KR20230156910A - 항-pd-1-항-vegfa 이중특이적 항체를 함유하는 약학적 조합 및 이의 용도 - Google Patents

항-pd-1-항-vegfa 이중특이적 항체를 함유하는 약학적 조합 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양 치료 및 면역 생물학 분야에 관한 것이다. 항-PD-1-항-VEGFA 이중특이적 항체를 함유하는 약학적 조합 및 이의 용도가 제공된다. 구체적으로, 약학적 조합은 적어도 1종의 이중특이적 항체 및 적어도 1종의 PARP 억제제를 포함하고, 이중특이적 항체는 PD-1을 표적화하기 위한 제1 단백질 기능 영역 및 VEGFA를 표적화하기 위한 제2 단백질 기능 영역을 포함하고; 이중특이적 항체에 함유된 면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라 2개의 위치, 즉 위치 234 및 위치 235에서 돌연변이되고, 돌연변이 후 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 C1q에 대한 이중특이적 항체의 친화도 상수는 돌연변이 전 이에 대한 이중특이적 항체의 친화도 상수와 비교하여 감소된다. PARPi와 이중특이적 항체의 조합 투여는 PARPi 또는 이중특이적 항체의 개별 사용보다 종양에 대해 상당히 더 우수한 치료 효과를 갖고; 본 발명은 우수한 적용 전망을 갖는다.

Description

항-PD-1-항-VEGFA 이중특이적 항체를 함유하는 약학적 조합 및 이의 용도
본 발명은 종양 치료 및 면역생물학 분야, 특히 항-PD-1/항-VEGFA 이중특이적 항체를 포함하는 치료 조합 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항-인간 PD-1/항-인간 VEGFA 이중특이적 항체를 포함하는 치료 조합 및 이의 용도에 관한 것이다.
종양, 특히 악성 종양은 오늘날 전 세계적으로 건강을 위협하는 심각한 질환이다. 종양 성장에는 2가지의 구별되는 단계, 즉 혈관이 없는 느린 성장 단계 및 혈관이 있는 급속한 증식 단계가 있다. 혈관신생은 종양이 혈관 전환 단계를 완료하기에 충분한 영양을 얻을 수 있게 하며, 혈관신생이 없으면 원발성 종양의 크기는 1-2 mm를 초과하지 않을 것이므로 전이가 발생하지 않을 수 있다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 내피 세포의 분열 및 증식을 촉진하고, 새로운 혈관의 형성을 촉진하며, 혈관 투과성을 개선할 수 있는 성장 인자이다. 이는 세포 표면의 혈관 내피 성장 인자 수용체에 결합하고, 티로신 키나제 신호 전달 경로를 활성화시키는 역할을 한다. 종양 조직에서는 종양 세포, 및 종양으로 침입한 대식세포 및 비만 세포는 높은 수준의 VEGF를 분비하고, 종양의 혈관 내피 세포를 측분비 형태로 자극하고, 내피 세포의 증식 및 이동을 촉진하고, 혈관신생을 유도하고, 종양의 지속적인 성장을 촉진하고, 혈관 투과성을 개선하고, 주변 조직에 피브린 침착을 유발하고, 단핵 세포, 섬유모세포 및 내피 세포의 침윤을 촉진하여 종양 간질의 형성 및 종양 세포의 새로운 혈관으로의 진입을 촉진하고, 종양 전이를 촉진할 수 있다. 따라서, 종양 혈관신생을 억제하는 것은 현재 가장 유망한 종양 치료 방법 중 하나로 간주된다. VEGF 계열은 VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD 및 PIGF를 포함한다. 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR)는 VEGFR1(Flt1로도 공지됨), VEGFR2(KDR 또는 Flk1로도 공지됨), VEGFR3(Flt4로도 공지됨) 및 뉴로필린-1(NRP-1)을 포함한다. 처음 3개의 수용체는 티로신 키나제 슈퍼패밀리의 구성원이며, 막외 영역, 막횡단 세그먼트 및 막내 영역으로 구성된 유사한 구조를 가지며, 막외 영역은 면역글로불린 유사 도메인으로 구성되고, 막내 영역은 티로신 키나제 영역이다. VEGFR1 및 VEGFR2는 혈관 내피 세포의 표면에서 주로 발견되며, VEGFR3은 림프 내피 세포의 표면에서 주로 발견된다.
VEGF 계열의 분자는 이러한 수용체에 대해 상이한 친화성을 갖는다. VEGFA는 주로 VEGFR1, VEGFR2 및 NRP-1과 함께 작용한다. VEGFR1은 최초로 인지된 수용체이며, 정상적인 생리학적 조건 하에서는 VEGFR2보다 VEGFA에 대해 더 높은 친화성을 갖지만 세포내 세그먼트에서는 VEGFR2보다 더 낮은 티로시나제 활성을 갖는다(Ma Li, Chinese Journal of Birth Health and Heredity, 24(5) (2016):146-148).
VEGFR2는 혈관신생 및 혈관 공학의 주요 조절자이며, VEGFR1보다 훨씬 더 높은 티로신 키나제 활성을 갖는다. VEGFR2는 리간드 VEGFA와 결합한 후 혈관 내피 세포의 증식, 분화 및 다른 진행 뿐만 아니라 혈관 형성 과정 및 혈관 투과성을 매개한다(Roskoski R Jr. et al., Crit Rev Oncol Hematol, 62(3) (2007):179-213). VEGFA는 VEGFR2에 결합한 후 다운스트림 PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK 신호전달 경로를 통해 관련 세포내 단백질 유전자의 전사 및 발현을 매개하여 혈관 내피 세포의 증식을 촉진한다(Takahashi T et al., Oncogene, 18(13) (1999):2221-2230).
VEGFR3은 티로신 키나제 계열 구성원 중의 하나이며, 배아 혈관 내피 세포 및 성숙한 림프 내피 세포에서 주로 발현되고, VEGFC 및 VEGFD는 VEGFR3에 결합하여 림프 내피 세포의 증식 및 이동을 자극하고 림프관의 신생을 촉진하며; NRP-1은 비-티로신 키나제 막횡단 단백질이며, 독립적으로는 생물학적 신호를 전달할 수 없고 VEGF 티로신 키나제 수용체와 복합체를 형성한 후에만 신호전달을 매개할 수 있다(Ma Li, Chinese Journal of Birth Health and Heredity, 24(5) (2016):146-148).
VEGFA 및 VEGFR2는 주로 혈관신생 조절에 관여하며, VEGFA가 VEGFR2에 결합하기 전후에 업스트림 및 다운스트림 경로에서 수많은 중간 신호의 케스케이드 반응이 형성되고, 최종적으로 증식, 생존, 이동, 투과성 증가, 말초 조직으로의 침윤 및 내피 세포의 다른 패턴에 의해 생리학적 기능이 변화된다(Dong Hongchao et al., Sep. 2014, Journal of Modern Oncology, 22(9): 2231-3).
CD279로도 공지된 프로그래밍된 세포사 수용체-1(PD-1)은 I형 막횡단 당단백질 막 표면 수용체 및 CD28 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이며, 일반적으로 T 세포, B 세포 및 골수 세포에서 발현된다. PD-1은 2가지의 천연 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 갖는다. PD-L1 및 PD-L2는 모두 B7 슈퍼패밀리의 구성원이며, 비-조혈 세포 및 다양한 종양 세포를 포함한 다양한 세포의 막 표면에서 구성적으로 또는 유도적으로 발현된다. PD-L1은 주로 T 세포, B 세포, DC 및 미세혈관 내피 세포 및 다양한 종양 세포에서 발현되는 반면, PD-L2는 수지상 세포 및 대식세포와 같은 항원 제시 세포에서만 발현된다. PD-1과 이의 리간드 사이의 상호작용은 림프의 활성화, T 세포의 증식, 및 IL-2 및 IFN-γ와 같은 시토카인의 분비를 억제할 수 있다.
많은 연구를 통해 종양 미세환경이 면역 세포에 의해 종양 세포가 손상되는 것을 보호할 수 있고, 종양 미세환경에서 침윤한 림프구의 PD-1의 발현이 상향 조절되며, 다양한 원발성 종양 조직이 폐암, 간암, 난소암, 피부암, 결장암 및 신경아교종과 같은 면역조직화학 분석에서 PD-L1 양성인 것으로 나타났다. 한편, 종양에서 PD-L1의 발현은 암 환자의 불량한 예후와 상당히 상관관계가 있다. PD-1과 이의 리간드 사이의 상호작용을 차단하면 종양 특이적 T 세포 면역을 촉진하고 종양 세포의 면역 제거 효율을 향상시킬 수 있다. 다수의 임상 시험에서 PD-1 또는 PD-L1을 표적으로 하는 항체가 CD8+ T 세포의 종양 조직으로의 침투를 촉진하고 IL-2, IFN-γ, 그랜자임 B 및 퍼포린과 같은 항종양 면역 효과 인자를 상향 조절하여 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
PD-1 항체의 광범위한 항종양 전망 및 놀라운 효능으로 인해, PD-1 경로를 표적으로 하는 항체가 다양한 종양의 치료에서 비-소세포 폐암, 신장 세포 암종, 난소암 및 흑색종(Homet M. B., Parisi G., et al, Anti-PD-1 Therapy in Melanoma. Semin Oncol., Jun; 42(3) (2015):466-473), 림프종 및 빈혈(Held S.A., Heine A., et al, Advances in immunology of biliary muscular tissue CML. Curr. Cancer Drug Targets, Sep; 13(7) (2013):768-74), 또는 높은 미세부수체 불안정(MSI-H) 또는 불일치 복구 결함(dMMR)을 갖는 종양의 치료를 위해 획기적인 발전을 가져올 것이라는 것이 업계에서 널리 받아들여지고 있다(여러 항-PD-1 항체 약물이 MSI-H/dMMR 특징을 갖는 종양의 치료를 위해 FDA 또는 다른 규제 당국의 승인을 받았음).
현재 항혈관신생 치료 및 면역 체크포인트 억제제의 조합 요법은 많은 종양에서 우수한 효능을 나타내었다. 예컨대, 베바시주맙과 같은 항-VEGF 항체와 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙 등과 같은 항PD-1/PD-L1 항체의 조합은 난소암(Joyce F. Liu, et al., JAMA Oncol., 2019; 5(12):1731-1738.), 비-소세포 폐암(EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이를 갖는 비-소세포 폐암 포함) (Manegold C, et al., J Thorac Oncol., 2017 Feb; 12(2):194-207), 신장 세포 암종(Dudek AZ, et al., J Clin Oncol., 2018; 36 (suppl; abstr 4558)), 간세포 암종(Stein S et al., J Clin Oncol, 2018, 36(15_suppl):4074.; 간세포 암종을 치료하기 위한 베바시주맙과 아테졸리주맙의 조합이 2020년 FDA 승인을 받았음), 결장직장암(MSI-H/dMMR 및 비-MSI-H/dMMR 유형 포함) (Bendell JC, et al., American Society of Clinical Oncology; May 29-June 2, 2015; Chicago, IL. 2015; abstract 704; Hochster HS, et al., American Society of Clinical Oncology Gastrointestinal Cancers Symposium; January 19-21, 2017; San Francisco, CA. 2017; abstract 673.) 및 유방암(Yukinori Ozaki, et al., AACR; Cancer Res, 2020; 80(4 Suppl):Abstract nr PD1-03.)에서 우수한 효능을 나타내었고; VEGFR2 항체와 PD-1 항체의 조합은 또한 위식도 접합부 선암종(Herbst RS, et al., Lancet Oncol., 2019; 20(8):1109-1123.)에서 우수한 항종양 효능을 나타내었고; PD-1 항체(펨브롤리주맙)와 혈관신생 억제제(렌바티닙)의 조합은 자궁내막암 치료에 우수한 효능을 나타내었으며, 자궁내막암 치료용으로 2019년 FDA 승인을 받았다. 흑색종(PD-1 항체 니볼루맙 및 펨브롤리주맙이 흑색종의 치료용으로 FDA 승인 받았음), 자궁경부암(Krishnansu S., et al., N Engl J Med 2014; 370:734-743.), 신경아교종, 전립선암(Antonarakis ES., et al., J Clin Oncol., Feb. 10, 2020; 38(5):395-405.), 요로상피세포 암종(Joaquim Bellmunt, et al., N Engl J Med, 2017; 376:1015-1026; 니볼루맙이 방광암 치료용으로 2017년 FDA 승인을 받았음), 식도암(Kato K, et al., Lancet Oncol. 2019; 20(11):1506-17.) 및 중피종(Scherpereel A, et al., Lancet Oncol., 2019; 20(2):239-253.)과 같은 종양에 대해, PD-1/PDL-1 항체는 우수한 효능을 나타내었다. 종양발생에서 PD-1 경로 및 VEGF 경로의 상승작용을 고려할 때, PD-1 및 VEGF 경로 둘 다를 차단하는 약물에서 탁월한 항종양 효능이 기대된다.
폴리 ADP-리보스 폴리머라제(PARP)는 PARP 효소 계열의 구성원이며, PARP-1, PARP-2, PARP-3 및 Vallt-PARP를 포함한다. PARP는 DNA 복구 경로에서 중요한 역할을 한다. DNA가 파손되면 PARP가 활성화된다. 이는 DNA 손상의 분자 센서로서 DNA의 절단 부위를 인식하고 결합하여 수용체 단백질의 폴리 ADP 리보실화를 활성화하고 촉매함으로써 DNA 복구 과정에 참여한다.
PARP 억제제는 합성 치사를 매개하여 항종양 효능을 발휘할 수 있다. PARP 매개된 DNA 복구 외에 다른 DNA 복구 메커니즘이 발생할 수 있다. 상동성 재조합은 자매가 아닌 염색분체 사이 또는 동일한 염색체에 상동성 서열을 함유하는 DNA 분자 사이 또는 내에서 발생하는 재조합을 지칭한다. DNA 상동성 재조합 복구(HRR)는 DNA 이중 가닥 손상의 중요한 복구 패턴이다. BRCA1 및 BRCA2는 이 과정의 핵심 단백질이며, BRCA 유전자 돌연변이로 인해 BRCA1 및 BRCA2 단백질이 결함되면 HRR 기능장애 또는 HRD(상동성 재조합 결함)가 발생할 수 있다. PALB2, ATM, BRCA1/2, CHEK2, BARD1, BRIP1, Mre11, CDK12, RAD50, NBS1, RAD51C, RAD51D 및 PALB2와 같은 다른 HRR 관련된 유전자의 이상, BRCA1 유전자 프로모터의 메틸화 및 다른 불특정 요인이 HRD 및 게놈 불안정성을 유발할 수 있다(Lord CJ, Ashworth A, Science, 2017; 355(6330):1152-1158.). 캔서 게놈 아틀라스(Cancer Genome Atlas) (TCGA)는 BRCA1/2 배선 돌연변이(15%), BRCA1/2 체세포 돌연변이(6%), 후생유전학적으로 변형된 BRCA1 프로모터 메틸화(11%), EMSY 증폭(8%), PTEN 돌연변이(7%), RAD51C 메틸화(3%), ATM 또는 ATR 돌연변이(2%) 및 다른 HRD 유전자 돌연변이(5%)를 포함하여 고등급 장액성 난소암의 50% 초과에서 HRD(상동성 재조합 결함)를 발견하였다(Turner NC., N Engl J Med., 2017; 377(25):2490-2492).
합성 치사는 2개의 치명적이지 않은 유전자가 동시에 비활성화되어 세포사를 초래하는 현상을 지칭한다. PARP 억제제는 PARP1 또는 PARP2의 촉매 부위에 결합하여 PARP 단백질이 DNA 손상 부위로부터 분리되지 못하게 하여 DNA 복제 포크를 정지시키고 DNA 복제를 실패하게 할 수 있으며; PARP가 억제되고 HRR 관련된 단백질에 결손이 있는 경우 합성 치사가 발생한다.
특정 DNA 복구 결함(예컨대, BRCA1 또는 BRCA2 배선 유전자 돌연변이)이 있는 종양 세포의 경우, PARP 억제는 종양 세포의 DNA 복구를 방해하고 합성 치사를 통해 종양 세포사를 촉진할 수 있다.
