JP2024511155A - 多価タンパク質およびスクリーニング法 - Google Patents

多価タンパク質およびスクリーニング法 Download PDF

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Abstract

本明細書では、治療薬として有用であり、新しい治療用化合物の特定に有用な多価タンパク質スキャフォールドが提供される。本発明は、複数の結合ドメインおよび構造ドメインを有するマルチドメインポリペプチド構築物にも関する。また、本明細書では、本提供の多価タンパク質スキャフォールドを使用して、新しい候補治療薬を特定するための方法、およびそれにより特定された新しい治療薬が提供される。

Description

本発明は、多価タンパク質スキャフォールド、ならびに標的分子の組合せの表現型スクリーニング用のモジュール系としてのおよび治療薬としてのそれらの使用に関する。本発明は、複数の結合ドメインおよび構造ドメインを含むマルチドメインポリペプチド構築物にも関する。本発明は、本記載のタンパク質スキャフォールドを使用して新しい治療薬を特定するための方法、およびそのようにして特定することができる治療薬にも関する。
多くの病理学的状態に対して新しい治療薬を特定する必要性が継続的に存在する。
タンパク質ベース療法は、多くの一般的疾患に対処するための魅力的なアプローチを提供している。そのような治療薬は臨床的に高い成功を収めていることが証明されており、多くのタンパク質治療薬は臨床使用が世界中で規制当局により承認されている。
タンパク質ベース治療薬は種々の様式：例えば、欠損または異常なタンパク質を置き換えることにより；既存の経路を強化することにより；治療薬有用性に新規機能または活性を提供することにより；分子または生物を妨害することにより；および放射性核種、細胞傷害薬、またはエフェクタータンパク質などの他の化合物またはタンパク質を送達することにより作用することができる。治療用タンパク質は、それらの物理的および構造的特性に基づきグループ分けすることができ、例えば、抗体ベース薬、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、遺伝子操作タンパク質スキャフォールド、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、および血栓溶解剤などに分けることができる。治療用タンパク質は、それらの分子活性機序に基づき分類することもできる。例えば、モノクローナル抗体は、典型的には、標的に非共有結合で結合することにより作用する。酵素は、標的の共有結合に影響を及ぼすことができる。他のタンパク質、例えば血清アルブミンは、いかなる特異的相互作用も示さずに活性を発揮することができる。
臨床的に成功を収めているタンパク質ベース治療薬の１つのクラスは、治療用抗体である。抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られており、多くの疾患状態に対する有望な治療法である評価されている。例えば、モノクローナル抗体療法は、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、および種々の形態のがんを含む疾患を治療するために使用されている。市販されている抗体治療薬としては、ムロモマブ（muromomab）、アブシキシマブ、リツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、イブリトモマブ、アダリムマブ、アレファセプト、オマリズマブ、トシツモマブ、エファリズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、およびセルトリズマブが挙げられる。
抗体は、典型的には、Ｆｃ領域および２つの抗原結合（Ｆａｂ）領域を形成する４つのポリペプチド鎖を含む。各Ｆａｂ領域は、パラトープを形成して抗原と接触する可変領域（Ｆｖ）を含む。天然に存在する抗体は、典型的には、可変領域において対称的な結合を示す。しかしながら、この制限は、典型的には、可変領域にて所与の抗体を標的にすることができるのは単一の受容体タイプ（または他の標的）のみであることを意味する。
これに対処することを試みるために、最近では二重特異性抗体に関心が多く集まっている。二重特異性抗体は、２つのＦａｂ部位の各々が２つの異なる抗原に結合するという点で、従来の単一特異性抗体とは異なる。二重特異性抗体は、多くの場合、Ｉｇ様または非Ｉｇ様のいずれかであると分類され、後者は、化学的に連結されたＦａｂ領域からなっていてもよい。
二重特異性抗体は、臨床使用に向けて積極的に研究されている。市販されている二重特異性抗体の２つの例としては、Ｔ細胞を標的とするためのＣＤ３部位およびＢ細胞を標的とするＣＤ１９部位を両方とも含み、フィラデルフィア染色体陰性再発または難治性急性リンパ芽球性白血病の治療に有用である、Ｂｌｉｎｃｙｔｏという商標名で販売されているブリナツモマブ；ならびに血液凝固第ＩＸａ因子および第Ｘ因子の両方を標的とし、血友病Ａの治療に使用されるエミシズマブ（商標名Ｈｅｍｌｉｂｒａで販売されている）が挙げられる。二重特異性抗体は、一般的に、複数の細胞タイプと同時に結合するために、例えば腫瘍細胞受容体との結合および細胞傷害性免疫細胞の動員を同時に行うことにより使用される。
一部の二重特異性抗体は有望性を提供しているにも関わらず、問題が依然として残っている。抗体治療薬には、少なくともそれらのサイズ、および複雑なグリコシル化パターンを含む複雑な翻訳後修飾化学のため、高い生産コストが伴う。抗体生産には、哺乳動物細胞の非常に大規模な培養の使用、続いて徹底した精製ステップが必要であり、これが非常に高い生産コストに結び付き、こうした薬物の広範な使用が制限される。また、抗体には、不良な腫瘍標的化が伴うため、がん治療における使用が制限されている（例えば、マウス異種移植モデルでの研究により、典型的には、投与された抗体の２０％未満しか腫瘍と相互作用しないことが示されている）。抗体のＦｃ部分、例えばＩｇＧ抗体は、幾つかの細胞タイプの表面に発現される種々の受容体と相互作用することができ、それにより循環中のそれらの滞留性が増加する。抗体のサイズが大きいことは、ｉｎ ｖｉｖｏでの拡散が遅いことにも結び付く。ＩｇＧ様抗体は免疫原性であり、Ｆｃ受容体活性化を介して有害な下流免疫反応を引き起こす可能性がある。特に二重特異性抗体に関しては、以前に記載されている「ノブイントゥホール（knobs into holes）」というＩｇ様手法は、モジュール性が欠如しているため、多数の抗原結合ドメインのスクリーニングに応用するのは容易ではない。さらに、二重特異性抗体手法は、実際にはＦｖ／Ｆａｂ領域のスクリーニングに限定されるため、他の非免疫グロブリンタンパク質ドメインの療法的可能性を調査するためには使用されない。タンデム融合の非Ｉｇ様手法は、応用性がより広いが、大規模化は容易ではない。
Blanco-Toribio et al（MAbs. 2013 Jan 1; 5(1): 70-79）には、単一特異性および二重特異性六価トリマーボディ（trimerbody）の生成および特徴付けが記載されている「トリマーボディ」と称されるこの分子では、三量体化スキャフォールドとして、２つの可撓性リンカーによりフランキングされている、ヒトＸＶＩＩＩ型コラーゲン非コラーゲン性１（ＮＣ１）ドメインのＮ末端三量体化領域の修飾型が使用されている。著者らは、同じまたは異なる特異性を有する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を、三量体化スキャフォールドドメインのＮ末端およびＣ末端の両方に融合させることにより、トランスフェクト哺乳動物細胞により可溶性タンパク質として効率的に分泌される単一特異性または二重特異性六価分子を生成した。二重特異性抗ラミニン×抗ＣＤ３ Ｎ－／Ｃ－トリマーボディは、溶液中で三量体であることが見出された。この方法の１つ欠点は、必要とされるトランスフェクションの使用が必ずしも便利な生産方法ではないことである。
国際公開第２０２０／０１８８３４６号パンフレットには、２つの抗原結合ドメイン（「ＡＢＤ」）が、抗原結合タンパク質とイソペプチド連結を形成する２つまたはそれよりも多くのドメインで形成される融合タンパク質に共有結合で結合している二重特異性抗原結合タンパク質が記載されている。イソペプチド連結形成ドメインは、典型的には、Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ（「ＳＣ」）などのキャッチャードメイン（catcher domain）であり、得られる二重特異性タンパク質は、ＡＢＤ－ＳＣ－ＳＣ－ＡＢＤ形式である。
Brune et al 2017（Bioconjugate Chem. 2017, 28, 5, 1544-1551）には、ツイン抗原免疫（twin antigen immunization）のための直交反応性タンパク質を使用したプラグアンドディスプレイ（plug-and-display）合成アセンブリが記載されている。著者らは、多量体化コイルドコイルＩＭＸ３１３および２つの直交反応性スプリットタンパク質（split protein）を遺伝子操作することにより、二重アドレス可能な合成ナノ粒子を調製した。この構築物は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＩＭＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ形式であり、モジュール式プラットフォームを提供する。これにより、混合するだけで、ＳｐｙＴａｇ－抗原およびＳｎｏｏｐＴａｇ－抗原を粒子の反対側の面で多量体化することができる。
このように、こうした問題の一部またはすべてを克服する新しいタンパク質治療薬の迅速で大規模化可能な応用性の高い特定および設計を可能にする新しいパラダイムが必要とされている。特に、従来の抗体プラットフォームに匹敵する新しいプラットフォーム技術が必要とされている。
本発明者らは、上記に記載の問題を認識した。今や、非抗体アセンブリプラットフォームを使用して、新規治療薬をスクリーニング、特定、および開発するためのカスタマイズ可能で再現可能であり大規模化可能で応用性の高いスキャフォールドを提供することができることが認識されている。本明細書に記載の手法により、複数の異なるタンパク質の幾何学的形状、結合価、および／または機能性を、潜在的な療法効果について評価することが可能になる。
本発明者らの手法の一部は、好ましい特性を有するタンパク質構築物を開発するためのものであった。そうした構築物は、融合タンパク質として発現させることにより組換え的に調製してもよく、または化学コンジュゲートなどの当技術分野で公知の他の手段により成分ドメインを接合してもよい。特に、本発明者らは、有利なことに、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の両方を修飾して、２つの修飾末端を有するポリペプチドを提供することができることを特定した。修飾は、典型的には、各々が標的分子、例えば抗原結合領域またはイソペプチド結合形成領域に結合することができるポリペプチドドメインの付加である。異なる標的分子をＮ末端およびＣ末端に結合させて、いわゆる二重特異性結合構築物を提供することができる。得られるタンパク質構築物は、修飾Ｎ末端および修飾Ｃ末端で標的分子に結合することができる。本発明者らは、特に、遺伝子操作タンパク質構築物であって、Ｎ末端およびＣ末端は、同じ基本配向性を示しており、得られた構築物は、結合パートナーが同じ基本空間および配向性で存在する場合、例えばプレートもしくはビーズなどの固体表面にまたは細胞の表面に結合している場合、各末端の結合パートナーに結合することができる、遺伝子操作タンパク質構築物を示す。これは、単一ポリペプチド鎖の修飾Ｎ末端およびＣ末端を「シス」配向性で提供することであると称することができる。典型的には、シス配向性二重特異性構築物が提供される。こうしたタンパク質構築物の２またはそれよりも多くを組み合わせて、オリゴマータンパク質を形成することできる。
こうしたタンパク質構築物は、結合領域（例えば、抗原結合領域）などのエフェクター部分の有用な組合せをスクリーニングするために使用することができるコンビナトリアル系の作出を可能にする。さらに、有用な組合せが特定されたら、構築物を修飾して、コンビナトリアルスクリーニングに必要な特徴を除去する（または例えばリンカーと置き換える）ことができ、それにより、特定された好ましい組合せの結合領域を有するより単純なタンパク質構築物が提供される。こうした構築物は、１つよりも多くの構築物の単量体またはオリゴマーとして、治療薬、診断薬、または分析剤として特に有用であり得る。
したがって、本明細書では、
－ 複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコア；および
－ 少なくとも２つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも２つの第１の結合部位
を含む多価タンパク質スキャフォールドであって、
前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は、スキャフォールドの同じ面に位置する、
多価タンパク質スキャフォールドが提供される。
また、
－ 複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコア；
－ 少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも１つの第１の結合部位
を含む多価タンパク質スキャフォールドであって、
前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は、スキャフォールドの同じ面に位置し、
前記第１の結合部位は、第１のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第１のタンパク質ドメインを含み、前記第２の結合部位は、第２のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第２のタンパク質ドメインを含む、
多価タンパク質スキャフォールドが提供される。
さらに、
－ 複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコア、
－ 少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも１つの第１の結合部位
を含む多価タンパク質スキャフォールドであって、
前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は、スキャフォールドの同じ面に位置し、
前記オリゴマーコアは、抗体のＦｃ領域を含まない、
多価タンパク質スキャフォールドが提供される。
好ましくは、オリゴマーコアは、少なくとも３つのサブユニット単量体を含む。より好ましくは、オリゴマーコアは、３～６つのサブユニット単量体を含む。
好ましくは、一実施形態では、サブユニット単量体は非共有結合で一緒に付着している。好ましくは、別の実施形態では、サブユニット単量体は共有結合で一緒に付着している。好ましくは、サブユニット単量体が共有結合で一緒に付着している場合、サブユニット単量体は、遺伝子的に一緒に融合している。一部の実施形態では、サブユニット単量体は、組換え核酸からの単一のポリペプチド鎖として発現される。
一実施形態では、オリゴマーコアは、好ましくはホモオリゴマーコアである。そのような実施形態では、好ましくは、オリゴマーコアの各単量体は、少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位を含み、少なくとも１つの第１の結合部位は、少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である。好ましくは、一態様では、各単量体は、前記単量体の第１の末端に付着した第１の結合部位、および前記単量体の第２の末端にある第２の結合部位を含む。好ましくは、各単量体の第１の末端および第２の末端は、前記単量体の同じ面に位置する。好ましくは、別の態様では、各単量体は、前記単量体の第１の末端に付着した第１の結合部位、および前記第１の結合部位に付着した第２の結合部位を含む。
別の実施形態では、オリゴマーコアは、好ましくは、ヘテロオリゴマーコアである。好ましくは、そのような実施形態では、前記コアは、第１の結合部位を含む少なくとも１つの第１のサブユニット単量体、および第２の結合部位を含む少なくとも１つの第２のサブユニット単量体を含み、第１の結合部位は第２の結合部位に対して直交性である。
好ましくは、本発明では、本明細書で提供されるタンパク質スキャフォールドは、典型的には、各サブユニット単量体が、３００個未満のアミノ酸、好ましくは２００個未満のアミノ酸、より好ましくは１５０個未満のアミノ酸を含む。好ましくは、オリゴマーコアは、約１５０ｋＤａ未満、好ましくは約１００ｋＤａ未満、より好ましくは約７０ｋＤａ未満の分子量を有する。
一部の実施形態では、オリゴマーコアは抗体のＦｃ領域を含まない。一部の実施形態では、オリゴマーコアはＣＨ２ドメインを含まない。一部の実施形態では、オリゴマーコアはＣＨ３ドメインを含まない。一部の実施形態では、オリゴマーコアは、ＣＨ２ドメインを含まず、ＣＨ３ドメインを含まない。
好ましくは、オリゴマーコアおよび／またはスキャフォールドは、ヒト対象に投与しても免疫応答を生じさせない。これについては、本明細書でさらに詳しく説明する。
一部の実施形態では、オリゴマーコアおよび／もしくはスキャフォールドまたは構造ドメインは、ヒト対象に投与しても有害な免疫応答を生じさせない。例えば、構造ドメインに対する活性Ｂ細胞またはＴ細胞応答は引き起こされず、および／または構造ドメインは、免疫グロブリン受容体と特異的に結合もせず、抗体依存性細胞媒介性傷害（ＡＤＣＣ）を活性化もしない。
好ましくは、オリゴマーコアは、多量体タンパク質の可溶性多量体化構造要素を含む。好ましくは、多量体タンパク質は、コラーゲンＮＣ（非コラーゲン性）ドメイン（例えば、ＮＣ１ドメイン）、ＣｕｔＡ１、Ｃ１ｑ頭部ドメイン、ＴＮＦ、ｐ５３、フィブリノーゲン、Ｃ４、枯草菌（Bacillus subtillus）ＡｂｒＢ、またはそれらのホモログもしくはパラログを含む。
好ましくは、多量体タンパク質は、ＶＩＩＩ型コラーゲンＮＣ１（非コラーゲン性）ドメイン、Ｘ型コラーゲンＮＣ１（非コラーゲン性）ドメイン、Ｃ１ｑ頭部ドメイン、ＣｕｔＡ１タンパク質、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）もしくはマクロファージ遊走阻害因子２（ＭＩＦ－２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＬ１ＡもしくはＣＤ４０Ｌを含むＴＮＦファミリーメンバー、またはそれらのホモログもしくはパラログを含む。
好ましくは、多量体化構造要素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９、配列番号６０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号４２、配列番号３１、配列番号５８、または配列番号１９と、少なくとも３０％または少なくとも５０％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
好ましくは、第１の結合部位および／または前記第２の結合部位は、タンパク質ドメインを含む。典型的には、前記第１の結合部位は第１のタンパク質ドメインを含み、前記第２の結合部位は第２のタンパク質ドメインを含む。好ましくは、第１の結合部位および／または第２の結合部位は、それらが付着するサブユニット単量体に遺伝子的に融合されており、単一のポリペプチド鎖を形成する。
好ましくは、第１の結合部位は、第１のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第１のタンパク質ドメインを含む。好ましくは、前記第２の結合部位は、第２のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第２のタンパク質ドメインを含む。より好ましくは、第１の結合部位は、第１のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第１のタンパク質ドメインを含み、前記第２の結合部位は、第２のポリペプチド標的と共有結合を形成することができる第２のタンパク質ドメインを含む。好ましくは、前記第１のタンパク質ドメインは前記第１のポリペプチド標的とイソペプチド結合を形成することが可能であり、前記第２のタンパク質ドメインは前記第２の結合標的とイソペプチド結合を形成することが可能である。
好ましくは、前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は各々、異なるスプリットリガンド結合タンパク質ドメイン（split ligand-binding protein domain）を含む。より好ましくは、前記第１の結合部位および前記第２の結合部位の一方は、スプリットストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）フィブロネクチン結合タンパク質ドメインを含み、前記第１の結合部位および前記第２の結合部位の他方は、スプリットストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）アドヘシンドメインを含む。
好ましくは、前記第１および前記第２の結合部位は、各々独立して、配列番号４～９、１１～１３、２３、または１５～１８のいずれか１つと、少なくとも５０％アミノ酸同一性を有する。一部の実施形態では、前記第１および前記第２の結合部位は、各々独立して、配列番号４～９、１１～１３、２３、または１５～１８のいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％アミノ酸同一性を有する。
また、本明細書では、本明細書に記載のタンパク質スキャフォールドを含むタンパク質複合体であって、第１の結合部位は、第１のエフェクター部分に付着した第１のポリペプチド標的に結合しており、第２の結合部位は、第２のエフェクター部分に付着した第２のポリペプチド標的に結合している、タンパク質複合体が提供される。
好ましくは、前記複合体では、第１の結合部位／ポリペプチド標的対および第２の結合部位／ポリペプチド標的対は、各々独立して、（ｉ）配列番号４、６、もしくは８のいずれか１つと配列番号５、７、もしくは９のいずれか１つとの組合せ；（ｉｉ）配列番号１２と配列番号１３もしくは１５との組合せ；（ｉｉｉ）配列番号５と配列番号１１との組合せ；（ｉｖ）配列番号１５と配列番号１６との組合せ；（ｖ）配列番号１７と配列番号１８との組合せ、または（ｖｉ）配列番号２３と配列番号１６との組合せから選択される。
また、ライブラリーを含むスクリーニングプラットフォームであって、前記ライブラリーは、本明細書に記載のタンパク質複合体の複数の集団を含み、タンパク質複合体の集団は各々、第１のエフェクター部分、第２のエフェクター部分、および／またはオリゴマーコアの異なる組合せを含む、スクリーニングプラットフォームが提供される。
また、治療用薬物または薬物アナログを特定するための方法であって、
本明細書に記載のタンパク質複合体を用意すること、
タンパク質複合体を生物系と接触させること、および
タンパク質複合体が生物系の特性に所望の変化を誘導するか否かを測定すること
を含み、
任意選択で、生物系の特性に所望の変化を誘導するタンパク質複合体を選択することをさらに含む方法が提供される。
この方法は、前記タンパク質複合体の第１および第２のエフェクター部分に付着した特定された治療用薬物アナログのタンパク質複合体のスキャフォールドのオリゴマーコアを含む治療用薬物または薬物候補を合成することをさらに含んでもよい。
また、本明細書に記載の方法に従って得ることが可能な治療用薬物候補が提供される。
また、本明細書に記載の方法に従って得ることが可能な治療用薬物が提供される。
また、本明細書に記載の１つまたは複数の構築物またはポリペプチドを含むかまたはからなる治療用薬物または薬物候補が提供される。
また、本明細書では、治療用薬物または薬物候補であって、１つまたは複数の第１のエフェクター部分および１つまたは複数の第２のエフェクター部分に付着した複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコアであって、前記１つまたは複数の第１のエフェクター部分および前記１つまたは複数の第２のエフェクター部分は、オリゴマーコアの同じ面に位置し、（ｉ）前記１つまたは複数の第１のエフェクター部分は、２つまたはそれよりも多くの第１のエフェクター部分を含み、前記１つまたは複数の第２のエフェクター部分は、２つまたはそれよりも多くの第２のエフェクター部分を含み；および／または（ｉｉ）前記オリゴマーコアは、抗体も抗体断片も含まない、オリゴマーコアを含む、治療用薬物または薬物候補が提供される。好ましくは、治療用薬物対応物のオリゴマーコアは、本明細書でより詳細に記載される通りである。
好ましくは、本提供の治療用薬物候補では、オリゴマーコアは、複数のサブユニット単量体を含み、（ｉ）各サブユニット単量体は、コラーゲンＮＣ１ドメイン、ＣｕｔＡ１、Ｃ１ｑドメイン、ＴＮＦ、ｐ５３、フィブリノーゲン、Ｃ４、枯草菌ＡｂｒＢ、またはそれらのホモログもしくはパラログを含み；および／または（ｉｉ）各サブユニット単量体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号１９と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む多量体化構造要素を含む。
好ましくは、本提供の治療用薬物または薬物候補では、オリゴマーコアは複数のサブユニット単量体を含み、（ｉ）各サブユニット単量体は、ＶＩＩＩ型コラーゲンＮＣ１（非コラーゲン性）ドメイン、Ｘ型コラーゲンＮＣ１（非コラーゲン性）ドメイン、Ｃ１ｑ頭部ドメイン、ＣｕｔＡ１タンパク質、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）もしくはマクロファージ遊走阻害因子２（ＭＩＦ－２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＬ１ＡもしくはＣＤ４０Ｌを含むＴＮＦファミリーメンバー、またはそれらのホモログもしくはパラログを含み；および／あるいは（ｉｉ）各サブユニット単量体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９、配列番号６０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号４２、配列番号３１、配列番号５８、または配列番号１９と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む多量体化構造要素を含む。
ある特定の態様では、本発明は、Ｎ末端に第１の結合ドメイン、およびＣ末端に第２の結合ドメインを含むポリペプチドであって、第１および第２の結合ドメインは構造ドメインにより分離されている、ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、典型的には、組換え核酸からの融合タンパク質として発現される単一の遺伝子操作ポリペプチド鎖である。典型的には、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、標的分子が単一細胞上に発現されるか、またはプレートもしくは単一ビーズに固定化されている場合、それらの標的に結合することができる。これは、本明細書では、第１および第２の結合ドメインを「シス」配向性で提供することであると説明されることがある。
一部の実施形態では、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、異なる抗原結合ドメインである。この場合、構築物は二重特異性構築物である。
一部の実施形態では、第１の結合ドメインおよび／または第２の結合ドメインは、生物学的分子と特異的に結合することが可能なタンパク質またはペプチドである。これは、タンパク質またはペプチドリガンドまたは受容体、例えばサイトカインまたは細胞表面受容体などの結合パートナーと特異的に相互作用することが可能なシグナル伝達分子であってもよい。
他の実施形態では、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、各々が、同族ペプチドとイソペプチド結合を形成することが可能なキャッチャードメイン（つまり、スプリットリガンド結合タンパク質ドメイン）である。こうした同族ペプチドはタグペプチドと呼ばれることが多く、例えば、当技術分野で公知であり、下記で考察されているように、ＳｐｙＴａｇは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインとイソペプチド結合を形成する。典型的には、第１の結合ドメインに対する同族ペプチドは、第２の結合ドメインに対する同族ペプチドとは異なる。しかしながら、一部の実施形態では、同族ペプチドは、第１および第２の結合ドメインの両方で同じであってもよい。各末端にキャッチャー（catcher）を有するポリペプチドは、タグを含む分子（例えば、タンパク質）とは別々に、例えばキットの一部として提供することができる。一部の実施形態では、各タグペプチドは、その同族キャッチャードメインに共有結合で付着しており、任意選択で、一方または両方の同族ペプチドは、イソペプチド結合により第１および／または第２のキャッチャードメインに連結されている。一部の実施形態では、一方または両方の同族ペプチドタグは、エフェクター部分、典型的には抗原結合ドメインとの融合ポリペプチドとして存在する。したがって、キャッチャーとその同族ペプチドタグとの連結により、エフェクター部分（例えば、抗原結合ドメイン）がその結合ドメインに連結される。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端に第１の結合ドメインおよびＣ末端に第２の結合ドメインを含み、第１および第２の結合ドメインは構造ドメインにより隔てられており、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、各々が同族ペプチドとイソペプチド結合を形成することができるキャッチャードメインであり、第１のキャッチャードメインは、イソペプチド結合によりその同族ペプチドタグに連結されており、第２のキャッチャードメインは、イソペプチド結合によりその同族ペプチドタグに連結されている。一部の実施形態では、各ペプチドタグは、抗原結合ドメインに付着している。
上述の４つの段落のポリペプチドは、単量体として有用であるか、または一緒になってオリゴマーを形成する。
一部の態様では、上記におよび本明細書の他所で規定の２つまたはそれよりも多くのポリペプチドを含むオリゴマーが提供される。
一部の態様では、先行する段落で規定のポリペプチドまたはオリゴマーは、本明細書の他所に記載の特徴を含む。例えば、ポリペプチド構築物の構造ドメインは、典型的には、本明細書で広範に記載される「サブユニット単量体」であり、したがって、サブユニット単量体の規定および説明は構造ドメインにも適用される。同様に、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、典型的には、本明細書の他所に記載の第１の結合部位および第２の結合部位であり、したがって、第１および第２の結合部位の規定および説明は、ポリペプチド構築物の第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインにも適用される。
本発明は、多数のエフェクター部分の高度に応用性が高いスクリーニングを可能にする。エフェクター部分は、任意のタンパク質ドメインであってもよく、Ｆａｂ／Ｆｖ領域または他の抗原結合ドメインに限定されない。また、本発明は、従来の二重特異性抗体または他の手法を使用しては観察されないと考えられるより高次結合価の相互作用により達成される分子の効果を調査するために使用することもできる。したがって、本発明は、より高次結合価の相互作用によってのみ観察される効果を拾い上げることができる、二重特異性分子組合せのハイスループットスクリーニング用の系を提供する。また、本発明は、本明細書で提供される方法に従って特定することができる新しい治療薬候補を提供する。治療薬候補は、複数の機能性および結合価増加という利益を提供する。
当技術分野には、多価タンパク質スキャフォールドの限定的な使用が記載されている。Brune et al., Bioconjugate Chemistry, 28(5), pp.1544-1551により記載の１つの試みは、抗原がＩＭＸ３１３七量体コアの反対側の面にアセンブリされた七量体アセンブリの潜在的マラリアワクチンとして使用に関する。しかしながら、そのような構築物は、付着した抗原が反対側に提示されるため、同一細胞多受容体係合には適しておらず、がんおよび自己免疫疾患などの障害を治療するための同一細胞結合への応用は限定的である。
このように、エフェクター部分（本明細書ではリガンドとも呼ばれる）の組合せの表現型スクリーニングのための新しいおよび／または改良された方法、および新しい治療薬を開発するための方法が必要とされている。従来の方法では、調査した機能性の組合せの結合価を増加させることが可能ではなく、および／またはタンパク質スキャフォールドの同じ面に抗原を提示することの相乗的利益は認識されていない。本開示に従って設計および特定することができる、本明細書で提供される治療薬を含む、新しいおよび／または改良された治療薬も必要とされている。
本明細書に記載の多価タンパク質スキャフォールドであって、第１の結合部位および第２の結合部位は、オリゴマーコアの同じ面に、したがって多価タンパク質スキャフォールドの同じ面に位置している、多価タンパク質スキャフォールドを示す概略図である。 本明細書に記載の多価タンパク質スキャフォールドであって、第１の結合部位および第２の結合部位は、オリゴマーコアの反対側の面に、したがって多価タンパク質スキャフォールドの反対側の面に位置している、多価タンパク質スキャフォールドを示す概略図である。 本明細書に記載の多価タンパク質スキャフォールドであって、複数の第１の結合部位および複数の第２の結合部位は、表面との係合のために、オリゴマーコアの同じ面に、したがって多価タンパク質スキャフォールドの同じ面に位置している、多価タンパク質スキャフォールドを示す概略図である。 本明細書に記載の多価タンパク質スキャフォールドであって、複数の第１の結合部位および複数の第２の結合部位は、オリゴマーコアの反対側の面に、したがって多価タンパク質スキャフォールドの反対側の面に位置しており、したがって表面と同時に係合することができない、多価タンパク質スキャフォールドを示す概略図である。 本明細書に記載の多価タンパク質スキャフォールドであって、第１の結合部位および第２の結合部位は、オリゴマーコアの同じ面に、したがって多価タンパク質スキャフォールドの同じ面に、前面－前面配向性で位置している、多価タンパク質スキャフォールドを示す概略図である。 本明細書に記載の多価タンパク質スキャフォールドであって、第１の結合部位および第２の結合部位は、オリゴマーコアの同じ面に、したがって多価タンパク質スキャフォールドの同じ面に、前面－側面配向性で位置している、多価タンパク質スキャフォールドを示す概略図である。 本明細書に記載の多価タンパク質スキャフォールドであって、第１の結合部位および第２の結合部位は、オリゴマーコアの同じ面に、したがって多価タンパク質スキャフォールドの同じ面に、前面－前面配向性と前面－側面配向性との中間の配向性で位置している、多価タンパク質スキャフォールドを示す概略図である。 本明細書に記載の多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアのサブユニット単量体に付着した第１の結合部位と第２の結合部位との間に形成される角度（Ｘ）を示す概略図である。 第１および第２の結合部位のタンデム融合体を、本明細書に記載のオリゴマーコアに付着させ、多価タンパク質スキャフォールドの産生を可能にする本発明の実施形態を示す概略図である。本明細書で開示の方法を使用して、種々の異なる幾何学的形状および化学量論を生成できる。 「シス」位にある融合部位の２Ｄ描写を示す図である。ａ）所与の標的平面に対して、その標的平面から引かれた直交線によりコアタンパク質の最長断面が決定され、それを距離ｄｃであると特徴付ける。この断面の中点を横切る平行な平面が示されている。この場合、タンパク質コンジュゲーション（星印、丸印）の部位は、すべてのコンジュゲート部位について、コンジュゲーション部位から、タンパク質表面と交差しない標的平面までの最短経路の距離が、距離ｄｃのある特定の％未満、例えばｄｃの５０％未満である場合、優先的に「シス」位にあるとみなされる。ｂ）すべての結合部位がシス位にあるタンパク質の例。ｃ）すべての第２の結合部位（丸印）が５０％ｄｃの閾値をわずかに下回る最小経路長であること特徴とするため、すべての結合部位が、ａ）に従って互いにシス位にあるタンパク質の例。ｄ）すべての結合部位から標的平面までの投影距離（タンパク質を横断する）はｃ）と同じであるが、このタンパク質は、すべての第２の結合部位（丸印）からの最短経路を妨害する幾何学的形状を特徴としているため、こうした結合部位は、スキャフォールドの同じ側面に接近可能でないかおよび／または同じ側面に入らない。ｅ、ｆ）結合部位は互いに離れすぎているため、いかなる標的平面に対してもシス位であるとみなすことができない。 本明細書で参照されるタンパク質構造の概要を提供する図である。所与のＰＤＢ ＩＤのタンパク質構造が、異なる色調の鎖を使用して模式図として視覚化されている。単一の単量体のＮ末端およびＣ末端には各々注釈が付けられており、ほぼ結合表面の方向を向いている。タンパク質構造の対称性、例えば、円Ｃ３対称性、円Ｃ４対称性、および二面体Ｄ２対称性が括弧内に示されている。＊：タンパク質対称性はＮＭＲ構造から推定されている。†１ＰＫ６は、Ｃ１対称性を特徴とするヘテロマーであるが、ドメインはホモマーであり、その配置はＣ３対称性に類似する。好適な単量体構成を有する多量体タンパク質コアを選択することにより、単量体毎に複数の結合部位を投影して単一の結合表面を形成することができる。組換え融合に加えて、そのようなタンパク質を、次いで、例えばＳｐｙＣａｔｃｈｅｒおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒまたはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒを用いたＮ末端およびＣ末端での組換え融合によるモジュール式アセンブリに使用して、例えば、オリゴマーコアタンパク質の単量体のＮ末端でのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとＣ末端でのＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒとの組換え融合を介して好適に修飾されたペプチドまたはタンパク質に、多価性または他の特性を迅速に付与することができる。例としては、以下のものが挙げられる：（１）高度に熱安定性であるヒト銅結合タンパク質であり、各単量体のＮ末端およびＣ末端の両方が互いに近近傍にあり、アッセンブリされた三量体の単一平面上に投影してＣ３構造であることを特徴とするＨｓＣｕｔＡ１（ＰＤＢ ＩＤ ２ＺＦＨ）。（２）ＨｓＣｕｔＡ１と高い構造類似性を有するパイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）由来の超熱安定性ホモログであるＰｈＣｕｔＡ１（ＰＤＢ ＩＤ ４ＮＹＯ）。（３）Ｘ型コラーゲンのＮＣ１ドメイン（ＰＤＢ ＩＤ：１ＧＲ３）、（４）ＶＩＩＩ型コラーゲンのＮＣ１ドメイン（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｏ９１）、（５）マクロファージ遊走阻害因子２（ＰＤＢ ＩＤ：７ＭＳＥ）、（６）腫瘍壊死因子（ＰＤＢ ＩＤ：１ＴＮＦ）、（７）ＴＮＦ様タンパク質ＴＬ１Ａ（ＰＤＢ ＩＤ：２ＲＥ９）。 シス配向性多量体タンパク質複合体は、容易に発現でき、標準的なタンパク質精製法により調製できることを示す図である。ａ）Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ［配列番号２１］のＮｉ－ＮＴＡ精製。Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣは、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）で容易に発現され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液で煮沸した後でも、超安定性ＰｈＣｕｔＡ１に特徴的なインタクト三量体構造を保持する。洗浄１および２は、１０カラム容量の平衡化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８；３００ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭイミダゾール）を用いて実施した。洗浄３および４は、１０カラム容量の洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８；３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭイミダゾール）を用いて実施した。すべての溶出ステップは、２カラム容量の溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８；３００ｍＭ ＮａＣｌ；２００ｍＭイミダゾール）を用いて実施した。試料は、クーマシー染色による１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して分析した。Ｐ－溶解物ペレット；ＣＬ－清澄化溶解物；ＦＴ－フロースルー；Ｗ－洗浄；Ｅ－溶出。ｂ、ｃ）ＨｉＬｏａｄ１６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇを使用した、Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣのサイズ排除クロマトグラフィーの結果。ｂ）Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣピークが強調表示されているＵＶ Ａ２８０吸光度クロマトグラム。ｃ）上記クロマトグラムの強調表示された領域からのＨ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ ２ｍＬ画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。 シス配向性提示のための、二面体六量体から円対称性三量体コアタンパク質への移行を示す図である。ａ）ホモ六量体逆平行コイルドコイルは、Ｎ末端およびＣ末端が、タンパク質アセンブリの２つの反対側にあることを特徴とする（ＰＤＢ ＩＤ：５Ｗ０Ｊ）。ｂ）点突然変異誘発により、例えば、塩橋形成の導入または修飾でアセンブリを一方向に「ロック」することにより、ホモマーアセンブリからヘテロマーアセンブリを誘導することができる（ＰＤＢ ＩＤ：５ＶＴＥ）。ｃ）ヘテロマーアセンブリの末端を連結することにより、シス配向性提示に好適なホモマーアセンブリを誘導することになる（ＨＩＶ ＧＰ４１、ＰＤＢ ＩＤ：１Ｉ５Ｙとの比較）。黒から白への方向（構造、概略図）および矢印の方向（概略図）はＮ末端からＣ末端へである。構造はＰｙＭＯＬで視覚化した。 ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣは非常に安定な三量体タンパク質であることを示す図である。ａ）ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣの試料を、ＳＤＳローディング色素を添加する前に、ＰＢＳに加えた０％、０．５％、または１％ＳＤＳのいずれかで２時間９７℃にて加熱した。試料を１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、クーマシーで染色した。加熱せずＳＤＳを有していなかった対照試料が最初のレーンに示されている。ＳＤＳ濃度が増加すると、三量体の部分的な単量体化が観察され、三量体が共有結合で架橋されていないことが確認された。ｂ）ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣは長期保存後も保持された。タンパク質アリコートを、４℃、周囲温度（２１℃）、または３７℃で７日間保管した後、ＳＤＳローディング緩衝液で試料を調製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。タンパク質は、２１℃～３７℃では、４℃保管と比較して分解の兆候をほとんど示さなかった。任意選択で、プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦを添加したところ、同様の効果が得られた。 プラットフォームタンパク質へのモジュール式アセンブリのためのＳｐｙＴａｇ付きおよびＳｎｏｏｐＴａｇ付きリガンド成分の調製を示す図である。