JP2024509018A - 抗ｐｄ－１－抗ｖｅｇｆａ二重特異性抗体を含有する組合せ医薬及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、がん治療及び免疫生物学に関し、抗ＰＤ－１－抗ＶＥＧＦＡ二重特異性抗体を含む組合せ医薬、及びその使用を提供する。具体的には、組合せ医薬は、少なくとも一つの二重特異性抗体及び少なくとも一つのPARP阻害剤を含み、ここで二重特異性抗体は、PD-1を標的とするための第１のタンパク質機能領域及びＶＥＧＦＡを標的とするための第２のタンパク質機能領域を含み；及びＥＵ番号付けシステムに従って、二重特異性抗体に含まれる免疫グロブリンの重鎖定常領域は２つの部位、すなわち、２３４位及び２３５位で変異しており、及び変異後、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ及び／又はＣ１ｑに対する二重特異性抗体の親和定数が、変異前の二重特異性抗体のそれに対する親和定数と比較して減少している。ＰＡＲＰｉと二重特異性抗体を併用することにより、ＰＡＲＰｉ又は二重特異性抗体を単独で使用する場合と比較して腫瘍に対する治療効果が著しく向上し、本発明は良好な応用可能性を有する。

Description

本発明は、腫瘍治療及び免疫学生物学の分野に属し、抗PD-1-抗VEGFA二重特異性抗体を含有する組合せ医薬及びその使用に関する。具体的には、本発明は、抗ヒトPD-1-抗ヒトVEGFA二重特異性抗体を含有する組合せ医薬及びその使用に関する。
腫瘍、特に悪性腫瘍は、今日の世界でヒトの健康を著しく害する疾患である。腫瘍の成長には2つの明らかに異なる段階があり、即ち血管のない緩慢な成長期から血管のある急速な増殖期に転化する。血管の新生が腫瘍に十分な栄養を与えて血管の切り替え期を完了させ、もし血管の新生がなければ、原発腫瘍の成長が1～2 mmを超えることはなく、転移は生じない。
血管内皮増殖因子（VEGF）は、内皮細胞の***増殖を促進し、新生血管の形成を促進し、血管透過性を高める成長因子であり、細胞表面の血管内皮増殖因子受容体と結合し、チロシンキナーゼシグナル伝達経路の活性化を通じて機能を発揮する。腫瘍組織において、腫瘍細胞、腫瘍浸潤マクロファージ及びマスト細胞は高レベルのVEGFを分泌し、腫瘍血管内皮細胞を傍分泌の形で刺激し、内皮細胞の増殖、遊走を促進し、血管形成を誘導し、腫瘍の持続的な成長を促進し、且つ血管透過性を高め、周囲組織のフィブリン沈着を引き起こし、単球、線維芽細胞内皮細胞の浸潤を促進し、腫瘍基質の形成と腫瘍細胞の新生血管への進入を促進し、腫瘍の転移を促進するため、腫瘍血管新生の阻害は現在最も有望な腫瘍治療方法の1つであると考えられている。VEGFファミリーは、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD及びPIGFを含む。血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）は、VEGFR1（別名Flt1）、VEGFR2（別名KDR又はFlk1）、VEGFR3（別名Flt4）及びNeuropilin-1（NRP-1）を含む。そのうち、最初の3つの受容体は、構造上類似し、いずれもチロシンキナーゼスーパーファミリーに属し、いずれも膜外領域、膜貫通断片、及び膜内領域の3つの部分から構成され、そのうち、膜外領域は、免疫グロブリン様ドメインからなり、膜内領域は、チロシンキナーゼ領域に属する。VEGFR1及びVEGFR2は、主に血管内皮細胞表面に位置し、VEGFR3は、主にリンパ管内皮細胞表面に位置する。
VEGFファミリー分子は、幾つかの受容体に対して異なる親和性を有する。VEGFAは、主にVEGFR1、VEGFR2及びNRP-1と結合して作用を発揮する。VEGFR1は、最も早く発見された受容体であり、正常な生理学的状況でVEGFR1とVEGFAとの親和性はVEGFR2とVEGFAとの親和性よりも高いが、その細胞内段チロシナーゼ活性はVEGFR2よりも低い（馬莉、中国優生及び遺伝雑誌、24(5)(2016):146-148）。
VEGFR2は血管新生及び構築の主な調節因子であり、VEGFR1と比較してVEGFR2は非常に高いチロシンキナーゼ活性を有する。VEGFR2は、リガンドVEGFAと結合した後に血管内皮細胞の増殖、分化などの挙動、並びに血管の形成過程及び血管の透過性を媒介し（Roskoski R Jr.ら、Crit Rev Oncol Hematol, 62(3)(2007):179-213.）、VEGFAはVEGFR2と結合した後に下流PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPKシグナル伝達経路を介して細胞内関連タンパク質遺伝子の転写発現を媒介し、血管内皮細胞の増殖を促進する（Takahashi Tら、Oncogene, 18(13)(1999):2221-2230.）。
VEGFR3は、チロシンキナーゼファミリーのメンバーの1つに属し、主に胚胎時期の血管内皮細胞及び成年期のリンパ管内皮細胞に発現し、VEGFC及びVEGFDは、VEGFR3と結合してリンパ管内皮細胞の増殖及び遊走を刺激し、リンパ管の新生を促進し、NRP-1は、非チロシンキナーゼ膜貫通タンパク質であり、生物学的シグナルを独立に伝達することができないが、VEGFチロシンキナーゼ受容体と複合体を形成してからシグナル伝達を媒介することができる。（馬莉、中国優生及び遺伝雑誌、24(5)(2016):146-148）。
VEGFA及びVEGFR2は、主に血管新生の制御に関与し、VEGFAとVEGFR2との結合前後に上下流経路において多数の中間シグナルがカスケード反応を形成することを引き起こし、最終的に内皮細胞の増殖、生存、遊走、透過性増加及び周辺組織への浸潤などの異なる形態でその生理機能を変化させる（董宏超ら、『現代腫瘍医学』、第22卷、第9期、2014年9月、2231-3ページ）。
プログラム細胞死受容体-1（Programmed cell death protein、PD-1）は、CD279とも呼ばれ、I型膜貫通糖タンパク質膜表面受容体であり、CD28免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、T細胞、B細胞及び髄様細胞に普遍的に発現される。PD-1には2つの天然リガンド、PD-L1とPD-L2とがある。PD-L1及びPD-L2は、いずれもB7スーパーファミリーに属し、非造血系細胞及び多種の腫瘍細胞を含む多種の細胞膜表面に構成的又は誘導的に発現される。PD-L1は、主にT細胞、B細胞、DC及び微小血管内皮細胞及び多種の腫瘍細胞に発現される。PD-L2は、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞にのみ発現される。PD-1とそのリガンドとの相互作用は、リンパの活性化を阻害し、T細胞の増殖及びIL-2、IFN-γなどのサイトカインの分泌を阻害する。
多くの研究により、腫瘍微小環境は腫瘍細胞を免疫細胞の破壊から保護でき、一方で、腫瘍微小環境中に浸潤したリンパ球PD-1の発現は上方制御されており、しかも多種の原発腫瘍組織が、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、皮膚癌、結腸癌、神経膠腫などの免疫組織化アッセイにおいてPD-L1陽性として現れることを示している。同時に、腫瘍におけるPD-L1の発現は、癌患者の予後不良と有意に相関する。PD-1とそのリガンドとの相互作用を遮断することにより、腫瘍特異的T細胞免疫を促進し、腫瘍細胞の免疫クリアランス効率を高めることができる。多数の臨床試験により、PD-1又はPD-L1を標的とする抗体は、腫瘍組織へのCD8+T細胞の浸潤を促進し、IL-2、IFN-γ、グランザイムB及びパーフォリンなどの抗腫瘍の免疫エフェクターをアップレギュレートし、それによって腫瘍の成長を効果的に阻害することができることを示している。
PD-1経路に対する抗体は、PD-1抗体の幅広い抗腫瘍性の有望さ及び驚くべき薬効のために、非小細胞性肺癌、腎細胞癌、卵巣癌、黒色腫（Homet M. B., Parisi G., et al., Anti-PD-1 Therapy in Melanoma. Semin Oncol. Jun;42(3) (2015):466-473）、リンパ腫及び貧血（Held SA, Heine A, et al., Advances in immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML. Curr Cancer Drug Targets. Sep;13(7) (2013):768-74）、高頻度マイクロサテライト不安定性（MSI-H）又はミスマッチ修復欠損（dMMR）腫瘍の治療に用いられる多種の腫瘍治療に対するブレイクスルーをもたらすと業界において一般的に考えられている（MSI-H/dMMR特徴を有する腫瘍の治療のために、FDAなどによって多数の抗PD-1抗体薬が承認されている）。
現在、抗血管新生療法と免疫チェックポイント阻害剤との併用は、多くの腫瘍において良好な治療効果を示す。例えば、卵巣癌（Joyce F. Liu et al., JAMA Oncol. 2019;5(12):1731-1738.）、非小細胞肺癌（EGFR及び/又はALK感受性変異を含む非小細胞肺癌）（Manegold C, et al., J Thorac Oncol. 2017 Feb;12(2):194-207.）、腎細胞癌（Dudek AZ et al., J Clin Oncol. 2018;36 (suppl; abstr 4558).）、肝細胞癌（Stein S et al., J Clin Oncol, 2018, 36(15_suppl):4074.；FDAは2020年にベバシズマブ（Bevacizumab）とアテゾリズマブ（Atezolizumab）とを併用して肝細胞癌を治療することを承認した）、直結腸癌（MSI-H/dMMR及び非MSI-H/dMMR型を含む）（Bendell JC et al. American Society of Clinical Oncology; May 29-June 2, 2015; Chicago, IL. 2015; abstract 704；Hochster HS et al. American Society of Clinical Oncology Gastrointestinal Cancers Symposium; January 19-21, 2017; San Francisco, CA. 2017; abstract 673.）、乳腺癌（Yukinori Ozaki et al., AACR; Cancer Res 2020;80(4 Suppl):Abstract nr PD1-03.）におけるベバシズマブなどの抗VEGF抗体と、ニボルマブ（Nivolumab）、ペムブロリズマブ（Pembrolizumab）、アテゾリズマブなどの抗PD-1/PD-L1抗体との併用が良好な結果を示している。VEGFR2抗体とPD-1抗体薬との併用は、胃及び胃食道接合部腺癌においても良好な抗腫瘍効果を示す（Herbst RS et al., Lancet Oncol. 2019;20(8):1109-1123.）、PD-1抗体（ペムブロリズマブ）と血管新生阻害剤（レンバチニブ（Lenvatinib））との併用態様は、子宮内膜癌の治療において良好な治療効果を示し、2019年に子宮内膜癌の治療のためにFDAによって承認されている。黒色腫（PD-1抗体ニボルマブ及びペムブロリズマブは黒色腫の治療のためにFDAによって承認されている）、子宮頸癌（Krishnansu S. et al., N Engl J Med 2014; 370:734-743.）、神経膠腫、前立腺癌（Antonarakis ES. et al., J Clin Oncol. 2020 Feb 10;38(5):395-405.）、尿路上皮癌（Joaquim Bellmunt. et al., N Engl J Med 2017; 376:1015-1026；FDAは2017年にニボルマブが膀胱癌の治療に用いられることを承認した）、食道癌（Kato K et al., Lancet Oncol. 2019;20(11):1506-17.）、中皮腫（Scherpereel A et al., Lancet Oncol. 2019;20(2):239-253.）などの腫瘍に対して、PD-1/PDL-1抗体は良好な治療効果を示し、腫瘍発生におけるPD-1経路とVEGF経路の相乗効果を考慮すると、PD-1及びVEGF経路を同時に遮断する薬剤は、より良好な抗腫瘍効果を有すると予想される。
ポリADPリボポリメラーゼ（Poly ADP-ribose Polymerase、PARP）は、PARP酵素ファミリーに属し、PARP-1、PARP-2、PARP-3及びVault-PARPを含む。PARPはDNA修復経路において重要な役割を果たす。DNA損傷断裂時にPARPを活性化し、それはDNA損傷の分子受容器として、DNA断裂位置を認識し、結合する機能を有し、更にレセプタータンパク質のポリADPリボシル化作用を活性化し、触媒し、DNAの修復過程に関与する。
PARP阻害剤は、合成致死を媒介することによって抗腫瘍効果を発揮することができる。PARP媒介DNA修復に加えて、他のDNA修復メカニズムも存在する。相同組換え（HomologousRecombination）とは、非姉妹染色単量体間又は同一染色体上に相同配列を含むDNA分子間又は分子内に発生する再結合を指す。DNA相同組換え修復（Homologous Recombination Repair、HRR）は、DNA二本鎖損傷の重要な修復方式であり、BRCA1及びBRCA2は、この過程の重要なタンパク質であり、BRCA遺伝子に変異が生じてBRCA1及びBRCA2タンパク質の機能が失われれば、HRR機能異常、即ちHRD（Homologous Recombination Deficiency）を引き起こす。他のHRR関連遺伝子、例えばPALB2、ATM、BRCA1/2、CHEK2、BARD1、BRIP1、Mre11、CDK12、RAD50、NBS1、RAD51C、RAD51D及びPALB2などの異常、又はBRCA1遺伝子プロモーターのメチル化、及びその他の未だに明らかでない原因により、これらはいずれもHRDを引き起こし、ゲノムの不安定化を招く（Lord CJ, Ashworth A. Science. 2017;355(6330):1152-1158.）。癌及び腫瘍遺伝子プロファイル（TCGA）研究により、50%超の高悪性度漿液性卵巣癌にHRD（相同組換え修復欠損）が存在することが見出された。BRCA1/2生殖系列変異（15%）、BRCA1/2体細胞変異（6%）、エピジェネティック変異BRCA1プロモーターメチル化（11%）、EMSY増幅（8%）、PTEN変異（7%）、RAD51Cメチル化（3%）、ATM又はATR変異（2%）及び他のHRD遺伝子変異（5%）を含む（Turner NC. N Engl J Med. 2017;377(25):2490-2492）。
合成致死（Synthetic lethality）とは、2つの非致死遺伝子が同時に不活性化されて細胞死を引き起こす現象を指す。PARP阻害剤は、PARP1又はPARP2触媒部位との結合により、PARPタンパク質がDNA損傷部位から脱落することができず、更にDNA複製フォークの停滞及びDNA複製の順調でないことをもたらし、PARPが阻害され、HRR関連タンパク質が欠損すると、合成致死を招く。
特定のDNA修復欠損（例えばBRCA1又はBRCA2系統遺伝子変異）を有する腫瘍細胞にとって、PARPの阻害は、腫瘍細胞のDNA修復を阻害し、合成致死を利用して腫瘍細胞の死を促進することができる。
PARP阻害剤（PARPi）は、卵巣癌、乳腺癌、前立腺癌、及び膵臓癌などの癌の臨床研究において良好な治療効果を示し、相同修復欠損を伴う卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、及び乳腺癌などの癌の治療における使用が承認されており（J. Mateo et al. Ann Oncol. 2019 Sep 1;30(9):1437-1447.）、PARPiは、膵臓癌、前立腺癌においても良好な薬効を示している。DNA修復欠損（例えばBRCA1又はBRCA2系統遺伝子変異）を伴わない腫瘍に対して、PARPiは依然として抗腫瘍効果を示す。NOVA臨床研究において、プラセボと比較すると、ニラパリブは、患者が相同組換え修復欠損遺伝子変異を伴うか否かに関わらず、そのPFSが有意に延長され（Mirza MR et al. N Engl J Med 2016; 375(22):2154-2164.）、他のPARPi、例えばオラパリブ、ルカパリブなどが、相同組換え修復欠損遺伝子変異を伴わない腫瘍患者においても良好な薬効を示す（J. Mateo et al. Ann Oncol. 2019 Sep 1;30(9):1437-1447.）。
既に発売が承認されているPARP阻害剤は、合計4種類があり、それぞれアストラゼネカのオラパリブ（Olaparib）、米Clovis Oncology社のルカパリブ（Rucaparib）、Tesaro社のニラパリブ（Niraparib）及びファイザーのタラゾパリブ（Talazoparib）である。中国恒瑞医薬のフルゾパリブ（Fluzoparib）は、中国で、以前は、二本鎖以上の化学療法を経た、胚性系統BRCA変異を伴う白金感受性再発性卵巣癌、卵管癌又は原発性腹膜癌患者の治療に使用することを承認された。更に、veliparib ER、ABT-472、ABT-767、Stenoparib、AST-6828、AG-PD、ANG-2864、ANG-3038、ANG-3186、AZD-5305、AZ-0108、AZD-2461、AMXI-5001、AMXI-2001、AMXI-3001、AMXI-7001、AMXI-9001、pamiparib、ZYTP-1、CK-102、XZ-120312、YHP-743、ヨーベングアン I 131、ルカパリブカンシレート、CVL-218、CPH-101、CPH-102、CBX-11、CBX-15、ミノサイクリン、DB-207、DPS-102、E-7016、ヨーベングアン I 131、MK-2512、HCX-014、HWH-340、IDX-1197、IDX-1197、senaparib、IMP-04100、IMP-04111、IMP-04149、IMP-04249、IMP-04307、IMP-04356、JPI-289、JPI-547、JPI-283、fluzoparib、GT-1620、ヨーベングアン I 131、DR-2313、MP-124、H-10、NT-125、BGP-15、NMSP-293、NMSP-293、NMSP-118、NMSP-648、NMSP-914、DB-207、NUV-1156、NUV-1176、JPI-289、Stenoparib、OX-401、NU-1025、NU-1085、PLX-376、R-554、RBN-2397、RBN-012759、PJ-34、INO-1001、WW-46、BSI-401、イニパリブ、SOMCL-9112、SC-10914、HTMC-0435、SRX-3128、TSL-1502、PJ-34、CEP-8983、CK-102、THG-009、talazoparib SR、L-2286、mitoparib、WB-1340などが研究開発中である。
二重機能抗体は、二重特異性抗体（Bispecific Antibody）とも呼ばれ、同時に2つの異なる抗原を標的とする特異的薬物であり、免疫選別精製による生産が可能である。また、遺伝子工学によっても得られ、遺伝子工学は結合部位の最適化、合成形態の考慮及び収量などの面で全て対応する柔軟性を有するので、一定の優位性を有する。現在、その存在形態は45種を超えることが証明されている（Muller D, Kontermann RE. Bispecific antibodies for cancer immunotherapy:Current perspectives. BioDrugs 2010; 24:89-98）。現在開発された多種の二重特異性抗体は、IgG-scFv形態であるMorrisonモードであり（Coloma M. J., Morrison S. L. Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat Biotechnol., 1997;15:159-163）、これは天然に存在するIgG形態に類似しており、抗体工学、発現、及び精製において有する利点が、二重機能抗体の理想的な存在形態であることが証明されている（Miller B. R., Demarest S. J., et al., Protein Eng Des Sel 2010; 23:549-57; Fitzgerald J, Lugovskoy A. MAbs 2011; 3:299-309）。
前臨床研究では、PARPiは、ネオ抗原及び非ネオ抗原に基づく腫瘍細胞の免疫系認識をトリガーし得、免疫チェックポイント阻害剤との併用により、より良好な治療効果を達成する可能性があることを示唆することが見出された（Mateo J et al. Ann Oncol. 2019;30(9):1437-1447.）。PARPの阻害は、腫瘍細胞にPD-L1の発現を増加させ、免疫阻害を形成し、それによってPARPiの治療効果を弱め、したがってPARPを阻害すると同時にPD-(L)1を遮断することは、免疫阻害の形成を回避し、それによってPARPi及びPD-(L)1阻害剤がより強い抗腫瘍活性を発揮する（Jiao S et al. Clin Cancer Res. 2017;23(14):3711-3720.）。一方、腫瘍細胞は、関連遺伝子の変異が、その特定のDNA修復欠損をもたらし、DNA損傷の蓄積が、腫瘍細胞と正常細胞との間の差異を増大させ、更に免疫系によって認識されやすく、しかも腫瘍の変異が多いほど、その生存はますます免疫系に対する阻害に依存する。そのため、PARPiとPD-1薬物との併用は、一定の理論的根拠がある。PD-1に加えて、例えば抗PD-1/VEGFA二重特異性抗体が、同時に腫瘍微小環境においてPD-1の発現と強い相関性を有するVEGF-Aを遮断し、血管新生阻害などのメカニズムによって腫瘍進行を阻害する。
したがって、より有効な治療手段の開発又は併用投与治療態様は、臨床的に大きな意義を有する。
本発明者らは、鋭意研究と創造的な努力を重ね、抗PD-1-抗VEGFA抗体とPARP阻害剤との腫瘍治療における併用に関する研究を進め、両者の併用が、腫瘍、特に悪性腫瘍を治療及び/又は予防することに良好な効果を有することを見出した。これにより、以下の発明が提供される。
本発明の一態様は、組合せ医薬に関し、少なくとも1つの二重特異性抗体と、少なくとも1つのPARP阻害剤と、を含み、
そのうち、上記二重特異性抗体は、
PD-1を標的とする第1タンパク質機能領域と、
VEGFAを標的とする第2タンパク質機能領域と、を含み、
そのうち、上記第1タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、上記第2タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、又は、上記第1タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、上記第2タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、
そのうち、
上記免疫グロブリンは、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号28～30で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、その軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号31～33で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、及び上記一本鎖抗体は、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号34～36で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、且つその軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号37～39で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、
或いは、
上記免疫グロブリンは、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号34～36で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、且つその軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号37～39で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、及び上記一本鎖抗体は、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号28～30で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、その軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号31～33で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、
上記免疫グロブリンはヒトIgG1サブタイプであり、