PARP 억제제(PARPi)는 난소암, 유방암, 전립선암 및 췌장암과 같은 암의 임상 연구에서 우수한 효능을 나타내었으며, 상동성 재조합 결함이 있는 난소암, 나팔관암, 복막암 및 유방암과 같은 암 치료용으로 승인되었고(J. Mateo et al., Ann Oncol., Sep. 1, 2019; 30(9):1437-1447.); PARPi는 또한 췌장암 및 전립선암에서도 우수한 효능을 나타내었다. PARPi는 DNA 복구 결함(예컨대, BRCA1 또는 BRCA2 배선 유전자 돌연변이)이 없는 종양에서 여전히 특정 항종양 효능을 나타낸다. NOVA 임상 연구에서, 위약과 비교하여, 니라파립을 받은 환자의 PFS는 환자는 상동성 재조합 결함 유전자 돌연변이를 보유하는지의 여부에 관계없이 상당히 연장되었고(Mirza MR, et al., N Engl J Med, 2016; 375(22):2154-2164.); 올라파립 및 루카파립과 같은 다른 PARPi도 상동성 재조합 결함 유전자 돌연변이가 없는 종양 환자에서 우수한 효능을 나타내었다(J. Mateo, et al., Ann Oncol., Sep. 1, 2019; 30(9):1437-1447.).
현재 4개의 승인된 PARP 억제제: 올라파립(AstraZeneca), 루카파립(Clovis Oncology, USA), 니라파립(Tesaro) 및 탈라조파립(Pfizer)이 있다. 플루조파립(Hengrui Pharmaceuticals, 중국)은 이전에 2가지 이상의 화학요법을 받은, 백금 민감성의 재발성 난소암, 나팔관암 또는 배선 BRCA 돌연변이를 갖는 원발성 복막암을 갖는 환자의 치료용으로 중국에서 승인되었다. 또한, 벨리파립 ER, ABT-472, ABT-767, 스테노파립, AST-6828, AG-PD, ANG-2864, ANG-3038, ANG-3186, AZD-5305, AZ-0108, AZD-2461, AMXI-5001, AMXI-2001, AMXI-3001, AMXI-7001, AMXI-9001, 파미파립, ZYTP-1, CK-102, XZ-120312, YHP-743, 아이오벤구안 I 131, 루카파립 캄실레이트, CVL-218, CPH-101, CPH-102, CBX-11, CBX-15, 미노사이클린, DB-207, DPS-102, E-7016, 아이오벤구안 I 131, MK-2512, HCX-014, HWH-340, IDX-1197, IDX-1197, 세나파립, IMP-04100, IMP-04111, IMP-04149, IMP-04249, IMP-04307, IMP-04356, JPI-289, JPI-547, JPI-283, 플루조파립, GT-1620, 아이오벤구안 I 131, DR-2313, MP-124, H-10, NT-125, BGP-15, NMSP-293, NMSP-118, NMSP-648, NMSP-914, DB-207, NUV-1156, NUV-1176, JPI-289, 스테노파립, OX-401, NU-1025, NU-1085, PLX-376, R-554, RBN-2397, RBN-012759, PJ-34, INO-1001, WW-46, BSI-401, 이니파립, SOMCL-9112, SC-10914, HTMC-0435, SRX-3128, TSL-1502, PJ-34, CEP-8983, CK-102, THG-009, 탈라조파립 SR, L-2286, 미토파립 및 WB-1340이 개발 중에 있다.
이중특이적 항체로도 공지된 이중기능적 항체는 2개의 상이한 항원을 동시에 표적으로 하는 특정 요법이며, 면역선택 정제에 의해 생성될 수 있다. 또한, 이중특이적 항체는 또한 유전 공학에 의해 생성될 수 있으며, 결합 부위 최적화, 합성 형태 및 수율 고려와 같은 측면에서 상응하는 유연성으로 인해 특정 이점을 갖는다. 현재, 이중특이적 항체는 45개 초과의 형태로 존재하는 것으로 입증되었다(M
Figure pct00001
ller D, Kontermann RE. Bispecific antibodies for cancer immunotherapy: current perspectives. BioDrugs, 2010; 24:89-98). 다수의 이중특이적 항체가 IgG-scFv 형태, 즉 모리슨(Morrison) 형태로 개발되었으며(Coloma M. J., Morrison S. L. Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat Biotechnol., 1997; 15:159-163), 자연적으로 존재하는 IgG 형태와의 유사성 및 항체 공학, 발현 및 정제에서의 이점으로 인해 이중특이적 항체의 이상적인 형태 중 하나인 것으로 입증되었다(Miller B. R., Demarest S. J., et al., Protein Eng Des Sel, 2010; 23:549-57; Fitzgerald J, Lugovskoy A. MAbs, 2011; 3:299-309).
전임상 연구에서 PARPi가 신생항원과 비-신생항원 모두를 기반으로 하는 면역계에 의해 종양 세포의 인식을 촉발할 수 있다는 것이 밝혀졌으며, 이는 면역 체크포인트 억제제와의 조합이 더 우수한 효능을 초래할 수 있음을 시사한다(Mateo J, et al., Ann Oncol., 2019; 30(9):1437-1447.). PARP의 억제는 종양 세포에서 PD-L1의 발현 증가를 유도하여 면역억제를 초래하고 이에 따라 PARPi의 효능이 손상된다. 이와 같이, PARP를 억제하면서 PD-(L)1을 차단하면 면역억제를 피할 수 있어 PARPi 및 PD-(L)1 억제제의 더 강한 항종양 활성을 초래할 수 있다(Jiao S, et al., Clin Cancer Res., 2017; 23(14):3711-3720.). 반면, 종양 세포의 경우, 관련된 유전자의 돌연변이로 인해 특정 DNA 복구 결함이 발생하고, DNA 손상이 축적되면 종양 세포와 정상 세포 간의 차이가 커지고 면역계가 종양 세포를 쉽게 인식하게 된다. 종양에 돌연변이가 많을수록 종양 세포의 생존은 면역계의 억제에 더욱 의존적이게 될 것이다. 따라서, PARPi와 PD-1 약물의 조합 사용은 특정한 이론적 근거를 갖는다. 예컨대, PD-1 외에 항-PD-1/VEGFA 이중특이적 항체는 또한 종양 미세환경에서 PD-1 발현과 높은 상관관계가 있는 VEGF-A를 차단하고, 혈관신생 억제와 같은 메커니즘을 통해 종양 진행을 억제한다.
따라서, 효능이 더 높은 치료 또는 조합 요법을 개발하는 것은 큰 의미가 있다.
본 발명자는 창의적인 노력을 통해 종양 치료에서 항PD-1/항-VEGFA 항체와 PARP 억제제의 조합 요법에 대해 심도 있는 연구를 수행하였으며, 2가지의 조합 사용이 종양, 특히 악성 종양의 치료 및/또는 예방에 우수한 효능이 있음을 발견하였다. 본 발명은 하기에서 상세히 설명된다.
본 발명의 하나의 측면은 적어도 1종의 이중특이적 항체 및 적어도 1종의 PARP 억제제를 포함하는 치료 조합에 관한 것으로서,
이중특이적 항체는
PD-1을 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역, 및
VEGFA를 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역
을 포함하고;
제1 단백질 기능 영역은 면역글로불린이고, 제2 단백질 기능 영역은 단일 쇄 항체이거나; 제1 단백질 기능 영역은 단일 쇄 항체이고, 제2 단백질 기능 영역은 면역글로불린이며;
면역글로불린은 각각 서열번호 28-30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 단일 쇄 항체는 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
면역글로불린은 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 단일 쇄 항체는 각각 서열번호 28-30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며;
면역글로불린은 인간 IgG1 서브타입이고;
면역글로불린은 EU 넘버링 시스템에 따라 위치 234, 235 및 237 중 어느 2개 또는 3개에서 돌연변이를 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, FcγRIIIa 및/또는 C1q에 대한 이중특이적 항체의 친화도 상수는 돌연변이 전과 비교하여 돌연변이 후 감소되고; 바람직하게는, 친화도 상수는 포르테비오 옥테트 시스템(Fortebio Octet system)에 의해 측정된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라
L234A 및 L235A; 또는
L234A 및 G237A; 또는
L235A 및 G237A; 또는
L234A, L235A 및 G237A
의 돌연변이를 갖는다.
본 발명에서, 달리 명시하지 않는 한, 위치 번호 앞의 문자는 돌연변이 전의 아미노산을 나타내고, 위치 번호 뒤의 문자는 돌연변이 후의 아미노산을 나타낸다.
본 발명은 또한 적어도 1종의 이중특이적 항체 및 적어도 1종의 PARP 억제제를 포함하는 치료 조합에 관한 것으로서,
이중특이적 항체는
PD-1을 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역, 및
VEGFA를 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역
을 포함하고;
제1 단백질 기능 영역은 면역글로불린이고, 제2 단백질 기능 영역은 단일 쇄 항체이거나; 제1 단백질 기능 영역은 단일 쇄 항체이고, 제2 단백질 기능 영역은 면역글로불린이며;
면역글로불린은 각각 서열번호 28-30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 단일 쇄 항체는 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
면역글로불린은 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 단일 쇄 항체는 각각 서열번호 28-30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며;
면역글로불린은 인간 IgG1 서브타입이다.
본 발명은 또한 적어도 1종의 이중특이적 항체 및 적어도 1종의 PARP 억제제를 포함하는 치료 조합에 관한 것으로서,
이중특이적 항체는
PD-1을 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역, 및
VEGFA를 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역
을 포함하고;
제1 단백질 기능 영역은 면역글로불린이고, 제2 단백질 기능 영역은 단일 쇄 항체이거나; 제1 단백질 기능 영역은 단일 쇄 항체이고, 제2 단백질 기능 영역은 면역글로불린이며;
면역글로불린은 각각 서열번호 28-30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 단일 쇄 항체는 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
면역글로불린은 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 단일 쇄 항체는 각각 서열번호 28-30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며;
면역글로불린은 인간 IgG1 서브타입이고;
면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라
L234A 및 L235A; 또는
L234A 및 G237A; 또는
L235A 및 G237A; 또는
L234A, L235A 및 G237A
의 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라 하기로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖거나 추가로 갖는다:
N297A, D265A, D270A, P238D, L328E, E233D, H268D, P271G, A330R, C226S, C229S, E233P, P331S, S267E, L328F, A330L, M252Y, S254T, T256E, N297Q, P238S, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, T394D, G236R, G236A, L328R, A330S, P331S, H268A, E318A 및 K320A.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합에 대해,
면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5 및 서열번호 9로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7, 서열번호 11 및 서열번호 17로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖거나;
면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5 및 서열번호 9로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7, 서열번호 11 및 서열번호 17로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합은 하기 (1)-(12) 중 어느 하나로부터 선택된다:
(1) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
(2) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
(3) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
(4) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
(5) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
(6) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
(7) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
(8) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
(9) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
(10) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
(11) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가짐; 및
(12) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가짐.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 면역글로불린은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 이중특이적 항체는 IgG-scFv의 형태, 즉 모리슨 형식이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 치료 조합에 대해,
면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되고, 면역글로불린은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 치료 조합에 대해,
면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 인간 Ig 감마-1 쇄 C 영역 또는 인간 Ig 감마-4 쇄 C 영역이고, 면역글로불린의 경쇄 불변 영역은 인간 Ig 카파 쇄 C 영역이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 면역글로불린의 불변 영역은 인간화된다. 예컨대, 중쇄 불변 영역은 Ig 감마-1 쇄 C 영역, ACCESSION: P01857이고, 경쇄 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, ACCESSION: P01834이거나;
면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 Ig 감마-4 쇄 C 영역, ACCESSION: P01861.1이고, 경쇄 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, ACCESSION: P01834이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 중쇄 불변 영역 Ig 감마-1 쇄 C 영역(ACCESSION: P01857)은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
본 발명의 한 실시양태에서, 중쇄 불변 영역 Ig 감마-4 쇄 C 영역(ACCESSION: P01861.1)은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
본 발명의 한 실시양태에서, 경쇄 불변 영역 Ig 카파 쇄 C 영역(ACCESSION: P01834)은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
본 발명의 일부 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 단일 쇄 항체는 면역글로불린 중쇄의 C 말단에 연결된다. 면역글로불린은 2개의 중쇄를 가지므로 2개의 단일 쇄 항체 분자는 하나의 면역글로불린 분자에 연결된다. 바람직하게는, 2개의 단일 쇄 항체 분자는 동일하다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 2개의 단일 쇄 항체가 존재하고, 각각의 단일 쇄 항체의 하나의 말단은 면역글로불린의 2개의 중쇄 중 하나의 C 말단 또는 N 말단에 연결된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 단일 쇄 항체의 VH와 VL 사이에 디술파이드 결합이 존재한다. 항체의 VH와 VL 사이에 디술파이드 결합을 도입하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예컨대, 문헌(US5,747,654; Rajagopal, et al., Prot. Engin., 10(1997)1453-1459; Reiter et al., Nat. Biotechnol., 14(1996)1239-1245; Reiter, et al., Protein Engineering, 8(1995)1323-1331; Webber, et al., Molecular Immunology, 32(1995)249-258; Reiter, et al., Immunity, 2(1995)281-287; Reiter, et al., JBC, 269(1994)18327-18331; Reiter, et al., Inter. J. of Cancer, 58(1994)142-149; and Reiter, et al., Cancer Res., 54(1994)2714-2718, 참조로 본원에 포함됨)을 참조한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 제1 단백질 기능 영역은 직접적으로 또는 링커 단편을 통해 제2 단백질 기능 영역에 연결되고/되거나; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 직접적으로 또는 링커 단편을 통해 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역에 연결된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 링커 단편은 (GGGGS)n이고; n은 양의 정수이고, 바람직하게는 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역의 수는 각각 독립적으로 1, 2 또는 그 초과이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 단일 쇄 항체는 면역글로불린의 중쇄의 C 말단에 연결된다.
