JP2024514197A - 仮性狂犬病ウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

本開示は、弱毒化ブタヘルペスウイルス１（仮性狂犬病ウイルス）であって、そのＴＫ、ｇＩ、及びｇＥ遺伝子が、親野外株に対して修飾されており、その結果得られたウイルスが、ブタ動物を毒性の仮性狂犬病ウイルスによる攻撃から保護する生ワクチンとしての使用に安全かつ有効である、弱毒化ブタヘルペスウイルス１（仮性狂犬病ウイルス）を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、概して、仮性狂犬病ウイルスに対するワクチンの分野におけるものである。

仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）は、世界中の多くの種の動物を感染させる疾患である。ＰＲＶ感染症は、感染性延髄麻痺、オーエスキー病、及びマッド・イッチ（ｍａｄ ｉｔｃｈ）と様々に呼ばれている。ＰＲＶ感染の臨床的徴候としては、中絶、子豚の高い死亡率、並びに子豚及び成熟豚の咳、くしゃみ、発熱、便秘、うつ病、発作、運動失調、旋回、及び過剰な唾液分泌が挙げられる。１ヶ月齢未満の子豚の死亡率は１００％に近いが、１か月齢～６か月齢の豚においては１０％未満である。妊娠中のブタは、それらの胎児を再吸収するか、又はミイラ化した、死産した、若しくは弱った子豚を産む場合がある。ウシでは、症状としては、激しい痒み、続いて神経学的徴候、及び死が挙げられる。イヌでは、症状としては、激しい痒み、顎及び咽頭の麻痺、遠吠え、並びに死などの症状が挙げられる。任意の感染した第二宿主は、一般に、２～３日しか生きられない。掻痒又は痒みは、ウイルスが掻痒の部位に見出されたことがないため、幻肢感覚とみなされる。

感染症は、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ラット、及びミンクなどの重要な家畜におけるものが知られている。宿主の範囲は非常に広く、ほとんどの哺乳動物、及び実験的には少なくとも多くの種類の鳥類が挙げられる（宿主の詳細なリストについては、Ｄ．Ｐ．Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ，“Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ”，Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ，５ｔｈ ｅｄ．，Ａ．Ｄ．Ｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，（１９８１）を参照のこと）。しかしながら、成熟ブタ及び場合によりラットは、この疾患によって死滅することはなく、したがって担体である。しかしながら、他の種については、この疾患は、致命的である。

ブタの集団は、特にＰＲＶに感染しやすい。成熟ブタはめったに症状を示さないか、又は疾患から死ぬことはないが、子豚は感染すると急性的に病にかかり、通常、特定の臨床的徴候なしに２４～４８時間で死亡することが多い（Ｔ．Ｃ．Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｒ．Ｄ．Ｈｕｎｔ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ（１９８３））。

ＰＲＶは、ヘルペスウイルスである。ＰＲＶゲノムは、２つの特異領域（ＵＬ及びＵＳ）によって特徴付けられ、ＵＳ領域は、内部反復配列及び末端反復配列（それぞれ、ＩＲＳ及びＴＲＳ）に隣接する。ＰＲＶゲノム全体の配列及び遺伝子配置は知られており、実験データによって十分に裏付けられた、可能性のある転写機構のマップが確立されている。逆位反復部間の組換えは、反対の向きのＵＳ領域を有するゲノムの２つの可能な異性体を生成することができる。７０の異なる遺伝子の機能が特定されている。ＰＲＶの一般の生物学及びその作用機序については、Ｐｏｍｅｒａｎｚ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０５，Ｓｅｐｔ．，４６２－５００を参照のこと。

ＰＲＶワクチンは種々の技法によって生成されており、ヨーロッパの流行地域では１５年超にわたってワクチン接種が実践されている。ワクチン接種によって損失は減少しているが、ワクチン接種により、環境内でウイルスが維持されている。毒性のウイルスに曝露されるワクチン接種された動物は、感染を生き延び、次いでより毒性が高いウイルスを排出する場合がある。したがって、ワクチン接種された動物は、再発し得る潜在的な感染症を抱えている場合がある。（上記のＤ．Ｐ．Ｇｕｓｔａｆｓｏｎを参照のこと）。

ＰＲＶに対する弱毒化生ワクチン及び不活性化ワクチンは、米国で市販されており、ＵＳＤＡによって承認されている（Ｃ．Ｅ．Ａｒｏｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，（１９８３）を参照のこと）。

ＰＲＶに対する弱毒化生ワクチン及び不活性化ワクチンは、米国で市販されており、ＵＳＤＡによって承認されている（Ｃ．Ｅ．Ａｒｏｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，（１９８３）を参照のこと）。それにもかかわらず、新規のＰＲＶワクチン、及び特に、安全かつ有効である弱毒化生ワクチンの必要性が依然としてある。

一態様では、本発明は、弱毒化ブタヘルペスウイルス１（仮性狂犬病ウイルス）であって、そのＴＫ、ｇＩ、及びｇＥ遺伝子が、親野外株に対して修飾されており、その結果得られたウイルスが、ブタ動物を毒性の仮性狂犬病ウイルスによる攻撃から保護する生ワクチンとしての使用に安全かつ有効であり、上記親株が、株ＦＳ１８（配列番号１）、株ＪＳ２０１２（配列番号２）、株ＴＪ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＪ７８９１８２）、株ＨｅＮ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ０９８５３４）、株ＨＬＪ８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８２４７７１）、株ＨＮ１２０１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ７２２０２２）、及び配列番号１又は配列番号２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列からコードされる任意の株からなる群から選択される、弱毒化ブタヘルペスウイルス１（仮性狂犬病ウイルス）を提供する。ある特定の実施形態では、ウイルスは、ＵＳ１、ＵＳ２、及びＵＳ９遺伝子のうちの１つ以上の弱毒化修飾を更に含むが、ただし、ＵＳ２及びＵＳ９遺伝子のうちの少なくとも１つが修飾されていないことを条件とする。

ある特定の実施形態では、ウイルスは、配列番号３、又はそれと少なくとも８５％同一である配列によってコードされており、この配列が、ａ）ＵＬ２３遺伝子ヌクレオチド４８０～８４６の欠失（分離株Ｍ１７０７）、又はｂ）ＵＬ２３遺伝子ヌクレオチド５２６～６０７の欠失（分離株Ｍ１７０５）、又はｃ）ＵＬ２３遺伝子ヌクレオチド２８０～７２３の欠失（分離株Ｍ１７０８）、又はｄ）ＵＬ２３遺伝子ヌクレオチド３６４～６１５の欠失（分離株Ｍ１７１０）、又はｅ）「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、若しくは「ｄ」の欠失のうちのいずれかを含むＵＬ２３遺伝子における欠失、を含む。

別の態様では、本発明は、弱毒化ブタヘルペスウイルスＩ（仮性狂犬病ウイルス）であって、ウイルスが、株ＦＳ１８（配列番号１）、株ＪＳ２０１２（配列番号２）、株ＴＪ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＪ７８９１８２）、株ＨｅＮ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ０９８５３４）、株ＨＬＪ８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８２４７７１）、若しくは株ＨＮ１２０１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ７２２０２２）、又は配列番号１若しくは配列番号２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列からコードされる任意の株に由来し、上記弱毒化物が、ＤＮＡ配列からコードされており、このＤＮＡ配列が、以下の欠失：ｇＥ遺伝子については、ＯＲＦのヌクレオチドの全てが欠失し、ｇＩ遺伝子については、１１０１ヌクレオチドＯＲＦの少なくともヌクレオチド２６９～１１０１が欠失し、ＴＫ遺伝子については、９６３ヌクレオチドＯＲＦから、５２６～６０７位、４８０～８４６位、２８０～７２３位、及び３６４～６１５位からなるヌクレオチド配列から欠失が選択される、を含む、弱毒化ブタヘルペスウイルスＩ（仮性狂犬病ウイルス）を提供する。

ある特定の実施形態では、ウイルスは、ＵＳ２遺伝子の完全な欠失、ＵＳ９遺伝子の完全な欠失、並びにＵＳ１遺伝子の１２６０ヌクレオチドＯＲＦの少なくともヌクレオチド９０９～１０３４及び／又は少なくともヌクレオチド３０１～３１５の欠失を更に含む。他の実施形態では、ＵＳ１、ＵＳ２、及びＵＳ９遺伝子は、修飾されていない。ある特定の実施形態では、ウイルスは、配列番号３（Ｍ１７０７）又はそれと少なくとも８５％同一の配列によってコードされている。

第３の態様では、本発明は、本発明の第１及び／又は第２の態様の任意の実施形態によるウイルスをコードする分離されたＤＮＡポリヌクレオチド分子を提供する。

第４の態様では、本発明は、宿主細胞を直接トランスフェクトすることができるプラスミドであって、本発明の第３の態様によるＤＮＡポリヌクレオチド分子と、上記コード配列の転写を可能にすることができるプロモーターと、を含む、プラスミドを提供する。