ａ）Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーを使用した、２００ｍＬ ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物からのＳｎＴ－Ｌ１の精製。各洗浄ステップは、５ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ洗浄緩衝液を使用して実施した。各溶出ステップは、２ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ溶出緩衝液を使用して実施した。試料は、クーマシー染色による１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して分析した。ｐｅｌ．－溶解物ペレット；ＦＴ－フロースルー；Ｗ－洗浄；Ｅ－溶出；Ｌ－ラダー。ｂ）ａ）と同様のＬ２－ＳｐＴの精製。ｃ）Ｎｉ－ＮＴＡ精製後のＳｎＴ－Ｌ１のサイズ排除クロマトグラフィー。ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ１６／６００ ７５ｐｇカラムを用いたＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ２５での、ＳｎＴ－Ｌ１のＵＶ Ａ２８０吸光度クロマトグラム。挿入図：クロマトグラムの強調表示された領域からのＳｎＴ－Ｌ１ ２ｍＬ画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。ｄ）ｃ）と同様のＬ２－ＳｐＴのサイズ排除クロマトグラフィー。 ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣは、ＳｐｙＴａｇ付きタンパク質およびＳｎｏｏｐＴａｇ付きタンパク質の安定三量体化を促進することを示す図である。ａ）Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣを、１：２：２モル過剰のＳｎＴ－Ｌ１またはＬ２－ＳｐＴと表記の時間にわたってコンジュゲートさせた後、試料をＳＤＳローディング緩衝液で補完し、すべての試料を９５℃で５分間煮沸することにより変性させた。試料を、８％および１６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、続いてクーマシー染色した。本発明者らは、リガンド成分の消費に伴って、ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣとＳｎＴ－Ｌ１またはＬ２－ＳｐＴとの時間依存性コンジュゲーションを観察した。ｂ）ａ）と同様のＳｐＣ－ＰＣ－ＳｎＣとＳｎＴ－Ｌ１およびＬ２－ＳｐＴとのコンジュゲーション。ｃ）ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣとＳｎＴ－Ｌ１およびＬ２－ＳｐＴとのコンジュゲーション。ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣを、ＳｎＴ－Ｌ１および／またはＬ２－ＳｐＴと共に１：２：２モル過剰でインキュベートし、試料を２５℃で６４時間インキュベートした。クーマシー染色による１６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して試料を分析した。注目すべきには、ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣおよびＳｎＴ－Ｌ１／Ｌ２－ＳｐＴは、完了までコンジュゲーションされ、ＰｈＣｕｔＡ１の特徴的な超熱安定性を保持した。ｄ）ｃ）と同様のＳｐＣ－ＰＣ－ＳｎＣとＳｎＴ－Ｌ１およびＬ２－ＳｐＴとのコンジュゲーション。ＳｐＣ－ＰＣ－ＳｎＣおよびＳｎＴ－Ｌ１／Ｌ２－ＳｐＴコンジュゲーションを完了するまで実施した。 高分子量スキャフォールドは、透析によるアセンブリ後精製を可能にすることを示す図である。ａ）Ｎｉ－ＮＴＡ精製ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣおよびｂ）ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴアセンブリを、９６ウェル形式を使用して透析した。ａ）ＳｐＣ－Ｐ２－ＳｎＣを、Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーを使用して精製し、溶出画分を一緒にして濃縮した。ｂ）ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ、ＳｎＴ－Ｌ１、およびＬ２－ＳｐＴのタンパク質コンジュゲーションを２５℃で２時間実施した。透析は、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を使用し、試料対透析緩衝液の比が１：１となるようにして、ＨＴＤｉａｌｙｓｉｓ９６ウェルブロックで実施した。透析は、周囲温度で円軌道で振盪しながら実施した。９０分までは、ＰＢＳ透析液を３０分毎に交換した。２４時間の透析では、タンパク質不純物（ａ～ｂ）および未コンジュゲートリガンド（ｂ）が平衡状態になるまで除去されたことを示す（試料対透析緩衝液の比は１：１）。試料を還元ＳＤＳローディング色素と共に煮沸し、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、クーマシー染色で視覚化した。ｃ）代替的に、ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴコンジュゲートを、試料対透析緩衝液の比が１：３０であることを特徴とする、１２ウェルプレート形式での透析により精製した。ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ、ＳｎＴ－Ｌ１、およびＬ２－ＳｐＴの、２５℃で２４時間の１：１コンジュゲーションを設定した。透析は、ＨＴＤｉａｌｙｓｉｓ１２ウェルブロックおよび１００ｋＤａ ＭＷＣＯセルロース膜を、周囲温度で１６時間にわたって撹拌せずに実施した。試料容積１００μＬおよびＰＢＳ透析液容積３ｍＬを使用した。両方とも、１×ＰＭＳＦを含んでいた。試料および透析液を、２時間、４時間、８時間、および１６時間の時点で採取した。試料は、１４％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよびクーマシー染色を使用して分析した。Ｓ＝透析試料、Ｄ＝透析液（ＰＢＳ）。 種コア成分（ＰｈＣｕｔＡ１からＭＩＦ２ｍまたはＨｓＣｕｔＡ１への）の変更、コンジュゲーション用のタンパク質成分（ＳｐＣ／ＳｎＣからＳｐＣ３／ＤｇＣへの）の変更、および可変リンカー長（ＭＩＦ２ｍの場合はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＨｓＣｕｔＡの場合はＧＧＧＧＳ）の変更を示し、迅速なプロトタイプ化の可能性が強調されている図である。ａ、ｂ）Ｈ６－ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣまたはＨ６－ＳｐＣ３－ＭＩＦ２ｍ－ＤｇＣのＮｉ－ＮＴＡ精製に由来する試料。ＴＬ－全溶解物；Ｐ－溶解物ペレット；ＣＬ－清澄化溶解物；ＦＴ－フロースルー；Ｗ－洗浄；Ｅ－溶出。試料は、クーマシー染色によるＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して分析した。ｃ）ＳｐＣ３－ＭＩＦ２ｍ－ＤｇＣおよびＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣは両方とも、ＤｏｇＴａｇ付きまたはＳｐｙＴａｇ付きタンパク質と迅速にコンジュゲーションすることが可能である。プラットフォームタンパク質を、１：１．５：１．５のモル比で１６時間２５℃にてインキュベートした。ｄ）Ｈ６－ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣと０．１％グルタルアルデヒドとのインキュベーションは、溶液中での三量体タンパク質の架橋を示す。１０μＭのＨ６－ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣを、０．１％グルタルアルデヒドを使用して０～２０分間架橋した。反応を、３７℃でインキュベートし、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．８の添加により停止させた。三量体架橋種が急速に形成され、長時間インキュベートすると、単量体Ｈ６－ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣが消費され、２つの三量体間の架橋の場合に予想される分子量の架橋種がある程度形成される。ｅ）ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣを、Ｌ１－ＳｐＴおよびＬ３－ＤｇＴと１：２：２のモル比で１６時間２５℃にて反応させた。次いで、ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣのみ、Ｌ１－ＳｐＴ：ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣ、ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣ：Ｌ３－ＤｇＴ、およびＬ１－ＳｐＴ：ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣ：Ｌ３－ＤｇＴの各試料を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ５／１５０ ＧＬカラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーに供したところ、各タンパク質スキャフォールドまたはタンパク質アセンブリの流体力学的半径の増加が示された。網掛け領域の各クロマトグラムピークのピーク画分を、ＳＤＳ ｐａｇｅゲルにローディングし、過剰なリガンドを除去してスキャフォールドおよびアセンブリタンパク質のみを表示させた。こうした試料を図２０ｃの入力として使用した。 融合タンパク質のシス配向性を予測するためにＡｌｐｈａｆｏｌｄ ｖ２．０をどのように使用したかを示す図である。各ＳｐＣ３－スキャフォールド－ＤｇＣアセンブリの最も順位の高いモデルをＰｙＭＯＬで視覚化した。単一鎖が強調表示されており、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ３（中間灰色）、スキャフォールド（濃灰色）、およびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（薄灰色）が示されている。追加の鎖は、白色で模式的に描かれている透明表面として表示されている。すべてのシミュレーションで、キャッチャーとスキャフォールドの間にＧＳＧＳリンカーを使用した。ＸＶ型コラーゲンＮＣ１の場合、ＧＳＧＳリンカーを使用すると予測構造が崩れた。したがって、（ＧＧＧＧＳ）２リンカーを使用して予測を繰り返し、この構造をここに示す。Ａｌｐｈａｆｏｌｄ予測に使用した単量体配列：ＴＬ１Ａ － 配列番号３２；Ｃｏｌ ＸＶ ＮＣ１ － 配列番号３３；ＭＩＦ２ｍ － 配列番号３４；ＨｓＣｕｔＡ１ － 配列番号５４；ＰｈＣｕｔＡ１ － 配列番号５５；Ｃｏｌ Ｘ ＮＣ１ － 配列番号５６；ＴＮＦ － 配列番号５７。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に対するスキャフォールドの適合性を示す図である。ａ）Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣを、２つの異なるリガンドＳｎＴ－Ｌ１およびＬ２－ＳｐＴにコンジュゲートした。血清飢餓ＮＣＩ－Ｎ８７細胞を、関連増殖因子および二重コンジュゲートアセンブリ（Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴ）、単一コンジュゲートアセンブリ（Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１、Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：Ｌ２－ＳｐＴ）、ならびにリガンドのみの対照（ＳｎＴ－Ｌ１、Ｌ２－ＳｐＴ、ＳｎＴ－Ｌ１＋Ｌ２－ＳｐＴ）の存在下で７日間増殖させ、続いてＭＴＴ細胞生存率測定を行った。１０ｎＭのＬ１、Ｌ２、およびＬ１＋Ｌ２に対する対照抗体を対照として使用したところ（データは示さず）、単一および二重コンジュゲートアセンブリ試料と比較して同様の結果が得られた。エラーバーは、ｎ＝３の技術的複製を示す。ｂ）完全アセンブリスキャフォールドＨ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴは、ＡｋｔおよびＥｒｋ１／２の活性化を抑制する。ＮＣＩ－Ｎ８７細胞を、スキャフォールドのみ（Ｓ；Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ）、リガンドのみ（Ｌ１；ＳｎＴ－Ｌ１およびＬ２；Ｌ２－ＳｐＴ）、ならびに単一コンジュゲート（Ｓ×Ｌ１、Ｓ×Ｌ２）アセンブリおよび二重コンジュゲート（Ｓ×Ｌ１×Ｌ２）アセンブリで１時間処理したところ、完全アセンブリＨ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴによるＡｋｔ／ＥＲＫシグナル伝達の下流活性化の抑制を示した。ｃ）Ｈ６－ＳｐＣ－ＨｓＣｕｔＡ１－ＳｎＣを２つの異なるリガンドＳｎＴ－Ｌ１およびＬ３－ＳｐＴとコンジュゲートした。血清飢餓ＮＣＩ－Ｎ８７細胞を、二重コンジュゲートアセンブリ（Ｈ６－ＳｐＣ－ＨｓＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ３－ＳｐＴ）、単一コンジュゲートアセンブリ（Ｈ６－ＳｐＣ－ＨｓＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１、Ｈ６－ＳｐＣ－ＨｓＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：Ｌ３－ＳｐＴ）、ならびにリガンドのみの対照（ＳｎＴ－Ｌ１、Ｌ３－ＳｐＴ、ＳｎＴ－Ｌ１＋Ｌ３－ＳｐＴ）で２日間処理し、続いてＭＴＴ細胞生存率測定を行った。エラーバーは、ｎ＝３の技術的複製を示す。 Ｎｉ－ＮＴＡおよびサイズ排除クロマトグラフィーの両方による、直接融合マルチドメインポリペプチドとしてのＬ１－ＰｈＣｕｔＡ１－Ｌ２の精製を示す図である。ａ）Ｌ１－ＰｈＣｕｔＡ１－Ｌ２は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で容易に発現され、ＨｉｓＰｕｒ樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＮｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーで精製する。洗浄１および２は、１０カラム容量の平衡化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８；３００ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭイミダゾール）を用いて実施した。洗浄３および４は、２カラム容量の洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８；３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭイミダゾール）を用いて実施した。すべての溶出ステップは、２カラム容量の溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８；３００ｍＭ ＮａＣｌ；２００ｍＭイミダゾール）を用いて実施した。試料を１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分析し、クーマシーで染色した。Ｐ－溶解物ペレット；ＣＬ－清澄化溶解物；ＦＴ－フロースルー；Ｗ－洗浄；Ｅ－溶出。ｂ）ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇを使用したＬ１－ＰｈＣｕｔＡ１－Ｌ２のサイズ排除クロマトグラフィーの結果。ｂ）Ｌ１－ＰｈＣｕｔＡ１－Ｌ２ピークが強調表示されたＵＶ Ａ２８０吸光度クロマトグラム。挿入図：上記クロマトグラムの強調表示された領域からのＬ１－ＰｈＣｕｔＡ１－Ｌ２ ２ｍＬ画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。
本発明は、特定の実施形態に関して、およびある特定の図面を参照して説明されることになるが、本発明はそれらに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲におけるいかなる参照符号も、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。無論、必ずしもすべての態様または利点が本発明の任意の特定の実施形態に従って達成されるわけではないことが理解されるべきである。したがって、例えば、当業者であれば、本発明は、本明細書で教示される１つの利点または利点の群を達成または最適化する様式で具現化または実施することができるが、本明細書で教示または示唆されていてもよい他の態様または利点を必ずしも実施しないことを認識するであろう。
加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別様の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「スキャフォールド」への言及は２つまたはそれよりも多くのスキャフォールドを含み、「オリゴマー」への言及は２つまたはそれよりも多くのそのようなオリゴマーなどを含む。
本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、上記であるかまたは下記であるかに関わらず、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
定義
以下の用語または定義は、本発明の理解を助けるために提供されているに過ぎない。本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、本発明の当業者にとっての意味と同じ意味を有する。専門家であれば、当技術分野における定義および用語について、特にSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012)；およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 114), John Wiley & Sons, New York (2016)を参照する。本明細書で提供される定義は、当業者が理解するものよりも狭い範囲を有すると解釈されるべきではない。
量および継続時間などの測定可能な値を参照する場合に本明細書で使用される「約」は、特定の値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、なおさらに好ましくは±０．１％のばらつきを包含することを意味し、このようなばらつきは、本開示の方法の実施に適切である。
本開示の状況における「アミノ酸」という用語は、その最も広義の意味で使用され、各アミノ酸に特異的な側鎖（例えば、Ｒ基）と共にアミン（ＮＨ２）官能基およびカルボキシル（ＣＯＯＨ）官能基を含む有機化合物を含むことを意味する。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するＬ α－アミノ酸または残基を指す。本明細書では、天然に存在するアミノ酸に関して一般的に使用される１文字略語および３文字略語が使用される：Ａ＝Ａｌａ；Ｃ＝Ｃｙｓ；Ｄ＝Ａｓｐ；Ｅ＝Ｇｌｕ；Ｆ＝Ｐｈｅ；Ｇ＝Ｇｌｙ；Ｈ＝Ｈｉｓ；Ｉ＝Ｉｌｅ；Ｋ＝Ｌｙｓ；Ｌ＝Ｌｅｕ；Ｍ＝Ｍｅｔ；Ｎ＝Ａｓｎ；Ｐ＝Ｐｒｏ；Ｑ＝Ｇｌｎ；Ｒ＝Ａｒｇ；Ｓ＝Ｓｅｒ；Ｔ＝Ｔｈｒ；Ｖ＝Ｖａｌ；Ｗ＝Ｔｒｐ；およびＹ＝Ｔｙｒ（Lehninger, A. L., (1975) Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92, Worth Publishers, New York）。「アミノ酸」という一般用語には、Ｄ－アミノ酸、レトロインベルソ型アミノ酸、ならびにアミノ酸アナログなどの化学修飾アミノ酸、ノルロイシンなど、通常はタンパク質に組み込まれない天然に存在するアミノ酸、およびβ－アミノ酸など、アミノ酸の特徴であることが当技術分野で公知である特性を有する化学合成化合物がさらに含まれる。例えば、天然ＰｈｅまたはＰｒｏと同じペプチド化合物の立体構造制限を可能にする、フェニルアラニンまたはプロリンのアナログまたは模倣物は、アミノ酸の定義内に含まれる。そのようなアナログおよび模倣物は、本明細書では対応するアミノ酸の「機能的等価物」と呼ばれる。アミノ酸の他の例は、Roberts and Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross and Meiehofer, eds., Vol. 5 p. 341, Academic Press, Inc., N.Y. 1983に掲載されている。この文献は参照により本明細書に組み込まれる
「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書では同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマー、ならびにそのバリアントおよび合成アナログを指す。したがって、こうした用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログなどの合成で天然に存在しないアミノ酸であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。また、ポリペプチドは、これらに限定されないが、グリコシル化、タンパク質分解的切断、脂質化、シグナルペプチド切断、プロペプチド切断、およびリン酸化などを含んでいてもよい、成熟または翻訳後修飾プロセスを受ける場合がある。ペプチドは、組換え技法を使用して、例えば、組換えまたは合成ポリヌクレオチドの発現により製作することができる。組換え産生されたペプチドは、典型的には培養培地を実質的に含まず、例えば、培養培地は、タンパク質調製物の容積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当する。
「タンパク質」という用語は、二次構造または三次構造を有するフォールディングしたポリペプチドを記述するために使用される。タンパク質は、単一のポリペプチドで構成されていてもよく、またはアセンブリして多量体を形成する複数のポリペプチドを含んでいてもよい。多量体は、ホモオリゴマーであってもよくまたはヘテロオリゴマーであってもよい。タンパク質は、天然に存在するタンパク質、野生型タンパク質、または修飾されているかもしくは天然に存在しないタンパク質であってもよい。タンパク質は、例えば、１つまたは複数のアミノ酸の付加、置換、または欠失により野生型タンパク質と異なっていてもよい。
タンパク質の「バリアント」は、問題の未修飾または野生型タンパク質と比べてアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を有し、それらが由来する未修飾タンパク質と同様の生物学的および機能的活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素を包含する。「アミノ酸同一性」という用語は、本明細書で使用される場合、比較ウィンドウにわたってアミノ酸毎の基準で同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインされた２つの配列を比較し、同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両配列に存在する位置の数を決定して一致位置の数を算出し、一致位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（つまり、ウィンドウサイズ）で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを算出することにより計算される。
本発明のすべての態様および実施形態では、「バリアント」は、典型的には、対応する野生型タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％完全配列同一性を有する。また、配列同一性は、全長ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの断片または部分に対するものであってもよい。したがって、配列は、全長参照配列と５０％の全体的配列同一性しか示さない場合があるが、特定の領域、ドメイン、またはサブユニットの配列は、参照配列と８０％、９０％、または９９％もの配列同一性を共有する可能性がある。
「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離された遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団内で最も頻繁に観察される遺伝子であり、したがって、任意に設計された「通常型」または「野生型」形態の遺伝子である。対照的に、「修飾された」、「突然変異体」、または「バリアント」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較して、配列の修飾（例えば、置換、切断、または挿入）、翻訳後修飾、および／または機能的特性（例えば、特徴の変更）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体は単離されていてもよいことに留意されたい。これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較して特徴が変更されているという事実により特定される。天然に存在するアミノ酸を導入または置換するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、突然変異体単量体をコードするポリヌクレオチドの関連位置のメチオニンのコドン（ＡＴＧ）をアルギニンのコドン（ＣＧＴ）に置き換えることにより、メチオニン（Ｍ）をアルギニン（Ｒ）に置換することができる。また、天然に存在しないアミノ酸を導入または置換するための方法は当技術分野で周知である。例えば、突然変異体単量体の発現に使用されるＩＶＴＴ系に合成アミノアシルｔＲＮＡを含めることにより、天然に存在しないアミノ酸を導入することができる。代替的に、天然に存在しないアミノ酸は、特定のアミノ酸の合成（つまり、天然に存在しない）アナログの存在下で、そうした特定のアミノ酸に対して栄養要求性である突然変異体単量体を大腸菌で発現させることにより導入することができる。突然変異体単量体は、部分的なペプチド合成を使用して生成する場合、ネイキッドライゲーション（naked ligation）により生成することもできる。保存的置換では、アミノ酸は、同様の化学構造、同様の化学的特性、または同様の側鎖容積を有する他のアミノ酸に置き換えられる。導入されるアミノ酸は、置き換えられるアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性性、中性性、または電荷を有してもよい。代替的に、保存的置換では、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入することができる。保存的アミノ酸変化は当技術分野で周知であり、下記の表１で規定される２０個の主要アミノ酸の特性に従って選択することができる。アミノ酸が同様の極性を有する場合、これは、表２のアミノ酸側鎖の疎水性親水性指標尺度を参照することによっても決定することができる。
Figure 2024511155000001
Figure 2024511155000002
また、突然変異または修飾タンパク質、単量体、またはペプチドを、任意の方法および任意の部位で化学的に修飾することができる。突然変異または修飾単量体またはペプチドは、１つまたは複数のシステインへの分子の付着（システイン連結）、１つまたは複数のリジンへの分子の付着、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾、または末端の修飾により化学的に修飾されていてもよい。そのような修飾を実施するための好適な方法は、当技術分野で周知である。修飾タンパク質、単量体、またはペプチドの突然変異体は、任意の分子の付着により化学的に修飾されていてもよい。例えば、修飾タンパク質、単量体、またはペプチドの突然変異体は、色素またはフルオロフォアの付着により化学的に修飾されていてもよい。
ポリペプチド構築物
本発明は、一部では、２つまたはそれよりも多くが一緒になってオリゴマータンパク質を形成する場合に有用であり、一部の実施形態では、単量体としても有用であり得るマルチドメインポリペプチド構築物に関する。マルチドメインポリペプチドは、典型的には、自然界では一緒に存在しないドメインが一緒になるように遺伝子操作されている。一部の実施形態では、３、４、５、または６つのポリペプチド構築物が一緒になってオリゴマーを形成する。一部の実施形態では、３つの構築物が一緒になって、三量体、例えばホモ三量体を形成する。
本明細書で提供される説明は、サブユニット単量体のオリゴマーコアについての説明である。サブユニット単量体は、典型的には、マルチドメインポリペプチド構築物の構造ドメインである。こうした構造ドメインのオリゴマー化は、ひいては多価タンパク質スキャフォールドのコアを形成することができる。
したがって、サブユニット単量体の特徴に関する考察は、個々のポリペプチド構築物の構造ドメインの開示および定義にも適用される。
同様に、ポリペプチド構築物の第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、状況に応じて、本明細書の他所に記載の第１の結合部位および第２の結合部位を形成してもよく、または本明細書の他所に記載の第１のエフェクター部分および第２のエフェクター部分を形成してもよい。例えば、結合ドメインがイソペプチド結合形成性「キャッチャー」ドメイン（または本明細書に記載の他の結合部位）である場合、それは下記の他所に記載の結合部位である。結合ドメインが、例えば、抗体、抗原結合性断片、抗体模倣体、タンパク質もしくはペプチドリガンド、タンパク質もしくはペプチドシグナル伝達分子（例えば、サイトカイン）、生物学的受容体、または本明細書においてエフェクター部分として記載されている他の分子である場合、結合ドメインは、本明細書の他所に記載のエフェクター部分である。
したがって、第１および第２の結合部位、または第１および第２のエフェクター部分の定義および説明は、ポリペプチド構築物の第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインに適宜適用される。
一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、Ｎ末端に第１の結合ドメインおよびＣ末端に第２の結合ドメインを含み、第１および第２の結合ドメインは、構造ドメインにより隔てられている。Ｎ末端は、ポリペプチドのアミノ末端の末端アミノ酸残基を指す。Ｃ末端は、ポリペプチドのカルボキシ末端の末端アミノ酸残基を指す。典型的には、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、標的分子が単一細胞上に発現されるか、またはプレートもしくは単一ビーズに固定化されている場合、それらの標的に結合することができる。これは、本明細書では、第１および第２の結合ドメインを「シス」配向性で提供することであると説明されることがある。典型的には、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、単一細胞の表面上にある細胞標的に結合し、両標的を細胞膜においてクラスター化することができる。したがって、シス配向性は、一部のシス作用剤（つまり、単一細胞に対して作用することができる）に対して優先的であり得る。二重特異性抗体のシス配向性は、逆の「トランス」配向性と共に、Dickopf et al (Computational and Structural Biotechnology Journal, Volume 18, 2020, Pages 1221-1227)にて考察されている。
幾何学的形状の状況における「シス配向性」は、本明細書では、シス－トランス異性化と同様に、および二重特異性抗体アーキテクチャを説明するために以前に使用されているように、２つの成分が平面の異なる側を「横切る」（ラテン語に由来する）、つまり平面の異なる側にある幾何学的形状の状況における「トランス」または「トランス配向性」とは対照的に、２つの成分が平面の「同じ側」にある（ラテン語に由来する）空間配置を指すために使用される。この幾何学的定義は、単一の二重特異性分子が、単一のまたは隣接する細胞（シス）または異なる細胞集団（トランス）に作用する、例えばエフェクター細胞を標的細胞へと動員する、生物学的効果の状況における「シス作用性」および「トランス作用性」とは異なる。様々な形式の幾何学的形状の探求に向けて積極的な関心および努力がなされている（例えば、Dengl et al Nat Commun. 2020; 11: 4974を参照）。「シス配向性」は、例えば、分子間距離を低減させることによる、ある特定の「トランス作用性」二重特異性においても有益であり得る（Dickopf et al, Computational and Structural Biotechnology Journal, Volume 18, 2020, pp. 1221-1227）。シス配向性は、単一細胞上の標的の多価結合またはクラスタリングによる、シス作用性二重特異性物質に対する多価シス配向性が特に興味深い（例えば、Veggiani et al Biochemistry January 19, 2016, 113 (5) 1202-1207に記載の二重特異性タンデム融合体、またはより高次の単一特異性クラスタリングKhairil Anuar et al, Nature Communications volume 10, Article number: 1734 (2019)との比較）。
構造ドメインの機能は、結合ドメインに対して、画定された構造的支持を提供することである。有利なことに、構造ドメインは、典型的には結合ドメインが両方ともシス配向性で標的に結合することができるように、結合ドメインが所望の配向性を有することを保証することができる。したがって、構築物は、単一の結合表面を提供することができる。
ある特定の実施形態では、構造ドメイン（オリゴマーコア）に対する結合ドメインの付着部位は、短いリンカーであっても結合を可能にする。
構造ドメインは、画定された二次構造、典型的にはアルファヘリックスまたはベータシートを含む任意のポリペプチドドメインであってもよい。一部の特に有利な実施形態では、構造ドメインは、例えば互いに実質的に隣接しているかまたは隣接しているそのＮ末端およびＣ末端を同じ空間領域に有する。結合ドメインを構造ドメインの末端に付着させると、三次元立体構造において実質的に隣接する２つの結合ドメインが提供される。一部の実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端は、実質的に同じ方向を向くように配向されている。本明細書の他所に記載のように、空間的に隣接するＮ末端およびＣ末端を提供することにより、構築物の同じ面に、または複数の構築物を含むオリゴマーの同じ面に位置する結合ドメインがもたらされる。したがって、構築物は、典型的には単一の結合表面を提供する。構築物は、典型的には、シス配向性の結合領域を提供する。
構造ドメインは、単一のポリペプチド鎖を含んでいてもよく、または付随して単一の構造ドメインを形成する２つまたはそれよりも多くの別々のポリペプチド鎖、例えば、２つの逆平行（Ｎ－Ｃ Ｃ－Ｎ）アルファヘリックスまたは付随してベータシートを形成する２つもしくはそれよりも多くのベータ鎖で形成されてもよい。一部の実施形態では、適切な特徴を有する２つまたはそれよりも多くのポリペプチド鎖を特定し、次いで、典型的には組換え手段により融合して単一のポリペプチド鎖（つまり、融合タンパク質）を形成させるが、また化学的コンジュゲーションまたは結合により単一の共有結合分子を形成させる。
構造ドメインは、２つの結合ドメインとは異なる。したがって、結合ドメインが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、またはＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒなどのキャッチャーポリペプチドである場合、構造ドメインは、キャッチャーポリペプチドではない。
典型的には、構造ドメインはＣＨ２ドメインを含まない。典型的には、構造ドメインはＣＨ３ドメインを含まない。一部の実施形態では、構造ドメインは、ＣＨ２ドメインを含まず、ＣＨ３ドメインを含まない。
下記および実施例で考察されているように、少なからぬ例示的な構造ドメインが本発明者らにより特定されている。一部の実施形態では、構造ドメインは、Ｘ型コラーゲンＮＣ１ドメイン（配列番号２）、またはそれと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドを含むかまたはからなる。一部の実施形態では、構造ドメインは、ＶＩＩＩ型コラーゲンＮＣ１ドメイン（配列番号３）、またはそれと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドを含むかまたはからなる。一部の実施形態では、構造ドメインは、ＣｕｔＡ１ポリペプチド（例えば、配列番号１または配列番号１９）、またはそれと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドを含むかまたはからなる。
ある特定の実施形態では、構造要素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１９、配列番号２９、配列番号６０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号４２、配列番号３１、または配列番号５８と、少なくとも５０％アミノ酸同一性、例えば少なくとも９０％同一性を有するポリペプチドを含むかまたはからなる。
好適な構造ドメインは、ＩＶ型コラーゲンＣ４ドメイン（ＩＶ型コラーゲンＮＣ１ドメインとしても知られている）（ＰＤＢ ＩＤ：１ｍ３ｄ、配列番号４９）であるか、またはそれと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドである。
一般に、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、およびＸ型コラーゲンに由来するＮＣ１ドメインを含むコラーゲンＮＣ１ドメインを、本発明による構造ドメインとして使用することができる。
しかしながら、すべてのコラーゲンＮＣ１ドメインが構造ドメインとして適切であるとは限らない。特に、ＸＶ型コラーゲンおよびＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来するＮＣ１ドメインは、必要とされる配向性を有していない。
ある特定の実施形態では、構造ドメインは、ヒトマクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）（ＰＤＢ ＩＤ：１ＣＡ７、または配列番号２５、またはＹ９９Ｇ突然変異を有するＰＤＢ ＩＤ：６ＯＹ８）またはヒトマクロファージ遊走阻害因子２（ＭＩＦ２）（ＰＤＢ ＩＤ：７ＭＳＥ、または配列番号２６、またはＳ６２ＡおよびＦ９９Ａ突然変異を有する配列番号２７）またはそれらのホモログもしくはパラログを含む。
ある特定の実施形態では、構造ドメインは、ＴＮＦ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＴＮＦ、配列番号４２）、ＴＬ１Ａ（ＰＤＢ ＩＤ：２ｒｅ９、配列番号３１）、またはＣＤ４０Ｌ（ＰＤＢ ＩＤ：３ｌｋｊ、配列番号５８）を含むＴＮＦファミリータンパク質を含む。
構造ドメインのさらなる例としては、好適に修飾された逆平行コイルドコイル六量体（ＰＤＢ ＩＤ：５Ｗ０Ｊ、実施例４を参照、配列番号４３）、ＨＩＶ－１ ＧＰ４１コア（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｉ５Ｙまたは配列番号４４）、シトクロムｃ５５５（ＰＤＢ ＩＤ：５Ｚ２５または配列番号４５）、ＭＨＣクラスＩＩ関連シャペロニンおよびターゲティングタンパク質インバリアント鎖（Ｉｉ）（ＰＤＢ ＩＤ：１ｉｉｅまたは配列番号４６）、ｐ５３（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｃ２６または配列番号４７）；フィブリノーゲン様ドメイン（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｍ７Ｆまたは配列番号４８）、枯草菌ＡｂｒＢ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＹＦＢまたは配列番号５０）、バクテリオファージラムダ頭部タンパク質Ｄ（例えば、ＰＤＢ ＩＤ：１Ｃ５ＥまたはＰＤＢ ＩＤ：１Ｃ５Ｅまたは配列番号５１）；ＨＣＲＢＰＩＩのドメインスワップ三量体バリアント（ＰＤＢ ＩＤ：６ＶＩＳまたは配列番号５２）；Ｔ１Ｌレオウイルス付着タンパク質シグマ１（ＰＤＢ ＩＤ：４ＯＤＢの鎖Ａ、Ｂ、Ｃ、または配列番号５３）が挙げられる。
本発明によるポリペプチド構築物は、構造ドメインに加えて、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、同族ペプチド、例えば当技術分野で周知である種々のキャッチャードメインとイソペプチド連結を形成することが可能である。こうしたイソペプチド結合形成ドメインを含む構築物は、抗原結合タンパク質などのエフェクター分子の異なる対のスクリーニングに特に良好に適している。本明細書の他所で考察されているように、エフェクター分子の多数の組合せを、イソペプチド形成ペプチドタグを介して、イソペプチド結合形成結合ドメインを含む構築物に連結することができる。したがって、同族ペプチドとイソペプチド結合を形成することができる結合ドメインを含む構築物は、創薬プラットフォームとして特に有用である。
イソペプチド結合形成に関する本発明の態様は、一般に、構造ドメインに付着した、典型的にはキャッチャーと呼ばれるより大きな分子（ドメイン）と、目的の結合領域（例えば、抗原結合ドメイン）の一部を形成する、典型的にはタグと呼ばれるより小さなポリペプチドまたはペプチドとを参照して例示される。しかしながら、すべての態様および実施形態は、より大きな（例えば、キャッチャー）分子が、目的の結合領域（例えば、抗原結合ドメイン）の一部を形成し、より小さなタグペプチドが、構造ドメインに付着した結合ドメインを形成する逆配向性で実施することができる。
一部の実施形態では、ポリペプチド構築物中の第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、抗原結合ドメインなどのエフェクター分子である。こうした実施形態では、構築物は、診断剤、分析剤、または療法剤としての使用に特に適している。
一部の実施形態では、抗原結合領域の興味深いまたは有効な対を、本発明の創薬プラットフォームを使用して特定し（例えば、構築物がイソペプチド結合形成結合ドメインを含む場合）、次いでイソペプチド結合形成結合領域を有さず、構造ドメインに中間キャッチャードメインを用いずに、および抗原結合ドメインにペプチドタグを用いずに構造ドメインに直接的に接続された、抗原結合ドメイン（または他のエフェクター部分）の特定された組合せを有する構築物を発現させる。疑義を避けるために付記すると、こうした直接融合構築物は、本明細書の他所に詳細に記載されているように、構造ドメインの末端残基とエフェクター部分または各エフェクター部分（例えば、抗原結合領域）の末端残基との間にリンカー領域を依然として含んでいてもよい。
したがって、本発明の一態様は、タグ付きエフェクタータンパク質のコンビナトリアル対を使用して、エフェクター分子の多数の考え得る組合せを大規模ハイスループットスクリーニングするための系を提供し、有用であると特定された組合せを、それらがスクリーニング構築物で提供された形態で使用してもよく、創薬プラットフォームで使用されたものと同じ構造ドメインにおいてエフェクター分子（例えば、抗原結合領域）との直接融合体を作出することにより、より簡便な形式（例えば、治療薬候補のための）に変換してもよい。これにより、二重特異性および多重特異性作用剤を特定および開発するための、簡便で迅速かつ信頼性の高い技術が提供される。