본 발명은 추가로 적어도 1종의 이중특이적 항체 및 적어도 1종의 PARP 억제제를 포함하는 치료 조합에 관한 것으로서,
이중특이적 항체는
PD-1을 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역, 및
VEGFA를 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역
을 포함하고;
제1 단백질 기능 영역의 수는 1이고, 제2 단백질 기능 영역의 수는 2이고;
제1 단백질 기능 영역은 면역글로불린이고, 제2 단백질 기능 영역은 단일 쇄 항체이고;
면역글로불린은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고;
단일 쇄 항체는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
단일 쇄 항체는 면역글로불린의 중쇄의 C 말단에 연결되고;
제1 단백질 기능 영역은 제1 링커 단편을 통해 제2 단백질 기능 영역에 연결되고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 제2 링커 단편을 통해 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역에 연결되고; 제1 링커 단편 및 제2 링커 단편은 동일하거나 상이하고;
바람직하게는, 제1 링커 단편 및 제2 링커 단편의 아미노산 서열은 서열번호 18 및 서열번호 19로부터 독립적으로 선택되고;
바람직하게는, 제1 링커 단편 및 제2 링커 단편의 아미노산 서열은 서열번호 18에 기재된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 10-6 M 미만, 예컨대 약 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 그 미만의 미만의 친화도 상수로 FcγRI에 결합하고; 바람직하게는, 친화도 상수는 포르테비오 옥테트 시스템에 의해 측정된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 10-9M 미만, 예컨대 약 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 그 미만의 미만의 친화도 상수로 C1q에 결합하고; 바람직하게는, 친화도 상수는 포르테비오 옥테트 시스템에 의해 측정된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 10-5 M 미만, 예컨대 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만의 미만의 KD로 VEGFA 단백질 및/또는 PD-1 단백질에 결합하고; 바람직하게는, KD는 포르테비오 분자 상호작용 장치에 의해 측정된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 치료 조합에 대해,
이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.2 nM 미만, 0.15 nM 미만 또는 0.14 nM 미만의 EC50으로 VEGFA 단백질에 결합하고; 바람직하게는, EC50은 간접 ELISA에 의해 측정되고/되거나;
이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.2 nM 미만, 0.17 nM 미만, 0.16 nM 미만 또는 0.15 nM 미만의 EC50으로 PD-1 단백질에 결합하고; 바람직하게는, EC50은 간접 ELISA에 의해 측정된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 이중특이적 항체는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간화 항체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 치료 조합에 대해, PARP 억제제는 올라파립, 루카파립, 니라파립, 탈라조파립, 플루조파립, 벨리파립 ER, ABT-472, ABT-767, 스테노파립, AST-6828, AG-PD, ANG-2864, ANG-3038, ANG-3186, AZD-5305, AZ-0108, AZD-2461, AMXI-5001, AMXI-2001, AMXI-3001, AMXI-7001, AMXI-9001, 파미파립, ZYTP-1, CK-102, XZ-120312, YHP-743, 아이오벤구안 I 131, 루카파립 캄실레이트, CVL-218, CPH-101, CPH-102, CBX-11, CBX-15, 미노사이클린, DB-207, DPS-102, E-7016, 아이오벤구안 I 131, MK-2512, HCX-014, HWH-340, IDX-1197, IDX-1197, 세나파립, IMP-04100, IMP-04111, IMP-04149, IMP-04249, IMP-04307, IMP-04356, JPI-289, JPI-547, JPI-283, 플루조파립, GT-1620, 아이오벤구안 I 131, DR-2313, MP-124, H-10, NT-125, BGP-15, NMSP-293, NMSP-118, NMSP-648, NMSP-914, DB-207, NUV-1156, NUV-1176, JPI-289, 스테노파립, OX-401, NU-1025, NU-1085, PLX-376, R-554, RBN-2397, RBN-012759, PJ-34, INO-1001, WW-46, BSI-401, 이니파립, SOMCL-9112, SC-10914, HTMC-0435, SRX-3128, TSL-1502, PJ-34, CEP-8983, CK-102, THG-009, 탈라조파립 SR, L-2286, 미토파립 및 WB-1340 중 1종 이상으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 치료 조합은 1종 이상의 항종양 화학요법제를 추가로 포함하고;
바람직하게는, 항종양 화학치료제는 토포이소머라제 II(TOP2) 억제제로부터 선택되고, 바람직하게는 토포이소머라제 II(TOP2) 억제제는 에토포시드이고;
바람직하게는, 항종양 화학치료제는 탁산으로부터 선택되고, 바람직하게는 탁산은 파클릭탁셀, 알부민 결합된 파클릭탁셀, 리포좀 파클릭탁셀 및 독세탁셀로부터 선택되고;
바람직하게는, 항종양 화학치료제는 백금계 약물로부터 선택되고, 바람직하게는 백금계 약물은 시스플라틴, 카르보플라틴, 및 옥살리플라틴으로부터 선택되고;
바람직하게는, 항종양 화학치료제는 젬시타빈, 페메트렉세드 및 카페시타빈으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 치료 조합은, 예컨대 고체 약학 조성물 또는 액체 약학 조성물 형태의 고정된 조합이거나;
치료 조합은 비-고정된 조합이고, 예컨대 이중특이적 항체, PARP 억제제 및 항종양 화학치료제는 각각 약학 조성물의 형태이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 치료 조합에 대해, 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 현탁제, 유제, 용액제, 겔제, 캡슐제, 산제, 과립제, 엘릭서제, 트로키제, 좌제, 주사제(주사제 용액, 주사용 멸균 분말, 주사용 농축 용액 포함), 흡입제 및 스프레이제와 같은 약학적 분야에 공지된 임의의 투여 형태로 제형화될 수 있다. 바람직한 투여 형태는 의도된 투여 경로 및 치료 용도에 따라 달라진다. 본 발명의 약학 조성물은 제조 및 보관 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 하나의 바람직한 투여 형태는 주사제이다. 이러한 주사제는 주사용 멸균 용액일 수 있다. 예컨대, 주사용 멸균 용액은 하기 방법에 의해 제조될 수 있다: 필요한 양의 본 발명의 이중특이적 항체를 적절한 용매에 첨가하고, 임의적으로 다른 원하는 성분(pH 조절제, 계면활성제, 애주번트, 이온 강도 강화제, 등장화제, 보존제, 희석제 또는 이들의 임의의 조합)을 동시에 첨가한 후 여과 및 멸균한다. 또한, 주사용 멸균 용액은 보관 및 사용이 용이하도록 멸균 동결건조 분말(예컨대, 진공 건조 또는 동결건조)로 제조될 수 있다. 이러한 멸균 동결건조 분말은 사용 전에 적합한 담체(예컨대, 발열원이 없는 멸균수)에 분산될 수 있다.
또한, 본 발명의 이중특이적 항체 또는 PARP 억제제는 투여의 용이성을 위해 단위 용량 형태로 약학 조성물에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 적어도 1 mg, 적어도 5 mg, 적어도 10 mg, 적어도 15 mg, 적어도 20 mg, 적어도 25 mg, 적어도 30 mg, 적어도 45 mg, 적어도 50 mg, 적어도 75 mg 또는 적어도 100 mg이다. 약학 조성물이 액체(예컨대, 주사) 투여 형태인 경우, 본 발명의 이중특이적 항체를 적어도 0.1 mg/mL, 예컨대 적어도 0.25 mg/mL, 적어도 0.5 mg/mL, 적어도 1 mg/mL, 적어도 2.5 mg/mL, 적어도 5 mg/mL, 적어도 8 mg/mL, 적어도 10 mg/mL, 적어도 15 mg/mL, 적어도 25 mg/mL, 적어도 50 mg/mL, 적어도 75 mg/mL 또는 적어도 100 mg/mL의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항체 또는 약학 조성물은 경구, 협측, 설하, 안구, 국소, 비경구, 직장, 척수강내, 수조내, 서혜부, 방광내, 국소(예컨대, 분말, 연고 또는 점적) 또는 비강 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 투여될 수 있다. 그러나, 많은 치료적 사용에 대해, 선호되는 투여 경로/방식은 비경구(예컨대, 정맥내 주사, 피하 주사, 복강내 주사 및 근육내 주사)이다. 당업자는 투여 경로 및/또는 방식이 의도된 목적에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체 또는 약학 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
본원에 제공된 이중특이적 항체 또는 약학 조성물은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있거나, 추가 약학적 활성제(예컨대, 종양 화학치료제)와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 추가적인 약학적 활성제는 본 발명의 이중특이적 항체 또는 본 발명의 약학 조성물의 투여 전, 투여와 공동으로, 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
본 발명에서, 투여 레지먼(regimen)은 최적의 원하는 반응(예컨대, 치료 또는 예방 반응)을 달성하도록 조정될 수 있다. 예컨대, 레지먼은 단일 용량 또는 일정 기간에 걸친 다중 용량일 수 있거나, 용량은 치료의 응급 상황에 따라 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항체는 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 이중특이적 항체, 즉 항-PD-1/항-VEGFA 이중특이적 항체이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 치료 조합 및 패키지 삽입물을 포함하는 키트 제품에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 악성 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 치료 조합 또는 본 발명의 키트 제품의 용도에 관한 것으로서;
바람직하게는, 악성 종양은 난소암, 자궁내막암, 유방암, 자궁경부암, 나팔관암, 복막암, 췌장암, 결장암, 직장암, 폐암, 간암, 피부암, 신경아교종, 흑색종, 림프종, 신장 종양, 전립선암, 방광암, 위장암, 뇌암, 식도암, 예컨대 식도 편평암, 높은 미세부수체 불안정(MSI-H) 또는 불일치 복구 결함(dMMR) 암, 요로상피세포 암종, 중피종, 위 선암종, 위식도 접합부 선암종, 백혈병, 골수종, 갑상선암, 두경부암, 골암, 담도암 및 고환암으로부터 선택되고;
바람직하게는, 종양은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 종양이고;
바람직하게는, 종양은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함이 없는 종양이고;
바람직하게는, 폐암은 비-소세포 폐암 또는 소세포 폐암이고;
바람직하게는, 비-소세포 폐암은 EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이를 갖는 비-소세포 폐암이고;
바람직하게는, 비-소세포 폐암은 EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이가 없는 비-소세포 폐암이고;
바람직하게는, 간암은 간세포 암종이고;
바람직하게는, 신장암은 신장 세포 암종이고;
바람직하게는, 유방암은 삼중 음성 유방암이고;
바람직하게는, 요로상피세포 암종은 방광암이고;
바람직하게는, 복막암은 원발성 복막암이고;
바람직하게는, 난소암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 난소암이고;
바람직하게는, 나팔관암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 나팔관암이고;
바람직하게는, 복막암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 복막암이고;
바람직하게는, 유방암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 유방암이다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 약제의 제조에서 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 치료 조합 또는 본 발명의 키트 제품의 용도에 관한 것이다:
(1) 샘플 내 VEGFA의 수준을 검출하기 위한 약제 또는 작용제,
VEGFA의 VEGFR2에 대한 결합을 차단하기 위한 약제 또는 작용제,
VEGFA의 활성 또는 수준을 하향 조절하기 위한 약제 또는 작용제,
혈관 내피 세포 증식에 대한 VEGFA의 자극을 완화하기 위한 약제 또는 작용제,
혈관 내피 세포 증식을 억제하기 위한 약제 또는 작용제, 또는
종양 혈관신생을 차단하기 위한 약제 또는 작용제;
및/또는
(2) PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 차단하기 위한 약제 또는 작용제,
PD-1의 활성 또는 수준을 하향 조절하기 위한 약제 또는 작용제,
유기체에서 PD-1의 면역억제를 완화하기 위한 약제 또는 작용제,
T 림프구에서 IFN-γ 분비를 촉진하기 위한 약제 또는 작용제, 또는
T 림프구에서 IL-2 분비를 촉진하기 위한 약제 또는 작용제.
본 발명의 시험관내 실험에서, 항-VEGFA 항체 및 항-VEGFA/항-PD-1 이중특이적 항체는 모두 HUVEC 세포 증식을 억제할 수 있고, 항-PD-1 항체 및 항-VEGFA/항-PD-1 이중특이적 항체는 모두 IFN-γ 및/또는 IL-2의 분비를 촉진하고 면역 반응을 활성화할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 악성 종양의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 유효량의 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 치료 조합 또는 본 발명의 키트 제품을 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것으로서,
바람직하게는, 악성 종양은 난소암, 자궁내막암, 유방암, 자궁경부암, 나팔관암, 복막암, 췌장암, 결장암, 직장암, 폐암, 간암, 피부암, 신경아교종, 흑색종, 림프종, 신장 종양, 전립선암, 방광암, 위장암, 뇌암, 식도암, 예컨대 식도 편평암, 높은 미세부수체 불안정(MSI-H) 또는 불일치 복구 결함(dMMR) 암, 요로상피세포 암종, 중피종, 위 선암종, 위식도 접합부 선암종, 백혈병, 골수종, 갑상선암, 두경부암, 골암, 담도암 및 고환암으로부터 선택되고;
바람직하게는, 종양은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 종양이고;
바람직하게는, 종양은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함이 없는 종양이고;
바람직하게는, 폐암은 비-소세포 폐암 또는 소세포 폐암이고;
바람직하게는, 비-소세포 폐암은 EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이를 갖는 비-소세포 폐암이고;
바람직하게는, 비-소세포 폐암은 EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이가 없는 비-소세포 폐암이고;
바람직하게는, 간암은 간세포 암종이고;
바람직하게는, 신장암은 신장 세포 암종이고;
바람직하게는, 유방암은 삼중 음성 유방암이고;
바람직하게는, 요로상피세포 암종은 방광암이고;
바람직하게는, 복막암은 원발성 복막암이고;
바람직하게는, 난소암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 난소암이고;
바람직하게는, 나팔관암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 나팔관암이고;
바람직하게는, 복막암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 복막암이고;
바람직하게는, 유방암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 유방암이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 악성 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 대해, 투여는 수술 전후 및/또는 방사선요법 전후에 수행된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 악성 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 대해, 이중특이적 항체는 체중 kg당 0.1-100 mg, 바람직하게는 체중 kg당 5-50 mg 또는 5-15 mg의 단위 용량으로 투여되고/되거나,
3일, 4일, 5일, 6일, 10일, 1주, 2주 또는 3주마다 1회 투여되고/되거나,
정맥내 점적 주입 또는 정맥내 주사로 투여된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 악성 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 대해, PARP 억제제는 체중 kg당 0.1-100 mg, 바람직하게는 체중 kg당 5-50 mg 또는 5-15 mg의 단위 용량으로 투여되고/되거나,
3일, 4일, 5일, 6일, 10일, 1주, 2주 또는 3주마다 1회 투여되고/되거나,
정맥내 점적 주입 또는 정맥내 주사로 투여된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 악성 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 대해, 이중특이적 항체 및 PARP 억제제는 동시에 또는 비-동시에 투여된다.
본 발명의 이중특이적 항체 및/또는 PARP 억제제의 치료적 또는 예방적 유효량의 전형적인 비제한적 범위는 0.02-100 mg/kg, 예컨대 0.1-50 mg/kg, 0.1-25 mg/kg, 또는 1-10 mg/kg이다. 치료될 증상의 유형 및 중증도에 따라 용량이 달라질 수 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 당업자는 임의의 특정 환자에 대해 특정 용량 레지먼이 환자의 필요 및 의사의 전문적 판단에 따라 시간이 지남에 따라 조정될 수 있음을 인식할 것이며; 본원에 제공된 용량 범위는 단지 예시 목적일 뿐이며, 본 발명의 약학 조성물의 용도 또는 범위를 제한하지 않는다.
본 발명에 있어서, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기로부터 선택되는 생체내 또는 시험관내 방법에 관한 것이다:
(1) 샘플 내 VEGFA의 수준을 검출하는 방법,
VEGFA의 VEGFR2에 대한 결합을 차단하는 방법,
VEGFA의 활성 또는 수준을 하향 조절하는 방법,
혈관 내피 세포 증식에 대한 VEGFA의 자극을 완화하는 방법,
혈관 내피 세포 증식을 억제하는 방법, 또는
종양 혈관신생을 차단하는 방법;
및/또는
(2) PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 차단하는 방법,
PD-1의 활성 또는 수준을 하향 조절하는 방법,
유기체에서 PD-1의 면역억제를 완화하는 방법,
T 림프구에서 IFN-γ 분비를 촉진하는 방법, 또는
T 림프구에서 IL-2 분비를 촉진하는 방법.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합 또는 키트 제품은 악성 종양을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이고;
바람직하게는, 악성 종양은 난소암, 자궁내막암, 유방암, 자궁경부암, 나팔관암, 복막암, 췌장암, 결장암, 직장암, 폐암, 간암, 피부암, 신경아교종, 흑색종, 림프종, 신장 종양, 전립선암, 방광암, 위장암, 뇌암, 식도암, 예컨대 식도 편평암, 높은 미세부수체 불안정(MSI-H) 또는 불일치 복구 결함(dMMR) 암, 요로상피세포 암종, 중피종, 위 선암종, 위식도 접합부 선암종, 백혈병, 골수종, 갑상선암, 두경부암, 골암, 담도암 및 고환암으로부터 선택되고;
바람직하게는, 종양은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 종양이고;
바람직하게는, 종양은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함이 없는 종양이고;
바람직하게는, 폐암은 비-소세포 폐암 또는 소세포 폐암이고;
바람직하게는, 비-소세포 폐암은 EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이를 갖는 비-소세포 폐암이고;
바람직하게는, 비-소세포 폐암은 EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이가 없는 비-소세포 폐암이고;
바람직하게는, 간암은 간세포 암종이고;
바람직하게는, 신장암은 신장 세포 암종이고;
바람직하게는, 유방암은 삼중 음성 유방암이고;
바람직하게는, 요로상피세포 암종은 방광암이고;
바람직하게는, 복막암은 원발성 복막암이고;
바람직하게는, 난소암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 난소암이고;
바람직하게는, 나팔관암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 나팔관암이고;
바람직하게는, 복막암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 복막암이고;
바람직하게는, 유방암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 유방암이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 치료 조합 또는 키트 제품은 하기에 사용하기 위한 것이다:
(1) 샘플 내 VEGFA의 수준을 검출,
VEGFA의 VEGFR2에 대한 결합을 차단,
VEGFA의 활성 또는 수준을 하향 조절,
혈관 내피 세포 증식에 대한 VEGFA의 자극을 완화,
혈관 내피 세포 증식을 억제; 또는
종양 혈관신생을 차단;
및/또는
(2) PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 차단,
PD-1의 활성 또는 수준을 하향 조절,
유기체에서 PD-1의 면역억제를 완화,
T 림프구에서 IFN-γ 분비를 촉진,
T 림프구에서 IL-2 분비를 촉진.
본 발명의 또 다른 측면은 악성 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 치료 조합 중의 이중특이적 항체의 용도에 관한 것으로서, 악성 종양은 난소암, 나팔관암, 복막암 및 유방암으로부터 선택되고;
바람직하게는, 난소암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 난소암이고;
바람직하게는, 나팔관암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 나팔관암이고;
바람직하게는, 복막암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 복막암이고;
바람직하게는, 유방암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 유방암이다.