本発明の第５の態様では、本発明の第１又は第２の態様の実施形態のうちのいずれかによるウイルスを含むワクチンが提供される。

第６の態様では、本発明は、ブタ動物を仮性狂犬病感染から保護する方法であって、本発明の第５の態様の実施形態のうちのいずれかによるワクチンを上記ブタ動物に投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、ワクチンの各用量は、ウイルスの１０^４．５及び１０^９ＴＣＩＤ_５０、好ましくは、約１０^７ＴＣＩＤ_５０を含む。好ましくは、ウイルスは、配列番号３によってコードされる分離株Ｍ１７０７である。異なる実施形態では、上記ブタ動物は、雄豚、雌豚、未経産豚、又は子豚である。

本明細書には、以下の定義及び導入事項が適用可能である。

文脈が別途明確に指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数の指示語を含む。同様に、文脈が別途明確に指示しない限り、「又は」という単語は、「及び」を含むことが意図される。「又は」という単語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。

「アジュバント」という用語は、ワクチンの有効性を強化する化合物を指し、免疫剤を含む製剤に添加され得る。アジュバントは、単回用量のみのワクチンの投与後でさえ、強化された免疫応答を提供する。アジュバントとしては、例えば、ムラミルジペプチド、ピリジン、水酸化アルミニウム、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、油、水中油型エマルション、サポニン、サイトカイン、及び当該技術分野で知られている他の物質が挙げられ得る。好適なアジュバントの例は、米国特許出願公開第２００４／０２１３８１７ Ａ１号に記載されている。「アジュバント化物（Ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）」は、アジュバントを組み込むか、又はアジュバントと組み合わせられる組成物を指す。

「抗体」は、Ｆａｂ又は他の免疫グロブリン発現ライブラリの生成物を含む、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、キメラ及び一本鎖抗体、並びにＦａｂ断片を指す。抗体に関して、「免疫学的に特異的な」という用語は、目的のタンパク質の１つ以上のエピトープに結合するが、抗原性生体分子の混合集団を含有する試料中の他の分子を実質的に認識及び結合しない抗体を指す。

本明細書で使用される「弱毒化された」ＰＲＶは、感受性宿主において感染及び／又は複製することができるが、感染しやすい宿主に対して非病原性であるか、又はより低い病原性であるＰＲＶを指す。例えば、弱毒化ウイルスは、関連する野外で分離された株と比較して、観察可能／検出可能な臨床的病態、若しくはより少ない臨床的病態、若しくはより少ない重篤な臨床的病態を引き起こさないか、又はウイルス複製効率及び／又は感染力の低下を示し得る。ＰＲＶ感染症の臨床的病態としては、子豚及び成熟豚の咳、くしゃみ、発熱、便秘、うつ病、発作、運動失調、前回、及び過剰な唾液分泌が挙げられ得るが、これらに限定されない。

「エピトープ」は、宿主に投与されると、体液型（Ｂ細胞）及び／又は細胞型（Ｔ細胞）の免疫応答を惹起することができるという意味で、免疫学的に活性である抗原性決定基である。これらは、抗原性である分子上の特定の化学基又はペプチド配列である。抗体は、ポリペプチド上の特定の抗原性エピトープに特異的に結合する。動物では、ほとんどの抗原は、いくつか、又は更には多くの抗原性決定基を同時に提示するであろう。そのようなポリペプチドはまた、免疫原性ポリペプチドとして認定することができ、エピトープは、更に記載されるように特定することができる。

本発明の目的のために、第２のポリヌクレオチド分子（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）のヌクレオチド配列は、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列が遺伝コードの縮重に基づいて第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列と同じポリアミノ酸をコードする場合、又は第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列が第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされるポリアミノ酸と十分に類似するポリアミノ酸をコードするとき、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列と「同一」である。一般に、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列がＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、別途ＮＣＢＩとして知られている（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ＵＳＡ））に基づいて第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８５％のヌクレオチド配列同一性を有する場合、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列と同一である。本発明の実践による計算のための特定の例では、ＢＬＡＳＴＰ ２．２．６［Ｔａｔｕｓｏｖａ ＴＡ ａｎｄ ＴＬ Ｍａｄｄｅｎ，“ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ－－ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７－２５０．］が参照される。簡潔に言えば、１０のギャップオープニングペナルティ、０．１のギャップエクステンションペナルティ、並びにＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆの「ｂｌｏｓｕｍ６２」スコアリングマトリックスを使用して、２つのアミノ酸配列を整列させて、アライメントスコアを最適化する（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ３２５ ８９：１０９１５－１０９１９．１９９２）。次いで、同一性パーセントは、以下のように計算される：完全一致の総数×１００／２つの配列を整列させるためにより長い配列の長さ＋より長い配列に導入されたギャップの数で除算する。

「分離された」という用語は、細胞、ペプチド、又は核酸がその自生環境から離れていることを示すために使用される。分離されたペプチド及び核酸は、実質的に純粋であり得る、すなわち、それらが天然に結合し得る他の物質を本質的に含まない。

「機能的タンパク質を欠く」という語句は、修飾遺伝子によってコードされるタンパク質の量及び／又は活性が、非修飾遺伝子によってコードされるタンパク質と比較して少なくとも９５％減少することを意味する。ある特定の態様では、修飾遺伝子によってコードされるタンパク質の量及び／又は活性は、少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．９％減少する。ある特定の態様では、修飾遺伝子によってコードされるタンパク質の量及び／又は活性は、完全に排除される。

「薬学的に許容される担体」は、ワクチンの生成及び投与のために当該技術分野で使用される任意の従来の薬学的に許容される担体、ビヒクル、又は賦形剤を意味する。薬学的に許容される担体は、典型的には、非毒性、不活性、固体、又は液体の担体である。

「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）」及び「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」という用語は、本明細書で互換的に使用され、例えば豚などのイノシシ科のメンバーである任意の動物を指す。

本明細書で使用される「感染しやすい」宿主は、ＰＥＤＶによって感染させることができる細胞又は動物を指す。感染しやすい動物に導入すると、弱毒化されたＰＥＤＶはまた、ＰＥＤＶ又はその抗原に対する免疫学的応答を誘発することができ、それによって、ＰＥＤＶ感染に対する動物の免疫をもたらす。

「ワクチン」という用語は、感染の影響を予防又は軽減するために、疾患に対する免疫を生成するために使用される抗原性調製物を指す。ワクチンは、典型的には、免疫原に対するワクチン接種された対象の免疫応答を強化するのに有効なアジュバントと一緒に、免疫学的有効量の免疫原の組み合わせを使用して調製される。

ワクチン製剤は、「治療有効量」の活性配合成分、つまり、組成物が投与される対象における免疫保護応答の誘発を生じさせることができる量を含有するであろう。ＰＥＤＶ疾患の処置及び予防において、例えば、「治療有効量」は、好ましくは、新たな感染に対するワクチン接種された対象の耐性を強化する、及び／又は疾患の臨床的重症度を低減する量である。そのような保護は、ＰＲＶに感染した対象によって通常表される症状の低減若しくは消失、より速い回復時間、及び／又は減少したウイルス粒子数のいずれかによって実証されるであろう。ワクチンは、ＰＲＶに対する予防的措置として、感染前に投与することができる。代替的に、ワクチンは、対象がすでに疾患に罹患した後に投与され得る。ＰＲＶへの曝露後に与えられるワクチンは、疾患を緩和することができ、自然感染自体よりも優れた免疫応答を引き起こし得る。

本開示は、ワクチンに使用された場合に安全かつ有効であり、毒性のＰＲＶ株による攻撃から豚を保護するＰＲＶの弱毒化株を提供する。ある特定の態様では、ＰＲＶの弱毒化株は、親野外株に対するチミジンキナーゼ（ＴＫ）、糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）、及び糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）遺伝子における修飾を含む。

好適な親株としては、ＦＳ１８（配列番号１）、株ＪＳ２０１２（配列番号２）、株ＴＪ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＪ７８９１８２）、株ＨｅＮ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ０９８５３４）、株ＨＬＪ８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８２４７７１）、株ＨＮ１２０１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ７２２０２２）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な株は、全長配列番号１又は配列番号２と少なくとも８５％同一（すなわち、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．２％同一、少なくとも９９．４％同一、少なくとも９９．６％同一、少なくとも９９．８％同一、少なくとも９９．９％同一）であるヌクレオチド配列によってコードされる株である。