そのうち、EU番号付けシステムに従って、上記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、第234位、235位及び237位のうちの任意の2つの部位又は3つの部位で変異し、且つ変異後、二重特異性抗体は、FcγRIIIa及び/又はC1qとの親和性定数が変異前と比較して低下し、好ましくは、上記親和性定数は、Fortebio Octet分子相互作用装置によって測定される。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬において、EU番号付けシステムに従って、上記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、以下の変異を有する：
L234A及びL235A、又は
L234A及びG237A、又は
L235A及びG237A、
又は
L234A、L235A、G237A。
本発明において、特に断らない限り、部位の前のアルファベットは変異前のアミノ酸を示し、部位の後のアルファベットは変異後のアミノ酸を示す。
本発明はまた、組合せ医薬に関し、少なくとも1つの二重特異性抗体と、少なくとも1つのPARP阻害剤と、を含み、
そのうち、上記二重特異性抗体は、
PD-1を標的とする第1タンパク質機能領域と、
VEGFAを標的とする第2タンパク質機能領域と、を含み、
そのうち、上記第1タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、上記第2タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、又は、上記第1タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、上記第2タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、
そのうち、
上記免疫グロブリンは、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号28～30で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、その軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号31～33で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、及び上記一本鎖抗体は、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号34～36で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、且つその軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号37～39で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、
或いは、
上記免疫グロブリンは、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号34～36で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、且つその軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号37～39で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、及び上記一本鎖抗体は、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号28～30で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、その軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号31～33で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、
上記免疫グロブリンはヒトIgG1サブタイプである。
本発明はまた、組合せ医薬に関し、少なくとも1つの二重特異性抗体と、少なくとも1つのPARP阻害剤と、を含み、
そのうち、上記二重特異性抗体は、
PD-1を標的とする第1タンパク質機能領域と、
VEGFAを標的とする第2タンパク質機能領域と、を含み、
そのうち、上記第1タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、上記第2タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、又は、上記第1タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、上記第2タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、
そのうち、
上記免疫グロブリンは、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号28～30で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、その軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号31～33で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、及び上記一本鎖抗体は、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号34～36で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、且つその軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号37～39で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、
或いは、
上記免疫グロブリンは、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号34～36で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、且つその軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号37～39で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、及び上記一本鎖抗体は、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号28～30で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、その軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号31～33で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、
上記免疫グロブリンはヒトIgG1サブタイプであり、
そのうち、EU番号付けシステムに従って、上記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、以下の変異の組合せの1つを有する：
L234A及びL235A、又は
L234A及びG237A、又は
L235A及びG237A、又は
L234A、L235A、G237A。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬において、EU番号付けシステムに従って、上記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、
N297A、D265A、D270A、P238D、L328E、E233D、H268D、P271G、A330R、C226S、C229S、E233P、P331S、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、N297Q、P238S、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、T394D、G236R、G236A、L328R、A330S、P331S、H268A、E318A及びK320Aからなる群より選ばれた1つ又は複数の変異を有するか、又は更に有する。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬において、
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5及び配列番号9からなる群より選ばれ、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7、配列番号11及び配列番号17からなる群より選ばれ、
或いは、
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5及び配列番号9からなる群より選ばれ、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7、配列番号11及び配列番号17からなる群より選ばれ、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示される。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬は、以下の（1）～（12）からなる群より選ばれるいずれかである：
（1）
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7で示され、
（2）
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号11で示され、
（3）
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号17で示され、
（4）
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7で示され、
（5）
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号11で示され、
（6）
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号17で示され、
（7）
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7で示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、
（8）
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号11で示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、
（9）
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号17で示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、
（10）
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7で示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、
（11）
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号11で示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び
（12）
上記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号17にで示され、及び、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示される。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬：
上記免疫グロブリンの重鎖のアミノ酸配列は、配列番号24で示され、且つその軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号26で示される。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬において、上記二重特異性抗体はIgG-scFv形態であるMorrisonモードである。
本発明の幾つかの実施形態において、上記組合せ医薬において、
上記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の重鎖定常領域から選ばれ、且つ上記免疫グロブリンの軽鎖定常領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の軽鎖定常領域から選ばれる。
本発明の幾つかの実施形態において、上記組合せ医薬において、
上記免疫グロブリンは、その重鎖定常領域がヒトIg gamma-1 chain C region又はヒトIg gamma-4 chain C regionであり、且つその軽鎖定常領域がヒトIg kappa chain C regionである。
本発明の幾つかの実施形態において、上記免疫グロブリンの定常領域はヒト化されており、例えば、重鎖定常領域は、Ig gamma-1 chain C region，アクセッション番号:P01857を採用し、軽鎖定常領域は、Ig kappa chain C region，アクセッション番号:P01834を採用し、又は
上記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、Ig gamma-4 chain C region，アクセッション番号: P01861.1を採用し、軽鎖定常領域は、Ig kappa chain C region，アクセッション番号: P01834を採用する。
本発明の一実施形態において、重鎖定常領域Ig gamma-1 chain C region（アクセッション番号:P01857）のアミノ酸配列は、以下の通りである：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK （配列番号40）
本発明の一実施形態において、重鎖定常領域Ig gamma-4 chain C region（アクセッション番号:P01861.1）のアミノ酸配列は、以下の通りである：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK （配列番号41）
本発明の一実施形態において、軽鎖定常領域Ig kappa chain C region（アクセッション番号:P01834）のアミノ酸配列は、以下の通りである：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （配列番号42）
本発明の幾つかの実施形態において、上記組合せ医薬において、上記一本鎖抗体は、免疫グロブリンの重鎖のC末端に接続されている。免疫グロブリンは2本の重鎖からなるため、1つの免疫グロブリン分子に2つの一本鎖抗体分子が接続されている。好ましくは、2つの一本鎖抗体分子は同じである。
本発明の幾つかの実施形態において、上記組合せ医薬において、上記一本鎖抗体は2本であり、各一本鎖抗体の一端は、それぞれ免疫グロブリンの2本の重鎖のC末端又はN末端に接続されている。
本発明の幾つかの実施形態において、上記一本鎖抗体のVHとVLとの間にジスルフィド結合が存在する。抗体のVHとVLとの間にジスルフィド結合を導入する方法は、当技術分野で周知であり、例えば米国特許US5,747,654；Rajagopal et. al，Prot. Engin. 10(1997)1453-1459；Reiter et. al，Nat. Biotechnol. 14(1996)1239-1245；Reiter et. al，Protein Engineering 8(1995)1323-1331；Webber et. al，Molecular Immunology 32(1995)249-258；Reiter et. al，Immunity 2(1995)281-287；Reiter et. al，JBC 269(1994)18327-18331；Reiter et. al，Inter. J. of Cancer 58(1994)142-149、又はReiter et. al，Cancer Res.54(1994)2714-2718を参照することができ、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬において、上記第1タンパク質機能領域は、上記第2タンパク質機能領域に直接接続されているか又は接続断片を介して接続されており、及び/又は上記一本鎖抗体の重鎖可変領域は、上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域に直接接続されているか又は接続断片を介して接続されている。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬において、上記接続断片は、（GGGGS）nであり、nは正の整数であり、好ましくは、nは、1、2、3、4、5又は6である。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬において、上記第1タンパク質機能領域及び第2タンパク質機能領域は、独立的に1つ、2つ又は2つ以上である。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬において、上記一本鎖抗体は、免疫グロブリンの重鎖のC末端に接続されている。
本発明はまた、組合せ医薬に関し、少なくとも1つの二重特異性抗体と、少なくとも1つのPARP阻害剤と、を含み、
そのうち、上記二重特異性抗体は、
PD-1を標的とする第1タンパク質機能領域と、
VEGFAを標的とする第2タンパク質機能領域と、を含み、
上記第1タンパク質機能領域は1つであり、上記第2タンパク質機能領域は2つであり、
そのうち、上記第1タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、上記第2タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、
上記免疫グロブリンの重鎖のアミノ酸配列は、配列番号24で示され、且つその軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号26で示され、
上記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号17で示され、
上記一本鎖抗体は免疫グロブリンの重鎖のC末端に接続されており、
上記第1タンパク質機能領域は、上記第2タンパク質機能領域に第1の接続断片を介して接続され、且つ上記一本鎖抗体の重鎖可変領域は、上記一本鎖抗体の軽鎖可変領域に第2の接続断片を介して接続され、上記第1の接続断片と上記第2の接続断片とは相同又は相異し、
好ましくは、上記第1の接続断片及び上記第2の接続断片のアミノ酸配列は、配列番号18及び配列番号19からなる群より独立的に選ばれ、
好ましくは、上記第1の接続断片及び上記第2の接続断片のアミノ酸配列はいずれも配列番号18で示される。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬において、上記二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、約10-6 M未満、例えば約10-7 M、10-8 M又は10-9 M未満又はそれ以下の親和性定数でFcγRIに結合し、好ましくは、上記親和性定数は、Fortebio Octet分子相互作用装置によって測定される。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬において、上記二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、約10-9 M未満、例えば約10-7 M、10-8 M又は10-9 M未満又はそれ以下の親和性定数でC1qに結合し、好ましくは、上記親和性定数は、Fortebio Octet分子相互作用装置によって測定される。
本発明の幾つかの実施形態において、上記組合せ医薬において、上記二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、10-5 M未満、例えば10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M又は10-10 M未満又はそれ以下のKDでVEGFAタンパク質及び/又はPD-1タンパク質に結合し、好ましくは、上記KDは、Fortebio分子相互作用装置によって測定される。
本発明の幾つかの実施形態において、上記組合せ医薬において、
上記二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、1 nM未満、0.5 nM未満、0.2 nM未満、0.15 nM未満又は0.14 nM未満のEC50でVEGFAタンパク質に結合し、好ましくは、上記EC50は、間接ELISA法によって測定され、
及び/又は、
上記二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、1 nM未満、0.5 nM未満、0.2 nM未満、0.17 nM未満、0.16 nM未満又は0.15 nM未満のEC50でPD-1タンパク質に結合し、好ましくは、上記EC50は、間接ELISA法によって測定される。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記二重特異性抗体はモノクローナル抗体である。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記二重特異性抗体はヒト化抗体である。
本発明の幾つかの実施形態において、上記組合せ医薬において、上記PARP阻害剤は、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブ、フルゾパリブ、veliparib ER、ABT-472、ABT-767、Stenoparib、AST-6828、AG-PD、ANG-2864、ANG-3038、ANG-3186、AZD-5305、AZ-0108、AZD-2461、AMXI-5001、AMXI-2001、AMXI-3001、AMXI-7001、AMXI-9001、pamiparib、ZYTP-1、CK-102、XZ-120312、YHP-743、ヨーベングアン I 131、ルカパリブカンシレート、CVL-218、CPH-101、CPH-102、CBX-11、CBX-15、ミノサイクリン、DB-207、DPS-102、E-7016、ヨーベングアン I 131、MK-2512、HCX-014、HWH-340、IDX-1197、IDX-1197、senaparib、IMP-04100、IMP-04111、IMP-04149、IMP-04249、IMP-04307、IMP-04356、JPI-289、JPI-547、JPI-283、fluzoparib、GT-1620、ヨーベングアン I 131、DR-2313、MP-124、H-10、NT-125、BGP-15、NMSP-293、NMSP-293、NMSP-118、NMSP-648、NMSP-914、DB-207、NUV-1156、NUV-1176、JPI-289、Stenoparib、OX-401、NU-1025、NU-1085、PLX-376、R-554、RBN-2397、RBN-012759、PJ-34、INO-1001、WW-46、BSI-401、イニパリブ（iniparib）、SOMCL-9112、SC-10914、HTMC-0435、SRX-3128、TSL-1502、PJ-34、CEP-8983、CK-102、THG-009、talazoparib SR、L-2286、mitoparib及びWB-1340からなる群より選ばれる1つ又は複数である。
本発明の幾つかの実施形態において、上記組合せ医薬は、1種又は複数種の腫瘍化学療法薬を更に含み、
好ましくは、上記腫瘍化学療法薬は、トポイソメラーゼII（TOP2）阻害剤から選ばれ、好ましくは、上記トポイソメラーゼII（TOP2）阻害剤は、エトポシドであり、
好ましくは、上記腫瘍化学療法薬は、パクリタキセル系薬剤から選ばれ、好ましくは、上記パクリタキセル系薬剤は、パクリタキセル、アルブミンパクリタキセル、リポソームパクリタキセル及びドセタキセル（タキソテール）からなる群より選ばれ、
好ましくは、上記腫瘍化学療法薬は、白金系薬剤から選ばれ、好ましくは、上記白金系薬剤は、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンからなる群より選ばれ、
好ましくは、上記腫瘍化学療法薬は、ゲムシタビン、ペメトレキセド及びカペタビンからなる群より選ばれる1つ又は複数である。
本発明の幾つかの実施形態において、上記組合せ医薬において、上記組合せ医薬は、固定組合せであり、例えば固体医薬組成物形態又は液体医薬組成物形態を呈し、又は
上記組合せ医薬は、非固定組合せであり、例えば上記二重特異性抗体、PARP阻害剤及び腫瘍化学療法薬は、それぞれ医薬組成物形態を呈する。
本発明の幾つかの実施形態において、上記組合せ医薬において、上記医薬組成物は、薬学的に許容されるベクター及び/又は賦形剤を更に含む。