抗原結合ドメインは、本発明に従って使用および適用することができる典型的なドメインである。本発明のある特定の態様では、抗原結合ドメインは、ＳｐｙＴａｇまたはＳｎｏｏｐＴａｇなどの、イソペプチド結合を形成することができるペプチドタグを含み、同族キャッチャードメインを含む構築物にイソペプチド結合で結合させて、例えば、コンビナトリアル式またはモジュール式スクリーニングのプラットフォームを作出することができる。本発明の他の態様では、本発明の構築物は、Ｎ末端に第１の抗原結合ドメインおよびＣ末端に第２の抗原結合ドメインを含み、第１および第２の結合ドメインは、構造ドメインにより隔てられている。任意選択で、抗原結合ドメインの１つまたは各々と構造ドメインとの間にリンカー配列が存在してもよい。下記で考察されるように、結合ドメイン（結合部位）を構造ドメイン（単量体サブユニット）に接続する際に使用するための好適なペプチドリンカーは、典型的には、１～１００、１～５０、１～２５、１～２０、１～１５、または１～１０アミノ酸長である。リンカー配列の例は、ＧＳＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。
抗原結合ドメインは、典型的には、抗体の抗原結合性断片である。抗原結合性抗体断片は、完全長インタクト抗体ではなく、典型的には少なくともＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインを欠如している。そのような抗原結合性断片は周知であり、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。抗原結合性断片は、典型的には、抗原結合に必要なＣＤＲ（典型的には６つのＣＤＲ）、および正しいＣＤＲ構造に必要なフレームワーク残基を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）および軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（ＶＬ）を含む。
一部の実施形態では、抗原結合領域は、単一ドメイン抗体であってもよい。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）としては、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体を挙げることができる。例としては、これらに限定されないが、重鎖抗体、軽鎖を天然に欠く抗体、従来の４本鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、遺伝子操作抗体、および抗体に由来するもの以外の単一ドメインスキャフォールドが挙げられる。単一ドメイン抗体は、当技術分野の任意のものであってもよく、または任意の将来の単一ドメイン抗体であってもよい。単一ドメイン抗体は、これらに限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含む種に由来してもよい。単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られている天然に存在する単一ドメイン抗体であってもよい。そのような単一ドメイン抗体は、例えば国際公開第９４／０４６７８号パンフレットに開示されている。明瞭性の理由で、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、４本鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、ＶＨＨまたはナノボディと呼ばれることがある。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコで生じた抗体に由来してもよい。ラクダ科の他にも他の種は、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を産生することができ、そのようなＶＨＨは、本発明の範囲内にある。
また、抗原結合ドメインは、アフィボディまたはＤＡＲＰｉｎなどの抗体模倣物を含んでいてもよくまたはからなっていてもよい。アフィボディは、当技術分野で公知のように、典型的には約５８個のアミノ酸を有し、約６ｋＤａの分子質量を有する３つのアルファヘリックスを含む小型ポリペプチドである。当技術分野で公知のように、ＤＡＲＰＩＮ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）は、典型的には高度に特異的で高親和性の標的タンパク質結合を呈する、遺伝子操作された抗体模倣タンパク質である。
結合ドメインは、抗原結合ドメインの代替として、サイトカインなどの天然に存在するリガンドを含んでもよい。
２つの異なる抗原結合ドメインが二重特異性分子に存在する場合、それらは、典型的には、異なるエピトープに結合する。これは、同じ標的分子にある異なるエピトープであってもよく、または異なる標的分子にある異なるエピトープであってもよい。一部の実施形態では、エピトープは両方とも療法標的にあり、療法標的に対する抗原結合ドメインの結合は、療法上の利益のために生物学的機序、典型的には病理学的機序を改変する。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは各々、生物学的標的をアゴナイズすることができる。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは各々、生物学的標的をアンタゴナイズすることができる。一部の実施形態では、一方の抗原結合ドメインは第１の標的をアゴナイズすることができ、他方の抗原結合ドメインは第２の標的をアンタゴナイズすることができる。
一部の実施形態では、構築物は、同じエピトープに結合するが、そのエピトープに対して異なる親和性を有する２つの結合領域を含んでいてもよい。一部の実施形態では、構築物は、同じエピトープに対して任意選択で異なる親和性で結合する２つの結合領域を含んでいてもよく、２つの結合領域は、異なる形式を有し、例えば、一方の抗原結合領域はｓｃＦｖであり、第２の抗原結合領域はＦａｂである。
本発明のマルチドメインポリペプチド構築物は、典型的には、通常の慣例に従ってＮからＣへの方向で示される以下の形式を有する：
（結合ドメイン１）－リンカー１－構造ドメイン－リンカー２－（結合ドメイン２）
式中、リンカー１およびリンカー２は、任意選択のリンカー配列であり、任意選択で１～２０個のアミノ酸、例えばＧＳＧＳである。任意選択の精製タグ、例えばＨｉｓタグ、例えば６×Ｈｉｓを構築物のいずれかの末端に組み込むことができる。
結合ドメインは同じであってもよく、または典型的には異なっている。結合ドメインは、典型的には、キャッチャーポリペプチドであってもよくまたは抗原結合ドメインであってもよい。少なからぬ例示的な構成を下記に提供する。
ＳｐＣ－リンカー１－ＣｕｔＡ１－リンカー２－ＳｐＣ
ＳｎＣ－リンカー１－ＣｕｔＡ１－リンカー２－ＳｎＣ
ＳｎＣ－リンカー１－ＣｕｔＡ１－リンカー２－ＳｐＣ
ＳｐＣ－リンカー１－ＣｕｔＡ１－リンカー２－ＳｎＣ
ＳｐＣ３－リンカー１－ＣｕｔＡ１－リンカー２－ＤｇＣ
ｓｃＦｖ－リンカー１－ＣｕｔＡ１－リンカー２－ＳｃＦｖ
Ｆａｂ－リンカー１－ＣｕｔＡ１－リンカー２－Ｆａｂ
ＳｃＦｖ－リンカー１－ＣｕｔＡ１－リンカー２－Ｆａｂ
Ｆａｂ－リンカー１－ＣｕｔＡ１－リンカー２－ＳｃＦｖ
ナノボディ１－リンカー１－ＣｕｔＡ１－リンカー２－ナノボディ２
ナノボディ－リンカー１－ＣｕｔＡ１－リンカー２－ＤｇＣ
ＳｐＣ３－リンカー１－ＣｕｔＡ１－リンカー２－ナノボディ
式中、ＳｐＣはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、ＳｐＣ３はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３であり、ＳｎＣはＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒであり、Ｆａｂは抗体「断片抗原結合」であり、ｓｃＦｖは単鎖Ｆｖである。いずれの場合でも、リンカー１およびリンカー２リンカーは、任意選択である。ＣｕｔＡ１配列は、ヒトもしくはパイロコッカス・ホリコシイに由来してもよく、または別の種由来のホモログであってもよく、あるいはヒトまたはパイロコッカス・ホリコシイ配列と、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％同一性を有してもよい。
さらに例示的な構築物は以下の通りである。
ＳｐＣ－リンカー１－ＮＣ１－リンカー２－ＳｐＣ
ＳｎＣ－リンカー１－ＮＣ１－リンカー２－ＳｎＣ
ＳｎＣ－リンカー１－ＮＣ１－リンカー２－ＳｐＣ
ＳｐＣ－リンカー１－ＮＣ１－リンカー２－ＳｎＣ
ｓｃＦｖ－リンカー１－ＮＣ１－リンカー２－ＳｃＦｖ
Ｆａｂ－リンカー１－ＮＣ１－リンカー２－Ｆａｂ
ＳｃＦｖ－リンカー１－ＮＣ１－リンカー２－Ｆａｂ
Ｆａｂ－リンカー１－ＮＣ１－リンカー２－ＳｃＦｖ
ナノボディ１－リンカー１－ＮＣ１－リンカー２－ナノボディ２
ナノボディ－リンカー１－ＮＣ１－リンカー２－ＤｇＣ
ＳｐＣ３－リンカー１－ＮＣ１－リンカー２－ナノボディ
式中、ＮＣ１は、ＶＩＩＩ型コラーゲンまたはＸ型コラーゲンに由来するコラーゲンＮＣ１ドメインである。いずれの場合でも、リンカー１およびリンカー２リンカーは任意選択である。
さらに例示的な構築物は、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）（配列番号２５）またはマクロファージ遊走阻害因子２（ＭＩＦ２）（配列番号２６）またはＭＩＦ２のＳ６２Ａ Ｆ９９Ａ突然変異体（ＭＩＦ２ｍ、配列番号２７）を、構造ドメインとして含み、以下のものが挙げられる。
ＳｐＣ－リンカー１－ＭＩＦ２－リンカー２－ＳｐＣ
ＳｎＣ－リンカー１－ＭＩＦ２－リンカー２－ＳｎＣ
ＳｎＣ－リンカー１－ＭＩＦ２－リンカー２－ＳｐＣ
ＳｐＣ－リンカー１－ＭＩＦ２－リンカー２－ＳｎＣ
ｓｃＦｖ－リンカー１－ＭＩＦ２－リンカー２－ＳｃＦｖ
Ｆａｂ－リンカー１－ＭＩＦ２－リンカー２－Ｆａｂ
ＳｃＦｖ－リンカー１－ＭＩＦ２－リンカー２－Ｆａｂ
Ｆａｂ－リンカー１－ＭＩＦ２－リンカー２－ＳｃＦｖ
ナノボディ１－リンカー１－ＭＩＦ２－リンカー２－ナノボディ２
ナノボディ－リンカー１－ＭＩＦ２－リンカー２－ＤｇＣ
ＳｐＣ３－リンカー１－ＭＩＦ２－リンカー２－ナノボディ
任意の好適な構造ドメイン、特に本明細書に記載の構造ドメインのいずれかを、上記で提供されている例示的な構造ドメインの代わりに、こうした構築物に使用することができる。したがって、こうした例示的な形式は、構造ドメイン一般にて、および本明細書に記載の構造ドメインにて使用するために記載されている。
マルチドメイン構築物の結合ドメインの配向性は、単量体形態でまたはオリゴマー形態で、様々なアッセイを使用して機能的に評価できる。例示的なアッセイの選択を下記に記載する。
ＦＲＥＴ：非シス配向性タンパク質と比較して、選択されたスキャフォールドがシス配向性であることを示すために、ＦＲＥＴアッセイを実施することができる。キャッチャー成分を有するスキャフォールドポリペプチド、例えばＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣを、それぞれのタグ対に融合されている蛍光タンパク質ＦＲＥＴ対、例えばｍＣｈｅｒｒｙ（６＋）－ＳｐＴ３－Ｈ６およびＨ６－ＤｇＴ－ｍＣｉｔｒｉｎｅ（４－）にコンジュゲートしてもよい。タグ付きＦＲＥＴ対をスキャフォールドタンパク質にコンジュゲートしたら、アクセプターＦＲＥＴタンパク質の発光を、標準的な蛍光読取法で測定して、ドナーＦＲＥＴタンパク質の発光増感と比較することができる。優先的にシス配向性を示すタンパク質スキャフォールドは、より高いアクセプター発光を示すが、優先的にトランス配向性を示すタンパク質スキャフォールドは、より高いドナー発光増感を示すことになる。
ＳＰＲ：好適なリガンドにコンジュゲートされたシス配向性スキャフォールドが、非シス配向性タンパク質と比較して同じ平面にある標的に優先的に結合することができることを示すために、ＳＰＲ実験を実施することができる。スキャフォールドコンジュゲートリガンドに対する標的タンパク質、例えばＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴのＬ１およびＬ２に対する標的を、一緒に、または対照のためにＬ１標的のみまたはＬ２標的のみとして別々に、のいずれかで、ＳＰＲセンサーチップの表面に固定化することができる。次いで、Ｌ１およびＬ２にコンジュゲートされたシス配向性または非シス配向性スキャフォールドを、Ｌ１標的および／またはＬ２標的を有するＳＰＲセンサーチップにローディングし、チップ上の固定化標的に対するコンジュゲートアセンブリの結合を決定する。シス配向性を有するアセンブリは、両標的が同じチップ上に固定化されている場合、Ｌ１標的およびＬ２標的の両方に対して高度に測定可能な結合を示すことが予想されるが、非シス配向性を有するアセンブリは、そのようなチップに対して高度に測定可能な結合を示さないことが予想される。両アセンブリタイプは、固定化されたＬ１標的のみまたはＬ２標的のみに対して高度に測定可能な結合を示すことが予想される。
ＳＥＣ－ＭＡＬＳ：溶液中のスキャフォールドおよびアセンブリタンパク質が天然でオリゴマー状態にあることを示すために、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ実験を実施することができる。スキャフォールドおよびアセンブリタンパク質を、方法セクションに記載のように調製することができる。次いで、試料をＭＡＬＳ装置および検出器にカップリングされたＦＰＬＣ装置に注入して試料をサイズで分離し、光散乱の計算により天然タンパク質質量を概算する。次いで、天然タンパク質質量を、ＰｒｏｔＰａｒａｍなどのソフトウェアで算出した予測単量体質量で除算することにより、タンパク質のオリゴマー状態を導き出すことができる。スキャフォールドおよびアセンブリタンパク質、例えばＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣおよびＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴは両方とも、オリゴマー状態が３であることを示すと予想される。
架橋およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ：シス配向性コンジュゲートアセンブリと、２つの標的、例えばＬ１およびＬ２に対する標的との同時結合を示すために、標的発現細胞を、コンジュゲートアセンブリのビオチン化型である、ビオチン－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴと共にインキュベートし、その後標的とビオチン化アセンブリとの結合を、ＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）で架橋し、続いて細胞溶解、およびストレプトアビジンによる架橋標的－アセンブリ複合体の抽出を行うことができる。次いで、この複合体をトリプシン消化してＬＣ－ＭＳ／ＭＳに供給し、Ｌ１およびＬ２とそれぞれの標的との結合を確認する。非シス配向性アセンブリに対して同じ方法論を実行することにより、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータの出力を２つのタンパク質アセンブリ間で比較することができる。シス配向性アセンブリは、Ｌ１標的およびＬ２標的の両方に対して優先的に結合することができるが、非シス配向性アセンブリは、Ｌ１標的またはＬ２標的のいずれかに対してのみ優先的に結合することができると予想される。
多価タンパク質スキャフォールド
本発明の一態様は、標的分子をスクリーニングするためのモジュール式系に関する。この系は、標的分子の多価提示を可能にする。一態様では、多価タンパク質スキャフォールドが提供される。多価タンパク質スキャフォールドは、複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコアを含む。また、多価タンパク質スキャフォールドは、少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも１つの第１の結合部位を含む。好適な結合部位は、本明細書でより詳細に記載されている。
スキャフォールドは、他の分子が結合することができるプラットフォームとして機能する。分子の様々な組合せを、モジュール様式でスキャフォールドに結合させることができる。スキャフォールドは、分子の多価結合を可能にする。一般に、スキャフォールドに結合した分子は、潜在的な療法上の利益を有し、分子に結合したスキャフォールドを使用して、異なる分子の多価アセンブリが所望の効果を有し得るか否かを調査することができる。例えば、潜在的な抗がんポリペプチドの様々な組合せをスキャフォールドに付着させることができ、次いで、得られたアセンブリをスクリーニングアッセイに使用して、その組合せが、がん細胞と結合することおよび殺傷を引き起こすなどの、がん細胞に対する効果を示すか否かを確認することができる。分子の組合せが特定されたら、モジュール式系を使用するのではなく、特定された分子と直接付着するように多価タンパク質スキャフォールドを修飾することにより治療用薬物候補を生成することができる。多価タンパク質スキャフォールドは、スキャフォールドの同じ面に分子を「提示」し、それにより分子のすべてが標的細胞と潜在的に相互作用することを可能にする。
本提供のスキャフォールドは、典型的には、少なくとも２つの第１の結合部位および少なくとも２つの第２の結合部位を含む。少なくとも２つの第１結合部位および少なくとも２つの第２結合部位の存在は、このスキャフォールドを、例えば二重特異性抗体形式を用いてスクリーニングする場合には必ずしも見出すことができない多価相互作用のスクリーニングに使用することを可能にする。また、同じ組合せに関して、様々なスキャフォールドを「ツールボックス」として試験することも可能になる。
したがって、本明細書では、
－ 複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコア、および
－ 少なくとも２つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも２つの第１の結合部位
を含む多価タンパク質スキャフォールドであって、
前記第１の結合部位および前記第２の結合部位はスキャフォールドの同じ面に位置する、多価タンパク質スキャフォールドが提供される。
本提供のスキャフォールドは、典型的には、それぞれの標的と共有結合を形成することが可能な結合部位を含む。共有結合は、強力な不可逆的付随に結び付く。本発明のスキャフォールドを、結合部位に対する標的と共有結合で付着させることにより生成される複合体は、物理的にロバストであり、容易に生産することができる。そのような複合体は、高収率および高均質性で生産することができる。したがって、そのような複合体を本明細書に記載の対象などの生物系に投与する際に生じる生物学的応答は、再現性があり、制御可能である。
したがって、本明細書では、
－ 複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコア、
－ 少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも１つの第１の結合部位
を含む多価タンパク質スキャフォールドであって、
前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は、スキャフォールドの同じ面に位置し、前記第１の結合部位は、第１のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第１のタンパク質ドメインを含み、前記第２の結合部位は、第２のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第２のタンパク質ドメインを含む、多価タンパク質スキャフォールドも提供される。
本明細書で説明されているように、本明細書で提供されるスキャフォールドは、二重特異性抗体を含む従来の抗体に対して著しい利点を有する。本提供のスキャフォールドのオリゴマーコアは、典型的には、抗体のＦｃ領域を含まない。一部の実施形態では、オリゴマーコアはＣＨ２領域を含まない。一部の実施形態では、オリゴマーコアはＣＨ３領域を含まない。一部の実施形態では、オリゴマーコアは、ＣＨ２領域を含まず、ＣＨ３領域を含まない。抗体の免疫グロブリンドメイン、典型的にはＦｃ領域などの定常ドメインの使用は、典型的には、本明細書に記載の本提供のスキャフォールドの利点を示すことができない。例えば、二重特異性抗体は、本発明のモジュール性を欠如しており、多価相互作用の調査には有用ではない可能性がある。
したがって、本明細書では、
－ 複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコア、
－ 少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも１つの第１の結合部位
を含む多価タンパク質スキャフォールドであって、
前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は、スキャフォールドの同じ面に位置し、前記オリゴマーコアは抗体のＦｃ領域を含まない、多価タンパク質スキャフォールドも提供される。
また、
－ 複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコア、
－ 少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも１つの第１の結合部位
を含む多価タンパク質スキャフォールドであって、
前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は、スキャフォールドの同じ面に位置し、前記オリゴマーコアは、抗体のＣＨ２ドメインを含まないか、または抗体のＣＨ３ドメインを含まないか、またはＣＨ２ドメインを含まずかつＣＨ３ドメインを含まない、多価タンパク質スキャフォールドも提供される。
多価タンパク質スキャフォールドは、オリゴマーコア、および少なくとも１つの第１の結合部位、および少なくとも１つの第２の結合部位を含む。また、多価タンパク質スキャフォールドは、本明細書でより詳細に記載のように、リンカー、ドメイン挿入物、および／または官能基などの他の特徴を含んでいてもよい。
好ましくは、多価タンパク質スキャフォールドの直径は、約１００ｎｍ未満、例えば約５０ｎｍ未満、例えば約２５ｎｍ未満、例えば約１０ｎｍ未満である。好ましくは、多価タンパク質スキャフォールドの高さは、約１００ｎｍ未満、例えば約５０ｎｍ未満、例えば約３０ｎｍ未満、例えば約２０ｎｍ未満、例えば約１０ｎｍ未満である。多価タンパク質スキャフォールドは、好ましくは、サイズが、１～５００Å、例えば２～２５０Å、例えば約１０～約１００Å、例えば約２０～約８０Åである。
好ましくは、多価タンパク質スキャフォールド自体は、好ましくは、生物系、細胞培養物、またはヒト対象などの対象において免疫応答を本質的に誘導しない。換言すれば、典型的には、オリゴマーコアの結合部位および／またはタンパク質スキャフォールドの結合部位に付着したエフェクター部分が存在しない場合、タンパク質スキャフォールドをヒト対象などの生物系に投与しても免疫応答は誘導されない（または免疫応答は本質的には誘導されない。例えば、免疫応答は、非免疫原性タンパク質を投与した場合よりも大きくない）。例えば、タンパク質スキャフォールドを（多価タンパク質スキャフォールドの結合部位および／または多価タンパク質スキャフォールドの結合部位に付着したエフェクター部分の非存在下で）生物系（例えば、本明細書で規定の対象）に投与しても、典型的には生物系の自然免疫も適応免疫も誘導しない。例えば、タンパク質スキャフォールドは、典型的には、補体系、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、樹状細胞、またはマクロファージの活性化を誘導しない。
多価タンパク質スキャフォールドは、好ましくは抗体も抗体断片も含まないが、本明細書でさらに記載されているように、抗体および／または抗体断片は、エフェクター部分としてスキャフォールドに付着していてもよい。多価タンパク質スキャフォールド（例えば、エフェクター部分が一切存在しない）は、より好ましくは、抗体のＦｃ領域を含まない。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体および補体系の一部のタンパク質と相互作用する抗体の尾部領域である。一部の場合では、多価タンパク質スキャフォールドは、免疫グロブリン定常領域を含まない。一部の実施形態では、多価タンパク質スキャフォールドはＣＨ２ドメインを含まない。一部の実施形態では、多価タンパク質スキャフォールドはＣＨ３ドメインを含まない。一部の実施形態では、多価タンパク質スキャフォールドは、ＣＨ２ドメインを含まず、ＣＨ３ドメインを含まない。
好ましくは、多価タンパク質スキャフォールドは熱力学的に安定である。好ましくは、多価タンパク質スキャフォールドは、約０～約１００℃、例えば約４℃～約９０℃、例えば約１０℃～約５０℃、例えば約２０から約３８℃、例えば約２５～約３７℃の温度で安定である。換言すれば、好ましくは、多価タンパク質スキャフォールドは、約０～約１００℃（例えば、約４℃～約９０℃、例えば約１０℃～約５０℃、例えば約２０～約３８℃、例えば約２５～約３７℃）の温度の水溶液中に存在する場合、その置換成分サブユニット単量体へと解離せず、および／または結合部位は、オリゴマーコアから解離しない。例えば、そのような温度の水溶液中にある場合、多価タンパク質スキャフォールドの少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％、例えば少なくとも９９．９％、例えば少なくとも９９．９９％または９９．９９９％は、その置換成分サブユニット単量体へと解離せず、および／または結合部位はオリゴマーコアから解離しない。より好ましくは、多価タンパク質スキャフォールドは、約０℃～約１００℃、例えば約４℃～約９０℃、例えば約１０℃～約５０℃、例えば約２０～約３８℃、例えば約２５～約３７℃の温度で安定である。多価タンパク質スキャフォールドは、約０～約１００℃、例えば約４℃～約９０℃、例えば約１０℃～約５０℃、例えば約２０～約３８℃、例えば約２５～約３７℃の温度で測定した場合、好ましくは、少なくとも１０分間、より好ましくは少なくとも１時間、例えば少なくとも１日間、例えば少なくとも１週間、例えば少なくとも１か月間または少なくとも１年間の寿命を有する。
好ましくは、多価タンパク質スキャフォールドの構成物質間の相互作用は、弱い一過性相互作用ではない。弱い一過性複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏでは異なるオリゴマー状態の動的な混合物を示すが、強力な一過性複合体は、例えばリガンド結合により引き起こされる場合にのみ四次状態を変化させる。弱い一過性相互作用は、マイクロモル範囲の解離定数（ＫＤ）および数秒間の寿命により特徴付けられる。エフェクター分子の結合により安定化される強力な一過性相互作用は、より長い寿命を有し、ナノモル範囲のより低いＫＤを有することができる。多価タンパク質スキャフォールドの構成物質は、好ましくは、少なくとも強力な一過性反応で相互作用し、より好ましくは、多価タンパク質スキャフォールドの構成物質は恒久的な相互作用を形成する。恒久的な相互作用は、多価タンパク質スキャフォールドが、通常条件下、例えば２０℃～４０℃およびｐＨ６～ｐＨ８でその構成物質へと解離しないことを意味する。構成物質部分が恒久的な相互作用を形成する多価タンパク質スキャフォールドは、典型的には、サブユニット単量体自体の三次構造を変性させる変性条件下でのみ解離する。
したがって、好ましくは、多価タンパク質スキャフォールドの構成物質は、約０℃～約１００℃、例えば約４℃～約９０℃、例えば約１０℃～約５０℃、例えば約２０～約３８℃、例えば約２５～約３７℃の温度で、１μＭ未満、例えば１００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤで相互作用する。
好ましくは、多価タンパク質スキャフォールドおよびその構成物質部分は、プロテアーゼに対して安定である。例えば、多価タンパク質スキャフォールドおよび多価タンパク質スキャフォールドの構成物質は、スキャフォールドの三次構造または四次構造を喪失させずに、トリプシンなどのプロテアーゼに曝露させることができる。多価タンパク質スキャフォールドおよび多価タンパク質スキャフォールドの構成物質部分は、例えば約１０から約４０℃、例えば約２０から約３８℃、例えば約２５から約３７℃の温度で、少なくとも１時間、例えば少なくとも２時間、例えば少なくとも４時間、例えば少なくとも８時間、例えば少なくとも２４時間、またはそれよりも長期間、プロテアーゼに対して安定である。
オリゴマーコア
上記で説明されているように、本明細書で提供される多価タンパク質スキャフォールドは、複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコアを含む。オリゴマーコアのサブユニット単量体は、典型的には、本明細書の他所に記載のポリペプチド構築物の構造ドメインである。
任意の好適な数のサブユニット単量体を使用することができる。例えば、オリゴマーコアは、約２～約２０個のサブユニット単量体、例えば約２～約１０個のサブユニット単量体、より好ましくは３～７個のサブユニット単量体、より好ましくは３～６個のサブユニット単量体を含んでいてもよい。例えば、オリゴマーコアは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のサブユニット単量体を含んでいてもよい。好ましくは、オリゴマーコアは、少なくとも３つのサブユニット単量体を含む。最も好ましくは、オリゴマーコアは、３つのサブユニット単量体を含む。好ましくは、オリゴマーコアは、７つのサブユニット単量体を含みもせず、からなってもいない。
好ましくは、サブユニット単量体は、多量体化した際に、３回回転対称性、４回回転対称性、５回回転対称性、６回回転対称性、または７回回転対称性など、回転対称性を有する。オリゴマーコアは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｄ２、Ｃ５、Ｃ６、Ｄ３、Ｃ７、Ｃ８、Ｄ４、Ｃ９、Ｃ１０、Ｄ５、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｄ６、またはＴ対称性を有していてもよい。
オリゴマーコアのサブユニット単量体の一部またはすべては、非共有結合で一緒に付着していてもよい。オリゴマーコアのサブユニット単量体の一部またはすべては、共有結合で一緒に付着していてもよい。オリゴマーコアは、共有結合および非共有結合で付着したサブユニット単量体のミックスを含んでもよい。例えば、オリゴマーコアは、第２の単量体に共有結合で結合してヘテロ二量体を形成する第１の単量体を含んでもよい。オリゴマーコアは、非共有結合で一緒に結合した少なくとも２つのそのようなヘテロ二量体を含んでいてもよい。例えば、オリゴマーコアは、非共有結合で一緒に付着した３つの非ヘテロ二量体を含んでいてもよく、各ヘテロ二量体は、共有結合で一緒に結合した２つの単量体を含む。
オリゴマーコアのサブユニット単量体の一部またはすべては、非共有結合相互作用により付着していてもよい。好適な非共有結合相互作用としては、これらに限定されないが、静電相互作用、例えばイオン結合、水素結合、およびハロゲン結合、ファンデルワールス力、例えば双極子間相互作用、π－πスタッキング、カチオン－π相互作用、アニオン－π相互作用、または極性－π相互作用が挙げられる。
オリゴマーコアのサブユニット単量体の一部またはすべては、共有結合で一緒に付着していてもよい。サブユニット単量体が共有結合で一緒に付着している場合、単量体は、典型的には、元のまたは天然に存在する単量体ドメインに対応するアミノ酸配列である。
２つまたはそれよりも多くのサブユニット単量体は、ジスルフィド結合により共有結合で連結されていてもよい。ジスルフィド結合は、典型的には、ポリペプチドのシステイン残基間に形成される。遊離チオール基を有する人工アミノ酸もジスルフィド結合形成に参加することができる。
２つまたはそれよりも多くのサブユニット単量体は、化学架橋により共有結合で付着していてもよい。架橋試薬としては、ホモ二官能性架橋試薬、ヘテロ二官能性架橋試薬、および光反応性架橋試薬が挙げられる。ホモ二官能性架橋試薬は、いずれの末端にも同一の反応性基を有する。ホモ二官能性架橋試薬の例としては、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）、およびジチオビスプロピオン酸スクシンイミジル（ＤＳＰ）が挙げられる。スルフヒドリル－スルフヒドリル架橋剤の一部の一般的な例としては、ＢＭＯＥおよびＤＴＭＥが挙げられる。ヘテロ二官能性架橋試薬は、２つの異なる反応性基を有し、異なる官能基を連結するために使用することができる。ヘテロ二官能性架橋試薬の例としては、ＭＤＳ（ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ－γ－マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル）、ＥＭＣＳ（Ｎ－（ε－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル）、およびスルホ－ＥＭＣＳ（Ｎ－（ε－マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）が挙げられる。光反応性架橋試薬は、紫外線または可視光に曝された場合にのみ反応性を示すヘテロ二官能性架橋剤である。一般的な光反応性化学基の２つのクラスは、アリールアジドおよびジアジリンである。アリールアジド（Ｎ－（（２－ピリジルジチオ）エチル）－４－アジドサリチルアミド）が広く使用されている。２５０～３５０ｎｍのＵＶ光に曝されると、こうした試薬は、二重結合との付加反応を触発させることができるナイトレン基の形成を促進することができる。加えて、こうした架橋剤は、Ｃ－Ｈ挿入産物の生成を開始することができるか、または求核剤と反応することができる。この群に属する一部の一般的な架橋試薬としては、ＡＮＢ－ＮＯＳ（Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンジルオキシスクシンイミド）およびスルホ－ＳＡＮＰＡＨが挙げられる。ＮＨＳエステルジアジリンまたはアジペンタノエートは、光活性化可能なジアジリン環およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含み、中性～塩基性緩衝液中で第一級アミノ基と効率的に反応して、安定したアミド結合を形成する。これらは、フェニルアジド基と比較してより良好な光安定性を呈し、長波長紫外光（３３０～３７０ｎｍ）で容易に活性化させて、スペーサーアーム距離内の任意のペプチド骨格またはアミノ酸側鎖と共有結合を形成するカルベン中間体を生成することができる。
より好ましくは、オリゴマーコアの２つまたはそれよりも多くのサブユニット単量体は、遺伝子的に一緒に融合されていてもよい。サブユニット単量体は、単一のポリペプチド鎖で発現されるように単一のポリヌクレオチド配列中にコードされて発現される場合、遺伝子的に一緒に融合されている。したがって、サブユニット単量体が遺伝子的に一緒に融合されている場合、オリゴマーコアは、単一のポリペプチド鎖を含むことができる。
遺伝子的に融合されたサブユニット単量体は、ペプチドリンカーを介して遺伝子的に一緒に融合されていてもよい。サブユニット単量体の連結に使用するために好適なペプチドリンカーは、サブユニット単量体間のヒンジ領域として機能することができ、したがってサブユニット単量体が互いに独立してフォールディングすることを可能にし、サブユニット単量体が多量体化する能力を保持することを可能にするのに十分な可撓性を提供するアミノ酸配列である。ペプチドリンカーの長さ、可撓性、および親水性は、典型的には、サブユニット単量体が容易にアセンブリしてオリゴマーコアを形成することができるように設計されている。好ましくは、ペプチドリンカーにより連結されたサブユニット単量体はアセンブリして、隣接するサブユニット単量体間の相互作用が、そうでない場合の同じサブユニット単量体間の相互作用と実質的に同一であるオリゴマーコアを形成することができる。
オリゴマーコア単量体サブユニットを接続する際に使用するために好適なペプチドリンカーは、典型的には、１～１００、１～５０、１～２５、１～２０、１～１５、または１～１０アミノ酸長である。リンカーは、例えば、以下のアミノ酸：リジン、セリン、アルギニン、プロリン、グリシン、およびアラニンの１つまたは複数で構成されていてもよい。好適な可撓性ペプチドリンカーの例は、２～２０個、例えば４、６、８、１０、または１６個のセリンおよび／またはグリシンアミノ酸のストレッチである。剛性のリンカーの例は、２～３０個、例えば４、６、８、１６、または２４個のプロリンアミノ酸のストレッチである。好適なリンカーの例としては、これらに限定されないが、以下のもの：ＧＧＧＳ、ＰＧＧＳ、ＰＧＧＧ、ＲＰＰＰＰＰ、ＲＰＰＰＰ、ＶＧＧ、ＲＰＰＧ、ＰＰＰＰ、ＲＰＰＧ、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰ、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ、ＲＰＰＧ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＳＧ、ＳＧＳＧ、ＳＧＳＧＳＧ、ＳＧＳＧＳＧＳＧ、ＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ、およびＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧが挙げられ、配列中、Ｇはグリシン、Ｐはプロリン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、およびＶはバリンである。追加の例示的なリンカーとしては、ＧＳＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳが挙げられる。適切な連結基は、従来のモデリング技法を使用して設計することができる。リンカーは、典型的には、単量体またはそれらのサブユニットが、対応するタンパク質オリゴマーへとアセンブリすることを可能にするのに十分な可撓性を有する。
好ましくは、オリゴマーコアの総分子量は、約１０００ｋＤａ未満、例えば約５００ｋＤａ未満、例えば約２５０ｋＤａ未満である。オリゴマーコアの総分子量は、好ましくは約１０ｋＤａ～約１０００ｋＤａ、例えば約１０ｋＤａ～約５００ｋＤａ、例えば約１０ｋＤａ～約２５０ｋＤａ、例えば約１０ｋＤａ～約１５０ｋＤａである。オリゴマーコアの総分子量は、より好ましくは、約２０ｋＤａ～約１５０ｋＤａである。
好ましくは、オリゴマーコアの直径は、約１００ｎｍ未満、例えば約５０ｎｍ未満、例えば約３０ｎｍ未満、例えば約２０ｎｍ未満、例えば約１０ｎｍ未満である。好ましくは、オリゴマーコアの高さは、約１００ｎｍ未満、例えば約５０ｎｍ未満、例えば約３０ｎｍ未満、例えば約２０ｎｍ未満、例えば約１０ｎｍ未満である。オリゴマーコアは、サイズが、好ましくは１～５０ｎｍ、例えば２～４０ｎｍ、例えば約２～約２０ｎｍ、例えば約５～約１０ｎｍである。
好ましくは、オリゴマーコアは熱力学的に安定である。好ましくは、オリゴマーコアは、約０～約５０℃の温度で安定である。換言すれば、好ましくは、オリゴマーコアは、約０～約５０℃の温度の溶液中に存在する場合、その置換成分単量体へと自発的には解離しない。より好ましくは、オリゴマーコアは、約１０～約４０℃、例えば約２０～約３８℃、例えば約２５～約３７℃の温度で安定である。
好ましくは、サブユニット単量体は、安定的に相互作用してオリゴマーコアを形成する。サブユニット単量体間の相互作用は、好ましくは、弱い一過性相互作用ではない。弱い一過性複合体は、典型的には、ｉｎ ｖｉｖｏではそれぞれのオリゴマー状態の動的な混合物を示すが、強力な一過性複合体は、例えばリガンド結合により引き起こされた場合にのみ四次状態を変化させ、単一の主要なオリゴマー状態で存在する（例えば、複合体の少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％、例えば少なくとも９９．９％、例えば少なくとも９９．９９％、または９９．９９９％は、標準条件下では安定なオリゴマー状態で存在することができる）。弱い一過性相互作用は、マイクロモル範囲の解離定数（ＫＤ）および数秒間の寿命により特徴付けられる。エフェクター分子の結合により安定化された強力な一過性相互作用は、典型的には、より長い寿命を有し、ナノモル範囲のより低いＫＤを有する。サブユニット単量体は、より好ましくは、少なくとも強力な一過性反応で相互作用し、より好ましくは恒久的な相互作用を形成する。恒久的な相互作用は、オリゴマーが、通常条件下ではその構成物質サブユニット単量体へと解離しないかまたは実質的に解離せず（例えば、約０～約１００℃の温度の水溶液中に存在する場合。こうした条件下では、典型的には、オリゴマーコアの少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％、例えば少なくとも９９．９％、例えば少なくとも９９．９９％、または９９．９９９％は解離しない）、通常、オリゴマーコアは、サブユニット単量体自体の三次構造を変性させる変性条件が使用される場合にのみ解離することを意味する。したがって、好ましくは、サブユニット単量体は、１μＭ未満、例えば１００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤで多量体化する。オリゴマーコアは、典型的には、少なくとも１０分間、より好ましくは少なくとも１時間、例えば少なくとも１日間、例えば少なくとも１週間、例えば少なくとも１か月間、または少なくとも１年間の寿命を有する。寿命は、約０℃～約１００℃、例えば約４℃～約９０℃、例えば約１０℃～約５０℃、例えば約２０～約３８℃、例えば、約２５～約３７℃など、任意の好適な温度で決定することができる。
好ましくは、オリゴマーコアは、プロテアーゼに対して安定である。例えば、オリゴマーコアは、オリゴマーコアの三次構造または四次構造を喪失させずに、限定的な期間、例えば４時間にわたって、トリプシンなどの希釈濃度のプロテアーゼに曝露させることができる。
好ましくは、オリゴマーコアは、ヒトであるかまたはヒト化されている。ヒトオリゴマーコアは、ヒトタンパク質の多量体領域である。ヒト化オリゴマーコアは、ヒトタンパク質の対応する多量体領域とより近似的に類似するように修飾されている、非ヒトタンパク質の多量体領域であるオリゴマーコアである。ヒト化オリゴマーコアは、対応するヒトタンパク質の多量体領域のアミノ酸配列と、少なくとも５０％アミノ酸同一性、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％アミノ酸同一性を備えていてもよい。ヒトタンパク質の対応する多量体領域は、ヒト化オリゴマーコアと最も高いアミノ酸配列同一性を有するヒトタンパク質の多量体領域である。この情報は、Ｂｌａｓｔ検索（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ． ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用し、検索結果をホモ・サピエンス（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）に限定して、特定することができる。
好ましくは、多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアは、生物系、細胞培養物、または対象（非ヒト対象またはヒト対象など）において、それ自体では免疫応答を誘導しない。換言すれば、典型的には、オリゴマーコアの結合部位および／またはオリゴマーコアの結合部位に付着したエフェクター部分が存在しない場合、オリゴマーコアを生物系に投与しても免疫応答は誘導されない。例えば、オリゴマーコアを（オリゴマーコアの結合部位および／またはオリゴマーコアの結合部位に付着したエフェクター部分の非存在下で）生物系（例えば、本明細書で規定の対象）に投与しても、典型的には、生物系の自然免疫も適応免疫も誘導しない。例えば、オリゴマーコアは、典型的には、補体系、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、樹状細胞、またはマクロファージの活性化を誘導しない。しかしながら、オリゴマーコアに付着した分子は、ヒト対象において免疫応答を生成するように特別に設計することができる。
好ましくは、タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアは、抗体も抗体断片も含まないが、本明細書でさらに記載のように、抗体および／または抗体断片は、エフェクター部分としてオリゴマーコアに付着していてもよい。オリゴマーコア（例えば、エフェクター部分が一切存在しない）は、より好ましくは、抗体のＦｃ領域を含まない。一部の場合では、オリゴマーコアは、免疫グロブリン定常領域を含まない。
一部の実施形態では、多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアはホモオリゴマーコアであってもよく、つまり、オリゴマーコアは、１タイプの単量体のみを含んでもよい。ホモオリゴマーコアは、２つもしくはそれよりも多くの、例えば３つもしくはそれよりも多くの、４つもしくはそれよりも多くの、５つもしくはそれよりも多くの、６つもしくはそれよりも多く、または７つもしくはそれよりも多くの同一のサブユニット単量体を含んでいてもよい。