본 발명의 또 다른 측면은 악성 종양의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 치료 조합 중의 이중특이적 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것으로서, 악성 종양은 난소암, 나팔관암, 복막암 및 유방암으로부터 선택되고;
바람직하게는, 난소암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 난소암이고;
바람직하게는, 나팔관암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 나팔관암이고;
바람직하게는, 복막암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 복막암이고;
바람직하게는, 유방암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 유방암이다.
본 발명의 또 다른 측면은 악성 종양을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 치료 조합 중의 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 악성 종양은 난소암, 나팔관암, 복막암 및 유방암으로부터 선택되고;
바람직하게는, 난소암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 난소암이고;
바람직하게는, 나팔관암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 나팔관암이고;
바람직하게는, 복막암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 복막암이고;
바람직하게는, 유방암은 is 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 유방암이다.
항체 약물, 특히 모노클로날 항체는 다양한 질환 치료에서 우수한 효능을 달성하였다. 이러한 치료 항체를 획득하기 위한 통상적인 방법은 동물을 항원으로 면역화하고 면역화된 동물에서 항원을 표적으로 하는 항체를 획득하거나 친화도 성숙에 의해 항원에 대해 친화력이 더 낮은 항체를 변형시키는 것을 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원에 대한 결합을 결정하며; 각각의 쇄의 가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3개의 초가변 영역을 포함한다(중쇄(H 쇄)의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3이고, 경쇄(L 쇄)의 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3이다(문헌(Kabat et al., Bethesda M.d., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication, (1-3) 1991: 91-3242) 참조).
바람직하게는, CDR은 또한 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의될 수 있다(문헌(Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas, and Marie-Paule Lefranc. "IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF." Nucleic acids research, 38.suppl_1 (2009): D301-D307) 참조).
하기 (1)-(13)에서 모노클로날 항체 서열의 CDR 영역의 아미노산 서열은 당업자에게 널리 공지된 기술적 수단, 예컨대 VBASE2 데이터베이스, 특히 IMGT 정의에 따라 분석되었으며, 결과는 하기와 같다:
(1) 베바시주맙
중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
중쇄 가변 영역의 3개의 CDR은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
HCDR1: GYTFTNYG (서열번호 28)
HCDR2: INTYTGEP (서열번호 29)
HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV (서열번호 30)
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
LCDR1: QDISNY (서열번호 31)
LCDR2: FTS (서열번호 32)
LCDR3: QQYSTVPWT (서열번호 33)
(2) 14C12, 14C12H1L1 또는 14C12H1L1(M)
중쇄 가변 영역의 3개의 CDR은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
HCDR1: GFAFSSYD (서열번호 34)
HCDR2: ISGGGRYT (서열번호 35)
HCDR3: ANRYGEAWFAY (서열번호 36)
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
LCDR1: QDINTY (서열번호 37)
LCDR2: RAN (서열번호 38)
LCDR3: LQYDEFPLT (서열번호 39)
(3) VP101(hG1WT) 또는 VP101(hG1DM)
중쇄의 9개의 CDR은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
HCDR1: GYTFTNYG (서열번호 28)
HCDR2: INTYTGEP (서열번호 29)
HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV (서열번호 30)
HCDR4: GFAFSSYD (서열번호 34)
HCDR5: ISGGGRYT (서열번호 35)
HCDR6: ANRYGEAWFAY (서열번호 36)
HCDR7: QDINTY (서열번호 37)
HCDR8: RAN (서열번호 38)
HCDR9: LQYDEFPLT (서열번호 39)
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
LCDR1: QDISNY (서열번호 31)
LCDR2: FTS (서열번호 32)
LCDR3: QQYSTVPWT (서열번호 33).
본 발명의 항체 VP101(hG1DM)를 위해, VP101(hG1WT)의 비-가변 영역에 아미노산 돌연변이가 도입된다. 아미노산 돌연변이는 EU 넘버링 시스템에 따라 위치 234 및 위치 235에 도입된다.
VP101(hG1DM)은 중쇄의 힌지 영역에서 위치 234에 류신의 알라닌으로의 포인트 돌연변이(L234A)를 도입하고 위치 235에 류신의 알라닌으로의 포인트 돌연변이(L235A)를 도입하여 수득되었다.
본 발명에서, 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 본원에 사용된 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학의 실험실 작업은 상응하는 분야에서 널리 사용되는 일상적인 절차이다. 한편, 본 발명의 이해를 돕기 위해 관련 용어의 정의 및 설명을 이하에 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, VEGFA 단백질의 아미노산 서열을 지칭할 때, 이는 VEGFA 단백질(GenBank ID: NP_001165097.1)의 전체 길이 뿐만 아니라 VEGFA의 융합 단백질, 예컨대 마우스 또는 인간 IgG의 Fc 단백질 단편(mFc 또는 hFc)에 융합된 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그러나, 당업자는 VEGFA 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 변이(치환, 결실 및/또는 부가를 포함하지만 이에 제한되지 않음)가 자연적으로 발생할 수 있거나 생물학적 기능에 영향을 주지 않으면서 인위적으로 도입될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명에서 용어 "VEGFA 단백질"은 천연 또는 인공 변이체를 포함하여 이러한 모든 서열을 포함한다. 또한, VEGFA 단백질의 서열 단편을 기재할 때, 또한 천연 또는 인공 변이체의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, VEGFA 단백질은 서열번호 33의 밑줄 친 부분에 기재된 아미노산 서열(마지막 6개의 His를 제외한 총 302개의 아미노산)을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, VEGFR2 단백질(KDR로도 공지됨)의 아미노산 서열을 지칭할 때, 이는 VEGFR2 단백질(GenBank ID: NP_002244)의 전체 길이, 또는 VEGFR2의 세포외 단편 VEGFR2-ECD, 또는 VEGFR2-ECD를 포함하는 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 또한 VEGFR2-ECD의 융합 단백질, 예컨대 마우스 또는 인간 IgG의 Fc 단백질 단편(mFc 또는 hFc)에 융합된 단편을 포함한다. 그러나, 당업자는 VEGFR2 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 변이(치환, 결실 및/또는 부가를 포함하지만 이에 제한되지 않음)가 자연적으로 발생할 수 있거나 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 인위적으로 도입될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명에서 용어 "VEGFR2 단백질"은 이들 서열의 천연 또는 인공 변이체를 포함하는 이러한 모든 서열을 포함한다. 또한, VEGFR2 단백질의 서열 단편을 기재할 때, 또한 천연 또는 인공 변이체의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, VEGFR2의 세포외 단편 VEGFR2-ECD는 서열번호 34에 기재된 아미노산 서열(766개 아미노산)을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, VEGFR은 VEGFR1 및/또는 VEGFR2이고; 이의 특정 단백질 서열은 선행 기술에 공지된 서열이며, 기존 문헌 또는 진뱅크(GenBank)에 개시된 서열을 참조할 수 있다. 예컨대, VEGFR1(VEGFR1, NCBI 유전자 ID: 2321); VEGFR2(VEGFR2, NCBI 유전자 ID: 3791).
본원에서 사용되는 바와 같이, PD-1 단백질(프로그래밍된 세포사 단백질 1)의 아미노산 서열을 지칭할 때, 이는 PD-1 단백질(NCBI GenBank: NP_005009.2)의 전체 길이, 또는 PD-1의 세포외 단편 PD-1ECD, 또는 PD-1ECD를 포함하는 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 또한 PD-1ECD의 융합 단백질, 예컨대 마우스 또는 인간 IgG의 Fc 단백질 단편(mFc 또는 hFc)에 융합된 단편을 포함한다. 그러나, 당업자는 PD-1 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 변이(치환, 결실 및/또는 부가를 포함하지만 이에 제한되지 않음)가 자연적으로 발생할 수 있거나 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 인위적으로 도입될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명에서 용어 "PD-1 단백질"은 이들 서열의 천연 또는 인공 변이체를 포함하는 이러한 모든 서열을 포함한다. 또한, PD-1 단백질의 서열 단편을 기재할 때, 또한 천연 또는 인공 변이체의 상응하는 서열 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 EC50은 최대 효과의 50%에 대한 농도, 즉 최대 효과의 50%를 유발할 수 있는 농도를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 일반적으로 2개의 쌍의 폴리펩티드 쇄(각각의 쌍은 하나의 "경"(L) 쇄 및 하나의 "중"(H) 쇄로 이루어짐)로 이루어진 면역글로불린 분자를 지칭한다. 일반적인 의미에서, 중쇄는 항체에서 분자량이 큰 폴리펩티드 쇄로 해석될 수 있고, 경쇄는 항체에서 분자량이 작은 폴리펩티드 쇄로 해석될 수 있다. 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로 분류될 수 있다. 중쇄는 일반적으로 μ, δ, γ, α, ε으로 분류되며, 항체는 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE 이소타입으로 정의된다. 경쇄 및 중쇄에서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 약 3개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 추가로 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예컨대, 이펙터 세포)의 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)에 대한 결합을 포함한 면역글로불린의 숙주 조직 또는 인자에 대한 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역은 초가변 영역(상보성 결정 영역 또는 CDR이라고 함) 및 CDR 사이에 분포된 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보존 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노 말단에서 카르복실 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 각각의 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역(VH 및 VL)은 항체 결합 부위를 형성한다. 영역 또는 도메인에 대한 아미노산의 지정은 문헌(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), 또는 문헌(Chothia & Lesk J. Mol. Biol., 196(1987): 901-917; Chothia et al., Nature, 342(1989): 878-883) 또는 IMGT 넘버링 시스템(Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas, and Marie-Paule Lefranc. "IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF." Nucleic acids research, 38.suppl_1 (2009): D301-D307)에 의해 정의될 수 있다. 특히, 중쇄는 6개, 9개 또는 12개와 같은 3개 초과의 CDR을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 이중특이적 항체에서, 중쇄는 또 다른 항체에 연결된 IgG 항체의 중쇄의 C 말단을 갖는 scFv일 수 있으며, 이 경우 중쇄는 9개의 CDR을 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 생성하는 특정한 방법에 의해 제한되지 않는다. 예컨대, 항체는 특히 재조합 항체, 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 포함한다. 항체는 IgG(예컨대, 서브타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM과 같은 상이한 이소타입의 항체일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 단편"은 "항원 결합 부분"으로도 공지되어 있으며, 전체 길이 항체의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하며, 이는 전체 길이 항체가 결합하는 동일한 항원에 특이적으로 결합하고/하거나 항원에 대한 특이적 결합에 대해 전체 길이 항체와 경쟁하는 능력을 유지한다. 일반적으로 문헌(Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, N.Y. (1989))을 참조한다. 항체의 항원 결합 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 일부 경우에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F (ab')2, Fd, Fv, dAb, 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일 쇄 항체 단편 (예컨대, scFv), 키메라 항체, 디아바디 및 폴리펩티드에 특이적 항원 결합 능력을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fd 단편"은 VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭하며; 용어 "Fv 단편"은 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭하고; 용어 "dAb 단편"은 VH 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭하고(Ward et al., Nature, 341 (1989):544-546)); 용어 "Fab 단편"은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭하고; 용어 "F(ab')2 단편"은 힌지 영역에서 디술파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다.
일부 경우에서, 항체의 항원 결합 단편은 VL 및 VH 도메인이 쌍을 이루어 단일 폴리펩티드 쇄의 생성을 가능하게 하는 링커를 통해 1가 분자를 형성하는 단일 쇄 항체(예컨대, scFv)이다(예컨대, 문헌(Bird et al., Science 242 (1988):423-426 and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988):5879-5883) 참조). 이러한 scFv 분자는 일반 구조: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH를 가질 수 있다. 선행 기술의 적절한 링커는 GGGGS 아미노산 서열 반복부 또는 이의 변이체로 이루어진다. 예컨대, 아미노산 (GGGGS)4를 갖는 링커를 사용할 수 있으며, 이의 변이체를 사용할 수도 있다(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1993):6444-6448). 본 발명에 유용한 다른 링커는 문헌(Alfthan et al., Protein Eng. 8 (1995): 725-731, Choi et al., Eur. J. Immunol. 31 (2001): 94-106, Hu et al., Cancer Res. 56 (1996): 3055-3061, Kipriyanov et al., J. Mol. Biol. 293 (1999): 41-56, and Roovers et al., Cancer Immunol. (2001))에 기재되어 있다.
일부 경우에서, 항체의 항원 결합 단편은 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에서 발현되는 디아바디, 즉 2가 항체이다. 그러나, 사용된 링커는 너무 짧아서 동일한 쇄에 있는 2개의 도메인의 쌍형성을 허용하지 않는다. 따라서, 도메인은 다른 쇄 상의 상보적 도메인과 쌍을 이루도록 강제되고 2개의 항원 결합 부위가 생성된다(예컨대, 문헌(Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993):6444-6448, and Poljak R.J. et al., Structure 2 (1994):1121-1123) 참조).
