CN107849147B - 基于二泛素突变蛋白的Her2结合蛋白 - Google Patents

基于二泛素突变蛋白的Her2结合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于二泛素突变蛋白的新型Her2结合分子。本发明进一步涉及可选地融合至或结合至调节药代动力学的部分或者融合至或结合至治疗或诊断活性组分的Her2结合蛋白。本发明还涉及这些Her2结合蛋白在医药中的用途，优选地用于诊断或治疗癌症。

Description

基于二泛素突变蛋白的Her2结合蛋白
技术领域
本发明涉及基于二泛素突变蛋白(di-ubiquitin mutein)的新Her2结合分子。本发明还涉及Her2结合蛋白，其可选地融合(fuse)至或结合(conjugate)至调节药代动力学的部分或者融合至或结合至治疗或诊断活性组分。本发明还涉及这些Her2结合蛋白在医药中的用途，优选用于诊断或治疗癌症。
背景技术
膜结合受体酪氨酸激酶Her2的表达增加在许多乳腺癌的发展和进展中起重要作用，而且在卵巢癌、胃癌和子宫癌中尤其是侵袭性癌症中也起重要作用。针对恶性肿瘤(主要是上皮起源的恶性肿瘤)报道了这种致癌基因的过表达，并且与癌症复发和预后不良有关。三结构域蛋白(细胞外、跨膜、细胞内酪氨酸激酶结构域)介导细胞增殖和抑制细胞凋亡。当配体结合到Her2的细胞外结构域时，Her2与受体形成二聚体，从而Her2的细胞内结构域被激活，这介导细胞过程如增殖、分化、迁移或凋亡。因此，调节Her2的功能是癌症治疗发展的重要手段，特别是基于结合至Her2细胞外结构域的单克隆抗体的那些。治疗性抗Her2单克隆抗体如曲妥珠单抗(Trastuzumab)或帕妥珠单抗(Pertuzumab)可用于治疗癌症，特别是乳腺癌。
本发明的技术问题
然而，单克隆抗体具有诸如分子结构复杂、大尺寸和具挑战性的生产方法等主要缺点。另外，使用目前可用的Her2结合分子治疗疾病并非在所有患者中有效，并且可能具有严重的副作用。
不用说，对于使用改进的新型药剂来有效治疗癌症，特别是有效的肿瘤靶向治疗和诊断存在强烈的医学需要。目前仍然需要寻找现有疗法和诊断的替代方法，即用较小和较不复杂的Her2特异性分子(例如基于非免疫球蛋白的Her2结合剂)代替Her2单克隆抗体。
为了克服抗体的缺点，适用于诊断和治疗应用的新型Her2结合分子应包括诸如对Her2的亲和力、对Her2的特异性以及高稳定性等特性。
因此，本发明的目的是提供新的Her2结合非免疫球蛋白分子，用于治疗和诊断具有Her2过表达的癌症的新的和改进的策略。特别地，目的是提供对Her2具有高亲和力和特异性的新型结合蛋白，其结合了较不复杂且更小的结构，例如用于实现简化的分子工程。
本发明通过小Her2结合蛋白诸如基于非免疫球蛋白的结合剂，特别是基于泛素突变蛋白的Her2结合分子(也称为
Figure GDA0001546328990000021
分子)，提供了一种解决方案。
与抗体相比，本发明的Her2结合蛋白的显著优点是在(i)尺寸减小(例如最大152个氨基酸)、(ii)简单的分子结构(一条链相比于抗体的四条链)、和(iii)对全功能性可能的但不是必需的翻译后修饰方面降低了复杂性。本发明的结合蛋白提供的分子格式具有有利的物理化学性质(如稳定性和溶解性)、高水平表达并且允许容易的生产方法。本发明的Her2特异性Affilin分子的特征在于对Her2的高亲和力、对Her2的特异性以及高稳定性，并提供了新的治疗和诊断可能性。
上述目标和优点是通过所附独立权利要求的主题来实现的。本发明通过提供基于二泛素突变蛋白的特异性Her2结合蛋白的实例来满足上述需要，在二泛素的至少12个氨基酸位置具有取代。在从属权利要求以及以下描述、实施例和附图中包括了本发明的优选实施方案。上述概述不一定描述本发明解决的所有问题。
发明内容
在第一方面，本发明涉及Her2结合蛋白，其中所述Her2结合蛋白包含氨基酸序列，其中从二泛素(SEQ ID NO:4)的位置R42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141和T142中选择的至少12个氨基酸被取代，并且其中所述Her2结合蛋白与二泛素(SEQ ID NO:4)具有至少85％的序列一致性，并且其中所述Her2结合蛋白对Her2具有低于700nM的结合亲和力(KD)，优选所述结合亲和力是通过ELISA或通过表面等离子体共振测定法来确定的。
本发明的另一方面涉及Her2结合蛋白，其进一步包含至少一种附加分子，该附加分子优选地选自由以下各项组成的组(i)、(ii)和(iii)中的至少一个成员：(i)调节药代动力学行为的部分，选自例如聚乙二醇、人血清白蛋白(HSA)、人血清白蛋白结合蛋白、白蛋白结合肽、或免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、多糖；和(ii)治疗性活性组分，可选地选自例如单克隆抗体或其片段、细胞因子、趋化因子、细胞毒性化合物、酶、或它们的衍生物、或放射性核素；和(iii)诊断组分，可选地选自例如荧光化合物、光敏剂、标签、酶或放射性核素。
在进一步方面，本发明还提供了编码包含本发明的结合蛋白或由本发明的结合蛋白组成的Her2结合蛋白的核酸或多个核酸，以及包含所述核酸或多个核酸的载体或多个载体，和包含所述载体或多个载体的宿主细胞或多个宿主细胞。
另一方面涉及用于在诊断或药物中使用(优选用于诊断或治疗癌症)的所述Her2结合蛋白，或编码所述Her2结合蛋白的核酸分子，或包含所述Her2结合蛋白的载体，或包含所述Her2结合蛋白的宿主细胞，或包含所述Her2结合蛋白的非人类宿主。
另一方面涉及一种组合物，其包含本发明的Her2结合蛋白、本发明的核酸分子、本发明的载体、或本发明的宿主细胞，优选用于诊断或治疗癌症。
本发明的另一方面涉及一种用于生产本发明前述方面中任一项所述的Her2结合蛋白的方法，包含在适合的条件下培养宿主细胞和可选地分离所产生的Her2结合蛋白。
本发明内容部分不一定描述了本发明的全部特征。通过审阅随后的详细描述，其它实施方案将变得显而易见。
附图说明
附图显示：
图1A-图1D示出了Her2结合Affilin分子。
图1A列出了为产生Her2结合蛋白而被取代的二泛素(SEQ ID NO:4)的位置。在第一行中列出相应的氨基酸位置。所有Her2结合蛋白(例如SEQ ID NO:5-38)在从SEQ ID NO:4的位置R42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141和T142中选择的至少12个位置被取代。表中的“.”是指野生型位置(未改变的)；例如，如SEQ ID No:6、31、33、34、35、36和37中所例示的。
图1B示出了与图1A的相同氨基酸交换，然而，交换根据以下代码进行翻译，其将具有相似生物物理性质的氨基酸进行分组(group)。波浪线“
Figure GDA0001546328990000031
”是极性氨基酸(T、S、N或Q)的符号，“H”是疏水性氨基酸(例如A、M、L、V、I)的符号，“o”是芳香族氨基酸(例如F、W、Y)的符号，“+”是碱性氨基酸(例如K、R、H)的符号，“-”是酸性氨基酸(例如D、E)的符号，且“G”对应于甘氨酸。
图1C列出了进一步的取代；除了从SEQ ID NO:4的氨基酸位置R42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141和T142中选择的至少12个取代之外，所有的Her2结合蛋白具有0、1、2、3、4、5或6个其它修饰。
图1D示出了与图1C的相同氨基酸交换，但是根据代码进行翻译，所述代码将具有类似生物物理性质的氨基酸进行分组(group)(如图1B所述)。
图2.Her2结合Affilin分子(例如SEQ ID NO:5-38)的生化表征。示出的是由SPR检测法(Biacore；表的第三列)获得的结合亲和力(KD)以及温度稳定性(DSF；表的第四列)。
图3A-图3B.使用SPR(Biacore)通过无标签相互作用测定对Her2结合蛋白的分析。分析了不同浓度的Affilin蛋白(0、0.137、0.4115、1.2345、3.7037、11.11和33.33nM)与固定化在芯片(Biacore)上的Her2的结合，以分析Affilin蛋白与Her2之间的相互作用。图3A示出了Affilin-12628与Her2的结合动力学。图3B示出了Affilin-144633与Her2的结合动力学。
图4A-图4B.Her2结合蛋白的功能表征证实与细胞Her2结合。该图显示了通过FACS分析确定的与外源性Her2表达SkBr3细胞的结合。Her2结合蛋白(“Affilin”)显示以50nM结合在SkBr3细胞上(深灰色条)并且在HEK/293上无活性(参见图4A和图4B)。观察到Affilin-142655(简称“142655”)、Affilin-141965、Affilin-42465(简称“142465”)、Affilin-142502(简称“142502”)和二泛素(简称“di-ubi”)对Her2表达的SkBr3的结合较弱或无结合。
图5A-图5B.通过流式细胞术分析确定的Her2结合蛋白与外源性Her2表达SkBr3细胞的浓度依赖性功能结合。显示的是333nM到5.6pM结合蛋白的稀释系列。Affilin-141926(图5A)和Affilin-141890(图5B)在SkBr3-细胞上显示出浓度依赖性结合。
图6A-图6C.通过流式细胞术分析确定，Her2结合蛋白的功能表征证实了与外源性Her2过表达CHO-K1细胞的结合。Her2结合蛋白在50nM、5nM和0.5nM的浓度下显示出对CHO-K1-Her2细胞的结合。图6A显示了Affilin-142627、Affilin-142628、Affilin-142654和Affilin-141884的Her2-结合；图6B显示了Affilin-144631、Affilin-144632、Affilin-144633、Affilin-144634、Affilin-144635、Affilin-144636、Affilin-144637的细胞Her2结合；并且图6C显示了Affilin-144567的细胞Her2结合，和142502在500nM下仅有低水平的结合。因此，证实了除142502以外的所有结合分子(即使在测试的最低浓度下)的细胞Her2结合。二泛素未显示出对CHO-K1-Her2-细胞的结合(例如图6B所示)。
图7.Affilin-142628的浓度依赖性结合。该图显示了通过流式细胞述(FACS分析)确定的Affilin-142628与外源性Her2表达CHO-K1细胞的结合(对照：空载体CHO-K1-pEntry细胞)。显示了与二泛素139090(SEQ ID NO:4)相比，在50nM、5nM和0.5nM的不同Affilin蛋白浓度下的柱状图。Affilin-142628在Her2-过表达细胞系上诱导浓度依赖性位移。
图8.通过流式细胞术确定的，Her2结合蛋白与外源性Her2表达SkBr3-细胞的浓度依赖性功能结合。使用100nM至0.06pM稀释系列的Affilin-142628来分析与Her2过表达SkBr3细胞的相互作用。图8显示了Affilin-142628的浓度依赖性结合。
图9A-图9B示出了通过免疫荧光染色对不同Her2结合蛋白在Her2-过表达SkBr3-细胞上的结合分析。图9A示出了50nM Affilin-141884、Affilin-142628、Affilin-141926、Affilin-144637、Affilin-142418的浓度。图9B示出了50nM Affilin-144567、二泛素(139090)、PBS和曲妥珠单抗(赫赛汀)的浓度。Affilin-141884、Affilin-142628、Affilin-141926、Affilin-144637和Affilin-142418在Her2-过表达细胞系上显示出强的结合，而Affilin-144567和二泛素(139090)不结合SkBr-3细胞上的Her2。
图10确认，Her2结合蛋白结合SKOV-3异种移植肿瘤组织。显示了来源于人类卵巢腺癌细胞的Her2-表达肿瘤组织上的50nM Affilin-141884和50nM Affilin-142628的免疫组织学染色。Affilin-141884和Affilin-142628显示出对Her2表达组织的强结合。二泛素(139090)未显示出对SKOV-3组织切片的结合。
图11示出了Her2结合蛋白对Her2-表达SKOV-3-肿瘤组织切片和不具有Her2表达的肺组织切片的免疫组织结合分析。Affilin-141884和Affilin-142628在20nM下在SKOV-3组织上显示强结合。没有观察到与肺组织的结合。此外，没有观察到Affilin-141884和Affilin-142628与从肝脏、心肌和卵巢获得的组织的结合。
图12显示，Affilin-142628和Affilin-143692结合不同的Her2表位(竞争分析；结合分析SPR)。这些Her2结合蛋白不竞争Her2结合，因此使用Her2的不同或不重叠的表位。