一部の他の実施形態では、多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアはヘテロオリゴマーコアであってもよく、つまり、オリゴマーコアは、１つよりも多くのタイプの単量体を含んでもよい。異なるタイプのサブユニット単量体は、オリゴマーコアを形成することが可能である。言い換えれば、サブユニット単量体は、一緒に付着することが可能である。ヘテロオリゴマーコアは、２つもしくはそれよりも多くの、例えば３つもしくはそれよりも多くの、４つもしくはそれよりも多くの、５つもしくはそれよりも多くの、６つもしくはそれよりも多く、または７つもしくはそれよりも多くの異なるサブユニット単量体を含んでいてもよい。例えば、ヘテロオリゴマーコアが３つの単量体を含む場合、ヘテロオリゴマーコアは、２つの第１の単量体および１つの第２の単量体を含んでいてもよく、または、１つの第１の単量体、１つの第２の単量体、および１つの第３の単量体を含んでもよい。ヘテロオリゴマーコアが４つの単量体を含む場合、ヘテロオリゴマーコアは、２つの第１の単量体および２つの第２の単量体；２つの第１の単量体、１つの第２の単量体、および１つの第３の単量体；または１つの第１の単量体、１つの第２の単量体、１つの第３の単量体、および１つの第４の単量体を含んでいてもよい。好ましくは、オリゴマーコアがヘテロオリゴマーコアである場合、オリゴマーコアは、２つのタイプのサブユニット単量体を含み、つまり、タイプＡおよびタイプＢの単量体を含み、合計ｎ個のサブユニット単量体を有するヘテロオリゴマーコアの場合、前記ヘテロオリゴマーコアは、（ＡａＢｂ）の化学量論を有してもよく、式中ａ＋ｂ＝ｎである。オリゴマーコアがヘテロオリゴマーコアである場合、そこに含まれるサブユニット単量体は、第１のタイプのサブユニット単量体が、第１のタイプの別の単量体よりも第２のタイプのサブユニット単量体と優先的に結合するように修飾されていてもよい（換言すれば、タイプＡの単量体およびタイプＢの単量体を含むヘテロオリゴマーコアの場合、ヘテロオリゴマーコアは、ＡＡＡＢＢＢ・・・ではなくＡＢＡＢＡＢ・・・の形態である）。
なおさらなる実施形態では、オリゴマーコアは、複数の多量体サブユニットを含んでもよい。例えば、２つの単量体を融合させることができ（例えばタンデム融合体として）、単量体融合体はアセンブリしてオリゴマーコアを形成することができる。この点において、融合される単量体は同じであってもよくまたは異なっていてもよい。
例えば、２つまたはそれよりも多くの同一の単量体を融合させ、融合産物をさらに同一の融合産物とアセンブリしてホモオリゴマーコアを形成させることができる。オリゴマーコアは、複数のホモ二量体を含んでもよく、例えば、ホモ二量体が「ＡＡ」である場合、オリゴマーコアは、「ＡＡ」、「ＡＡＡＡ」、または「ＡＡＡＡＡＡ」などを含んでもよい。
代替的に、２つまたはそれよりも多くの異なる単量体を一緒に融合させ、融合産物をさらなる同一の融合産物とアセンブリさせてオリゴマーコアを形成させることができる。本明細書で使用される場合、そのようなコアは、典型的には、ホモオリゴマーコアとみなされ、各融合産物は単量体サブユニットとみなされる。オリゴマーコアは、複数のヘテロ二量体を含んでいてもよく、例えば、ヘテロ二量体が「ＡＢ」である場合、オリゴマーコアは、「ＡＢ」、「ＡＢＡＢ」、または「ＡＢＡＢＡＢ」などを含んでいてもよい。
代替的に、２つまたはそれよりも多くの同一の単量体を融合させて、融合産物をさらなる非同一融合産物とアセンブリさせてヘテロオリゴマーコアを形成させることができる。オリゴマーコアは、複数のホモ二量体を含んでもよく、例えば、第１のホモに二量体が「ＡＡ」であり、第２のホモ二量体が「ＢＢ」である場合、オリゴマーコアは、「ＡＡＢＢ」などを含んでいてもよい。
代替的に、２つまたはそれよりも多くの異なる単量体を一緒に融合させて、融合産物をさらなる非同一融合産物とアセンブリさせてヘテロオリゴマーコアを形成させることができる。オリゴマーコアは、複数のヘテロ二量体を含んでいてもよく、例えば、第１のヘテロ二量体が「ＡＢ」であり、第２のヘテロ二量体が「ＣＤ」である場合、オリゴマーコアは、「ＡＢＣＤ」などを含んでいてもよい。
ホモオリゴマーコアは、複数のサブユニット単量体を含み、各単量体は、少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位を含む。例えば、ホモオリゴマーコアが３つのサブユニット単量体を含む場合、オリゴマーコアは、少なくとも３つの第１の結合部位および少なくとも３つの第２の結合部位を含むことになる。ホモオリゴマーコアが４、５、６、または７つのサブユニット単量体を含む場合、オリゴマーコアは、それぞれ、少なくとも４つの第１の結合部位および少なくとも４つの第２の結合部位；少なくとも５つの第１の結合部位および少なくとも５つの第２の結合部位；少なくとも６つの第１の結合部位および少なくとも６つの第２の結合部位；または少なくとも７つの第１の結合部位および少なくとも７つの第２の結合部位を含むことになる。したがって、多価タンパク質スキャフォールドは、好ましくは、少なくとも２つの第１の結合部位および少なくとも２つの第２の結合部位を含み、つまり、第１の結合部位のすべては他の第１の結合部位と同じであり、第２の結合部位のすべては他の第２の結合部位と同じである。多価タンパク質スキャフォールドは、より好ましくは、少なくとも３つの第１の結合部位および少なくとも３つの第２の結合部位を含む。一部の実施形態では、多価タンパク質スキャフォールドは、各々少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つの第１および第２の結合部位を含む。
ヘテロオリゴマーコアは、少なくとも２つのタイプのサブユニット単量体を含む複数のサブユニット単量体を含み、１つのタイプのサブユニット単量体は少なくとも１つの第１の結合部位を含み、第２のタイプのサブユニット単量体は少なくとも１つの第２の結合部位を含む。例えば、ヘテロオリゴマーコアが３つのサブユニット単量体を含む場合、ヘテロオリゴマーコアは、３つの異なる結合部位を含んでいてもよく、または２つの第１の結合部位および１つの第２の結合部位を含んでいてもよい。ヘテロオリゴマーコアが４つのサブユニット単量体を含む場合、ヘテロオリゴマーコアは４つの異なる結合部位を含んでいてもよく、または２つの第１の結合部位および１つの第２の結合部位および１つの第３の結合部位を含んでいてもよく、または２つの第１の結合部位および２つの第２の結合部位を含んでいてもよい。
結合部位は、本明細書でより詳細に記載されている。
単量体
上記で説明されているように、本明細書で提供される多価タンパク質スキャフォールドは、複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコアを含む。サブユニット単量体は、典型的には、本明細書の他所に記載のマルチドメインポリペプチド構築物の構造ドメインである。
各サブユニット単量体（本明細書でより詳細に記載のように、それに付着するあらゆる結合部位を除く）は、好ましくは３００個未満のアミノ酸、好ましくは２００個未満のアミノ酸、より好ましくは１５０個未満のアミノ酸を含む。例えば、各サブユニット単量体（それに付着するあらゆる結合部位を除く）は、好ましくは４０ｋＤａ未満、例えば３０ｋＤａ未満、例えば２０ｋＤａ未満の分子量を有する。そのような単量体を含む本明細書に記載のタンパク質スキャフォールドは、質量が比較的低く、ｉｎ ｖｉｖｏでの効率的な拡散が可能である。それらは、典型的には、細菌細胞発現系または酵母細胞発現系で発現され、正しくフォールディングすることが可能である。そのような発現系は、多くの場合、抗体の産生に典型的に必要とされる哺乳類細胞培養よりもはるかにより高い収率を得ることができる。
サブユニット単量体は、好ましくは、抗体または抗体断片を含みもせず、からなってもいない。オリゴマーコアまたはサブユニット単量体は、好ましくは、抗体のＦｃ領域を含みもせず、からなってもいない。一部の実施形態では、サブユニット単量体は、ＣＨ２ドメインを含みもせず、からなってもいない。一部の実施形態では、サブユニット単量体は、ＣＨ３ドメインを含みもせず、からなってもいない。一部の実施形態では、サブユニット単量体は、ＣＨ２ドメインを含まず、ＣＨ３ドメインを含まない。
好ましくは、オリゴマーコアの各単量体サブユニットは、ヒトであるかまたはヒト化されている。ヒト単量体は、ヒトオリゴマータンパク質の単量体である。ヒト化単量体は、対応するヒトタンパク質の単量体とより近似的に類似するように修飾された非ヒトオリゴマータンパク質の単量体である。したがって、ヒト化単量体は、対応するヒトタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも５０％アミノ酸同一性、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％アミノ酸同一性を含んでいてもよい。典型的には、ヒトまたはヒト化タンパク質は、それが投与される患者に有害な免疫応答を引き起こさないだろう。
オリゴマーコアに含まれるサブユニット単量体は、好ましくは、各々、サブユニット単量体の多量体化を可能にする、サブユニット単量体の構造的および／または機能的特徴である多量体化構造要素を含む。
多量体化構造要素は、タンパク質ドメインであってもよい。オリゴマーコアの多量体化構造要素は、天然に存在する多量体タンパク質の多量体化ドメイン、またはｄｅ ｎｏｖｏ多量体ドメインであってもよい。タンパク質ドメインは、タンパク質の自律的フォールディング単位である。多量体化ドメインは、典型的には、別のタンパク質ドメインとのタンパク質間相互作用に関与するタンパク質ドメインである。多量体化構造要素は、好ましくは、可溶性であり、したがって単量体およびオリゴマーコアは可溶性である。
本明細書の開示を考慮すると、当業者であれば、本発明で使用するための好適な多量体化構造要素を特定することができるだろう。例えば、当業者であれば、多量体タンパク質を特定することができる。例えば、ＮＣＢＩデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ；ｗｗｗ．ｒｓｃｂ．ｏｒｇ）などのデータベースには、数多くの多量体タンパク質が掲載されており、回転対称軸を有する多量体タンパク質を検索することができる。
好ましくは、特定される多量体タンパク質は、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体、ホモ五量体、ホモ六量体、およびホモ七量体などのホモオリゴマーである。多量体タンパク質は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、ヘテロ五量体、ヘテロ六量体、およびヘテロ七量体などのヘテロオリゴマーであってもよい。機能情報および／または構造情報を使用して、多量体タンパク質のどのドメインが多量体化に関与しているのか、つまり多量体化ドメインであるのかを特定することができる。
多量体化構造要素は、好ましくは、多量体化ドメインの多量体化界面（つまり、ドメインの多量体化を可能にする多量体化ドメインの構造要素または機能要素）を含む。多量体化ドメインの他の態様は、サブユニット単量体の多量体化に影響を及ぼすことなく修飾することができる。したがって、オリゴマーコアのサブユニット単量体は、好ましくは、多量体化構造要素を含む。サブユニット単量体は、好ましくは、それらが由来する多量体化ドメインと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性を含む。サブユニット単量体は、多量体（つまり、オリゴマーコア）を形成する能力を保持する。
好ましくは、オリゴマーコアのサブユニット単量体は、多量体タンパク質の可溶性多量体化構造要素を含む。可溶性ドメインは、例えば、膜内に見出される多量体化ドメインよりも好ましい。好ましくは、オリゴマーコアのサブユニット単量体の各々は、可溶性多量体タンパク質の可溶性多量体化構造要素を含む。
多量体化構造要素は、コラーゲン（例えば、コラーゲンＮＣ１ドメイン）、ＣｕｔＡ、ＴＮＦ、ｐ５３、フィブリノーゲン、Ｃ４、枯草菌ＡｂｒＢ、またはそれらのホモログもしくはパラログなどの、好適な対称性（例えば、本明細書でより詳細に記載のような、回転対称性または二面体対称性）を有する任意の多量体タンパク質に由来してもよい。
好ましくは、サブユニット単量体は、以下のものから選択されるタンパク質の単量体または多量体化ドメインを含んでいてもよい：Ｘ型コラーゲン（ＰＤＢ ＩＤ：１ＧＲ３）（例えば、そのＮＣ１ドメイン）、ＶＩＩＩ型コラーゲン（ＰＤＢ ＩＤ：１ｏ９１）（例えば、そのＮＣ１ドメイン）、Ｃ１ｑ頭部ドメイン（例えば、ＰＤＢ ＩＤ：１ＰＫ６はヒトＣ１ｑの球状頭部である）、またはパイロコッカス・ホリコシイ、ホモ・サピエンス（ＰＤＢ ＩＤ：２ＺＦＨ）、高度好熱菌（Thermus thermophiles）（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｖ６Ｈ）；イネ（Oryza sativa）（ＰＤＢ ＩＤ：２ＺＯＭ）；またはシュワネラ種（Shewanella sp.）ＳＩＢ１（ＰＤＢ ＩＤ：３ＡＨＰ）由来のＣｕｔＡ１タンパク質などのＣｕｔＡ（銅耐性Ａ）タンパク質；；または先行するポリペプチドのいずれか１つと少なくとも３０％もしくは少なくとも５０％アミノ酸配列同一性；より好ましくは、先行するポリペプチドのいずれか１つと少なくとも６０％アミノ酸配列同一性、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチド。
一部の実施形態では、サブユニット単量体は、以下のものを含むかまたはからなる：Ｘ型コラーゲン（ＰＤＢ ＩＤ：１ＧＲ３、または配列番号２）（例えば、そのＮＣ１ドメイン）、ＶＩＩＩ型コラーゲン（ＰＤＢ ＩＤ：１ｏ９１、または配列番号３）（例えば、そのＮＣ１ドメイン）、ヘテロマーＣ１ｑ頭部ドメイン（例えば、ＰＤＢ ＩＤ：１ＰＫ６はヒトＣ１ｑの球状頭部である。配列番号３６～３８を参照）、またはパイロコッカス・ホリコシイ（ＰＤＢ ＩＤ：４ＹＮＯ、または配列番号１）、ホモ・サピエンス（ＰＤＢ ＩＤ：２ＺＦＨ、または配列番号１９）、高度好熱菌（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｖ６Ｈ、または配列番号３９）、イネ（ＰＤＢ ＩＤ：２ＺＯＭ、または配列番号４０）；またはシュワネラ種ＳＩＢ１（ＰＤＢ ＩＤ：３ＡＨＰ、または配列番号４１）由来のＣｕｔＡ１タンパク質などのＣｕｔＡ（銅耐性Ａ）タンパク質；ＴＮＦ様タンパク質ＴＬ１Ａ（ＰＤＢ ＩＤ：２ＲＥ９、または配列番号３１）；ＴＮＦ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＴＮＦ、または配列番号４２）；ＴＮＦファミリータンパク質ＣＤ４０Ｌ（ＰＤＢ ＩＤ：３ＬＫＪ、または配列番号５８）；ヒトマクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）（ＰＤＢ ＩＤ：１ＣＡ７、または配列番号２５、またはＹ９９Ｇ突然変異を有するＰＤＢ ＩＤ：６ＯＹ８）；ヒトマクロファージ遊走阻害因子２（ＭＩＦ２）（ＰＤＢ ＩＤ：７ＭＳＥ、または配列番号２６、またはＳ６２ＡおよびＦ９９Ａ突然変異を有する配列番号２７）、またはそれらのホモログもしくはパラログ。
他の多量体化ドメインとしては、以下のものの多量体化ドメインが挙げられる：逆平行コイルドコイル六量体（ＰＤＢ ＩＤ：５Ｗ０Ｊ、実施例４を参照、配列番号４３）、ＨＩＶ－１ ＧＰ４１コア（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｉ５Ｙまたは配列番号４４）、シトクロムｃ５５５（ＰＤＢ ＩＤ：５Ｚ２５または配列番号４５）、ＭＨＣクラスＩＩ関連シャペロニンおよびターゲティングタンパク質インバリアント鎖（Ｉｉ）（ＰＤＢ ＩＤ：１ｉｉｅまたは配列番号４６）；ｐ５３（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｃ２６または配列番号４７）；フィブリノーゲン様ドメイン（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｍ７Ｆまたは配列番号４８）、ＩＶ型コラーゲンＣ４（ＰＤＢ ＩＤ：１ＬＩ１または配列番号４９）；枯草菌ＡｂｒＢ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＹＦＢまたは配列番号５０）；または先行するポリペプチドのいずれか１つと少なくとも５０％アミノ酸配列同一性；より好ましくは、先行するポリペプチドのいずれか１つと少なくとも６０％アミノ酸配列同一性、例えば少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチド。
他の多量体化ドメインとしては、以下のものの多量体化ドメインが挙げられる：バクテリオファージラムダ頭部ドメインＤ（例えば、ＰＤＢ ＩＤ：１Ｃ５ＥまたはＰＤＢ ＩＤ：１Ｃ５Ｅまたは配列番号５１）；ＨＣＲＢＰＩＩのドメインスワップ三量体バリアント（ＰＤＢ ＩＤ：６ＶＩＳまたは配列番号５２）；Ｔ１Ｌレオウイルス付着タンパク質シグマ１（ＰＤＢ ＩＤ：４ＯＤＢの鎖Ａ、Ｂ、Ｃ、または配列番号５３）；または先行するタンパク質のいずれか１つと少なくとも５０％アミノ酸配列同一性；より好ましくは、先行するタンパク質のいずれか１つと少なくとも６０％アミノ酸配列同一性、例えば少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチド。
好ましくは、一実施形態では、オリゴマーコアは、パイロコッカス・ホリコシイＣｕｔＡ１の多量体化構造要素に由来する単量体を含んでいてもよい。したがって、サブユニット単量体または各サブユニット単量体は、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも３０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含んでいてもよくまたはからなっていてもよい。
本明細書の上記および他所で考察されているように、ＣｕｔＡ１（例えば、パイロコッカス・ホリコシイ）は、マルチドメインポリペプチド構築物の典型的な構造ドメインである。
好ましくは、別の実施形態では、オリゴマーコアは、Ｘ型コラーゲンＮＣ１の多量体化構造要素に由来する単量体を含んでいてもよい。したがって、サブユニット単量体または各サブユニット単量体は、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも３０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含んでいてもよくまたはからなっていてもよい。
本明細書の上記および他所で考察されているように、Ｘ型コラーゲンＮＣ１は、マルチドメインポリペプチド構築物の典型的な構造ドメインである。
好ましくは、別の実施形態では、オリゴマーコアは、ＶＩＩＩ型コラーゲンＮＣ１の多量体化構造要素に由来する単量体を含んでいてもよい。したがって、サブユニット単量体または各サブユニット単量体は、配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも３０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含んでいてもよくまたはからなっていてもよい。
本明細書の上記および他所で考察されているように、ＶＩＩＩ型コラーゲンＮＣ１は、マルチドメインポリペプチド構築物の典型的な構造ドメインである。
好ましくは、別の実施形態では、オリゴマーコアは、ホモ・サピエンスに由来するＣｕｔＡ１の多量体化構造要素に由来する単量体を含んでいてもよい。したがって、サブユニット単量体または各サブユニット単量体は、配列番号１９のアミノ酸配列と、少なくとも３０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含んでいてもよくまたはからなっていてもよい。
本明細書の上記および他所で考察されているように、ＣｕｔＡ１（例えば、ヒト）は、マルチドメインポリペプチド構築物の典型的な構造ドメインである。
好ましくは、別の実施形態では、オリゴマーコアは、ＭＩＦまたはＭＩＦ－２の多量体化構造要素に由来する単量体を含んでいてもよい。したがって、サブユニット単量体または各サブユニット単量体は、配列番号２５または配列番号２６または配列番号２７のアミノ酸配列と、少なくとも３０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含んでいてもよくまたはからなっていてもよい。
本明細書の上記および他所で考察されているように、ＭＩＦは、マルチドメインポリペプチド構築物の典型的な構造ドメインである。本明細書の上記および他所で考察されているように、ＭＩＦ－２は、マルチドメインポリペプチド構築物の典型的な構造ドメインである。
好ましくは、別の実施形態では、オリゴマーコアは、ＴＮＦおよびＴＮＦ様ＴＬ１ＡまたはＣＤ４０Ｌを含む、多量体化構造要素ＴＮＦファミリータンパク質に由来する単量体を含んでいてもよい。したがって、サブユニット単量体または各サブユニット単量体は、配列番号４２または配列番号３１または配列番号５８のアミノ酸配列と、少なくとも３０％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含んでいてもよくまたはからなっていてもよい。
本明細書の上記および他所で考察されているように、ＴＮＦは、マルチドメインポリペプチド構築物の典型的な構造ドメインである。本明細書の上記および他所で考察されているように、ＴＮＦ様タンパク質は、マルチドメインポリペプチド構築物の典型的な構造ドメインである。
オリゴマーコアがヘテロオリゴマーコアである場合、オリゴマーコアの各単量体は同じタンパク質に由来してもよい。例えば、オリゴマーコアの各単量体は、上記に記載のタンパク質の１つに由来してもよい。オリゴマーコアは、各単量体サブユニットの多量体化ドメインが同一であったとしても、単量体サブユニットに付着した結合部位が異なるためヘテロマーであり得る。オリゴマーコアは、すべての単量体サブユニットが同じタンパク質に由来する場合であっても、単量体サブユニットの多量体化ドメインが異なるためヘテロマーであり得る。
当業者であれば、本明細書で提供される多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアの単量体サブユニットをさらに変更して、追加の機能性または有益な特性を提供することができることを理解するだろう。
例えば、単量体は、本明細書に記載の単量体または多量体化構造要素の断片、誘導体、またはバリアントであってもよい。当業者であれば理解することになるように、アミノ酸配列の断片としては、１つまたは複数の、例えば少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、または１００個のアミノ酸が欠失されている、そのような配列の欠失バリアントが挙げられる。欠失は、天然配列のＣ末端またはＮ末端に生じてもよく、または天然配列内部に生じてもよい。典型的には、１つまたは複数のアミノ酸の欠失は、サブユニット単量体の多量体化構造要素のすぐ周囲にある残基には影響を及ぼさない。
アミノ酸配列の誘導体としては、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで修飾される配列を含む、翻訳後修飾配列が挙げられる。多数の異なるタンパク質修飾が当業者に公知であり、アミノ酸残基に新しい機能性を導入するための修飾、反応性アミノ酸残基を保護するための修飾、またはそのようなアミノ酸残基に付着させるためのリンカーもしくは基質（表面）の反応性官能基などの化学部分にアミノ酸残基をカップリングするための修飾が挙げられる。
また、アミノ酸配列の誘導体としては、１つまたは複数の、例えば少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、または１００個のアミノ酸が天然配列に付加または導入されている、そのような配列の付加バリアントが挙げられる。付加は、天然配列のＣ末端またはＮ末端に生じてもよく、または天然配列内部に生じてもよい。典型的には、１つまたは複数のアミノ酸の付加は、サブユニット単量体の多量体化構造要素のすぐ周囲にある残基には影響を及ぼさない。
アミノ酸配列のバリアントとしては、天然配列の１つまたは複数のアミノ酸、例えば少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、または１００個のアミノ酸残基が１つまたは複数の非天然残基と交換されている配列が挙げられる。したがって、そのようなバリアントは、点突然変異を含んでいてもよく、またはより顕著な突然変異であってもよく、例えばネイティブ化学ライゲーションを使用して、非天然アミノ酸配列を部分的天然配列へとスプライスし、天然酵素のバリアントを産生することができる。アミノ酸配列のバリアントとしては、天然に存在するアミノ酸および／または非天然アミノ酸を有する配列が挙げられる。
上述のアミノ酸配列のバリアント、誘導体、および機能的断片は、典型的には、野生型配列のオリゴマー化能力を保持する。好ましくは、上述の配列のバリアント、誘導体、および機能的断片は、野生型または天然配列と比較して、安定性の増加、毒性の低減、結合部位を含む追加の機能性などの特性の向上を示す。
結合部位
多価タンパク質スキャフォールドは、少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位を含む。一部の実施形態では、典型的には、創薬においてエフェクター分子の有用な組合せを特定するのに有用なモジュール式系では、少なくとも１つの第１の結合部位は、少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である。換言すれば、第１の結合部位がそれによりその標的（第１の標的）に結合する化学反応は、第２の結合部位がその標的（第２の標的）に結合する化学反応に対して直交性である。したがって、第１の標的は第１の結合部位には結合することになるが、第２の結合部位には結合せず、第２の標的は第２の結合部位には結合することになるが、第１の結合部位には結合しない。したがって、直交性という用語には、タンパク質間相互作用の分野におけるその通常の意味が与えられ、第１の結合相互作用（つまり、第１の結合部位および第１のリガンド）は、第２の結合相互作用（つまり、第２の結合部位および第２のリガンド）とは無関係である。
多価タンパク質スキャフォールドの結合部位は、スキャフォールドを、エフェクター部分に結合するモジュール式系として使用することを可能にする。第１および第２の結合部位は、エフェクター部分でそれらの同族標的に結合する。
第１および第２の結合部位は、本明細書で提供される多価タンパク質スキャフォールドに任意の好適な方法で組み込むことができる。一実施形態では、第１および第２の結合部位は、本明細書に記載のようにオリゴマーコアの単量体または各単量体に付着して、多価タンパク質スキャフォールドを形成するタンデム融合体として提供される。比較のため、配列番号２２は、αＨリンカーにより連結された融合体として提供される２つの結合部位（本明細書に記載の）の例である。
結合部位は、下記でより詳細に記載されている。
結合部位とその標的との相互作用は、非共有結合性相互作用であってもよい。好ましくは、結合部位または各結合部位は、それぞれの標的と共有結合を形成することができる。反応性官能基は、サブユニット単量体もしくはエフェクター部分に天然に存在していてもよく、または、例えば遺伝子改変もしくは単量体の化学修飾により導入してもよい。反応性基は、その合成または発現中に、例えば無細胞発現中に、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を介して単量体に組み込まれる非天然アミノ酸に由来してもよい。
多価タンパク質スキャフォールドの結合部位は、反応性基を介してその標的に結合することができる。任意の好適な反応性基を使用することができる。例えば、反応性基は、アミン反応性基；カルボキシル反応性基；スルフヒドリル反応性基またはカルボニル反応性基であってもよい。反応性基は、システイン反応性基を含んでいてもよい。反応性基は、マレイミド、アジド、チオール、アルキン、ＮＨＳエステル、またはハロアセトアミドを含んでいてもよい。
反応性基は、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（Ｆａｚ）、およびLiu C. C. and Schultz P. G., Annu. Rev. Biochem., 2010, 79, 413-444の図１の１～７１番のアミノ酸のいずれか１つなどの非天然アミノ酸と反応することが可能な基であってもよい。そのような基は、対応する非天然アミノ酸が結合部位および同族標的に含まれている場合に特に有用である。
反応性基は、クリックケミストリー基であってもよい。クリックケミストリーは、Ｋｏｌｂら、２００１年により初めて導入された、小規模応用および大規模応用の両方において信頼性高く機能する、強力で選択的でありモジュール式のビルディングブロックの拡張セットを記述するための用語である（Kolb HC, Finn, MG, Sharpless KB, Click chemistry: diverse chemical function from a few good reactions, Angew. Chem. Int. Ed. 40 (2001) 2004-2021）。Ｋｏｌｂらは、クリックケミストリーに関する１セットの厳格な基準を以下のように規定している：「反応はモジュール式であり、範囲が広く、非常に高い収率が得られ、非クロマトグラフィー法で除去することできる無害副産物しか生成せず、立体特異的でなければならない（しかしながら、必ずしもエナンチオ選択的ではない）。必要とされるプロセス特徴としては、反応条件が単純であること（理想的には、プロセスは酸素および水の影響を受けるべきではない）、出発物質および試薬が容易に入手可能であること、溶媒を使用しないか、または（水などの）穏和であるかもしくは簡単に除去することができる溶媒を使用すること、および生成物単離が簡便であることが挙げられる。必要に応じて精製は、結晶化または蒸留などの非クロマトグラフィー法によるものでなければならず、生成物は生理学的条件下で安定でなければならない」。
例えば、第１および第２の結合部位は、直交性クリックケミストリー試薬を含んでもよい。クリックケミストリーの好適な例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：
（ａ）アジドが例えばシクロオクタン環における歪み下のアルキンと反応する、１，３双極子環化付加反応の銅を含まない変化型反応、
（ｂ）一方のリンカーにある酸素求核剤と、他方のリンカーにあるエポキシドまたはアジリジン反応性部分との反応、
（ｃ）アルキン部分をアリールホスフィンに置き換えることができ、アジドとの特異的反応が生じてアミド結合がもたらされる、シュタウディンガーライゲーション、
（ｄ）ニトロン双極子環化付加、
（ｅ）ノルボルネン環化付加、
（ｆ）オキサノルボルナジエン環化付加、
（ｇ）テトラジンライゲーション、
（ｈ）［４＋１］環化付加、
（ｉ）テトラゾールフォトクリックケミストリー、および
（ｊ）クアドリシクランライゲーション。
反応性基は、ハロアセトアミド、例えばヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、またはクロロアセトアミドであってもよい。
反応性基は、ビニル基、ＴＣＯ、テトラジン、および歪みアルキン；ＤＢＣＯ；活性化された酸、例えば酸塩化物；およびピペラジン、および反応性アミンから選択することができる。
ホスト－ゲスト化学反応を使用して、結合部位とその標的との間の反応を提供することもできる。例えば、結合部位は、金属錯体に結合するためのリガンドを含んでいてもよく、標的は金属錯体を含み、またはその逆である。したがって、結合部位は、安定した会合を形成することにより、修飾因子分子と錯体を形成するリガンドとして作用することができる部位を含むその標的と、キレート化または超分子会合を介して非共有結合的に相互作用することができる金属錯体を含んでいてもよく、またはその逆であってもよい。
反応性基は、Sakamoto and Hamachi, "Recent progress in chemical modification of proteins", Anal. Sci 2019 (35) 5-27；またはMcKay and Finn, "Click chemistry in complex mixtures: bioorthogonal bioconjugation", Chem. Biol. 2014, 21(9) 1075-1101に開示されているもののいずれかであってもよい。これら文献は両方とも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
多価タンパク質スキャフォールドの結合部位は、好ましくは、タンパク質ドメインなどのポリペプチドを含む。より好ましくは、第１の結合部位は第１のタンパク質ドメインを含み、前記第２の結合部位は第２のタンパク質ドメインを含む。
第１の結合部位が第１のタンパク質ドメインを含み、第２の結合部位が第２のタンパク質ドメインを含む場合、第１の結合部位および／または第２の結合部位は、好ましくは、それらが付着するサブユニット単量体と遺伝子的に融合されており、単一のポリペプチド鎖を形成する。典型的には、第１の結合部位および／または第２の結合部位は、それらが付着するサブユニット単量体を有する単一のポリペプチド鎖として、例えば融合タンパク質として、組換え核酸分子から発現される。これは、例えばクリックケミストリー試薬を付着させるために必要なさらなる化学修飾を必要とせずに、多価タンパク質スキャフォールドを、エフェクター部分に結合する準備ができた状態で発現させることができるという点で有益であり得る。タンパク質結合部位と、それが付着するタンパク質、例えば多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアの単量体サブユニットとの付着は、下記に記載されている。
第１の結合部位は、第１のポリペプチド標的と非共有結合を形成することが可能な第１のタンパク質ドメインを含んでいてもよく、前記第２の結合部位は、第２のポリペプチド標的と非共有結合を形成することが可能な第２のタンパク質ドメインを含んでいてもよい。より好ましくは、第１の結合部位は、第１のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第１のタンパク質ドメインを含み、前記第２の結合部位は、第２のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第２のタンパク質ドメインを含む。任意の好適な共有結合を、上記の例と形成することができる。好ましくは、第１のタンパク質ドメインは、第１のポリペプチド標的とイソペプチド結合を形成することが可能であり、第２のタンパク質ドメインは、第２の結合標的とイソペプチド結合を形成することが可能である。イソペプチド結合は、例えば、１つのアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基との間に形成させることができるアミド結合である。こうした接合基の少なくとも１つは、典型的には、こうしたアミノ酸の１つの側鎖の一部である。
好ましくは、第１の結合部位および第２の結合部位は各々、スプリットリガンド結合タンパク質ドメインなどの、異なるスプリットタンパク質ドメインを含む。本明細書で使用される場合、リガンド結合タンパク質ドメインは、タンパク質結合リガンドのドメインである。任意の好適なタンパク質を使用することができるが、イソペプチド結合などの鎖内共有結合により天然で安定化されているタンパク質が特に有益である。そのような場合、イソペプチド結合供与残基を含むタンパク質の部分は、イソペプチド結合受容残基を含むペプチドの部分とは分割されている。２つのタンパク質断片は、例えば遺伝子融合により、本明細書に記載のオリゴマーコアの単量体および／またはポリペプチド標的などのさらなるポリペプチドに付着させることができる。２つの別々の断片を接触させることにより、典型的には２つの断片が不可逆的に付着するイソペプチド結合の作出に結び付く。したがって、結合部位および相補的タグを生成するスプリットタンパク質手法は特に有用である。そのような結合部位／タグの対は、１つのタンパク質の断片が、任意の他の潜在的なパートナーよりもその天然パートナー（つまり、それが由来していたタンパク質の相補的部分）と優先的にまたは排他的に結合することになるため、典型的には直交性である。こうした原理は、例えば、Reddington & Howarth, Curr. Op. Chem. Biol. 29, 94-99 (2015) and Keeble et al, PNAS 2019 116(52) 26523で考察されている。
好ましくは、前記第１の結合部位および前記第２の結合部位の一方は、スプリットストレプトコッカス・ピオゲネスフィブロネクチン結合タンパク質ドメインを含み、前記第１の結合部位および前記第２の結合部位の他方は、スプリットストレプトコッカス・ニューモニエアドヘシンドメインを含む。
好ましくは、第１のタンパク質ドメインおよび第１のポリペプチド標的、ならびに第２のタンパク質ドメインおよび第２のポリペプチド標的は、各々、国際公開第２０１６／１９３７４６号パンフレット、国際公開第２０１８／１９７８５４号パンフレット、国際公開第２０１８／１８９５１７号パンフレット、Keeble et al. (PNAS 116(52), 2019: 26523-26533)、Fierer et al. (PNAS 111(13), 2014: E1176-E1181)に記載のものなどのペプチドリンカー対を含んでいてもよい。
好ましくは、前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は、各々独立して、配列番号４～９、１１～１３、２３、または１５～１８のいずれか１つと、少なくとも５０％アミノ酸同一性を有する。
好ましくは、前記第１の結合部位／ポリペプチド標的対および第２の結合部位／ポリペプチド標的対は、各々独立して、（ｉ）配列番号４、６、もしくは８のいずれか１つと配列番号５、７、もしくは９のいずれか１つとの組合せ；（ｉｉ）配列番号１２と配列番号１３もしくは１５との組合せ；（ｉｉｉ）配列番号５と配列番号１１との組合せ；（ｉｖ）配列番号１５と配列番号１６との組合せ；（ｖ）配列番号１７と配列番号１８との組合せ、または（ｖｉ）配列番号２３と配列番号１６との組合せから選択される。
より好ましくは、第１のタンパク質ドメインおよび第１のポリペプチド標的、ならびに第２のタンパク質ドメインおよび第２のポリペプチド標的は、各々独立して、以下の対から選択される。
Figure 2024511155000003
Figure 2024511155000004
タンパク質ドメインおよび標的ドメインは、タンパク質ドメインが標的ドメインと特異的に結合する能力を保持しつつ、上記に示されている配列と少なくとも５０％のアミノ酸同一性、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％アミノ酸同一性を有していてもよい。
一部の実施形態では、第１の結合部位はタンパク質ドメインであり、第１の標的は、第１のタンパク質ドメインに結合するタグである。第２の結合部位はタンパク質ドメインであり、第２の標的は、第２のタンパク質ドメインに結合するタグである。一部の実施形態では、第１の結合部位はタグであり、第１の標的は、第１のタグに結合するタンパク質ドメインである。第２の結合部位はタグであり、第２の標的は、第２のタグに結合するタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、第１の結合部位はタンパク質ドメインであり、第１の標的は、第１のタンパク質ドメインに結合するタグである。第２の結合部位はタグであり、第２の標的は、第２のタグに結合するタンパク質ドメインである。好ましくは、第１および第２の結合部位は両方ともタンパク質ドメインであり、第１および第２の標的は、それぞれ第１および第２のタンパク質ドメインに特異的に結合するタグである。
より好ましくは、第１のタンパク質ドメインおよび第１のポリペプチド標的、ならびに第２のタンパク質ドメインおよび第２のポリペプチド標的は、各々独立して、以下のペアから選択される。
Figure 2024511155000005
タンパク質ドメインおよび標的ドメインは、タンパク質ドメインが標的ドメインと特異的に結合する能力を保持しつつ、上記に示されている配列と、少なくとも５０％アミノ酸同一性、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％アミノ酸同一性を有していてもよい。
上記の結合グループおよび標的は、以下のサブグループに分類することができる。
サブグループＡ：
－ ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号４）／ＳｐｙＴａｇ（配列番号５）；
－ ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号４）／ＳｐｙＴａｇ００２（配列番号７）；
－ ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号４）／ＳｐｙＴａｇ００３（配列番号９）；
－ ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２（配列番号６）／ＳｐｙＴａｇ （配列番号５）；
－ ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２（配列番号６）／ＳｐｙＴａｇ００２（配列番号７）；
－ ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２（配列番号６）／ＳｐｙＴａｇ００３（配列番号９）；
－ ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３（配列番号６）／ＳｐｙＴａｇ００３（配列番号５）；
－ ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３（配列番号６）／ＳｐｙＴａｇ００３（配列番号７）；
－ ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３（配列番号８）／ＳｐｙＴａｇ００３（配列番号９）；
－ ＳｐｙＴａｇ（配列番号５）／Ｋ－ｔａｇ（配列番号１１）（ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（配列番号１０）により媒介される）
サブグループＢ：
－ ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（配列番号１２）／ＳｎｏｏｐＴａｇ（配列番号１３）；
－ ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（配列番号１２）／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ（配列番号１５）；
－ ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ（配列番号１５）／ＤｏｇＴａｇ（配列番号１６）（ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（配列番号１４）により媒介される／
－ ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ （配列番号２３） ／ ＤｏｇＴａｇ （配列番号１６）
サブグループＣ
－ Ｐｉｌｉｎ－Ｃ（配列番号１７）／ＩｓｏｐｅｐＴａｇ（配列番号１８）
好ましくは、第１の結合部位／標的対はサブグループＡから選択され、第２の結合部位／標的対はサブグループＢおよびサブグループＣから選択されるか、または第１の結合部位／標的対はサブグループＢから選択され、第２の結合部位／標的対はサブグループＡおよびサブグループＣから選択されるか、または第１の結合部位／標的対はサブグループＣから選択され、第２の結合部位／標的対はサブグループＡおよびサブグループＢから選択される。