항체의 항원 결합 단편(예컨대, 상기 언급된 항체 단편)은 당업자에게 공지된 통상적인 기술(예컨대, DNA 재조합, 또는 효소적 또는 화학적 절단)을 이용하여 주어진 항체로부터 수득될 수 있으며, 항체의 항원 결합 항체의 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 특이성에 대해 스크리닝된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 문맥에서 달리 명확히 정의되지 않는 한, 온전한 항체 뿐만 아니라 항체의 항원 결합 단편도 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "mAb" 및 "모노클로날 항체"는 자발적으로 발생할 수 있는 천연 돌연변이를 제외하고는 고도로 상동성인 항체 그룹, 즉 동일한 항체 분자 그룹으로부터 유래된 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 모노클로날 항체는 항원의 단일 에피토프에 대해 매우 특이적이다. 폴리클로날 항체는 모노클로날 항체에 비해 일반적으로 항원 상의 상이한 에피토프를 인식하는 적어도 2개 이상의 상이한 항체를 포함한다. 모노클로날 항체는 일반적으로 문헌(Kohler et al., Nature, 256:495, 1975)에 의해 처음 보고된 하이브리도마 기술에 의해 수득되거나, 재조합 DNA 기술에 의해서도 수득될 수 있다(예컨대, U.S. Patent No. 4,816,567 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 경쇄 및/또는 중쇄의 일부가 (특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 이소타입 또는 서브타입에 속할 수 있는) 항체로부터 유래되고, 경쇄 및/및 중쇄의 다른 부분은 (동일하거나 상이한 종으로부터 유래되거나 동일하거나 상이한 항체 이소타입 또는 서브타입에 속할 수 있는) 또 다른 항체로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 그러나, 어떠한 경우에도, 표적 항원에 대한 결합 활성을 유지한다(U.S. Patent 4,816,567 Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984):6851-6855).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 인간 면역글로불린(수용체 항체)의 CDR 전체 또는 일부가 비-인간 항체(공여자 항체)의 CDR로 대체되어 수득되는 항체 또는 항체 단편을 지칭하며, 공여자 항체는 예상되는 특이성, 친화성 또는 반응성을 갖는 비-인간(예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼) 항체일 수 있다. 또한, 수용체 항체의 프레임워크 영역(FR)의 일부 아미노산 잔기는 상응하는 비-인간 항체의 아미노산 잔기 또는 다른 항체의 아미노산 잔기로 대체되어 항체의 성능을 더욱 향상시키거나 최적화할 수도 있다. 인간화 항체에 대한 더 자세한 내용은, 예컨대 문헌(Jones et al., Nature, 321 (1986): 522-525; Reichmann et al., Nature, (1988) 332:323-329; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2 (1992): 593-596, and Clark, Immunol. Today 21 (2000): 397-402)을 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. "에피토프"는 또한 당업계에서 "항원성 결정자"로도 지칭된다. 에피토프 또는 항원성 결정자는 일반적으로 아미노산, 탄수화물 또는 슈가 측쇄와 같은 화학적으로 활성인 분자 표면 그룹으로 이루어지며, 일반적으로 특정한 3차원 구조 특징 및 특정한 전하 특징을 갖는다. 예컨대, 에피토프는 일반적으로 독특한 공간적 입체형태에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속 또는 비-연속 아미노산을 포함하며, 이는 "선형" 또는 "입체형태"일 수 있다(예컨대, 문헌(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)) 참조). 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예컨대, 항체) 사이의 모든 상호작용 부위는 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 위치된다. 입체형태 에피토프에서, 상호작용 부위는 서로 분리된 단백질의 아미노산 잔기에 걸쳐 위치된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 자연 상태로부터 인위적인 수단에 의해 수득되는 것을 지칭한다. 특정 "단리된" 물질 또는 성분이 자연에 존재하는 경우, 이는 자연 환경에 변화가 발생하는 경우, 자연 환경으로부터 단리되는 경우, 또는 둘 다일 수 있다. 예컨대, 특정한 비-단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 특정한 살아있는 동물에서 자연적으로 발생하며, 이러한 자연 상태로부터 단리된 순도가 높은 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드로 지칭한다. 용어 "단리된"은 물질의 활성에 영향을 미치지 않는 인공 또는 합성 물질 또는 다른 불순물의 존재를 배제하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 핵산 비히클을 지칭한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 단백질의 발현을 허용하는 경우, 벡터는 발현 벡터로 지칭된다. 벡터는 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있으며, 이로써 벡터에 의해 운반된 유전 물질 요소가 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 플라스미드; 파지미드; 코스미드; 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래된 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체; 람다 파지 또는 M13 파지와 같은 파지; 및 동물 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 벡터가 당업자에게 널리 공지되어 있다. 벡터로 사용될 수 있는 동물 바이러스는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련된 바이러스, 헤르페스 바이러스(예컨대, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마바이러스 및 파포바바이러스(예컨대, SV40)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선별 요소 및 리포터 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 발현을 제어하는 다양한 요소를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 개시 부위를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 벡터가 도입될 수 있는 세포를 지칭하며, 원핵 세포, 예컨대 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 진균 세포, 예컨대 효모 세포 또는 아스페르길루스(Aspergillus), 곤충세포, 예컨대, S2 초파리 세포 또는 Sf9, 또는 동물 세포, 예컨대 섬유모세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다"는 두 분자 사이의 비-무작위 결합 반응, 예컨대 항체와 이것이 표적으로 하는 항원 사이의 반응을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 항원에 특이적인 항체)는 항체가 약 10-5 M 미만, 예컨대 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 또는 그 미만의 미만의 친화도(KD)로 항원에 결합하는 것을 의미한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 용어 "표적"은 특이적 결합을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "KD"는 특정한 항체-항원 상호작용에 대한 해리 평형 상수를 지칭하며, 이는 항체와 항원 사이의 결합 친화도를 설명하는 데 사용된다. 해리 평형 상수가 작을수록 항체-항원 결합이 더 강하고 항체와 항원 사이의 친화력이 더 높다는 것을 나타낸다. 일반적으로, 항체는, 예컨대 비아코어(BIACORE) 시스템에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 또는 포르테비오 시스템에 의해 측정 시 약 10-5 M 미만, 예컨대 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 또는 그 미만의 미만의 해리 평형 상수(KD)로 항원에 결합한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체" 및 "mAb"는 동일한 의미를 갖고 상호교환적으로 사용될 수 있으며; 용어 "폴리클로날 항체" 및 "pAb"는 동일한 의미를 갖고 상호교환적으로 사용될 수 있으며; 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 동일한 의미를 갖고 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산은 일반적으로 당업계에 공지된 단일 문자 및 3문자 약어로 표시된다. 예컨대, 알라닌은 A 또는 Ala로 표시될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는 부형제"는 대상체 및 활성 성분과 약리학적 및/또는 생리학적으로 적합한 담체 및/또는 비히클을 지칭하며, 이는 당업계에 널리 공지되어 있고(예컨대, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) 참조), pH 조절제, 계면활성제, 애주번트 및 이온 강도 강화제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예컨대, pH 조절제는 포스페이트 버퍼를 포함하지만 이에 제한되지 않고; 계면활성제는 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈-80을 포함하지만 이에 제한되지는 않고; 이온 강도 강화제는 염화나트륨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "애주번트"는 항원과 함께 또는 사전에 유기체 내로 전달될 때 항원에 대한 유기체의 면역 반응을 향상시키거나 면역 반응의 유형을 변화시킬 수 있는 비-특이적 면역 증강제를 지칭한다. 알루미늄 애주번트(예컨대, 수산화알루미늄), 프로인트 애주번트(예컨대, 완전 프로인트 애주번트 및 불완전 프로인트 애주번트), 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 지질다당류, 시토카인 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 애주번트가 있다. 프로인트 애주번트는 동물 실험에서 가장 흔히 사용되는 애주번트이다. 수산화알루미늄 애주번트는 임상 시험에서 더 자주 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 원하는 효과를 수득하거나 적어도 부분적으로 수득하기에 충분한 양을 지칭한다. 예컨대, (예컨대, PD-L1에 대한 PD-1 결합 또는 VEGF의 과발현과 관련된 질환, 예컨대 종양에 대한) 예방적 유효량은 질환(예컨대, PD-L1에 대한 PD-L1 결합 또는 VEGF의 과발현과 관련된 질환, 예컨대 종양)의 발병을 방지, 중단 또는 지연시키는 데 충분한 양이고; 치료적 유효량은 질환을 앓고 있는 환자의 질환 및 이의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 중단시키기에 충분한 양이다. 이러한 유효량을 결정하는 것은 의심할 바 없이 당업자의 능력 내에 있다. 예컨대, 치료 목적에 유효한 양은 치료될 질환의 중증도, 환자 자신의 면역계의 전반적인 상태, 환자의 일반적 조건, 예컨대 연령, 체중, 성별, 투여 경로, 및 다른 공동 치료 등에 따라 달라질 것이다.
유익한 효과
본 발명은 하기의 기술적 효과 (1) 내지 (6) 중 어느 하나 이상을 달성한다:
(1) 본 발명에서, 항체의 Fc 단편에서의 변형은 FC 수용체 FcγRI 및 FcγRIIIa_F158에 대한 VP101(hG1WT)의 결합 활성을 완전히 제거하여 ADCC 활성을 완전히 제거한다.
(2) 본 발명에서, 항체의 Fc 단편에서의 변형은 보체 C1q에 대한 VP101(hG1WT)의 결합 활성을 완전히 제거하여 CDC 활성이 제거한다.
(3) 본 발명의 이중특이적 항체는 VEGFA에 특이적으로 결합하여 VEGFR2에 대한 VEGFA의 결합을 효과적으로 차단하고, 면역억제 및 혈관신생에 대한 VEGFA의 촉진 효과를 특이적으로 완화할 수 있다.
(4) 본 발명의 이중특이적 항체는 PD-1에 특이적으로 결합하여, PD-L1에 대한 PD-1의 결합을 효과적으로 차단하고, 유기체에 대한 PD-1의 면역억제를 특이적으로 완화하고 면역 반응을 활성화시킬 수 있다.
(5) 본 발명의 PARPi와 이중특이적 항체의 조합 사용은 종양, 특히 유방암 또는 난소암에서 PARPi 또는 이중특이적 항체 단독 사용에 비해 현저히 우수한 효능을 갖는다.
(6) 본 발명의 PARPi 및 이중특이적 항체는 종양을 치료 또는 예방하는 데 있어서 상승작용 효과를 갖는다.
도 1: FcγRI에 대한 VP101(hG1DM)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM 및 3.12 nM이다.
도 2: FcγRI에 대한 베바시주맙의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM 및 3.12 nM이다.
도 3: FcγRI에 대한 니볼루맙의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM 및 3.12 nM이다..
도 4: FcγRI에 대한 VP101(hG1WT)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM 및 3.12 nM이다.
도 5: FcγRI에 대한 VP101(hG4WT)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM 및 3.12 nM이다.
도 6: FcγRIIa_H131에 대한 VP101(hG1DM)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 및 12.5 nM이다.
도 7: FcγRIIa_H131에 대한 베바시주맙의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 및 12.5 nM이다.
도 8: FcγRIIa_H131에 대한 니볼루맙의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 및 12.5 nM이다.
도 9: FcγRIIa_H131에 대한 VP101(hG1WT)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 및 12.5 nM이다.
도 10: FcγRIIa_H131에 대한 VP101(hG4WT)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 및 12.5 nM이다.
도 11: FcγRIIa_R131에 대한 VP101(hG1DM)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 및 12.5 nM이다.
도 12: FcγRIIa_R131에 대한 베바시주맙의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 및 12.5 nM이다.
도 13: FcγRIIa_R131에 대한 니볼루맙의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 및 12.5 nM이다.
도 14: FcγRIIa_R131에 대한 VP101(hG1WT)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 및 12.5 nM이다.
도 15: FcγRIIa_R131에 대한 VP101(hG4WT)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 및 12.5 nM이다.
도 16: FcγRIIIa_V158에 대한 VP101(hG1DM)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM 및 31.25 nM이다.
도 17: FcγRIIIa_V158에 대한 베바시주맙의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM 및 31.25 nM이다.
도 18: FcγRIIIa_V158에 대한 니볼루맙의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM 및 31.25 nM이다.
도 19: FcγRIIIa_V158에 대한 VP101(hG1WT)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM 및 31.25 nM이다.
도 20: FcγRIIIa_V158에 대한 VP101(hG4WT)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM 및 31.25 nM이다.
도 21: FcγRIIIa_F158에 대한 VP101(hG1DM)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항원 농도는 각각 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM 및 31.25 nM이다.
도 22: FcγRIIIa_F158에 대한 베바시주맙의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM 및 31.25 nM이다.
도 23: FcγRIIIa_F158에 대한 니볼루맙의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM 및 31.25 nM이다.
도 24: FcγRIIIa_F158에 대한 VP101(hG1WT)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM 및 31.25 nM이다.
도 25: FcγRIIa_F158에 대한 VP101(hG4WT)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM 및 31.25 nM이다.
도 26: C1q에 대한 VP101(hG1DM)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1.25 nM 및 0.625 nM이다.
도 27: C1q에 대한 베바시주맙의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1.25 nM 및 0.625 nM이다.
도 28: C1q에 대한 니볼루맙의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1.25 nM 및 0.625 nM이다.
도 29: C1q에 대한 VP101(hG1WT)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항체 농도는 각각 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1.25 nM 및 0.625 nM이다.
도 30: C1q에 대한 VP101(hG4WT)의 친화도 상수 검정. 위에서 아래로의 곡선 쌍에 대한 항원 농도는 각각 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1.25 nM 및 0.625 nM이다.
도 31: PD-1 항원을 발현하는 CHO-K1-PD1 표적 세포 시스템에서 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 ADCC 활성 검정.
도 32: PD-1 항원을 발현하는 CHO-K1-PD1 표적 세포 시스템에서 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 CDC 활성 검정.
도 33: ELISA에 의한 PBMC와 Raji-PDL1 세포의 혼합 림프구 반응에 의해 유도된 시토카인 IFN-γ의 분비에 대한 항체 VP101(hG1DM)의 효과.
도 34: ELISA에 의한 PBMC와 Raji-PDL1 세포의 혼합 림프구 반응에 의해 유도된 시토카인 IL-2의 분비에 대한 항체 VP101(hG1DM)의 효과.
도 35: PD-1 항원을 발현하는 CHO-K1-PD1 표적 세포 시스템에서 VP101(hG1DM)의 ADCC 활성 검정.
도 36: VP101(hG1DM)에 의한 유방 패드 종양 이종이식 모델에서 유방암 종양 세포의 증식 활성 억제.
도 37: PARPi와 VP101(hG1DM)의 조합 사용에 의한 난소암 세포의 이동 억제.
도 38: 유방암 피하 이종이식 종양 마우스 모델에서 종양 부피에 대한 PARPi와 VP101(hG1DM) 조합의 효과.
도 39: 유방암 피하 이종이식 종양 마우스 모델에서 체중에 대한 PARPi와 VP101(hG1DM) 조합의 효과.
도 40: 난소암 피하 이종이식 종양 마우스 모델에서 종양 부피에 대한 PARPi와 VP101(hG1DM) 조합의 효과.
도 41: 난소암 피하 이종이식 종양 마우스 모델에서 체중에 대한 PARPi와 VP101(hG1DM) 조합의 효과.
이하, 실시예를 참조하여 본 발명의 실시양태를 상세히 설명할 것이다. 당업자는 하기 실시예가 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해할 것이다. 구체적인 기술 또는 조건이 명시되지 않은 실시예는 당업계의 공개물에 설명된 기술 또는 조건에 따라 (예컨대, 문헌(Guide to Molecular Cloning Experiments, 저자: J. Sambrook et al., 번역자: Huang Peitang et al., third edition, Science Press) 참조) 또는 제품 설명서에 따라 수행된다. 사용되는 시약 또는 기구는 제조사가 명시되지 않는 경우 모두 시판되는 일반 제품이다.
본 발명의 하기 실시예에서, 동일한 표적에 대해 승인된 항체 베바시주맙(상표명 Avastin®)을 참조 항체로서 로슈(Roche)에서 구입하거나, 제조예 1에 따라 제조하였다.
본 발명의 하기 실시예에서, 동일한 표적에 대한 승인된 항체 니볼루맙(상표명 Opdivo®)을 참조 항체로서 BMS에서 구입하였다.
본 발명의 하기 실시예에서, 사용된 PARP 억제제 올라파립은 쉘렉켐(Selleckchem)에서 구입하였다.
본 발명의 실시예에서 이소타입 대조군 항체인 인간 항-달걀 리소자임 IgG(항-HEL, 또는 인간 IgG, hIgG로 약칭됨)의 가변 영역 서열은 문헌(Acierno et al., "Affinity maturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies" (Acierno et al., J Mol Biol., 2007; 374(1):130-46)으로부터 유도된다. 실시예에 사용된 hIgG1DM 및 hIgG4WT는 각각 아케소 바이오파마, 인크(Akeso Biopharma, Inc.)에서 제조된 hG1DM 및 hG4WT 불변 영역 서열을 갖는 항-HEL을 갖는 이소타입 대조군 항체이다.
본 발명의 하기 실시예에서, MDA-MB-231 유방암 세포, SNU-251 난소암 세포 및 SK-OV-3 세포는 BRCA1 돌연변이 및 BRCA2 돌연변이를 함유한다.
제조예 1: 항-VEGFA 항체 베바시주맙의 제조
시판되는 항-VEGFA 모노클로날 항체인 아바스틴(베바시주맙)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 대해 중국 특허 공개 번호 CN1259962A를 참조한다. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열의 합성은 진스크립트(Genscript)에 위탁되었다.
베바시주맙 중쇄 가변 영역(베바시주맙-Hv)의 아미노산 서열: (123 aa)
베바시주맙 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열: (369 bp)
베바시주맙 경쇄 가변 영역(베바시주맙-Lv)의 아미노산 서열: (107 aa)
베바시주맙 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열: (321 bp)
중쇄 불변 영역은 모두 Ig 감마-1 쇄 C 영역, ACCESSION: P01857였고; 경쇄 불변 영역은 모두 Ig 카파 쇄 C 영역, ACCESSION: P01834였다.
베바시주맙의 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA를 벡터 pcDNA3.1에 클로닝하고, 베바시주맙 항체의 재조합 발현 플라스미드를 수득하였다. 재조합 플라스미드를 사용하여 293F 세포를 형질감염시켰다. 293F 세포 배양물을 정제한 다음 검출하였다.
이에 따라 항-VEGFA 모노클로날 항체 아바스틴(베바시주맙)이 수득되었다.
제조예 2: 항PD-1 항체 14C12, 이의 인간화 항체 14C12H1L1 및 돌연변이체 14C12H1L1(M)의 서열 설계
항-PD-1 항체 14C12 및 이의 인간화 항체 14C12H1L1의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 및 코딩 핵산 서열은 각각 중국 특허 공개 번호 CN106967172A의 14C12 및 14C12H1L1의 것과 동일하다.
(1) 14C12의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열
14C12 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열: (118 aa)
14C12 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열: (354 bp)
14C12 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열: (107 aa)
14C12 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열: (321 bp)
(2) 인간화 모노클로날 항체 14C12H1L1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 중쇄 및 경쇄 서열
14C12H1L1 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열: (118 aa)
14C12H1L1 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산서열: (354 bp)
14C12H1L1 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열: (107 aa)
14C12H1L1 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산서열: (321 bp)
14C12H1L1 중쇄(14C12H1)의 아미노산 서열: (448 aa)
14C12H1L1 중쇄(14C12H1)를 코딩하는 핵산 서열: (1344 bp)
14C12H1L1 경쇄(14C12L1)의 아미노산 서열: (214 aa)
14C12H1L1 경쇄(14C12L1)를 코딩하는 핵산 서열: (642 bp)
(3) 14C12H1L1(M)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열
14C12H1L1(M)은 14C12H1L1의 프레임워크 영역(경쇄)에 있는 아미노산의 돌연변이에 의해 수득되었다.