ある特定の態様では、親株は、前の段落に記述されているように、配列番号１又は２と少なくとも８５％同一であり、また、異なる塩基の少なくとも半分（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）は、類似のアミノ酸をコードするコドン、すなわち、保存的アミノ酸置換をもたらす。そのようなある特定の保存的アミノ酸置換は、一般に、全体的なタンパク質機能を不活性化しないことが認識されている：例えば、正に帯電したアミノ酸（及び、逆もまた同様）については、リジン、アルギニン、及びヒスチジン；負に帯電したアミノ酸（及び、逆もまた同様）については、アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに中性に帯電したアミノ酸のある特定の群（及び、全ての場合において、逆もまた同様）については、（１）アラニン及びセリン、（２）アスパラギン、グルタミン、及びヒスチジン、（３）システイン及びセリン、（４）グリシン及びプロリン、（５）イソロイシン、ロイシン、及びバリン、（６）メチオニン、ロイシン、及びイソロイシン、（７）フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、及びチロシン、（８）セリン及びスレオニン、（９）トリプトファン及びチロシン、（１０）並びに例えば、チロシン、チルプトファン、及びフェニルアラニン。アミノ酸は、物理的特性、並びに二次及び三次タンパク質構造への寄与に従って分類することができる。したがって、保存的置換は、類似の特性を有する別のアミノ酸に対する１つのアミノ酸の置換として当該技術分野で認識され、例示的な保存的置換は、１９９７年３月１３日に公開されたＷＯ９７／０９４３３、１０頁（１９９６年９月６日に出願されたＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１９７）に見出され得る。代替的に、保存的アミノ酸は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１－７７）に記載されているようにグループ化され得る。タンパク質配列は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １１．５及びＣＬＵＳＴＡＬ ２．１の両方の多重配列アラインメントを使用して整列させることができる。本明細書で使用される場合、特定のアミノ酸又はヌクレオチド配列の列挙は、核酸配列に関する全てのサイレント変異、及びアミノ酸配列に関する任意の及び全ての保存的に修飾された変異体を含むものとする。

仮性狂犬病ウイルスのｇＩ、ｇＥ、及びＴＫタンパク質の配列並びに機能が知られている。チミジンキナーゼは、ＵＬ２３遺伝子によってコードされ、ヌクレオチド合成に関与する。糖タンパク質Ｉ及びＥは、それぞれ、ＵＳ７及びＵＳ８遺伝子によってコードされるウイルス粒子タンパク質である。Ｐｏｍｅｒａｎｚらは、ｇＩ及びｇＥが互いに複合体化されることを開示している。本開示の目的のために、遺伝子ＵＬ２３、ＵＳ７、及びＵＳ８は、それぞれ、「ＴＫ遺伝子」、「ｇＩ遺伝子」、及び「ｇＥ遺伝子」と称され得る。

ある特定の実施形態では、ＰＲＶの弱毒化株は、ＵＳ１、ＵＳ２、及びＵＳ９遺伝子のうちの１つ以上（すなわち、１つ、２つ、又は３つ全て）の修飾体を更に含む。これらの遺伝子は、ＲＳｐ４０／ＩＣＰ２２、１１Ｋ、及び２８Ｋタンパク質をそれぞれコードする。ある特定の実施形態では、ＵＳ２及びＵＳ９遺伝子のうちの少なくとも１つは、修飾されていない。したがって、例えば、ウイルスは、未修飾ＵＳ２、修飾ＵＳ９、及び修飾又は未修飾ＵＳ１を含み得る。代替的に、ウイルスは、未修飾ＵＳ９、修飾ＵＳ２、及び修飾又は未修飾ＵＳ１を含み得る。

ある特定の他の実施形態では、本発明のＰＲＶの弱毒化株では、ＵＳ１、ＵＳ２、及びＵＳ９遺伝子は、修飾されていない。

Ｐｏｍｅｒａｎｚらは、ＵＳ１がＲＳｐ４０／ＩＣＰ２２タンパク質をコードすることを開示している。ＲＳｐ４０／ＩＣＰ２２タンパク質は、ＰＲＶにおける機能が現在知られていないタンパク質であるが、Ｐｏｍｅｒａｎｚは、そのＨＳＶ－１ホモログが遺伝子発現の調節因子として作用することを開示している。ＵＳ２は、ウイルスのテグメントに存在するタンパク質をコードする。ＵＳ９は、軸索におけるタンパク質選別に関与し、ＩＩ型テイルアンカー型膜タンパク質として機能するエンベロープタンパク質をコードする。

ＴＫ、ｇＩ、ｇＥタンパク質をコードする遺伝子における修飾、並びにＵＳ１、ＵＳ２、及びＵＳ９遺伝子における任意の修飾は、これらの遺伝子によって発現される機能性タンパク質を欠くウイルスをもたらす。

例えば、ある特定の態様では、機能性ｇＥタンパク質を欠く本発明のウイルスは、多数の手段によって調製することができる。例えば、ｇＥタンパク質をコードするＯＲＦの近位部分に終止コドンを導入してもよい。異なる実施形態では、終止コドンは、Ｎ末端１０アミノ酸以下、例えば、９、８、７、６、５、４、３、又は２Ｎ末端アミノ酸の後に導入され得る。他の実施形態では、転写スタット部位は、転写が開始されないように変更され得る。更に他の実施形態では、ｇＥタンパク質をコードするＯＲＦ中のヌクレオチドの全てが欠失している。

本発明のウイルスはまた、機能性ｇＩタンパク質を欠いている。ある特定の実施形態では、少なくともヌクレオチド２６９～１１０１は、ｇＩタンパク質をコードする１１０１－ヌクレオチド－ＯＲＦから欠失している。ある特定の実施形態では、欠失は、ヌクレオチド２６９の上流、例えば、ヌクレオチド２５０、２００、１５０、１００、５０、又は更には更に上流で始まる。ある特定の実施形態では、全ての１１０１ヌクレオチドが欠失している。ある特定の実施形態では、終止コドンは、フレームシフト変異を導入することなく、２６９位又はその上流に導入される。

本発明のウイルスはまた、ＴＫタンパク質をコードする修飾ＵＳ２３遺伝子を有する。ＵＬ２３遺伝子は、９６３－ヌクレオチド－長ＯＲＦを有する。ある特定の態様では、この９６３－ヌクレオチド－長ＯＲＦは、この９６３－ヌクレオチド－長ＯＲＦのヌクレオチド５２６～６０７、４８０～８４６、２８０～７２３、及び３６４～６１５によって定義される配列から選択される少なくとも１つ（又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は４つ全て）のサブ配列を欠く。当然、より長い欠失、例えば、４つ全てのサブ配列を組み込む２８０～８４６位によって定義される欠失、又は２つのサブ配列を含む３００～６５０位によって定義される欠失なども存在し得る。代替的に、ＯＲＦの９６３ヌクレオチドの全てが欠失し得る。代替的に、終止コドンは、５２６の上流の位置、又は３６４位の上流、又は４８０位の上流、又は２８０位の上流などに（フレームシフトを引き起こすことなく）導入され得る。転写開始部位の変異は、ある特定の態様においても可能である。

ＵＳ１、ＵＳ２、及びＵＳ９遺伝子のうちのいずれか１つに対する任意選択の修飾は、好ましくは、得られたウイルスを、修飾遺伝子によってコードされるタンパク質を欠くようにする。好適な変異としては、遺伝子欠失、挿入、置換などが挙げられる。上述のように、フレームシフト変異が導入され得、したがって、非修飾遺伝子によってコードされるタンパク質と最小限の類似性を有するタンパク質を生成する。フレーム内変異は、遺伝子の近位部分（例えば、Ｎ末端２０、１５、１０、５、３アミノ酸内）への終止コドンの導入、又は対応するＯＲＦが転写されないための転写開始部位の変異を含み得る。

ある特定の態様では、本発明の弱毒化ウイルスは、配列番号１又は２と少なくとも８５％同一であり、以下の修飾を有するゲノムを有する：
ａ）ｇＩタンパク質をコードする少なくとも９０％（少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）のＯＲＦ；
ｂ）ｇＥタンパク質をコードする少なくとも９０％（少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）のＯＲＦ；
ｃ）ＴＫタンパク質をコードするＯＲＦは、この９６３－ヌクレオチド－長ＯＲＦの５２６～６０７位、４８０～８４６位、２８０～７２３位、及び３６４～６１５位にあるヌクレオチドによって定義されるサブ配列のうちの少なくとも１つ（すなわち、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全て）を欠いている。

ある特定の他の態様では、修飾生ウイルスは、配列番号３又はそれと少なくとも８５％同一である配列によってコードされるが、ただし、ウイルスをコードする配列がＵＬ２３遺伝子（ＴＫをコードする）、ＵＳ７遺伝子（ｇＩをコードする）、ＵＳ８遺伝子（ｇＥをコードする）に対する修飾を含むことを条件とする。本発明のこの態様によるいくつかの修飾ライフウイルスは、非修飾ＵＳ１、ＵＳ２、及びＵＳ９遺伝子を含み得る。本発明のこの態様によるいくつかの他の修飾生ウイルスは、上述のように、ＵＳ１、ＵＳ２、及びＵＳ９遺伝子に対する任意選択の修飾体、例えば、修飾ＵＳ２、未修飾ＵＳ９、及び修飾若しくは未修飾ＵＳ１、又は修飾ＵＳ９、未修飾ＵＳ２、及び修飾若しくは未修飾ＵＳ１を更に含む。他の態様では、これらの遺伝子（ＵＳ１、ＵＳ２、ＵＳ９）の３つ全てが修飾されている

得られたウイルスが、これらの遺伝子によってコードされる機能性タンパク質を欠くと言われるような遺伝子を修飾する方法は、よく知られている。これらの方法としては、完全又は部分的な欠失、フレームシフト変異、ヌクレオチド交換、又は挿入が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、１つは、遺伝子又は転写開始部位を調節するプロモーターを修飾することができる。代替的に（又は追加的に）、１つは、コード配列に未成熟終止コドンをもたらす変異を挿入することができる。他の好適な方法は、当業者の専門知識内にある。