本発明の医薬組成物は、薬学的に公知の任意の剤形、例えば、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、溶液、ゲル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、錠剤、坐剤、注射剤（注射液、注射用無菌粉末、及び注射用濃溶液を含む）、吸入剤、スプレー剤などに製剤化され得る。好ましい剤形は、意図される投与方式及び治療用途に依存する。本発明の医薬組成物は、無菌であり、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならない。好ましい剤形の1つは注射剤である。そのような注射剤は、無菌注射溶液であり得る。例えば、無菌注射溶液は、必要量の本発明の二重特異性抗体を適切な溶媒に組み込み、任意選択で他の所望の成分（pH調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、等張化剤、防腐剤、希釈剤、又はそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない）を同時に組み込み、続いてろ過して除菌することによって調製することができる。更に、保存及び使用を容易にするために、無菌注射溶液を無菌凍結乾燥粉末剤として（例えば、真空乾燥又は凍結乾燥によって）調製することができる。このような無菌凍結乾燥粉末剤は、使用前に、滅菌発熱性物質除去水のような適切なベクター中に分散させることができる。
更に、本発明の二重特異性抗体又はPARP阻害剤は、投与を容易にするために、単位用量の形態で医薬組成物に存在することができる。ある実施形態では、上記単位用量は、少なくとも1 mg、少なくとも5 mg、少なくとも10 mg、少なくとも15 mg、少なくとも20 mg、少なくとも25 mg、少なくとも30 mg、少なくとも45 mg、少なくとも50 mg、少なくとも75 mg、又は少なくとも100 mgである。上記医薬組成物が液体（例えば、注射剤）剤形である場合、濃度が少なくとも0.1 mg/mLであり、例えば少なくとも0.25 mg/mL、少なくとも0.5 mg/mL、少なくとも1 mg/mL、少なくとも2.5 mg/mL、少なくとも5 mg/mL、少なくとも8 mg/mL、少なくとも10 mg/mL、少なくとも15 mg/mL、少なくとも25 mg/mL、少なくとも50 mg/mL、少なくとも75 mg/mL、又は少なくとも100 mg/mLの本発明の二重特異性抗体を含み得る。
本発明の二重特異性抗体又は医薬組成物は、経口、口腔、舌下、眼球、局所、非経口、直腸、くも膜下腔内、内漿水槽内、鼠径部、膀胱内、局所（例えば、散剤、軟膏剤又は滴剤）、又は鼻腔経路を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって投与することができる。しかし、多くの治療用途のために、好ましい投与経路/方式は非経口投与（例えば、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射）である。投与経路及び/又は方式は、意図される目的に応じて変化することが、当業者によって理解されたい。好ましい一実施形態において、本発明の二重特異性抗体又は医薬組成物は、静脈内注入又は注射によって投与される。
本発明において提供される二重特異性抗体又は医薬組成物は、単独で又は併用してもよいし、別の薬学的活性剤（例えば腫瘍化学療法薬）と併用してもよい。このような別の薬学的活性剤は、本発明の二重特異性抗体又は本発明の医薬組成物の投与の前、同時又は後に投与され得る。
本発明において、最適な目的反応（例えば、治療又は予防反応）を得るために、投与態様を調整することができる。例えば、単回投与、一定期間にわたる複数回の投与、又は治療状況の緊急性に応じて用量を比例的に減少又は増加させることが可能である。
本発明の二重特異性抗体は、本発明のいずれか1項に記載の二重特異性抗体であり、抗PD-1-抗VEGFA二重特異性抗体である。
本発明の別の態様は、本発明のいずれか1項に記載の組合せ医薬と、製品説明書とを含む薬物キット製品に関する。
本発明のさらなる態様は、悪性腫瘍の治療及び/又は予防のための医薬品の製造における、本発明のいずれか1項に記載の組合せ医薬又は本発明の薬物キット製品の使用に関し、
好ましくは、上記悪性腫瘍は、卵巣癌、子宮内膜癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵管癌、腹膜癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、消化管癌、脳癌、食道癌、例えば、食道扁平上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性（MSI-H）又はミスマッチ修復欠損（dMMR）癌、尿路上皮癌、中皮腫、胃腺癌、胃食道接合部腺癌、白血病、骨髄腫、甲状腺癌、頭頸部癌、骨癌、胆道癌、及び精巣癌からなる群より選ばれ、
好ましくは、上記腫瘍は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腫瘍であり、
好ましくは、上記腫瘍は、相同組換え媒介性修復機能欠損が存在しない腫瘍であり、
好ましくは、上記肺癌は、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌であり、
好ましくは、上記非小細胞性肺癌は、EGFR及び/又はALK感受性変異を伴う非小細胞肺癌であり、
好ましくは、上記非小細胞性肺癌は、EGFR及び/又はALK感受性変異を伴わない非小細胞肺癌であり、
好ましくは、上記肝臓癌は、肝細胞癌であり、
好ましくは、上記腎腫瘍は、腎細胞癌であり、
好ましくは、上記乳腺癌は、トリプルネガティブ乳腺癌であり、
好ましくは、上記尿路上皮癌は、膀胱癌であり、
好ましくは、上記腹膜癌は、原発性腹膜癌であり、
好ましくは、上記卵巣癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵巣癌であり、
好ましくは、上記卵管癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵管癌であり、
好ましくは、上記腹膜癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腹膜癌であり、
好ましくは、上記乳腺癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する乳腺癌である。
本発明のさらなる態様は、以下の医薬品の製造における、本発明のいずれか1項に記載の組合せ医薬又は本発明の薬物キット製品の使用に関する：
（1）
サンプル中のVEGFAレベルを検出する薬剤又は試薬、
VEGFAとVEGFR2との結合を遮断する薬剤又は試薬、
VEGFAの活性又はそのレベルを下方制御する薬剤又は試薬、
血管内皮細胞の増殖に対するVEGFAの刺激作用を解除する薬剤又は試薬、
血管内皮細胞の増殖を阻害する薬剤又は試薬、又は
腫瘍血管新生を遮断する薬剤又は試薬、
及び/又は
（2）
PD-1とPD-L1との結合を遮断する薬剤又は試薬、
PD-1の活性又はそのレベルを下方制御する薬剤又は試薬、
PD-1による生体免疫阻害を解除する薬剤又は試薬、
Tリンパ球におけるIFN-γ分泌を促進する薬剤又は試薬、又は
Tリンパ球におけるIL-2分泌を促進する薬剤又は試薬。
本発明のインビトロ実験では、抗VEGFA抗体及び抗VEGFA-抗PD-1二重特異性抗体はいずれもHUVEC細胞の増殖を阻害することができ、抗PD-1抗体及び抗VEGFA-抗PD-1二重特異性抗体はいずれもIFNγ及び/又はIL-2の分泌活性化免疫反応を促進することができる。
本発明のさらなる態様は、悪性腫瘍を治療及び/又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本発明のいずれか1項に記載の組合せ医薬又は本発明の薬物キット製品を投与するステップを含み、
好ましくは、上記悪性腫瘍は、卵巣癌、子宮内膜癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵管癌、腹膜癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、消化管癌、脳癌、食道癌、例えば、食道扁平上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性（MSI-H）又はミスマッチ修復欠損（dMMR）癌、尿路上皮癌、中皮腫、胃腺癌、胃食道接合部腺癌、白血病、骨髄腫、甲状腺癌、頭頸部癌、骨癌、胆道癌、及び精巣癌からなる群より選ばれ、
好ましくは、上記腫瘍は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腫瘍であり、
好ましくは、上記腫瘍は、相同組換え媒介性修復機能欠損が存在しない腫瘍であり、
好ましくは、上記肺癌は、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌であり、
好ましくは、上記非小細胞性肺癌は、EGFR及び/又はALK感受性変異を伴う非小細胞肺癌であり、
好ましくは、上記非小細胞性肺癌は、EGFR及び/又はALK感受性変異を伴わない非小細胞肺癌であり、
好ましくは、上記肝臓癌は、肝細胞癌であり、
好ましくは、上記腎腫瘍は、腎細胞癌であり、
好ましくは、上記乳腺癌は、トリプルネガティブ乳腺癌であり、
好ましくは、上記尿路上皮癌は、膀胱癌であり、
好ましくは、上記腹膜癌は、原発性腹膜癌であり、
好ましくは、上記卵巣癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵巣癌であり、
好ましくは、上記卵管癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵管癌であり、
好ましくは、上記腹膜癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腹膜癌であり、
好ましくは、上記乳腺癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する乳腺癌である。
本発明の幾つかの実施形態において、上記悪性腫瘍を治療及び/又は予防する方法において、手術の前又は後に、及び/又は放射線治療の前又は後に投与される。
本発明の幾つかの実施形態において、上記悪性腫瘍を治療及び/又は予防する方法において、上記二重特異性抗体の単回投与量は、体重1キログラム当たり0.1～100 mg、好ましくは体重1キログラム当たり5～50 mg又は5～15 mgであり、
3日、4日、5日、6日、10日、1週間、2週間又は3週間毎に1回投与し、
及び/又は
投与方式は静脈点滴又は静脈注射である。
本発明の幾つかの実施形態において、上記悪性腫瘍を治療及び/又は予防する方法において、PARP阻害剤の単回投与量は、体重1キログラム当たり0.1～100 mg、好ましくは体重1キログラム当たり5～50 mg又は5～15 mgであり、
3日、4日、5日、6日、10日、1週間、2週間又は3週間毎に1回投与し、
及び/又は
投与方式は静脈点滴又は静脈注射である。
本発明の幾つかの実施形態において、上記悪性腫瘍を治療及び/又は予防する方法において、上記二重特異性抗体はPARP阻害剤と同時に投与し、又は同時に投与しない。
本発明の二重特異性抗体及び/又はPARP阻害剤の治療又は予防有効量の典型的な非限定的範囲は、0.02～100 mg/kg、例えば0.1～50 mg/kg、0.1～25 mg/kg、又は1～10 mg/kgである。投与量は、治療を必要とする症状のタイプ及び重症度によって変化し得ることに留意されたい。更に、当業者は、任意の特定の患者について、特定の投薬態様が、患者の必要性及び医師の専門的評価に基づいて、時間とともに調整されるべきであることを理解されたい、本明細書に記載の投与量の範囲は、例示目的のためのものであり、本発明の組合せ医薬の使用又は範囲を限定するものではない。
本発明において、上記対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよい。
本発明のさらなる態様は、以下からなる群より選ばれる、インビボ又はインビトロでの方法に関する：
（1）
サンプル中のVEGFAレベルを検出する方法、
VEGFAとVEGFR2との結合を遮断する方法、
VEGFAの活性又はそのレベルを下方制御する方法、
血管内皮細胞の増殖に対するVEGFAの刺激作用を解除する方法、
血管内皮細胞の増殖を阻害する薬剤又は試薬の方法、又は
腫瘍血管新生を遮断する方法、
及び/又は
（2）
PD-1とPD-L1との結合を遮断する方法、
PD-1の活性又はそのレベルを下方制御する方法、
PD-1による生体免疫阻害を解除する方法、
Tリンパ球におけるIFN-γ分泌を促進する方法、又は
Tリンパ球におけるIL-2分泌を促進する方法。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬又は薬物キット製品は、悪性腫瘍を治療及び/又は予防するために用いられ、
好ましくは、上記悪性腫瘍は、卵巣癌、子宮内膜癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵管癌、腹膜癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、消化管癌、脳癌、食道癌、例えば、食道扁平上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性（MSI-H）又はミスマッチ修復欠損（dMMR）癌、尿路上皮癌、中皮腫、胃腺癌、胃食道接合部腺癌、白血病、骨髄腫、甲状腺癌、頭頸部癌、骨癌、胆道癌、及び精巣癌からなる群より選ばれ、
好ましくは、上記腫瘍は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腫瘍であり、
好ましくは、上記腫瘍は、相同組換え媒介性修復機能欠損が存在しない腫瘍であり、
好ましくは、上記肺癌は、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌であり、
好ましくは、上記非小細胞性肺癌は、EGFR及び/又はALK感受性変異を伴う非小細胞肺癌であり、
好ましくは、上記非小細胞性肺癌は、EGFR及び/又はALK感受性変異を伴わない非小細胞肺癌であり、
好ましくは、上記肝臓癌は、肝細胞癌であり、
好ましくは、上記腎腫瘍は、腎細胞癌であり、
好ましくは、上記乳腺癌は、トリプルネガティブ乳腺癌であり、
好ましくは、上記尿路上皮癌は、膀胱癌であり、
好ましくは、上記腹膜癌は、原発性腹膜癌であり、
好ましくは、上記卵巣癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵巣癌であり、
好ましくは、上記卵管癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵管癌であり、
好ましくは、上記腹膜癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腹膜癌であり、
好ましくは、上記乳腺癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する乳腺癌である。
本発明の1つ又は複数の実施形態において、上記組合せ医薬又は薬物キット製品は、以下のように用いられる：
（1）
サンプル中のVEGFAレベルを検出し、
VEGFAとVEGFR2との結合を遮断し、
VEGFAの活性又はそのレベルを下方制御し、
血管内皮細胞の増殖に対するVEGFAの刺激作用を解除し、
血管内皮細胞の増殖を阻害し、又は
腫瘍血管新生を遮断し、
及び/又は
（2）
PD-1とPD-L1との結合を遮断し、
PD-1の活性又はそのレベルを下方制御し、
PD-1による生体免疫阻害を解除し、
Tリンパ球におけるIFN-γ分泌を促進し、又は
Tリンパ球におけるIL-2分泌を促進する。
本発明のさらなる態様は、悪性腫瘍の治療及び/又は予防のための医薬品の製造における、本発明のいずれか1項に記載の組合せ医薬における二重特異性抗体の使用に関し、そのうち、上記悪性腫瘍は、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌及び乳腺癌からなる群より選ばれ、
好ましくは、上記卵巣癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵巣癌であり、
好ましくは、上記卵管癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵管癌であり、
好ましくは、上記腹膜癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腹膜癌であり、
好ましくは、上記乳腺癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する乳腺癌である。
本発明のさらなる態様は、悪性腫瘍を治療及び/又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本発明のいずれか1項に記載の組合せ医薬における二重特異性抗体を投与するステップを含み、そのうち、上記悪性腫瘍は、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、及び乳腺癌からなる群より選ばれ、
好ましくは、上記卵巣癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵巣癌であり、
好ましくは、上記卵管癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵管癌であり、
好ましくは、上記腹膜癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腹膜癌であり、
好ましくは、上記乳腺癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する乳腺癌である。
本発明のさらなる態様は、悪性腫瘍の治療及び/又は予防のための本発明のいずれか1項に記載の組合せ医薬における二重特異性抗体に関し、そのうち、上記悪性腫瘍は、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌及び乳腺癌からなる群より選ばれ、
好ましくは、上記卵巣癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵巣癌であり、
好ましくは、上記卵管癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵管癌であり、
好ましくは、上記腹膜癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腹膜癌であり、
好ましくは、上記乳腺癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する乳腺癌である。
抗体治療薬、特にモノクローナル抗体は、既に多くの疾患の治療において良好な治療効果を得ている。これらの治療用抗体を得るための従来の実験方法は、動物を抗原で免疫すること、動物を免疫した場合に抗原を標的とする抗体を得ること、又は親和性成熟法により抗原に対する親和性が低い抗体を改良することである。
軽鎖及び重鎖の可変領域が抗原の結合を決定し、各鎖の可変領域は、いずれも3つの高可変領域を含み、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる（重鎖（H Chain）のCDRはHCDR1、HCDR2、HCDR3を含み、軽鎖（L Chain）のCDRはLCDR1、LCDR2、LCDR3を含み、それはKabatらによって命名され、Bethesda M.d., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition ,NIH Publication (1-3) 1991:91-3242.を参照されたい。
好ましくは、CDRはIMGT番号付けシステムによって定義され、Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas, and Marie-Paule Lefranc. “IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF.” Nucleic acids research 38.suppl_1 (2009):D301-D307を参照されたい。
当業者によく知られている技術的手段により、例えばVBASE2データベースによって、特にIMGT定義に従って、以下の項目（1）～（13）のモノクローナル抗体配列のCDR領域のアミノ酸配列を分析し、結果は、以下の通りである：
（1）ベバシズマブ
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示される。
その重鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りである：
HCDR1: GYTFTNYG （配列番号28）
HCDR2: INTYTGEP （配列番号29）
HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV （配列番号30）
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りである：
LCDR1: QDISNY （配列番号31）
LCDR2: FTS （配列番号32）
LCDR3: QQYSTVPWT （配列番号33）
（2）14C12、14C12H1L1又は14C12H1L1（M）
その重鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りである：
HCDR1: GFAFSSYD （配列番号34）
HCDR2: ISGGGRYT （配列番号35）
HCDR3: ANRYGEAWFAY （配列番号36）
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りである：
LCDR1: QDINTY （配列番号37）
LCDR2: RAN （配列番号38）
LCDR3: LQYDEFPLT （配列番号39）
（3）VP101（hG1WT）又はVP101（hG1DM）
その重鎖の9つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りである：
HCDR1: GYTFTNYG （配列番号28）
HCDR2: INTYTGEP （配列番号29）
HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV （配列番号30）
HCDR4: GFAFSSYD （配列番号34）
HCDR5: ISGGGRYT （配列番号35）
HCDR6: ANRYGEAWFAY （配列番号36）
HCDR7: QDINTY （配列番号37）
HCDR8: RAN （配列番号38）
HCDR9: LQYDEFPLT （配列番号39）
その軽鎖可変領域の3つのCDR領域のアミノ酸配列は、以下の通りである：
LCDR1: QDISNY （配列番号31）
LCDR2: FTS （配列番号32）
LCDR3: QQYSTVPWT （配列番号33）。
本発明の抗体VP101（hG1DM）は、VP101（hG1WT）の非可変領域にアミノ酸変異を導入する。EU番号付けシステムにより234、235位にアミノ酸変異を導入する：
その重鎖ヒンジ領域第234位にロイシンからアラニンへの点変異（L234A）を導入し、第235位ロイシンからアラニンへの点変異（L235A）を導入し、VP101（hG1DM）を得た。
本発明において、特に言及しない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。また、本明細書で用いられる細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、免疫学的実験室操作手順は当技術分野で広く使用されている通常手順である。同時に、本発明をより良く理解するために、以下に関連用語の定義及び説明を提供する。
本明細書で使用されるように、VEGFAタンパク質のアミノ酸配列に言及する場合、これにはVEGFAタンパク質（GenBank ID： NP_001165097.1）の全長が含まれるが、これに限定されず、VEGFAの融合タンパク質、例えばマウス又はヒトIgGのFcタンパク質断片（mFc又はhFc）と融合した断片も含まれる。しかしながら、VEGFAタンパク質のアミノ酸配列において、変異又はバリアント（置換、欠失及び/又は付加が挙げられるが、これらに限定されない）は、その生物学的機能に影響を及ぼすことなく、天然に生成され得るか、又は人工的に導入され得ることが、当業者には理解される。したがって、本発明において、用語「VEGFAタンパク質」は、その天然又は人工の変異体を含む、そのような配列の全てを含むものとする。且つ、VEGFAタンパク質の配列断片が記載される場合、それはまた、その天然又は人工変異体の対応する配列断片を含む。本発明の一実施態様において、VEGFAタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号33の下線部分で示される（末尾の6個のHisを含まず、合計302個のアミノ酸）。
本明細書で使用されるように、VEGFR2タンパク質（KDRとも呼ばれる）のアミノ酸配列は、VEGFR2タンパク質（GenBank ID：NP_002244）の全長、又はVEGFR2の細胞外断片VEGFR2－ECD又はVEGFR2－ECDを含む断片を含むが、これらに限定されない、また、VEGFR2－ECDの融合タンパク質、例えば、マウス又はヒトIgGのFcタンパク質断片（mFc又はhFc）と融合する断片を含む。しかしながら、VEGFR2タンパク質のアミノ酸配列において、変異又はバリアント（置換、欠失及び/又は付加が挙げられるが、これらに限定されない）は、その生物学的機能に影響を及ぼすことなく、天然に生成され得るか、又は人工的に導入され得ることが、当業者には理解される。したがって、本発明において、用語「VEGFR2タンパク質」は、その天然又は人工の変異体を含む、そのような配列の全てを含むものとする。且つ、VEGFR2タンパク質の配列断片が記載される場合、それはまた、その天然又は人工変異体の対応する配列断片を含む。本発明の一実施態様において、VEGFR2の細胞外断片VEGFR2-ECDのアミノ酸配列は、配列番号34で示される（766個のアミノ酸）。