图13显示，Her2结合蛋白Affilin-142628和Affilin-143692结合与曲妥珠单抗(Herceptin，赫赛汀)不同的Her2表位。
图14示出了双特异性融合蛋白同时结合Her2和EGFR。Her2结合蛋白与EGFR特异性单克隆抗体(西妥昔单抗)的融合能够双特异性靶向，例如融合蛋白SEQ ID NO:44-47所示的。
图15A-图15B示出了包含融合到西妥昔单抗轻链C-末端的Her2特异性Affilin的双特异性融合蛋白(CL-141926；SEQ ID NO:44)在Her2过表达CHO K1细胞上(图15A)和在EGFR过表达CHO K1细胞上(图15B)的流式细胞仪结合分析。融合蛋白显示出与两种细胞外靶标结合。该图显示了中值荧光强度(MFI)，表示Affilin-抗体融合蛋白在指定浓度下与EGFR以及与Her2表达细胞结合。
具体实施方式
在下面更详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限定。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
优选地，本文使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)”,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和
Figure GDA0001546328990000061
H.编(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,瑞士，中描述的定义。
在整个本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”和诸如“包含有(comprises)”和“包含了(comprising)”的变型将被理解为暗示包括所叙述的整数或步骤或者整数组或步骤组，但不排除任何其它整数或步骤或者整数组或步骤组。在整个本说明书的文本中引用了多篇文献(例如：专利，专利申请，科学出版物，制造商的规格，使用说明，GenBank登录号序列提交等)。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明没有资格先于由于先前发明所致的此种公开。本文引用的一些文献的特征是“通过引用并入”。倘若此种并入的参考文献的定义或教导与本说明书中叙述的定义或教导之间发生冲突，则本说明书的文本优先。
在所附的序列表中公开了本文中提及的所有序列，其全部内容和公开内容是本说明书的一部分。
申请中使用的重要术语的一般定义
术语“蛋白质”和“多肽”是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的任何链而不是指产物的具体长度。因此，“多肽”的定义包括“肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的链的任何其它术语，并且可以使用术语“多肽”来代替或与这些术语中的任何一个互换使用。术语“多肽”也意指多肽的翻译后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、蛋白水解切割、通过非天然存在的氨基酸的修饰和本领域公知的类似修饰。因此，包含两个或更多个蛋白质部分的结合蛋白也归入术语“蛋白质”或“多肽”的定义。
术语“泛素”或“未修饰的泛素”是指根据SEQ ID NO:1所述的泛素，以及是指与根据SED ID NO:4所述的二泛素具有至少95％一致性的蛋白，诸如SEQ ID NO:2(在不影响与靶结合的位置45、75、76处的点突变)，以及是指具有至少95％一致性的蛋白质，诸如根据SEQ ID NO:48所述的二泛素，并且根据以下定义。特别优选的是来自哺乳动物(例如人类、灵长类动物、猪和啮齿动物)的泛素分子。另一方面，泛素来源是不相关的，因为根据本领域，所有的真核泛素都是高度保守的，并且迄今为止检查的哺乳动物泛素在它们的氨基酸序列方面甚至是相同的。此外，可以使用来自任何其他真核来源的泛素。例如，酵母的泛素仅有三个氨基酸不同于野生型人类泛素(SEQ ID NO:1)。
术语“二泛素”是指包含两个在头至尾的方向(in head-to-tail orientation)相互连接的未修饰的泛素部分的蛋白质。SED ID NO:4(在野生型泛素的位置45、75、76、151、152的点突变；这些点突变不影响与靶标的结合；克隆139090)和SEQ ID NO:48给出了例子。SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:48之间的氨基酸序列一致性为96.7％。根据本发明的二泛素是152个氨基酸的人造蛋白质，其由彼此直接连接的两个泛素部分组成，在该两个泛素部分之间没有肽接头。本文中所理解的二泛素是与SEQ ID NO:4具有至少95％一致性的蛋白质。
术语“修饰泛素”和“泛素突变蛋白”和“Affilin”均被同义使用并且可以交换。本文所用的术语“修饰泛素”或“泛素突变蛋白”或“Affilin”是指泛素的衍生物，其通过氨基酸交换、***、缺失或其任何组合而与所述未修饰的泛素不同，前提条件是该泛素突变蛋白与靶表位或抗原具有特异性结合亲和力，其在未修饰的泛素中至少10倍更低或不存在。泛素突变蛋白(Affilin；修饰的泛素)的这种功能性质是从头创建功能(全新功能，de novocreated function)。
术语
Figure GDA0001546328990000071
(Scil Proteins GmbH的注册商标)是指基于泛素突变蛋白的非免疫球蛋白衍生的结合蛋白。Affilin蛋白不是存在于自然界的天然泛素或不是从自然界分离的天然泛素，例如SEQ ID NO:1所示。本发明的范围不包括未修饰的泛素。根据本发明所述的Affilin分子包含头至尾融合连接在一起的两个不同的修饰泛素部分或者Affilin分子(包含一个修饰的泛素部分或基本由其组成或由其组成)或基本由其组成或由其组成。“头至尾融合(head-to-tail fusion)”应理解为通过在方向(头)N-C-N-C-(尾)上连接两个蛋白质而将它们融合在一起(串联分子)，如通过引用并入本文的EP2379581B1所描述的。头部部分被指定为第一部分，尾部部分被指定为第二部分。在这种头至尾融合中，两个部分可以直接连接而无需任何接头(例如SEQ ID NO:5-38)。可替代地，两种蛋白质的融合可以通过本文所述的接头(例如多肽接头)进行。
术语“取代”包括“保守”和“非保守”取代。可以例如基于所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性来进行“保守取代”。氨基酸可以分组为以下标准氨基酸组：(1)疏水侧链：Ala(A)、Met(M)、Leu(L)、Val(V)、lle(I)；(图1A-图1D中的符号“H”)(2)酸性极性侧链：Asp(D)、Glu(E)(图1A-图1D中的符号“-”)；(3)碱性侧链极性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)(图1A-图1D中的符号“+”)；(4)芳香族氨基酸：Trp(W)、Tyr(Y)、Phe(F)(图1A-图1D中的符号“o”)；(5)极性氨基酸：Thr(T)、Ser(S)、Asn(N)、Gln(Q)(图1A-图1D中的符号“波浪线”)；(6)影响链取向的残基：Gly(G)、Pro(P)；和(7)Cys(C)。如本文所使用的，“保守取代”定义为氨基酸被上述标准氨基酸组的同一组中列出的另一个氨基酸交换。例如，Asp被Glu交换在如此修饰的多肽中保留了一个负电荷。此外，Gly和Pro基于它们破坏α-螺旋的能力而可以相互取代。上述组中的一些优选保守取代是以下亚组内的交换：(i)Ala、Val、Leu和lle；(ii)Ser和Thr；(ii)Asn和Gln；(iv)Lys和Arg；以及(v)Tyr和Phe。鉴于已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，熟练的科学家可以容易地构建编码保守氨基酸变体的DNA。如本文所使用的，“非保守取代”或“非保守氨基酸交换”被定义为氨基酸被上述氨基酸组(1)至(7)的不同组中列示的另一氨基酸交换。
术语“***”包含向泛素的原氨基酸序列中添加氨基酸，其中该泛素保持稳定而没有显著的结构变化。自然地，环区域连接常规的二级结构元件。人类未修饰的泛素(SEQ IDNO:1)的结构在氨基酸区8-11、17-22、35-40、45-47和50-63处显示六个环，其连接二级结构元件，例如β片和α螺旋。在本发明的一个实施方案中，所公开的Her2结合蛋白包含具有***和取代的组合的泛素突变蛋白。在一个实施方案中，泛素突变蛋白具有2-10个氨基酸残基的***，优选在氨基酸8-11内的最N-末端环内。具体地，要***的氨基酸残基的数目是2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选2-10个氨基酸残基，最优选6-9个氨基酸残基。
根据本发明所述使用的术语“抗体”包含具有两个重链和两个轻链的单克隆抗体(免疫球蛋白或IgG抗体)。另外，仍然保持了结合特异性的其片段或衍生物也包含在术语“抗体”中。术语“抗体”还包括诸如嵌合抗体(人类恒定结构域、非人类可变结构域)、单链抗体和人源化抗体(除了非人类CDR之外的人类抗体)等实施方案。本发明最优选的是由两条重链和两条轻链组成的全长IgG抗体。重链和轻链通过非共价相互作用和二硫键连接。
在本申请中，术语“靶抗原”、“靶”、“抗原”和“结合配偶体(binding partner)”均被同义使用并且可以交换。优选地，靶是下文中定义的靶之一。如本文使用的“抗原”应作广义解释并且包括由本发明的结合蛋白的结合部分结合的任何靶部分。
根据本发明所述的术语“能够结合的蛋白”或“结合蛋白”或“结合Her2”或“对……的结合亲和力”是指包含对所定义的靶抗原具有结合能力的蛋白质。术语“Her2结合蛋白”是指对Her2具有高亲和力结合能力的蛋白质。
“抗原结合位点”是指提供与抗原相互作用的抗原结合分子的位点，即一个或多个氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
术语“表位”包括能够被本文定义的抗原结合蛋白结合的任何分子决定簇并且是由靶向抗原的抗原结合蛋白所结合的靶抗原的区域，并且当抗原是蛋白质时，其可以包括直接接触抗原结合蛋白的特异性氨基酸。在构象表位中，氨基酸残基以一级序列分离，但是当多肽折叠成天然三维结构时，在分子表面上彼此靠近定位。线性表位的特征在于，在蛋白质链的单个线性区段中相邻定位的两个或更多个氨基酸残基。在其他情况下，表位可以包括来自靶蛋白的翻译后修饰的决定簇，例如糖基化、磷酸化、硫酸化、乙酰化、脂肪酸或其它。
术语“融合”是指组分(例如Affilin分子和单克隆抗体或Fab片段)通过肽键直接连接或通过肽接头连接。
术语“融合蛋白”涉及包含至少第一蛋白的蛋白质，该至少第一蛋白质基因上接合至少第二蛋白。融合蛋白是通过连接两个或多个最初编码单独蛋白质的基因来创造的。因此，融合蛋白可以包含相同或不同结合蛋白的多个链节(multimer)，其表达为单一的线性多肽。它可以包括一个、两个、三个或甚至更多个第一和/或第二结合蛋白。如本文中使用的融合蛋白包含至少第一结合蛋白(例如Affilin)，其与至少第二结合蛋白(例如单克隆抗体或其片段)融合。此种融合蛋白可以进一步包含不参与靶结合的其它结构域，诸如但不限于，例如多聚化(multimerization)部分、多肽标签、多肽接头。
本文所用的术语“结合物(conjugate)”涉及包含与其它物质(诸如第二蛋白质或非蛋白质部分)化学连接的至少第一蛋白质或基本上由其组成的蛋白质。结合可以通过有机合成或通过使用包括酶促翻译后修饰的天然过程的酶进行。蛋白质结合物的例子是糖蛋白(蛋白质与碳水化合物组分结合)或脂蛋白(蛋白质与脂质组分结合)。分子可以通过任何形式的接头附接在例如一个或多个位点。化学偶联可以通过本领域技术人员熟知的化学作用进行，包括取代(例如N-琥珀酰亚胺基化学)、加成或环加成(例如马来酰亚胺化学或点击化学)或氧化化学(例如二硫化物形成)。与本发明的蛋白质化学连接的非蛋白质聚合物分子的一些实例是羟乙基淀粉、聚乙二醇、聚丙二醇、树枝状聚合物或聚氧化烯等。
融合蛋白或蛋白质结合物还可包含一个或多个反应性基团或者肽或非肽部分(诸如配体)或者治疗性或诊断性相关分子(诸如放射性核素或毒素)。它还可以包含小的有机或非氨基酸类化合物，例如糖、寡糖或多糖、脂肪酸等。用于将感兴趣的蛋白质附接到此种非蛋白质组分的方法在本领域中是众所周知的，因此在这里不再详细描述。
