酢酸エステルの還元
能力が高いことを見い出し、先に特許出願した（特願昭
61−33935号）。本発明者らは、前記菌株から還元能力
を示す酵素を抽出し精製したところ、本発明の目的にか
なう新規酵素であることが明らかになり本発明を完成す
るに到つた。(Means for Solving Problems) As a result of screening a large number of enzymes in order to achieve the above-mentioned object, the present inventors have found that a strain belonging to the genus Sporobolomyces, for example, Sporobolomyces.・ Salmoni color (Sporobolomyces salmoni
color) IFO-1038 found that γ-substituted acetoacetic acid ester has a high reducing ability, and applied for a patent (Patent application Sho
61-33935). When the present inventors extracted and purified an enzyme having a reducing ability from the above-mentioned strain, it became clear that the enzyme was a novel enzyme that fulfills the purpose of the present invention, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は下記理化学的性質を有する新規な
還元酵素である。That is, the present invention is a novel reductase having the following physicochemical properties.

記 イ）作用…補酵素還元型ニコチンアミド・アデニン・ジ
ヌクレオチド・リン酸（以下、これをNADPHという）の
存在下、アルデヒド類およびケトン類を還元し、これら
と等モルのアルコール類を生成する。B) Action: In the presence of coenzyme-reduced nicotinamide / adenine / dinucleotide / phosphate (hereinafter referred to as NADPH), aldehydes and ketones are reduced to produce alcohols equimolar to them. .

ロ）基質特異性…γ−置換アセト酢酸エステルを選択的
に還元し、（Ｒ）−体の相当するアルコール類を生成す
る。また、NADPHに対し活性を有するが、NADH（還元型
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド）に対して
は活性がない。(B) Substrate specificity ... Selectively reducing γ-substituted acetoacetic acid ester to produce alcohols corresponding to the (R) -form. Further, it is active against NADPH, but is inactive against NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide).

ハ）至適pH及び安定pH範囲…至適pHは７付近、安定pH範
囲は６〜10である。C) Optimum pH and stable pH range ... The optimum pH is around 7, and the stable pH range is 6-10.

ニ）至適温度…至適温度は60℃付近である。D) Optimum temperature ... The optimum temperature is around 60 ° C.

ホ）温度による失活の条件…40℃では失活がなく、60℃
（pH7）で10分間で30％失活する。E) Deactivation condition due to temperature ... 60 ° C without deactivation at 40 ° C
30% inactivation in 10 minutes at (pH7).

ヘ）阻害及び活性化…クエルセチンで阻害され、Fe³⁺、
Mg²⁺で若干阻害される。α，α′−ジピリジルで若干活
性化される。F) Inhibition and activation ... Inhibited by quercetin, Fe ³⁺ ,
It is slightly inhibited by Mg ²⁺ . It is slightly activated by α, α'-dipyridyl.

ト）等電点…pH4.7である。G) Isoelectric point: pH 4.7.

チ）分子量…セフアデツクスＧ−100のゲル濾過法によ
れば32000であり、SDS電気泳動法によれば36500であ
る。H) Molecular weight: 32000 according to the gel filtration method of Sephadex G-100 and 36500 according to the SDS electrophoresis method.

つぎに、本発明の新規な還元酵素の生産と精製法およ
びその諸性質につき具体的に説明する。なお、以下の％
はすべて重量％を表わす。グルコース５％およびコーン
ステイープリカー５％からなり、pHを6.0に調整した培
地でスポロボロマイセス・サルモニカラーIFO−1038を
生育させた。Next, the production and purification method of the novel reductase of the present invention and various properties thereof will be specifically described. The following%
All represent% by weight. Sporoboromyces salmonicolor IFO-1038 was grown in a medium containing glucose 5% and corn stay liquor 5% and having a pH adjusted to 6.0.