本明細書で使用されるように、特に明記しない限り、上記VEGFRはVEGFR1及び/又はVEGFR2であり、その具体的なタンパク質配列は従来技術において既知の配列であり、従来の文献又はGenBankに開示された配列を参照することができる。例えば、VEGFR1（VEGFR1, NCBI Gene ID: 2321）、VEGFR2（VEGFR2, NCBI Gene ID: 3791）。
本明細書で使用されるように、PD-1タンパク質（Programmed cell death protein 1）のアミノ酸配列に言及する場合、これには、PD-1タンパク質（NCBI GenBank: NP_005009.2）の全長、又はPD-1の細胞外断片PD-1ECD又はPD-1ECDを含む断片を含むが、これらに限定されず、PD-1ECDの融合タンパク質、例えば、マウス又はヒトIgGのFcタンパク質断片（mFc又はhFc）と融合する断片を更に含む。しかしながら、、PD-1タンパク質のアミノ酸配列において、変異又はバリアント（置換、欠失及び/又は付加が含まれるが、これらに限定されない）は、その生物学的機能に影響を及ぼすことなく、天然に生成され得るか、又は人工的に導入され得ることが、当業者には理解される。したがって、本発明において、用語「PD-1タンパク質」は、その天然又は人工の変異体を含む、そのような配列の全てを含むものとする。且つ、PD-1タンパク質の配列断片が記載される場合、それはまた、その天然又は人工変異体の対応する配列断片を含む。
本明細書で使用されるように、用語EC50は、最大効果の50%をもたらすことができる濃度を指す、半最大効果濃度（concentration for 50% of maximal effect）を指す。
本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、一般に2つの対のポリペプチド鎖（各対が1つの「軽」（L）鎖及び1つの「重」（H）鎖を有する）からなる免疫グロブリン分子を指す。一般の意味で、重鎖は抗体中の比較的分子量の大きいポリペプチド鎖を意味し、軽鎖は抗体中の比較的分子量の小さいポリペプチド鎖を意味すると理解される。軽鎖は、κ及びλ軽鎖に分類することができる。重鎖は通常、μ、δ、γ、α又はεに分けられ、且つ抗体のアイソタイプは、それぞれ、IgM、IgD、IgG、IgA及びIgEと定義される。軽鎖と重鎖では、可変領域と定常領域は、約12個又はそれ以上のアミノ酸の「J」領域を通じて連結され、重鎖はまた約3個又はそれ以上のアミノ酸の「D」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（VH）及び重鎖定常領域（CH）からなる。重鎖定常領域は、3つのドメイン（CH1、CH2及びCH3）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（VL）及び軽鎖定常領域（CL）からなる。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLからなる。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織又は因子（免疫系の各細胞（例えば、エフェクター細胞）と古典的補体系の第一成分（C1q）を含む）への結合を媒介することができる。VH及びVL領域は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれるより保存された領域が散在する、高可変性を有する領域（相補性決定領域(CDR)と呼ばれる）に細分することもできる。各VH及びVLは、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順でアミノ基端末からカルボキシル基端末まで配列された3つのCDR及び4つのFRからなる。各重鎖/軽鎖対の可変領域（VH及びVL）は、それぞれ抗体結合部位を形成する。各領域又はドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest （ National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991) ）、又はChothia & Lesk J. Mol. Biol. 196(1987):901-917; Chothia et al. Nature 342(1989): 878-883又はIMGT番号付けシステムに従って定義され、Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas, and Marie-Paule Lefranc. "IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF." Nucleic acids research 38.suppl_1 (2009): D301-D307.の定義を参照する。特に、重鎖は、3個を超えるCDR、例えば6、9、又は12個を含むこともできる。例えば、本発明の二重特異性抗体において、重鎖は、IgG抗体の重鎖のC末端が別の抗体に接続されたscFvであることができ、この場合、重鎖は9つのCDRを含む。用語「抗体」は、抗体を産生する任意の特定の方法によって限定されない。例えば、これには、特に、組換え抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体が含まれる。抗体は、異なるアイソタイプの抗体であってもよく、例えば、IgG（例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4サブタイプ）、IgA1、IgA2、IgD、IgE又はIgM抗体である。
本明細書で使用されるように、抗体の「抗原結合断片」という用語は、完全長抗体の断片を含むポリペプチドを指し、完全長抗体が結合する同じ抗原に特異的に結合する能力を維持し、及び/又は抗原への特異的結合について完全長抗体と競合し、これは「抗原結合部分」とも呼ばれる。通常、Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 第2版，Raven Press, N.Y. (1989)を参照する。抗体の抗原結合断片は、組換えDNA技術によって、又は完全抗体の酵素的若しくは化学的切断方法によって産生することができる。場合によっては、抗原結合断片は、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb及び相補性決定領域（CDR）断片、一本鎖抗体（例えば、scFv）、キメラ抗体、ダイアボディ（diabody）、並びにポリペプチドに特異的な抗原結合能を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を有するポリペプチドを含む。
本明細書で使用する場合、用語「Fd断片」は、VH及びCH1ドメインからなる抗体断片を意味し、用語「Fv断片」は、抗体の単一アームVL及びVHドメインからなる抗体断片を意味し、用語「dAb断片」は、VHドメインからなる抗体断片を意味し（Ward ら、Nature 341 (1989):544-546）、用語「Fab断片」は、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる抗体断片を意味し、用語「F(ab')2断片」は、ヒンジ領域上のジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む抗体断片を意味する。
幾つかの場合において、抗体の抗原結合断片は、VL及びVHドメインが、単一のポリペプチド鎖として産生されることを可能にするリンカーの対を形成することによって一価分子を形成する一本鎖抗体（例えば、scFv）である（例えば、Birdら、Science 242 (1988):423-426及びHustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988):5879-5883を参照する）。そのようなscFv分子は、NH2-VL-リンカー-VH-COOH又はNH2-VH-リンカー-VL-COOHという一般的な構造を有することができる。適切な先行技術のリンカーは、GGGGSのアミノ酸配列の反復配列又はその変異体からなる。例えば、アミノ酸配列（GGGGS）4を有するリンカーを用いることができるが、その変異体を用いることもできる（Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993): 6444-6448）。本発明において有用な他のリンカーは、Alfthan et al.，Protein Eng. 8 (1995):725-731，Choi et al. ，Eur. J. Immunol. 31 (2001): 94-106，Hu et al.，Cancer Res. 56 (1996):3055-3061，Kipriyanov et al.，J. Mol. Biol. 293 (1999):41-56及びRoovers et al.，Cancer Immunol. (2001)によって記載される。
場合によって、抗体の抗原結合断片は、二重抗体、即ち、VH及びVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖の2つのドメイン間での対合を可能にしないほど短いリンカーを使用し、それによりドメインが別の鎖の相補的ドメインと対合して2つの抗原結合部位を生成することを強要する二価抗体である（例えば、Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993):6444-6448，及びPoljak R. J. et al., Structure 2 (1994):1121-1123を参照する）。
抗体の抗原結合断片（例えば、上記の抗体断片）は、当業者に公知の従来の技術（例えば、組換えDNA技術又は酵素的若しくは化学的切断）を使用して所与の抗体から得ることができ、完全な抗体と同じ方法で、抗体の抗原結合断片について特異的にスクリーニングすることができる。
本明細書において、用語「抗体」を指す場合、文脈上明白に示されない限り、完全な抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片も含む。
本明細書で使用されるように、用語「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体」は、抗体分子の高度に相同な集団からの抗体又は抗体の断片を指し、即ち、自然発生し得る自然突然変異を除いて、完全に同一の抗体分子の集団を指す。モノクローナル抗体は、抗原上の単一エピトープに対する高い特異性を有する。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と比較して、一般的には、抗原上の異なるエピトープを一般的に認識する少なくとも2つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は、一般的に、Kohlerらによって初めて報告されたハイブリドーマ技術（Nature, 256:495,1975）を用いて得ることができるが、組換えDNA技術（例えば、U.S. Patent 4,816,567を参照する）を用いても得ることができる。
本明細書で使用されるように、用語「キメラ抗体」は、軽鎖又は/及び重鎖の一部が、ある特定の種に由来してもよく、又はある特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属してもよい1つの抗体に由来し、軽鎖又は/及び重鎖の別の一部が、同じ又は異なる種に由来してもよく、又は同じ又は異なる抗体クラス若しくはサブクラスに属してもよい別の抗体に由来するが、いずれにせよ、標的抗原に対する結合活性を保持する抗体を指す（U.S. Patent 4,816,567 Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984):6851-6855）。
本明細書で使用されるように、用語「ヒト化抗体」は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）のCDR領域の全て又は一部が、非ヒト抗体（ドナー抗体）のCDR領域で置換された後に得られる抗体又は抗体断片を指し、そのうち、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性又は反応性を有する非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット又はウサギ）であり得る。更に、レセプター抗体のフレームワーク領域（FR）の幾つかのアミノ酸残基はまた、抗体の性能を更に改良又は最適化するために、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基又は他の抗体のアミノ酸残基と置換され得る。ヒト化抗体のさらなる詳細については、例えば、Jones et al., Nature, 321 (1986):522-525; Reichmann et al., Nature, (1988) 332:323 329; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2 (1992):593-596;及びClark, Immunol. Today 21 (2000): 397-402を参照することができる。
本明細書で使用されるように、用語「エピトープ」とは、抗原における免疫グロブリン又は抗体と特異的に結合する部位である。「エピトープ」は、当技術分野において「抗原決定基」とも呼ばれる。エピトープ又は抗原決定基は、一般的には、分子の化学的に活性な表面基、例えば、アミノ酸若しくは炭水化物又は糖側鎖からなり、一般的には、特定の3次元構造的特徴及び特定の電荷特徴を有する。例えば、エピトープは、一般に、独特な空間立体配座として少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個又は15個の連続又は非連続のアミノ酸を含み、「線状」エピトープ又は「立体配座」エピトープであってもよい。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照する。線状エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）の間における全ての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に存在する。立体配座エピトープでは、相互作用部位が、互いに分離したタンパク質のアミノ酸残基に跨って存在している。
本明細書で使用されるように、「分離する」又は「分離される」という用語は、天然の状態から手作業で得られることを指す。特定の「分離」物質又は成分が自然界に存在する場合、それが存在する自然環境が変化したか、又は自然環境から物質が分離されたか、又はその両方である可能性がある。例えば、天然に存在する分離されていないポリヌクレオチド又はポリペプチドは、動物の生体内で天然に存在し、そのような天然の状態から分離された、同じポリヌクレオチド又はポリペプチドの高純度のものは、分離と呼ばれる。用語「分離する」又は「分離される」は、人工物質又は合成物質の混合物を排除するものではなく、また、物質の活性に影響を及ぼしない他の不純物の存在を排除するものでもない。
本明細書で使用されるように、用語「ベクター（vector）」は、ポリヌクレオチドが挿入され得る核酸ビークルを指す。ベクターは、挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入又はトランスフェクションによって宿主細胞に導入され、それが保持する遺伝物質エレメントを宿主細胞において発現させることができる。ベクターは当業者に周知であり、限定されるものではないが、プラスミド、ファージミド、コックスプラスミド、人工染色体、例えば酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、又はP1由来人工染色体（PAC）などの人工染色体、バクテリオファージ、例えばラムダファージ又はM13ファージ、及び動物ウイルスなどが挙げられる。ベクターとして有用な動物ウイルスには、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パピローマバキュロウイルス（SV40など）が含まれるが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、及びレポーター遺伝子を含むが、これらに限定されず、複数の発現制御エレメントを含み得る。また、ベクターは、複製開始部位を含んでいてもよい。
本明細書で使用されるように、用語「宿主細胞」は、ベクターの導入に有用な細胞を指し、大腸菌又は枯草菌などの原核細胞、酵母細胞又はアスペルギルスなどの真菌細胞、S2ショウジョウバエ細胞又はSf9などの昆虫細胞、又は線維芽細胞、CHO細胞、COS細胞、NSO細胞、HeLa細胞、BHK細胞、HEK 293細胞又はヒト細胞などの動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるように、用語「特異的結合」は、2つの分子間の非ランダム結合反応、例えば、抗体と、それが向けられる抗原との間の反応を指す。ある実施形態において、抗原に特異的に結合する抗体（又は抗原に対して特異性を有する抗体）とは、抗体が約10-5 M未満、例えば、約10-6 M未満、約10-7 M未満、約10-8 M未満、約10-9 M未満、約10-10 M未満又はそれ以下の親和性（KD）で当該抗原に結合することを指す。本発明の幾つかの態様において、用語「標的」は、特異的結合を指す。
本明細書で使用されるように、用語「KD」は、抗体と抗原との間の結合親和性を記述するために使用される、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指す。平衡解離定数が小さいほど、抗体-抗原結合がより密であり、抗体と抗原との間の親和性がより高い。一般的には、抗体は、例えば、BIACORE装置又はFortebio分子相互作用装置での表面プラズモン共鳴（SPR）を使用して決定されるように、約10-5 M未満、例えば、約10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M又は10-10 M未満、又はそれ未満の解離平衡定数（KD）で抗原に結合する。
本明細書で使用されるように、用語「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体」は、同じ意味を有し、交換可能に使用され、用語「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体」は、同じ意味を有し、交換可能に使用され、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同じ意味を有し、交換可能に使用される。また、本発明において、アミノ酸は、当該技術分野において周知の略号、略号の単語で通常表される。例えば、アラニンはA又はAlaで表すことができる。
本明細書で使用されるように、用語「薬学的に許容される賦形剤」は、対象及び有効成分と薬理学的及び/又は生理学的に適合性があり、当技術分野で周知であるベクター及び/又は賦形剤を指し（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照する）、pH調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤が含まれるが、これらに限定されない。例えば、pH調整剤は、リン酸緩衝液を含むが、これに限定されず、界面活性剤は、Tween（登録商標）-80などのカチオン性、アニオン性又は非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されず、イオン強度増強剤は、塩化ナトリウムを含むが、これに限定されない。
本明細書で使用されるように、用語「アジュバント」は、抗原と共に又は抗原と共に生体に予め送達される場合、抗原に対する生体の免疫応答を増強するか、又は免疫応答の種類を変更することができる非特異的免疫増強剤を指す。アジュバントには、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント）、ブレビス、リポ多糖、サイトカインなどが含まれるが、これらに限定されない。フロイントアジュバントは、現在の動物試験において最も一般的に使用されるアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床実験においてより多く使用されている。
本明細書で使用されるように、用語「有効量」は、所望の効果を達成するのに、又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、PD-1がPD-L1に結合するか、又はVEGF発現が高すぎることに関連する疾患、例えば、腫瘍）を予防する、阻止する、又はその発生を遅延させるのに十分な量を意味し、疾患を治療するのに有効な量とは、疾患及びその合併症を、疾患に罹患している患者において治癒又は少なくとも部分的に予防するのに十分な量を指す。そのような有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。例えば、治療的使用に有効な量は、治療される疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、年齢、体重、性別などの患者の一般的な状況、薬物の投与様式、及び同時に投与される他の治療などに依存する。
本発明は下記（1）～（6）の技術的効果のいずれか1つ又は複数を達成する。
（1）本発明の抗体のFc末端の改変は、VP101（hG1WT）とFC受容体FcγRI、FcγRIIIa_F158との結合活性を完全に除去し、更にADCC活性を完全に除去する。
（2）抗体のFc末端の改変は、VP101（hG1WT）と補体C1qとの結合活性を完全に排除し、更にCDC活性を完全に排除する。
（3）本発明の二重特異性抗体は、VEGFAに特異的に結合することができ、VEGFAとVEGFR2との結合を非常に効果的に遮断し、VEGFAによる生体免疫阻害及び血管形成促進作用を特異的に解除することができる。
（4）本発明の二重特異性抗体は、PD-1に特異的に結合することができ、PD-1とPD-L1との結合を非常に効果的に遮断し、PD-1による生体免疫阻害を特異的に解除し、免疫反応を活性化することができる。
（5）PARPiと本発明の二重特異性抗体との併用投与は、腫瘍、特に乳腺癌又は卵巣癌に対する治療効果が、PARPi又は二重特異性抗体単独投与よりも著しく優れている。
（6）PARPiと本発明の二重特異性抗体との間に相乗効果があり、腫瘍の治療又は予防の相乗効果が得られる。