术语“双特异性结合分子”或“多特异性结合分子”是指抗原结合分子能够特异性结合两个或多个不同表位。典型地，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点对于不同的表位具有特异性。在某些实施方案中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两个表位，特别是在两个不同细胞上表达的两个表位。术语“双特异性结合分子”或“双特异性结合蛋白”是指本发明的结合蛋白能够特异性结合两个不同的表位。此外，本发明的双特异性结合分子能够同时结合两种不同的表位。这意味着双特异性构建体能够同时结合至少一个表位“A”和至少一个表位“B”，其中A和B不相同。两个表位可以位于相同或不同的靶抗原上，这意味着本发明的融合分子可以在两个不同的表位结合一个靶，或者结合两个靶抗原，每个靶抗原与自身表位结合。类似地，“多特异性结合分子”能够同时结合多个表位，其中所述表位可以位于相同或不同的抗原上。
可替代地，所述结合蛋白可以结合相同或不同靶分子上的不同的，非重叠的表位，并因此被分类为双特异性、三特异性、多特异性等，例如αβ、βγ、αδ、αβγ、αβγδ分别结合表位AB、BC、AD、ABC或ABCD。例如，具有Her2-特异性Affilin和抗-EGFR-单克隆抗体的融合蛋白是双特异性的。
术语“多聚结合分子(multimeric binding molecule)”是指多价和/或多特异性的融合蛋白，包含结合蛋白α、β和/或γ等的两个或更多个部分(即二多或多价)，例如，αα、βββ、ααβ、ααββ、αγγ、ββγ、αβγδδ等。例如，相对于表位A，ααβγ是三特异性的和二价的。例如，本文所述的Her2-特异性Affilin和单克隆抗体的融合蛋白是至少“二价的”，因为它们包含至少两个结合蛋白(例如，Affilin和单克隆抗体)。所述结合蛋白可以特异性结合靶抗原上的相同或重叠的表位(单特异性)，例如结合蛋白的组成可以通过(α)2、(α)3、(α)4、(β)2、(β)3、(β)4等来描述。在这种情况下，融合分子分别对表位A或表位B具有单特异性，但是为二价、三价、四价或多价。
术语“氨基酸序列一致性”是指两种或更多种蛋白质的氨基酸序列的一致性(或差异)的定量比较。相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列一致性定义为在比对序列并且引入间隙(gap)(如果需要)以获得最大的百分比序列一致性之后，与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的序列中的氨基酸残基的百分比。
为了确定序列一致性，将查询蛋白的序列与参考蛋白的序列进行比对，例如与SEQID NO:4(二泛素)或与SEQ ID NO:1(泛素)进行比对。用于比对的方法是本领域中公知的。例如，为了确定任意多肽相对于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列一致性的程度，优选采用SIM局部相似性程序(Xiaoquin Huang和Webb Miller(1991),Advances in Applied Mathematics,第12卷:337-357)，其可免费获得(还参见：http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html)。为了多重比对分析，优选使用ClustalW(Thompson et al.(1994)Nucleic Acids Res.,22(22):4673-4680)。
在本发明的上下文中，如果没有另外明确说明，修饰序列与其衍生来源的序列(也称为“亲代序列”)之间的序列一致性程度，通常相对于未修饰序列的总长度来计算。在给定位置与参考氨基酸序列不同的查询序列的每个氨基酸被计为一个差异。查询序列中的***或缺失也被计为一个差异。例如，与参考序列相比，两个泛素部分之间***的接头被计为一个差异。然后，将差异的总和与参考序列的长度相关联以产生非一致性百分比。将一致性的定量百分比计算为100减去非一致性百分比。在针对未修饰泛素比对确定泛素突变蛋白的一致性的具体情况下，特别地不考虑位置45、45和/或76的差异，因为它们与泛素突变蛋白的新结合能力无关。泛素部分可以在氨基酸残基45、75和/或76中被修饰，而不影响其结合能力；然而，所述修饰可以与实现突变蛋白的生物化学性质的修饰相关。通常，用作修饰起始原料的泛素的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、或至少97％、或至少98％的氨基酸序列一致性。因此，例如“与参考序列95％一致”的多肽与参考序列相比，可以例如每100个氨基酸包含五点突变或四点突变和一个***等。
术语“解离常数”或“KD”定义了特异性结合亲和力。如本文使用的，术语“KD”(通常测量单位为“mol/L”，有时缩写为“M”)是指第一化合物和第二化合物之间的特定相互作用的解离平衡常数。在本发明的上下文中，术语KD特别用于描述Her2-结合蛋白和Her2之间的结合亲和力。高亲和力对应于KD的低值。因此，表述“至少为例如10-7M的KD”意味着值为10-7M或更低(结合更紧密)。1×10-7M对应于100nM。10-5M且低至10-12M的值可被认为是可量化的结合亲和力。取决于应用，10-7至10-12M的值对于色谱应用或对于诊断或治疗应用是优选的。根据本发明，靶结合的亲和力应在7x 10-7M(700nM)或更小的范围内。理想地是，最终的靶结合亲和力可以为10-9M(1nM)或更小。
本发明的结合蛋白包含不使用任何接头而直接连接的两个泛素突变蛋白，产生独特的高亲和力Her2结合蛋白，其在从二泛素(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:48)的位置42、44、68、70、72、73、74、82、84、138、139、140、141和142中选择的至少12、13或14个位置具有取代并且可选地具有0、1、2、3、4、5或6个其它取代。
例如在遗传上，本发明的结合蛋白可以融合到其他功能性蛋白质部分。在本发明的这种融合蛋白的上下文中，术语“接头”是指共价连接至少两个其它蛋白质分子的单个氨基酸或多肽。接头是例如与第一和第二蛋白质或蛋白质部分遗传融合以产生单一的线性多肽链。接头的长度和组成可以至少一个和至多约50个氨基酸之间变化。优选地，接头长度在1至30个氨基酸之间。更优选地，肽接头的长度在1至20个氨基酸之间；例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。优选的是，肽接头的氨基酸序列对人体无免疫原性、对蛋白酶稳定并且可选地不形成二级结构。一个实例是由小氨基酸如甘氨酸或丝氨酸组成的接头。接头可以是富含甘氨酸的(例如，接头中多于50％的残基可以是甘氨酸残基)。优选的是仅由甘氨酸和丝氨酸残基组成的可变长度的甘氨酸-丝氨酸-接头。通常，可以使用结构(SGGG)n或SGGG的变换例如(GGGS)n的接头，其中n可以是1和6之间的任何数，优选1或2或3。还优选包含其它氨基酸的接头。用于蛋白质的遗传融合的其它接头是本领域已知的并且可以使用。在本发明的一个实施方案中，第一结合蛋白(例如Affilin)和第二结合蛋白(例如单克隆抗体或其片段)通过(G3S)4接头连接。
在本发明的结合蛋白的化学结合物的情况下，术语“接头”是指将Her2结合蛋白与其它蛋白质或非蛋白质部分共价或非共价连接的任何化学部分，例如通过氢键、离子或范德华相互作用，例如，连接到彼此杂交的两个不同部分的两个互补核酸分子，或化学聚合物诸如聚乙二醇等。这样的接头可以包含能够通过蛋白质的氨基酸侧链、N-末端α-氨基或C-末端羧基与蛋白质化学连接的反应性基团。这样的接头和反应性基团是本领域技术人员所熟知的并且不再进一步描述。
Her2(人表皮生长因子受体2；同义词是ErbB-2、Neu、CD340或p185)是1984年(Schlechter et al(1984)Nature 312:513-516)中首次描述的185-kDa受体。已经显示，该基因的扩增或过表达在某些侵袭性类型的乳腺癌的发病机理和进展中起重要作用，并且Her2已知为该疾病的重要生物标志物和治疗靶点。Her2发挥作用的其他肿瘤包括卵巢癌和胃癌。人类Her2由NCBI登录号NP_004439代表；Her2的细胞外结构域(残基1-652)由uniprot登录号p04626代表。术语“Her2”包含显示出与NP_004439具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％或97％或更高或100％的序列一致性并且具有Her2功能性的所有多肽。
本发明实施方案的详细描述
本发明的Her2结合蛋白包含在头至尾的方向不用接头而直接连接的两个不同修饰的泛素部分，基本上由其组成或由其组成。本发明的Her2结合蛋白与二泛素(SEQ ID NO:4)具有至少85％的氨基酸一致性；即二泛素(SEQ ID NO:4)(总计152个氨基酸)中最多23个氨基酸被改变以生产二泛素(SEQ ID NO:4)对Her2的新结合性能。进一步优选的新型Her2结合蛋白与二泛素(SEQ ID NO:4)的氨基酸一致性为至少86％、至少87％(对应于20个氨基酸被修饰)、至少88％、或至少89％、至少90％(对应于15个氨基酸被修饰)、至少91％(对应于14个氨基酸被修饰)、至少92％(对应于12个氨基酸被修饰)。因此，本发明的Her2结合蛋白显示出与二泛素具有85％至92％的一致性，更优选与二泛素具有87％至91％的一致性。对Her2的结合亲和力(KD)低于700nM的本发明Her2结合蛋白包含根据二泛素(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列、基本上由该氨基酸序列组成或由该氨基酸序列组成，其中选自二泛素(SEQ ID NO:4)的位置R42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141和T142的至少12、13或14个氨基酸的氨基酸被取代，其中Her2结合蛋白与二泛素(SEQ ID NO:4)具有至少85％的序列一致性。本发明中描述的Her2结合蛋白显示出与SEQ ID NO:4的序列一致性不超过92％。优选的Her2结合蛋白包含152个氨基酸，与二泛素(SEQ ID NO:4)具有至少85％的一致性，前提条件是从位置R42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141和T142中选择的至少12、13或14个氨基酸被取代。所有的Her2结合蛋白在位置R42、V70、R72、L73、K82、L84、Q138、K139、E140和T142中取有取代，并且优选在位置I44、H68、R74和S141中具有取代。意外地，在SEQ ID NO:4的所述12、13或14个位置中的取代的特定组合产生高亲和力的Her2结合蛋白。这些蛋白质是从头创建的人工蛋白质。本发明的Her2结合蛋白在自然界中不存在。SEQ ID NO:5-38中提供了从头创建的Her2结合蛋白的例子。
Her2结合蛋白在从二泛素(SEQ ID NO:4)的位置42、44、68、70、72、73、74、82、84、138、139、140、141和142中选择的至少12个位置中被取代并且不具有其它取代，例如SEQ IDNO:29,33；具有一个附加取代，例如SEQ ID NO:27,28,31,32；具有两个附加取代，例如SEQID NO:14,16,21,25,26,30,35；具有三个附加取代，例如SEQ ID NO:6,12,13,15,17,18,20,34,36；具有四个附加取代，例如SEQ ID NO:10,11,19,22,23,24；具有五个附加取代，例如SEQ ID NO:5,7,8,9；或具有六个附加取代，例如SEQ ID NO:37。例如，除了SEQ ID NO:4的位置42、44、68、70、72、73、74、82、84、138、139、140、141和142中的至少12个取代之外，进一步的1、2、3、4、5或6个取代可以优选地选自SEQ ID NO:4的位置6、10、11、15、20、21、23、27、28、31、34、36、40、46、48、49、52、58、62、63、75、78、88、92、95、96、98、114、120、124、131、133、144和/或147(参见图1A-图1D和表1)。
表1.本发明的Her2结合蛋白-取代数及与SEQ ID NO:4的一致性程度
Figure GDA0001546328990000141
Figure GDA0001546328990000151
本发明中提供了Her2结合蛋白的许多例子(参见例如图1A，SEQ ID NO:5-38)。本发明的Her2结合Affilin分子以小于700nM、小于500nM、小于100nM、小于20nM、小于10nM(例如SEQ ID NO:6,14,15,18,22,24,25,26,28,35,36,38)且更优先小于1nM(例如SEQ ID NO:7,8,9,10,11,12,13,16,17,19,20,23)(通过Biacore确定的结合亲和力；参见例如图2)的可测量结合亲和力结合Her2的分离的细胞外结构域。二泛素(SEQ ID NO:4)不能以任何可测量的结合亲和力自然地结合Her2。本发明的所有Her2结合蛋白显示以高亲和力从头创建的结合Her2。