上述の修飾は、標的の突然変異誘発及び相同組換えが挙げられるが、これらに限定されない、多数の方法によってウイルスのゲノムに導入することができる。

この技法の第１のステップは、ＰｒＶゲノムＤＮＡとの組換えのための組換えＤＮＡ分子の構築を含む。そのような組換えＤＮＡ分子は、任意の好適なプラスミド、コスミド、又はファージに由来し得、プラスミドが最も好ましく、上記で定義されるようなＰｒＶゲノムの部分のＤＮＡを含有するＰｒＶ ＤＮＡの断片を含む。上記で定義されるＰｒＶゲノムの部分のＤＮＡ配列は、好ましくは、ウイルスＰｒＶゲノムとのインビボ相同組換えが起こることを可能にするように、適切な長さ、例えば５０～３０００ｂｐであるべきＰｒＶ核酸配列に隣接する。

このようにして得られた組換えＤＮＡ分子は、変異をＰｒＶゲノムに導入するのに好適である。

次に、細胞、例えば、ブタ腎臓細胞又はＶＥＲＯ細胞は、上述のような組換えＤＮＡ分子の存在下でＰｒＶ ＤＮＡでトランスフェクトされるか、又は野生型ＰｒＶで感染させることができ、それによって組換えＤＮＡ分子内の配列とＰｒＶゲノム内の対応する配列との間で組換えが起こる。

組換えはまた、プラスミド配列を含まない適切な隣接ＰｒＶ配列に隣接する変異配列を含む核酸配列で細胞を共トランスフェクトすることによって誘発することができる。その後、組換えウイルス子孫は、細胞培養で生成され、例えば、遺伝子型的又は表現型的に選択することができる。別の可能性は、変異が局在化された核酸配列がコードしていたポリペプチドの非存在の検出である。同じように、挿入された異種核酸配列によってコードされたポリペプチドの存在を検出することができる。組換えウイルスはまた、ネオマイシン、ゲンタマイシン、又はミコフェノール酸などの化合物に対する耐性に基づいて確実に選択され得る。

選択された組換えＰｒＶは、細胞培養において大規模に培養することができ、この後に、組換えＰｒＶ含有物質又は上記ＰｒＶによって発現される異種ポリペプチドを収集することができる。

組換えＤＮＡ技法に対して代替的又は追加的に、クローン濃縮及びクローン選択と組み合わせた細胞培養継代を使用して、本発明のウイルスを調製してもよい。例えば、遺伝子、例えば、ｇＩ又はｇＥのうちの１つに欠失を有するクローンは、更なる増殖のために選択されてもよく、ＴＫ天然遺伝子欠失変異体がウイルス複製欠損からもたらされ得ることが知られている。

好適な細胞株としては、ブタ精巣細胞株ＳＴ、ブタ腎臓細胞株ＰＫ－１５又はＭＲＳ－２、ウサギ腎臓細胞株ＲＫ、アフリカミドリザル腎臓細胞株Ｖｅｒｏ、サル胚腎臓上皮細胞株Ｍａｒｃ－１４５、ウシ腎臓細胞株ＭＤＢＫ、ウシ精巣細胞株ＢＴ、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、及びベビーハムスター腎臓細胞株ＢＨＫ－２１が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、好適な細胞株は、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）である。

本発明のワクチンの免疫学的有効量は、ウイルス感染に対する保護を必要とする豚に投与される。豚に接種する免疫学的有効量又は免疫原性量は、ルーチン試験によって容易に決定又は容易に滴定することができる。有効量は、ＰＲＶウイルスに曝露された豚を保護するために、ワクチンに対する十分な免疫学的応答が達成される量である。好ましくは、豚は、ウイルス性疾患の有害な生理学的症状又は影響のうちの１つから全てが有意に低減、軽減、又は完全に予防される程度まで保護される。

本発明のワクチンは、標準的な緩衝液、安定剤、希釈剤、防腐剤、及び／又は可溶化剤などの動物用の許容される担体を含むように、許容された慣習に従って製剤化することができ、徐放を促進するように製剤化することもできる。希釈剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが挙げられる。等張性のための添加剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが挙げられる。安定剤としては、とりわけ、アルブミンが挙げられる。修飾生ワクチンを製剤化する際に特に有用であるものを含む、他の好適なワクチンビヒクル及び添加剤は、当業者に知られているか、又は明らかであろう。例えば、参考により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ ｅｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照のこと。

本発明のワクチンは、非アジュバント化物であり得る。代替的に、本発明のワクチンは、とりわけ、例えば、アジュバント又はサイトカインなどの１つ以上の追加の免疫調節成分を更に含み得る。本発明のワクチンに使用することができるアジュバントの非限定的な例としては、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルなどの鉱物ゲル、水中油型エマルション、例えばフロイントの完全及び不完全アジュバントなどの油中水型エマルション、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ Ｇａ．）、ＱＳ－２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓ．）、ＳＡＦ－Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ Ｃａｌｉｆ．）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ又は他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、イオン性多糖類、及びＡｖｒｉｄｉｎｅ脂質－アミンアジュバントが挙げられる。本発明のワクチンに有用な水中油型エマルションの非限定的な例としては、修飾ＳＥＡＭ６２及びＳＥＡＭ１／２製剤が挙げられる。修飾ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）スクワレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５洗剤（ＩＣＩ界面活性剤）、０．７％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０洗剤（ＩＣＩ界面活性剤）、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、２００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、１００μｇ／ｍｌのコレステロール、及び０．５％（ｖ／ｖ）レシチンを含有する水中油型エマルションである。修飾ＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）スクワレン、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５洗剤、０．７％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０洗剤、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、１００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、及び５０μｇ／ｍｌのコレステロールを含む水中油型エマルションである。ワクチンに含まれ得る他の免疫調節剤としては、例えば、１つ以上のインターロイキン、インターフェロン、又は他の知られているサイトカインが挙げられる。

追加のアジュバント系は、Ｔヘルパー及びＢ細胞エピトープの両方の組み合わせを可能にし、ＷＯ２００６／０８４３１９、ＷＯ２００４／０１４９５７、及びＷＯ２００４／０１４９５６に記載されるものなどの追加的に脂質化され得る１つ以上の種類の共有結合Ｔ－Ｂエピトープ連結構造をもたらす。

本発明の好ましい実施形態では、ＯＲＦＩ ＰＥＤＶタンパク質、又は他のＰＥＤＶタンパク質若しくはその断片は、以下で論じられるように、５％ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）で製剤化される。

アジュバント成分
本発明のワクチン組成物は、アジュバントを含んでもよく、又は含まなくてもよい。具体的には、経口感染性ウイルスに基づくように、本発明の修飾生ワクチンは、無菌担体とともに、アジュバントを含まずに使用され得る。経口投与に使用され得るアジュバントとしては、ＣＴ様免疫調節剤（ｒｍＬＴ、ＣＴ－Ｂ、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉの組換え変異型熱不安定毒素、コレラ毒素－Ｂサブユニット）に基づくもの、又はポリマー及びアルギン酸塩、若しくはキトサンなどの粘膜付着剤とのカプセル化を介するもの、又はリポソームを介するものが挙げられる。ワクチン放出を通した最小保護用量での好ましいアジュバント化物又は非アジュバント化物ワクチン用量は、用量当たり約１０～約１０^６ ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０のウイルス、又はそれ以上を提供し得る。「ＴＣＩＤ_５０」は、「組織培養感染用量」を指し、接種された細胞培養物の所与のバッチの５０％に感染するために必要なウイルスのその希釈として定義される。本明細書全体を通して利用されるＳｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法を含む、ＴＣＩＤ_５０を計算するために様々な方法が使用され得る。Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法の記載については、Ｂ．Ｗ．Ｍａｈｙ ＆ Ｈ．Ｏ．Ｋａｎｇｒｏ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ，ｐ．２５－４６（１９９６）を参照のこと。存在する場合、アジュバントは、より一般的に、非経口投与が選択される場合、エマルションとして提供され得るが、開始力価を０．７ｌｏｇ（８０％低減）を超えて低下させてはならない。

一例では、アジュバント成分は、軽鉱物油中のレシチン、及びまた水酸化アルミニウム成分の組み合わせから提供される。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）（代表的なレシチン／鉱物油成分として）の組成及び配合に関する詳細は次のとおりである。