さらにより好ましくは、第１のタンパク質ドメイン－ポリペプチド標的対および第２のタンパク質ドメイン－ポリペプチド標的は、以下のものからなる群から選択することができる：（ｉ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ／ＳｎｏｏｐＴａｇ；（ｉｉ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２／ＳｐｙＴａｇ００２およびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ／ＳｎｏｏｐＴａｇ；（ｉｉｉ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３／ＳｐｙＴａｇ００３およびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ／ＳｎｏｏｐＴａｇ；（ｉｖ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇおよびＰｉｌｉｎ－Ｃ／Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ；（ｖ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２／ＳｐｙＴａｇ００２およびＰｉｌｉｎ－Ｃ／Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ；（ｖｉ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３／ＳｐｙＴａｇ００３およびＰｉｌｉｎ－Ｃ／Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ；（ｖｉｉ）Ｐｉｌｉｎ－Ｃ／ＩｓｏｐｅｐｔａｇおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ／ＳｎｏｏｐＴａｇ；（ｖｉｉｉ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ／ＤｏｇＴａｇ；（ｉｘ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２／ＳｐｙＴａｇ００２およびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ／ＤｏｇＴａｇ；（ｘ）ＳｐｙＴａｇ／Ｋ－ｔａｇおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ／ＳｎｏｏｐＴａｇ；（ｘｉ）ＳｐｙＴａｇ／Ｋ－ｔａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ／ＤｏｇＴａｇ；（ｘｉｉ）ＳｐｙＴａｇ／Ｋ－ｔａｇおよびＰｉｌｉｎ－Ｃ／Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ；および（ｘｉｉｉ）ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ／ＤｏｇＴａｇおよびＰｉｌｉｎ－Ｃ／Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ；ならびに（ｘｉｖ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３／ＳｐｙＴａｇ００３およびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ／ＤｏｇＴａｇ；および（ｘｖ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３／ＳｐｙＴａｇ００２およびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ／ＤｏｇＴａｇ；および（ｘｖｉ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３／ＳｐｙＴａｇおよびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ／ＤｏｇＴａｇ；（ｘｖｉｉ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３／ＳｐｙＴａｇ００３およびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ；および（ｘｖｉｉｉ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３／ＳｐｙＴａｇ００２およびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ；ならびに（ｘｉｘ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３／ＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ。
当業者であれば、ＳｐｙＬｉｇａｓｅ／ＳｐｙＴａｇ／Ｋ－ｔａｇ、またはＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ／ＤｏｇＴａｇを使用する場合、「リガーゼ」が２つのタグの付着を触媒することを理解するだろう。したがって、第１の結合部位および第１のポリペプチド標的、ならびに第２の結合部位および第２のポリペプチド標的は、この２つの「タグ」から選択される。リガーゼを外因的に添加して２つの「タグ」の付着を触媒してもよく、または多価タンパク質スキャフォールドと遺伝子的に融合するなど、非共有結合的または共有結合的に多価タンパク質スキャフォールドと付随させてもよい。どちらのタグが多価タンパク質スキャフォールド内に含まれるかは交換可能である。
他の結合部位／タグ対としては、ＳｄｙＴａｇ／ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒ（Tan et al, PLOS One 11(1) e0165074）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）細胞表面接着タンパク質Ｃｐｅ０１４７に由来するＣｐｅ０１４７４３９～５６３／Ｃｐｅ０１４７５６５～５８７対（Young et al, Chem Comm. 53(9) 1502）が挙げられる。
「特異的に結合する」は、結合部位とその標的との結合の状況において本明細書で使用される場合、結合部位が、無関連対照に結合するよりも高い親和性でその相補的結合部位に結合する能力を指す。無関連対照は、無関連対照タンパク質であってもよい。例えば、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒは、無関連対照タンパク質に結合するよりも高い親和性でＳｎｏｏｐＴａｇと特異的に結合する。結合は、好ましくは、イソペプチド結合の形成など、共有結合性である。好ましくは、対照タンパク質はウシ血清アルブミンであり、結合部位は、対照タンパク質よりも、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍高い親和性で相補的結合部位に結合する。親和性は、当技術分野で公知の方法により決定することができる。例えば、親和性は、ＥＬＩＳＡアッセイ、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴法、速度論的方法、または平衡／溶液法により決定することができる。当業者であれば、どの結合部位対が特異的に結合して、本発明の方法で使用することができるタンパク質複合体を生成するかを認識するだろう。
少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位は、好ましくは、抗体も抗体断片も含まない。少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位は、より好ましくは、ＦａｂまたはＦｃ領域など、抗体の抗原結合性断片を含まない。
本明細書での「標的」に結合する「結合部位」に関するすべての考察では、当業者であれば、化学結合基が可逆的であることを容易に理解するであろう。換言すれば、上記の結合は、その結合部位に対する標的の対応する反応性基Ｂとの結合部位における反応性基Ａの反応の観点から説明されているが、結合部位における反応性基Ｂは標的の反応性基Ａと反応する同等の化学反応が可能である。
多価タンパク質スキャフォールドが、タンパク質ドメイン、例えば、多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアの単量体サブユニットに付着したタンパク質ドメインである１つまたは複数の結合部位を含む場合、タンパク質ドメインは、任意の好適な手段により、多価タンパク質スキャフォールドに付着させることができる（例えば、多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアの単量体サブユニットに付着させることができる）。
結合部位は、リンカーにより多価タンパク質スキャフォールドに付着していてもよい（例えば、多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアの単量体サブユニットに付着していてもよい）。一実施形態では、オリゴマーコアのサブユニット単量体の各末端に同じリンカーを使用してもよい。別の実施形態では、オリゴマーコアのサブユニット単量体の各末端に異なるリンカーを使用してもよい。
結合部位は、好ましくは、オリゴマーコア（またはサブユニット単量体）に共有結合で付着している。共有結合連結は、例えば、ペプチド結合、ジスルフィド結合、またはクリックケミストリー連結であってもよい。より好ましくは、共有結合連結は、少なくとも１つのアミノ酸、つまりペプチドリンカーを含み、結合部位においてサブユニット単量体と同じポリペプチド鎖の一部を形成する。
結合部位を、多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアの単量体サブユニットに付着させるために使用されるペプチドリンカーは、サブユニット単量体および／または結合部位に遺伝子的に融合されていてもよい。リンカーが、サブユニット単量体および／または結合部位を有する単一の構築物として、単一のポリヌクレオチドコード配列から発現される場合、リンカーは遺伝子的に融合されている。ペプチドリンカーの長さ、可撓性、および親水性は、典型的には、結合部位がオリゴマーコアまたは多価タンパク質スキャフォールドの同じ面に位置することができるように設計される。ペプチドリンカーは、典型的には、結合部位の指向性係留を可能にする。
結合部位を単量体サブユニットに接続する際に使用するための好適なペプチドリンカーは、典型的には、１～１００、１～５０、１～２５、１～２０、１～１５、または１～１０アミノ酸長である。リンカーは、例えば、以下のアミノ酸：リジン、セリン、アルギニン、プロリン、グリシン、およびアラニンの１つまたは複数で構成されていてもよい。好適な可撓性ペプチドリンカーの例は、２～２０個、例えば４、６、８、１０、または１６個のセリンおよび／またはグリシンアミノ酸のストレッチである。剛性のリンカーの例は、２～３０個、例えば４、６、８、１６、または２４個のプロリンアミノ酸のストレッチである。好適なリンカーの例としては、これらに限定されないが、以下のもの：ＧＧＧＳ、ＰＧＧＳ、ＰＧＧＧ、ＲＰＰＰＰＰ、ＲＰＰＰＰ、ＶＧＧ、ＲＰＰＧ、ＰＰＰＰ、ＲＰＰＧ、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰ、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ、ＲＰＰＧ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＳＧ、ＳＧＳＧ、ＳＧＳＧＳＧ、ＳＧＳＧＳＧＳＧ、ＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ、およびＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧが挙げられ、配列中、Ｇはグリシン、Ｐはプロリン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、およびＶはバリンである。他の例示的なリンカーとしては、ＧＳＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳが挙げられる。適切な連結基は、従来のモデリング技法を使用して設計することができる。リンカーは、典型的には、結合部位および単量体サブユニットが、対応するタンパク質オリゴマーへとアセンブリすることを可能にするのに十分な可撓性を有する。
多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアは、好ましくは、サブユニット単量体の末端に少なくとも１つの第１の結合部位、およびサブユニット単量体の末端に少なくとも１つの第２の結合部位を含む。例えば、第１の結合部位はサブユニット単量体の第１の末端に位置してもよく、第２の結合部位はサブユニット単量体の第２の末端に位置してもよい。
末端は、好ましくは、いかなるリンカーも結合部位も含まない、オリゴマーコアのサブユニット単量体の末端を参照して決定される。より好ましくは、サブユニット単量体の末端は、サブユニット単量体のＮ末端および／またはＣ末端から選択される。結合部位（例えば、タンパク質ドメイン）がサブユニット単量体と同じポリペプチドの一部を形成する場合、Ｎ末端およびＣ末端は、好ましくは、結合部位が存在しない場合の単量体のそれぞれの末端に対応するアミノ酸に関する。同様に、リンカーがサブユニット単量体と同じポリペプチドの一部を形成する場合、Ｎ末端およびＣ末端は、好ましくは、リンカーが存在しない場合の単量体のそれぞれの末端に対応するアミノ酸に関する。
好ましくは、結合部位が付着しているサブユニット単量体の末端は、上記でより詳細に規定したように、オリゴマーコアまたは多量体タンパク質スキャフォールドの同じ面に存在する。
一部の場合では、オリゴマーコアは、各サブユニット単量体の単一の末端のみを所与の面に含む。この場合、少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位は、典型的には、両方とも同じ末端に付着しており、それにより多価タンパク質スキャフォールドの同じ面に存在する。例えば、オリゴマーコアは複数のサブユニット単量体を含んでもよく、各サブユニット単量体は、前記単量体の第１の末端に付着した第１の結合部位、および前記第１の結合部位に付着した第２の結合部位を含む。オリゴマーコアは複数のサブユニット単量体を含んでもよく、少なくとも１つの第１の結合部位は、第１のサブユニット単量体の第１の末端に付着しており、少なくとも１つの第２の結合部位は、第２のサブユニット単量体（例えば、ヘテロオリゴマーコア）の第２の末端に付着している。オリゴマーコアは、上記に記載の付着方法の組合せを含んでもよい。
多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアのサブユニット単量体は、好ましくは各々が、単量体の単一の面に（したがって、オリゴマーコアおよび多価タンパク質スキャフォールドの単一の面に）２つの末端を含む。２つの末端は、好ましくは、単量体ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端である。各単量体は、より好ましくは、前記単量体の第１の末端に付着した第１の結合部位、および前記単量体の第２の末端に付着した第２の結合部位を含む。第１および第２の結合部位は、それぞれＮ末端およびＣ末端に存在してもよく、またはそれぞれＣ末端およびＮ末端に存在してもよい。
場合によっては、単量体は、各末端に１つよりも多くの結合部位を含んでいてもよい。例えば、サブユニット単量体は、各末端に以下ものを含んでいてもよい：（ｉ）前記単量体の末端に付着した第１の結合部位および前記第１の結合部位に付着した第２の結合部位、またはその逆のもの、（ｉｉ）前記単量体の末端に付着した第１の結合部位、および前記第１の結合部位に付着した少なくとも１つのさらなる第１の結合部位、（ｉｉｉ）前記単量体の末端に付着した第２の結合部位、および前記第２の結合部位に付着した少なくとも１つのさらなる第２の結合部位、（ｉｖ）前記単量体の末端に付着した単一の第１または第２の結合部位。
多価タンパク質スキャフォールドにおける結合部位の位置
上記に記載のように、本明細書で提供される多価タンパク質スキャフォールドでは、少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位は、スキャフォールドの同じ面に位置する。同様に、マルチドメインポリペプチド構築物の典型的な実施形態では、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、ポリペプチド構築物の同じ面に位置する。
多価タンパク質スキャフォールド（またはマルチドメインポリペプチド構築物）の同じ面に位置することにより、少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位は、最終的に結合部位を介して多価タンパク質スキャフォールドに結合したエフェクター部分が単一の表面または平面にあるそれぞれの生物学的標的（例えば、細胞表面の受容体）と相互作用することができるように配置される。
少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位は、多価タンパク質スキャフォールド（またはマルチドメインポリペプチド構築物）の同じ面に位置する。好ましくは、少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位は、オリゴマーコアの同じ面に位置する。好ましくは、少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位は、それらが付着しているサブユニット単量体の同じ面に位置する。本明細書に記載のように、サブユニット単量体は、典型的には、マルチドメインポリペプチド構築物の構造ドメインである。
「少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位は、スキャフォールドの同じ面に位置する」という用語は、図１および２を参照して、以下のように理解することができる。
多価タンパク質スキャフォールド（１）またはオリゴマーコア（１０）は、コアの単量体の数に対応する概念的な回転対称軸（２０）を含む。例えば、ホモ三量体コアはＣ３対称軸を含む。例えば、ホモオリゴマー五量体コアはＣ５対称軸を含む。同様にヘテロオリゴマーコアは、オリゴマーコアの中心を通り、各サブユニット間の界面に平行に延びる概念的な回転軸を含む。例えば、ヘテロ二量体の回転軸は、オリゴマーコアを通り、単量体間の界面の長さに平行に延びる。ヘテロ三量体の回転軸は、オリゴマーコアを通り、単量体間の少なくとも２つの界面の長さにできるだけ平行に延びる。平面（２１）は、回転軸に対して垂直またはほぼ垂直（例えば、約８０°～約１００°、例えば約８５°～約９５°、例えば約８８°～約９２°、例えば約９０°）であり、オリゴマーコアの中心を通って延びると規定することができる。少なくとも１つの第１の結合部位（１１）および少なくとも１つの第２の結合部位（１２）は、その平面の同じ側に位置し、したがって多価タンパク質スキャフォールド（１）の同じ面に位置する。これは、図１に概略的に示されており、図１には、三量体オリゴマーコアが示されており、明瞭性のために１つの第１の結合部位および１つの第２の結合部位のみが示されている。対照的に、図２は、少なくとも１つの第１の結合部位（１１）および少なくとも１つの第２の結合部位（１２）が平面（２１）の反対側に位置しており、したがって多価タンパク質スキャフォールド（１）の反対側の面にある対照的な状況を示す。
当業者であれば、オリゴマーコアの単量体が、例えば本明細書に記載のように共有結合による融合により連結されている場合でも、概念的な対称軸が依然として存在することを理解するだろう。
したがって、「タンパク質スキャフォールドの同じ面」は、多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアの最高次回転対称軸に垂直であり、多価タンパク質スキャフォールドの中心を通って延びる平面の一方の側にある、多価タンパク質スキャフォールドの溶媒露出表面であってもよい。同様に、オリゴマーコアの面は、オリゴマーコアの最高次回転対称軸に垂直であり、オリゴマーコアの中心を通って延びる平面の一方の側にある、オリゴマーコアの溶媒露出可能表面（好ましくは、結合部位がそれに付着していない状態で規定される）であってもよい。
好ましくは、多価タンパク質スキャフォールドの面は、単一の表面、例えば細胞壁、細胞膜などの細胞またはタンパク質複合体の表面と接触する、多価タンパク質スキャフォールドの溶媒露出部分である。したがって、図３の概略図（明瞭性のため、多価タンパク質スキャフォールド（１）のオリゴマーコア（１０）に付着した複数の第１および第２の結合部位（１１、１２）が示されている）を参照すると、少なくとも１つの第１の結合部位（１１）および少なくとも１つの第２の結合部位（１２）は、好ましくは、それらが両方とも前記表面（３０）と接触することができるように、多価タンパク質スキャフォールド（１）に位置している。これは、図４に概略的に示されているように、少なくとも１つの第１の結合部位（１１）および少なくとも１つの第２の結合部位（１２）が多価タンパク質スキャフォールド（１）の反対側の面に位置している場合は不可能である。例えば、第１の結合部位は表面（３０）と接触することが可能であってもよいが、第２の結合部位は表面（３０）と接触することが可能ではない可能性がある。
少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位は、好ましくは、前面－前面配向性もしくは側面－前面配向性に、またはそれらの間の任意の位置に配置される。本明細書で使用される場合、前面－前面配向性は、第１の結合部位および第２の結合部位の両方が両方とも多価タンパク質スキャフォールドの同じ面に位置し、付着が、多価タンパク質スキャフォールドを通る回転対称軸と実質的に平行であることを指す。これは、図５に概略的に示されている。側面－前面配向性は、第１の結合部位および第２の結合部位の一方が、多価タンパク質スキャフォールドの一面に位置しており、付着は多価タンパク質スキャフォールドを通る回転対称軸に対して実質的に平行であり、第１の結合部位および第２の結合部位の他方は両方とも多価タンパク質スキャフォールドの同じ面に位置し、付着は、多価タンパク質スキャフォールドを通る回転対称軸に対して実質的に垂直（つまり、平面（２１）に対して実質的に平行）であることを指す。これは、図６に概略的に示されている。無論、こうした両極端の間の任意の位置を使用することができ、例えば、第１の結合部位および／または第２の結合部位は、多価タンパク質スキャフォールドの同じ面にあり、付着は多価タンパク質スキャフォールドを通る回転対称軸に対しておよそ４５°である。これは、図７に概略的に示されている。
当業者であれば、１つまたは複数の第１の結合部位（１１）と軸（２０）との間の角度、および１つまたは複数の第２の結合部位（１２）と軸（２０）との間の角度は同じである必要はないことを理解するだろう。例えば、１つまたは複数の第１の結合部位（１１）は、多価タンパク質スキャフォールドの「前面」に存在してもよく、１つまたは複数の第２の結合部位（１２）は、多価タンパク質スキャフォールドの「側面」に存在してもよく、つまり上記に記載のように前面－側面配向性であってもよい。代替的に、１つまたは複数の第１の結合部位（１１）は、多価タンパク質スキャフォールドの「側面」に存在してもよく、１つまたは複数の第２の結合部位（１２）は、多価タンパク質スキャフォールドの「前面」に存在してもよく、つまり、上記に記載のように側面－前面配向性であってもよい。１つまたは複数の第１の結合部位（１１）および１つまたは複数の第２の結合部位（１２）は両方とも、多価タンパク質スキャフォールドの「前面」に存在してもよく、つまり、上記に記載のように前面－前面配向性であってもよい。
第１の結合部位および第２の結合部位が両方とも多価タンパク質スキャフォールドの同じ面に存在することを前提とし、第１の結合部位および第２の結合部位が両方とも所与のサブユニット単量体（２）に付着している場合、典型的には、第１の結合部位および第２の結合部位とその単量体の中心との間に形成される角度（図８ではＸで示されている）は、最大で１６０°の角度、例えば最大で１４０°の角度、例えば最大で１２０°の角度、例えば最大で１００°の角度、またはで最大で９０°の角度である。典型的には、第１の結合部位および第２の結合部位とその単量体の中心との間に形成される角度は、少なくとも１０°の角度、例えば少なくとも２０°の角度、例えば少なくとも３０°の角度、例えば少なくとも４５°の角度、または少なくとも６０°の角度である。
構造は、タンパク質構造データ（ＮＭＲ、Ｘ線）または構造予測から決定されるオリゴマーコアの表面と交差しないように、３Ｄ座標系の任意の位置に平坦な標的平面を配置することにより視覚化することもできる。融合部位毎に、オリゴマーコア（元の融合部位以外）の表面と交差しない標的平面までの最短経路の距離を決定することができる。好ましくは、所与の構造について、そのような最短経路がすべて、標的平面に対して直交する最も長いタンパク質断面の５０％、４５％、または４０％未満であるような標的平面の位置を見出すことができる。
一部の実施形態では、同じ平面に接触するまでの最大の最短経路長は、１００ｎｍ未満、例えば５０ｎｍ未満、例えば２０ｎｍ未満、例えば１０ｎｍ未満、例えば５ｎｍ未満、例えば２ｎｍ未満である。好ましい状況では、標的平面までの最短経路長はすべて、５０ｎｍ未満、例えば２５ｎｍ未満、例えば１０ｎｍ未満、例えば５ｎｍ未満の半径を有する、標的平面上の円形領域内で終わる。
一部の実施形態では、スキャフォールドコアに融合されたタンパク質のシス配向性は、構造予測により決定することができる。Ａｌｐｈａｆｏｌｄでは、距離のみに加えて、リンカーの幾何学形状、および融合結合ドメインとスキャフォールドコアタンパク質との相互作用も考慮に入れることができる。好ましくは、スキャフォールドコアは、リンカーを介して、好ましくは短いリンカーを介して、例えばＧＳＧＳを介して、例えばＧＧＧＧＳを介して、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを介して、好ましい結合部位に融合した後でさえ、そのオリゴマー化特性を保持することが予測され、結合部位は、ほぼシス幾何学的配置で表されることが予測される。
ドメイン挿入物
多価タンパク質スキャフォールドは、複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコア、および少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも１つの第１の結合部位を含み、好ましくは、少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位は、多価タンパク質スキャフォールドの同じ面に位置する。多価タンパク質スキャフォールドは、ドメイン挿入物をさらに含んでいてもよい。ドメイン挿入物はタンパク質ドメインである。ドメイン挿入物は、結合部位と同じ多価タンパク質スキャフォールドの面に位置してもよく、異なる面に位置してもよい。
一部の場合では、オリゴマーコアおよび／またはサブユニット単量体が、結合部位に付着していない少なくとも１つの遊離末端を含む場合、多価タンパク質スキャフォールドは遊離末端にドメイン挿入物を含む。また、ドメイン挿入物は、オリゴマーコアのループ領域内に位置してもよく、したがって、サブユニット単量体のループ領域内に位置してもよい。好ましくは、多量体タンパク質スキャフォールドは、結合部位が位置する面に対して、オリゴマーコアおよび／または多量体タンパク質スキャフォールドの反対側の面に、例えば軸の反対側の端部の９０°以内に、少なくとも１つのドメイン挿入物を含む。
本明細書で使用される場合、ドメイン挿入物は、タンパク質ドメイン、つまりタンパク質の自律的にフォールディングする機能性単位をコードするポリペプチド配列である。ドメイン挿入物は、オリゴマーコアまたは結合部位の構造およびフォールディングを妨害しない。
ドメイン挿入物は、好ましくは、エフェクター機能を有する。ドメイン挿入物は、抗体、抗体断片、またはＣＤ３もしくはＣＤ１６に結合することが可能な抗原結合性断片などの抗原結合性断片を含んでいてもよい。例えば、ドメイン挿入物は、サイトカインなどの免疫調節タンパク質、または化学療法剤、またはがん免疫療法剤（つまり、がんを治療するために対象の免疫系を使用する治療）に結合することができる。ドメイン挿入物は、生物系と接触した際に細胞死を誘導するタンパク質を形成することができる。ドメイン挿入物は、アポトーシスを誘導してもよく、抗腫瘍応答を増加させてもよく、または他の有益な活性を示してもよい。ドメイン挿入物は、補体阻害活性を有してもよくまたは補体刺激活性を有してもよい。
疑義を回避するために述べるが、ドメイン挿入は、典型的には、本明細書に記載のマルチドメインポリペプチド構築物の構造ドメイン内になされる。
タンパク質複合体
また、本明細書では、少なくとも１つの第１のエフェクター部分および少なくとも１つの第２のエフェクター部分に付着した、本明細書でより詳細に記載されている多価タンパク質スキャフォールドを含むタンパク質複合体が提供される。各第１のエフェクター部分は、多価タンパク質スキャフォールドの第１の結合部位に結合した第１の標的に付着している。各第２のエフェクター部分は、多価タンパク質スキャフォールドの第２の結合部位に結合した第２の標的に付着している。
標的は、好ましくは、ポリペプチド標的であり、より好ましくは、上記に記載のペプチドリンカー対のパートナーである。
各エフェクター部分は標的に付着しており、それにより各エフェクター部分は多価タンパク質スキャフォールドに結合する。第１および第２のエフェクター部分は、同じであってもよくまたは異なっていてもよく、好ましくは異なっていてもよい。結合部位の状況において上記に記載の付着経路のいずれかを使用することができる。当業者が利用できる従来の有機化学経路を使用して、各エフェクター部分を標的に直接付着させてもよく、それにより各エフェクター部分は多価タンパク質スキャフォールドに結合する。好適な化学的手法は、March's Advanced Organic Chemistry (Wiley 2020)などの教科書に記載されている。
好ましくは、各エフェクター部分は、標的と共有結合で連結されている。より好ましくは、標的はポリペプチド標的であり、エフェクター部分に遺伝子的に融合されていてもよい。換言すれば、好ましくは、エフェクター部分または各エフェクター部分は、単一のポリペプチド鎖として発現されるように同じポリヌクレオチドにコードすることにより、ポリペプチド標的と遺伝子的に融合されている。エフェクターは、第１のポリペプチド標的、切断部位、および第２のポリペプチド標的と遺伝子的に融合されていてもよく、第１のポリペプチド標的は第２のポリペプチド標的に対して直交性である。切断部位はＴＥＶ切断部位であってもよい。第１および第２のポリペプチド標的が両方ともエフェクター部分に存在する場合、末端ポリペプチド標的のみが機能性である（つまり、多価タンパク質スキャフォールドのその同族結合部位に結合することができる）。切断部位は、単一の標的のみが存在するように、末端ポリペプチド標的を分離するために使用することができる。エフェクター部分のコンジュゲーション完了後、末端ポリペプチド標的を特異的に展開することができる。
エフェクター部分は、好ましくはタンパク質ドメインである。タンパク質ドメインは、好ましくは可溶性タンパク質ドメインである。タンパク質ドメインは、好ましくは、分泌タンパク質のドメインまたは膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む。タンパク質ドメインは、より好ましくは、ヒト細胞表面受容体などの細胞表面受容体の細胞外ドメインまたは細胞表面受容体のリガンドを含む。
エフェクター部分は、好ましくは、生物系と接触した際に療法効果を発揮する部分である。例えば、エフェクター部分は、サイトカインなどの免疫調節タンパク質であってもよく、または化学療法剤、またはがん免疫療法剤（つまり、がんを治療するために対象の免疫系を使用する治療）であってもよい。エフェクター部分は、生物系と接触した際に細胞死を誘導してもよい。エフェクター部分は、アポトーシスを誘導してもよく、抗腫瘍応答を増加させてもよく、または他の有益な活性を示してもよい。エフェクター部分は、補体阻害活性を有してもよくまたは補体刺激活性を有してもよい。エフェクター部分は、遺伝子発現の変更、受容体内部移行、サイトカイン放出、細胞死、または治療用分子に対する感受性をもたらしてもよい。
一実施形態では、エフェクター部分は、合成有機分子であってもよくまたは合成無機分子であってもよい。好適な分子は、化学療法剤であってもよい。好適な分子は、毒性作用剤、例えば約１００μＭ未満、例えば約１０μＭ未満、例えば約１μＭ未満または約１００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する作用剤であってもよく、ＥＣ５０は、好適な細胞アッセイで評価して５０％細胞毒性をもたらすのに必要な作用剤の濃度である。好適な細胞アッセイは、例えば、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイであってもよい。
好適な合成分子は、酵素活性化剤であってもよくまたは酵素阻害剤であってもよい。好適な分子は、セリン／スレオニン／チロシンキナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、およびプロテアソームの１つまたは複数の阻害剤であってもよい。好適な分子は、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、テトラジン、アジリジン、シスプラチン、およびそれらの誘導体）；代謝拮抗剤（例えば、葉酸拮抗剤、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシドアナログ、およびチオプリン）；抗微小管剤（例えば、ビンカアルキロイドまたはタキサン）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポイソメラーゼＩの阻害剤、イリノテカンおよびトポテカン；エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、およびテニポシデルなどのトポイソメラーゼＩＩ毒素、またはノボビオシン、メルバロン、およびアクラルビシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤）、または細胞傷害性抗生物質（例えば、アントラサイクリンおよびブレオマイシン）として作用することができる。好適な分子は、約５０～約５０００ｇ／ｍｏｌ、例えば約１００～約１０００ｇ／ｍｏｌ、例えば約２５０～約５００ｇ／ｍｏｌの分子質量を有してもよい。
別の実施形態では、エフェクター部分は、好ましくは、抗体またはその抗原結合性断片を含む。「抗体またはその抗原結合性断片」という用語は、エフェクター部分に関して本明細書で使用される場合、抗体全体（つまり、ジスルフィド結合により相互接続されている２つの重鎖および２つの軽鎖の要素を含む）ならびにそれらの抗原結合性断片に関してもよい。抗体は、典型的には、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、つまり、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子の免疫学的に活性な部分を含む。本明細書で使用される場合、抗体またはその断片と抗原との相互作用の状況での、「特異的に結合する」または「と免疫反応する」という用語は、抗体が、他のポリペプチドと比較して、所望の抗原の１つまたは複数の抗原決定基と優先的に反応することを意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および少なくとも１つの重鎖定常領域で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域で構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができる。抗体としては、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、およびＦａｂ発現ライブラリーを挙げることができる。抗体は、例えば、単鎖抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変断片（Ｆｖ）、断片抗原結合領域（Ｆａｂ）、組換え抗体、モノクローナル抗体、天然抗体の抗原結合ドメインを含む融合タンパク質またはアプタマー、ＶＨＨ抗体としても知られている単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ（ラクダ科動物由来の単一ドメイン抗体）、ＶＮＡＲと呼ばれるサメＩｇＮＡＲ由来の単一ドメイン抗体断片、ダイアボディ、トリアボディ、アンチカリン、アプタマー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、およびそれらの活性成分または断片からなる群から選択することができる。
「Ｆａｂ断片」（断片抗原結合、またはＦａｂ領域とも呼ばれる）は、それぞれ軽鎖および重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨと共に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ（ＣＤＲ、超可変領域とも呼ばれる）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域の１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨＩドメインのカルボキシ末端に少数の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、こうしたドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に対して望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の例として、抗体ｓｃＦｖ断片は、国際公開第９３／１６１８５号パンフレット；米国特許第５，５７１，８９４号明細書；および米国特許第５，５８７，４５８号明細書に記載されている。
エフェクター部分は、治療用抗体のＦａｂ領域であってもよい。例えば、エフェクター部分は、ムロモマブ、アブシキシマブ、リツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、イブリツモマブ（ibritomomab）、アダリムマブ、アレファセプト、オマリズマブ、トシツモマブ、エファリズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、またはセルトリズマブなどのモノクローナル抗体のＦａｂ領域であってもよい。
エフェクター部分は、病理学的状態、例えば、本明細書に記載の病理学的状態に関連付けられるあらゆる受容体を標的とすることができる。例えば、エフェクター部分は、その結合が臨床的利益に関連付けられるあらゆる受容体を標的とすることができる。例えば、ホルモン受容体。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、病理学的状態に関連付けられることがこれまで知られていない標的（例えば、受容体）を有してもよい。例えば、一部の場合では、そのような受容体を標的とすることは、療法効果を示すことが見出されている。
したがって、当業者であれば、本明細書で提供されるタンパク質複合体を使用して、生物系内の２つの標的に同時に係合し、それにより同時に接触させることができることを理解するだろう。標的は、例えば、同じ細胞に由来するものであってもよい。例えば、本明細書で提供されるタンパク質複合体は、同じ細胞表面上の２つの異なるタイプの受容体に結合させるために使用することができる。
本明細書で提供されるタンパク質複合体は、典型的には、多価タンパク質スキャフォールドに複数の第１の結合部位および複数の第２の結合部位を含み、したがって、複数の第１のエフェクター部分および複数の第２のエフェクター部分と結合することができる。これは、そのような「高結合価」化合物が、エフェクター機能の向上またはこれまで未知だったエフェクター機能を可能にすることができるため特に有益である。単一のエフェクター部分の複数のコピーは、生物系と接触した際の療法応答の向上に結び付く可能性があることが以前に示されている（例えば、Brune et al. (above); and Khairil Anuar et al., Nature communications 10.1 (2019): 1-13）。しかしながら、複数の異なるエフェクター部分の複数のコピーを接触させることは、複雑な技術的課題であり、この課題は、本明細書で提供されるタンパク質複合体により解決される。
一部の実施形態では、エフェクター機能は、エフェクター部分の組合せと、それに接触する生物系との相互作用の結果としてのみ生じさせることができる。例えば、第１のエフェクター部分（例えば、第１の結合部位に付着したエフェクター部分）は、第１または第２のエフェクター部分がいずれも単独では療法有効性を示さない状況において、第２のエフェクター部分（例えば、第２の結合部位に付着したエフェクター部分）と組み合わせた場合にのみ療法効果を有することが示されていてもよい。
当業者であれば、本明細書で特定されているプラットフォームおよび方法は、療法上有用なエフェクター部分の新しい組合せをスクリーニングし、有用な候補を特定することを可能にすることを理解するだろう。
スクリーニングプラットフォーム
また、本明細書では、スクリーニングプラットフォームが提供される。スクリーニングプラットフォームはライブラリーを含み、前記ライブラリーは、本発明のタンパク質複合体の複数の集団を含み、タンパク質複合体の集団は各々、第１のエフェクター部分、第２のエフェクター部分、および／またはオリゴマーコアの異なる組合せを含む。そのようなライブラリーも本明細書で提供される。
例えば、ライブラリーは、エフェクター部分の新しい組合せをスクリーニングするために使用することができる。したがって、ライブラリーは、異なるタンパク質複合体の複数の試料を含んでいてもよい。各試料は均質であってもよく、つまり各試料は、１つのタイプのタンパク質複合体のみを含んでいてもよい。各試料は、他の各試料とは異なっていてもよい。したがって、各試料は、他の各試料のタンパク質複合体の第１および第２のエフェクター部分の組合せと比較して、異なる組合せの第１および第２のエフェクター部分を含むタンパク質複合体を含んでいてもよい。例えば、ライブラリーは、約１個または約２個～約１，０００，０００個の試料、例えば約１０～約１００，０００個の試料、例えば約５０～約５０，０００個の試料、例えば約１００～約１０，０００個の試料、例えば約５００～約１，０００個の試料を含んでいてもよい。各試料は、異なるタイプのタンパク質複合体を含んでいてもよく、各試料中のタンパク質複合体は、すべての他の試料中のタンパク質複合体と比較して、第１のエフェクター部分、第２のエフェクター部分、およびオリゴマーコアの異なる組合せを有する。
一部の実施形態では、ライブラリーは「１Ｄ」ライブラリーであってもよい。したがって、一部の実施形態では、ライブラリー中のすべての試料は、同じまたは実質的に同じオリゴマーコアおよび第１のエフェクター部分を有していてもよく、第２のエフェクター部分に関しては異なっていてもよい。他の実施形態では、ライブラリー中のすべての試料は、同じまたは実質的に同じオリゴマーコアおよび第２のエフェクター部分を有していてもよく、第１のエフェクター部分に関しては異なっていてもよい。一部の他の実施形態では、ライブラリー中のすべての試料は、同じまたは実質的に同じ第１および第２のエフェクター部分を有していてもよく、オリゴマーコアに関しては異なっていてもよい。所与のポリペプチドと実質的に同じであるポリペプチド（例えば、オリゴマーコア、または第１もしくは第２のポリペプチド結合部位）は、例えば、所与のポリペプチドと少なくとも９０％配列同一性、例えば、所与のポリペプチドと少なくとも９５％配列同一性、例えば少なくとも９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％配列同一性を有していてもよい。所与のポリペプチドと実質的に同じであるポリペプチド（例えば、オリゴマーコア、または第１もしくは第２のポリペプチド結合部位）は、例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の配列付加、欠失、もしくは挿入、または変異を含むことにより所与のポリペプチドと異なっていてもよい。所与のポリペプチドと実質的に同じであるポリペプチド（例えば、オリゴマーコア、または第１もしくは第２のポリペプチド結合部位）は、例えば、ポリペプチドに対してなされる翻訳後修飾、例えばそのグリコシル化またはリン酸化パターンに関して所与のポリペプチドと異なっていてもよい。
一部の実施形態では、ライブラリーは「２Ｄ」ライブラリーであってもよい。したがって、一部の実施形態では、ライブラリー中のすべての試料は、同じまたは実質的に同じオリゴマーコアを有していてもよく、第１のエフェクター部分および第２のエフェクター部分の組合せに関して異なっていてもよい。他の実施形態では、ライブラリー中のすべての試料は、同じまたは実質的に同じ第１のエフェクター部分を有していてもよく、オリゴマーコアおよび第２のエフェクター部分の組合せに関して異なっていてもよい。一部の他の実施形態では、ライブラリー中のすべての試料は、同じまたは実質的に同じ第２のエフェクター部分を有していてもよく、オリゴマーコアおよび第１のエフェクター部分の組合せに関して異なっていてもよい。