基于二泛素(SEQ ID NO:4)的Her2结合蛋白的优选取代是通过芳族氨基酸取代选自位置70和140的氨基酸。基于二泛素(SEQ ID NO:4)的Her2结合蛋白的进一步优选的取代是通过极性氨基酸取代选自位置42的氨基酸，通过疏水性或极性氨基酸取代位置44的氨基酸，通过芳族氨基酸取代位置68的氨基酸，通过极性或芳族氨基酸取代位置72的氨基酸，通过除了碱性或酸性氨基酸之外的任何氨基酸取代位置73的氨基酸，通过芳族、碱性或极性氨基酸取代位置74的氨基酸，通过除了碱性或酸性氨基酸之外的任何氨基酸取代位置82的氨基酸，通过碱性或酸性氨基酸取代位置84的氨基酸，通过碱性或酸性或极性氨基酸取代位置138的氨基酸，通过酸性或疏水性氨基酸或甘氨酸取代位置139的氨基酸，通过疏水性或极性或碱性氨基酸取代位置141的氨基酸，和/或通过疏水或极性氨基酸取代位置142的氨基酸。基于二泛素(SEQ ID NO:4)的Her2结合蛋白的优选取代选自R42T、R42S、R42L、I44A、I44V、I44S、I44T、H68W、H68Y、H68F、V70Y、V70W、R72T、R72F、R72G、R72Y、L73W、L73S、L73V、L73I、R74Y、R74S、R74N、R74K、K82T、K82L、K82N、K82I、K82Y、L84H、L84D、L84E、L84S、Q138S、Q138R、Q138E、K139E、K139G、K139L、E140W、S141A、S141R、T142I、T142L和/或T142N。进一步优选的是在SEQ ID NO:4中具有氨基酸取代的特定组合(例如至少R42T、I44A、H68W、V70Y、R72T、L73W、R74Y、K82T、L84H)的Her2结合蛋白，如在SEQ ID NO:7-29和38中。
在二泛素(SEQ ID NO:4)中具有氨基酸取代的特定组合的其它优选Her2结合蛋白是例如至少R42S、I44V、H68Y、V70Y、R72F、L73S、K82L、L84D，如例如在SEQ ID NOs:34,35,36和37中。进一步优选的是在二泛素(SEQ ID NO:4)中具有氨基酸取代的特定组合的Her2结合蛋白，例如Q138S、K139E、E140W、S141A、T142I(例如在SEQ ID NO:5,7-29,33,36,37中)，或Q138R、K139G、E140W、T142L(例如在SEQ ID NO:6,34,35中)，或Q138E、K139L、E140W、S141R、T142N(例如在SEQ ID NO:30,31,32中)。
本发明的Her2结合蛋白包含选自由SEQ ID NO:5-38组成的组中的氨基酸序列。优选的是，本发明的Her2结合蛋白包含表现出与SEQ ID NO:5-38的氨基酸序列中的一个或多个具有至少85％或至少87％或至少91％或至少94％或至少96％序列一致性的氨基酸序列。图1A-图1D示出了Her2结合蛋白的例子。
在进一步的实施方案中，基于SEQ ID NO:1的Her2结合蛋白除了在SEQ ID NO:1的位置62、63、64、65、66中的取代以及可能进一步的1、2、3、4、5或6个修饰(例如在位置2、4、6或8)之外，还包含在天然环区内的氨基酸***，优选在在N端部分的第一环内。基于SEQ IDNO:1的优选Her2结合蛋白在SEQ ID NO:1的氨基酸区62–66具有取代，并且与以下各项组合：在所述SEQ ID NO:1天然环区内(优选在区8-11，更优选在对应于SEQ ID NO:1的位置9和10之间)的2-10个氨基酸(优选4-9个氨基酸，甚至更优选6、7、8或9个氨基酸)***。例如，Her2结合Affilin-144567(SEQ ID NO:39)除了在SEQ ID NO:1的位置2、4、6、62、63.、64、65、66的取代(2R、4G、6G、62R、63F、64W、65K、66K)之外，还在SEQ ID NO:1的位置9具有6个氨基酸***(PYETQV,SEQ ID NO:42)。Her2结合Affilin-143692(SEQ ID NO:40)除了在SEQID NO:1的位置2、4、6、62、63、64、65、66的取代(2D、4D、6M、62H、63W、64I、65L、66N)之外，还在SEQ ID NO:1的位置9具有9个氨基酸***(AGNPSHMHH,SEQ ID NO:43)。本发明的Her2结合蛋白包含选自由SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40组成的组的氨基酸序列。优选的是，Her2结合蛋白包含表现出与SEQ ID NO:39-40的氨基酸序列中的一个或多个具有至少85％或至少87％或至少91％或至少94％或至少96％序列一致性的氨基酸序列。
Her2结合蛋白的进一步表征可以以可溶性蛋白的形式进行。适当的方法是本领域技术人员已知的或描述在文献中。用于确定结合亲和力的方法本身是已知的，并且可以例如从本领域已知的以下方法中选择：基于表面等离子体共振(SPR)的技术、生物层干涉测量(BLI)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、荧光光谱技术、等温滴定量热法(ITC)、分析超速离心、放射免疫测定(RIA或IRMA)和增强化学发光(ECL)。下列实施例中描述了所述方法的一些。
对于稳定性分析，例如与化学或物理去折叠相关的基于光谱或基于荧光的方法是本领域技术人员已知的。用于表征Her2结合蛋白的示例性方法概述在本发明的实施例章节中。
例如，生化靶结合分析总结在图2中和进一步描述于实施例中。如通过基于SPR的技术测定的，本发明的所有结合蛋白对Her2具有小于700nM的亲和力。在第一方面的实施方案中，Her2结合蛋白与人类Her2的解离常数KD在0.01nM至700nM之间的范围内，更优选为0.05nM至500nM，更优选为0.1nM至100nM，更优选为0.1nM至20nM，更优选为0.1nM至10nM。解离常数KD可以通过ELISA或表面等离子体共振测定来确定。通常，解离常数KD在20℃、25℃或30℃下确定。如果没有另外的具体说明，本文所述的KD值在25℃下由表面等离子体共振确定。
此外，通过差示扫描荧光测定法(DSF)测定温度稳定性，如实施例中更详细的描述且如图2所示。除了图2所示的结果之外，通过尺寸排阻色谱法证实了所有Her2结合分子的溶解度至少为80％；本发明的Her2结合分子未显示聚集。图3A-3B显示了两种不同Her2结合蛋白的结合动力学。
比较Affilin分子的竞争结合实验显示，不同Her2结合蛋白(例如Affilin-142628和Affilin-143692)结合的表位不相同或不重叠(参见图12)。
这些Her2结合蛋白不竞争Her2结合。另外，Her2结合蛋白结合与单克隆抗体曲妥珠单抗不同的Her2表位。图13显示，Affilin-142628和Affilin-143692结合与曲妥珠单抗不同或非重叠的Her2表位。另外，Affilin-141926(SEQ ID NO:28)、Affilin-141884(SEQID NO:38)、Affilin-141890(SEQ ID NO:30)和Affilin-141975(SEQ ID NO:37)结合与曲妥珠单抗不同或非重叠的Her2表位(表2)。表2中的第一KD显示了结合Her2，表2中第二KD显示了在存在曲妥珠单抗下结合Her2。由于两个数值几乎相同，因此可以得出结论：Affilin-蛋白质结合与曲妥珠单抗不同或非重叠的表位。相比之下，具有与曲妥珠单抗相似或重叠的表位显示Affilin-141931(SEQ ID NO:27)、Affilin-141912(SEQ ID NO:31)和Affilin-141935(SEQ ID NO:32)。
表2.Affilin蛋白与曲妥珠单抗的竞争
Figure GDA0001546328990000181
通过使用Her2过表达细胞(例如SkBr3细胞和遗传工程改造的CHO-K1细胞)的细胞Her2结合分析进行额外的功能表征。测试了不同浓度的Affilin分子。确认了Her2细胞靶结合，如图4A-图4B至图9A-图9B所示。
另外，Affilin结合蛋白显示结合来自人类来源的细胞的肿瘤组织上的Her2(参见图10和图11)。特别地且令人惊讶的是，Affilin分子显示出与SKOV-3肿瘤组织上表达的Her2强的结合。在肺、肝、心肌和卵巢的组织上未观察到结合。
本发明的一个实施方案涵盖本发明的Her2结合蛋白，并且进一步地至少一种附加蛋白质或分子。该附加蛋白质可以是第二结合蛋白，其对于抗原的特异性可以与第一结合蛋白相同或不同。本发明的一个实施方案涵盖包含Affilin-抗体融合蛋白或结合物的融合蛋白或结合物，可选地进一步融合或结合到优选地从由以下各项构成的组(i)、(ii)和(iii)中的至少一个成员中选择的部分：(i)从聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白(HSA)、人血清白蛋白、白蛋白结合肽、或免疫球蛋白(Ig)或Ig片段、多糖中选择的调节药代动力学的部分；和(ii)治疗活性组分，可选地选自单克隆抗体或其片段、细胞因子、趋化因子、细胞毒性化合物、酶、或它们的衍生物、或放射性核素；和(iii)诊断组分，可选地选自荧光化合物、光敏剂、标签、酶或放射性核素。结合物分子可以通过肽接头序列或载体分子连接例如在一个或多个位点处。
与蛋白质部分或非蛋白质部分进一步结合以产生根据本发明的蛋白质结合物可以应用本领域公知的化学方法进行。特别地，专用于半胱氨酸或赖氨酸残基的衍生化的偶联化学是适用的。在引入非天然氨基酸的情况下，化学合成的其它途径是可能的，例如，“点击化学(click chemistry)”或醛特异性化学等。
如此获得的结合物可以选自以下实施例中的一个或多个：(i)经由赖氨酸残基结合蛋白质；(ii)经由半胱氨酸残基通过马来酰亚胺化学结合蛋白质；特别地，半胱氨酸残基可以被特别地引入并且可以位于适合于结合其它部分的任何位置；(iii)肽性(peptidic)或蛋白原性(proteinogenic)结合。将感兴趣的蛋白质共价和非共价地连接到其它功能组分的这些和其它方法在本领域中是众所周知的，因此在此不再详细描述。
进一步的实施方案涉及根据本发明所述的结合蛋白，进一步包含调节药代动力学或生物分布的部分，优选地选自EG、HSA或Ig或Ig片段，例如Fc片段。用于生产具有延长的半衰期的蛋白质的多种技术是本领域已知的。
本发明的结合蛋白还可以包含第二结合蛋白，其包含单抗隆抗体或其片段，或者由单抗隆抗体或其片段组成。在一个实施方案中，第二结合蛋白是对EGFR具有特异的单克隆抗体。惊奇地发现，由EGFR单克隆抗体和Her2-特异性Affilin组成的双特异性结合分子能够特异地结合EGFR和Her2两者。融合蛋白的EGFR结合水平惊人地高于西妥昔单抗的EGFR-结合水平。
在本发明的一些实施方案中，提供了包含同时特异性结合Her2和EGFR的多肽的双特异性结合分子。图14示出了双特异性Affilin-抗体结合蛋白同时结合两个靶抗原(Her和EGFR)。图15A-图15B示出了Affilin-抗体结合蛋白(例如C-末端融合到轻链；CL-141926,SEQ ID NO:44)在Her2过表达细胞(图15A)和在EGFR过表达细胞(图15B)上的流式细胞术结合分析。该图显示了平均荧光强度，表现出Affilin-抗体融合蛋白对Her2过表达细胞和对EGFR过表达细胞的浓度依赖性结合。
在本发明的进一步方面，Her2结合蛋白或融合蛋白或结合物用于医学中，特别是用于医学治疗或诊断的方法，优选治疗或诊断癌症。已知膜蛋白Her2在肿瘤细胞中被上调，导致肿瘤细胞不受控制的生长和转移的形成。用于癌症患者的新疗法包括通过靶向治疗诸如例如单克隆抗体曲妥珠单抗
Figure GDA0001546328990000191
或帕妥珠单抗
Figure GDA0001546328990000192
来抑制Her2。T-DM1(一种抗体-药物结合物)对过表达Her2的乳腺、子宫和卵巢肉瘤有很高的疗效。
HER2过表达已经在多种癌症中被描述。例如，在大约15％至30％的乳腺癌和10％至30％的胃/胃食管癌中发生了Her2的过表达，并且在如卵巢、子宫内膜、膀胱、肺结肠、头颈部等其它癌症中也观察到了Her2过表达。因此，包含本发明的Her2结合蛋白的药物组合物可用于治疗其中Her2与疾病发展相关的癌症，包括但不限于特别是乳腺癌、卵巢癌、胃癌，而且还有肺、头颈部、子宫颈、***、胰腺等中的癌症。
所述组合物含有治疗或诊断有效剂量的本发明的Her2结合蛋白。待施用的蛋白质的量取决于待治疗的生物体、疾病的类型、患者的年龄和体重以及本身已知的其它因素。