好ましいアジュバント化物は、約５％（ｖ／ｖ）のＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）（水酸化アルミニウムゲル）及び「２０％ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）を約２５％最終物（ｖ／ｖ）に更に含む緩衝溶液中の２ＭＬ用量として提供され得る。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）は、一般に、米国特許第５，０８４，２６９号に記載され、軽油中に溶解された脱油レシチン（好ましくは、大豆）を提供し、軽油は、次いで、水中油型エマルションとして、抗原の水溶液又は懸濁液中に分散される。Ａｍｐｈｉｇｅｎは、米国特許第６，８１４，９７１号（その第８～９欄を参照のこと）のプロトコルに従って改善されて、本発明の最終的なアジュバント化ワクチン組成物で使用するためのいわゆる「２０％Ａｍｐｈｉｇｅｎ」成分を提供する。したがって、１０％レシチン及び９０％キャリアオイル（ＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）、Ｐｅｎｒｅｃｏ、Ｋａｒｎｓ Ｃｉｔｙ，Ｐａ．）のストック混合物は、０．６３％リン酸縁緩衝生理食塩水溶液で１：４で希釈され、それによって、レシチン及びＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）成分をそれぞれ２％及び１８％（すなわち、それらの元の濃度の２０％）まで低減する。Ｔｗｅｅｎ８０及びＳｐａｎ８０界面活性剤は、この組成物に添加され、代表的かつ好ましい最終量は、５．６％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び２．４％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８０であり、生理食塩水及びＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）成分の混合物が最終的に所望の界面活性剤濃度をもたらすように、ＳＰＡＮ（登録商標）は、最初にストックＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）成分に提供され、ＴＷＥＥＮ（登録商標）は、最初に緩衝生理食塩水成分から提供される。ＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）／レシチン及び生理食塩水溶液の混合物は、Ｉｎ－Ｌｉｎｅ Ｓｌｉｍ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ装置、モデル４０５（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｏｓｓ ａｎｄ Ｓｏｎ、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）を使用して実現することができる。

ワクチン組成物はまた、追加のアジュバント成分（Ｒｅｈｅｉｓ、Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ、及びＣｈｅｍＴｒａｄｅ Ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ、ＵＳＡから入手可能）として、ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）ＬＶ（ストック材料中の約２％水酸化アルミニウム含有量）を含む。０．６３％のＰＢＳを使用して更に希釈すると、最終ワクチン組成物は、２ＭＬ用量当たり以下の組成量、５％（ｖ／ｖ）ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）ＬＶ、２５％（ｖ／ｖ）の「２０％Ａｍｐｈｉｇｅｎ」、すなわち、更に４倍に希釈される）、及び０．０１％（ｗ／ｖ）のメルチオレートを含有する。

当該技術分野で理解されるように、成分の添加の順序は、同等の最終ワクチン組成物を提供するために変動させることができる。例えば、緩衝液中のウイルスの適切な希釈物を調製することができる。次いで、実際の最終生成物中に所望の５％（ｖ／ｖ）濃度のＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）ＬＶを可能にするために、ブレンドしながら、適切な量のＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）ＬＶ（約２％の水酸化アルミニウム含有量）ストック溶液を添加することができる。調製した後、この中間ストック材料を、適切な量の「２０％Ａｍｐｈｉｇｅｎ」ストック（一般に上述したように、すでに必要量のＴｗｅｅｎ８０及びＳｐａｎ８０を含有する）と組み合わせて、２５％（ｖ／ｖ）の「２０％Ａｍｐｈｉｇｅｎ」を有する最終生成物を再び達成する。最終的に、適切な量の１０％メルチオレートを添加することができる。

本発明のワクチン接種組成物は、抗原の総用量が、好ましくは、上記の抗原用量と比較して１００倍（上又は下）、及び最も好ましくは１０倍以下（上又は下）変動し得るように、配合成分の全てにおける変動を可能にする。同様に、界面活性剤濃度（ＴＷＥＥＮ（登録商標）又はＳＰＡＮ（登録商標）にかかわらず）は、互いに独立して、最大１０倍まで変動させてもよく、又はそれらは、当該技術分野でよく理解されているように、適切な濃度の類似の材料によって置き換えられて、完全に欠失させてもよい。

最終生成物中のＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）濃度は、まず、他の多くの製造業者（すなわち、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）、Ｂｒｅｎｎｔａｇ；Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能な同等の材料を使用することによって、又はＣＧ、ＨＰＡ、又はＨＳなどのＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）製品ラインにおいて追加の変形形態を使用することによって変動させることができる。ＬＶを例として使用して、その最終的に有用な濃度は、０％～２０％を含み、２～１２％がより好ましく、４～８％が最も好ましく、同様に、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）の最終濃度（「２０％Ａｍｐｈｉｇｅｎ」の％で表される）は、好ましくは２５％であるが、この量は５～５０％、好ましくは２０～３０％で変動させることができ、最も好ましくは約２４～２６％であり得る。

本発明の実践によれば、本発明のアジュバント製剤で使用される油は、好ましくは鉱物油である。本明細書で使用される場合、「鉱物油」という用語は、蒸留技法を介してワセリンから得られる液体炭化水素の混合物を指す。この用語は、「液状パラフィン」、「液体ワセリン」、及び「白色鉱物油」と同義である。この用語はまた、「軽鉱物油」、すなわち、ワセリンの蒸留によって同様に得られるが、白色鉱物油よりもわずかに低い比重を有する油を含むことが意図される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８８ ａｎｄ １３２３）を参照のこと。鉱物油は、様々な商業的供給源、例えば、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｐａ．）、ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）から得ることができる。好ましい鉱物油は、ＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）の名前で市販されている軽鉱物油である。

本発明の免疫原性及びワクチン組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態の薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は安定剤を更に含むことができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２００５，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ）を参照のこと。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、投薬量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（水銀（（ｏ－カルボキシフェニル）チオ）エチルナトリウム塩（ＴＨＩＯＭＥＲＳＡＬ（登録商標））、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールなどの）；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストランを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；並びに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、若しくはＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤を含む。

本発明のワクチンは、任意選択で、本発明のウイルス、感染性ＤＮＡ分子、プラスミド、又はウイルスベクターの徐放のために製剤化され得る。そのような徐放製剤の例としては、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどの、生体適合性ポリマーの複合体と組み合わせたウイルス、感染性ＤＮＡ分子、プラスミド、又はウイルスベクターが挙げられる。薬物送達ビヒクルにおける分解性ポリマーの構造、選択、及び使用は、いくつかの刊行物で概説されており、Ａ．Ｄｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３：２７９－２９２を含む（参照により本明細書に組み込まれる）。薬学的製剤におけるポリマーの選択及び使用に関する追加のガイダンスは、当該技術分野で知られているテキスト、例えば、更に参照により本明細書に組み込まれるＭ．Ｃｈａｓｉｎ ａｎｄ Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ（ｅｄｓ），１９９０，“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ”：Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４５，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹに見出すことができる。代替的に、又は追加的に、ウイルス、プラスミド、又はウイルスベクターは、投与及び効力を改善するためにマイクロカプセル化することができる。マイクロカプセル化抗原のための方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第３，１３７，６３１号、米国特許第３，９５９，４５７号、米国特許第４，２０５，０６０号、米国特許第４，６０６，９４０号、米国特許第４，７４４，９３３号、米国特許第５，１３２，１１７号、及び国際特許公開第９５／２８２２７号に記載される技法を含み、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる。

リポソームを使用して、ウイルス、プラスミド、ウイルスタンパク質、又はウイルスベクターの徐放を提供することもできる。リポソーム製剤を作製及び使用する方法に関する詳細は、とりわけ、米国特許第４，０１６，１００号、米国特許第４，４５２，７４７号、米国特許第４，９２１，７０６号、米国特許第４，９２７，６３７号、米国特許第４，９４４，９４８号、米国特許第５，００８，０５０号、及び米国特許第５，００９，９５６号に見出すことができ、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる。

上述のワクチンのうちのいずれかの有効量は、低用量のウイルス、ウイルスタンパク質プラスミド、又はウイルスベクターから開始し、次いで、効果を監視しながら投薬量を増加させる、従来の手段によって決定することができる。有効量は、ワクチンの単回投与後、又はワクチンの複数回投与後に得ることができる。動物当たりの最適用量を決定するときに、知られている要因を考慮することができる。これらは、動物の種、サイズ、年齢、及び一般状態、動物における他の薬物の存在などを含む。実際の投薬量は、好ましくは、他の動物研究からの結果を考慮した後に選ばれる。

適切な免疫応答が達成されたかどうかを検出する１つの方法は、ワクチン接種後の動物におけるセロコンバージョン及び抗体力価を決定することである。もしあれば、ワクチン接種のタイミング及びブースターの数は、好ましくは、全ての関連する要因の分析に基づいて、医師又は獣医によって決定され、これらのうちのいくつかは、上述されている。

ブタのワクチン接種に関連する本発明の好ましい例では、動物に対する最適な年齢目標は、約１～２１日であり、これは、豚肺炎マイコプラズマ又は豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスに対してなどの他のスケジュール化されたワクチン接種にも対応し得る。追加的に、繁殖雌豚のための好ましいワクチン接種スケジュールには、同様の用量が含まれ、毎年の再接種スケジュールが含まれる。

投薬
好ましい臨床的適応は、繁殖雌豚及び未経産豚の両方の分娩前の処置、制御、及び予防、続いて子豚のワクチン接種のためのものである。代表的な例（雌豚及び未経産豚の両方に適用可能）では、単回用量のワクチンが使用されるが、当然、必要に応じて２回用量のワクチン接種レジメンも想定される。