一部の実施形態では、ライブラリーは「３Ｄ」ライブラリーであってもよい。したがって、一部の実施形態では、ライブラリー中のすべての試料は、オリゴマーコア、第１のエフェクター部分、および第２のエフェクター部分の組合せに関して異なっていてもよい。
また、スクリーニングプラットフォームは、ライブラリーに加えて他の構成物質部分を含んでもよい。例えば、スクリーニングプラットフォームは、以下のもののいずれかまたはすべてを含んでいてもよい。
－ ライブラリー中の試料と接触させるための生物系、
－ 生物系とライブラリー中の試料との接触からもたらされる生物系の変化を検出するための検出系、
－ 試薬および／または緩衝液、ならびに
－ 検出系により報告される変化を検出するための光学的、電気的、または分光法的手段。
生物系は、細胞培養物、例えば哺乳動物細胞培養物、好ましくはヒト細胞培養物、より好ましくは免疫細胞培養物および／またはがん細胞株培養物であってもよい。生物系は、血液試料、血清試料、血漿試料、または組織もしくは器官の試料などの生物学的試料であってもよい。生物学的試料としては、腫瘍試料、細胞、細胞溶解物、尿、羊水、および他の生物学的流体が挙げられる。生物学的試料は、好ましくは、哺乳動物である。試料は、ヒトであってもよくまたは非ヒトであってもよい。
検出系は、任意の好適な検出系であってもよい。検出系は、色素または染色剤、例えば細胞生存染色剤であってもよい。好適な染色剤としては、例えば、トリパンブルー、（フルオレセインジアセテート）グリーン、ヨウ化プロピジウム、およびヘキスト３３２５８などを挙げることができる。
試薬としては、細胞増殖培地成分を含む、細胞生存に必要な成分が挙げられ、治療用分子を挙げることができる。
緩衝剤としては、例えば緩衝剤塩を含んでいてもよい水性組成物が挙げられる。使用することができる好ましい緩衝剤塩としては、Ｔｒｉｓ；リン酸塩；クエン酸／Ｎａ２ＨＰＯ４；クエン酸／クエン酸ナトリウム；酢酸ナトリウム／酢酸；Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４；イミダゾール（グリオキサリン）／ＨＣｌ；炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム；炭酸アンモニウム／重炭酸アンモニウム；ＭＥＳ；Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ；ＡＤＡ；ａｃｅｓ；ＰＩＰＥＳ；ＭＯＰＳＯ；Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓプロパン；ＢＥＳ；ＭＯＰＳ；ＴＥＳ；ＨＥＰＥＳ；ＤＩＰＳＯ；ＭＯＢＳ；ＴＡＰＳＯ；トリズマ；ＨＥＰＰＳＯ；ＰＯＰＳＯ；ＴＥＡ；ＥＰＰＳ；トリシン；Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；ビシン；ＨＥＰＢＳ；ＴＡＰＳ；ＡＭＰＤ；ＴＡＢＳ；ＡＭＰＳＯ；ＣＨＥＳ；ＣＡＰＳＯ；ＡＭＰ；ＣＡＰＳ；およびＣＡＢＳが挙げられる。所望のｐＨにとっての適切な緩衝剤の選択は当業者であれば日常的であり、指針は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｏｒｅ－ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ／ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｂｕｆｆｅｒｓ／ｌｅａｒｎｉｎｇ－ｃｅｎｔｅｒ／ｂｕｆｆｅｒ－ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ－ｃｅｎｔｅｒ．ｈｔｍｌで入手可能である。緩衝剤塩は、好ましくは、溶液中で１ｍＭ～１Ｍ、好ましくは１０ｍＭ～１００ｍＭ、例えば約５０ｍＭの濃度で使用される。
検出系により報告される変化を検出するための手段としては、顕微鏡（光学的または電子的）、電気生理学的（例えば、パッチクランプ）装置などの電気的手段；およびＵＶ／ＶＩＳ分光法、ＮＭＲ分光法、質量分析法、ＩＲ分光法、ラマン分光法、円二色性分光法などのための機器などの分光法的手段が挙げられる。
方法
また、治療用薬物アナログを特定するための方法であって、
本明細書に記載のタンパク質複合体を用意すること、
タンパク質複合体を生物系と接触させること、および
タンパク質複合体が生物系の特性に所望の変化を誘導するか否かを測定すること
を含む方法が提供される。
この方法は、任意選択で、生物系の特性に所望の変化を誘導するタンパク質複合体を選択することをさらに含む。
また、エフェクター分子（例えば、抗原結合ドメイン）の療法組合せを特定するための方法であって、
本明細書に記載のタンパク質複合体を用意すること、
タンパク質複合体を生物系と接触させること、および
タンパク質複合体が生物系の特性に所望の変化を誘導するか否かを測定すること
を含む方法が提供される。
生物系は、細胞培養物、例えば哺乳動物細胞培養物、好ましくはヒト細胞培養物、より好ましくは免疫細胞培養物および／またはがん細胞株培養物であってもよい。
生物系は、血液試料、血清試料、血漿試料、または組織もしくは器官の試料などの生物学的試料であってもよい。生物学的試料としては、腫瘍試料、細胞、細胞溶解物、尿、羊水、および他の生物学的流体が挙げられる。生物学的試料は、好ましくは、哺乳動物である。試料は、ヒトであってもよくまたは非ヒトであってもよい。
生物系の特性の変化は、意図されている治療薬の所望の活性に関連付けられるあらゆる変化であってもよい。一部の実施形態では、所望の変化は細胞死である。これは、特に、がん治療薬を開発する場合に使用することができる。
他の変化としては、エフェクター機能の変化が挙げられる。したがって、この方法は、タンパク質複合体が生物系においてエフェクター機能を誘導するか否かを測定するステップを含んでいてもよい。
エフェクター機能の変化としては、遺伝子発現の変更、タンパク質修飾、例えばリン酸化の変更、受容体内部移行、サイトカイン放出、細胞死、治療用分子に対する感受性などを挙げることができる。エフェクター機能は、生物学的試料に対する高親和性結合であってもよく、それは、ＥＬＩＳＡなどの一連の技法により測定することができる。標的生物系との高親和性結合は、上記で考察されているエフェクタードメインが、がん細胞などの特定の細胞タイプであってもよい標的生物系に対して特異的に影響を及ぼすことを可能にすることができる。
エフェクター機能は、対照を基準にして評価することができる。対照は、エフェクター部分を有していないタンパク質複合体であってもよい。
対照は、単一タイプのエフェクター部分のみが付着した（つまり、１つのタイプのエフェクター部分のみが多価タンパク質スキャフォールドに付着している）タンパク質複合体であってもよい。この場合、この方法を使用して、「相乗的機能」または「相乗的生物学的機能」を有するエフェクター部分を特定することができ、「相乗的機能」または「相乗的生物学的機能」は、二重特異性多価タンパク質複合体を使用するまで個々の融合タンパク質成分では観察されないエフェクター機能もしくはエフェクター機能のレベル、またはタンパク質複合体の第１および第２エフェクター部分を個々に使用した場合に観察される活性と比較してより高いかもしくはより低い活性、つまり両エフェクター部分を複合体において一緒に使用した場合にのみ観察される活性を指す。
この方法は、タンパク質複合体のエフェクター部分が結合する生物系の分子を特定するステップをさらに含んでいてもよい。この方法は、好ましくは、エフェクター部分自体など、生物系の同じ分子に特異的に結合するエフェクター部分の組合せを選択されたタンパク質複合体として選択することを含んでいてもよい。
この方法は、エフェクター部分またはそれらのアナログの選択された組合せを含む治療用薬物候補または薬物を合成することをさらに含んでもよい。治療用薬物候補または薬物は、オリゴマーコアおよび治療用薬物アナログのエフェクター部分を含んでいてもよいが、結合部位および標的官能基は、本明細書でより詳細に記載される遺伝子融合などの共有結合連結で置き換えられている。治療用薬物または薬物候補は、本開示の方法で特定された治療用薬物アナログと同じオリゴマーコアを含んでいてもよい。代替的に、治療用薬物候補は、本開示の方法で特定された治療用薬物アナログとは異なるオリゴマーコアを含んでいてもよい。治療用薬物候補は、さらなる療法上の利益、例えば、さらなるエフェクター機能を付与するために選択または設計されたオリゴマーコアを有していてもよい。
また、本開示の方法に従って得ることが可能な治療用薬物候補が提供される。
治療用薬物候補、治療用薬物
さらに、１つまたは複数の第１のエフェクター部分および１つまたは複数の第２のエフェクター部分に付着した複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコアを含む治療用薬物候補であって、前記１つまたは複数の第１のエフェクター部分および前記１つまたは複数の第２のエフェクター部分は、オリゴマーコアの同じ面に位置し、（ｉ）前記１つまたは複数の第１のエフェクター部分は２つまたはそれよりも多くの第１のエフェクター部分を含み、前記１つまたは複数の第２のエフェクター部分は２つまたはそれよりも多くの第２のエフェクター部分を含み；および／または（ｉｉ）前記オリゴマーコアは、抗体も抗体断片も含まない、治療用薬物候補が提供される。
同じ特徴を有する治療用薬物も提供される。
典型的には、オリゴマーコアは、本明細書でより詳細に記載されるオリゴマーコアである。典型的には、サブユニット単量体は、本明細書でより詳細に記載されている通りである。典型的には、第１のエフェクター部分および第２のエフェクター部分は、本明細書でより詳細に記載されている通りである。第１および第２のエフェクター部分は、本明細書に記載の付着手段のいずれかによることを含む、任意の適切な方法でオリゴマーコアのサブユニット単量体に付着させることができる。一部の実施形態では、第１および第２のエフェクター部分の付着は、本明細書に記載の第１および第２の結合部位ならびに第１および第２のポリペプチド標的を含む。しかしながら、他の実施形態では、第１および第２のエフェクター部分の付着は、本明細書に記載の第１および第２の結合部位ならびに第１および第２のポリペプチド標的を含んでおらず、その代わりに、本明細書に記載の遺伝子融合および／またはクリックケミストリー連結などの単純な共有結合付着を含んでいてもよい。
特定の実施形態
第１の好ましい態様では、以下のものが本明細書で提供される。
－ 各々が、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも３０％または少なくとも５０％アミノ酸同一性（例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性）を有するアミノ酸配列を含む複数の（例えば３～６つ、好ましくは３つの）単量体を含むオリゴマーコアを含む多価タンパク質スキャフォールドであって、各単量体は、第１の結合部位および第２の結合部位を含み、第１の結合部位は第２の結合部位に対して直交性であり、第１の結合部位および第２の結合部位は、各々独立して、配列番号４～９、１１～１３、２３、または１５～１８のいずれか１つと、少なくとも５０％アミノ酸同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性）を有し、各第１の結合部位および各第２の結合部位は、独立して、それらが付着する単量体に遺伝子的に融合されている、多価タンパク質スキャフォールド。好ましくは、第１および第２の結合部位の一方は、配列番号４、６、または８と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有し、他方は、配列番号１２と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有する。この態様の好ましい多価タンパク質スキャフォールドは、配列番号２１の単量体またはその断片（例えば、その残基１４～３４８を含む）を含む。
－ 第１の態様の多価タンパク質スキャフォールドを含むタンパク質複合体であって、第１の結合部位は、第１のエフェクター部分に付着した第１のポリペプチド標的に結合しており、第２の結合部位は、第２のエフェクター部分に付着した第１のポリペプチド標的に結合しており、第１および第２のエフェクター部分は同じであってもよくまたは異なっていてもよく、好ましくは異なっていてもよく、第１の結合部位／ポリペプチド標的対および第２の結合部位／ポリペプチド標的対は、各々独立して、（ｉ）配列番号４、６、もしくは８のいずれか１つと配列番号５、７、もしくは９のいずれか１つとの組合せ、（ｉｉ）配列番号１２と配列番号１３もしくは１５との組合せ、（ｉｉｉ）配列番号５と配列番号１１との組合せ、（ｉｖ）配列番号１５と配列番号１６との組合せ；（ｖ）配列番号１７と配列番号１８との組合せ、または（ｖｉ）配列番号２３と配列番号１６との組合せから選択される、タンパク質複合体。
－ 第１の態様のタンパク質複合体の複数の集団を含むライブラリーを含むスクリーニングプラットフォームであって、各集団は、第１および第２のエフェクター部分の異なる組合せを含む、スクリーニングプラットフォーム。
－ 各々が、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも５０％アミノ酸同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性）を有するアミノ酸配列を含む複数の（例えば、３～６つ、好ましくは３つの）単量体を含むオリゴマーコアを含む治療用薬物候補であって、各単量体は、第１のエフェクター部分および第２のエフェクター部分に直接付着しており（例えば、遺伝子融合体として）、第１および第２のエフェクター部分は同じであってもよくまたは異なっていてもよく、好ましくは異なっていてもよく、好ましくは、各単量体は、それに付着する第１のエフェクター部分および第２のエフェクター部分に、ポリペプチドリンカーを介して直接付着している、治療用薬物候補。
第２の好ましい態様では、特に、以下のものが本明細書で提供される。
－ 各々が、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも５０％アミノ酸同一性（例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性）を有するアミノ酸配列を含む複数の（例えば３～６つ、好ましくは３つの）単量体を含むオリゴマーコアを含む多価タンパク質スキャフォールドであって、各単量体は、第１の結合部位および第２の結合部位を含み、第１の結合部位は第２の結合部位に対して直交性であり、第１の結合部位および第２の結合部位は、各々独立して、配列番号４～９、１１～１３、２３、または１５～１８のいずれか１つと、少なくとも５０％アミノ酸同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性）を有し、各第１の結合部位および各第２の結合部位は、独立して、それらが付着する単量体に遺伝子的に融合されている、多価タンパク質スキャフォールド。好ましくは、第１および第２の結合部位の一方は、配列番号４、６、または８と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有し、他方は、配列番号１２と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有する。この態様の好ましい多価タンパク質スキャフォールドは、配列番号２０の単量体またはその断片（例えば、その残基１４～３８０を含む）を含む。
－ 第２の態様の多価タンパク質スキャフォールドを含むタンパク質複合体であって、第１の結合部位は、第１のエフェクター部分に付着した第１のポリペプチド標的に結合しており、第２の結合部位は、第２のエフェクター部分に付着した第１のポリペプチド標的に結合しており、第１および第２のエフェクター部分は同じであってもよくまたは異なっていてもよく、好ましくは異なっていてもよく、第１の結合部位／ポリペプチド標的対および第２の結合部位／ポリペプチド標的対は、各々独立して、（ｉ）配列番号４、６、もしくは８のいずれか１つと配列番号５、７、もしくは９のいずれか１つとの組合せ、（ｉｉ）配列番号１２と配列番号１３もしくは１５との組合せ、（ｉｉｉ）配列番号５と配列番号１１との組合せ、（ｉｖ）配列番号１５と配列番号１６との組合せ；（ｖ）配列番号１７と配列番号１８との組合せ、または（ｖｉ）配列番号２３と配列番号１６との組合せから選択される、タンパク質複合体。
－ 第２の態様のタンパク質複合体の複数の集団を含むライブラリーを含むスクリーニングプラットフォームであって、各集団は、第１および第２のエフェクター部分の異なる組合せを含む、スクリーニングプラットフォーム。
－ 各々が、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも５０％アミノ酸同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性）を有するアミノ酸配列を含む複数の（例えば、３～６つ、好ましくは３つの）単量体を含むオリゴマーコアを含む治療用薬物候補であって、各単量体は、第１のエフェクター部分および第２のエフェクター部分に直接付着しており（例えば、遺伝子融合体として）、第１および第２のエフェクター部分は同じであってもよくまたは異なっていてもよく、好ましくは異なっていてもよく、好ましくは、各単量体は、それに付着する第１のエフェクター部分および第２のエフェクター部分に、ポリペプチドリンカーを介して直接付着している、治療用薬物候補。
第３の好ましい態様では、特に、以下のものが本明細書で提供される。
－ 各々が、配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも５０％アミノ酸同一性（例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性）を有するアミノ酸配列を含む複数の（例えば３～６つ、好ましくは３つの）単量体を含むオリゴマーコアを含む多価タンパク質スキャフォールドであって、各単量体は、第１の結合部位および第２の結合部位を含み、第１の結合部位は第２の結合部位に対して直交性であり、第１の結合部位および第２の結合部位は、各々独立して、配列番号４～９、１１～１３、２３、または１５～１８のいずれか１つと、少なくとも５０％アミノ酸同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性）を有し、各第１の結合部位および各第２の結合部位は、独立して、それらが付着する単量体に遺伝子的に融合されている、多価タンパク質スキャフォールド。好ましくは、第１および第２の結合部位の一方は、配列番号４、６、または８と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有し、他方は、配列番号１２と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有する。
－ 第３の態様の多価タンパク質スキャフォールドを含むタンパク質複合体であって、第１の結合部位は、第１のエフェクター部分に付着した第１のポリペプチド標的に結合しており、第２の結合部位は、第２のエフェクター部分に付着した第１のポリペプチド標的に結合しており、第１および第２のエフェクター部分は同じであってもよくまたは異なっていてもよく、好ましくは異なっていてもよく、第１の結合部位／ポリペプチド標的対および第２の結合部位／ポリペプチド標的対は、各々独立して、（ｉ）配列番号４、６、もしくは８のいずれか１つと配列番号５、７、もしくは９のいずれか１つとの組合せ、（ｉｉ）配列番号１２と配列番号１３もしくは１５との組合せ、（ｉｉｉ）配列番号５と配列番号１１との組合せ、（ｉｖ）配列番号１５と配列番号１６との組合せ；（ｖ）配列番号１７と配列番号１８との組合せ、または（ｖｉ）配列番号２３と配列番号１６との組合せから選択される、タンパク質複合体。
－ 第３の態様のタンパク質複合体の複数の集団を含むライブラリーを含むスクリーニングプラットフォームであって、各集団は、第１および第２のエフェクター部分の異なる組合せを含む、スクリーニングプラットフォーム。
－ 各々が、配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも５０％アミノ酸同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性）を有するアミノ酸配列を含む複数の（例えば、３～６つ、好ましくは３つの）単量体を含むオリゴマーコアを含む治療用薬物候補であって、各単量体は、第１のエフェクター部分および第２のエフェクター部分に直接付着しており（例えば、遺伝子融合体として）、第１および第２のエフェクター部分は同じであってもよくまたは異なっていてもよく、好ましくは異なっていてもよく、好ましくは、各単量体は、それに付着する第１のエフェクター部分および第２のエフェクター部分に、ポリペプチドリンカーを介して直接付着している、治療用薬物候補。
第４の好ましい態様では、特に、以下のものが本明細書で提供される。
－ 各々が、配列番号１９のアミノ酸配列と、少なくとも５０％アミノ酸同一性（例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性）を有するアミノ酸配列を含む複数の（例えば３～６つ、好ましくは３つの）単量体を含むオリゴマーコアを含む多価タンパク質スキャフォールドであって、各単量体は、第１の結合部位および第２の結合部位を含み、第１の結合部位は第２の結合部位に対して直交性であり、第１の結合部位および第２の結合部位は、各々独立して、配列番号４～９、１１～１３、２３、または１５～１８のいずれか１つと、少なくとも５０％アミノ酸同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性）を有し、各第１の結合部位および各第２の結合部位は、独立して、それらが付着する単量体に遺伝子的に融合されている、多価タンパク質スキャフォールド。好ましくは、第１および第２の結合部位の一方は、配列番号４、６、または８と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有し、他方は、配列番号１２と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有する。
－ 第４の態様の多価タンパク質スキャフォールドを含むタンパク質複合体であって、第１の結合部位は、第１のエフェクター部分に付着した第１のポリペプチド標的に結合しており、第２の結合部位は、第２のエフェクター部分に付着した第１のポリペプチド標的に結合しており、第１および第２のエフェクター部分は同じであってもよくまたは異なっていてもよく、好ましくは異なっていてもよく、第１の結合部位／ポリペプチド標的対および第２の結合部位／ポリペプチド標的対は、各々独立して、（ｉ）配列番号４、６、もしくは８のいずれか１つと配列番号５、７、もしくは９のいずれか１つとの組合せ、（ｉｉ）配列番号１２と配列番号１３もしくは１５との組合せ、（ｉｉｉ）配列番号５と配列番号１１との組合せ、（ｉｖ）配列番号１５と配列番号１６との組合せ；（ｖ）配列番号１７と配列番号１８との組合せ、または（ｖｉ）配列番号２３と配列番号１６との組合せから選択される、タンパク質複合体。
－ 第４の態様のタンパク質複合体の複数の集団を含むライブラリーを含むスクリーニングプラットフォームであって、各集団は、第１および第２のエフェクター部分の異なる組合せを含む、スクリーニングプラットフォーム。
－ 各々が、配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも５０％アミノ酸同一性（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性）を有するアミノ酸配列を含む複数の（例えば、３～６つ、好ましくは３つの）単量体を含むオリゴマーコアを含む治療用薬物候補であって、各単量体は、第１のエフェクター部分および第２のエフェクター部分に直接付着しており（例えば、遺伝子融合体として）、第１および第２のエフェクター部分は同じであってもよくまたは異なっていてもよく、好ましくは異なっていてもよく、好ましくは、各単量体は、それに付着する第１のエフェクター部分および第２のエフェクター部分に、ポリペプチドリンカーを介して直接付着している、治療用薬物候補。
第５の好ましい態様では、特に、以下のものが本明細書で提供される。
－ Ｎ末端に第１の結合ドメインおよびＣ末端に第２の結合ドメインを含むポリペプチドであって、第１および第２の結合ドメインは、構造ドメインにより隔てられており、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、標的分子が、単一細胞上に発現されているか、またはプレートもしくは単一ビーズに固定化されている場合、それらの標的に結合することができる、ポリペプチド。
－ ポリペプチドのオリゴマーであって、オリゴマーの各ポリペプチドは、Ｎ末端に第１の結合ドメインおよびＣ末端に第２の結合ドメインを含むポリペプチドを含むかまたはからなり、第１および第２の結合ドメインは、構造ドメインにより隔てられており、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、標的分子が、単一細胞上に発現されているか、またはプレートもしくは単一ビーズに固定化されている場合、それらの標的に結合することができる、ポリペプチドのオリゴマー。
－ Ｎ末端に第１の結合ドメインおよびＣ末端に第２の結合ドメインを含むポリペプチドであって、第１および第２の結合ドメインは、構造ドメインにより隔てられており、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、標的分子が、単一細胞上に発現されているか、またはプレートもしくは単一ビーズに固定化されている場合、それらの標的に結合することができる、ポリペプチド。第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、各々が、同族ペプチドとイソペプチド連結を形成することができるキャッチャードメインである。こうした同族ペプチドはタグペプチドと呼ばれることが多く、例えば、当技術分野で公知であり、下記で考察されているように、ＳｐｙＴａｇは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインとイソペプチド結合を形成する。第１の結合ドメインの同族ペプチドは、第２の結合ドメインの同族ペプチドとは異なる。
－ ポリペプチドのオリゴマーであって、オリゴマーの各ポリペプチドは、Ｎ末端に第１の結合ドメインおよびＣ末端に第２の結合ドメインを含むポリペプチドを含むかまたはからなり、第１および第２の結合ドメインは、構造ドメインにより隔てられており、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、標的分子が、単一細胞上に発現されているか、またはプレートもしくは単一ビーズに固定化されている場合、それらの標的に結合することができる、ポリペプチドのオリゴマー。第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、各々が、同族ペプチドとイソペプチド連結を形成することができるキャッチャードメインである。こうした同族ペプチドはタグペプチドと呼ばれることが多く、例えば、当技術分野で公知であり、下記で考察されているように、ＳｐｙＴａｇは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインとイソペプチド結合を形成する。第１の結合ドメインの同族ペプチドは、第２の結合ドメインの同族ペプチドとは異なる。
本開示の追加の態様
また、本明細書では、本明細書でより詳細に記載されている多価タンパク質スキャフォールドのオリゴマーコアの少なくとも１つの単量体をコードするポリヌクレオチドが提供される。また、本明細書では、第１の結合ドメイン、第２の結合ドメイン、および構造ドメインを含む、本明細書でより詳細に記載されているマルチドメインポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドが提供される。
さらに、上記ポリヌクレオチドを含むベクター；上記ベクターを含む細胞；上記単量体、上記オリゴマーコア、および／または上記多価タンパク質スキャフォールドを産生するための方法であって、上記細胞を培地中で培養して上記タンパク質スキャフォールドを産生することを含む方法が提供される。
さらに、上記ポリヌクレオチドを含むベクター；上記ベクターを含む細胞；マルチドメインポリペプチド構築物を産生するための方法であって、上記細胞を培地中で培養して上記マルチドメインポリペプチドを産生することを含む方法が提供される。
少なくとも１つの単量体をコードする適切なポリヌクレオチド配列；適切な発現ベクター；および単量体、オリゴマーコア、および／または多価タンパク質スキャフォールドを発現させるための適切な細胞の選択は、当業者であれば日常的なことである。
療法有効性
本明細書で提供されるタンパク質複合体、治療用薬物アナログ、および治療用薬物候補は、治療に有用である。マルチドメインポリペプチド構築物は、典型的には治療に有用である。こうした提供される物質は、本明細書では「治療用タンパク質複合体」とも呼ばれる。
したがって、本発明は、薬剤に使用するための、本明細書に記載の治療用タンパク質複合体および構築物を提供する。本発明は、ヒト身体または動物身体の治療に使用するための、本明細書に記載の治療用タンパク質複合体を提供する。本発明は、ヒト身体または動物身体の治療に使用するための、本明細書に記載の治療用タンパク質構築物を提供する。
本発明は、そのような治療を必要とするヒトまたは動物を治療するための方法であって、治療を必要とするヒトまたは動物に、本明細書に記載のタンパク質複合体、マルチドメインポリペプチド構築物（単量体またはオリゴマー形態の）、治療用薬物アナログ、治療用薬物候補、または薬物を投与することを含む方法を提供する。
また、薬学的に許容される担体または希釈剤と共に、本明細書に記載の１つまたは複数の治療用タンパク質複合体を含む医薬組成物が提供される。典型的には、組成物は、本発明の治療用タンパク質複合体を最大で８５重量％含む。より典型的には、組成物は、本発明の治療用タンパク質複合体を最大で５０重量％含む。好ましい医薬組成物は無菌であり、発熱物質を含まない。
また、薬学的に許容される担体または希釈剤と共に、本明細書に記載の１つまたは複数のマルチドメインポリペプチド構築物を含む医薬組成物が提供される。典型的には、組成物は、本発明の治療用マルチドメインポリペプチド構築物を最大で８５重量％含む。より典型的には、組成物は、本発明の治療用マルチドメインポリペプチド構築物を最大で５０重量％含む。好ましい医薬組成物は無菌であり、発熱物質を含まない。
本発明の組成物は、本明細書に記載の方法におけるキットの使用を可能にするための使用説明書、または方法をどの対象に対して使用することができるかに関する詳細を含むキットとして提供することができる。
上記で説明したように、本明細書で提供される治療用タンパク質複合体および構築物は、種々の障害の治療または予防に有用である。本提供の治療用タンパク質複合体を使用した治療の対象である障害としては、がん、自己免疫疾患（例えば、強直性脊椎炎（ankolysing spondylitis））、乾癬、加齢黄斑変性症などの眼疾患、多発性硬化症、心臓血管障害、ウイルス感染症および細菌感染症を含む感染症、クローン病、関節リウマチ、変形性関節症、アルツハイマー病、移植および同種移植片拒絶反応など、および造血幹細胞障害などを挙げることができる。より幅広く、本明細書で提供される治療用タンパク質複合体は、抗体、特に二重特異性抗体を使用して治療されるありとあらゆる状態の治療にも有用性を見出す。
がん、例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、エイズ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門がん、星状細胞腫、脳がん、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、および悪性線維性組織球腫）、乳がん、気管支腫瘍、髄芽腫および他のＣＮＳ胚芽腫、子宮頸がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、性腺外胚細胞腫瘍、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管がん、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、精巣がん、妊娠性絨毛膜疾患、ヘアリー細胞白血病、肝細胞がん、組織球症、ランゲルハンス細胞、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、胸膜肺芽腫、および気管気管支腫瘍）、リンパ腫、骨悪性線維性組織球腫および骨肉腫、メルケル細胞癌、中皮腫、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、骨髄性白血病、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、中咽頭がん、骨肉腫および未分化多形肉腫、膵臓がん、膵神経内分泌腫瘍（島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、直腸がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、ならびに気管気管支腫瘍などは、本明細書で提供される治療用タンパク質複合体で治療するのに特に好適である。本明細書で提供される治療用タンパク質複合体で治療し易い自己免疫障害としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（狼瘡）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、乾癬、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、および血管炎が挙げられる。
本明細書で提供される治療用タンパク質複合体は、独立型の治療剤として使用することができる。代替的に、本明細書で提供される治療用タンパク質複合体は、化学療法剤など、他の活性作用剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本明細書で提供される治療用タンパク質複合体は、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、またはセツキシマブ）、免疫療法（例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブ）、臓器横断的（tumour-agnostic）療法（例えば、ラロトレクチニブ）、または化学療法（例えば、５－フルオロウラシル、シスプラチン、またはドセタキセル）と組み合わせて使用することができる。
がんの治療に使用する場合、本明細書で提供される治療用タンパク質複合体は、がんの症状の緩和、改善、または悪化予防に使用することができる。典型的には、がんの治療は、がんの進行を低減させること、例えば、無憎悪生存期間を増加させることを含んでいてもよい。がんの治療は、がんに関連付けられる腫瘍の増殖を予防または阻害することを含んでいてもよい。がんの治療は、がんの転移を予防することを含んでいてもよい。好ましくは、がんの治療は、がんに関連付けられる腫瘍のサイズを低減することを含んでいてもよい。したがって、治療は、がんの腫瘍退縮を引き起こすことができる。がんの治療は、患者に存在する腫瘍または病変の数を低減することを含んでいてもよい。治療ががんに関連付けられる腫瘍のサイズを低減させる場合、腫瘍のサイズは、典型的には、ベースラインから少なくとも１０％低減される。ベースラインは、化合物による治療が最初に開始された日の腫瘍のサイズである。腫瘍のサイズは、典型的には、ＲＥＣＩＳＴ基準のバージョン１．１に準じて測定される（例えば、Eisenhauer et al, European Journal of Cancer 45 (2009) 228-247に記載の通りに）。
化合物による治療に対する応答は、ＲＥＣＩＳＴ基準のバージョン１．１に準じて、完全奏功、部分奏功、または安定疾患であり得る。好ましくは、応答は、部分奏功または完全奏功である。治療は、少なくとも６０日間、少なくとも１２０日間、または少なくとも１８０日間の無増悪生存期間を達成することができる。
腫瘍サイズの低減は、ベースラインと比べて、２０％よりも大きな、３０％よりも大きな、または５０％よりも大きな低減であってもよい。腫瘍サイズの低減は、治療の３０日後または治療の６０日後に観察される場合がある。
本明細書で提供される治療用タンパク質複合体は、感染症、例えばグラム陽性菌および／またはグラム陰性菌により引き起こされる感染症；ならびにウイルス感染症の治療にも有用であり得る。本明細書で提供される治療用タンパク質複合体は、細菌、真菌、およびウイルスなどの病原体と相互作用するように設計されていてもよい。
ここで説明されているように、本明細書で提供される治療用タンパク質複合体は、種々の障害の治療または予防に有用である。したがって、本発明は、薬剤に使用するための、本明細書に記載の治療用タンパク質複合体を提供する。また、本発明は、薬剤の製造における、本明細書で提供される治療用タンパク質複合体の使用を提供する。また、本発明は、本明細書で提供される治療用タンパク質複合体を含む組成物および生成物を提供する。そのような組成物および生成物は、障害の治療または予防にも有用である。したがって、本発明は、薬剤に使用するための、本明細書で規定の組成物または生成物を提供する。また、本発明は、薬剤の製造における本発明の組成物または生成物の使用を提供する。また、そのような治療を必要とする対象を治療する方法であって、本明細書で提供される治療用タンパク質複合体を対象に投与することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、対象は、本明細書で開示の障害の１つに罹患しているかまたは罹患するリスクがある。
一態様では、対象は、哺乳動物、特にヒトである。しかしながら、対象は非ヒトであってもよい。好ましい非ヒト動物としては、これらに限定されないが、マーモセットまたはサルなどの霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、またはブタなどの商業的飼育動物、およびイヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、フェレット、アレチネズミ、またはハムスターなどのペットが挙げられる。対象は、細菌に感染することが可能なあらゆる動物であってもよい。
対象は、典型的にはヒト患者である。患者は、男性であってもよくまたは女性であってもよい。患者の年齢は、典型的には、少なくとも１８歳、例えば３０歳～７０歳、または４０歳～６０歳である。また、対象は、例えば生後６か月～１１歳、または１２歳～１７歳までの小児または青少年であってもよい。
本発明の治療用タンパク質複合体、ポリペプチド構築物、または組成物は、障害の１つまたは複数の症状の発症または再発を防止するために対象に投与することができる。これは予防である。この実施形態では、対象は無症候性であってもよい。予防有効量の作用剤または製剤がそのような対象に投与される。予防有効量は、障害の１つまたは複数の症状の発症を防止する量である。
本発明の治療用タンパク質複合体、ポリペプチド構築物、または組成物は、障害の１つまたは複数の症状を治療するために対象に投与することができる。この実施形態では、対象は、典型的には症候性である。治療有効量の作用剤または製剤がそのような対象に投与される。治療有効量は、障害の１つまたは複数の症状の改善に有効な量である。
本発明の治療用タンパク質複合体、ポリペプチド構築物、または組成物は、様々な剤形で投与することができる。したがって、本発明の治療用タンパク質複合体、ポリペプチド構築物、または組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁剤、分散性粉末剤、または顆粒剤として経口投与することができる。本発明の治療用タンパク質複合体または組成物は、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、経皮、または輸注技法であるか否かに関わらず、非経口的に投与することもできる。治療用タンパク質複合体、ポリペプチド構築物、または組成物は、座薬として投与することもできる。好ましくは、化合物、組成物、または組合せは、吸入（エアロゾル化）または静脈内投与により、最も好ましくは吸入（エアロゾル化）投与により投与することができる。
本発明の治療用タンパク質複合体または組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体または希釈剤と共に投与するために製剤化される。例えば、固体経口剤形は、活性化合物と共に、以下のものを含んでいてもよい：例えば、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチ、またはジャガイモデンプンなどの希釈剤；滑沢剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、もしくはステアリン酸カルシウム、および／またはポリエチレングリコール；結合剤；例えば、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン；解凝集剤、例えば、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩、またはデンプングリコール酸ナトリウム；飽和剤；染料；甘味料；レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸などの湿潤剤；ならびに、医薬製剤に使用される一般に非毒性で薬理学的に不活性な物質。そのような医薬製剤は、公知の方法、例えば、混合、造粒、錠剤化、糖衣、またはフィルムコーティング法により製造することができる。
本発明の治療用タンパク質複合体、ポリペプチド構築物、または組成物は、溶液または懸濁物として吸入（エアロゾル化）投与するために製剤化されていてもよい。本発明の治療用タンパク質複合体または組成物は、定量吸入器（ＭＤＩ）または電子ネブライザーもしくはジェットネブライザーなどのネブライザーにより投与することができる。代替的に、本発明の治療用タンパク質複合体または組成物は、粉末薬物として吸入投与するために製剤化することができ、そのような製剤は、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）から投与することができる。吸入投与用に製剤化する場合、本発明の治療用タンパク質複合体または組成物は、１～１００μｍ、好ましくは１～５０μｍ、より好ましくは１～２０μｍ、例えば３～１０μｍ、例えば４～６μｍの空気力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）を有する粒子の形態で送達することができる。本発明の治療用タンパク質複合体または組成物を噴霧エアロゾルとして送達する場合、粒子径への言及によりエアロゾルの液滴のＭＭＡＤが規定される。ＭＭＡＤは、レーザー回折などの任意の好適な技法により測定することができる。
経口投与用の液体分散物は、シロップ、エマルジョン、および懸濁物であってもよい。シロップは、担体として、例えば、サッカロースまたはサッカロース＋グリセリンおよび／またはマンニトールおよび／またはソルビトールを含んでいてもよい。
懸濁物およびエマルジョンは、担体として、例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含んでもよい。筋肉内注射または吸入用の懸濁物または溶液は、活性化合物と共に、薬学的に許容される担体、例えば、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えばプロピレングリコール、および必要に応じて好適な量の塩酸リドカインを含んでいてもよい。
吸入、注射、または輸注用の溶液は、担体として例えば滅菌水を含んでいてもよく、または好ましくは滅菌水性等張生理食塩溶液の形態であってもよい。無針注射による、例えば経皮的な送達に好適な医薬組成物も使用することができる。
本発明の治療用タンパク質複合体または組成物の治療有効量または予防有効量が対象に投与される。用量は、種々のパラメーターに従って、特に、使用される化合物；治療を受ける対象の年齢、体重、および状態；投与経路；ならびに必要とされるレジメンに応じて決定することができる。この場合も、医師は、任意の特定の対象に必要とされる投与経路および投薬量を決定することができるだろう。典型的な１日用量は、特定の阻害剤の活性、治療を受ける対象の年齢、体重、および状態、疾患のタイプおよび重症度、ならびに投与の頻度および経路に応じて、体重１ｋｇ当たり約０．０１～１００ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１～１０ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、１日投薬量レベルは５ｍｇ～２ｇである。