本发明的一些实施方案描述了Her2结合蛋白，其以至少700nM的高亲和力结合到Her2的细胞外结构域，但没有或仅有弱的细胞结合。这样的Her2结合蛋白特别适用于需要在可溶性和细胞结合受体之间分化Her2结合蛋白的某些医学应用。可溶性Her2通常存在于癌症患者的血液中。结合可溶性Her2(例如Biacore检测)但不结合细胞结合受体的Her2结合蛋白可以用于其中可溶性Her2是疾病进展的预测性生物标志物的诊断应用。另外，对于仅结合可溶性Her2的Her2结合Affilin蛋白质的某些治疗应用可能是有用的，特别是与结合可溶性和细胞结合受体的治疗性抗体(例如曲妥珠单抗)组合。在这种情况下，Affilin将优选结合可溶性Her2分子，留下更多的抗体分子可用于细胞的治疗干预。这开启了降低以其心脏毒副作用而闻名的抗体的剂量的机会。在本发明中提供了此种Her2-结合蛋白的例子(例如Affilin-142465、Affilin-142655、Affilin-142502、Affilin-141965和Affilin-144567)。
本发明涵盖一种药物组合物，其包含本发明的Her2结合蛋白、融合蛋白或结合物，或核酸分子，本发明的载体，和/或宿主细胞或病毒以及药学上可接受的载体。本发明进一步涵盖一种诊断剂，其包含本发明的Her2结合蛋白或结合物或核酸分子、本发明的载体、和/或宿主细胞或非人类宿主与诊断上可接受的载体。所述组合物含有药学上或诊断上可接受的载体，并且可选地可以含有本身已知的其它助剂和赋形剂。这些包括例如但不限于稳定剂、表面活性剂、盐、缓冲剂、着色剂等。
包含Her2结合蛋白的药物组合物可以是液体制剂、冻干粉剂、霜剂、用于局部施用的洗剂、气雾剂的形式，是粉剂、颗粒剂的形式，是乳剂或脂质体制剂的形式。组合物优选是无菌的、非热原性的和等渗的并且含有本身已知的药学上常规和可接受的添加剂。此外，参考美国药典的规定或Remington's Pharmaceutical Sciences,Mac Publishing Company(1990)。在人和兽医学治疗和预防领域中，含有根据本发明的至少一种Her2结合蛋白的药学有效药物可以通过本身已知的方法制备。取决于盖仑制剂(galenic preparation)，这些组合物可以通过注射或输注、全身、腹膜内、肌内、皮下、经皮或其他常规使用的施用方法来胃肠外(parentally)给药。药物制剂的类型取决于待治疗的疾病类型、给药途径、疾病的严重程度、待治疗的患者以及医学领域技术人员已知的其它因素。
在还进一步方面，本发明公开了诊断组合物，其包含特异性结合特异性靶点/抗原或其同种型的根据本发明所述的Her2结合蛋白以及诊断上可接受的载体。由于增强的Her2表达与肿瘤恶性相关，为了获得关于在患者中Her2的表达状态的信息，需要开发用于非侵入性成像的诊断。此外，Her2成像可用于评估患者对治疗性治疗的反应。例如，使用用合适的放射性同位素或荧光团标记的本发明的蛋白质可用于非侵入性成像，以确定肿瘤和转移的位置(综述见例如Milenic et al.2008Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals 23:619-631；Hoeben et al.2011,Int.Journal Cancer129:870-878)。由于其药代动力学特征，完整抗体不适合常规成像。由于其小尺寸和高亲和力，放射性标记或荧光标记的本发明的融合蛋白预期将更好地适合用作成像诊断。
预期本发明的蛋白质可以有利地应用于治疗。特别地，预期所述分子显示出优异的肿瘤靶向效应和期望的生物分布，并因此降低副作用。本发明的药物组合物可以以任何常规方式制造。
在本领域中已经描述了泛素的衍生化以产生特异性结合特定靶抗原的泛素突变蛋白(mutein)。例如，可以创建其中如SEQ ID NO:4所示的序列已被改变的文库。优选地，所述改变包含从二泛素(SEQ ID NO:4)的位置R42、I44、H68、V70、R72、L73、R74、K82、L84、Q138、K139、E140、S141和T142中选择的至少12个氨基酸。在其它实施方案中，可以创造文库，其中如SEQ ID NO:1所示的序列至少在位于SEQ ID NO:1的位置62、63、64、65、66中氨基酸已经被改变，结合了在N-末端环中4-10个氨基酸的延伸。可以取代额外的1、2、3、4、5或6个氨基酸以产生对Her2具有新结合能力的蛋白质。
根据本发明进行修饰所选择的氨基酸的步骤优选通过所选氨基酸的随机诱变在遗传水平上进行。优选地，通过用于改变属于相应蛋白质的DNA的遗传工程方法来进行泛素的修饰。
优选地，改变是本领域所述的取代、***或缺失。可以使用任何所需的氨基酸进行用于产生源自泛素的新型结合蛋白的氨基酸残基的取代。这在通过引用方式并入本文的EP1626985B1、EP2379581B1和EP2721152中有详细描述。
可以使用任何所需的氨基酸进行用于产生基于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:1的新型结合蛋白的氨基酸的取代。这在例如通过引用并入本文的EP1626985B1和EP2379581B1中有详细描述。假设20个天然氨基酸随机分布在例如14个位置生成20的14乘方(2014)个理论泛素突变蛋白的库(pool)，每个具有不同的氨基酸组成和潜在的不同的结合性质。该大基因库组成了不同Affilin结合蛋白的文库。
举例来说，诱变的起点可以是例如编码SEQ ID NO:4和1的蛋白质的cDNA或基因组DNA。此外，也可以合成制备编码SEQ ID NO:4和1所示的蛋白质的基因。可以通过本领域技术人员已知的方法制备、改变和扩增DNA。本身已知的不同程序可用于诱变，例如位点特异性诱变方法、随机诱变方法、使用PCR或类似方法的诱变。所有方法均是本领域技术人员已知的。
在本发明优选的实施方案中，待诱变的氨基酸位置是预定的。在每种情况下，通常使用本身已知的方法建立不同突变体的文库。通常，可以基于可用于待修饰的泛素蛋白质的结构信息来进行待修饰的氨基酸的预选择。不同组的待随机化的氨基酸的选择产生不同的文库。
如上所述获得的基因库文库可与合适的功能性遗传元件组合，这些功能遗传元件使得蛋白质的表达能够用于选择方法如展示(display)方法。根据本发明，使表达的蛋白质与目标分子接触，以使得如果存在结合亲和力，配偶体(partner)能够彼此结合。该方法能够鉴定对靶分子具有结合活性的那些蛋白质。参见例如EP2379581B1，其通过引用并入本文。
根据本发明所述的接触优选通过适当的呈现和选择方法进行，例如噬菌体展示法、核糖体展示法、mRNA展示法或细胞表面展示法、酵母表面展示法或细菌表面展示法，优选通过噬菌体展示法。为了完整公开，还参考以下参考文献：Hoess,Curr.Opin.Struct.Biol.3(1993),572-579；Wells和Lowmann,Curr.Opin.Struct.Biol.2(1992),597-604；Kay et al.,Phage Display of Peptides and Proteins-A LaboratoryManual(1996),Academic Press。上述方法是本领域技术人员已知的。该文库可以克隆到噬菌粒载体中(例如pCD87SA(Paschke,M.and W.Hohne(2005)."Gene 350(1):79-88))。文库可以展示在噬菌体上，并针对相应的靶抗原进行重复的淘选(panning)。将来自富集噬菌体库的泛素突变蛋白克隆到表达载体中，以进行单独蛋白质表达。优选地，泛素突变蛋白的表达能够通过已建立的技术筛选特异性结合蛋白，例如在自动高通量筛选平台上的ELISA。然后对鉴定具有所需结合特性的克隆进行测序，以揭示Affilin分子的氨基酸序列。可以使鉴定的结合蛋白经历进一步的熟化步骤，例如通过基于所鉴定的序列的改变和重复如上所述的噬菌体展示、核糖体展示、淘选和筛选步骤来产生另外的文库。
本发明的Her2结合分子可以通过许多常规和公知技术中的任何一种制备，例如纯有机合成策略、固相辅助合成技术、片段连接技术或通过市售的自动合成仪。另一方面，它们也可以通过单独的常规重组技术或与常规合成技术组合来制备。此外，它们也可以通过无细胞体外转录/翻译来制备。根据本发明的结合物可以通过化学方法(例如,如上文所述的基于赖氨酸或半胱氨酸的化学)结合化合物来获得。
根据本发明的另一方面，提供了编码本发明的结合蛋白的分离的多核苷酸。本发明还涵盖由本发明的多核苷酸编码的多肽。本发明还提供了包含本发明的分离的多核苷酸的表达载体，以及包含本发明的分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
例如，可以在合适的宿主中表达编码本发明的Her2结合蛋白的一个或多个多核苷酸，并且可以分离所产生的结合蛋白。本发明涵盖了包含所述多核苷酸的载体。在进一步的实施方案中，本发明涉及包含本发明的核酸分子的载体。载体是指可用于将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
本发明还涉及包含本发明的核酸分子或本发明的载体的分离的细胞。合适的宿主细胞包括原核生物或真核生物。还可以使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养***来表达重组蛋白。
在一个实施方案中，本发明还涉及携带本发明载体的宿主细胞或非人宿主。宿主细胞是已经用核酸序列转化或能够用核酸序列转化从而表达感兴趣的基因的细胞。该术语包括亲代细胞的后代，无论后代在形态上或遗传组成上是否与原始亲本细胞相同，只要存在感兴趣的基因即可。根据本发明，宿主可以是用本发明的蛋白质转染的和/或表达本发明的蛋白质的转基因非人动物。的优选的实施方案中，转基因动物是非人哺乳动物。
另一方面，提供了本发明的结合蛋白的制造方法，包含以下步骤：a)在适合于表达结合蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，和b)分离所产生的结合蛋白。本发明还涵盖通过本发明的方法生产的结合蛋白。合适用于培养原核或真核宿主的条件是本领域技术人员公知的。
本发明的一个实施方案涉及用于制备如上详述的本发明的结合蛋白的方法，所述方法包含下列步骤：(a)制备根据本发明任何方面所述的编码Her2结合蛋白的核酸；(b)将所述核酸引入表达载体中；(c)将所述表达载体引入宿主细胞；(d)培养宿主细胞；(e)使宿主细胞经受培养条件，在该条件下表达Her2结合蛋白，由此产生如上所述的Her2结合蛋白；(f)可选地分离在步骤(e)中产生的Her2结合蛋白；和(g)可选地将Her2结合蛋白与其它功能部分结合(如上所述)。
用于蛋白质生产目的的细胞培养和蛋白质表达可以应用本领域技术人员熟知的技术以任何规模(从小体积摇瓶到大型发酵罐)进行。
在表达根据本发明所述的修饰的泛素蛋白之后，可以通过本身已知的方法进一步纯化和富集。所选择的方法取决于本身为本领域技术人员已知的多个因素，例如使用的表达载体、宿主生物体、预期使用的领域、蛋白质的大小和其他因素。
通常，可以使用本领域熟知的常规方法和技术从培养混合物中分离纯化的蛋白质，如离心、沉淀、絮凝、色谱法不同的实施方式、过滤、透析、浓缩及其组合等。色谱方法是本领域公知的，并且包括但不限于离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法(尺寸排阻色谱法)或亲和色谱法。
为了简化纯化，根据本发明修饰的蛋白质可以与对分离材料具有增加亲和力的其它肽序列融合。优选地，这样的融合物经选择以便对泛素突变蛋白的功能没有不利影响，或者可以在纯化后由于引入特异性蛋白酶切割位点而被分离。这些方法也是本领域技术人员已知的。
实施例
提供以下实施例用于进一步说明本发明。本发明特别地通过二泛素(SEQ ID NO：4或48)或野生型泛素(SEQ ID NO：1或2)导致结合Her2的特定修饰来例示。然而，本发明不限于此，并且以下实施例仅显示基于上述描述的本发明的实用性。为了本发明的完整公开，还参考通过引用完全并入本申请的在本申请中引用的文献。
实施例1.结合蛋白的鉴定
文库构建与克隆通过三联体技术(triplet technology)(MorphoSys Slonomics，德国)合成了两个泛素部分(各自包含七个随机化氨基酸位置)，以获得良好平衡的氨基酸分布。将不包括半胱氨酸的编码预制双链三联体(triplet)的19个氨基酸的混合物用于所述合成。在头至尾的方向直接连接两个泛素部分(在两个泛素部分之间没有接头(linker))，以产生具有14个随机化氨基酸位置的152个氨基酸的蛋白质。具有14个随机化位置的二泛素的序列示于SEQ ID NO：3中：
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQXLXFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLXLXLXXXAAMQIFVXTXTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIXXXXXLHLVLRLRAA.
所述14个随机化氨基酸对应于二泛素的位置42、44、68、70、72、73、74、82、84、138、139、140、141和142。二泛素的序列示于SEQ ID NO：4中：
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRAAMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRAA.
使用本领域技术人员已知的标准方法将构建体与修饰的pCD87SA噬菌粒(以下称为pCD12)连接。pCD12噬菌粒包含修饰的torA前导序列(leader sequence)(缺失氨基酸序列QPAMA)以实现在N末端无另外的氨基酸的蛋白质加工。将连接混合物的等分试样(aliquot)用于电穿孔大肠杆菌(Escherichia coli)ER2738(Lucigen)。将文库称为SPIF。除非另有说明，否则使用已建立的重组遗传方法，例如，如Sambrook等人的描述。
靶：从R&D Systems购买重组人类Her2-Fc嵌合体。将编码人类Her2的细胞外结构域的DNA序列(uniprot登录号p004626；残基1-652)在C末端与人IgG1的Fc区遗传融合。
TAT噬菌体展示选择。使用TAT噬菌体展示作为选择***，针对给定的蛋白质靶Her2富集SPIF文库。在用携带SPIF文库的噬菌粒pCD12转化感受态细菌ER2738细胞(Lucigene)后，使用本领域技术人员已知的标准方法进行噬菌体扩增和纯化。为了选择，将靶蛋白提供为固定化在
Figure GDA0001546328990000251
蛋白A或G上的Fc-融合蛋白(Her2-Fc，R&D Systems)。噬菌体孵育期间的靶浓度从200nM(第一轮)至50nM(第三轮)变化。从溶液中磁分离出靶噬菌体复合物并且洗涤多次。用胰蛋白酶洗脱靶结合的噬菌体。为了耗尽Fc结合变体的噬菌体文库，在第2轮和第3轮之前用固定化的IgG1的Fc-片段(Athens Research&Technology)对噬菌体进行预选。
为了鉴定靶特异性噬菌体库(phage pool)，通过噬菌体库ELISA分析了每个选择轮的洗脱和再扩增的噬菌体。分别使用Her2-Fc(2.5μg/ml)和IgG1的Fc-片段(5μg/ml)覆盖中等结合微量滴定板(Greiner bio-one)的孔。使用α-M13HRP-结合抗体(GE Healthcare)检测结合的噬菌体。第3轮的洗脱和再扩增的噬菌体展示与靶特异性结合，随后将其用于通过易错PCR(error prone PCR)的库成熟。将分离的噬菌粒库(pool)用作易错PCR(GeneMorph II随机诱变试剂盒，Agilent Technologies)的模板。将当前与文库(library)位置相比携带了附加取代的SPIF变体的扩增库(pool)再克隆到噬菌粒pCD12中并且转化到ER2738中进行噬菌体扩增和纯化。噬菌体再次进行如上所述的两轮淘选(panning)。靶分别以5nM和1nM的浓度用在第1轮和第2轮中。对于两轮，使用IgG1的Fc片段进行了预选择。为了分析用于特异性靶结合的成熟和选择的库，如上所述进行噬菌体库ELISA。
将靶结合噬菌体库克隆到表达载体中。在完成选择程序后，根据本领域已知的方法通过PCR扩增第一轮和第二轮成熟选择的靶特异性DNA库，用适当的限制性核酸酶切割并且连接到包含Strep-Tag II(IBA GmbH)的表达载体pET-28a(Merck,德国)的衍生物中。
单个菌落命中(hit)分析。在转化BL21(DE3)细胞(Merck,德国)后，生长出抗卡那霉素的单个菌落。使用自动诱导培养基(Studier,2005)通过在384孔板(Greiner BioOne)中培养实现靶结合修饰的泛素变体的表达。收获细胞并且随后分别通过BugBuster试剂(Novagen)进行化学裂解或酶裂解或机械地通过冻/融循环裂解。离心后，使用固定化在highbind 384微量滴定板(Greiner BioOne)上的靶通过ELISA筛选所得的上清液。使用Sfrep-
Figure GDA0001546328990000261
HRP结合物(IBA GmbH)与TMB-Plus底物(Biotrend,德国)结合，实现结合蛋白的检测。通过添加0.2M H2SO4溶液停止反应并且在450nm相对于620nm下在酶标仪(platereader)中进行测量。
实施例2.Her2-结合蛋白的表达和纯化
使用本领域技术人员已知的标准方法将Affilin分子克隆到表达载体中，如下所述进行纯化和分析。表达所有的Affilin蛋白并且通过亲和色谱法和凝胶过滤进行高度纯化。在亲和色谱纯化之后，使用
Figure GDA0001546328990000262
***和SuperdexTM 200HiLoad 16/600柱(GEHealthcare)进行尺寸排阻色谱法(SE HPLC或SEC)。该柱的体积为120ml，并用2CV平衡。以1ml/min流速的纯化缓冲液B施加样品。当信号强度达到10mAU时开始收集级分。SDS-PAGE分析后，集中(pool)阳性级分并且测定量它们的蛋白浓度。
进一步分析包括SDS-PAGE、SE-HPLC和RP-HPLC。通过使用摩尔吸收系数在280nm处的吸光度测量来确定蛋白质浓度。使用Dionex HPLC***和Vydac 214MS54C4(4.6x 250mm,5μm,300A)柱(GE Healthcare)进行RP色谱(RP HPLC)。
实施例3.Her2结合蛋白的溶解性分析
通过NuPage Novex 4-12％Bis-Tris SDS凝胶分析上清液和再悬浮团粒并且使用考马斯染色。通过添加8M尿素从团粒中回收蛋白质。Her2结合蛋白展现出至少80％可溶性(SEQ ID NO:5,27,30,37,38)、至少90％可溶性(SEQ ID NOs:6,20,23,28,34)、至少95％可溶性表达(SEQ ID NO:7,9,10,11,22,29)、100％可溶性(SEQ ID NO:8,12,13,14,15,16,17,18,19,21,25,26,33,35,36)的高溶解度。
实施例4.Her2结合蛋白在高温下是稳定的
通过差示扫描荧光法(DSF)测定本发明结合蛋白的热稳定性。将每种探针以0.1μg/μL的浓度转移到MicroAmp Optical 384-孔板上，并且以适合的稀释度添加SYPRO橙色染料。以每分钟1℃的加热速率编程从25℃至95℃的温度坡度(ramp)(ViiA-7AppliedBiosystems)。在520nm的激发波长和623nm的发射波长下不断测量荧光(ViiA-7AppliedBiosystems)。图2中示出了选定变体的热去折叠(thermal unfolding)的转变的中点(Tm，熔点)。本发明的Her2结合蛋白具有相似的熔融温度。所有结合蛋白的稳定性与对照蛋白质的稳定性相当。
实施例5.Her2结合蛋白的分析(表面等离子体共振,SPR)
用SPR运行缓冲液平衡CM5传感器芯片(GE Healthcare)。通过使EDC和NHS的混合物通过来活化表面暴露的羧基以产生反应性酯基团。使700-1500RU Her2-Fc(在配体上(on-ligand))固定化在流动池上，将IgG-Fc(脱离配体(off-ligand))以与靶成1:3的比率(hIgG-Fc:靶)固定在另一流动池上。配体固定后注射乙醇胺以用于封闭未反应的NHS基团。在配体结合后，蛋白质分析物积累在表面上，增加了折射率。实时测量折射率的这种变化并且绘制为响应或谐振单位(resonance unit)(RU)相对于时间的曲线。以30μl/min的流速以连续稀释将分析物应用于芯片上。进行30秒关联并且进行60秒解离。每次运行后，用30μl再生缓冲液再生芯片表面，并用运行缓冲液平衡。将稀释系列的曲妥珠单抗作为阳性对照，而稀释系列的未修饰的二泛素代表阴性对照。将对照样品以30μl/min的流速施加到基质上，同时将它们关联60秒并解离120秒。如前所述进行再生和再平衡。通过使用Biacore 3000(GE Healthcare)进行结合研究；通过由制造商提供的BIAevaluation 3.0软件通过使用朗缪尔1:1模型(RI＝0)进行数据评估。图2中示出了与Her2结合的结果。针对脱靶标准化评估的解离常数(KD)并且示出。
实施例6.功能表征：结合细胞表面表达的Her2(流式细胞术)
使用流式细胞术来分析Her2结合蛋白与表面暴露Her2的相互作用。使用Her2过表达人类乳腺腺癌来源的SkBr3细胞、Her2过表达转染的CHO-K1细胞(中国仓鼠卵巢细胞)、Her2不表达人类胚胎肾细胞系HEK/293和空载体对照CHO-K1细胞。结果汇总于图4A-图4B至图8中。
胰蛋白酶消化细胞并且重悬于含有FCS的培养基中，洗涤并在预冷FACS封闭缓冲液中染色。制备2x106个细胞/ml的细胞浓度以用于细胞染色并且装入到96孔板(Greiner)中，每个细胞系一式三份。
在多个实验中，将不同浓度的Affilin蛋白质加入到Her2过表达细胞和对照细胞中。在SkBr3和Her2-阴性HEK/293-细胞上测试50nM的每个Affilin(图4A和图4B)。向SkBr3-细胞中加入从333nM至5.6nM的稀释系列(图5A-图5B)和从100nM至0.06pM的稀释系列(图8)。在Her2-过表达CHO-K1细胞和Her2-阴性CHO-K1-pEntry细胞系上测试500nM至0.5nM的Affilin浓度(图6A-图6C和图7)。45分钟后除去上清液并且加入以1:300稀释于FACS封闭缓冲液中的100μl/孔兔抗Strep-Tag抗体(获自GenScript；A00626)。在除去第一抗体之后，以1:1000稀释度施加山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488抗体(获自Invitrogen；A11008)。在来自Merck-Millipore的Guava easyCyte 5HT装置上在激发波长488nm和发射波长525/30nm下进行流式细胞术测量。示出了在SkBr3上Affilin-141884、Affilin-141890、Affilin-141912、Affilin-141926、Affilin-141931、Affilin-141935、Affilin-141965、Affilin-141975(图4A)、Affilin-142418、Affilin-142437、Affilin-142465、Affilin-142502、Affilin-142609、Affilin-142618、Affilin-142620、Affilin-142627、Affilin-142628、Affilin-142654、Affilin-142655、Affilin-142672、Affilin-141884(图4B)和Affilin-141926及Affilin-141890(图5A-图5B)的结合结果。图6A-图6C中描绘了在CHO-K1-Her2细胞上Affilin-142628、Affilin-142654、Affilin-141884、Affilin-142627、Affilin-144631、Affilin-144632、Affilin-144633、Affilin-144634、Affilin-144635、Affilin-144636、Affilin-144637、Affilin-144567和Affilin-142502的结合结果。图7中示出了(50nM至0.5nM)Affilin-142628与CHO-K1-Her2细胞和CHO-K1-pEntry细胞的浓度依赖性结合。在适合的情况下，在实验中使用相当量的二泛素(139090)作为阴性对照(例如，在图4A、图4B、图6A、图6B和图7所示的实验中)。
然而，Affilin-142465(SEQ ID NO:33)、Affilin-142655(SEQ ID NO:34)、Affilin-142502(SEQ ID NO:49)和Affilin-141965(SEQ ID NO:50)显示仅微弱结合Her2过表达SkBr3细胞。SEQ ID NO:34,35,49和50具有至少下列取代：42S、44V、68Y、70Y、72F、73S、82L、84D、138R、139G、140W、142L(二泛素的)。Affilin-142418和Affilin-142655分别具有另外两个取代(K63I,Q78R)或另外四个取代(Q31L,D58V,Q78R,P95S)。以至少700nM的高亲和力结合Her2的细胞外结构域但没有细胞结合或细胞结合低的Her2结合蛋白对于某些应用特别有用，例如对于需要仅对可溶性Her2而非细胞Her2具有高亲和力的Her-结合蛋白的某些诊断或治疗应用。Affilin-142418显示结合Her2过表达SkBr3细胞(图4B，图9A-图9B)。
实施例7.结合细胞表面表达的Her2(免疫细胞化学和荧光显微术)
确认了本发明的蛋白质在外源表达人类Her2的细胞上的结合。在表达Her2的SkBr3细胞和阴性对照细胞系HEK/293上测试了50nM的Affilin-141884、Affilin-142628、Affilin-141926、Affilin-144637、Affilin-142418和Affilin-144567。将二泛素(139090)用作阴性对照并且将10nM曲妥珠单抗用作阳性对照。以1x105个细胞/ml的浓度将细胞接种在Lab-
Figure GDA0001546328990000291
腔室玻片(Chamber-Slide)(Sigma-Aldrich)上。培养72h后，用甲醇固定细胞(5min.,20℃)，随后进行封闭(5％在PBS中的胎马血清(Fetal Horse Serum)，1h)并且在室温下用50nM Affilin培育45分钟。通过兔抗Strep-Tag-抗体(1:500)培育1小时并且随后使用抗兔-IgG-Alexa488-抗体(1:1000)培育1小时来检测Affilin结合。使用抗人-IgG-Alexa488-抗体(1:1000)证明了曲妥珠单抗结合。细胞核用4μg/ml DAPI染色。所有培育步骤均在室温下进行。图9A显示了Affilin-141884、Affilin-142628、Affilin-141926、Afflin-144637和Affilin-142418的强结合。图9B中示出了Affilin-144567和二泛素的弱或负结合。用曲妥珠单抗检测到了可比较的结合。在Her2-阴性细胞系HEK/293上未观察到非特异性结合。
实施例8.功能表征：Her2结合蛋白与肿瘤细胞上表达的细胞外Her2结合(免疫组织化学和荧光显微镜术)
使用SKOV-3-肿瘤、肺、肝、心肌和卵巢的冷冻组织切片来分析本发明的结合蛋白质。将组织切片用冰冷的丙酮固定10分钟，随后使用不同浓度(20nM和50nM)的Affilin-141884和Affilin-142628以及作为阴性对照的等量二泛素克隆139090或作为阳性对照的10nM曲妥珠单抗封闭并且培育1小时。在使用PBS洗涤之后，使用兔抗-Strep-Tag抗体(1:500)在室温下将组织培育1小时，随后以作为曲妥珠单抗的第二抗体的山羊抗兔Alexa488(1:1000)或山羊抗人IgG Alexa594(1:1000)进行培育。用DAPI可视化细胞核。拆下腔室玻片(chamber slide)并且用Mowiol和盖玻片盖覆载玻片。在Zeiss Axio Scope.AI显微镜下将切片成像并且使用标准软件包加工图像。图10和图11显示了与非结合蛋白克隆139090相比，Affilin-141884和Affilin-142628对SKOV-3-肿瘤切片的特异性结合。没有获得对肺组织的组合(图11)。测试了其它组织(肝脏、心肌和卵巢组织)的切片；没有观察到特异性染色。
实施例9.Her2结合Affilin分子结合与抗-Her2单克隆抗体曲妥珠单抗不同的表位的竞争分析
结合特定曲妥珠单抗的不同Her2表位的Affilin蛋白在某些医学实施方案中是有用的。为了研究本发明的分离Her2结合蛋白是否能与抗-Her2单克隆抗体曲妥珠单抗竞争，进行了下列检测：使用NHS/EDC化学将Her2(来自Acrobiosystems)固定化在CM5Biacore芯片上，产生1000个响应单位(response unit)(RU)。在第一个实验中，所有变体均以30μl/min PBST0.005％吐温20的流速，以一个确定的浓度(2.5μΜ)注入(图12)。在第二个实验中，首先使用曲妥珠单抗(200nM)预先加载相同的流动通道，直到芯片表面饱和(图13)。加载曲妥珠单抗后，变体施加与实验1相同(2.5μΜ)。为了更好地澄清，在最后一次注射的Her2结合蛋白上比对了(align)两个传感图曲线(sensogram trace)。
结果表明，Her2结合蛋白的结合不受存在曲妥珠单抗的影响。因此，未观察到竞争，意味着曲妥珠单抗和本发明Her2结合蛋白结合不同或不重叠的Her2表位，即与曲妥珠单抗相比，本发明Her2结合蛋白结合不同的表面暴露的氨基酸(图13)。Affilin-142628(SEQ ID NO:19)、Affilin-143692(SEQ ID NO:39)、Affilin-141926(SEQ ID NO:28)、Affilin-141884(SEQ ID NO:38)、Affilin-141890(SEQ ID NO:30)和Affilin-141975(SEQID NO:37)观察到了这种情形。在报告有原发性及获得性曲妥珠单抗耐受性的癌症治疗中，这些结合蛋白可能特别有用。Affilin-41931(SEQ ID NO:27)、Affilin-141912(SEQ IDNO:31)和Affilin-141935(SEQ ID NO:32)结合与曲妥珠单抗相同或重叠的Her2-表位。
实施例10：Her2结合蛋白与EGFR-抗体西妥昔单抗的双特异性融合蛋白的结合分析
将Her2结合蛋白连接到抗-EGFR单克隆抗体西妥昔单抗的轻链或重链的C-或N-末端。通过将Her2结合蛋白(例如Affilin-141926)分别融合到抗EGFR抗体西妥昔单抗(称为NH-141926；SEQ ID NO:47)重链的N-末端、抗EGFR抗体西妥昔单抗(称为CH-141926；SEQ IDNO:45)重链的C-末端、抗EGFR抗体西妥昔单抗(称为NL-141926；SEQ ID NO:46)轻链的N-末端和抗-EGFR抗体西妥昔单抗(
Figure GDA0001546328990000301
称为CL-141926；SEQ ID NO:44)轻链的C-末端以产生融合蛋白。SEQ ID NO:44-47的第一至最多达20个氨基酸是信号序列。将编码融合蛋白的cDNA瞬时转染到FreeStyleTM 293-F细胞中并且在无血清/无动物成分的培养基中表达。通过蛋白质印迹分析确认了表达。使用
Figure GDA0001546328990000302
(GE Healthcare)通过蛋白A亲和色谱(GE-Healthcare cat no 17-0402-01)从上清液中纯化出融合蛋白。通过凝胶过滤进一步纯化融合蛋白。进一步分析包括SDS-PAGE、SE-HPLC和RP-HPLC。如上所述，通过差示扫描荧光法测定本发明的结合蛋白的热稳定性。确定融合蛋白热去折叠的转变中点(Tm，熔点)；所有融合蛋白具有在Tm＝63.9℃和67.9℃之间的热稳定性(参见表3)。所有结合蛋白的稳定性与对照蛋白质的稳定性相当。
表3：本发明结合蛋白和对照蛋白热去折叠的转变中点
融合蛋白或对照 Tm[℃]
西妥昔单抗 69.0
CH-141926 67.4
CL-141926 63.9
NH-141926 67.5
NL-141926 67.9
如上所述并且如图14所示，通过使用
Figure GDA0001546328990000311
3000(GE Healthcare)进行了结合研究。另外，融合蛋白与CHO-K1细胞中单独表达的靶受体的结合的FACS分析证实了细胞结合(图15A-图15B)。结果汇总于表4和表5中。
表4：本发明的Her2-泛素-突变蛋白-西妥昔单抗结合蛋白针对EGFR(Biacore)的亲和力数据
融合蛋白 K<sub>on</sub>[M<sup>-1</sup>x S<sup>-1</sup>] K<sub>off</sub>[S<sup>-1</sup>] K<sub>D</sub>[M]
西妥昔单抗 6.21x 10<sup>5</sup> 6.29x 10<sup>-4</sup> 1.01x 10<sup>-9</sup>
CH-泛素 7.28x 10<sup>5</sup> 6.72x 10<sup>-4</sup> 9.23x 10<sup>-10</sup>
CH-141926 4.66x 10<sup>5</sup> 1.65x 10<sup>-4</sup> 3.53x 10<sup>-10</sup>
CL-泛素 7.96x 10<sup>5</sup> 7.12x 10<sup>-4</sup> 8.95x 10<sup>-10</sup>
CL-141926 5.84x 10<sup>5</sup> 5.91x 10<sup>-4</sup> 1.01x 10<sup>-9</sup>
NH-泛素 3.02x 10<sup>5</sup> 6.5x 10<sup>-4</sup> 2.15x 10<sup>-9</sup>
NH-141926 3.79x 10<sup>5</sup> 4.12x 10<sup>-4</sup> 1.09x 10<sup>-9</sup>
NL-泛素 2.79x 10<sup>5</sup> 1.54x 10<sup>-5</sup> 5.52x 10<sup>-11</sup>
NL-141926 1.08x 10<sup>5</sup> 1.72x 10<sup>-4</sup> 1.59x 10<sup>-9</sup>
表5：本发明的Her2-泛素-突变蛋白-西妥昔单抗结合蛋白对于Her2(Biacore)的亲和力数据
融合蛋白 K<sub>on</sub>[M<sup>-1</sup>x S<sup>-1</sup>] K<sub>off</sub>[S<sup>-1</sup>] K<sub>D</sub>[M]
CH-141926 7.53x 10<sup>4</sup> 4.96x 10<sup>-4</sup> 6.58x 10<sup>-9</sup>
CL-141926 3.11x 10<sup>5</sup> 4.46x 10<sup>-4</sup> 1.43x 10<sup>-9</sup>