14C12H1L1(M)의 중쇄 가변 영역 14C12H1(M):
서열은 14C12H1L1의 중쇄 가변 영역 14C12H1과 동일하다. 즉, 아미노산 서열은 서열번호 9에 기재된다.
14C12H1L1(M)의 경쇄 가변 영역 14C12L1(M): (108 aa; 아미노산 서열에서 밑줄 친 14C12H1L1에 기초한 돌연변이 위치)
제조예 3: 이중특이적 항체의 서열 설계
1. 서열 설계
본원에 기재된 이중특이적 항체의 구조는 모리슨 형태(IgG-scFv)이며, 즉 하나의 IgG 항체의 2개 중쇄의 C-말단이 각각 다른 항체의 scFv 단편에 연결되어 있으며, 중쇄 및 경쇄의 설계는 하기 표 1과 같다.
상기에 기재된 베바시주맙을 기반으로, VP101 항체는 scFv 단편으로서 14C12H1L1(M)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하며, 이는 VP101(M)로 지칭된다. 14C12H1L1과 비교하여, 14C12H1L1(M)은 효과적으로 최적화된 이중특이적 항체 구조 및 개선된 효능을 나타내었다.
[표 1]
상기 표 1에서:
(1) 오른쪽 하단에 "V" 라벨이 있는 것은 상응하는 중쇄의 가변 영역 또는 상응하는 경쇄의 가변 영역을 지칭한다. "V" 라벨이 없는 경우, 상응하는 중쇄 또는 경쇄는 불변 영역을 포함하는 전체 길이이다. 이러한 가변 영역 또는 전체 길이의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 핵산 서열에 대해서는 상기 제조예에 기재된 상응하는 서열을 참조한다.
(2) 링커1의 아미노산 서열은 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 18)이다.
임의적으로, 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 19)이 전술된 링커1을 대체하기 위해 링커2로 사용될 수 있다.
(3) 베바시주맙-H는 중쇄 불변 영역으로 Ig 감마-1 쇄 C 영역(ACCESSION: P01857)을 포함한다.
(4) 베바시주맙-G4H는 중쇄 불변 영역으로 Ig 감마-4 쇄 C 영역(ACCESSION: P01861.1)을 포함한다.
2. 항체 VP101(M)의 발현 및 정제
VP101(M)의 중쇄 cDNA 서열 및 경쇄 cDNA 서열을 각각 벡터 pUC57simple(Genscript 제공)에 클로닝하여 각각 플라스미드 pUC57simple-VP101H 및 pUC57simple-VP101L을 수득하였다.
플라스미드 pUC57simple-VP101H 및 pUC57simple-VP101L은 효소적으로 분해되었다(HindIII&EcoRI). 전기영동에 의해 단리된 중쇄 및 경쇄를 벡터 pcDNA3.1에 서브클로닝하고, 재조합 플라스미드를 추출하여 293F 세포를 공동 형질감염시켰다. 세포 배양 7일 후, 배양 배지를 고속으로 원심분리하고, 상청액을 농축하고, HiTrap MabSelect SuRe 컬럼에 로딩하였다. 단백질을 추가로 용출 버퍼로 1단계 용출시키고, 버퍼 교환에 의해 표적 샘플 항체 VP101을 단리하고 PBS로 옮겼다.
3. 항체 VP101(M)의 검출
정제된 샘플을 환원 단백질 전기영동 로딩 버퍼 및 비-환원 단백질 전기영동 로딩 버퍼 모두에 첨가하고 끓인 후 SDS-PAGE 전기영동 분석을 수행하였다.
제조예 4의 돌연변이 항체와의 구별을 위해, 본 발명에서 VP101(M)은 VP101(hG1WT)로도 지칭된다. 상기에 기재된 VP101(M)은 중쇄 불변 영역으로 Ig 감마-1 쇄 C 영역(ACCESSION: P01857) 및 경쇄 불변 영역으로 Ig 카파 쇄 C 영역(ACCESSION: P01834)을 포함하는 "야생형"이다.
VP101(hG1WT)의 면역글로불린 모이어티의 중쇄의 아미노산 서열: (453 aa)
VP101(hG1WT)의 면역글로불린 모이어티의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열: (1359 bp)
제조예 4의 돌연변이 항체와의 구별을 위해, 본 발명에서 VP101(G4M)은 VP101(hG4WT)로도 지칭된다. 상기에 기재된 VP101(G4M)은 중쇄 불변 영역으로 Ig 감마-4 쇄 C 영역(ACCESSION: P01861.1) 및 경쇄 불변 영역으로 Ig 카파 쇄 C 영역(ACCESSION: P01834)을 포함하는 "야생형"이다.
VP101(hG4WT)의 면역글로불린 모이어티의 중쇄의 아미노산 서열: (450 aa)
VP101(hG4WT)의 면역글로불린 모이어티의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열: (1350 bp)
제조예 4: 인간화 이중특이적 항체 VP101(hG1WT) 기반의 비-가변 영역 아미노산 돌연변이 설계
제조예 3에서 수득된 VP101(hG1WT)을 기반으로 위치 234에 류신의 알라닌으로의 포인트 돌연변이(L234A)를 도입하고, 위치 235에 류신의 알라닌으로의 포인트 돌연변이(L235A)를 도입하여 VP101(hG1DM)을 수득하였다.
VP101(hG1DM)의 면역글로불린 모이어티의 중쇄의 아미노산 서열: (453 aa, 밑줄친 돌연변이 위치)
VP101(hG1DM)의 면역글로불린 모이어티의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열: (1359 bp, 밑줄친 돌연변이 위치)
VP101(hG1DM), VP101(hG1WT) 및 VP101(hG4WT)의 면역글로불린 모이어티의 경쇄의 아미노산 서열은 동일하고, 코딩 핵산 서열도 동일하다.
VP101(hG1DM)의 면역글로불린 모이어티의 경쇄의 아미노산 서열: (214 aa)
VP101(hG1DM)의 면역글로불린 모이어티의 경쇄를 코딩하는 핵산 서열: (642 bp)
실시예 1: VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)에 대한 FcγRI의 친화도 상수 검정
CD64로도 공지된 Fc 수용체 FcγRI는 IgG 항체의 Fc 단편에 결합할 수 있으며, 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)에 관여한다. Fc 수용체에 대한 치료 모노클로날 항체의 결합 능력은 항체의 안전성 및 효능에 영향을 미칠 것이다.
항체의 ADCC 활성을 평가하기 위해 포르테비오 옥테트 시스템을 이용하여 FcγRI에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 친화도 상수를 측정하였다.
포르테비오 옥테트 시스템에 의한 FcγRI에 대한 항체의 친화도 상수를 결정하는 방법을 간략하게 설명하면 하기와 같다: 샘플 희석 버퍼는 PBS, pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20 및 0.1% BSA의 용액이었다. 1 μg/mL FcγRIa를 HIS1K 센서에 50초 동안 고정시켰다. 센서는 60초 동안 버퍼에서 평형화되었고, 3.12-50 nM(2배 희석) 농도의 항체에 대한 센서에 고정된 CD64의 결합은 120초 동안 결정되었다. 항체를 버퍼에서 120초 동안 해리시켰다. 센서는 10 mM 글리신 pH 1.5에서 각각 5초 동안 4회 새로 고쳤다. 검출 온도는 30℃이고, 주파수는 0.3 Hz였다. 데이터는 1:1 모델 피팅으로 분석되어 친화도 상수를 얻었다.
VP101(hG1WT), VP101(hG4WT) 및 VP101(hG1DM), 및 참조 항체 니볼루맙 및 베바시주맙에 대한 FcγRI의 친화도 상수 검정 결과를 표 1 및 도 1 내지 5에 나타내었다.
N/A는 항체가 항원에 대한 결합이 없거나 극히 약한 결합 신호를 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서, 결과는 분석되지 않았으며 상응하는 데이터도 얻지 못하였다.
결과는 VP101(hG1WT)은 3.95E-09M의 친화도 상수로 FcγRI에 결합하고; VP101(hG4WT)는 8.52E-09M의 친화도 상수로 FcγRI에 결합하고; 베바시주맙은 3.68E-09M의 친화도 상수로 FcγRI에 결합하고; 니볼루맙은 6.20E-09M의 친화도 상수로 FcγRI에 결합하고; VP101(hG1DM)은 FcγRI에 대한 결합이 없거나 결합 신호가 매우 약하여 결과가 분석되지 않았으며 상응하는 데이터도 얻지 못하였다는 것을 나타내었다.
결과는 FcγRI에 대한 결합이 없는 VP101(hG1DM) 이외의 항체가 FcγRI에 대해 유사한 결합을 갖는다는 것을 입증하였다. VP101(hG1DM)의 결합 활성이 효과적으로 제거되었다.
실시예 2: VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)에 대한 FcγRIIa_H131의 친화도 상수 검정
Fc 수용체 FcγRIIa_H131(CD32a_H131로도 공지됨)은 IgG 항체의 Fc 단편에 결합하고 ADCC 효과를 매개할 수 있다.
항체의 ADCC 활성을 평가하기 위해 포르테비오 옥테트 시스템을 이용하여 FcγRIIa_H131에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 친화도 상수를 측정하였다.
포르테비오 옥테트 시스템에 의한 FcγRIIa_H131에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 친화도 상수를 결정하는 방법을 간략하게 설명하면 하기와 같다: 고정화 희석 버퍼는 PBS, pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20 및 0.1% BSA의 용액이고, 분석물 희석 버퍼는 PBS, pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20, 0.02% 카세인 및 0.1% BSA의 용액이었다. 5 μg/mL FcγRIIa_H131를 NTA 센서에 약 60 nm의 고정화 시간 동안 고정시켰다. 센서는 차단을 위해 600초 동안 PBS pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20, 0.02% 카제인 및 0.1% BSA의 버퍼에서 평형화되었고, 12.5-200 nM(일련의 2배 희석) 농도의 항체에 대한 센서에 고정된 FcγRIIa_H131의 결합은 60초 동안 결정되었다. 항체를 버퍼에서 60초 동안 해리시켰다. 센서는 10 mM 글리신 pH 1.7 및 10 nM 황산니켈에서 새로 고쳤다. 검출 온도는 30℃이고, 주파수는 0.6 Hz였다. 데이터는 1:1 모델 피팅으로 분석되어 친화도 상수를 얻었다.
VP101(hG1WT), VP101(hG4WT) 및 VP101(hG1DM) 및 참조 항체 니볼루맙 및 베바시주맙에 대한 FcγRIIa_H131의 친화도 상수 검정 결과를 표 2 및 도 6 내지 10에 나타내었다.
N/A는 항체가 항원에 대한 결합이 없거나 극히 약한 결합 신호를 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서, 결과는 분석되지 않았으며 상응하는 데이터도 얻지 못하였다.
결과는 VP101(hG1WT)은 2.28E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIa_H131에 결합하고; VP101(hG4WT)는 3.68E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIa_H131에 결합하고; 베바시주맙은 6.44E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIa_H131에 결합하고; VP101(hG1DM)은 3.57E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIa_H131에 결합하고; 니볼루맙은 FcγRIIa_H131에 대한 결합이 없거나 결합 신호가 매우 약하여 결과가 분석되지 않았으며 상응하는 데이터도 얻지 못하였다는 것을 나타내었다.
결과는 FcγRIIa_H131에 결합하지 않는 니볼루맙 이외의 항체가 FcγRIIa_H131에 대해 VP101(hG1WT), VP101(hG1DM), VP101(hG4WT), 베바시주맙의 내림차순으로 결합 친화도를 나타낸다는 것을 입증하였다.
실시예 3: VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)에 대한 FcγRIIa_R131의 친화도 상수 검정
Fc 수용체 FcγRIIa_R131(CD32a_R131로도 공지됨)은 IgG 항체의 Fc 단편에 결합하고 ADCC 효과를 매개할 수 있다.
항체의 ADCC 활성을 평가하기 위해 포르테비오 옥테트 시스템을 이용하여 FcγRIIa_R131에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 친화도 상수를 측정하였다.
포르테비오 옥테트 시스템에 의한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 친화도 상수를 결정하는 방법을 간략하게 설명하면 하기와 같다: 고정화 희석 버퍼는 PBS, pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20 및 0.1% BSA의 용액이고, 분석물 희석 버퍼는 PBS, pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20, 0.02% 카세인 및 0.1% BSA의 용액이었다. 5 μg/mL FcγRIIa_H131를 NTA 센서에 약 60 nm의 고정화 시간 동안 고정시켰다. 센서는 차단을 위해 600초 동안 PBS pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20, 0.02% 카제인 및 0.1% BSA의 버퍼에서 평형화되었고, 12.5-200 nM(일련의 2배 희석) 농도의 항체에 대한 센서에 고정된 FcγRIIa_R131의 결합은 60초 동안 결정되었다. 항체를 버퍼에서 60초 동안 해리시켰다. 센서는 10 mM 글리신 pH 1.7 및 10 nM 황산니켈에서 새로 고쳤다. 검출 온도는 30℃이고, 주파수는 0.6 Hz였다. 데이터는 1:1 모델 피팅으로 분석되어 친화도 상수를 얻었다.
VP101(hG1WT), VP101(hG4WT) 및 VP101(hG1DM), 및 참조 항체 니볼루맙 및 베바시주맙에 대한 FcγRIIa_R131의 친화도 상수 검정 결과를 표 3 및 도 11 내지 15에 나타내었다.
N/A는 항체가 항원에 대한 결합이 없거나 극히 약한 결합 신호를 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서, 결과는 분석되지 않았으며 상응하는 데이터도 얻지 못하였다.
결과는 VP101(hG1WT)은 2.42E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIa_R131에 결합하고; VP101(hG4WT)는 3.57E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIa_R131에 결합하고; 베바시주맙은 5.16E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIa_R131에 결합하고; 니볼루맙은 6.93E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIa_R131에 결합하고; VP101(hG1DM)은 3.35E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIa_R131에 결합한다는 것을 나타내었다.
결과는 항체가 FcγRIIa_R131에 대해 VP101(hG1WT), VP101(hG1DM), VP101(hG4WT), 베바시주맙, 니볼루맙의 내림차순으로 결합 친화도를 나타낸다는 것을 입증하였다.
실시예 4: VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)에 대한 FcγRIIb의 친화도 상수 검정
Fc 수용체 FcγRIIb(CD32b로도 공지됨)는 IgG 항체의 Fc 단편에 결합할 수 있고 면역 세포의 기능 조절에 관여한다.
Fc 수용체에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 결합 능력을 평가하기 위해 포르테비오 옥테트 시스템을 이용하여 FcγRIIb에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 친화도 상수를 측정하였다.
포르테비오 옥테트 시스템에 의한 FcγRIIb에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 친화도 상수를 결정하는 방법을 간략하게 설명하면 하기와 같다: 고정화 희석 버퍼는 PBS, pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20 및 0.1% BSA의 용액이고, 분석물 희석 버퍼는 PBS, pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20, 0.02% 카세인 및 0.1% BSA의 용액이었다. 5 μg/mL hFCGR2B-his를 NTA 센서에 약 60 nm의 고정화 시간 동안 고정시켰다. 센서는 차단을 위해 600초 동안 PBS pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20, 0.02% 카제인 및 0.1% BSA의 버퍼에서 평형화되었고, 12.5-200 nM(일련의 2배 희석) 농도의 항체에 대한 센서에 고정된 hFCGR2B-his의 결합은 60초 동안 결정되었다. 항체를 버퍼에서 60초 동안 해리시켰다. 센서는 10 mM 글리신 pH 1.7 및 10 nM 황산니켈에서 새로 고쳤다. 검출 온도는 30℃이고, 주파수는 0.6 Hz였다. 데이터는 1:1 모델 피팅으로 분석되어 친화도 상수를 얻었다.
실시예 5: VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)에 대한 FcγRIIIa_V158의 친화도 상수 검정
Fc 수용체 FcγRIIIa_V158(CD16a_V158로도 공지됨)은 IgG 항체의 Fc 단편에 결합하고 ADCC 효과를 매개할 수 있다.
항체의 ADCC 활성을 평가하기 위해 포르테비오 옥테트 시스템을 이용하여 FcγRIIIa_V158에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 친화도 상수를 측정하였다.