生育したスポロボロマイセス・サルモニカラーを遠心
分離により集菌し、0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4）で洗浄
後、ダイノミル（シンマルエンタープライズ社製）で細
胞を破砕し酵素を抽出した。破砕した細胞と酵素との混
合物を遠心分離し、得られた無細胞抽出液に硫酸アンモ
ニウム水溶液（飽和濃度の60〜80％の濃度）を加えるこ
とによつて酵素を含む画分を沈降させて集めた。The grown Sporoboromyces salmonicolor was collected by centrifugation, washed with 0.01 M phosphate buffer (pH 7.4), and then the cells were crushed with Dynomill (manufactured by Shinmaru Enterprise Co., Ltd.) to extract the enzyme. Centrifuge the mixture of crushed cells and enzyme, and add the ammonium sulfate aqueous solution (concentration of 60-80% of saturation concentration) to the obtained cell-free extract to precipitate and collect the fraction containing enzyme. It was

一晩0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4）に対し透析を行なつ
て硫酸アンモニウムを除去したのち、DEAE−セフアセル
（フアーマシア社製）カラムに吸着させ、濃度０〜0.6M
の塩化ナトリウム水溶液による直線グラジエント溶出を
行ない活性画分を集めた。さらに、限外濾過法（アミコ
ン社製装置使用）で濃縮し、ゲル濾過クロマト処理（フ
アーマシア社製セフアデツクスＧ−100を使用）を２回
行なうことにより活性画分を集め、精製酵素液標品を得
た。得られた標品を電気泳動法で調べた結果、均一な物
質であつた。After dialysis against 0.01 M phosphate buffer (pH 7.4) overnight to remove ammonium sulfate, it was adsorbed on a DEAE-Sephacel (manufactured by Pharmacia) column and the concentration was 0 to 0.6 M.
Was subjected to linear gradient elution with an aqueous sodium chloride solution to collect active fractions. Furthermore, the active fractions were collected by concentrating by ultrafiltration (using an Amicon device) and performing gel filtration chromatography (using Pharmacia's Sephadex G-100) twice to obtain a purified enzyme liquid preparation. Obtained. As a result of examining the obtained preparation by electrophoresis, it was found to be a uniform substance.

酵素活性の測定は基質600n molとNADPH192n molを0.6
mlの酵素液（濃度0.1Mのリン酸緩衝液、pH7.0）に添加
し、温度37℃における波長340nmの吸光度を測定するこ
とによつて求めた。そして、γ−クロルアセト酢酸エチ
ルエステルから１分間に１μmolのγ−クロル−β−ハ
イドロキシ酪酸エチルエステルを生成する能力を１単位
とした。The enzyme activity was determined by measuring substrate 600nmol and NADPH192nmol 0.6
It was determined by adding to ml of enzyme solution (0.1 M phosphate buffer, pH 7.0) and measuring the absorbance at a wavelength of 340 nm at a temperature of 37 ° C. Then, the ability to produce 1 μmol of γ-chloro-β-hydroxybutyric acid ethyl ester per minute from γ-chloroacetoacetic acid ethyl ester was defined as 1 unit.

本発明の還元酵素の理化学的諸性質はつぎの通りであ
る。The physicochemical properties of the reductase of the present invention are as follows.

作用…補酵素NADPHの存在下、アルデヒド類および
ケトン類を基質とし、これらと等モルのアルコール類を
生成する。Action: In the presence of coenzyme NADPH, aldehydes and ketones are used as substrates and alcohols equimolar to them are produced.

基質特異性 （ｉ） ケトン類およびアルデヒド類に対する活性…第
１表および第２表に記すとおりである。これらの活性の
値はγ−クロルアセト酢酸エチルに対する活性を100％
として表わしたものである。Substrate specificity (i) Activity against ketones and aldehydes ... As described in Tables 1 and 2. These activity values show 100% activity against ethyl γ-chloroacetoacetate.
Is expressed as.