NH-141926 9.03x 10<sup>4</sup> 3.05x 10<sup>-4</sup> 3.37x 10<sup>-9</sup>
NL-141926 8.23x 10<sup>4</sup> 2.36x 10<sup>-4</sup> 2.87x 10<sup>-9</sup>
众所周知，受体蛋白EGFR和Her2在各种形式的癌症(例如乳腺癌、结肠直肠癌和***癌)上的共表达与患者预后不良相关。在图14中，使用了具有固定化的细胞外结构域Her2-Fc的Biacore芯片。注射双特异性融合蛋白，在350秒之后，以1:2稀释系列注射浓度处于100nM和25nM之间的细胞外结构域EGFR-Fc。图14显示了双特异性Affilin-抗体融合蛋白同时结合两个靶。这种效应可以提高包含本发明双特异性EGFR-Her2-融合蛋白的产品在分子成像的治疗应用中的选择性和效率。在图15A-图15B中，通过对于变体CL 141926的流式细胞术测量，在Her2(图15A)和EGFR(图15B)过表达CHO细胞上显示了两个相互作用部分对它们各自靶的结合。
序列表
<110> 希尔蛋白质有限公司(Scil Proteins GmbH )
<120> 基于二泛素突变蛋白的Her2结合蛋白
<130> SP27 WO
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 泛素(野生型)(Ubiquitin (wildtype))
<400> 1
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75
<210> 2
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 泛素参照(Ubiquitin reference)
<400> 2
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 3
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 泛素参照(Ubiquitin reference)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (42)..(42)
<223> Xaa 可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (44)..(44)
<223> Xaa 可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (68)..(68)
<223> Xaa 可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (70)..(70)
<223> Xaa 可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (72)..(74)
<223> Xaa 可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (82)..(82)
<223> Xaa 可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (84)..(84)
<223> Xaa 可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (138)..(142)
<223> Xaa 可以是天然存在的氨基酸
<400> 3
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Xaa Leu Xaa Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Xaa Thr Xaa Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 4
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 泛素参照 (二泛素)克隆139090(Ubiquitin reference (di-ubiquitin)clone 139090)
<400> 4
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 5
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> Affilin-142437
<400> 5
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asn Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Thr Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe Ala Gly Lys
35 40 45
His Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Trp Asn Ala Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Thr Thr His Thr Gly Lys Asn Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Glu Trp Ala Ile Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 6
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> Affilin-142672
<400> 6
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe Thr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Trp Tyr Ala Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Leu Thr Asp Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
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100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
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Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
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<210> 7
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> Affilin-144637
<400> 7
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1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Thr Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe Val Gly Lys
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Gln Leu Glu Tyr Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Trp Tyr Ala Ala Met Arg Ile Phe
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100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
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145 150
<210> 8
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> Affilin-144636
<400> 8
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Thr Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe Val Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Tyr Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Trp Tyr Ala Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Thr Thr His Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Glu Trp Ala Ile Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 9
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
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<220>
<221> MUTAGEN
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85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Glu Trp Ala Ile Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 31
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> Affilin-141912
<400> 31
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Val Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Phe Leu Tyr Leu Tyr Val Ser Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Leu Thr Asp Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Glu Leu Trp Arg Asn Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 32
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> Affilin-141935
<400> 32
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Asp Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Thr Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Tyr Leu Tyr Leu Gly Ile Ser Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Ile Thr Ser Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Glu Leu Trp Arg Asn Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 33
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> Affilin-142465
<400> 33
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Leu Leu Ser Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Trp Leu Gly Val Arg Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Asn Thr Glu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Glu Trp Ala Ile Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 34
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> Affilin-142655
<400> 34
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Leu Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Ser Leu Val Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Val Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Tyr Leu Tyr Leu Phe Ser Arg Ala Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Leu Thr Asp Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Arg Gly Trp Ser Leu Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 35
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> Affilin-142418
<400> 35
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Ser Leu Val Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Ile Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Tyr Leu Tyr Leu Phe Ser Arg Ala Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Leu Thr Asp Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Arg Gly Trp Ser Leu Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 36
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> Affilin-142627
<400> 36
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Val Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Cys Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Ser Leu Val Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Tyr Leu Tyr Leu Phe Ser Arg Ala Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Leu Thr Asp Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Glu Trp Ala Ile Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 37
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> Affilin-141975
<400> 37
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Ser Leu Val Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Tyr Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Tyr Leu Tyr Leu Phe Ser Arg Val Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Leu Thr Asp Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Asn
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Ser Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Ala Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Glu Trp Ala Ile Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 38
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> Affilin-141884
<400> 38
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Arg Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Trp Tyr Ala Ala Met Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Thr Thr His Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Glu Trp Ala Ile Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 39
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 环结合件1>144567 (6链节 环)（LOOP BINDER 1>144567 (6er LOOP)）
<400> 39
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Pro Tyr Glu Thr Gln Val Gly
1 5 10 15
Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val
20 25 30
Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg
35 40 45
Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp
50 55 60
Tyr Asn Ile Arg Gly Gly Arg Phe Leu Trp Leu Lys Leu Lys Leu Arg
65 70 75 80
Ala Ala
<210> 40
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 环结合件2>143692 (9链节 环)（LOOP BINDER 2>143692 (9er LOOP)）
<400> 40
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Ala Gly Asn Pro Ser His Met
1 5 10 15
His His Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile
20 25 30
Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp
35 40 45
Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr
50 55 60
Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Asp Asp Met His Trp Leu Ile Leu Leu Leu
65 70 75 80
Asn Leu Arg Ala Ala
85
<210> 41
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 常规接头序列（General linker sequence）
<400> 41
Ser Gly Gly Gly
1
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 在Affilin-144567中***6个氨基酸（Insertion of 6 amino acid inAffilin-144567）
<400> 42
Pro Tyr Glu Thr Gln Val
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 在Affilin-143692中***9个氨基酸（Insertion of 9 amino acids inAffilin-143692）
<400> 43