VP101（hG1DM）とFcγRIとの親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.12 nMである。 ベバシズマブとFcγRIとの親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.12 nMである。 ニボルマブとFcγRIとの親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.12 nMである。 VP101（hG1WT）とFcγRIとの親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.12 nMである。 VP101（hG4WT）とFcγRIとの親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.12 nMである。 VP101（hG1DM）とFcγRIIa_H131との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nMである。 ベバシズマブとFcγRIIa_H131との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nMである。 ニボルマブとFcγRIIa_H131との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nMである。 VP101（hG1WT）とFcγRIIa_H131との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nMである。 VP101（hG4WT）とFcγRIIa_H131との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nMである。 VP101（hG1DM）とFcγRIIa_R131との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nMである。 ベバシズマブとFcγRIIa_R131との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nMである。 ニボルマブとFcγRIIa_R131との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nMである。 VP101（hG1WT）とFcγRIIa_R131との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nMである。 VP101（hG4WT）とFcγRIIa_R131との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nMである。 VP101（hG1DM）とFcγRIIIa_V158との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nMである。 ベバシズマブとFcγRIIIa_V158との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nMである。 ニボルマブとFcγRIIIa_V158との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nMである。 VP101（hG1WT）とFcγRIIIa_V158との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nMである。 VP101（hG4WT）とFcγRIIIa_V158との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nMである。 VP101（hG1DM）とFcγRIIIa_F158との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗原添加濃度はそれぞれ500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nMであるである。 ベバシズマブとFcγRIIIa_F158との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nMである。 ニボルマブとFcγRIIIa_F158との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nMである。 VP101（hG1WT）とFcγRIIIa_F158との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nMである。 VP101（hG4WT）とFcγRIIa_F158との親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nMである。 VP101（hG1DM）とC1qとの親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ10 nM、5 nM、2.5 nM、1.25 nM、0.625 nMである。 ベバシズマブとC1qとの親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ10 nM、5 nM、2.5 nM、1.25 nM、0.625 nMである。 ニボルマブとC1qとの親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ10 nM、5 nM、2.5 nM、1.25 nM、0.625 nMである。 VP101（hG1WT）とC1qとの親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗体添加濃度はそれぞれ10 nM、5 nM、2.5 nM、1.25 nM、0.625 nMである。 VP101（hG4WT）とC1qとの親和性定数検出結果図である。図の上から下の各対の曲線における抗原添加濃度はそれぞれ10 nM、5 nM、2.5 nM、1.25 nM、0.625 nMである。 PD-1抗原を発現するCHO-K1-PD1標的細胞系におけるVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）のADCC活性検出結果である。 PD-1抗原を発現するCHO-K1-PD1標的細胞系におけるVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）のCDC活性検出結果である。 PBMC、Raji-PDL1細胞混合培養により誘導されたサイトカインIFN-γの分泌に対する抗体VP101（hG1DM）の影響をELISA法により検出する。 PBMC、Raji-PDL1細胞混合培養により誘導されたサイトカインIL-2の分泌に対する抗体VP101（hG1DM）の影響をELISA法により検出する。 PD-1抗原を発現するCHO-K1-PD1標的細胞系におけるVP101（hG1DM）のADCP活性検出結果である。 乳パッド腫瘍移植モデルにおけるVP101（hG1DM）による乳腺癌腫瘍細胞増殖活性阻害の結果である。 PARPiとVP101（hG1DM）との併用による卵巣癌細胞の遊走阻害の結果である。 PARPiとVP101（hG1DM）との併用による乳腺癌皮下移植腫瘍モデルにおけるマウス皮下移植腫瘍体積に対する効果である。 PARPiとVP101（hG1DM）との併用による乳腺癌皮下移植腫瘍モデルにおけるマウス体重に対する効果である。 PARPiとVP101（hG1DM）との併用による卵巣癌皮下移植腫瘍モデルにおけるマウス皮下移植腫瘍体積に対する効果である。 PARPiとVP101（hG1DM）との併用による卵巣癌皮下移植腫瘍モデルにおけるマウス体重に対する効果である。
以下、実施例を参照しながら本発明の実施形態を詳細に説明する。当業者であれば、以下の実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではないと理解すべきである。実施例に具体的な技術又は条件が記載されていない場合、本分野の文献に記載された技術又は条件（例えばJ.サムブルックら著、黄培堂ら訳の『分子クローニング実験指針』、第3版、科学出版社を参照）に従って、又は製品の説明書に従って行われる。使用される試薬又は機器は、生産メーカーが明記されていない場合、いずれも市販されている一般的な製品であってもよい。
本発明の以下の実施例では、使用される同標的市販薬抗体ベバシズマブ（商品名Avastin（登録商標））を対照抗体とし、ロシュ株式会社Rocheから購入し、又は製造例1を参照して製造することができる。
本発明の以下の実施例では、使用される同標的市販薬抗体ニボルマブ（商品名Opdivo（登録商標））を対照抗体とし、ブリストルマイヤーズスクイブ社BMSから購入した。
本発明の以下の実施例では、使用されるPARP阻害剤オラパリブ（Olaparib）は、selleckchem社から購入した。
本発明の以下の実施例では、使用されるアイソタイプ対照抗体は、ヒト抗ニワトリ鶏卵リゾチーム（human anti-Hen Egg Lysozyme IgG、anti-HEL、即ちhuman IgG、略称hIgG）であり、その可変領域配列は、Aciernoらにより発表されたAffinity maturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies（Aciernoら. J Mol Biol. 2007; 374(1):130-46.）に由来する。実施例で使用されるhIgG1DM及びhIgG4WTは、即ちanti-HELにhG1DM及びhG4WT定常領域配列を有するアイソタイプ対照抗体であり、中山康方生物医薬有限公司の実験室で製造されたものである。
本発明の以下の実施例では、使用される乳腺癌細胞MDA-MB-231、SNU-251卵巣癌細胞及びSK-OV-3細胞には、いずれもBRCA1変異及びBRCA2変異が存在する。
製造例1：抗VEGFAの抗体ベバシズマブの製造
市販されている抗VEGFAモノクローナルAvastin（ベバシズマブ）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、中国特許公開CN1259962Aを参照されたい。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列はジェンスクリプト社へ合成委託した。
ベバシズマブ重鎖可変領域（ベバシズマブ-Hv）のアミノ酸配列：（123 aa）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS（配列番号1）
ベバシズマブ重鎖可変領域をコードする核酸配列：（369 bp）
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGC（配列番号2）
ベバシズマブ軽鎖可変領域（ベバシズマブ-Lv）のアミノ酸配列：（107 aa）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIK（配列番号3）
ベバシズマブ軽鎖可変領域をコードする核酸配列：（321 bp）
GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCATCACATGCAGTGCTTCACAGGATATTTCCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGAAAAGCACCCAAGGTGCTGATCTACTTCACTAGCTCCCTGCACTCAGGAGTGCCAAGCCGGTTCAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTTTACTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTATTCTACCGTGCCATGGACATTTGGCCAGGGGACTAAAGTCGAGATCAAG（配列番号4）
重鎖定常領域はいずれもIg gamma-1 chain C region，アクセッション番号:P01857を採用し、軽鎖定常領域はいずれもIg kappa chain C region，アクセッション番号:P01834を採用した。
ベバシズマブの重鎖cDNA及び軽鎖のcDNAをそれぞれpcDNA3.1ベクターにクローニングし、抗体ベバシズマブの組換え発現プラスミドを得た。組換えプラスミドを293F細胞にトランスフェクションした。293F細胞培養液を精製した後に検出を行った。
抗VEGFAモノクローナルAvastin（ベバシズマブ）を製造した。
製造例2：抗PD-1の抗体14C12、そのヒト化抗体14C12H1L1及び変異体14C12H1L1（M）の配列設計
抗PD-1の抗体14C12及びそのヒト化抗体14C12H1L1の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列、並びにコード核酸配列は、それぞれ中国特許公開CN106967172Aの14C12、14C12H1L1と同じである。
（1）14C12の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列
14C12の重鎖可変領域のアミノ酸配列：（118 aa）
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSA（配列番号5）
14C12の重鎖可変領域をコードする核酸配列：（354 bp）
GAGGTCAAACTGGTGGAGAGCGGCGGCGGGCTGGTGAAGCCCGGCGGGTCACTGAAACTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCATGGGTGAGGCAGACCCCTGAGAAGCGCCTGGAATGGGTCGCTACTATCAGCGGAGGCGGGCGATACACCTACTATCCTGACTCTGTCAAAGGGAGATTCACAATTAGTCGGGATAACGCCAGAAATACTCTGTATCTGCAGATGTCTAGTCTGCGGTCCGAGGATACAGCTCTGTACTATTGTGCAAACCGGTACGGCGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCTGCC（配列番号6）
14C12の軽鎖可変領域のアミノ酸配列：（107 aa）
DIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK（配列番号7）
14C12の軽鎖可変領域をコードする核酸配列：（321 bp）
GACATTAAGATGACACAGTCCCCTTCCTCAATGTACGCTAGCCTGGGCGAGCGAGTGACCTTCACATGCAAAGCATCCCAGGACATCAACACATACCTGTCTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAAAGCCCCAAGACCCTGATCTACCGGGCCAATAGACTGGTGGACGGGGTCCCCAGCAGATTCTCCGGATCTGGCAGTGGGCAGGATTACTCCCTGACCATCAGCTCCCTGGAGTATGAAGACATGGGCATCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCTCTGACCTTTGGAGCAGGCACAAAACTGGAACTGAAG（配列番号8）
（2）ヒト化モノクローナル抗体14C12H1L1の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列、重鎖配列及び軽鎖配列
14C12H1L1重鎖可変領域のアミノ酸配列：（118 aa）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号9）
14C12H1L1重鎖可変領域をコードする核酸配列：（354 bp）
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT （配列番号10）
14C12H1L1軽鎖可変領域のアミノ酸配列：（107 aa）
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK（配列番号11）
14C12H1L1軽鎖可変領域をコードする核酸配列：（321 bp）
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAG（配列番号12）
14C12H1L1重鎖（14C12H1）のアミノ酸配列：（448 aa）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号13）
14C12H1L1重鎖（14C12H1）をコードする核酸配列：（1344 bp）
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGTGCCAGCACCAAAGGACCTAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGAACTCCTCGGAGGCCCTAGCGTCTTCCTCTTTCCTCCCAAACCCAAGGACACCCTCATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTCACCTGTGTCGTCGTGGATGTCAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTATGTCGATGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCTCTCCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCTCCCTCCAGGGACGAACTCACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCTGTCCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAAGCCCTCCACAACCACTACACCCAGAAAAGCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAA（配列番号14）
14C12H1L1軽鎖（14C12L1）のアミノ酸配列：（214 aa）
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号15）
14C12H1L1軽鎖（14C12L1）をコードする核酸配列：（642 bp）
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAGCGAACTGTGGCCGCTCCCTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGCACAGCCAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCTAGAGAGGCAAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCCCTGCAGTCCGGCAACAGCCAGGAGAGTGTGACTGAACAGGACTCAAAAGATAGCACCTATTCCCTGTCTAGTACACTGACTCTGTCCAAGGCTGATTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCATGCGAAGTGACACATCAGGGACTGTCAAGCCCCGTGACTAAGTCTTTTAACCGGGGCGAATGT（配列番号16）
（3）14C12H1L1（M）の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列
14C12H1L1を基にその骨格領域（軽鎖）の個別アミノ酸を変異させて14C12H1L1（M）を得た。
14C12H1L1（M）の重鎖可変領域14C12H1（M）：
14C12H1L1の重鎖可変領域14C12H1と同じであり、即ちアミノ酸配列は配列番号9で示される。
14C12H1L1（M）の軽鎖可変領域14C12L1（M）：（108 aa、14C12H1L1に基づくアミノ酸配列の変異部位は下線で示されている）
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELKR（配列番号17）
製造例3：二重特異性抗体の配列設計
1.配列設計
本発明における二重特異性抗体の構造モードは、Morrisonモード（IgG-scFv）に属し、即ち一方のIgG抗体の2本の重鎖のC末端に他方の抗体のscFv断片が接続されており、その重鎖及び軽鎖の主な組成設計は下記の表1の通りである。
上記ベバシズマブに加えて、上記14C12H1L1（M）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をscFv断片部分とするVP101抗体は、VP101（M）と呼ばれる。14C12H1L1に対して、14C12H1L1（M）は、二重特異性抗体の構造を効果的に最適化し、その有効性を向上させる。
Figure 2024509018000002
上記表1において:
（1）右下隅に「V」と表記されている場合、対応する重鎖の可変領域又は対応する軽鎖の可変領域を指す。「V」と表記されていない場合、対応する重鎖又は軽鎖は定常領域を含む全長である。これらの可変領域又は全長のアミノ酸配列及びそのコード核酸配列はいずれも上記製造例に記載の対応する配列を参照されたい。
（2）リンカー1のアミノ酸配列：GGGGSGGGGSGGGGSG
GGGS（配列番号18）
選択的に、アミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号19）を前述リンカー1に代わるリンカー 2として用いることができる。
（3）ベバシズマブ-HはIg gamma-1 chain C region，アクセッション番号:P01857を重鎖定常領域として採用した。
（4）ベバシズマブ-G4HはIg gamma-4 chain C region，アクセッション番号:P01861.1を重鎖定常領域として採用した。
2. 抗体VP101（M）の発現及び精製
それぞれVP101（M）の重鎖cDNA配列及び軽鎖のcDNA配列をpUC57simple（ジェンスクリプト社提供）ベクターにクローニングし、それぞれpUC57simple-VP101H及びpUC57simple-VP101Lプラスミドを得た。
それぞれプラスミドpUC57simple-VP101H及びpUC57simple-VP101Lを酵素切断（HindIII&EcoRI）し、電気泳動により回収した重鎖軽鎖をそれぞれpcDNA3.1ベクターにサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して293F細胞に共トランスフェクションした。細胞培養7日後、培養液を高速遠心、上清濃縮後にHiTrap MabSelect SuReカラムに供試し、Elution Bufferを用いてタンパク質をワンステップで溶出して目的試料抗体VP101を回収し、且つPBSに交換した。
3. 抗体VP101（M）の検出
精製された試料にそれぞれ還元型タンパク質電気泳動供試緩衝液及び非還元型タンパク質電気泳動供試緩衝液を加え、煮沸した後にSDS－PAGE電気泳動検出を行った。
製造例4における変異後の抗体と区別するために、本発明ではVP101（M）をVP101（hG1WT）とも呼ぶ。上述したVP101 （M）は「野生型」として、Ig gamma-1 chain C region，アクセッション番号:P01857を重鎖定常領域として採用し、Ig kappa chain C region，アクセッション番号:P01834を軽鎖定常領域として採用した。
VP101（hG1WT）における免疫グロブリン部分の重鎖のアミノ酸配列：（453aa）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号20）
VP101（hG1WT）における免疫グロブリン部分の重鎖をコードする核酸配列：（1359bp）
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGCGCAAGCACCAAAGGGCCCAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGAACTCCTCGGAGGCCCTAGCGTCTTCCTCTTTCCTCCCAAACCCAAGGACACCCTCATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTCACCTGTGTCGTCGTGGATGTCAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTATGTCGATGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCTCTCCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCTCCCTCCAGGGACGAACTCACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCTGTCCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAACTGACCGTCGATAAATCTAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCATGAAGCACTGCACAACCATTATACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAG（配列番号21）
製造例4における変異後の抗体と区別するために、本発明ではVP101（G4M）をVP101（hG4WT）とも呼ぶ。上述したVP101 （G4M） は「野生型」として、Ig gamma-4 chain C region，アクセッション番号:P01861.1を重鎖定常領域として採用し、Ig kappa chain C region，アクセッション番号:P01834を軽鎖定常領域として採用した。
VP101 （hG4WT） における免疫グロブリン部分の重鎖のアミノ酸配列：（450aa）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号22）
VP101 （hG4WT） における免疫グロブリン部分の重鎖をコードする核酸配列：（1350bp）
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGCGCAAGCACCAAAGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCTCTGAGCCTGTCCCTCGGCAAG（配列番号23）
製造例4：ヒト化二重特異性抗体VP101（hG1WT）に基づく非可変領域アミノ酸変異設計
本発明者らは、製造例3で得られたVP101（hG1WT）の上で、その重鎖の第234位にロイシンからアラニンへの点変異（L234A）を導入し、第235位にロイシンからアラニンへの点変異（L235A）を導入することにより、VP101（hG1DM）を得た。
VP101（hG1DM）における免疫グロブリン部分の重鎖のアミノ酸配列：（453 aa、変異部位は下線で示されている）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号24）
VP101（hG1DM）における免疫グロブリン部分の重鎖をコードする核酸配列：（1359 bp、変異部位は下線で示されている）