用量の実際の体積は、ワクチンがどのように製剤化されるかの関数であり、実際に投薬する量は、動物のサイズも考慮して、０．０５～５ＭＬの範囲である。単回用量ワクチン接種も適切である。ワクチン中の仮性狂犬病ウイルスの量は、用量当たり１０^４．５ＴＣＩＤ_５０～１０^８ＴＣＩＤ_５０、好ましくは用量当たり１０^５～１０^７ＴＣＩＤ_５０、より好ましくは用量当たり１０^５．５～１０^５．５ＴＣＩＤ_５０である。

好ましくは、単回投与のみが保護を付与するのに十分である。しかしながら、２回用量レジメンが必要な場合、ブースター用量は、任意のその後の分娩の２～４週間前に与えることができる。筋肉内ワクチン接種（全ての用量）が好ましいが、用量のうちの１つ以上が皮下的に与えられ得る。経口投与も好ましい。ワクチン接種はまた、計画的又は自然感染によって実現されるように、投与済みの動物、及び未投与の動物においても有効であり得る。

更なる好ましい例では、雌豚又は未経産豚は、分娩の５週間前次いで分娩２週間前に、筋肉内又は経口でワクチン接種される。本発明のプロトコルはまた、すでに血清反応陽性の雌豚及び未経産豚、並びにまた子豚及び雄豚の処置に適用可能である。ブースターワクチンも与えることができ、これらは異なる投与経路を介してもよい。任意のその後の分娩の前に母豚に再ワクチン接種することが好ましいが、それにもかかわらず、本発明のワクチン組成物は、母豚が以前の分娩と関連してのみワクチン接種された場合でも、依然として、抗体の継続的な受動的伝達を介して子豚に保護を提供することができる。

次いで、子豚は、生後１日目に早くもワクチン接種することができることに留意されたい。例えば、子豚は、３週齢のブースター用量の有無にかかわらず、特に、親雌豚が、繁殖前にワクチン接種されているが、分娩前にワクチン接種されなかった場合、１日目にワクチン接種することができる。子豚ワクチン接種はまた、親雌豚が自然感染又は計画的感染のいずれかに起因して以前に投与済みではなかった場合に有効であり得る。母親が以前にウイルスに曝露されていないか、又は分娩前にワクチン接種されていないかのいずれかのとき、子豚のワクチン接種も有効であり得る。

他の態様では、ワクチンは、約６日齢以上、又は約１４日齢以上、又は約２１日齢以上、又は約２８日齢以上、又は約３５日齢以上、又は約４２日齢以上である子豚に投与され得る。

イノシシ（典型的には、繁殖目的で飼育されている）は、６か月ごとに１回ワクチン接種される必要がある。用量の変動は、当該技術分野の実践内で望ましい。本発明のワクチンは、妊娠した動物（全３期）及び新生児ブタで使用するのに安全であることに留意されたい。本発明のワクチンは、再び新生児ブタを含む最も敏感な動物でさえも許容される安全性のレベル（すなわち、死亡率なし、一過性の軽度の臨床的徴候又は新生児ブタに正常な徴候のみ）に弱毒化される。当然、ＰＲＶ流行及び持続性低レベルＰＲＶ発生の両方からブタの群れを保護する観点から、持続的な雌豚ワクチン接種のプログラムは非常に重要なものである。ＰＲＶ ＭＬＶで免疫化された雌豚又は未経産豚は、ＰＲＶ関連疾患及び死亡から子豚を保護するＰＲＶ特異的ＩｇＡを含む、子豚への免疫を受動的に受動的伝達することが理解されるであろう。追加的に、一般に、ＰＲＶ ＭＬＶで免疫化された豚は、量及び／若しくは持続時間が減少するか、又はそれらの糞便中へのＰＲＶの排出から保護され、更に、ＰＲＶ ＭＬＶで免疫化された豚は、ＰＲＶの死亡、生殖、神経、及び呼吸器の病態が挙げられるが、これらに限定されない、ＰＲＶの臨床的病態から保護され、更に、ＰＲＶ ＭＬＶは、ＰＥＤＶ伝送サイクルを停止又は制御するのに役立つであろう。

また、本発明のワクチンでワクチン接種された動物は、２１日以下などの任意の大幅な屠殺の保留なしに、ヒトの消費にも直ちに安全であることに留意されたい。

治療的に提供されるとき、ワクチンは、実際の感染の徴候の検出時に有効量で提供される。組成物は、その投与がレシピエントによって許容され得る場合、「薬理学的に許容される」と言われる。そのような組成物は、投与される量が生理学的に有意である場合、「治療又は予防有効量」で投与されると言われる。

本明細書に記載されるような薬学的組成物を使用して、意図される目的を達成する任意の手段によって、本発明の少なくとも１つのワクチン又は免疫原性組成物を投与することができる。例えば、そのような組成物の投与経路は、非経口、経口、口鼻、鼻腔内、気管内、局所、皮下、筋肉内、経皮、皮内、腹腔内、眼内、及び静脈内投与によるものであり得る。本発明の一実施形態では、組成物は、筋肉内で投与される。非経口投与は、ボーラス注入によるもの、又は経時的に、漸進的な灌流によるものであり得る。注射器、点滴器、無針注入デバイス、パッチなどを含む任意の好適なデバイスを使用して、組成物を投与してもよい。使用のために選択される経路及びデバイスは、アジュバント、抗原、及び対象の組成に依存し、そのようなものは、当業者によく知られている。経口又は代替的に皮下である投与が好ましい。経口投与は、直接、水を介した、又は飼料（固体又は液体飼料）を介したものであり得る。液体形態で提供されるとき、ワクチンは、再構成して凍結乾燥されるか、あるいは飼料に直接添加するか（混ぜ込むか、又は上からかける）、又は別の方法で水若しくは液体飼料に添加するためのペーストとして提供され得る。

診断キット
本発明はまた、診断キットを提供する。このキットは、ＰＲＶウイルスの野外株に自然に感染したブタ動物と、本明細書に記載されるＰＲＶワクチンのうちのいずれかでワクチン接種されたブタ動物とを区別するために有益であり得る。キットはまた、ＰＲＶウイルスの野外株に潜在的に感染した動物が、臨床症状の存在に先行して検出され、群れから除外されるか、又は投与済み動物若しくはワクチン接種された動物から隔離されたままにすることができるため、有益なものであり得る。

キットは、特定のＰＲＶウイルスの特定の成分に対する抗体の存在についてブタ動物からの試料を分析するための試薬を含む。本発明の診断キットは、成分として、野外株に存在するが目的のワクチンには存在しない又は逆もまた同様の本発明の変異体ＰＲＶ株からのペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）又はペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含むことができ、そのような好適なペプチドドメインの選択は、広範なアミノ酸配列決定によって可能になる。そのようなペプチドは、名前を挙げると、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、「サンドイッチ」アッセイ、沈降反応、ゲル拡散免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、蛍光イムノアッセイ、タンパク質Ａイムノアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイが挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野で知られている任意のイムノアッセイシステムで使用され得るが、いくつかの米国特許第４，６２９，７８３号及びその中で引用される特許もまた、好適なアッセイを記載している。

例えば、キットは、非修飾のＴＫ、ｇＥ、及び／又はｇＩタンパク質に存在し、任意選択で修飾ＵＳ１、ＵＳ２、及び／又はＵＳ９遺伝子の生成物に存在し、修飾遺伝子の発現生成物には非存在である免疫原性ペプチドを含有し得る。ＰＲＶに感染している疑いのある動物の試料との接触時に、ペプチドがこれらのタンパク質のうちの１つに対して抗体を結合する場合、これは、動物が感染していることを示している。結合の非存在は、動物が感染していないが、本発明のワクチンでワクチン接種されている可能性があることを示す。

キットはまた、ＰＲＶの弱毒化株及び野生型株の両方に存在するペプチドを含有し得る。そのようなペプチドの好適な非限定的な例としては、ＵＬ５３、ＵＬ４９．５、ＵＬ２７、ＵＬ３４遺伝子によってコードされたエンベロープタンパク質が挙げられる。ＰＲＶに感染している疑いのある動物の試料との接触時に、ペプチドがこれらのタンパク質のうちの１つに対して抗体を結合する場合、これは、動物が感染しているか、又はワクチン接種されていることを示している。結合の非存在は、動物が感染していないか、又はワクチン接種されていないことを示す。

以下の実施例は、上記の発明を例示することを意図しており、その範囲を狭めるものとして解釈されるべきではない。当業者であれば、実施例が、本発明を実践することができる多くの他の方法を示唆することを容易に認識するであろう。本発明の範囲内に留まりながら、数多く変形形態及び修正形態が行われ得ることを理解すべきである。

実施例１
ＰＲＶ抗原及び抗体の両方について陰性の子豚を、各群において７頭の子豚を有する群に割り当てた。子豚には、市販試料、及び水への自由なアクセスが提供された。

株Ｍ１７０７（配列番号３を含み、ＴＫをコードするＵＬ２３遺伝子のヌクレオチド４８０～８４６が欠失している）を、ＭＥＭ、ゼラチン、ＮＺアミン、グルタミン、スクロース、デキストラン４０、ラクトース、ソルビトール、及びペニシリン－ストレプトマイシンで製剤化した。