포르테비오 옥테트 시스템에 의한 FcγRIIIa_V158에 대한 항체의 친화도 상수를 결정하는 방법을 간략하게 설명하면 하기와 같다: 샘플 희석 버퍼는 PBS, pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20 및 0.1% BSA의 용액이었다. 5 μg/mL FcγRIIIa_V158을 HIS1K 센서에 120초 동안 고정시켰다. 센서는 60초 동안 버퍼에서 평형화되었고, 31.25-500 nM(일련의 2배 희석) 농도의 항체에 대한 센서에 고정된 hFcGR3A(V158)-his의 결합은 60초 동안 결정되었다. 항체를 버퍼에서 60초 동안 해리시켰다. 센서는 10 mM 글리신 pH 1.5에서 각각 5초 동안 4회 새로 고쳤다. 검출 온도는 30℃이고, 주파수는 0.3 Hz였다. 데이터는 1:1 모델 피팅으로 분석되어 친화도 상수를 얻었다.
VP101(hG1WT), VP101(hG4WT) 및 VP101(hG1DM), 및 참조 항체 니볼루맙 및 베바시주맙에 대한 FcγRIIIa_V158의 친화도 상수 검정 결과를 표 4 및 도 16 내지 20에 나타내었다.
N/A는 항체가 항원에 대한 결합이 없거나 극히 약한 결합 신호를 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서, 결과는 분석되지 않았으며 상응하는 데이터도 얻지 못하였다.
결과는 VP101(hG1WT)은 4.35E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIIa_V158에 결합하고; VP101(hG1DM)은 1.34E-07M의 친화도 상수로 FcγRIIIa_V158에 결합하고; 베바시주맙은 2.76E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIIa_V158에 결합하고; 니볼루맙 및 VP101(hG4WT)은 FcγRIIIa_V158에 대한 결합이 없거나 결합 신호가 매우 약하여 결과가 분석되지 않았으며 상응하는 데이터도 얻지 못하였다는 것을 나타내었다.
결과는 FcγRIIIa_V158에 결합하지 않는 니볼루맙 및 VP101(hG4WT) 이외의 항체가 FcγRIIIa_V158에 대해 베바시주맙, VP101(hG1WT), VP101(hG1DM)의 내림차순으로 결합 친화도를 나타낸다는 것을 입증하였다.
실시예 6: VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)에 대한 FcγRIIIa_F158의 친화도 상수 검정
Fc 수용체 FcγRIIIa_F158(CD16a_F158로도 공지됨)은 IgG 항체의 Fc 단편에 결합하고 ADCC 효과를 매개할 수 있다.
항체의 ADCC 활성을 평가하기 위해 포르테비오 옥테트 시스템을 이용하여 FcγRIIIa_F158에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 친화도 상수를 측정하였다.
포르테비오 옥테트 시스템에 의한 FcγRIIIa_F158에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM의 친화도 상수를 결정하는 방법을 간략하게 설명하면 하기와 같다: 샘플 희석 버퍼는 PBS, pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20 및 0.1% BSA의 용액이었다. 5 μg/mL FcγRIIIa_F158을 HIS1K 센서에 120초 동안 고정시켰다. 센서는 60초 동안 버퍼에서 평형화되었고, 31.25-500 nM(일련의 2배 희석) 농도의 항체에 대한 센서에 고정된 hFcGR3A(F158)-his의 결합은 60초 동안 결정되었다. 항체를 버퍼에서 60초 동안 해리시켰다. 센서는 10 mM 글리신 pH 1.5에서 각각 5초 동안 4회 새로 고쳤다. 검출 온도는 30℃이고, 주파수는 0.3 Hz였다. 데이터는 1:1 모델 피팅으로 분석되어 친화도 상수를 얻었다.
VP101(hG1WT), VP101(hG4WT) 및 VP101(hG1DM), 및 참조 항체 니볼루맙 및 베바시주맙에 대한 FcγRIIIa_F158의 친화도 상수 검정 결과를 표 5 및 도 21 내지 25에 나타내었다.
N/A는 항체가 항원에 대한 결합이 없거나 극히 약한 결합 신호를 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서, 결과는 분석되지 않았으며 상응하는 데이터도 얻지 못하였다.
결과는 VP101(hG1WT)은 7.41E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIIa_F158에 결합하고; 베바시주맙은 9.32E-08M의 친화도 상수로 FcγRIIIa_F158에 결합하고; 니볼루맙, VP101(hG4WT) 및 VP101(hG1DM)은 FcγRIIIa_F158에 대한 결합이 없거나 결합 신호가 매우 약하여 결과가 분석되지 않았으며 상응하는 데이터도 얻지 못하였다는 것을 나타내었다.
결과는 FcγRIIIa_V158에 결합하지 않는 니볼루맙, VP101(hG4WT) 및 VP101(hG1DM 이외의 항체가 FcγRIIIa_F158에 대해 VP101(hG1WT), 베바시주맙의 내림차순으로 결합 친화도를 나타낸다는 것을 입증하였다.
실시예 7: VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)에 대한 C1q의 친화도 상수 검정
혈청 보체 C1q는 IgG 항체의 Fc 단편에 결합하고 CDC 효과를 매개할 수 있다. C1q에 대한 치료 모노클로날 항체의 결합 능력은 항체의 안전성 및 효능에 영향을 미칠 것이다.
항체의 CDC 활성을 평가하기 위해 포르테비오 옥테트 시스템을 이용하여 C1q에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 친화도 상수를 측정하였다.
포르테비오 옥테트 시스템에 의한 C1q에 대한 항체의 친화도 상수를 결정하는 방법을 간략하게 설명하면 하기와 같다: 샘플 희석 버퍼는 PBS, pH 7.4 중의 0.02% 트윈-20 및 0.1% BSA의 용액이었다. 50 μg/mL 항체를 FAB2G 센서에 약 2.0 nm의 고정화 높이에서 고정시켰다. 센서는 차단을 위해 60초 동안 버퍼에서 평형화되었고, 0.625-10 nM(2배 희석) 농도의 C1q에 대한 센서에 고정된 항체의 결합은 60초 동안 결정되었다. 항원 및 항체를 버퍼에서 120초 동안 해리시켰다. 센서는 10 mM 글리신 pH 1.7에서 각각 5초 동안 4회 새로 고쳤다. 샘플 플레이트의 진동 속도는 1000 rpm이고, 검출 온도는 30℃이고, 주파수는 0.6 Hz였다. 데이터는 1:1 모델 피팅으로 분석되어 친화도 상수를 얻었다. 데이터 획득 소프트웨어는 포르테비오 데이터 획득 7.0이고, 데이터 분석 소프트웨어는 포르테비오 데이터 분석 7.0이었다.
VP101(hG1WT), VP101(hG4WT) 및 VP101(hG1DM), 및 참조 항체 니볼루맙 및 베바시주맙에 대한 C1q의 친화도 상수 검정 결과를 표 6 및 도 26 내지 30에 나타내었다.
N/A는 항체가 항원에 대한 결합이 없거나 극히 약한 결합 신호를 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서, 결과는 분석되지 않았으며 상응하는 데이터도 얻지 못하였다.
결과는 VP101(hG1WT)은 9.76E-10M의 친화도 상수로 C1q에 결합하고; 베바시주맙은 1.14E-09M의 친화도 상수로 C1q에 결합하고; 니볼루맙, VP101(hG4WT) 및 VP101(hG1DM)은 C1q에 대한 결합이 없거나 결합 신호가 매우 약하여 결과가 분석되지 않았으며 상응하는 데이터도 얻지 못하였다는 것을 나타내었다.
결과는 FcγRIIIa_F158에 결합하지 않는 니볼루맙, VP101(hG4WT) 및 VP101(hG1DM) 이외의 항체가 C1q에 대해 결합 친화성을 나타내고, VP101(hG1WT) 및 베바시주맙은 유사한 친화도를 갖는다는 것을 입증하였다.
실시예 8: PD-1 항원을 발현하는 CHO-K1-PD1 세포에서 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 ADCC 활성 검정
세포학적 수준에서 항체 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 ADCC 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 PD-1을 발현하는 CHO-K1-PD1 세포 및 정상 인간 PBMC와 표적 세포의 혼합 림프구 반응 시스템을 구축하였다.
PD-1 항원을 발현하는 CHO-K1-PD1 세포에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 ADCC 활성 검정 방법은 하기와 같다:
먼저 인간 PD-1 과발현 벡터 pCDH-CMV-PD1FL-Puro를 구축하고(pCDH-CMV-Puro는 유비오(Youbio)에서 구입함), CHO-K1 세포를 감염시키기 전에 발현 벡터를 바이러스로 패키징하였다. 스크리닝을 위해 퓨로마이신(2 μg/mL)을 첨가하고, 막 PD-1 단백질을 안정적으로 발현하는 약물 내성을 갖는 CHO-K1-PD1 안정 세포주를 수득하였다. 정상 인간 PBMC를 피콜 말초 혈액 단핵 세포 분리 배지 매뉴얼에 따라 수득하였다. 단리된 PBMC를 1640 완전 배양 배지에 재현탁하였다. 트리판 블루 염색 후, 세포를 계수하고, 생존력을 분석하고, 37℃, 5% CO2 및 포화 습도의 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, CHO-K1-PD1 세포 및 PBMC를 별도로 수집하고 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 세포 펠릿을 RPMI-1640(1% BSA 함유) (이하 분석 배지로 지칭함)에 재현탁하고, 원심분리하고, 2회 세척하였다. 세포를 계수하고, 생존력을 분석하고, 분석 배지를 사용하여 적절한 세포 밀도 범위를 조정하였다. 연구 설계에 따라, CHO-K1-PD1 세포 현탁액을 96 웰 플레이트(30000개/웰)에 첨가하고, 50 μL의 항체를 첨가하였다. 혼합물을 균일하게 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션 후, PBMC를 900,000개 세포/50 μL/웰의 농도로 첨가하였다. 혼합물을 잘 혼합하고, 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 4시간 후, 96 웰 플레이트를 꺼내고, 250 Xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 100 μL의 상청액을 새로운 96 웰 평저 마이크로플레이트에 조심스럽게 옮겼다(세포 침전물을 피펫팅하지 않음). 세포독성 검출 키트 지침에 따라 100 μL의 새로 준비된 반응 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 암실에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. OD 값을 490 nm 및 650 nm에서 측정하였으며, OD = OD490nm - OD650nm로 계산하였다. 각각의 그룹에 대한 ADCC 활성을 ADCC(%) = (처리군 - 음성 대조군)/(표적 세포 LDH 최대 방출 - 표적 세포 LDH 자연 방출) X 100%로 계산하였다.
PD-1 항원을 발현하는 CHO-K1-PD1 세포에서 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 ADCC 활성 검정 결과를 ADCC%로 표시하고, 도 31에 나타내었다.
결과는 양성대조군 14C12H1L1(G1WT)이 PBMC와 CHO-K1-PD1 세포의 혼합 림프구 반응에서 상당한 ADCC 활성을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 ADCC 시스템이 정상임을 나타낸다. 이소타입 대조군 항체 hIgG1DM과 비교하여, VP101(hG1WT)는 용량 의존적으로 상당한 ADCC 활성을 나타낸 반면, VP101(G1DM)은 ADCC 활성을 나타내지 않았다. 결과는 VP101(hG1WT)을 기반으로 돌연변이에 의해 생성된 VP101(hG1DM)이 세포학적 수준에서 ADCC 활성이 없으며 ADCC 효과가 제거된다는 것을 시사하였다.
실시예 9: PD-1 항원을 발현하는 CHO-K1-PD1 세포에서 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 CDC 활성 검정
세포학적 수준에서 항체 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 CDC 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 PD-1을 발현하는 CHO-K1-PD1 세포(구축 방법에 대해 실시예 8 참조) 및 표적 세포와 정상 인간 보체 혈청의 혼합 림프구 반응 시스템을 구축하였다.
PD-1 항원을 발현하는 CHO-K1-PD1 세포에 대한 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 CDC 활성 검정 방법은 하기와 같다:
검출 당일, CHO-K1-PD1 세포를 트립신을 사용하여 분해하여 수집하고, 170 Xg에서 5분 동안 원심분리한 후, RPMI-1640(1% BSA 함유) (이하 분석 배지로 지침함)에 재현탁하고, 원심분리하고, 2회 세척하였다. 세포를 계수하고, 생존력을 분석하고, 분석 배지를 사용하여 적절한 세포 밀도 범위를 조정하였다. 연구 설계에 따라, CHO-K1-PD1 세포 현탁액을 96 웰 플레이트(30000개/웰)에 첨가하고, 50 μL의 항체를 첨가하였다. 혼합물을 균일하게 혼합하고, 실온에서 10분 동안 사전 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션 후, 정상 인간 보체 혈청(최종 농도: 2%)을 50 μL/웰로 첨가하였다. 혼합물을 잘 혼합하고, 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 4시간 후, 혼합물을 250 Xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 100 μL의 상청액을 조심스럽게 피펫팅하고, 새로운 96 웰 평저 플레이트에 조심스럽게 옮겼다(세포 침전물을 피펫팅하지 않음). 세포독성 검출 키트 지침에 따라 100 μL의 새로 준비된 반응 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 암실에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. OD 값을 490 nm 및 650 nm에서 측정하였으며, OD = OD490nm - OD650nm로 계산하였다. 각각의 그룹에 대한 CDC 활성을 CDC(%) = (처리군 - 음성 대조군)/(표적 세포 LDH 최대 방출 - 표적 세포 LDH 자연 방출) X 100%로 계산하였다.
PD-1 항원을 발현하는 CHO-K1-PD1 세포에서 VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)의 CDC 활성 검정 결과를 CDC%로 표시하고, 도 32에 나타내었다.
결과는 이소타입 대조군 항체 hIgG1DM과 비교하여, 양성 대조군 항체 14C12H1L1(G1WT)이 정상 인간 보체 혈청과 CHO-K1-PD1 세포의 혼합 림프구 반응에서 CDC%에 상당한 차이가 있음을 나타내었으며, 이는 CDC 시스템이 정상적임을 나타낸다. 동등한 용량 수준에서, VP101(hG1WT) 및 VP101(hG1DM)은 이소타입 대조군과 비교하여 CDC%에 유의한 차이가 없다.
실시예 10: 말초 혈액 단핵 세포와 Raji-PDL1 세포의 혼합 림프구 반응(MLR)에 의해 측정된 VP101(hG1DM)의 약력학적 활성
먼저, 인간 PD-L1 과발현 벡터 plenti6.3-PD-L1-BSD를 구축하고(plenti6.3-BSD는 인비트로겐(Invitrogen)에서 구입함), Raji 세포를 감염시키기 전에 발현 벡터를 바이러스로 패키징하였다. 스크리닝을 위해 BSD(10 μg/mL)를 첨가하고, 막 PD-L1 단백질을 안정적으로 발현하는 Raji-PDL1 안정 세포주를 수득하였다. 정상 인간 PBMC를 피콜 말초 혈액 단핵 세포 단리 지침에 따라 단리하였다. 단리된 PBMC를 1640 완전 배지에 재현탁하고, 계수하고, 동결하였다. PBMC를 해동하고, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 장독소 B(SEB)와 함께 2일 동안 공동 인큐베이셔하였다. 2일 후, 대수기의 Raji-PDL1 세포를 수집하고, 미토마이신 C(Sigma, 작업 농도: 25 μg/mL)를 첨가하였다. Raji-PDL1 세포를 인큐베이터에서 60분 동안 인큐베이션하고, 원심분리하고, 세척하였다. SEB 자극 2일 후 PBMC를 수집하고, 세척하였다. 혼합 림프구 반응을 항체 유무에 관계없이 1:1의 세포 수 비율로 수행하였다. 3일 후, 상청액을 원심분리로 수집하고, 상청액 중의 IL-2 및 IFN-γ 농도를 ELISA로 검출하였다.
IFN-γ 분비 결과를 도 33에 나타내었다. 결과는 VP101(hG1DM)이 니볼루맙에 비해 상당히 우수한 활성으로 IFN-γ 분비를 효과적으로 촉진할 수 있음을 나타낸다.
IL-2 분비 결과를 도 34에 나타내었다. 결과는 VP101(hG1DM)이 니볼루맙에 비해 상당히 우수한 활성으로 용량 의존적 방식으로 IL-2 분비를 효과적으로 촉진할 수 있음을 나타낸다.