なお、活性がゼロのケトン類は下記の通りである。２
−ケトグルタール酸、２−ケト酪酸、２−ケト吉草酸、
２−ケトカプロン酸、２−ケトアジピン酸、２−ケトイ
ソ吉草酸、２−ケトイソカプロン酸、２−ケトマロン
酸、２−ケト−３−メチル吉草酸、２−ケト−Ｄ−グル
コン酸、３−インド−ルグリオキシル酸、ピルビン酸、
フエニルピルビン酸、ベンゾイルピルビン酸、グリオキ
シレート、オキサル酸、オキシピルビン酸、ｐ−オキシ
フエニルピルビン酸、インドール−３−ピルビン酸、ケ
トパントテン酸カルシウム、ケトパントテンアミド、ケ
トパントテン酸、ケトパントラクトン、アセト酢酸、レ
ブリン酸、ジヒドロ−4,4−ジエチル−2,3−フランジオ
ン、ジヒドロ−４−メチル−４−エチル−2,3−フラン
ジオン、ジヒドロ−４−メチル−４−プロピル−2,3−
フランジオン、２−ケト−３−吉草酸エチル、２−ケト
−３−カプロン酸メチル、２−ケト−３−フエニル酪
酸、ジヒドロ−５−イソプロピル−4,4−ジメチル−2,3
−フランジオン、ジヒドロ−５−（３−ペンチル）−4,
4−ジメチル−2,3−フランジオン、ジヒドロ−５−（３
−ペンチル）−4,4−ジエチル−2,3−フランジオン、デ
ハイドロカルニチンエチルエステル、Ｓ−アセトアセチ
ル・コーエンザイムＡ、アセトイン、ベンゾイン、アセ
トール、ビタミンK₃、ビタミンK₅、イサチン、α−ナフ
トキノン、パラバン酸、2,5−トルキノン、クロラニ
ル、３−メチル−1,2−シクロヘキサジオン、アセナフ
テンキノン また、活性がゼロのアルデヒド類は下記の通りであ
る。 The ketones with zero activity are as follows. Two
-Ketoglutaric acid, 2-ketobutyric acid, 2-ketovaleric acid,
2-ketocaproic acid, 2-ketoadipic acid, 2-ketoisovaleric acid, 2-ketoisocaproic acid, 2-ketomalonic acid, 2-keto-3-methylvaleric acid, 2-keto-D-gluconic acid, 3-indole Glyoxylic acid, pyruvic acid,
Phenylpyruvic acid, benzoylpyruvic acid, glyoxylate, oxalic acid, oxypyruvic acid, p-oxyphenylpyruvic acid, indole-3-pyruvic acid, calcium ketopantothenate, ketopantothenamide, ketopantothenic acid, ketopanto Lactone, acetoacetic acid, levulinic acid, dihydro-4,4-diethyl-2,3-furandione, dihydro-4-methyl-4-ethyl-2,3-furandione, dihydro-4-methyl-4-propyl- 2,3-
Frangion, ethyl 2-keto-3-valerate, methyl 2-keto-3-caproate, 2-keto-3-phenylbutyric acid, dihydro-5-isopropyl-4,4-dimethyl-2,3
-Flangion, dihydro-5- (3-pentyl) -4,
4-dimethyl-2,3-furandione, dihydro-5- (3
- pentyl) -4,4-diethyl-2,3-furandione, de hydro carnitine ethyl ester, S- acetoacetyl Ko Enzyme A, acetoin, benzoin, acetol, vitamin K _3, vitamin K _5, isatin, alpha- Naphthoquinone, parabanic acid, 2,5-toluquinone, chloranil, 3-methyl-1,2-cyclohexadione, acenaphthenequinone. Aldehydes having zero activity are as follows.

ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、クロトンアル
デヒド、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−ホスフエート・
ジアセチルアセタール、グリコールアルデヒド、プロピ
オンアルデヒド、サリチルアルデヒド、ベタインアルデ
ヒド、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド、ｐ−ヒド
ロベンズアルデヒド、無水グルタール酸、ｎ−ブチルア
ルデヒド、グルタルアルデヒド、Ｄ−グルコン酸ナトリ
ウム塩、 （ii） 補酵素 ・NADPHに対し活性有り。Formaldehyde, acetaldehyde, crotonaldehyde, D-glyceraldehyde-3-phosphate
Diacetylacetal, glycolaldehyde, propionaldehyde, salicylaldehyde, betaine aldehyde, p-dimethylaminobenzaldehyde, p-hydrobenzaldehyde, glutaric anhydride, n-butyraldehyde, glutaraldehyde, D-gluconic acid sodium salt, (ii) coenzyme・ Active against NADPH.