Ala Gly Asn Pro Ser His Met His His
1 5
<210> 44
<211> 401
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 融合到西妥昔单抗轻链C-末端的Affilin SEQ ID NO: 28 的融合蛋白（称为CL-141926）（Fusion protein of Affilin SEQ ID NO: 28 to c-terminus of light
chain of Cetuximab (refered to as CL-141926)）
<400> 44
Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro
1 5 10 15
Ala Ser Arg Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser
20 25 30
Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn
85 90 95
Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
100 105 110
Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gln Ile Phe Val Lys Thr
245 250 255
Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile
260 265 270
Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp
275 280 285
Gln Gln Thr Leu Ala Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr
290 295 300
Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu
305 310 315 320
Thr Trp Tyr Ala Ala Met Arg Ile Phe Val Thr Thr His Thr Gly Lys
325 330 335
Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys
340 345 350
Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu
355 360 365
Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr
370 375 380
Asn Ile Ser Glu Trp Ala Ile Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala
385 390 395 400
Ala
<210> 45
<211> 635
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 融合到西妥昔单抗重链C-末端的Affilin SEQ ID NO: 28 的融合蛋白（称为CH-141926）（Fusion protein of Affilin SEQ ID NO: 28 to c-terminus of heavy
chain of Cetuximab (refered to as CH-141926)）
<400> 45
Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr
65 70 75 80
Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
85 90 95
Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Ser Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile
485 490 495
Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys
500 505 510
Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe
515 520 525
Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile
530 535 540
Gln Lys Glu Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Trp Tyr Ala Ala Met
545 550 555 560
Arg Ile Phe Val Thr Thr His Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val
565 570 575
Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys
580 585 590
Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln
595 600 605
Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Glu Trp Ala
610 615 620
Ile Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
625 630 635
<210> 46
<211> 401
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 融合到西妥昔单抗轻链N-末端的Affilin SEQ ID NO: 28 的融合蛋白（称为NL-141926）（Fusion protein of Affilin SEQ ID NO: 28 to n-terminus of light
chain of Cetuximab (refered to as NL-141926)）
<400> 46
Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro
1 5 10 15
Ala Ser Arg Ser Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr
20 25 30
Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala
35 40 45
Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Trp Tyr Ala Ala
85 90 95
Met Arg Ile Phe Val Thr Thr His Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
100 105 110
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
115 120 125
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys
130 135 140
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Glu Trp
145 150 155 160
Ala Ile Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Leu Thr
180 185 190
Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe
195 200 205
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln
210 215 220
Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu
225 230 235 240
Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
245 250 255
Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp
260 265 270
Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly
275 280 285
Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
290 295 300
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
305 310 315 320
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
325 330 335
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
340 345 350
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
355 360 365
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
370 375 380
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
385 390 395 400
Cys
<210> 47
<211> 643
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 融合到西妥昔单抗重链N-末端的Affilin SEQ ID NO: 28 的融合蛋白（称为NH-141926）（Fusion protein of Affilin SEQ ID NO: 28 to n-terminus of heavy
chain of Cetuximab (refered to as NH-141926)）
<400> 47
Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Val Leu Ser Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile
20 25 30
Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys
35 40 45
Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Thr Leu Ala Phe
50 55 60
Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile
65 70 75 80
Gln Lys Glu Ser Thr Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Trp Tyr Ala Ala Met
85 90 95
Arg Ile Phe Val Thr Thr His Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val
100 105 110
Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys
115 120 125
Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln
130 135 140
Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ser Glu Trp Ala
145 150 155 160
Ile Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln
180 185 190
Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys
195 200 205
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg
210 215 220
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly
225 230 235 240
Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn
245 250 255
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
260 265 270
Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr
275 280 285
Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
290 295 300
Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
305 310 315 320
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
325 330 335
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
340 345 350
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
355 360 365
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
370 375 380
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
385 390 395 400
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
405 410 415
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
420 425 430
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
435 440 445
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
450 455 460
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
465 470 475 480
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
485 490 495
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
500 505 510
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
515 520 525
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
530 535 540
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
545 550 555 560
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
565 570 575
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
580 585 590
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
595 600 605
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
610 615 620
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Trp Ser His Pro Gln
625 630 635 640
Phe Glu Lys
<210> 48
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 泛素参照 (二泛素)(Ubiquitin reference (di-ubiquitin))
<400> 48
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
145 150
<210> 49
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 克隆142502(Clone 142502)
<400> 49
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Ser Leu Val Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Tyr Leu Tyr Leu Phe Ser Arg Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Leu Thr Asp Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Arg Gly Trp Ser Leu Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 50
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工的(artificial)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 克隆141965(Clone 141965)
<400> 50
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Ser Leu Val Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu Tyr Leu Tyr Leu Phe Ser Arg Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Leu Thr Asp Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Met Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Arg Gly Trp Ser Leu Leu His
130 135 140
Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150

Claims (15)

1.一种Her2结合蛋白，其中所述Her2结合蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5-38的氨基酸序列中的一种，其中所述Her2结合蛋白对Her2的结合亲和力小于700nM。
2.根据权利要求1所述的Her2结合蛋白，其中所述Her2结合蛋白结合至与单克隆抗体曲妥珠单抗不同或不重叠的Her2表位。
3.根据权利要求1或2所述的Her2结合蛋白，进一步包含至少一种附加分子，所述附加分子选自由以下各项组成的组(i)、(ii)和(iii)中的至少一个成员：
(i)调节药代动力学的部分，选自聚乙二醇、人血清白蛋白、白蛋白结合肽、或免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、多糖，和
(ii)治疗活性组分，可选地选自单克隆抗体或其片段、细胞因子、趋化因子、细胞毒性化合物、酶、或它们的衍生物、或放射性核素，和
(iii)诊断组分，可选地选自荧光化合物、光敏剂、标签、酶、或放射性核素。
4.根据权利要求3所述的Her2结合蛋白，包含对EGFR具有特异性的单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的Her2结合蛋白，其中所述Her2结合蛋白结合至细胞结合Her2的细胞外结构域和可溶性Her2两者。
6.根据权利要求5所述的Her2结合蛋白，其中所述Her2结合蛋白的氨基酸序列选自SEQID NO：5-32、35-38的氨基酸序列中的一种。
7.根据权利要求1所述的Her2结合蛋白，其中所述Her2结合蛋白结合至可溶性Her2，但是并不结合至细胞结合Her2的细胞外结构域。
8.根据权利要求7所述的Her2结合蛋白，其中所述Her2结合蛋白的氨基酸序列选自SEQID NO：33或34的氨基酸序列。
9.权利要求1-8中任一项所述的Her2结合蛋白在制备用于诊断或治疗与Her2结合相关疾病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述疾病为癌症。
11.一种编码权利要求1至8中任一项限定的Her2结合蛋白的核酸分子。
12.一种包含权利要求11所述的核酸分子的载体。
13.一种宿主细胞或非人类、非动物或非植物宿主，包含权利要求1至8中任一项限定的Her2结合蛋白、权利要求11中限定的核酸分子和/或权利要求12所述的载体。
14.一种组合物，包含权利要求1至8中任一项限定的Her2结合蛋白；权利要求11中限定的核酸分子；权利要求12中限定的载体；和/或权利要求13中限定的宿主细胞。
15.一种用于生产权利要求1至8中任一项所述的Her2结合蛋白的方法，包括在合适的条件下培养权利要求13中限定的宿主细胞，以获得所述Her2结合蛋白，并且可选地分离所述Her2结合蛋白。
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