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGCGCAAGCACCAAAGGGCCCAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGAAGCTGCTGGAGGCCCTAGCGTCTTCCTCTTTCCTCCCAAACCCAAGGACACCCTCATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTCACCTGTGTCGTCGTGGATGTCAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTATGTCGATGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCTCTCCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCTCCCTCCAGGGACGAACTCACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCTGTCCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAACTGACCGTCGATAAATCTAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCATGAAGCACTGCACAACCATTATACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAG（配列番号25）
VP101（hG1DM）、VP101（hG1WT）及びVP101（hG4WT）の免疫グロブリン部分の軽鎖アミノ酸配列は同じであり、そのコード核酸配列も同じである。
VP101（hG1DM）における免疫グロブリン部分の軽鎖のアミノ酸配列：（214 aa）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号26）
VP101（hG1DM）における免疫グロブリン部分の軽鎖をコードする核酸配列：（642 bp）
GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCATCACATGCAGTGCTTCACAGGATATTTCCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGAAAAGCACCCAAGGTGCTGATCTACTTCACTAGCTCCCTGCACTCAGGAGTGCCAAGCCGGTTCAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTTTACTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTATTCTACCGTGCCATGGACATTTGGCCAGGGGACTAAAGTCGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCAGTGTCTTCATTTTTCCCCCTAGCGACGAACAGCTGAAATCCGGGACAGCCTCTGTGGTCTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTAGAGAGGCAAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCCCTGCAGAGTGGCAATTCACAGGAGAGCGTGACAGAACAGGACTCCAAAGATTCTACTTATAGTCTGTCAAGCACACTGACTCTGAGCAAGGCTGACTACGAAAAGCATAAAGTGTATGCATGTGAGGTCACCCACCAGGGGCTGAGCAGTCCAGTCACCAAGTCATTCAACAGAGGCGAGTGC（配列番号27）
実施例1：FcγRIとVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）との親和性定数測定
Fc受容体FcγRI（別名CD64）はIgG抗体のFc末端に結合し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）に関与することができる。Fc受容体に結合する治療用モノクローナル抗体の能力は、当該抗体の安全性及び有効性に影響を及ぼす。
本実験ではFortebio Octet分子相互作用装置を用いてVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）とFcγRIとの親和性定数を測定し、各抗体のADCC活性を評価した。
Fortebio Octet分子相互作用装置による対応する抗体とFcγRIとの親和性定数の検出実験方法を簡単に説明すると、以下の通りである：試料希釈緩衝液はPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.1%BSA、pH7.4であった。1 μg/mLのFcγRIaをHIS1Kセンサに固定し、時間が50 sであり、センサを緩衝液中で60 s平衡化し、センサに固定されたCD64が各抗体に結合し、抗体濃度が3.12～50 nM（2倍希釈）であり、時間が120 sであり、抗体が緩衝液中で解離し、時間が120 sであった。センサは10 mMグリシンを用い、pH1.5で再生し、時間が5 sであり、4回繰り返した。検出温度は30℃、周波数は0.3 Hzであった。データを1:1モデルでフィッティングして分析し、親和性定数を得た。
FcγRIとVP101（hG1WT）、VP101（hG4WT）及びVP101（hG1DM）並びに対照抗体ニボルマブ、ベバシズマブの親和性定数測定結果を表1及び図1～図5に示す。
Figure 2024509018000003
N/Aは、抗体と抗原が結合していないか、結合シグナルが極めて低いことを示し、結果を分析していないため、対応するデータが得られなかった。
結果により、VP101（hG1WT）はFcγRIに結合することができ、親和性定数は3.95E-09Mであり、VP101（hG4WT）はFcγRIに結合することができ、親和性定数は8.52E-09Mであり、ベバシズマブはFcγRIに結合することができ、親和性定数は3.68E-09Mであり、ニボルマブはFcγRIに結合することができ、親和性定数は6.20E-09Mであることを示すが、VP101（hG1DM）はFcγRIに結合していないか、結合シグナルが極めて低く、結果を分析していないため、対応するデータが得られなかった。
結果により、VP101（hG1DM）がFcγRIに結合しなかった以外は、他の抗体とFcγRIとの親和性がいずれも近いことが明らかになる。VP101（hG1DM）の結合活性は効果的に除去された。
実施例2：FcγRIIa_H131とVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）との親和性定数測定
Fc受容体FcγRIIa_H131（別名CD32a_H131）は、IgG抗体のFc末端に結合し、ADCCを媒介することができる。
本実験ではFortebio Octet分子相互作用装置を用いてVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）とFcγRIIa_H131との親和性定数を測定し、各抗体のADCC活性を評価した。
Fortebio Octet分子相互作用装置によるVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）とFcγRIIa_H131との親和性定数の検出実験方法を簡単に説明すると、以下の通りである：固定化希釈液はPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.1%BSA、pH7.4であり、分析物希釈緩衝液はPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.02%casein、0.1%BSA、pH7.4であった。5 μg/mLのFcγRIIa_H131をNTAセンサに固定し、固定時間が60 sであり、センサをPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.02%casein、0.1%BSA、pH7.4緩衝液中で600 s平衡化してセンサをブロックし、センサに固定されたFcγRIIa_H131が抗体に結合し、抗体濃度が12.5～200 nM（2倍勾配希釈）であり、時間が60 sであり、抗体が緩衝液中で解離し、時間が60 sであった。センサは10 mM Glycine、pH1.7及び10 mMの硫酸ニッケルを用いて再生した。検出温度は30℃、周波数は0.6 Hzであった。データを1:1モデルでフィッティングして分析し、親和性定数を得た。
FcγRIIa_H131とVP101（hG1WT）、VP101（hG4WT）及びVP101（hG1DM）並びに対照抗体ニボルマブ、ベバシズマブとの親和性定数測定結果を表2及び図6～図10に示す。
Figure 2024509018000004
N/Aは、抗体と抗原が結合していないか、結合シグナルが極めて低いことを示し、結果を分析していないため、対応するデータが得られなかった。
結果により、VP101（hG1WT）はFcγRIIa_H131に結合することができ、親和性定数は2.28E-08Mであり、VP101（hG4WT）はFcγRIIa_H131に結合することができ、親和性定数は3.68E-08Mであり、ベバシズマブはFcγRIIa_H131に結合することができ、親和性定数は6.44E-08Mであり、VP101（hG1DM）はFcγRIIa_H131に結合することができ、親和性定数は3.57E-08Mであることを示すが、ニボルマブはFcγRIIa_H131に結合していないか、結合シグナルが極めて低く、結果を分析していないため、対応するデータが得られなかった。
結果により、ニボルマブがFcγRIIa_H131に結合しなかったこと以外は、他の抗体がいずれもFcγRIIa_H131に結合し、その親和性は強い順にVP101（hG1WT）、VP101（hG1DM）、VP101（hG4WT）、ベバシズマブであることが明らかになる。
実施例3：FcγRIIa_R131とVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）との親和性定数測定
Fc受容体FcγRIIa_R131（別名CD32a _R131）は、IgG抗体のFc末端に結合し、ADCCを媒介することができる。
本実験ではFortebio Octet分子相互作用装置を用いてVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）とFcγRIIa_R131との親和性定数を測定し、各抗体のADCC活性を評価した。
Fortebio Octet分子相互作用装置によるVP101（hG1WT）とVP101（hG1DM）との親和性定数の検出実験方法を簡単に説明すると、以下の通りである：固定化希釈液はPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.1%BSA、pH7.4であり、分析物希釈緩衝液はPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.02%casein、0.1%BSA、pH7.4であった。5 μg/mLのFcγRIIa_R131をNTAセンサに固定し、固定時間が60 sであり、センサをPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.02%casein、0.1%BSA、pH7.4緩衝液中で600 s平衡化してセンサをブロックし、センサに固定されたFcγRIIa_R131が抗体に結合し、抗体濃度が12.5～200 nM（2倍勾配希釈）であり、時間が60 sであり、抗体が緩衝液中で解離し、時間が60 sであった。センサは10 mM Glycine、pH1.7及び10 mMの硫酸ニッケルを用いて再生した。検出温度は30℃、周波数は0.6 Hzであった。データを1:1モデルでフィッティングして分析し、親和性定数を得た。
FcγRIIa_R131とVP101（hG1WT）、VP101（hG4WT）及びVP101（hG1DM）並びに対照抗体ニボルマブ、ベバシズマブとの親和性定数測定結果を表3及び図11～図15に示す。
Figure 2024509018000005
N/Aは、抗体と抗原が結合していないか、結合シグナルが極めて低いことを示し、結果を分析していないため、対応するデータが得られなかった。
結果により、VP101（hG1WT）はFcγRIIa_R131に結合することができ、親和性定数は2.42E-08Mであり、VP101（hG4WT）はFcγRIIa_R131に結合することができ、親和性定数は3.57E-08 Mであり、ベバシズマブはFcγRIIa_R131に結合することができ、親和性定数は5.16E-08 Mであり、ニボルマブはFcγRIIa_R131に結合することができ、親和性定数は6.93E-08 Mであり、VP101（hG1DM）はFcγRIIa_R131に結合することができ、親和性定数は3.35E-08Mである。
結果により、抗体がいずれもFcγRIIa_R131に結合し、その親和性は強い順にVP101（hG1WT）、VP101（hG1DM）、VP101（hG4WT）、ベバシズマブ、ニボルマブであることが明らかになる。
実施例4：FcγRIIbとVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）との親和性定数測定
Fc受容体FcγRIIb（別名CD32b）はIgG抗体のFc末端に結合し、免疫細胞の機能の調節に関与することができる。
本実験ではFortebio Octet分子相互作用装置を用いてVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）とFcγRIIbとの親和性定数を測定し、VP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）とFc受容体との結合能力を評価した。
Fortebio Octet分子相互作用装置によるVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）とFcγRIIbとの親和性定数の検出実験方法を簡単に説明すると、以下の通りである：固定化希釈液はPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.1%BSA、pH7.4であり、分析物希釈緩衝液はPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.02%casein、0.1%BSA、pH7.4であった。5 μg/mLのhFCGR2B-hisをNTAセンサに固定し、固定時間が60 sであり、センサをPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.02%casein、0.1%BSA、pH7.4緩衝液中で600 s平衡化してセンサをブロックし、センサに固定されたhFCGR2B-hisが抗体に結合し、抗体濃度が12.5～200 nM（2倍勾配希釈）であり、時間が60 sであり、抗体が緩衝液中で解離し、時間が60 sであった。センサは10 mM Glycine、pH1.7及び10 mMの硫酸ニッケルを用いて再生した。検出温度は30℃、周波数は0.6 Hzであった。データを1:1モデルでフィッティングして分析し、親和性定数を得た。
実施例5：FcγRIIIa_V158とVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）との親和性定数測定
Fc受容体FcγRIIIa_V158（別名CD16a_V158）は、IgG抗体のFc末端に結合し、ADCC効果を媒介することができる。
本実験ではFortebio Octet分子相互作用装置を用いてVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）とFcγRIIIa_V158との親和性定数を測定し、各抗体のADCC活性を評価した。
Fortebio Octet分子相互作用装置による対応する抗体とFcγRIIIa_V158との親和性定数の検出実験方法を簡単に説明すると、以下の通りである：試料希釈緩衝液はPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.1%BSA、pH7.4であった。5 μg/mLのFcγRIIIa_V158をHIS1Kセンサに固定し、時間が120 sであり、センサを緩衝液中で60 s平衡化し、センサに固定されたhFcGR3A（V158）-hisが各抗体に結合し、抗体濃度が31.25～500 nM（2倍希釈）であり、時間が60 sであり、抗体が緩衝液中で解離し、時間が60 sであった。センサは10 mMグリシンを用い、pH1.5で再生し、時間が5 sであり、4回繰り返した。検出温度は30℃、周波数は0.3 Hzであった。データを1:1モデルでフィッティングして分析し、親和性定数を得た。
FcγRIIIa_V158とVP101（hG1WT）、VP101（hG4WT）及びVP101（hG1DM）並びに対照抗体ニボルマブ、ベバシズマブとの親和性定数測定結果を表4及び図16～図20に示す。
Figure 2024509018000006
N/Aは、抗体と抗原が結合していないか、結合シグナルが極めて低いことを示し、結果を分析していないため、対応するデータが得られなかった。
結果により、VP101（hG1WT）はFcγRIIIa_V158に結合することができ、親和性定数は4.35E-08Mであり、VP101（hG1DM）はFcγRIIIa_V158に結合することができ、親和性定数は1.34E-07Mであり、ベバシズマブはFcγRIIIa_V158に結合することができ、親和性定数は2.76E-08Mであることを示し、ニボルマブ、VP101（hG4WT）はFcγRIIIa_V158に結合していないか、結合シグナルが極めて低く、結果を分析していないため、対応するデータが得られなかった。
結果により、ニボルマブ、VP101（hG4WT）がFcγRIIIa_V158に結合しなかったこと以外は、他の抗体がいずれもFcγRIIIa_V158に結合し、その親和性は強い順にベバシズマブ、VP101（hG1WT）、VP101（hG1DM）であることが明らかになる。
実施例6：FcγRIIIa_F158とVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）との親和性定数測定
Fc受容体FcγRIIIa_F158（別名CD16a_F158）は、IgG抗体のFc末端に結合し、ADCCを媒介することができる。
本実験ではFortebio Octet分子相互作用装置を用いてVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）とFcγRIIIa_F158との親和性定数を測定し、各抗体のADCC活性を評価した。
Fortebio Octet分子相互作用装置によるVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）とFcγRIIIa_F158との親和性定数の検出実験方法を簡単に説明すると、以下の通りである：試料希釈緩衝液はPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.1%BSA、pH7.4であった。5 μg/mLのFcγRIIIa_F158をHIS1Kセンサに固定し、時間が120 sであり、センサを緩衝液中で60 s平衡化し、センサに固定されたhFcGR3A（F158）-hisが各抗体に結合し、抗体濃度が31.25～500 nM（2倍希釈）であり、時間が60 sであり、抗体が緩衝液中で解離し、時間が60 sであった。センサは10 mMグリシンを用い、pH1.5で再生し、時間が5 sであり、4回繰り返した。検出温度は30℃、周波数は0.3 Hzであった。データを1:1モデルでフィッティングして分析し、親和性定数を得た。
FcγRIIIa_F158とVP101（hG1WT）、VP101（hG4WT）及びVP101（hG1DM）並びに対照抗体ニボルマブ、ベバシズマブとの親和性定数測定結果を表5及び図21～図25に示す。
Figure 2024509018000007
N/Aは、抗体と抗原が結合していないか、結合シグナルが極めて低いことを示し、結果を分析していないため、対応するデータが得られなかった。
結果により、VP101（hG1WT）はFcγRIIIa_F158に結合することができ、親和性定数は7.41E-08Mであり、ベバシズマブはFcγRIIIa_F158に結合することができ、親和性定数は9.32E-08Mであることを示すが、ニボルマブ、VP101（hG4WT）及びVP101（hG1DM）はFcγRIIIa_F158に結合していないか、結合シグナルが極めて低く、結果を分析していないため、対応するデータが得られなかった。
結果により、ニボルマブ、VP101（hG4WT）及びVP101（hG1DM）がFcγRIIIa_F158に結合しなかったこと以外は、他の抗体がいずれもFcγRIIIa_F158に結合し、その親和性は強い順にVP101（hG1WT）、ベバシズマブであることが明らかになる。
実施例7：C1qとVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）との親和性定数測定
血清補体C1qはIgG抗体のFc末端に結合し、CDC効果を媒介することができる。C1qに結合する治療用モノクローナル抗体の能力は、当該抗体の安全性及び有効性に影響を及ぼす。
本実験ではFortebio Octet分子相互作用装置を用いてVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）とC1qとの親和性定数を測定し、各抗体のCDC活性を評価した。
Fortebio Octet分子相互作用装置による対応する抗体とC1qとの親和性定数の検出実験方法を簡単に説明すると、以下の通りである：試料希釈緩衝液はPBS、0.02%Tween（登録商標）-20、0.1%BSA、pH7.4であった。50 μg/mLの抗体をFAB2Gセンサに固定し、固定高さは約2.0 nmであり、センサを緩衝液中で60 s平衡化し、センサに固定された抗体がC1qに結合し、C1q濃度は0.625 nM～10 nM（2倍希釈）であり、時間が60 sであり、抗原抗体が緩衝液中で解離し、時間が60 sであった。センサは10 mMグリシンを用い、pH1.7で再生し、時間が5 sであり、4回繰り返した。試料板振動速度は1000 rpmであり、検出温度は30度であり、検出周波数は0.6 Hzであった。データを1:1モデルでフィッティングして分析し、親和性定数を得た。データ収集ソフトウェアはFortebio Data Acqμisition 7.0、データ分析ソフトウェアはFortebio Data Analysis 7.0であった。
C1qとVP101（hG1WT）、VP101（hG4WT）及びVP101（hG1DM）並びに対照抗体ニボルマブ、ベバシズマブとの親和性定数測定結果を表6及び図26～図30に示す。
Figure 2024509018000008
 N/Aは、抗体と抗原が結合していないか、結合シグナルが極めて低いことを示し、結果を分析していないため、対応するデータが得られなかった。
結果により、VP101（hG1WT）はC1qに結合することができ、親和性定数は9.76E-10Mであり、ベバシズマブはC1qに結合することができ、親和性定数は1.14E-09Mであることを示すが、ニボルマブ、VP101（hG4WT）及びVP101（hG1DM）はC1qに結合していないか、結合シグナルが極めて低く、結果を分析していないため、対応するデータが得られなかった。
結果により、ニボルマブ、VP101（hG4WT）及びVP101（hG1DM）がFcγRIIIa_F158に結合しなかったこと以外は、他の抗体がいずれもC1qに結合し、VP101（hG1WT）とベバシズマブとの親和性が近いであることが明らかになる。
実施例8：PD-1抗原を発現するCHO-K1-PD1細胞に対するVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）のADCC活性検出
抗体VP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）の細胞レベルでのADCC効果を検出するために、本発明者らは、PD-1抗原を発現したCHO-K1-PD1細胞を構築し、且つ抗体の細胞学的レベルでのADCC活性を検出するために、正常ヒトPBMCと標的細胞との共培養系を構築した。
PD-1抗原を発現するCHO-K1-PD1細胞に対するVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）のADCC活性検出方法は、具体的に以下の通りである：
実験はまずヒトPD-1過剰発現ベクターpCDH-CMV-PD1FL-Puro（pCDH-CMV-Puroは優宝生物から購入）を構築し、発現ベクターをウイルスパッケージングした後にCHO-K1細胞に感染し、Puromycin（2 μg/mL）を投与してスクリーニングした後、薬剤耐性安定発現膜PD-1タンパク質のCHO-K1-PD1安定細胞株を得た。Ficoll末梢血単核細胞分離液操作説明書に従って正常ヒトPBMCを分離し、分離したPBMCを1640完全培地で再懸濁させ、トリパンブルー染色により細胞数及び活性を測定し、37℃、5%CO2、飽和湿度のインキュベーターで一晩インキュベートし、翌日、それぞれCHO-K1-PD1細胞及びPBMCを収集し、遠心分離により上清を除去した後、RPMI-1640（1%BSA含有）（以下、分析培地と呼ぶ）で細胞沈殿を再懸濁させ、遠心分離により2回細胞を洗浄し、細胞数及び活性率を測定し、分析培地を用いて細胞濃度を適切な範囲に調整し、試験設計に従って、CHO-K1-PD1細胞懸濁液を30000/ウェルで96ウェルプレートに加え、50 μLの抗体を加え、均一に混合して室温で1 hプレインキュベートし、プレインキュベート後、PBMCを90万/50 μL/孔で加え、十分に混合し、37℃、5%CO2のインキュベーターで4hrsインキュベートした。4hrs後、96ウェルプレートを取り出し、250×gで5 min遠心分離し、100 μL細胞上清（プレート底細胞に吸い込まないように注意）を新しい96ウェルの平底マイクロプレートに転移し、Cytotoxicity Detection Kit説明書に従ってウェルごとに100 μLの調製済み反応液を加え、室温で30 min光を避けてインキュベートした。それぞれ490 nm及び650 nmでOD値を測定し、各群のOD値=OD490 nm-OD650 nmであった。ADCC(%)=（実験群-陰性対照群）/（標的細胞LDH最大放出-標的細胞LDH自発放出）×100%で各群のADCC活性を計算した。