・NADH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオシド）に対
し作用しない。・ Does not act on NADH (nicotinamide adenine dinucleoside).

（iii） アルコール類 第３表のアルコール類に対して実質的に活性は認めら
れない。(Iii) Alcohols Substantially no activity is observed against the alcohols shown in Table 3.

至適pH及び安定pH範囲 至適pHは７近辺にある。また、pH6〜10で55℃、10分
間処理した場合でも80％以上の活性が残存する。 Optimal pH and stable pH range The optimal pH is around 7. Moreover, 80% or more of the activity remains even when treated at pH 6 to 10 at 55 ° C for 10 minutes.

至適温度及び安定温度範囲 至適温度は60℃付近にある。また、pH7.0で10分間の
処理では40℃で100％、60℃で70％の活性が残存する。Optimal temperature and stable temperature range The optimal temperature is around 60 ° C. Moreover, 100% activity at 40 ° C and 70% activity at 60 ° C remain when treated at pH 7.0 for 10 minutes.

添加剤（金属イオンおよび化合物）の影響…第４表
に示すとおりである。なお、活性（％）はこれらの金属
イオンまたは化合物を添加しないときを100とした相対
値である。Effects of additives (metal ions and compounds) ... As shown in Table 4. Note that the activity (%) is a relative value with 100 when the addition of these metal ions or compounds is not performed.

光学選択性 γ−置換アセト酢酸エステルの還元反応生成物は第５
表に示すとおりいずれも（Ｒ）−体で光学純度は97％ee
以上である。 Optical Selectivity The reduction reaction product of γ-substituted acetoacetic ester is the fifth
As shown in the table, all of them are (R) -form and optical purity is 97% ee
That is all.

生成物の光学純度は、（＋）−α−メトキシ−α−ト
リフルオロメチルフエニル酢酸（MTPA）とのエステルを
合成し、ジアステレオマー化合物とした後、高速液体ク
ロマトグラフイ（HPLC）により分離定量する。 The optical purity of the product was determined by high-performance liquid chromatography (HPLC) after synthesizing an ester with (+)-α-methoxy-α-trifluoromethylphenylacetic acid (MTPA) to obtain a diastereomeric compound. Separate and quantify.

HPLC条件 カラム:Partisil5（ワツトマン社製）（4.6
φ×250mm） 移動相：ヘキサン：テトラクロロフラン：メ
タノール＝600:100:1 速 度:2.0ml/分 検出（吸光度波長）:217nm 有機溶媒に対する安定性 第６表の有機溶媒を含むpH7.0のリン酸緩衝液中で28
℃、24時間処理した場合でも80％以上の活性を保有して
いる。HPLC conditions Column: Partisil5 (Watman) (4.6
φ × 250 mm) Mobile phase: Hexane: Tetrachlorofuran: Methanol = 600: 100: 1 Speed: 2.0 ml / min Detection (Absorbance wavelength): 217 nm Stability to organic solvents pH 7.0 including organic solvents in Table 6 28 in phosphate buffer
It retains 80% or more of activity even when it is treated at ℃ for 24 hours.

等電点 pH4.7 分子量 32,000（セフアデツクスＧ−100のゲル濾過法） 36,500〔SDS（ソジウムドデシルサルフエート）電気泳
動法〕 本発明で使用する新規還元酵素を生産するには、常法
に従つて、当該菌を培養することができる。培養に用い
られる培地は微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無
機物質等を含む通常の培地である。更に、ビタミン、ア
ミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が
得られる場合が多い。 Isoelectric point pH 4.7 Molecular weight 32,000 (Sephadex G-100 gel filtration method) 36,500 [SDS (sodium dodecyl sulphate) electrophoresis method] To produce the novel reductase used in the present invention, a conventional method is used. Then, the bacterium can be cultured. The medium used for culturing is an ordinary medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like necessary for the growth of microorganisms. In addition, the addition of organic micronutrients such as vitamins and amino acids often produces desirable results.