本発明の治療用タンパク質複合体または組成物が、別の活性作用剤と組み合わせて対象に投与される場合、他の活性作用剤の用量は、上記に記載のように決定することができる。用量は、種々のパラメーターに応じて、特に、使用される作用剤；治療を受ける対象の年齢、体重、および状態；投与経路；ならびに必要とされるレジメンに従って決定することができる。この場合も、医師は、任意の特定の対象に必要とされる投与経路および投薬量を決定することができるだろう。典型的な１日用量は、特定の作用剤の活性、治療を受ける対象の年齢、体重、および状態、疾患のタイプおよび重症度、ならびに投与の頻度および経路に応じて、体重１ｋｇ当たり約０．０１～１００ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１～１０ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、１日投薬量レベルは５ｍｇ～２ｇである。
本明細書で提供されるタンパク質複合体、治療用薬物アナログ、および治療用薬物候補は、診断方法にも有用である。本明細書で提供されるポリペプチド構築物および薬物は、診断方法にも有用である。したがって、本明細書では、対象の病理を診断するための方法で使用するための、本明細書に記載のタンパク質複合体、治療用薬物アナログもしくは治療用薬物候補、またはポリペプチド構築物もしくは薬物が提供される。対象は、本明細書でより詳細に記載の対象であってもよい。病理は、本明細書に記載の病理であってもよい。この方法は、タンパク質複合体、治療用薬物アナログまたは治療用薬物候補を、対象から得られる試料（例えば、血液、血清、尿、または脳脊髄液などの生物学的流体；ならびにウイルス学的スワブ試料、生検組織、および剖検組織）と接触させること、およびタンパク質複合体、治療用薬物アナログまたは治療用薬物候補が存在する場合に試料中で生じる病理の特徴的な変化を、それらが存在しない場合と比較して検出することを含んでいてもよい。
本発明は、少なくとも以下の番号付き実施形態を含む。
１．
－ 複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコア、および
－ 少なくとも２つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも２つの第１の結合部位
を含む多価タンパク質スキャフォールドであって、
前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は、スキャフォールドの同じ面に位置する、多価タンパク質スキャフォールド。
２．
－ 複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコア、
－ 少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも１つの第１の結合部位
を含む多価タンパク質スキャフォールドであって、
前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は、スキャフォールドの同じ面に位置し、
前記第１の結合部位は、第１のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第１のタンパク質ドメインを含み、前記第２の結合部位は、第２のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第２のタンパク質ドメインを含む、多価タンパク質スキャフォールド。
３．
－ 複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコア、
－ 少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも１つの第１の結合部位
を含む多価タンパク質スキャフォールドであって、
前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は、スキャフォールドの同じ面に位置し、
前記オリゴマーコアは、抗体のＦｃ領域を含まない、多価タンパク質スキャフォールド。
４． オリゴマーコアは、少なくとも３つのサブユニット単量体を含み、
より好ましくは、オリゴマーコアは、３～６つのサブユニット単量体を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
５． 前記サブユニット単量体は、非共有結合で一緒に付着している、先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
６． 前記サブユニット単量体は、共有結合で一緒に付着しており、
好ましくは、前記サブユニット単量体は、遺伝子的に一緒に融合されている、実施形態１～４に記載のタンパク質スキャフォールド。
７． 前記オリゴマーコアは、ホモオリゴマーコアである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
８． オリゴマーコアの各単量体は、少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位を含み、少なくとも１つの第１の結合部位は、少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
９． 各単量体は、前記単量体の第１の末端に付着した第１の結合部位、および前記単量体の第２の末端に付着した第２の結合部位を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
１０． 各単量体の第１の末端および第２の末端は、前記単量体の同じ面に位置する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
１１． 各単量体は、前記単量体の第１の末端に付着した第１の結合部位、および前記第１の結合部位に付着した第２の結合部位を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
１２． 前記オリゴマーコアは、ヘテロオリゴマーコアである、実施形態１～６のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
１３． 前記コアは、第１の結合部位を含む少なくとも１つの第１のサブユニット単量体、および第２の結合部位を含む少なくとも１つの第２のサブユニット単量体を含み、第１の結合部位は第２の結合部位に対して直交性である、実施形態１２に記載のタンパク質スキャフォールド。
１４．
ｉ）各サブユニット単量体は、３００個未満のアミノ酸を含み、
好ましくは、各サブユニット単量体は、２００個未満のアミノ酸を含み、
より好ましくは、各サブユニット単量体は、１５０個未満のアミノ酸を含み、および／または
ｉｉ）オリゴマーコアは、約１５０ｋＤａ未満、好ましくは約１００ｋＤａ未満、より好ましくは約７０ｋＤａ未満の分子量を有する、
先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
１５． オリゴマーコアは、抗体のＦｃ領域を含まない、先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
１６． オリゴマーコアは、多量体タンパク質の可溶性多量体化構造要素を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
１７． 多量体タンパク質は、コラーゲンＮＣ１ドメイン、ＣｕｔＡ１、Ｃ１ｑドメイン、ＴＮＦ、ｐ５３、フィブリノーゲン、Ｃ４、枯草菌ＡｂｒＢ、またはそれらホモログもしくはパラログを含む、実施形態１６に記載のタンパク質スキャフォールド。
１８． 多量体化構造要素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号１９と、少なくとも５０％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、実施形態１６または実施形態１７に記載のタンパク質スキャフォールド。
１９． 前記第１の結合部位および／または前記第２の結合部位は、タンパク質ドメインを含み、
好ましくは、前記第１の結合部位は第１のタンパク質ドメインを含み、前記第２の結合部位は第２のタンパク質ドメインを含み、第１の結合部位および／または第２の結合部位は、それらが付着するサブユニット単量体と遺伝子的に融合されており、単一のポリペプチド鎖を形成する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
２０． 前記第１の結合部位は、第１のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第１のタンパク質ドメインを含み、前記第２の結合部位は、第２のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第２のタンパク質ドメインを含み、
好ましくは、前記第１のタンパク質ドメインは前記第１のポリペプチド標的とイソペプチド結合を形成することが可能であり、前記第２のタンパク質ドメインは前記第２の結合標的とイソペプチド結合を形成することが可能である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールド。
２１． 前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は各々、異なるスプリットリガンド結合タンパク質ドメインを含み、
好ましくは、前記第１の結合部位および前記第２の結合部位の一方は、スプリットストレプトコッカス・ピオゲネスフィブロネクチン結合タンパク質ドメインを含み、前記第１の結合部位および前記第２の結合部位の他方は、スプリットストレプトコッカス・ニューモニエアドヘシンドメインを含む、実施形態２０に記載のタンパク質スキャフォールド。
２２． 前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は、各々独立して、配列番号４～９、１１～１３、または１５～１８のいずれか１つと、少なくとも５０％アミノ酸同一性を有する、実施形態２１に記載のタンパク質スキャフォールド。
２３． 先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質スキャフォールドを含むタンパク質複合体であって、第１の結合部位は、第１のエフェクター部分に付着した第１のポリペプチド標的に結合しており、第２の結合部位は、第２のエフェクター部分に付着した第２のポリペプチド標的に結合している、タンパク質複合体。
２４． 第１の結合部位／ポリペプチド標的対および第２の結合部位／ポリペプチド標的対は、各々独立して、（ｉ）配列番号４、６、もしくは８のいずれか１つと配列番号５、７、もしくは９のいずれか１つとの組合せ；（ｉｉ）配列番号１２と配列番号１３もしくは１５との組合せ；（ｉｉｉ）配列番号５と配列番号１１との組合せ；（ｉｖ）配列番号１５と配列番号１６との組合せ；（ｖ）配列番号１７と配列番号１８との組合せから選択される、実施形態２３に記載のタンパク質複合体。
２５． ライブラリーを含むスクリーニングプラットフォームであって、前記ライブラリーは、実施形態２３または実施形態２４に記載のタンパク質複合体の複数の集団を含み、タンパク質複合体の集団は各々、第１のエフェクター部分、第２のエフェクター部分、および／またはオリゴマーコアの異なる組合せを含む、スクリーニングプラットフォーム。
２６． 治療用薬物アナログを特定するための方法であって、
実施形態２３または実施形態２４に記載のタンパク質複合体を用意すること、
タンパク質複合体を生物系と接触させること、および
タンパク質複合体が、生物系の特性機能に所望の変化を誘導するか否かを測定すること
を含み、
任意選択で、生物系の特性に所望の変化を誘導するタンパク質複合体を選択することをさらに含む、方法。
２７．
－ タンパク質複合体の第１および第２のエフェクター部分に付着した特定された治療用薬物アナログの前記タンパク質複合体のスキャフォールドのオリゴマーコアを含む治療用薬物候補を合成すること
をさらに含む、実施形態２６に記載の方法。
２８． 実施形態２６または実施形態２７の方法により得ることが可能な治療用薬物候補。
２９． １つまたは複数の第１のエフェクター部分および１つまたは複数の第２のエフェクター部分に付着した複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコアを含む治療用薬物候補であって、前記１つまたは複数の第１のエフェクター部分および前記１つまたは複数の第２のエフェクター部分は、オリゴマーコアの同じ面に位置し、
（ｉ）前記１つもしくは複数の第１エフェクター部分は２つもしくはそれよりも多くの第１エフェクター部分を含み、前記１つもしくは複数の第２エフェクター部分は２つもしくはそれよりも多くの第２エフェクター部分を含み、および／または（ｉｉ）前記オリゴマーコアは、抗体も抗体断片も含まない、治療用薬物候補。
３０． オリゴマーコアは、実施形態１～２２のいずれか１つに規定されている通りである、実施形態２９に記載の治療用薬物候補。
３１． オリゴマーコアは、複数のサブユニットモノマーを含み、（ｉ）各サブユニット単量体は、コラーゲンＮＣ１ドメイン、ＣｕｔＡ１、Ｃ１ｑドメイン、ＴＮＦ、ｐ５３、フィブリノーゲン、Ｃ４、枯草菌ＡｂｒＢ、またはそれらのホモログもしくはパラログを含む；および／あるいは（ｉｉ）各サブユニット単量体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号１９と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む多量体化構造要素を含む、実施形態２９または実施形態３０に記載の治療用薬物候補。
以下の実施例は本発明の例示である。しかしながら、以下の実施例は、本発明をいかなる点でも限定しない。特に、タンパク質結合のアッセイは数多く存在し、そのため任意の特定のアッセイにおける陰性結果は決定的なものではない。本発明は、特許請求の範囲により規定される。
まとめると、実施例１には、Ｘ型コラーゲンＮＣ１構造ドメインならびにＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインをＮ末端およびＣ末端に含む構築物を生成し、次いでそれらを、ＳｐｙＴａｇ付きおよびＳｎｏｏｐＴａｇ付き治療用ポリペプチドにイソペプチド結合を介して共有結合で連結させ、次いでイソペプチド結合構築物をオリゴマー化してホモ三量体を形成することが詳述されている。実施例２は、後続の実施例で使用される材料および方法を提供する。実施例３は、本発明による構築物の設計を概説し、Ｃ３幾何学形状を含む好適な幾何学形状の複数の成分を特定し、ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ（配列番号２２）の精製を示す。実施例４は、本発明の好ましい構築物の設計基準を満たすように他のアセンブリ幾何学形状を改変することができる方法を示す。実施例５では、ＰｈＣｕｔＡ１由来成分の並外れた安定性、ならびにその構造により予測される多量体化の確固たる証拠が強調される。実施例６では、ＳｐｙＴａｇ付き／ＳｎｏｏｐＴａｇ付き成分を精製し、得られたプラットフォームをタグ付きタンパク質で修飾する。実施例７には、モジュール式アセンブリ後、タンパク質を、大規模化可能な様式でクリーンアップすることできることが示されており、ここでは、溶液中のサイズが大きいことを利用して１００ｋＤａ膜に対して透析される。実施例８は、モジュール式アセンブリが、ＰｈＣｕｔＡ１由来のプラットフォームからの移行としてのＨｓＣｕｔＡ１由来プラットフォームの開発を含む、迅速プロトタイプ化を可能にすることを示す。実施例９では、Ａｌｐｈａｆｏｌｄを使用してシス配向性を予測し、非シスＩＭＸおよびＸＶＩＩＩ型コラーゲンＮＣ１アセンブリと対比させる。実施例１０は、アセンブリされたプラットフォームを、リガンドの有効性および下流効果を解明するためのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングのために使用することできることを示す細胞データを提供する。また、実施例１０は、エフェクター部分を組み込んだＰｈＣｕｔＡ１のマルチドメインポリペプチドを容易に生成することができることを示す。
[実施例１]
リンカーによりＮ末端がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒの一方に付着し、Ｃ末端がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒの他方に付着したコラーゲンＮＣ１の単量体をコードするポリヌクレオチド配列を、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4thed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012)に記載の方法に従って合成する。このポリヌクレオチド配列を細胞発現系で発現させてポリペプチド融合体を産生させる。このポリペプチド融合体は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合部位およびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ結合部位がオリゴマー化三量体構築物の同じ面に存在するようにオリゴマー化することができる。
構築物の試料を、各々が対応するＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇに結合した異なる第１および第２の治療用ポリペプチドのパネルと接触させると、ＳｐｙＴａｇ付きポリペプチドが各ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分と共有結合性イソペプチド結合を形成し、ＳｎｏｏｐＴａｇ付きポリペプチドが各ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分と共有結合性イソペプチド結合を形成し、それにより、構築物の各単量体が２つの異なる治療用ポリペプチドの各々に結合しており、したがって三量体構築物は各ポリペプチドの３つのコピーを含む、Ｘ型コラーゲンＮＣ１構築物のライブラリーが生成される。各試料は、第１および第２の治療用ポリペプチドの異なる組合せを含む。
ライブラリー中の各試料を、がん細胞の試料にて細胞死を引き起こすなど、生物系に生物学的反応を誘発する能力について評価する。
がん細胞死を引き起こすのに最も効果的なライブラリーの試料に着目する。そのような試料中の治療用ポリペプチドの組合せに着目する。
Ｎ末端が治療用ポリペプチドの一方に連結され、Ｃ末端が治療用ペプチドの他方に連結されたコラーゲンＮＣ１の単量体などのオリゴマータンパク質の単量体をコードするポリヌクレオチドを、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4thed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012)に記載のように合成する。このポリヌクレオチドを発現させて、オリゴマータンパク質単量体ならびに第１および第２の治療用ポリペプチドの融合体からなるポリペプチド単量体を産生させる。単量体のオリゴマー化を可能にする。単量体を、生物系に対して試験する。初期構築物で観察される生物学的反応、例えばがん細胞の試料における細胞死の因果関係を観察する。
この実施例は、リンカーによりＮ末端がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒの一方に付着し、Ｃ末端がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒの他方に付着したＣｕｔＡ１の単量体をコードするポリヌクレオチド配列を用いて実施することができる。
[実施例２]
方法
スキャフォールドタンパク質成分の選択：設計基準を満たすタンパク質構造をＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）から選択した。適切な検索フィルター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／で提供されているものなど）を使用することにより、幾何学的形状ベースのプレスクリーニングを可能にし、その後、タンパク質構造を視覚化することにより、および関連文献に記載の生化学的特性を参照することにより、候補構造をさらに調査した。
アセンブリされるタンパク質構造の予測：タンパク質配列の多量体３Ｄ構造を、Mirdita et al., 2021, bioRxiv, DOI: 10.1101/2021.08.15.456425v3により提供されたＣｏｌａｂノートブックに実装されたＡｌｐｈａＦｏｌｄ ｖ２．０で、ＡｌｐｈａＦｏｌｄ２－ｍｕｌｔｉｍｅｒ－ｖ２ ｍｏｄｅｌ＿ｔｙｐｅパラメーターを使用して予測した。ＩＭＸ含有ＳｐＣ３－ＩＭＸ－ＤｇＣ配列番号３５を除いてすべてのタンパク質について、初期パラメーターを用いた。ＩＭＸ含有ＳｐＣ３－ＩＭＸ－ＤｇＣ配列番号３５の場合、計算資源を節約するため、ｔｅｍｐｌａｔｅ＿ｍｏｄｅをｐｄｂ７０に設定した。ＳｐＣ３－ＩＭＸ－ＤｇＣ以外のすべてのタンパク質は三量体としてサブミットし、ＳｐＣ３－ＩＭＸ－ＤｇＣは七量体としてサブミットした。末端リンカーおよびタグ配列は、予測前に除去した。最上位モデルを可視化した。
分子クローニング：組換えタンパク質をコードするプラスミドは、Ｔｗｉｓｔ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘが提供した。ＤＮＡ断片およびオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）が合成した。Ｌ１－ＰｈＣｕｔＡ１－Ｌ２、ＤｇＴ－Ｘ３、およびＳｐＣ－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣの構築物を、標準的なクローニング手順によりアセンブリした。合成したＤＮＡ断片をプラスミド骨格に導入するために、点突然変異を導入するために、または組換え配列に他の調整をなすために、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してＤＮＡを増幅し、続いて制限クローニングなどの標準的クローニング方法を使用した。アセンブリ構築物を大腸菌ＮＥＢ５－アルファ細胞に形質転換した。推定陽性クローンを一晩増殖させ、ミニプレップにより細菌ペレットからＤＮＡを単離した。試料を、サンガー配列決定のためにＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅへと送付して配列を検証し、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇの分子生物学パッケージ（ｗｗｗ．ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ）を使用してアラインメントを実施した。
タンパク質精製：ＳｎＴ－Ｌ１（１６．１ｋＤａ）、Ｌ２－ＳｐＴ（９．７ｋＤａ）、ＤｇＴ－Ｘ３（２６．９ｋＤａ）、ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ（３９．０ｋＤａ）、ＳｐＣ３－ＭＩＦ２ｍ－ＤｇＣ（３９．６ｋＤａ）、およびＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣ（４０．５ｋＤａ）のタンパク質を得るために、両タンパク質をコードするＤＮＡ（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、または標準的クローニング手順により合成）をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。コロニーを使用して、３７℃にて１６０～２２０ｒｐｍで振盪しながら５０μｇ／ｍＬカナマイシンを有するＬＢ培養物を接種した。一晩培養物を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンで補完されたＬＢまたは２×ＹＴ培地で１：１００に希釈した。培養物を１６０～２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で増殖させてから、ＯＤ０．６～０．８（ＬＢ）または１．６～２．０（２×ＹＴ）時に０．２～０．４μＭのＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導した。プラットフォームタンパク質（ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ、ＳｐＣ３－ＭＩＦ２ｍ－ＤｇＣ、ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣ）の場合、試料を１６０～２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でさらに４時間インキュベートした。タグ付きタンパク質（ＳｎＴ－Ｌ１、Ｌ２－ＳｐＴ、ＤｇＴ－Ｘ３）の場合、試料を１６０～２００ｒｐｍで振盪しながら１８℃でさらに１６時間インキュベートした。５０００×ｇで１５分間４℃にて遠心分離することにより細胞を収集し、ペレットを－２０℃で保管した。タンパク質精製のため、細胞ペレットを、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤カクテル、およびベンゾナーゼ（５Ｕ／ｍＬ）で補完されたＮｉ－ＮＴＡ平衡化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８；３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）に再懸濁した。試料を、２０ｍｍプローブおよび２０％の振幅を使用した超音波プロセッサを用いて、オン２秒／オフ４秒のパルスで９～１２分間超音波処理し、１６，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィー用に保持した。
事前に平衡化したＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ重力流カラムを使用して、細胞溶解物からタンパク質を精製した。タンパク質溶解物を樹脂にローディングした。樹脂を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８；３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールで洗浄し、続いて２８０ｎｍでのフロースルー画分の吸光度がベースラインに近づくまで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８；３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾールで洗浄した。２８０ｎｍでの溶出画分の吸光度がベースラインに近づくまで、樹脂床容積の２倍の溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８；３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール）でＨｉｓタグ付きタンパク質を樹脂から溶出させた。溶出液を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、続いてクーマシー染色することにより分析した。Ｎｉ－ＮＴＡ精製後、３Ｋ ＭＷＣＯのＳｎａｋｅＳｋｉｎ（商標）透析チューブを使用して、高濃度イミダゾール中の試料をＰＢＳに対して透析した。チューブの適切な長さを、総溶出容積に基づいて決定し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で水和させた。試料をＳｎａｋｅＳｋｉｎ（商標）透析チューブに移し、５ＬのＰＢＳに入れ、磁石スターラーに一晩４℃で載せておいた。１６時間後、緩衝液をさらに２回交換し、２時間インキュベーションした。Ｉｍｐｌｅｎ ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｎ６０を使用して２８０ｎｍの吸光度を測定し、ＰｒｏｔＰａｒａｍにより予測される還元吸光係数を用いて推定タンパク質濃度を算出した。Ｌ３－ＤｇＴは、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙが産生させた。
サイズ排除クロマトグラフィー：Ｎｉ－ＮＴＡ精製後、任意選択で、図に示されているように、サイズ排除クロマトグラフィーを使用してタンパク質をさらに精製した。これは、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ（ＳｎＴ－Ｌ１およびＬ２－ＳｐＴ）カラムまたはＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣおよびＬ１－ＰｈＣｕｔＡ１－Ｌ２）カラムで、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ２５（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して実施した。カラムを、まず１カラム容積のＰＢＳで平衡化した。ローディング前に、タンパク質試料を約１ｍＬに濃縮し、２ｍＬの注入ループを使用してカラムに注入した。次いで、試料を１ｍＬ分－１の流速を使用して分離し、２ｍＬ画分サイズを収集した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析用に、主要溶出ピークに対応する２０μｌの試料を各画分から取り出した。目的のタンパク質のピークに対応する画分をプールし、下流応用に使用したか、または－２０℃で保管した。
ＨｓＣｕｔＡ１アセンブリを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０カラムを使用して精製した。カラムを、まず１カラム容積のＰＢＳで平衡化した。ローディング前に、タンパク質試料を約１００μＬに調製し、Ｈａｍｉｌｔｏｎ７００マイクロリットルシリンジでカラムに注入した。次いで、試料を０．３ｍＬ分－１の流速を使用して分離し、０．１ｍＬ画分サイズを収集した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析用に、主要溶出ピークに対応する１０μＬの試料を各画分から取り出した。目的のタンパク質のピークに対応する画分をプールし、下流応用に使用したか、または－２０℃で保管した。
ＢＣＡアッセイによるタンパク質定量化：コンジュゲーション前に、製造業者の使用説明書に従ってＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して試料を定量化した。ＢＳＡ標準物質を１×ＰＢＳで希釈した。精製タンパク質を１×ＰＢＳで１／５、１／１０、および１／２０に希釈して、濃度がアッセイの線形範囲内であることを保証した。ＢＣＡ試薬と共にインキュベーションした後、ＢＭＧ ＦｌｕｏＳＴＡＲ Ｏｍｅｇａプレートリーダーで５６２ｎｍの吸光度を測定した。標準曲線に基づいて、濃度をｍｇ／ｍＬ単位で補間した。
キャッチャーベースタンパク質コンジュゲーション：関連リガンドとのプラットフォームコンジュゲーションは、関連する図に詳述されている特定のアッセイに従って、１：１：１～１：２：２のプラットフォーム：リガンド：リガンド比で実施した。コンジュゲーション反応を、関連アッセイに従って、２５℃で１６時間、２４時間、または６４時間進行させ、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（８％、１６％）にかけ、続いてクーマシー染色することにより分析した。
アセンブリ後の透析：過剰な基質を除去するための、コンジュゲートされたアセンブリＨ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴの確認透析を、１００ｋＤａ ＭＷＣＯセルロース膜を有するＨＴＤｉａｒａｃｙ１２ウェルブロックを使用して室温で実施した。透析前に、膜を滅菌Ｍｉｌｌｉ－Ｑで６０分間水和させ、２０％エタノールで２０分間置換し、使用前に滅菌Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で２回洗浄した。試料および透析液は両方とも１×ＰＭＳＦを含んでいた。アセンブリプラットフォームおよび透析液の試料を、透析中２時間、４時間、８時間、および１６時間の時点で取り出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１４％）にかけ、続いてクーマシー染色することにより分析した。
細胞アッセイの入力としてのコンジュゲートされたアセンブリの予備透析を上記と同様に行ったが、以下の変更を加えた：ＰＭＳＦを添加せず、透析を室温で一晩実施した。
ＨｓＣｕｔＡ１架橋：Ｈ６－ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣを架橋するために、１０μＭのタンパク質を、ＰＢＳ中０．１％グルタルアルデヒドと共に３７℃で２０分間インキュベートした。反応中に表記の間隔で試料を取り出し、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８を添加して反応を停止させた。試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％）にかけ、続いてクーマシー染色することにより分析した。
細胞培養：ＮＣＩ－Ｎ８７（ＣＲＬ－５８２２）細胞およびＡ－４３１（ＣＲＬ－１５５５）細胞を、ＡＴＣＣから入手し、それぞれ１０％ＦＣＳおよび５％ペニシリン／ストレプトマイシンで補完されたＲＰＭＩおよびＤＭＥＭ中で通常の通りに培養した。
細胞生存率アッセイ：２０００個のＮＣＩ－Ｎ８７細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＣＳで補完されたＤＭＥＭで２４時間増殖させてから、０．２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中で２４時間飢餓状態にした。次いで細胞を、２つのリガンド（Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴ）または１つのリガンドのみ（Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１、Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：Ｌ２－ＳｐＴ）を有する種々の濃度（０．０１～１００ｎＭ）のタンパク質アセンブリで処理するかまたは偽処理した。スキャフォールドのみ（Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ）、リガンドのみ（ＳｎＴ－Ｌ１、Ｌ２－ＳｐＴ、ＳｎＴ－Ｌ１＋Ｌ２－ＳｐＴ）、および両リガンドに対するモノクローナル対照抗体を対照として使用した。すべての抗体を飢餓培地で希釈した。処理開始の１時間後、アッセイ関連増殖因子を、最終濃度が３０ｎｇ／ｍＬになるように添加し、最終ＦＣＳ濃度を２％とした。次いで細胞を７日間増殖し、ＭＴＴアッセイを使用して生存画分を測定した。ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）２０μＬを、２００μＬ培地を含む各ウェルに添加した。３時間のインキュベーション後に、培地を吸引し、１００％ＤＭＳＯ中でホルマザン溶解し、５７０ｎｍの吸光度を読み取った。生存画分を偽処理対照に対して正規化した。
ウェスタンブロッティング：安定性アッセイ：Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣおよびＨ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴ（サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した）を、ＰＢＳおよび１０％ＦＣＳを含む完全培地で４日間４℃または３７℃にてインキュベートした。試料を、４～２０％Ｔｒｉｓ－グリシンＳＤＳ－Ｐａｇｅゲルで泳動させ、ｉＢｌｏｔ２システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してニトロセルロース膜に転写した。膜を抗ポリヒスチジンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ７０５８、１：２０００）でプローブし、ＥＣＬを使用してシグナルを検出した。
Ａｋｔ／ＥＲＫシグナル伝達：１．５×１０６個のＮＣＩ－Ｎ８７細胞をＴ２５フラスコに播種し、１０％ＦＣＳおよび５％ペニシリン／ストレプトマイシン培地で補完されたＤＭＥＭ中で２４時間増殖させてから、０．２％ＦＣＳを含む培地中で２４時間飢餓状態にした。次いで細胞を、両リガンド（Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴ）または１つのリガンド（Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１、Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：Ｌ２－ＳｐＴ）を含む２５ｎＭのタンパク質アセンブリで処理したかまたは偽処理した。スキャフォールドのみ（Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ）、リガンドのみ（ＳｎＴ－Ｌ１、Ｌ２－ＳｐＴ、ＳｎＴ－Ｌ１＋Ｌ２－ＳｐＴ）、およびこの２つの標的タンパク質に対する市販のモノクローナル抗体を対照として使用した。処理開始の１時間後、アッセイ関連増殖因子を最終濃度５０ｎｇ／ｍＬになるように添加することにより細胞を刺激し、処理全体にわたって０．２％ＦＣＳと共に１時間インキュベートした。ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤で補完されたＲＩＰＡ緩衝液を使用して全細胞抽出物を調製した。１レーン当たり２５μｇのタンパク質を、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルで分離し、製造業者の使用説明書に従ってｉＢｌｏｔ２システムを使用してニトロセルロース膜に転写した。膜を、ｐ－Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、カタログ番号４０６０、１：２０００）、Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、カタログ番号２９２０、１：２０００）、ｐ－ＥＲＫ １／２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、カタログ番号９１０１、１：１０００）、ＥＲＫ１／２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、カタログ番号４６９５Ｓ、１：１０００）に対する抗体でプローブした。ＥＣＬを使用してシグナルを検出した。
細胞殺傷アッセイ：Ｌ１およびＬ３を標的とするタンパク質アセンブリを調査するため、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞（３０，０００細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳおよび５％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充）で２４時間増殖させ、続いて０．２％ＦＣＳおよび５％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地中で２４時間飢餓状態にした。次いで細胞を、種々の濃度（０．０１～１００ｎＭ）のアセンブリタンパク質Ｈ６－ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣ：Ｌ１－ＳｐＴ：Ｌ３－ＤｇＴ、Ｈ６－ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣ：Ｌ１－ＳｐＴ、およびＨ６－ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣ：Ｌ３－ＤｇＴ、スキャフォールドのみ（Ｈ６－ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣ）、およびリガンドのみ（Ｌ１－ＳｐＴ、Ｌ３－ＤｇＴ）で処理し、４０時間インキュベートした。生存画分をＭＴＴアッセイにより測定し、偽処理した対照細胞に対して正規化した。
[実施例３]
組換えタンパク質成分を好適に選択することにより、シス配向性幾何学的形状の結合を特徴とするタンパク質複合体を簡便に調製することが可能になる。
本発明者らは、各単量体が、互いにまたは同じ複合体の他の単量体の末端に近接するＣ末端およびＮ末端を有することを特徴とする多量体タンパク質成分を使用して、結合部位を単一結合表面に対して「シス配向性」に突出させることができることを認識した。公的に入手可能なタンパク質構造をキーワードおよび／または幾何学的パラメーターでフィルタリングして、単量体末端の結合部位またはそのようなタンパク質複合体に対するリガンドの組換え融合により「シス配向性」の多量体タンパク質複合体に到達するために好適な幾何学的形状を有するタンパク質構造を特定した（図１１）。
本発明者らは、以下のものを含む、少なからぬ好適なドメインを特定した：Ｘ型コラーゲンＮＣ１ドメイン（ＰＤＢ ＩＤ：１ＧＲ３）、ＶＩＩＩ型コラーゲンＮＣ１ドメイン（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｏ９１）、種々の種に由来するＣｕｔＡ１（銅耐性Ａ）タンパク質（例えば、パイロコッカス・ホリコシイ（ＰＤＢ ＩＤ：４ＹＮＯ）、ホモ・サピエンス（ＰＤＢ ＩＤ：２ＺＦＨ）、高度好熱菌（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｖ６Ｈ）；イネ（ＰＤＢ ＩＤ：２ＺＯＭ）；またはシュワネラ種ＳＩＢ１（ＰＤＢ ＩＤ：３ＡＨＰ）に由来するＣｕｔＡ１タンパク質）、Ｃ１ｑ頭部ドメイン（ＰＤＢ ＩＤ：１ＰＫ６）、ＴＮＦ様タンパク質ＴＬ１Ａ（ＰＤＢ ＩＤ：２ＲＥ９）、ＴＮＦ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＴＮＦ）、ＭＩＦ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＣＡ７）、ＭＩＦ２（ＰＤＢ ＩＤ：７ＭＳＥ）、および本明細書に記載されているかまたは図１１に図示されている他のタンパク質構造。
本発明者らは、Ｎ末端がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号４）に（ＧＳＧＳリンカーを介して）およびＣ末端がＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（配列番号１２）に（ＧＳＧＳリンカーを介して）融合されており、さらにＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＨｉｓタグＮ末端（配列番号２１、図１２）を特徴とする、パイロコッカス・ホリコシイに由来するＰｈＣｕｔＡ１（配列番号１）を大腸菌で容易に発現および組換え的に調製することができた。注目すべきことに、この構築物「Ｈ６－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ」または「ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ」は、変性ＳＤＳローディング緩衝液中での沸騰に対して耐性であることから明らかなように、インタクトＰｈＣｕｔＡ１に特徴的な特性である超熱安定性三量体化により特徴付けられた（Tanaka et al., 2006, FEBS Letters, 580(17), pp.4224-4230）。したがって、コアタンパク質ＰｈＣｕｔＡ１の多量体化特性を、ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣスキャフォールドに付与することに成功した。
[実施例４]
単量体タンパク質のＮ末端およびＣ末端組換え融合による「シス配向性」提示に好適なタンパク質複合体は、ヘテロマータンパク質複合体または二面体タンパク質アセンブリから誘導することができる。
Ｎ末端部位およびＣ末端部位での組換え融合による「シス配向性」提示に好適な幾何学的形状をすでに特徴としているタンパク質構造またはドメインに加えて、本発明者らは、そのような成分をそれらから派生させることができるタンパク質も特定した。