豚の第２の群に、株Ｂａｒｔｈａ Ｋ６１をワクチン接種した。豚の第３の群に、ＤＭＥＭをワクチン接種した。ワクチン接種方法は、頸部への筋肉内注射であった。処置群に対する接種体積は、全て子豚当たり１ｍＬであった。接種後、豚の直腸温度を測定することを含む臨床的観察を毎日実施した。

データは、Ｆ３５ラボ製品レベルの株Ｍ１７０７が３～４週齢の子豚（７頭の豚を処置）及び７週齢の目標年齢の子豚（１４頭の豚を処置）において＞１０^６で安全であることを示した。３つの異なるバッチのラボ製品による^５ＴＣＩＤ_５０／豚処置。対照ブタを含む全てのブタの体温は正常であり、１４日間の観察期間内に臨床的徴候を示さなかった。

実施例２
ＰＲＶ抗原及び抗体の両方について陰性の子豚を、各群において７頭の子豚を有する群に割り当てた。子豚には、市販試料、及び水への自由なアクセスが提供された。

ＰＲＶ株Ｍ１７０７の３つのロット（ロットＡ、ロットＢ、及びロットＣ）を調製した。ウイルスを、ＭＥＭ、ゼラチン、ＮＺアミン、グルタミン、スクロース、デキストラン４０、ラクトース、ソルビトール、及びペニシリン－ストレプトマイシンで製剤化した。

０日目に、用量当たり１０^５．０ＴＣＩＤ_５０の量のロットのうちの１つの製剤を筋肉内注入して、豚を処置した。対照群を、ＤＭＥＭのみで処置した。接種後、豚の直腸温度を毎日測定した。臨床症状の観察では、全ての豚が正常な体温、良好な食欲、正常な精神状態、呼吸器及び消化器の症状なし、並びに２１日間の観察期間内に神経学的症状なし、ということが見出された。３つのワクチン接種群及び対照群を、２１日目に、株ＦＳ２１ＰＦ１１１５、２ｍＬ（１０^５．０ＴＣＩＤ_５０）で鼻腔内攻撃した。

保護を、症状の重症度（又は非存在）によって決定した。３つの対照群では、２０頭の豚のうち１９頭（ロットＡ及びＢの各々において７頭のうち７頭、ロットＣにおいて７頭のうち６頭）が保護された。対照群では、７頭の豚のうち保護されたのは０頭であった。

実施例３
ＰＲＶ抗原及び抗体の両方について陰性の子豚を、各群において５頭の子豚を有する群に割り当てた。子豚には、市販試料、及び水への自由なアクセスが提供された。

ＰＲＶ株１７０７を、ＭＥＭ、ゼラチン、ＮＺアミン、グルタミン、スクロース、デキストラン４０、ラクトース、ソルビトール、及びペニシリン－ストレプトマイシンで製剤化した。各ワクチン接種されたブタは、用量当たり１０^５．０ＴＣＩＤ_５０の抗原を受け取った。対照群を、ＤＭＥＭで処置した。製剤を筋肉内注入によって投与した。ワクチン接種群及び対照群の両方に、ワクチン接種の６か月後、株ＦＳ２１ＰＦ１１１５、２ｍＬ（１０^６．０ＴＣＩＤ_５０）で鼻腔内攻撃した。

免疫の持続時間を、症状の重症度（又は非存在）によって決定した。ワクチン接種群の５頭のうち５頭の豚が保護的力価を示し、対照群のいずれも保護的力価を示さなかった。

Claims (31)