PD-1抗原を発現するCHO-K1-PD1細胞に対するVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）のADCC活性検出結果をADCC%で示し、結果を図31に示す。
結果により、PBMCとCHO-K1-PD1との混合培養系において、陽性対照14C12H1L1（G1WT）は顕著なADCC活性を有し、ADCC系が正常であることを示す。アイソタイプ対照抗体hIgG1DMと比較して、VP101（hG1WT）が顕著なADCC活性を示し、且つ用量依存性を示すが、VP101（G1DM）はADCC活性を認めなかった。結果により、VP101（hG1WT）を基に変異したVP101（hG1DM）は細胞学的レベルでADCC活性がなく、ADCC効果が除去されたことが明らかになる。
実施例9：PD-1抗原を発現するCHO-K1-PD1細胞に対するVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）のCDC活性検出
抗体VP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）の細胞学的レベルでのCDC効果を検出するために、本発明者らは、PD-1抗原を発現したCHO-K1-PD1細胞を構築し（構築方法は実施例8を参照）、且つ標的細胞を正常ヒト補体血清と共培養する系を構築して抗体の細胞学的レベルでのCDC活性を検出した。
PD-1抗原を発現するCHO-K1-PD1細胞に対するVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）のCDC活性検出方法は、具体的に以下の通りである：
検出当日、CHO-K1-PD1細胞を膵臓酵素消化により収集し、170×gで5 min遠心分離した後、更にRPMI-1640（1%BSA含有）（以下分析培地と呼ぶ）で細胞沈殿を再懸濁させ、2回遠心洗浄を繰り返し、細胞数及び生存率を測定し、分析培地を用いて細胞濃度を適切な範囲に調整し、試験設計に基づいて、96ウェルプレートにCHO-K1-PD1細胞懸濁液を、30000/ウェルで加え、50 μLの抗体を加え、均一に混合し、室温で10 min予備インキュベートし、予備インキュベート後、正常ヒト補体血清（最終濃度2%）を、50 μL/ウェルで加え、十分に混合し、37℃、5% CO2のインキュベーターに入れて4時間インキュベートした。4時間後、250×gで5 min遠心分離し、100 μL細胞上清（プレート底細胞に吸い込まないように注意）を慎重に吸引して新しい96ウェルの平底マイクロプレートに転移し、Cytotoxicity Detection Kit説明書に従ってウェルごとに100 μLの調製済み反応液を加え、室温で30 min光を避けてインキュベートした。それぞれ490 nm及び650 nmでOD値を測定し、各群のOD値=OD490 nm-OD650 nmであった。CDC(%)=（実験群-陰性対照群）/（標的細胞LDH最大放出-標的細胞LDH自発放出）×100%で各群のCDC活性を計算した。
PD-1抗原を発現するCHO-K1-PD1細胞に対するVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）のCDC活性検出結果をCDC%で示し、結果を図32に示す。
結果により、正常ヒト補体血清とCHO-K1-PD1との混合培養系において、陽性対照抗体14C12H1L1（G1WT）はアイソタイプ対照抗体hIgG1DM群と比べ、CDC%に有意差があり、本CDC検出系が正常であることを示した。一方、同量レベルでは、アイソタイプ対照と比較してVP101（hG1WT）及びVP101（hG1DM）のCDC%は有意差がなかった。
実施例10：末梢血単核細胞とRaji-PDL1細胞との混合培養系（MLR）におけるVP101（hG1DM）の薬効学的活性の検出
実験はまずヒトPD-L1過剰発現ベクターplenti6.3-PD-L1－BSD（plenti6.3-BSDはinvitrogenから購入）を構築し、発現ベクターをウイルスパッケージングした後にRaji細胞に感染し、BSD（10 μg/mL）を投与してスクリーニングした後、膜PD-L1蛋白を安定して発現するRaji-PDL1安定細胞株を得た。Ficoll末梢血単核細胞分離液操作説明書に従って正常ヒトPBMCを分離し、分離後のPBMCを1640完全培地で再懸濁、計数、凍結保存した。PBMCを蘇生し、SEB（黄色ブドウ球菌エンテロトキシン抗原）を加えて2日間刺激培養した。2日後に対数期Raji-PDL1細胞を収集し、且つマイトマイシンC（Sigma、作業濃度は25 μg/mL）を加えてインキュベーターに入れて60 min処理し、マイトマイシンC処理後のRaji-PDL1細胞を遠心洗浄し、同時にSEB刺激2日後のPBMCを収集して洗浄し、抗体あり又は抗体なしの条件下で、細胞数1:1の割合で混合培養した。3日後、遠心分離により上清を収集し、ELISAにより上清におけるIL-2及びIFN-γ濃度を検出した。
IFN-γ分泌結果を図33に示す。結果により、VP101（hG1DM）はIFN-γの分泌を効果的に促進でき、活性がニボルマブよりも顕著に優れることを示す。
IL-2分泌結果を図34に示す。結果により、VP101（hG1DM）はIL-2の分泌を効果的に促進でき、且つ用量依存性を呈し、活性がニボルマブよりも顕著に優れることを示す。
実施例11：VP101（hG1DM）はPD-1発現陽性細胞に対する抗体媒介性細胞貪食活性を有さない
抗体媒介性細胞貪食（antibody dependent cellular phagoxytosis、ADCP）とは細胞表面抗原に結合する抗体のFc段が貪食活性を有する細胞、例えばマクロファージのFc受容体と結合し、更に貪食細胞が抗体に結合した細胞を貪食することを媒介することである。免疫チェックポイント阻害剤抗体、例えばPD－1抗体の場合、ADCP活性の存在は抗腫瘍キラー作用を発揮するPD－1を発現した免疫細胞の傷害を引き起こし、その抗腫瘍活性に影響を及ぼす。
本実験はマウス由来マクロファージをエフェクター細胞とし、PD-1を過剰発現したCHO-K1-PD1細胞株（構築方法は実施例8を参照）を標的細胞とし、その媒介ADCP効果を検出した。本実験はフローサイトメトリーを用いて、VP101（hG1DM）のPD-1発現細胞に対するADCP活性を検出した結果、ADCP活性を有さないが、標的に市販されているPD-1抗体ニボルマブと明らかなADCP活性を有することを示した。具体的な方法は下記の通りである。
まず無菌条件下でC57マウス（広東省医学実験動物センターから購入した）の大腿骨骨髄を採取し、赤血球分解液による氷上分解を5 min行い、DMEM完全培地（10%FBS含有）で分解を停止し、1000 rpm遠心洗浄を2回行った。細胞塊を10 mL DMEM完全培地で再懸濁し、M-CSFを作業濃度100 ng/mLまで添加し、37℃、5%CO2の細胞インキュベーターで7日間誘導培養し、その中で第3と第5日に半量の液交換とM-CSFを補充した。7日目に細胞の誘導を完了し、0.25%膵臓酵素で消化し、マクロファージを収集し、750×gで5 min遠心分離し、上清を除去し、DMEM完全培地（10% FBS含有）に懸濁し、計数し、細胞密度を調整して96ウェルコーン底板に分注し、予備した。
通常の方法でCHO-K1-PD1細胞を収集し、170xgで5 min遠心分離し、再懸濁後に計数し、生存率を測定し、PBSで一回洗浄した。カルボキシルフルオレセイン二酢酸コハク酸イミド（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester、CFSE）をPBSで2.5 μMに希釈し、適当量希釈したCFSE再懸濁細胞（染色密度：1000万細胞/mL）を取り、インキュベーターに置いて20 min培養した。6 mLのDMEM完全培地（10%FBS含有）を加えて染色を終了し、170xgで5 min遠心分離し、上清を廃棄し、1 mLのDMEM完全培地を加え、インキュベーターを置いて10 min培養した。抗体はDMEM完全培地で20 μg/mL、2 μg/mL、0.2 μg/mL（作業濃度10 μg/mL、1 μg/mL、0.1 μg/mL）に希釈し、アイソタイプ対照抗体hIgG1DMとhIgG4を設計した。新鮮で誘導成熟したマクロファージを収集し、750xgで5 min遠心分離し、上清を廃棄して計数し、96ウェルコーン底板に移し、1000xgで5 min遠心分離し、上清を廃棄し、CHO-K1-PD1-CFSE細胞密度を調整し、実験設計に従って希釈した抗体をそれぞれ標的細胞と50 μL：50 μLで対応するマクロファージを含む96ウェルコーン底板に加え、再懸濁混合し、37℃のインキュベーターに置いて2 hインキュベートした。ウェルごとに150 μL常温の1%PBSAを加え、1000xgで5 min遠心分離し、上清を廃棄し、200 μLのPBSAで1回洗浄し、100 μL/サンプルでAPC anti-mouse/human CD11b antibody（PBSA 500倍で希釈）を対応するサンプルに加え、均一に混合し、氷上で40 minインキュベートした。ウェルごとに150 μL 1%PBSAを加え、1000xgで5 min遠心し、上清を廃棄し、ウェルごとに200 μLPBSAで1回洗浄した。ウェルごとに200 μL 1%PBSAを加えて再懸濁し、Beckman流式計を投入した。
投入系にマクロファージはAPC+陽性であり、貪食作用を起こしたマクロファージはAPCとCFSEのダブル陽性であった。APC陽性細胞数に対する双陽性細胞数の割合を貪食率とし、抗体媒介ADCP活性を評価した。各群のADCP活性を以下の式で計算し、P%で表す：
Figure 2024509018000009
結果を図35に示す。
結果により、ニボルマブはマクロファージ+CHO-K1-PD1系に明らかなADCP効果があることを示した、VP101（hG1DM）の貪食率は同型対照抗体と同程度であり、VP101（hG1DM）はADCP効果を有さないことを示す。当該結果により、VP101（hG1DM）がより優れた抗腫瘍効果を有する可能性が高いことを示す。
実施例12：乳腺癌治療のためのVP101（hG1DM）単剤投与の動物実験
本実験では、移植乳腺癌細胞VP101（hG1DM）の体内増殖の抗腫瘍活性を検討した。研究計画は下記の表7を参照されたい。
研究中に使用した重度免疫不全NCGマウスは、メス、5週齢であり、江蘇集萃薬康生物科技有限公司から購入した。使用したアイソタイプ対照抗体hIgG4は中山康方生物医薬有限公司が構築したもので、構築方法は同じである。PBMCは中山康方生物医薬有限公司から分離活性化し、方法は前と同じである。
収集した乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞を200万/50 μL/匹、***パッド接種、計12匹のマウスに接種した。体内で30日間成長した時点で、マウスを腫瘍の体積に応じて2群、陰性対照群、VP101（hG1DM）群に均等に分けた。当日PBMC100万/50 μL/匹を皮下接種し、PBMC接種当日を0日目とし、接種当日（0日目）、7日目、14日目、21日目に投与した。腫瘍体積をノギスで測定し、分類後にノギスを用いて腫瘍サイズを週2回測定し、計算式TV=0.5×ab2（式中、aは腫瘍の長径であり、bは腫瘍の短径であり、TVは腫瘍の体積である）に従って腫瘍体積を計算した。
Figure 2024509018000010
 実験結果を図36に示す。結果により、VP101（hG1DM）が、アイソタイプ対照抗体と比較して、乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞の体積成長を効果的に阻害でき、良好な抗腫瘍、特に抗乳腺癌の効果を示すことを示す。
実施例13：PARPiとVP101（hG1DM）の併用投与による卵巣癌細胞の阻害の研究
対数成長期のSNU-251卵巣癌細胞（深セン市豪地華拓生物科技有限公司、貨物番号：HTX2700C）を取り、膵臓酵素消化により単細胞懸濁液を調製し、計数し、細胞密度を調整し、2×105/ウェルで6ウェルプレートに接種し、そしてRPMI 1640培地（Gibco、貨物番号：22400-089）中で37℃で24 h培養した。
細胞が60%～70%まで成長した後、細胞を群分けして投与し、対照群、薬物群を設置し、37℃、5%CO2インキュベーターで24 h培養した。
Transwellチャンバーを24ウェルプレートに入れ、上部チャンバーに100 μLのRPMI 1640培地を加え、インキュベーターに入れて1 h平衡化し、阻害6ウェルプレート中の細胞を膵臓酵素で消化し、無血清培地で単細胞懸濁液を調製し、計数して、細胞密度を4×104個/100 μLに調整し、チャンバーの上部チャンバーに接種し、下部チャンバーに10%胎児牛血清含有のRPMI 1640培地600 μLを加え、37℃、5%CO2インキュベーターに24 hインキュベートした。
培養終了後、Transwellチャンバーを取り出し、培地を廃棄し、下部チャンバー細胞をPBSで2 min固定し、次いで下部チャンバー細胞を4%パラホルムアルデヒドで20 min固定し、PBSで2回チャンバーを洗浄した。
500 μL 0.1%クリスタルバイオレット染色液で下部チャンバー細胞を15 min染色し、そして残りの染色液をPBSで洗浄し、綿棒で下部チャンバーの細胞を丁寧に拭き取り、チャンバーをスライドに置いて顕微鏡下で3つの視野を選んで下部チャンバーに移動した細胞を観察し、写真を撮った。ImgeJソフトウェアを用いて細胞数を計算し、式に従って細胞の遊走度を計算した。
実験結果を図37に示す。結果により、同濃度下の単剤オラパリブ（Olaparib）又は単剤VP101（hG1DM）、PARP阻害剤であるオラパリブ（Olaparib）とVP101（hG1DM）を併用した場合、卵巣癌細胞の遊走を阻害する作用が顕著に増強された。
実施例14：乳腺癌治療のためのPARPiとVP101（hG1DM）の併用投与の動物実験
PARP阻害剤オラパリブ（Olaparib）と抗PD-1-抗VEGFA二重機能抗体VP101（hG1DM）の併用による体内腫瘍阻害活性を測定するために、まずMDA-MB-231細胞（ヒト乳腺癌細胞、ATCCから購入）を用い、5～7週齢のNCGマウス（広東薬康生物科技有限公司から購入）の皮下に接種し、接種後23日目に、マウスは腫瘍の体積によって無作為に4群に分け、各群は6匹である。群分け当日をD0日とし、群分け当日D0日にオラパリブの投与を開始した。D2日目に400万活性化PBMCを腹腔内注射し、VP101（hG1DM）の投与を開始した。併用投与群の投与方式は、薬物を単独に調合し、前後に別々に投与する（投与順序と間隔時間の特定の要求がなく、ある薬物を投与した後に別の薬物を投与する）。モデル作成及び具体的な投与方式を表8に示す。投与後に各群の腫瘍の縦横を測定し、腫瘍体積を計算した。
Figure 2024509018000011
結果を図38に示す。結果により、オラパリブ単用群とVP101（hG1DM）単用群に比べ、VP101（hG1DM）とPARP阻害剤オラパリブの併用はマウス乳腺癌モデルに対して併用抗腫瘍薬効を示し、その併用による腫瘍に対する阻害は各被験薬単用群より優れていた。
また、図39に示すように、被験薬であるVP101（hG1DM）とPARP阻害剤であるオラパリブOlaparibの単用と併用に対する許容性はいずれも良好であり、各群は荷腫マウスの体重に影響を与えなかった。
実施例15：卵巣癌治療のためのPARPiとVP101（hG1DM）の併用投与の動物実験
PARP阻害剤オラパリブ（Olaparib）と抗PD-1-抗VEGFA二重機能抗体VP101（hG1DM）の併用による体内腫瘍阻害活性を測定するために、まずSK-OV-3ヒト卵巣癌細胞（ATCCから購入）を用い、5～7週齢のNCGマウス（広東薬康生物科技有限公司から購入）の皮下に接種し、接種後39日目に300万活性化PBMCを腹腔内注射し、マウスは腫瘍の体積によって無作為に4群に分け、各群は6匹である。群分け当日をD0日とし、群分け当日D0日に投与を開始した。併用投与群の投与方式は、薬物を単独に調合し、前後に別々に投与する（投与順序と間隔時間の特定の要求がなく、ある薬物を投与した後に別の薬物を投与する）。モデル作成及び具体的な投与方式を表9に示す。投与後に各群の腫瘍の縦横を測定し、腫瘍体積を計算した。
Figure 2024509018000012
結果を図40に示す。結果により、オラパリブ単用群とVP101（hG1DM）単用群に比べ、VP101（hG1DM）とPARP阻害剤オラパリブの併用はマウス卵巣癌モデルに対して併用抗腫瘍薬効を示し、その併用による腫瘍に対する阻害は各被験薬単用群より優れていた。
また、図41に示すように、被験薬であるVP101（hG1DM）とPARP阻害剤であるオラパリブの単用と併用に対する許容性はいずれも良好であり、各群は荷腫マウスの体重に影響を与えなかった。
本発明の具体的な実施形態は詳細に説明されているが、当業者には理解されたい。開示されている全ての教示によれば、これらの詳細に対する修正及び置換が可能であり、これらの変更は、本発明の保護の範囲内にある。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらのいずれかの均等物によって定義される。

Claims (29)

  1. 少なくとも1つの二重特異性抗体と、少なくとも1つのPARP阻害剤と、を含む、組合せ医薬であって、
    そのうち、前記二重特異性抗体は、
    PD-1を標的とする第1タンパク質機能領域と、
    VEGFAを標的とする第2タンパク質機能領域と、を含み、
    ここで、
    前記第1タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第2タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、そのうち、前記免疫グロブリンは、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号34～36で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、且つその軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号37～39で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、及び前記一本鎖抗体は、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号28～30で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、その軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号31～33で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含む、
    或いは、
    前記第1タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、前記第2タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、そのうち、前記免疫グロブリンは、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号28～30で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、その軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号31～33で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、及び前記一本鎖抗体は、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号34～36で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、且つその軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号37～39で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、
    前記免疫グロブリンはヒトIgG1サブタイプであり、
    且つ、EU番号付けシステムに従って、前記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、第234位、235位及び237位のうちの任意の2つの部位又は3つの部位で変異し、且つ変異後、二重特異性抗体は、FcγRIIIa及び/又はC1qとの親和性定数が変異前と比較して低下し、好ましくは、前記親和性定数は、Fortebio Octet分子相互作用装置によって測定される、
    組合せ医薬。
  2. EU番号付けシステムに従って、前記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、以下の変異：
    L234A及びL235A、又は
    L234A及びG237A、又は
    L235A及びG237A、
    又は
    L234A、L235A、G237Aを有する、
    請求項1に記載の組合せ医薬。
  3. 少なくとも1つの二重特異性抗体と、少なくとも1つのPARP阻害剤と、を含む、組合せ医薬であって、
    そのうち、前記二重特異性抗体は、
    PD-1を標的とする第1タンパク質機能領域と、
    VEGFAを標的とする第2タンパク質機能領域と、を含み、
    ここで、
    前記第1タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第2タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、そのうち、前記免疫グロブリンは、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号34～36で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、且つその軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号37～39で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、及び前記一本鎖抗体は、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号28～30で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、その軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号31～33で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含む、
    或いは、
    前記第1タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、前記第2タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、そのうち、前記免疫グロブリンは、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号28～30で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、その軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号31～33で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、及び前記一本鎖抗体は、その重鎖可変領域がそれぞれ配列番号34～36で示されるアミノ酸配列を有するHCDR1～HCDR3を含み、且つその軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号37～39で示されるアミノ酸配列を有するLCDR1～LCDR3を含み、
    前記免疫グロブリンはヒトIgG1サブタイプであり、
    且つ、EU番号付けシステムに従って、前記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、以下の変異の組合せの1つ：
    L234A及びL235A、又は
    L234A及びG237A、又は
    L235A及びG237A、又は
    L234A、L235A、G237Aを有する、
    組合せ医薬。
  4. 前記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、EU番号付けシステムに従って、
    N297A、D265A、D270A、P238D、L328E、E233D、H268D、P271G、A330R、C226S、C229S、E233P、P331S、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、N297Q、P238S、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、T394D、G236R、G236A、L328R、A330S、P331S、H268A、E318A及びK320Aからなる群より選ばれる1つ又は複数の変異を更に有する、