培地は好気的条件下、pH3〜８、温度10〜40℃の任意
の範囲に制御しつつ１〜10日間行う。The medium is aerated under aerobic conditions for 1 to 10 days while controlling the pH to 3 to 8 and the temperature to 10 to 40 ° C.

当該菌を培養して電気泳動的に均一な還元酵素を得る
には、通常の硫安分画、アフイニテイクロマトグラフ
イ、イオン交換クロマトグラフイ、ゲルろ過クロマトグ
ラフイ等が用いられる。To obtain the electrophoretically uniform reductase by culturing the bacterium, ordinary ammonium sulfate fractionation, affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography and the like are used.

〔実施例〕〔Example〕

次に、実施例によつて本発明の方法を更に詳しく説明
する。Next, the method of the present invention will be described in more detail with reference to Examples.

グルコース５重量％、コーン・ステイープ・リカー５
重量％からなる培地（pH6）5mlを試験管に取り、スポロ
ボロマイセス・サルモニカラー（Sporobolomyces salmo
nicolor）IFO1038を接種して28℃で48時間振とう培養を
行ない種培養液を得た。Glucose 5% by weight, corn staple liquor 5
Take 5 ml of a medium (pH 6) containing 10% by weight in a test tube and use Sporobolomyces salmonicolor.
nicolor) IFO1038 was inoculated and shake-cultured at 28 ° C. for 48 hours to obtain a seed culture solution.

次に10本の２容フラスコを準備し、それぞれのフラ
スコに上記と同一組成の培地500mlと種培養5mlを添加し
て、温度28℃で３〜４日間振とう培養を行なつた。Next, 10 2-volume flasks were prepared, 500 ml of the medium having the same composition as described above and 5 ml of the seed culture were added to each flask, and shake culture was performed at a temperature of 28 ° C. for 3 to 4 days.

ついで、５の培養液から遠心分離（28000G、20分
間）により回収した培養菌体を0.01Mリン緩衝液（pH7.
4）で洗浄したのち、ダイノミル（ビーズ直径0.25〜0.5
mm）で20分間処理し、28000Gで20分間遠心分離して、け
ん濁物質を除くことにより粗酵素液を得た。この粗酵素
液に硫酸アンモニウム水溶液（飽和濃度の60〜80％の濃
度）を加えることによつて酵素を含む画分を沈降させて
集め、酵素を含む画分を遠心分離（28000G、30分）によ
り回収し0.01Mリン酸緩衝液（pH7.0）で20時間透析して
硫酸アンモニウムを除いた。Then, the cultured cells recovered from the culture solution of 5 by centrifugation (28000 G, 20 minutes) were mixed with 0.01 M phosphorus buffer solution (pH 7.
After washing with 4), Dyno Mill (Bead diameter 0.25 ~ 0.5
mm) for 20 minutes and centrifuged at 28000G for 20 minutes to remove suspended substances to obtain a crude enzyme solution. By adding ammonium sulfate aqueous solution (concentration of 60-80% of saturation concentration) to this crude enzyme solution, the fractions containing the enzyme were precipitated and collected, and the fraction containing the enzyme was centrifuged (28000G, 30 minutes). It was recovered and dialyzed against 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0) for 20 hours to remove ammonium sulfate.

得られた酵素液をDEAE−セフアセル・カラム（カラム
の直径1.6cm、長さ30cm）に吸着させた。カラムを上記
緩衝液で洗浄したのち、０〜0.6Mの塩化ナトリウムを含
む同緩衝液により直線グラジエント溶出を行ない活性を
示す画分を集めた。The obtained enzyme solution was adsorbed on a DEAE-Sephacel column (column diameter 1.6 cm, length 30 cm). After the column was washed with the above buffer, a linear gradient elution was carried out with the same buffer containing 0 to 0.6 M sodium chloride to collect fractions showing activity.