ＰＤＢ ＩＤ ５ｗ０ｊ（Spencer & Hochbaum, 2017, Biochemistry, 56(40), pp.5300-5308）の逆平行コイルドコイルのＣ末端とＮ末端との間に好適なリンカーがあると、その構造は、円対称性ＨＩＶ ＧＰ４１（ＰＤＢ ＩＤ １ｉ５ｙ）の構造を模倣する（図１３ａ、ｃ）。ここで、ＰＤＢ ＩＤ ５ｗ０ｊ（Spencer & Hochbaum, 2017）と同じ公開文献に由来するヘテロマー逆平行コイルドコイルアセンブリ（ＰＤＢ ＩＤ ５ｖｔｅ）は、単純な（合理的な）突然変異誘発がどのようにして、均一なアセンブリを促進することにより末端の反転を軽減することができるかに関する例を提供する。コイルドコイルタンパク質は設計が容易であり、ｐＨ感受性（Nagarkar et al., 2020, Peptide Science, 112(5), e24180）または生物活性タンパク質スイッチ（Langan et al., 2019, Nature, 572(7768), pp. 205-210）などの特性を設計することから利益を得ることができる。
[実施例５]
ＣｕｔＡ１タンパク質は、キャッチャータンパク質との組換え融合後も三量体構造を保持する。
ＰｈＣｕｔＡ１は、高度に熱安定性のタンパク質であり、変性ＳＤＳローディング緩衝液中で煮沸した後でも三量体構造を保持する。図１４に示されているように、ＳｐＣおよびＳｎＣとの組換え融合後でも、ＰｈＣｕｔＡ１の安定三量体化を示すタンパク質バンドが１３０～２５０ｋＤａに観察され、複合体全体が、本発明者らの構造ベース設計に従ってアセンブリしていることが確認された。この観察されたバンドが正しいＰｈＣｕｔＡ１アセンブリによるものであったことをさらに検証するために、本発明者らは、過酷な変性条件を使用し、そうした条件下ではＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣが部分的に単量体化したことを観察した。
[実施例６]
モジュール式成分を使用することにより、リガンドタンパク質および他のエフェクターを、選択したスキャフォールドタンパク質と迅速にアセンブリして、複雑な幾何学的形状を付与することができる。
モジュール式成分アセンブリの実現可能性を示すために、ＳｐｙＴａｇ付き、ＳｎｏｏｐＴａｇ付き、およびＤｏｇＴａｇ付きリガンドを設計し、発現させた。Ｓｐｙ／Ｓｎｏｏｐタグ付きタンパク質成分ＳｎＴ－Ｌ１およびＬ２－ＳｐＴは、一般的細胞抗原に対するリガンドである。Ｎｉ－ＮＴＡ精製は、両リガンドタンパク質のクリーンアップをもたらし（図１５ａ～ｂ）、続いて任意選択でサイズ排除クロマトグラフィーを行った（図１５ｃ～ｄ）。こうした成分を使用して、タグ付きリガンドと、キャッチャータンパク質を含むモジュール式プラットフォームとのコンジュゲートにより、リガンドが付着した完全にアセンブリされたプラットフォームが得られることを確認した。
ＳｎＴ－Ｌ１および／またはＬ２－ＳｐＴをＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣまたは対照タンパク質ＳｐＣ－ＰＣ－ＳｎＣと共にインキュベートした後、本発明者らは、すべての試料についてコンジュゲーションを完了させることができたことを観察した（図１６ａ～ｃ）。注目すべきことに、ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣの超熱安定性三量体化は、ＳｎＴ－Ｌ１およびＬ２－ＳｐＴの両方による装飾時でさえ保持された。Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ（三量体としては１１７ｋＤａ）およびＨ６－ＳｐＣ－ＰＣ－ＳｎＣ（３１ｋＤａ）と、ＳｎＴ－Ｌ１とのおよびＬ２－ＳｐＴとのコンジュゲーションは、追加された分子量（１単量体ＳｎＴ－Ｌ１当たり１６．１ｋＤａ、１単量体Ｌ２－ＳｐＴ当たり９．７ｋＤａ）に対応するバンドシフトをもたらした。両リガンドをいずれかのプラットフォームに同時コンジュゲートすると、著しいバンドシフトがもたらされた（１単量体当たり２５．８ｋＤａと予想される）（図１５ｃ～ｄ）。さらに、リガンドの消費が、リガンド強度の低減として観察された（過剰量のプラットフォームを添加した）。
[実施例７]
モジュール式アセンブリと簡便なアセンブリ後クリーンアップを統合することにより、下流分析用の均一な薬物候補の製造が可能になる。
アセンブリ薬物候補を自動化に適した様式で精製するための簡便で効果的な方法を検証するために、本発明者らは、薬物候補精製のための再利用可能な９６ウェルおよび１２ウェルハイスループット透析デバイスの適合性を調査した。本発明者らは、ＳｎＴ－Ｌ１およびＬ２－ＳｐＴを有するＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣのモジュール式アセンブリを、定期的に緩衝液交換をした１６時間のハイスループット透析により精製することができることを実証した。そのために、タンパク質成分比１：１：１でアセンブリを実施し、試料を２５℃で１６時間インキュベートした。透析は、１００ｋＤａ ＭＷＣＯセルロース膜を有する１２ウェルハイスループット透析ブロックを使用して室温で実施した。透析中のタンパク質分解を回避するために、試料および透析液は両方とも１×ＰＭＳＦを含んでいた。アセンブリプラットフォームおよび透析液の試料を、透析中、２時間、４時間、８時間、および１６時間の時点で取り出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析して、過剰リガンドおよび低分子不純物が経時的に除去されたことを実証した（図１７）。
これは、大きな分子量のアセンブリが溶液中に存在し、安定していることを実証する。その特性は、簡便な精製プロトコルを可能にする。さらに、この方法論は、大規模化可能であり、次いで下流のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析に使用することができる最終的タンパク質アセンブリワークフローと自動化適合性である。
[実施例８]
モジュール式成分設計は、迅速なプロトタイプ化を可能にし、初期スクリーニングに最適化されたアセンブリプラットフォームから、より下流の療法検証に最適化されたアセンブリプラットフォームへの段階的な移行を可能にする。
ＰｈＣｕｔＡ１を用いて、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングに使用するための細菌スキャフォールドタンパク質の設計、産生、アセンブリ、および精製を実証した（図１１、図１２）。潜在的な薬物有用性などのために、プラットフォーム成分を迅速に変更する能力をさらに実証するために、本発明者らは、ＣｕｔＡ１タンパク質のヒトホモログであるＨｓＣｕｔＡ１（図１１）およびヒトマクロファージ遊走阻害因子２（ＭＩＦ２）の突然変異体であるＭＩＦ２ｍ（図１１）に基づくスキャフォールドを特定、クローニング、発現、および精製した。ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣ（配列番号２４）プラットフォームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検証および下流の療法検証のためのヒトバリアントであるＨｓＣｕｔＡ１（配列番号２９、オリゴマーコアを越えて一部の天然アミノ酸をリンカーとして保持するように短縮されている）に融合されたタグ付きリガンドとのシームレスなモジュール式コンジュゲーションのためにＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３（配列番号８）およびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（配列番号２３）を有することを特徴とする。ＳｐＣ３－ＭＩＦ２ｍ－ＤｇＣ（配列番号２８）は、ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ（ＧＳＧＳ）およびＳｐ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣ（ＧＧＧＧＳ）と比較して、同様のＣ３幾何学的形状およびより長いリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を有する異なるスキャフォールドを有することを特徴とする。ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣおよびＳｐＣ３－ＭＩＦ２－ＤｇＣを調製するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をタンパク質発現に使用し、続いてＮｉ－ＮＴＡ重力流カラム精製を行った（図１８ａ）。ＰｈＣｕｔＡ１と同様に、ＨｓＣｕｔＡ１およびＭＩＦ２ｍに由来するプラットフォームは、リガンドアセンブリに利用可能になるように調製することが容易だった。
ＨｓＣｕｔＡ１は、ＰｈＣｕｔＡ１とほぼ同一の立体構造を有する安定タンパク質であるが（図１１）、ＳＤＳローディング緩衝液中での煮沸中に単量体へと容易に変性する（図１８）。架橋剤グルタルアルデヒドと共にインキュベートした際に、本発明者らは、見かけの分子量がおよそ３倍増加した、ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣの単量体サブユニットの共有結合架橋を観察した。これにより、このタンパク質が溶液中で三量体であり（図１８ｃ）、タンパク質構造の予測通りに正しくアセンブリすることが確認された。また、他のリガンドを、ＳｐＣ３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣにコンジュゲートし、次いで、未コンジュゲートスキャフォールドのみ、コンジュゲートスキャフォールド＋１つのリガンド、およびコンジュゲートスキャフォールド＋２つのリガンドの異なる試料をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、アセンブリとしての流体力学半径が増加すること、複合体のサイズが増加すること、および過剰リガンドが除去されることを示した。
[実施例９]
「シス配向性」を生み出すプラットフォーム設計の能力は、計算的に探索することができる。
Ｎ末端融合部位およびＣ末端融合部位が好適に配置されたコア成分の事前選択にも関わらず、エフェクターまたはリガンドタンパク質の導入、ならびに様々な長さおよび可撓性のリンカーを介したそのようなドメインの接続は、融合タンパク質幾何学的形状に影響を及ぼす可能性がある。本発明者らは、多価タンパク質アセンブリ用に最適化されたＡｌｐｈａｆｏｌｄ ｖ２．０の実装を使用して、異なるコアタンパク質にコンジュゲートされた様々なキャッチャー成分の配向性を予測した。ここでは、ＰｈＣｕｔＡ１、ＨｓＣｕｔＡ１、Ｃｏｌ Ｘ ＮＣ１、ＴＮＦ、およびＴＬ１Ａが、安定三量体としてキャッチャー成分をシス配向性で提示すると想定されることが予測された（図１９）。ＰｈＣｕｔＡ１の場合、これは、ＰｈＣｕｔＡ１単独の結晶構造（図１１）および種々の実験（図１２、図１４）と合致する。比較のために、本発明者らは、「トランス配向性」設計で以前に使用されたコアタンパク質、即ちＩＭＸ３１３（Brune et al., 2017, Bioconjugate Chemistry, 28(5), pp.1544-1551）およびＸＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメイン（Lobo et al., 2006, International Journal of Cancer, 119(2), pp.455-462）も試験した。ここでは、ＧＳＧＳリンカーを特徴とするＳｐＣ３－ＩＭＸ－ＤｇＣ（配列番号３５）は、インタクトなコア構造を生成することができなかった。このような提示は、ＳｐｙＴａｇ付き／ＤｏｇＴａｇ付きタンパク質とのコンジュゲーション時に立体衝突を引き起こす可能性がある。注目すべきことに、Ｂｒｕｎｅらは、ＩＭＸとＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒとの間に長くて剛性のリンカーを導入して、直交性のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質を隔てた。ＩＭＸと同様に、ＧＳＧＳリンカーを特徴とするＳｐＣ３－ＸＶ型コラーゲンＮＣ１－ＤｇＣ（配列番号３３）は、インタクトなコア構造を生成することができなかった。ＧＳＧＳリンカー（配列番号３３のような）をより長い（Ｇ４Ｓ）２リンカーに置き換えると、ＳｐＣ３－ＸＶ型コラーゲンＮＣ１－ＤｇＣではキャッチャーがねじれ形配座にあることが観察された。
[実施例１０]
アセンブリプラットフォームをｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングに使用して、リガンドの有効性を解明することができる。
本発明者らは、細胞増殖に関与する２つの異なる標的に対するリガンドと完全にコンジュゲートしたＰｈＣｕｔＡ１が、増殖因子誘導性細胞増殖を阻害することができるか否かを試験した（図２０ａ）。ＮＣＩ－Ｎ８７細胞を、２つのリガンド（Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴ）または１つのリガンドのみ（Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１、Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：Ｌ２－ＳｐＴ）を含む表記濃度のタンパク質アセンブリで処理するかまたは偽処理した。スキャフォールドのみ（Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ）、リガンドのみ（ＳｎＴ－Ｌ１、Ｌ２－ＳｐＴ、ＳｎＴ－Ｌ１＋Ｌ２－ＳｐＴ）、およびＬ１またはＬ２の受容体標的に対するモノクローナル対照抗体を対照として使用した。処理開始の１時間後、関連増殖因子を添加することにより細胞を刺激した。７日後にＭＴＴアッセイを使用して細胞生存率を測定した。生存画分を偽処理対照細胞に対して正規化した。スキャフォールドまたはリガンドのみによる処理は、細胞生存率に著しい影響を及ぼさないが、リガンド成分を１つのみ有するコンジュゲートアセンブリによる処理は、細胞生存率の中程度の低減をもたらす（いずれかのタンパク質コンジュゲート１０ｎＭで約６０％の細胞生存率）。完全にアセンブリされたアセンブリによる処理は、細胞数の著しい減少をもたらし、１０ｎＭの完全アセンブリの存在下で増殖させた後で存在する生存細胞はわずか３５％だった。これは、同じ濃度（１０ｎＭ）のモノクローナル対照抗体の組合せで処理した後に本発明者らが観察した生存率と非常に類似していた。これは、構築物が、同じ細胞上にある標的を両方とも阻止していることを示唆する。これをさらに確認するために、同じ処理試料のＨ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１、Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：Ｌ２－ＳｐＴからなる対照を、将来のアッセイに添加することができる。
本発明者らは、完全にコンジュゲートされたアセンブリが、ＡｋｔおよびＥｒｋ１／２の下流活性化を抑制するか否かをさらに調査した（図２０ｂ）。ＮＣＩ－Ｎ８７細胞を、０．２％ＦＣＳを含む培地中で２４時間飢餓状態にした後、スキャフォールドのみ、またはタンパク質ＳｎＴ－Ｌ１およびＬ２－ＳｐＴのコンジュゲートアセンブリで１時間処理し、次いで増殖因子で１時間刺激してから全細胞抽出物を調製した。２つの使用したリガンドがそれらの受容体に結合すると、２つの下流シグナル伝達経路の活性化、ならびにそれらの主要エフェクターであるＡｋｔおよびＥｒｋ１／２のリン酸化がもたらされる。こうした２つのタンパク質のリン酸化レベルをウェスタンブロッティングで分析した。Ｅｒｋ１は、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞では、増殖因子刺激の非存在下でさえ構成的にリン酸化される。しかしながら、完全にコンジュゲートされたアセンブリ（Ｈ６－ＳｐＣ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎＣ：ＳｎＴ－Ｌ１：Ｌ２－ＳｐＴ）は、Ｅｒｋリン酸化を著しく抑制する。増殖因子誘導性Ａｋｔ活性化は、この濃度では未結合Ｌ２により妨げられる。重要なことには、リン酸化レベルは、完全アセンブリの存在下ではさらに減少する。
薬物開発の標的が確認されれば、臨床試験で検証される薬物ついて、リガンドとマルチドメインポリペプチドとしてのコアタンパク質との直接融合体を、タグおよびキャッチャー成分を使用せずに達成することができる（図２１）。
また、本発明者らは、別のリガンド対（ＳｐＴ－Ｌ１、Ｌ３－ＤｇＴ）にコンジュゲートされた異なるスキャフォールドＳｐＣ－ＨｓＣｕｔＡ１－ＳｎＣが、２日以内にアポトーシスを引き起こすか否かを調査した。（図２０ｃ）。ＮＣＩ－Ｎ８７細胞を、０．２％ＦＣＳを含む培地中で２４時間飢餓状態にした後、スキャフォールドのみ、リガンドのみ、またはタンパク質ＳｐＴ－Ｌ１およびＬ３－ＤｇＴのコンジュゲートアセンブリで飢餓培地にて４８時間処理した。細胞生存率をＭＴＴアッセイにより測定し、生存画分を、偽処理した対照細胞に対して正規化した。スキャフォールドまたはいずれかのリガンドのみによる処理は、細胞生存率の低減をもたらさなかった。細胞生存率の最も高い減少は、完全にアセンブリされたスキャフォールドＳｐＣ－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｇＣ：ＳｐＴ－Ｌ１：Ｌ３－ＤｇＴによる処理後に観察された。
略式配列表の簡単な説明
配列番号１は、パイロコッカス・ホリコシイ由来のＣｕｔＡ１タンパク質（ＰｈＣｕｔＡ１）の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、Ｘ型コラーゲンＮＣ１タンパク質ドメインの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ＶＩＩＩ型コラーゲンタンパク質の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、「ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ」のアミノ酸配列を示す。これは、本明細書では「ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ ００１」とも呼ばれる。
配列番号５は、「ＳｐｙＴａｇ」のアミノ酸配列を示す。これは、本明細書では「ＳｐｙＴａｇ ００１」とも呼ばれる。
配列番号６は、「ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ ００２」のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、「ＳｐｙＴａｇ ００２」のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、「ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ ００３」のアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、「ＳｐｙＴａｇ ００３」のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、「ＳｐｙＬｉｇａｓｅ」のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、「Ｋ－Ｔａｇ」のアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、「ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ」のアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、「ＳｎｏｏｐＴａｇ」のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、「ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ」のアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、「ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ」のアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、「ＤｏｇＴａｇ」のアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、Ｐｉｌｉｎ－Ｃのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、「Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ」のアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、ヒトＣｕｔＡ１タンパク質の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、ｈｉｓタグ付き構築物Ｈ６－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＮＣ１－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、ｈｉｓタグ付き構築物Ｈ６－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＰｈＣｕｔＡ１－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、Ｈ６－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－αＨ＿Ｌｉｎｋｅｒ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ構築物のアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、「ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ」のアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、配列番号２９と同様に短縮されたＨｓＣｕｔＡ１を有するＨｉｓタグ付き構築物Ｈ６－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、ヒトマクロファージ遊走阻害因子２（ＭＩＦ２）の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、ＭＩＦの突然変異Ｓ６２ＡおよびＦ９９Ａを有するヒトマクロファージ遊走阻害因子２（ＭＩＦ２）（ＭＩＦ２ｍ）の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、ＭＩＦ２の突然変異Ｓ６２ＡおよびＦ９９Ａ（ＭＩＦ２ｍ）を有するＨｉｓタグ付き構築物Ｈ６－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３－ＭＩＦ２ｍ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、ＰＤＢ ＩＤ：２ｚｆｈの解像構造に基づき短縮された、配列番号１９と配列番号６０との間の中間短縮を表すヒトＣｕｔＡ１の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、ｍＣｉｔｒｉｎｅ蛍光タンパク質ＤｇＴ－Ｘ３のバリアント（Grunberg et al, 2013に初めて記載）に対するＤｏｇＴａｇのＨｉｓタグ付き融合体のアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、ＴＮＦ様タンパク質ＴＬ１Ａの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、構造予測に使用される構築物ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３－ＴＬ１Ａ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、構造予測に使用される構築物ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３－Ｃｏｌ ＸＶ ＮＣ１－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、ＭＩＦ２の突然変異Ｓ６２ＡおよびＦ９９Ａを有する構造予測に使用される構築物ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３－ＭＩＦ２ｍ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、構造予測に使用される構築物ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３－ＩＭＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、ヘテロ三量体Ｃ１ｑ頭部ドメインの鎖Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、ヘテロ三量体Ｃ１ｑ頭部ドメインの鎖Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、ヘテロ三量体Ｃ１ｑ頭部ドメインの鎖Ｃのアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は、高度好熱菌ＨＢ８由来のＣｕｔＡ１の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号４０は、イネ由来のＣｕｔＡ１の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号４１は、シュワネラ種ＳＩＢ１由来のＣｕｔＡ１の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号４２は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号４３は、逆平行コイルドコイル六量体の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号４４は、ＨＩＶ－１ ＧＰ４１コアの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号４５は、シトクロムｃ５５５の円順列変異体の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号４６は、ＭＨＣクラスＩＩ関連インバリアント鎖の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号４７は、ｐ５３の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号４８は、フィブリノーゲン様ドメインの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号４９は、ＩＶ型コラーゲンＮＣ１ドメインの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号５０は、枯草菌ＡｂｒＢの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号５１は、ファージラムダ頭部タンパク質Ｄの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号５２は、ＨＣＲＢＰＩＩのドメインスワップ三量体バリアントの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号５３は、Ｔ１Ｌレトロウイルス付着タンパク質シグナルの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号５４は、構造予測に使用される構築物ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３－ＨｓＣｕｔＡ１－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号５５は、構造予測に使用される構築物ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３－ＰｈＣｕｔＡ１－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号５６は、構造予測に使用される構築物ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３－Ｃｏｌ Ｘ ＮＣ１－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号５７は、構造予測に使用される構築物ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３－ＴＮＦ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号５８は、ＴＮＦファミリータンパク質ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号５９は、ヒトロイコトリエンＣ４シンターゼの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号６０は、配列番号１９の短縮を表すＰＤＢ ＩＤ：２ｚｆｈに解像されているヒトＣｕｔＡ１の単量体のアミノ酸配列を示す。
Figure 2024511155000006
Figure 2024511155000007
Figure 2024511155000008
Figure 2024511155000009
Figure 2024511155000010
１ 多価タンパク質スキャフォールド
２ サブユニット単量体
１０ オリゴマーコア
１１ 第１の結合部位
１２ 第２の結合部位
２０ 回転対称軸
２１ 平面
３０ 表面

Claims (33)

  1. － 複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコア、
    － 少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である少なくとも１つの第１の結合部位
    を含む多価タンパク質スキャフォールドであって、
    前記第１の結合部位および前記第２の結合部位は、前記スキャフォールドと同じ面に位置し、
    前記第１の結合部位は、第１のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第１のタンパク質ドメインを含み、前記第２の結合部位は、第２のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第２のタンパク質ドメインを含む、多価タンパク質スキャフォールド。
  2. 前記オリゴマーコアの各単量体が、少なくとも１つの第１の結合部位および少なくとも１つの第２の結合部位を含み、前記少なくとも１つの第１の結合部位は、前記少なくとも１つの第２の結合部位に対して直交性である、請求項１に記載のタンパク質スキャフォールド。
  3. 各単量体が、前記単量体の第１の末端に付着した第１の結合部位、および前記単量体の第２の末端に付着した第２の結合部位を含む、請求項１または２に記載のタンパク質スキャフォールド。
  4. 各単量体の前記第１の末端および前記第２の末端が、前記単量体の同じ面に、および／または前記単量体のオリゴマーの同じ面に位置する、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質スキャフォールド。
  5. 前記第１の結合部位が、第１のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第１のタンパク質ドメインを含み、前記第２の結合部位が、第２のポリペプチド標的と共有結合を形成することが可能な第２のタンパク質ドメインを含み、
    前記第１のタンパク質ドメインが、前記第１のポリペプチド標的とイソペプチド結合を形成することが可能であり、前記第２のタンパク質ドメインが、前記第２の結合標的とイソペプチド結合を形成することが可能である、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質スキャフォールド。
  6. 前記第１の結合部位および前記第２の結合部位が各々、異なるスプリットリガンド結合タンパク質ドメインを含み、
    好ましくは、前記第１の結合部位および前記第２の結合部位の一方が、スプリットストレプトコッカス・ピオゲネスフィブロネクチン結合タンパク質ドメインを含み、前記第１の結合部位および前記第２の結合部位の他方が、スプリットストレプトコッカス・ニューモニエアドヘシンドメインを含む、請求項５に記載のタンパク質スキャフォールド。
  7. 前記第１および前記第２の結合部位が、各々独立して、配列番号４～９、１１～１３、２３，または１５～１８のいずれか１つと、少なくとも５０％アミノ酸同一性を有する、請求項６に記載のタンパク質スキャフォールド。
  8. 前記オリゴマーコアが、少なくとも３つのサブユニット単量体を含み、
    好ましくは、前記オリゴマーコアが、３～６つのサブユニット単量体を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質スキャフォールド。
  9. 前記サブユニット単量体が、非共有結合で一緒に付着している、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質スキャフォールド。
  10. 前記サブユニット単量体が、共有結合で一緒に付着しており、
    好ましくは、前記サブユニット単量体が、組換え融合タンパク質を形成する、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質スキャフォールド。
  11. 前記オリゴマーコアが、ホモオリゴマーコアである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のタンパク質スキャフォールド。
  12. 前記オリゴマーコアが、ヘテロオリゴマーコアである、請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質スキャフォールド。
  13. ｉ）各サブユニット単量体が、３００個未満のアミノ酸を含み、
    好ましくは、各サブユニット単量体が、２００個未満のアミノ酸を含み、
    より好ましくは、各サブユニット単量体が、１５０個未満のアミノ酸を含み、および／または
    ｉｉ）前記オリゴマーコアが、約１５０ｋＤａ未満、好ましくは約１００ｋＤａ未満、より好ましくは約７０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載のタンパク質スキャフォールド。
  14. 前記オリゴマーコアが、（ｉ）抗体のＦｃ領域を含まないか、または（ｉｉ）ＣＨ２ドメインを含まないか、または（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメインを含まないか、または（ｉｖ）ＣＨ２ドメインもＣＨ３ドメインも含まない、請求項１～１３のいずれか一項に記載のタンパク質スキャフォールド。
  15. 前記オリゴマーコアが、多量体タンパク質の可溶性多量体化構造要素を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質スキャフォールド。
  16. 前記多量体タンパク質が、ＶＩＩＩ型コラーゲンＮＣ１（非コラーゲン性）ドメイン、Ｘ型コラーゲンＮＣ１（非コラーゲン性）ドメイン、Ｃ１ｑ頭部ドメイン、ＣｕｔＡ１タンパク質、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦまたはＭＩＦ２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、またはそれらのホモログもしくはパラログを含む、請求項１５に記載のタンパク質スキャフォールド。
  17. 前記多量体化構造要素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１９、配列番号２９、配列番号６０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号４２、配列番号３１、または配列番号５８と、少なくとも３０％または少なくとも５０％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１５または１６に記載のタンパク質スキャフォールド。
  18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のタンパク質スキャフォールドを含むタンパク質複合体であって、前記第１の結合部位は、第１のエフェクター部分に付着した第１のポリペプチド標的に結合しており、前記第２の結合部位は、第２のエフェクター部分に付着した第２のポリペプチド標的に結合している、タンパク質複合体。
  19. 前記第１の結合部位／ポリペプチド標的対および前記第２の結合部位／ポリペプチド標的対が、各々独立して、（ｉ）配列番号４、６、もしくは８のいずれか１つと配列番号５、７、もしくは９のいずれか１つとの組合せ；（ｉｉ）配列番号１２と配列番号１３もしくは１５との組合せ；（ｉｉｉ）配列番号５と配列番号１１との組合せ；（ｉｖ）配列番号１５と配列番号１６との組合せ；（ｖ）配列番号１７と配列番号１８との組合せ；または（ｖｉ）配列番号２３と配列番号１６との組合せから選択される、請求項１８に記載のタンパク質複合体。
  20. ライブラリーを含むスクリーニングプラットフォームであって、前記ライブラリーは、
    請求項１８または１９に記載のタンパク質複合体の複数の集団であって、前記タンパク質複合体の集団が各々、第１のエフェクター部分、第２のエフェクター部分、および／もしくはオリゴマーコアの異なる組合せを含む、集団、または
    請求項１～１７のいずれか一項に記載の複数のタンパク質スキャフォールド、前記第１の結合部位に特異的に結合することができる複数の第１のエフェクター部分、および前記第２の結合部位に特異的に結合することができる複数の第２のエフェクター部分
    を含む、スクリーニングプラットフォーム。
  21. 治療用薬物または薬物アナログを特定するための方法であって、
    請求項１８または１９に記載のタンパク質複合体を用意すること、
    前記タンパク質複合体を生物系と接触させること、および
    前記タンパク質複合体が、前記生物系の特性機能に所望の変化を誘導するか否かを測定すること、
    を含み、
    任意選択で、前記生物系の特性に所望の変化を誘導するタンパク質複合体を選択することをさらに含む、
    方法。
  22. － 前記タンパク質複合体の前記第１および第２のエフェクター部分に付着した前記特定された治療用薬物または薬物アナログの前記タンパク質複合体の前記スキャフォールドの前記オリゴマーコアを含む治療用薬物または薬物候補を合成すること
    をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 請求項２１または２２に記載の方法に従って得ることが可能であるかまたは得られる治療用薬物または薬物候補。
  24. 治療用薬物または薬物候補であって、
    （ａ）１つまたは複数の第１のエフェクター部分および１つまたは複数の第２のエフェクター部分に付着した複数のサブユニット単量体を含むオリゴマーコアであって、前記１つまたは複数の第１のエフェクター部分および前記１つまたは複数の第２のエフェクター部分は、前記オリゴマーコアの同じ面に位置し、
    （ｉ）前記１つまたは複数の第１のエフェクター部分は、２つまたはそれよりも多くの第１のエフェクター部分を含み、前記１つまたは複数の第２のエフェクター部分は、２つまたはそれよりも多くの第２のエフェクター部分を含み、および／または（ｉｉ）前記オリゴマーコアは、抗体も抗体断片も含まない、オリゴマーコア、または
    （ｂ）１つまたは複数の第１のエフェクター部分および１つまたは複数の第２のエフェクター部分に付着した単量体ポリペプチドであって、前記１つまたは複数の第１のエフェクター部分および前記１つまたは複数の第２のエフェクター部分は、前記単量体ポリペプチドの同じ面に位置し、
    （ｉ）前記１つまたは複数の第１のエフェクター部分は、２つまたはそれよりも多くの第１のエフェクター部分を含み、前記１つまたは複数の第２のエフェクター部分は、２つまたはそれよりも多くの第２のエフェクター部分を含み、および／または（ｉｉ）前記オリゴマーコアは、抗体も抗体断片も含まない、単量体ポリペプチド
    を含む、治療用薬物または薬物候補。
  25. 前記オリゴマーコアが、請求項１～１７のいずれか一項に規定される、請求項２４（ａ）に記載の治療用薬物または薬物候補。
  26. （ａ）各サブユニット単量体が、ＶＩＩＩ型コラーゲンＮＣ１（非コラーゲン性）ドメイン、Ｘ型コラーゲンＮＣ１（非コラーゲン性）ドメイン、Ｃ１ｑ頭部ドメイン、ＣｕｔＡ１タンパク質、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ、ＭＩＦ－２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、またはそれらのホモログもしくはパラログを含み；および／あるいは（ｉｉ）各サブユニット単量体が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１９、または配列番号２９、配列番号６０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号４２、配列番号３１、または配列番号５８と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む多量体化構造要素を含むか、あるいは
    （ｂ）前記単量体ポリペプチドが、ＶＩＩＩ型コラーゲンＮＣ１（非コラーゲン性）ドメイン、Ｘ型コラーゲンＮＣ１（非コラーゲン性）ドメイン、Ｃ１ｑ頭部ドメイン、ＣｕｔＡ１タンパク質、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦまたはＭＩＦ－２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、またはそれらのホモログもしくはパラログを含む、
    請求項２４または２５に記載の治療用薬物または薬物候補。
  27. Ｎ末端に第１の結合ドメインおよびＣ末端に第２の結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記第１および前記第２の結合ドメインは、構造ドメインにより隔てられており、前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインは、単一細胞上に発現されているか、またはプレートもしくは単一ビーズに固定化されている場合、それらの標的に結合することができる、ポリペプチド。
  28. 前記構造ドメインが、ＣｕｔＡ１、ＭＩＦもしくはＭＩＦ－２、ＴＮＦもしくはＴＮＦ様タンパク質ＴＬ１ＡもしくはＣＤ４０Ｌ、またはＶＩＩＩ型コラーゲンもしくはＸ型コラーゲン由来のＮＣ１である、請求項２７に記載のポリペプチド。
  29. 前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが、異なる抗原結合ドメインであり、任意選択で、一方または両方の抗原結合ドメインが、抗体の抗原結合性断片であり、任意選択でｓｃＦｖもしくはＦａｂであるか、または単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、または特定の標的に結合するように選択された他の抗体模倣物もしくはスキャフォールド、または生物学的分子と特異的に結合することが可能な他のタンパク質もしくはペプチドである、請求項２７または２８に記載のポリペプチド。
  30. 前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが、各々が同族ペプチドとイソペプチド連結を形成することができるキャッチャードメインであり、任意選択で、前記第１の結合ドメインに対する同族ペプチドが、前記第２の結合ドメインに対する同族ペプチドとは異なる、請求項２７または２８に記載のポリペプチド。
  31. 各同族ペプチドが抗原結合ドメインに付着しており、任意選択で、一方または両方の同族ペプチドが、イソペプチド結合により第１および／または第２のキャッチャードメインに連結されている、請求項３０に記載のポリペプチド。
  32. 請求項２７～３１のいずれかに記載の２つまたはそれよりも多くのポリペプチドを含むオリゴマー。
  33. 請求項１～２６のいずれかに記載の特徴を含む、請求項２７～３１のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項３２に記載のオリゴマー。
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