    請求項1～3のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
  5. 前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5及び配列番号9からなる群より選ばれ、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7、配列番号11及び配列番号17からなる群より選ばれ、
    或いは、
    前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5及び配列番号9からなる群より選ばれ、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7、配列番号11及び配列番号17からなる群より選ばれ、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示される、
    請求項1～4のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
  6. 以下の（1）～（12）
    （1）前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7で示され、
    （2）前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号11で示され、
    （3）前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号17で示され、
    （4）前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7で示され、
    （5）前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号11で示され、
    （6）前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号17で示され、
    （7）前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、
    （8）前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号11で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、
    （9）前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号17で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、
    （10）前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、
    （11）前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号11で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示され、及び
    （12）前記免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号17で示され、及び、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3で示される、のいずれかから選ばれる、請求項1～5のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
  7. 前記免疫グロブリンの重鎖のアミノ酸配列は、配列番号24で示され、且つその軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号26で示される、
    請求項1～6のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
  8. 前記二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、約10-6 M未満、例えば約10-7 M、10-8 M又は10-9 M未満又はそれ以下の親和性定数でFcγRIに結合し、好ましくは、前記親和性定数は、Fortebio Octet分子相互作用装置によって測定される、
    請求項1～7のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
  9. 前記二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、約10-9 M未満、例えば約10-7 M、10-8 M又は10-9 M未満又はそれ以下の親和性定数でC1qに結合し、好ましくは、前記親和性定数は、Fortebio Octet分子相互作用装置によって測定される、
    請求項1～8のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
  10. 前記第1タンパク質機能領域は、前記第2タンパク質機能領域に直接接続されているか又は接続断片を介して接続されており、及び/又は前記一本鎖抗体の重鎖可変領域は、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域に直接接続されているか又は接続断片を介して接続されている、
    請求項1～9のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
  11. 前記接続断片は、（GGGGS）nであり、nは正の整数であり、好ましくは、nは、1、2、3、4、5又は6である、
    請求項10に記載の組合せ医薬。
  12. 前記第1タンパク質機能領域及び第2タンパク質機能領域は、独立的に1つ、2つ又は2つ以上である、
    請求項1～11のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
  13. 前記一本鎖抗体は、免疫グロブリンの重鎖のC末端に接続されている、
    請求項1～12のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
  14. 前記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の重鎖定常領域から選ばれ、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖定常領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の軽鎖定常領域から選ばれ、
    好ましくは、前記免疫グロブリンの重鎖定常領域がヒトIg gamma-1 chain C region又はヒトIg gamma-4 chain C regionであり、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖定常領域がヒトIg kappa chain C regionであり、
    好ましくは、前記免疫グロブリンの重鎖定常領域がヒトIg gamma-1 chain C region，アクセッション番号: P01857であり、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖定常領域がヒトIg kappa chain C region，アクセッション番号: P01834であり、又は
    好ましくは、前記免疫グロブリンの重鎖定常領域がヒトIg gamma-4 chain C region，アクセッション番号: P01861.1であり、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖定常領域がヒトIg kappa chain C region，アクセッション番号: P01834である、
    請求項1～13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 少なくとも1つの二重特異性抗体と、少なくとも1つのPARP阻害剤と、を含む、組合せ医薬であって、
    そのうち、前記二重特異性抗体は、
    PD-1を標的とする第1タンパク質機能領域と、
    VEGFAを標的とする第2タンパク質機能領域と、を含み、
    前記第1タンパク質機能領域は1つであり、前記第2タンパク質機能領域は2つであり、
    そのうち、前記第1タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第2タンパク質機能領域は一本鎖抗体であり、
    前記免疫グロブリンの重鎖のアミノ酸配列は、配列番号24で示され、且つその軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号26で示され、
    前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9で示され、且つ前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号17で示され、
    前記一本鎖抗体は免疫グロブリンの重鎖のC末端に接続されており、
    前記第1タンパク質機能領域は、前記第2タンパク質機能領域に第1の接続断片を介して接続され、且つ前記一本鎖抗体の重鎖可変領域は、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域に第2の接続断片を介して接続され、前記第1の接続断片と前記第2の接続断片とは相同又は相異し、
    好ましくは、前記第1の接続断片及び前記第2の接続断片のアミノ酸配列は、配列番号18及び配列番号19からなる群より独立的に選ばれ、
    好ましくは、前記第1の接続断片及び前記第2の接続断片のアミノ酸配列はいずれも配列番号18で示される、
    組合せ医薬。
  16. 前記PARP阻害剤は、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブ、フルゾパリブ、veliparib ER、ABT-472、ABT-767、Stenoparib、AST-6828、AG-PD、ANG-2864、ANG-3038、ANG-3186、AZD-5305、AZ-0108、AZD-2461、AMXI-5001、AMXI-2001、AMXI-3001、AMXI-7001、AMXI-9001、pamiparib、ZYTP-1、CK-102、XZ-120312、YHP-743、ヨーベングアン I 131、ルカパリブカンシレート、CVL-218、CPH-101、CPH-102、CBX-11、CBX-15、ミノサイクリン、DB-207、DPS-102、E-7016、ヨーベングアン I 131、MK-2512、HCX-014、HWH-340、IDX-1197、IDX-1197、senaparib、IMP-04100、IMP-04111、IMP-04149、IMP-04249、IMP-04307、IMP-04356、JPI-289、JPI-547、JPI-283、fluzoparib、GT-1620、ヨーベングアン I 131、DR-2313、MP-124、H-10、NT-125、BGP-15、NMSP-293、NMSP-293、NMSP-118、NMSP-648、NMSP-914、DB-207、NUV-1156、NUV-1176、JPI-289、Stenoparib、OX-401、NU-1025、NU-1085、PLX-376、R-554、RBN-2397、RBN-012759、PJ-34、INO-1001、WW-46、BSI-401、イニパリブ、SOMCL-9112、SC-10914、HTMC-0435、SRX-3128、TSL-1502、PJ-34、CEP-8983、CK-102、THG-009、talazoparib SR、L-2286、mitoparib及びWB-1340からなる群より選ばれる1つ又は複数である、
    請求項1～15のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
  17. 1つ又は複数の腫瘍化学療法薬を更に含み、
    好ましくは、前記腫瘍化学療法薬は、トポイソメラーゼII（TOP2）阻害剤から選ばれ、好ましくは、前記トポイソメラーゼII（TOP2）阻害剤は、エトポシドであり、
    好ましくは、前記腫瘍化学療法薬は、パクリタキセル系薬剤から選ばれ、好ましくは、前記パクリタキセル系薬剤は、パクリタキセル、アルブミンパクリタキセル、リポソームパクリタキセル及びドセタキセルからなる群より選ばれ、
    好ましくは、前記腫瘍化学療法薬は、白金系薬剤から選ばれ、好ましくは、前記白金系薬剤は、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンからなる群より選ばれ、
    好ましくは、前記腫瘍化学療法薬は、ゲムシタビン、ペメトレキセド及びカペタビンからなる群より選ばれる1つ又は複数である、
    請求項1～16のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
  18. 前記組合せ医薬は、固定の組合せであり、例えば固体医薬組成物形態又は液体医薬組成物形態を呈し、又は
    前記組合せ医薬は、非固定の組合せであり、例えば前記二重特異性抗体及びPARP阻害剤は、それぞれ医薬組成物形態を呈する、
    請求項1～17のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
  19. 前記医薬組成物は、薬学的に許容されるベクター及び/又は賦形剤を更に含む、
    請求項18に記載の組合せ医薬。
  20. 請求項1～19のいずれか一項に記載の組合せ医薬、及び製品説明書を含む、
    薬物キット製品。
  21. 悪性腫瘍の治療及び/又は予防のための医薬品の製造における、請求項1～19のいずれか一項に記載の組合せ医薬又は請求項20に記載の薬物キット製品の使用であって、
    好ましくは、前記悪性腫瘍は、卵巣癌、子宮内膜癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵管癌、腹膜癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、消化管癌、脳癌、食道癌、例えば、食道扁平上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性（MSI-H）又はミスマッチ修復欠損（dMMR）癌、尿路上皮癌、中皮腫、胃腺癌、胃食道接合部腺癌、白血病、骨髄腫、甲状腺癌、頭頸部癌、骨癌、胆道癌、及び精巣癌からなる群より選ばれ、
    好ましくは、前記腫瘍は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腫瘍であり、
    好ましくは、前記腫瘍は、相同組換え媒介性修復機能欠損が存在しない腫瘍であり、
    好ましくは、前記肺癌は、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌であり、
    好ましくは、前記非小細胞性肺癌は、EGFR及び/又はALK感受性変異を伴う非小細胞肺癌であり、
    好ましくは、前記非小細胞性肺癌は、EGFR及び/又はALK感受性変異を伴わない非小細胞肺癌であり、
    好ましくは、前記肝臓癌は、肝細胞癌であり、
    好ましくは、前記腎腫瘍は、腎細胞癌であり、
    好ましくは、前記乳腺癌は、トリプルネガティブ乳腺癌であり、
    好ましくは、前記尿路上皮癌は、膀胱癌であり、
    好ましくは、前記腹膜癌は、原発性腹膜癌であり、
    好ましくは、前記卵巣癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵巣癌であり、
    好ましくは、前記卵管癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵管癌であり、
    好ましくは、前記腹膜癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腹膜癌であり、
    好ましくは、前記乳腺癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する乳腺癌である、
    使用。
  22. 悪性腫瘍を治療及び/又は予防するために用いられ、
    好ましくは、前記悪性腫瘍は、卵巣癌、子宮内膜癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵管癌、腹膜癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、消化管癌、脳癌、食道癌、例えば、食道扁平上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性（MSI-H）又はミスマッチ修復欠損（dMMR）癌、尿路上皮癌、中皮腫、胃腺癌、胃食道接合部腺癌、白血病、骨髄腫、甲状腺癌、頭頸部癌、骨癌、胆道癌、及び精巣癌からなる群より選ばれ、
    好ましくは、前記腫瘍は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腫瘍であり、
    好ましくは、前記腫瘍は、相同組換え媒介性修復機能欠損が存在しない腫瘍であり、
    好ましくは、前記肺癌は、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌であり、
    好ましくは、前記非小細胞性肺癌は、EGFR及び/又はALK感受性変異を伴う非小細胞肺癌であり、
    好ましくは、前記非小細胞性肺癌は、EGFR及び/又はALK感受性変異を伴わない非小細胞肺癌であり、
    好ましくは、前記肝臓癌は、肝細胞癌であり、
    好ましくは、前記腎腫瘍は、腎細胞癌であり、
    好ましくは、前記乳腺癌は、トリプルネガティブ乳腺癌であり、
    好ましくは、前記尿路上皮癌は、膀胱癌であり、
    好ましくは、前記腹膜癌は、原発性腹膜癌であり、
    好ましくは、前記卵巣癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵巣癌であり、
    好ましくは、前記卵管癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵管癌であり、
    好ましくは、前記腹膜癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腹膜癌であり、
    好ましくは、前記乳腺癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する乳腺癌である、
    請求項1～19のいずれか一項に記載の組合せ医薬又は請求項20に記載の薬物キット製品。
  23. 悪性腫瘍を治療及び/又は予防する方法であって、
    それを必要とする対象に、有効量の請求項1～19のいずれか一項に記載の組合せ医薬又は請求項20に記載の薬物キット製品を投与するステップを含み、
    好ましくは、前記悪性腫瘍は、卵巣癌、子宮内膜癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵管癌、腹膜癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、消化管癌、脳癌、食道癌、例えば、食道扁平上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性（MSI-H）又はミスマッチ修復欠損（dMMR）癌、尿路上皮癌、中皮腫、胃腺癌、胃食道接合部腺癌、白血病、骨髄腫、甲状腺癌、頭頸部癌、骨癌、胆道癌、及び精巣癌からなる群より選ばれ、
    好ましくは、前記腫瘍は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腫瘍であり、
    好ましくは、前記腫瘍は、相同組換え媒介性修復機能欠損が存在しない腫瘍であり、
    好ましくは、前記肺癌は、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌であり、
    好ましくは、前記非小細胞性肺癌は、EGFR及び/又はALK感受性変異を伴う非小細胞肺癌であり、
    好ましくは、前記非小細胞性肺癌は、EGFR及び/又はALK感受性変異を伴わない非小細胞肺癌であり、
    好ましくは、前記肝臓癌は、肝細胞癌であり、
    好ましくは、前記腎腫瘍は、腎細胞癌であり、
    好ましくは、前記乳腺癌は、トリプルネガティブ乳腺癌であり、
    好ましくは、前記尿路上皮癌は、膀胱癌であり、
    好ましくは、前記腹膜癌は、原発性腹膜癌であり、
    好ましくは、前記卵巣癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵巣癌であり、
    好ましくは、前記卵管癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵管癌であり、
    好ましくは、前記腹膜癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腹膜癌であり、
    好ましくは、前記乳腺癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する乳腺癌である、
    方法。
  24. 手術の前又は後に、及び/又は放射線治療の前又は後に投与される、
    請求項23に記載の方法。
  25. 前記二重特異性抗体の単回投与量は、体重1キログラム当たり0.1～100 mg、好ましくは体重1キログラム当たり5～50 mg又は5～15 mgであり、
    3日、4日、5日、6日、10日、1週間、2週間又は3週間毎に1回投与し、
    及び/又は
    投与方式は静脈点滴又は静脈注射である、
    請求項23～24のいずれか一項に記載の方法。
  26. PARP阻害剤の単回投与量は、体重1キログラム当たり0.1～100 mg、好ましくは体重1キログラム当たり5～50 mg又は5～15 mgであり、
    3日、4日、5日、6日、10日、1週間、2週間又は3週間毎に1回投与し、
    及び/又は
    投与方式は静脈点滴又は静脈注射である、
    請求項23～25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 悪性腫瘍の治療及び/又は予防のための医薬品の製造における、請求項1～19のいずれか一項に記載の組合せ医薬における二重特異性抗体の使用であって、
    そのうち、前記悪性腫瘍は、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌及び乳腺癌からなる群より選ばれ、
    好ましくは、前記卵巣癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵巣癌であり、
    好ましくは、前記卵管癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵管癌であり、
    好ましくは、前記腹膜癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腹膜癌であり、
    好ましくは、前記乳腺癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する乳腺癌である、
    使用。
  28. 悪性腫瘍を治療及び/又は予防する方法であって、
    それを必要とする対象に、有効量の請求項1～19のいずれか一項に記載の組合せ医薬における二重特異性抗体を投与するステップを含み、そのうち、前記悪性腫瘍は、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌及び乳腺癌からなる群より選ばれ、
    好ましくは、前記卵巣癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵巣癌であり、
    好ましくは、前記卵管癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵管癌であり、
    好ましくは、前記腹膜癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腹膜癌であり、
    好ましくは、前記乳腺癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する乳腺癌である、
    方法。
  29. 悪性腫瘍を治療及び/又は予防するために用いられ、そのうち、前記悪性腫瘍は、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌及び乳腺癌からなる群より選ばれ、
    好ましくは、前記卵巣癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵巣癌であり、
    好ましくは、前記卵管癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する卵管癌であり、
    好ましくは、前記腹膜癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する腹膜癌であり、
    好ましくは、前記乳腺癌は、相同組換え媒介性修復機能欠損（例えばBRCA1変異及び/又はBRCA2変異）が存在する乳腺癌である、
    請求項1～19のいずれか一項に記載の医薬組成物における二重特異性抗体。
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