活性画分を限外濾過（アミコン社、YM10）で濃縮し、
ゲル濾過カラム（セフアデツクスＧ−100、カラムの直
径2.0cm、長さ90cm）に供給した。0.1Mの食塩を含む上
記緩衝液でクロマトグラフを行ない、活性を示した画分
を集め、上記と同様の方法でゲル濾過クロマトグラフイ
ーを行ない精製酵素液を調製した。この精製酵素液を電
気泳動法にかけたところ単一バンドを示した。精製結果
を第７表に示す。The active fraction was concentrated by ultrafiltration (Amicon, YM10),
It was supplied to a gel filtration column (Sephadex G-100, column diameter 2.0 cm, length 90 cm). Chromatography was performed with the above buffer containing 0.1 M sodium chloride, the active fractions were collected, and gel filtration chromatography was performed in the same manner as above to prepare a purified enzyme solution. When this purified enzyme solution was subjected to electrophoresis, it showed a single band. The purification results are shown in Table 7.

（発明の効果） 本発明により得られた新規な還元酵素はγ−置換アセ
ト酢酸エステルの還元能力が高いので、有機合成反応と
くに不斉合成反応における還元触媒として有用であり、
工業的価値が大きい。 (Effect of the invention) The novel reductase obtained by the present invention has a high reducing ability of γ-substituted acetoacetic acid ester, and thus is useful as a reduction catalyst in an organic synthesis reaction, particularly an asymmetric synthesis reaction,
Great industrial value.

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】下記理化学的性質を有する新規な還元酵
素。 記 イ）作用…補酵素還元型ニコチンアミド・アデニン・ジ
ヌクレオチド・リン酸（以下、これをNADPHという）の
存在下、アルデヒド類およびケトン類を還元し、これら
と等モルのアルコール類を生成する。 ロ）基質特異性…γ−置換アセト酢酸エステルを選択的
に還元し、（Ｒ）−体の相当するアルコール類を生成す
る。また、NADPHに対し活性を有するが、NADH（還元型
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド）に対して
は活性がない。 ハ）至適pH及び安定pH範囲…至適pHは７付近、安定pH範
囲は６〜10である。 ニ）至適温度…至適温度は60℃付近である。 ホ）温度による失活の条件…40℃では失活がなく、60℃
（pH7）で10分間で30％失活する。 ヘ）阻害及び活性化…クエルセチンで阻害され、Fe³⁺、
Mg²⁺で若干阻害される。α，α′−ジピリジルで若干活
性化される。 ト）等電点…pH4.7である。 チ）分子量…セフアデツクスＧ−100のゲル濾過法によ
れば32000であり、SDS電気泳動法によれば36500であ
る。1. A novel reductase having the following physicochemical properties. B) Action: In the presence of coenzyme-reduced nicotinamide / adenine / dinucleotide / phosphate (hereinafter referred to as NADPH), aldehydes and ketones are reduced to produce alcohols equimolar to them. . (B) Substrate specificity ... Selectively reducing γ-substituted acetoacetic acid ester to produce alcohols corresponding to the (R) -form. Further, it is active against NADPH, but is inactive against NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide). C) Optimum pH and stable pH range ... The optimum pH is around 7, and the stable pH range is 6-10. D) Optimum temperature ... The optimum temperature is around 60 ° C. E) Deactivation condition due to temperature ... 60 ° C without deactivation at 40 ° C
30% inactivation in 10 minutes at (pH7). F) Inhibition and activation ... Inhibited by quercetin, Fe ³⁺ ,
It is slightly inhibited by Mg ²⁺ . It is slightly activated by α, α'-dipyridyl. G) Isoelectric point: pH 4.7. H) Molecular weight: 32000 according to the gel filtration method of Sephadex G-100 and 36500 according to the SDS electrophoresis method.