1. 弱毒化ブタヘルペスウイルス１（仮性狂犬病ウイルス）であって、そのＴＫ、ｇＩ、及びｇＥ遺伝子が、親野外株に対して修飾されており、その結果得られたウイルスが、ブタ動物を毒性の仮性狂犬病ウイルスによる攻撃から保護する生ワクチンとしての使用に安全かつ有効であり、前記親株が、株ＦＳ１８（配列番号１）、株ＪＳ２０１２（配列番号２）、株ＴＪ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＪ７８９１８２）、株ＨｅＮ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ０９８５３４）、株ＨＬＪ８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８２４７７１）、株ＨＮ１２０１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ７２２０２２）、及び配列番号１又は配列番号２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列からコードされる任意の株からなる群から選択される、弱毒化ブタヘルペスウイルス１（仮性狂犬病ウイルス）。
2. ＵＳ１、ＵＳ２、及びＵＳ９遺伝子のうちの１つ以上の弱毒化修飾を更に含むが、ただし、ＵＳ２及びＵＳ９遺伝子のうちの少なくとも１つが修飾されていないことを条件とする、請求項１に記載のウイルス。
3. ＵＳ１、ＵＳ２、及びＵＳ９遺伝子が、非修飾である、請求項１に記載のウイルス。
4. 前記弱毒化遺伝子修飾が、完全若しくは部分的な欠失、フレームシフト変異、ヌクレオチド交換、又は挿入を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のウイルス。
5. 前記ＦＳ１８株（配列番号１によってコードされる）又は前記ＪＳ２０１２株（配列番号２によってコードされる）に由来する、請求項１～４のいずれか一項に記載のウイルス。
6. 配列番号３、又はそれと少なくとも８５％同一である配列によってコードされており、前記配列が、
   ａ）ＵＬ２３遺伝子ヌクレオチド４８０～８４６の欠失（分離株Ｍ１７０７）、又は
   ｂ）ＵＬ２３遺伝子ヌクレオチド５２６～６０７の欠失（分離株Ｍ１７０５）、又は
   ｃ）ＵＬ２３遺伝子ヌクレオチド２８０～７２３の欠失（分離株Ｍ１７０８）、又は
   ｄ）ＵＬ２３遺伝子ヌクレオチド３６４～６１５の欠失（分離株Ｍ１７１０）、又は
   ｅ）「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、若しくは「ｄ」の欠失のうちのいずれかを含むＵＬ２３遺伝子における欠失、を含む、請求項１に記載のウイルス。
7. 前記ｇＥ、ＵＳ９、及びＵＳ２遺伝子が、完全に欠失し、前記ｇＩ及びＴＫ遺伝子が、少なくとも部分的に欠失し、ＵＳ１遺伝子の１つ以上のコピーが、少なくとも部分的に欠失している、請求項２に記載のウイルス。
8. 弱毒化ブタヘルペスウイルスＩ（仮性狂犬病ウイルス）であって、前記ウイルスが、株ＦＳ１８（配列番号１）、株ＪＳ２０１２（配列番号２）、株ＴＪ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＪ７８９１８２）、株ＨｅＮ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ０９８５３４）、株ＨＬＪ８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ８２４７７１）、若しくは株ＨＮ１２０１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ７２２０２２）、又は配列番号１若しくは配列番号２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列からコードされる任意の株に由来し、前記弱毒化物が、ＤＮＡ配列からコードされており、前記ＤＮＡ配列が、以下の欠失：
   ｇＥ遺伝子については、ＯＲＦのヌクレオチドの全てが欠失し、
   ｇＩ遺伝子については、１１０１ヌクレオチドＯＲＦの少なくともヌクレオチド２６９～１１０１が欠失し、
   ＴＫ遺伝子については、９６３ヌクレオチドＯＲＦから、５２６～６０７位、４８０～８４６位、２８０～７２３位、及び３６４～６１５位からなる前記ヌクレオチド配列から欠失が選択される、を含む、弱毒化ブタヘルペスウイルスＩ（仮性狂犬病ウイルス）。
9. ＵＳ２遺伝子の完全な欠失、ＵＳ９遺伝子の完全な欠失、並びにＵＳ１遺伝子の１２６０ヌクレオチドＯＲＦの少なくともヌクレオチド９０９～１０３４及び／又は少なくともヌクレオチド３０１～３１５の欠失を更に含む、請求項８に記載の弱毒化ウイルス。
10. 配列番号３（Ｍ１７０７）、又はそれと少なくとも８５％同一の配列によってコードされている、請求項９に記載の弱毒化ウイルス。
11. ＵＳ１、ＵＳ２、及びＵＳ９遺伝子が、修飾されていない、請求項８に記載の弱毒化ウイルス。
12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の生ウイルスと、薬学的に許容される担体と、を含む、ワクチン組成物。
13. 前記ウイルスが、死滅した形態で提供される、請求項１～７のいずれか一項に記載のウイルスを含むワクチン組成物。
14. ブタ動物にワクチン接種して、毒性の仮性狂犬病ウイルスによる攻撃に対する保護を提供する方法であって、請求項１２又は１３に記載のワクチン組成物の１回以上の用量を投与することを含む、方法。
15. 単回用量の前記ウイルスＭ１７０７が、使用され、前記投薬量が、１０^４．５～１０^９ＴＣＩＤ_５０を提供する、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ワクチンが、１０^７ＴＣＩＤ_５０の単回投与処置で子豚に投与された場合に安全である、請求項１４に記載の方法。
17. 前記ブタ動物が、雄豚、雌豚、未経産豚、又は子豚である、請求項１４に記載の方法。
18. 前記ＵＳ－１遺伝子のヌクレオチド配列における欠失が、配列ｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃ ｔｃｇｔｃ（配列番号４）、又は前記配列が含まれる前記ＵＳ－１遺伝子の任意のより大きな配列である、請求項２に記載のウイルス。
19. 前記ＵＳ－１遺伝子のヌクレオチド配列における欠失が、配列ｃｇａｇ ｇａａｇａｇｇａａｇ ａｇｇａａｇａｇｇａ ａｇａｃｇｇｇｇａｃ ｇａｇｇａｃｇａｇｇａａｇａｇｇａｇｇａ ｃｇａｇｇａａｇａｇ ｇａｇｇａｃｇａｇｇ ａａｇａｇｇａｇｇａ ｃｇａｇｇａａｇａｇ ｇａｇｇａｃｇａｇｇ ａａｇａｇｇａｇｇａ ｃｇａｇｇａａｇａｇ ｇａ（配列番号５）、又は前記配列が含まれる前記ＵＳ－１遺伝子の任意のより大きな配列である、請求項２に記載のウイルス。
20. ＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列における欠失が、配列ｇｃｇｇｃｇｃｃｔ ｇｃｇｃｇｃｃｃｇｃ ｇｃｇｃｇｃｇｃｃｇ ｇｇｇａｇｃａｃｇｔ ｇｇａｃｇｃｇｃｇｃ ｃｔｇｃｔｃａｃｇｇ ｃｃｃｔｇｃｇｃａａ ｃｇｔｃｔａｃｇｃｃ ａｔｇｃｔｇｇｔｃａ ａｃａｃｇｔｃｇｃｇ ｃｔａｃｃｔｇａｇｃ ｔｃｇｇｇｇｃｇｃｃ ｇｃｔｇｇｃｇｃｇａ ｃｇａｃｔｇｇｇｇｇ ｃｇｃｇｃｇｃｃｇｃ ｇｃｔｔｃｇａｃｃａ ｇａｃｃｇｔｇｃｇｃ ｇａｃｔｇｃｃｔｃｇ ｃｇｃｔｃａａｃｇａ ｇｃｔｃｔｇｃｃｇｃ ｃｃｇｃｇｃｇａｃｇ ａｃｃｃｃｇａｇｃｔ ｃｃａｇｇａｃａｃｃ ｃｔｃｔｔｃｇｇｃｇ ｃｇｔａｃａａｇｇｃ ｇｃｃｃｇａｇｃｔｃ ｔｇｃｇａｃｃｇｇｃ ｇｃｇｇｇｃｇｃｃｃ ｇｃｔｃｇａｇｇｔｇ ｃａｃｇｃｇｔｇｇｇ ｃｇａｔｇｇａｃｇｃ ｇｃｔｃｇｔｇｇｃｃ ａａｇｃｔｇｃｔｇｃ ｃｇｃｔｇｃｇｃｇｔ ｃｔｃｃａｃｃｇｔｃ ｇａｃｃｔｇｇｇｇｃ ｃｃｔｃｇｃｃ（配列番号６）、又は前記配列が含まれる前記ＴＫ遺伝子の任意のより大きな配列である、請求項２に記載のウイルス。
21. ＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列における欠失が、配列ＪＳ２０１２ヌクレオチド５２６～６０７（ｃｇｃｃｔｇｃｔｃａｃｇｇｃｃｃｔｇｃｇｃａａｃｇｔｃｔａｃｇｃｃａｔｇｃｔｇｇｔｃａａｃａｃｇｔｃｇｃｇｃｔａｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｇｇｇｃｇｃｃｇｃｔｇｇｃｇ、配列番号７）、又は前記配列が含まれる前記ＴＫ遺伝子の任意のより大きな配列である、請求項２に記載のウイルス。
22. ＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列における欠失が、配列ＪＳ２０１２ヌクレオチド２８０～７２３（ｇｇｇｃｃｃｇｃｇｇｔｃｇａｇｇｇｃｃｃｇｃｃｃｇａｇａｔｇａｃｇｇｔｃｇｔｃｔｔｔｇａｃｃｇｃｃａｃｃｃｇｇｔｇｇｃｃｇｃｇａｃｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃｃｃｇｃｔｇｇｃｇｃｇｃｔｔｃａｔｃｇｔｃｇｇｇｇａｃａｔｃａｇｃｇｃｇｇｃｇｇｃｃｔｔｃｇｔｇｇｇｃｃｔｇｇｃｇｇｃｃａｃｇｃｔｇｃｃｃｇｇｇｇａｇｃｃｃｃｃｃｇｇｃｇｇｃａａｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｃｃｔｃｇｃｔｇｇａｃｃｃｇｇａｃｇａｇｃａｃｃｔｇｃｇｇｃｇｃｃｔｇｃｇｃｇｃｃｃｇｃｇｃｇｃｇｃｇｃｃｇｇｇｇａｇｃａｃｇｔｇｇａｃｇｃｇｃｇｃｃｔｇｃｔｃａｃｇｇｃｃｃｔｇｃｇｃａａｃｇｔｃｔａｃｇｃｃａｔｇｃｔｇｇｔｃａａｃａｃｇｔｃｇｃｇｃｔａｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｇｇｇｃｇｃｃｇｃｔｇｇｃｇｃｇａｃｇａｃｔｇｇｇｇｇｃｇｃｇｃｇｃｃｇｃｇｃｔｔｃｇａｃｃａｇａｃｃｇｔｇｃｇｃｇａｃｔｇｃｃｔｃｇｃｇｃｔｃａａｃｇａｇｃｔｃｔｇｃｃｇｃｃｃｇｃｇｃｇａｃｇａｃｃｃｃｇａｇｃｔｃｃａｇｇａｃａｃｃｃｔｃｔｔｃｇｇｃｇｃｇｔａｃ、配列番号８）、又は前記配列が含まれる前記ＴＫ遺伝子の任意のより大きな配列である、請求項２に記載のウイルス。
23. ＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列における欠失が、配列ＪＳ２０１２ヌクレオチド３６４～６１５（ｃｇｃｔｔｃａｔｃｇｔｃｇｇｇｇａｃａｔｃａｇｃｇｃｇｇｃｇｇｃｃｔｔｃｇｔｇｇｇｃｃｔｇｇｃｇｇｃｃａｃｇｃｔｇｃｃｃｇｇｇｇａｇｃｃｃｃｃｃｇｇｃｇｇｃａａｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｃｃｔｃｇｃｔｇｇａｃｃｃｇｇａｃｇａｇｃａｃｃｔｇｃｇｇｃｇｃｃｔｇｃｇｃｇｃｃｃｇｃｇｃｇｃｇｃｇｃｃｇｇｇｇａｇｃａｃｇｔｇｇａｃｇｃｇｃｇｃｃｔｇｃｔｃａｃｇｇｃｃｃｔｇｃｇｃａａｃｇｔｃｔａｃｇｃｃａｔｇｃｔｇｇｔｃａａｃａｃｇｔｃｇｃｇｃｔａｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｇｇｇｃｇｃｃｇｃｔｇｇｃｇｃｇａｃｇａｃｔｇｇ、配列番号９）、又は前記配列が含まれる前記ＴＫ遺伝子の任意のより大きな配列である、請求項２に記載のウイルス。
24. 前記ＵＳ－１遺伝子のヌクレオチド配列における欠失が、配列番号４に類似するＦＳ１８からの配列、又は前記配列が含まれる前記ＵＳ－１遺伝子の任意のより大きな配列である、請求項２に記載のウイルス。
25. 前記ＵＳ－１遺伝子のヌクレオチド配列における欠失が、配列番号５に類似するＦＳ１８からの配列、又は前記配列が含まれる前記ＵＳ－１遺伝子の任意のより大きな配列である、請求項２に記載のウイルス。
26. ＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列における欠失が、配列ＦＳ１８／Ｍ１７０７ヌクレオチド４８０～８４６（配列番号６）、又は前記配列が含まれる前記ＴＫ遺伝子の任意のより大きな配列である、請求項２に記載のウイルス。
27. ＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列における欠失が、配列ＦＳ１８／Ｍ１７０５ヌクレオチド５２６～６０７（配列番号７）、又は前記配列が含まれる前記ＴＫ遺伝子の任意のより大きな配列である、請求項２に記載のウイルス。
28. ＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列における欠失が、配列ＦＳ１８／Ｍ１７０８ヌクレオチド２８０～７２３（配列番号８）、又は前記配列が含まれる前記ＴＫ遺伝子の任意のより大きな配列である、請求項２に記載のウイルス。
29. ＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列における欠失が、配列ＦＳ１８／Ｍ１７１０ヌクレオチド３６４～６１５（配列番号９）、又は前記配列が含まれる前記ＴＫ遺伝子の任意のより大きな配列である、請求項２に記載のウイルス。
30. 請求項１又は２に記載のウイルスをコードする、分離されたＤＮＡポリヌクレオチド分子。
31. 宿主細胞を直接トランスフェクトすることができるプラスミドであって、請求項３０に記載のＤＮＡポリヌクレオチド分子と、前記コード配列の転写を可能にすることができるプロモーターと、を含む、プラスミド。