실시예 11: PD-1 양성 세포에 대한 VP101(hG1DM)의 항체 의존성 세포 식세포작용 활성의 부재
항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)은 세포 표면 항원에 결합된 항체의 Fc 단편이 대식세포와 같은 식세포 작용적으로 활성인 세포의 Fc 수용체에 결합하여 항체 결합된 세포의 식세포작용을 매개하는 것을 지칭한다. PD-1 항체와 같은 면역 체크포인트 억제제 항체의 경우, ADCP 활성의 존재는 항종양 사멸 효과를 발휘하는 PD-1을 발현하는 면역 세포에 손상을 유발하여 항종양 활성에 영향을 미칠 것이다.
본 실험에서, 뮤린의 대식세포를 이펙터 세포로 사용하고, PD-1을 과발현하는 CHO-K1-PD1 세포(구축 방법에 대해 실시예 8 참조)를 표적 세포로 사용하여 매개된 ADCP 효과를 시험하였다. PD-1을 발현하는 세포에 대한 VP101(hG1DM)의 ADCP 활성을 유동 세포측정으로 결정하였으며, 그 결과 항체는 ADCP 활성이 없는 반면, 동일한 표적을 갖는 승인된 PD-1 항체 니볼루맙은 상당한 ADCP 활성을 갖는 것으로 나타났다. 방법은 하기와 같다:
C57 마우스(광동 의학 실험 동물 센터(Guangdong Medical Laboratory Animal Center)에서 구입함)의 대퇴 골수를 먼저 무균적으로 수집하고, 얼음 위의 적혈구 용해 버퍼로 5분 동안 용해시켰다. DMEM 완전 배지(10% FBS 함유)를 사용하여 용해를 종료하고, 용해물을 1000 rpm으로 원심분리하고, 2회 세척하였다. 세포 펠릿을 10 mL의 DMEM 완전 배지에 재현탁하고, M-CSF를 100 ng/mL의 작업 농도로 첨가하였다. 유도를 위해 세포를 세포 배양 챔버에서 37℃ 및 5% CO2에서 7일 동안 배양하였다. 배지의 절반을 교환하고, 제3일 및 제5일에 M-CSF를 첨가하였다. 세포 유도는 7일에 완료되었다. 세포를 0.25% 트립신으로 분해하였다. 대식세포를 수집하고, 750 Xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세포를 DMEM 완전 배지(10% FBS 함유)에 현탁하고, 계수하였다. 세포를 적절한 밀도로 조정하고, 추가 사용을 위해 96 웰 플레이트에 채웠다.
CHO-K1-PD1 세포를 통상적인 방법으로 수집하고, 170 Xg에서 5분 동안 원심분리하고, 재현탁하고, 계수하고, 생존력에 대해 분석하고, PBS로 1회 세척하였다. 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE)를 PBS로 2.5 μM로 희석하고, 세포를 재현탁하였다(염색 밀도: 1천만개 세포/mL). 적당량의 세포를 세포 인큐베이터에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 염색을 중단시키기 위해 6 mL의 DMEM 완전 배지(FBS 10% 함유)를 사용하였다. 세포를 170 Xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 1 mL의 DMEM 완전 배지를 첨가하고, 세포를 인큐베이터에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 항체를 DMEM 완전 배지로 20 μg/mL, 2 μg/mL 및 0.2μg/mL(작업 농도 10 μg/mL, 1 μg/mL 및 0.1 μg/mL)로 희석하고, 이소타입 대조군 항체 hIgG1DM 및 hIgG4를 설계하였다. 새로 유도된 성숙한 대식세포를 수집하고, 750 Xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 계수하고, 96 웰 플레이트에 옮기로, 1000 Xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. CHO-K1-PD1-CFSE 세포 밀도를 조정하였다. 설계에 따라, 희석된 항체 및 표적 세포를 대식세포가 포함된 96 웰 플레이트의 웰에 50 μL:50 μL의 비율로 첨가하고, 재현탁하고, 잘 혼합하고, 37℃의 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 150 μL의 1% PBSA를 실온에서 각각의 웰에 첨가하였다. 혼합물을 1000 Xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 세포를 200 μL의 PBSA로 1회 세척하였다. APC 항-마우스/인간 CD11b 항체(PBSA로 500배 희석)를 상응하는 샘플에 100 μL/샘플로 첨가하고, 혼합물을 잘 혼합하고, 얼음 위에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 150 μL의 1% PBSA를 각각의 웰에 첨가하고, 1000 Xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 각각의 웰을 200 μL의 PBSA로 1회 세척하였다. 재현탁을 위해 200 μL의 1% PBSA를 각각의 웰에 첨가하고, 베크만(Beckman) 유동 세포측정기에 로딩하였다.
시스템의 대식세포는 APC+ 양성이었고, 식세포작용에 관여한 대식세포는 APC 및 CFSE 이중 양성이었다. 식세포작용 속도를 APC 양성 세포 수에 대한 이중 양성 세포 수의 비율로 결정하였고, 항체 매개된 ADCP 활성을 평가하였다. P%로 표시되는 각각의 그룹의 ADCP 활성은 하기 수학식에 따라 계산되었다:
결과를 도 35에 나타내었다.
결과는 니볼루맙이 대식세포 + CHO-K1-PD1 시스템에서 상당한 ADCP 효과를 갖는다는 것을 나타내었으며; VP101(hG1DM)의 식세포작용 속도는 이소타입 대조군 항체와 유사하였으며, 이는 VP101(hG1DM)이 ADCP 효과가 없음을 나타낸다. 결과는 VP101(hG1DM)이 우수한 항종양 효능을 가질 가능성이 있다는 것을 시사하였다.
실시예 12: 유방암 치료를 위한 VP101(hG1DM) 단독요법의 동물 연구
본 연구는 유방암 이종이식편의 생체내 세포 증식에 대한 VP101(hG1DM)의 항종양 활성을 조사하였다. 프로토콜은 하기 표 7에 나타나 있다.
젬파마텍(GemPharmatech)에서 구입한 5주령의 심각한 면역결핍을 갖는 암컷 NCG 마우스가 본 연구에 사용되었다. 이소타입 대조군 항체 hIgG4는 아케소 바이오파마, 인크(Akeso Biopharma, Inc.)에 의해 상기 기재된 방법을 이용하여 구축되었다. PBMC는 상기에 기재된 방법을 이용하여 아케소 바이오파마, 인크에 의해 단리되고 활성화되었다.
수집된 유방암 MDA-MB-231 세포를 12마리 마우스의 유방 패드에 2백만개 세포/50 μL/마우스로 접종하였다. 접종 30일 후, 마우스를 종양 부피에 따라 음성 대조군 및 VP101(hG1DM) 그룹의 2개 그룹으로 나누었다. 같은 날 PBMC를 1백만개 세포/50 μL/마우스의 용량으로 피하 투여하였으며, PBMC 투여일을 제0일로 기록하였다. 처리는 제0일, 제7일, 제14일 및 제21일에 이루어졌다. 종양 부피는 버니어 캘리퍼로 측정되었다. 종양 크기는 버니어 캘리퍼를 사용하여 그룹화한 후 매주 2회 측정되었으며, 종양 부피는 수학식: TV = 0.5 Х ab2 에 따라 계산되었으며, 여기서 a는 종양의 가장 긴 직경이고, b는 종양의 가장 짧은 직경이고, TV는 종양의 부피이다.
결과를 도 36에 나타내었다. 결과는 VP101(hG1DM)이 유방암 MDA-MB-231 세포의 부피 증가를 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 나타내었으며, 이는 이소타입 대조군 항체에 비해 우수한 항종양 효능, 특히 항-유방암 효능을 나타낸다.
실시예 13: 난소암 세포 억제를 위한 PARPi와 VP101(hG1DM) 조합 요법의 연구
대수 성장기의 SNU-251 난소암 세포(오투 바이오텍(Otwo Biotech), 카달로그 번호: HTX2700C)를 트립신으로 분해하여 단일 세포 현탁액으로 제조하였다. 세포를 계수하고, 적절한 세포 밀도로 조정하고, 6 웰 플레이트에 웰당 2 x 105개로 시딩하고, RPMI 1640 배지(집코(Gibco), 카탈로그 번호: 22400-089)에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
세포가 60%-70%까지 성장한 후, 세포를 대조군 및 처리군을 포함하는 그룹으로 투여하기 위해 나누고, 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
트랜스웰 챔버를 24 웰 플레이트에 배치하고, 상부 챔버에 100 μL의 RPMI 1640 배지를 첨가하고, 혼합물을 인큐베이터에서 1시간 동안 평형화시켰다. 6 웰 플레이트의 세포를 트립신을 사용하여 분해하고, 무혈청 배양 배지를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 제조하였다. 세포를 계수하고, 세포 밀도를 4×104개 세포/100 μL로 조정하였다. 세포를 상부 챔버에 시딩하고, 10% 소 태아 혈청을 함유한 600 μL의 RPMI 1640 배양 배지를 하부 챔버에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 트랜스웰 챔버를 꺼내고, 배양 배지를 제거하였다. 하부 챔버 세포를 PBS로 2분 동안 고정시키고, 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정시켰다. 챔버를 PBS로 2회 세척하였다.
하부 챔버의 세포를 500 μL의 0.1% 크리스탈 바이올렛 염료로 15분 동안 염색하였다. 잔여 염료를 PBS로 세척하였다. 상부 챔버의 세포를 면봉으로 조심스럽게 닦아내었다. 챔버를 슬라이드 위에 놓고, 현미경 하에서 3개의 시야를 선택하여 하부 챔버로 이동한 세포를 관찰하고 사진을 촬영하였다. 이미지J(ImgeJ) 소프트웨어를 사용하여 세포 수를 계산하고, 수학식에 따라 세포 이동을 계산하였다.
결과를 도 37에 나타내었다. 결과는 동일 농도의 올라파립 단독요법 또는 VP101(hG1DM) 단독요법과 비교하여, PARP 억제제 올라파립과 VP101(hG1DM) 조합 요법이 난소암 세포의 이동을 억제하는 효능이 상당히 향상된다는 것을 나타내었다.
실시예 14: 유방암 치료를 위한 PARPi와 VP101(hG1DM) 조합 요법의 동물 연구
PARP 억제제 올라파립과 항PD-1/항-VEGFA 이중기능적 항체 VP101(hG1DM) 조합 요법의 생체내 항종양 활성을 시험하기 위해, MDA-MB-231 세포(인간 유방암 세포, ATCC에서 구입함)를 5-7주령의 NCG 마우스(젬파마텍에서 구입함)에 피하 이식하였다. 이식 23일 후, 마우스를 종양 부피에 따라 무작위로 6마리 동물의 4개 그룹으로 나누었다. 그룹화 일을 D0으로 정의하고, D0일에 올라파립 투여를 시작하였다. D2에 4백만개의 활성화된 PBMC를 복강내 주사하고, VP101(hG1DM) 처리를 시작하였다. 조합 요법 그룹의 레지먼은 하기와 같다: 약물을 별도로 조제하고 순차적으로 투여하였다(특정 순서 또는 시간 간격은 필요하지 않았으며, 하나의 처리는 다른 처리의 투여가 완료된 후 실시되어야 함). 모델링 및 구체적인 레지먼을 표 8에 나타내었다. 투여 후, 각각의 그룹의 종양의 길이 및 폭을 측정하고, 종양 부피를 계산하였다.
결과를 도 38에 나타내었다. 결과는 VP101(hG1DM)과 PARP 억제제 올라파립 조합 요법이 마우스 유방암 모델에서 올라파립 단독요법 그룹 및 VP101(hG1DM) 단독요법 그룹에 비해 상승작용적 항종양 효과를 나타내며, 조합 요법이 단독요법 그룹에 비해 종양 억제가 우수하다는 것을 나타내었다.
또한, 도 39에 나타난 바와 같이, VP101(hG1DM) 및 PARP 억제제 올라파립은 둘 다 종양 보유 마우스에 의해 단독으로 또는 조합으로 잘 용인되었으며, 그룹에서 종양 보유 마우스의 체중에 대한 영향은 발견되지 않았다.
실시예 15: 난소암 치료를 위한 PARPi와 VP101(hG1DM) 조합 요법의 동물 연구
PARP 억제제 올라파립과 항PD-1/항-VEGFA 이중기능적 항체 VP101(hG1DM) 조합 요법의 생체내 항종양 활성을 시험하기 위해, SK-OV-3 인간 난소암 세포(ATCC에서 구입함)를 5-7주령의 NCG 마우스(젬파마텍에서 구입함)에 피하 이식하였다. 이식 39일 후, 마우스에 3백만개의 활성화된 PBMC를 복강내 주사하고, 종양 부피에 따라 무작위로 6마리 동물의 4개 그룹으로 나누었다. 그룹화 일을 D0으로 정의하고, 그룹화 D0일에 투여를 시작하였다. 조합 요법 그룹의 레지먼은 하기와 같다: 약물을 별도로 조제하고 순차적으로 투여하였다(특정 순서 또는 시간 간격은 필요하지 않았으며, 하나의 처리는 다른 처리의 투여가 완료된 후 실시되어야 함). 모델링 및 구체적인 레지먼을 표 9에 나타내었다. 투여 후, 각각의 그룹의 종양의 길이 및 폭을 측정하고, 종양 부피를 계산하였다.
결과를 도 40에 나타내었다. 결과는 VP101(hG1DM)과 PARP 억제제 올라파립 조합 요법이 마우스 난소암 모델에서 올라파립 단독요법 그룹 및 VP101(hG1DM) 단독요법 그룹에 비해 상승작용적 항종양 효과를 나타내며, 조합 요법이 단독요법 그룹에 비해 종양 억제가 우수하다는 것을 나타내었다.
또한, 도 41에 나타난 바와 같이, VP101(hG1DM) 및 PARP 억제제 올라파립은 둘 다 종양 보유 마우스에 의해 단독으로 또는 조합으로 잘 용인되었으며, 그룹에서 종양 보유 마우스의 체중에 대한 영향은 발견되지 않았다.
본 발명의 특정 실시양태가 상세하게 설명되었지만, 당업자는 개시된 모든 교시 내용에 따라 세부 사항에 대한 다양한 변형 및 치환이 이루어질 수 있으며 이러한 변화는 모두 본 발명의 보호 범위 내에 속한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 청구범위 및 이의 등가물에 의해 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> Akeso Biopharma, Inc <120> PHARMACEUTICAL COMBINATION CONTAINING ANTI-PD-1-ANTI-VEGFA BISPECIFIC ANTIBODY, AND USE THEREOF <130> IEC210077PCT <150> CN202110270652.7 <151> 2021-03-12 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bevacizumab-Hv <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 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Immunoglobulin light chain of VP101(hG1DM) <400> 27 gatattcaga tgactcagag cccctcctcc ctgtccgcct ctgtgggcga cagggtcacc 60 atcacatgca gtgcttcaca ggatatttcc aactacctga attggtatca gcagaagcca 120 ggaaaagcac ccaaggtgct gatctacttc actagctccc tgcactcagg agtgccaagc 180 cggttcagcg gatccggatc tggaaccgac tttactctga ccatttctag tctgcagcct 240 gaggatttcg ctacatacta ttgccagcag tattctaccg tgccatggac atttggccag 300 gggactaaag tcgagatcaa gcggaccgtg gccgctccca gtgtcttcat ttttccccct 360 agcgacgaac agctgaaatc cgggacagcc tctgtggtct gtctgctgaa caacttctac 420 cctagagagg caaaagtgca gtggaaggtc gataacgccc tgcagagtgg caattcacag 480 gagagcgtga cagaacagga ctccaaagat tctacttata gtctgtcaag cacactgact 540 ctgagcaagg ctgactacga aaagcataaa gtgtatgcat gtgaggtcac ccaccagggg 600 ctgagcagtc cagtcaccaa gtcattcaac agaggcgagt gc 642 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 28 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 29 Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro 1 5 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 30 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 31 Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 32 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 32 Phe Thr Ser 1 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 33 Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 34 Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 35 Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr 1 5 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 36 Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 37 Gln Asp Ile Asn Thr Tyr 1 5 <210> 38 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 38 Arg Ala Asn 1 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 39 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 40 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig gamma-1 chain C region <400> 40 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 41 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig gamma-4 chain C region <400> 41 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig kappa chain C region <400> 42 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (29)

  1. 적어도 1종의 이중특이적 항체 및 적어도 1종의 PARP 억제제를 포함하는 치료 조합(therapeutic combination)으로서,
    이중 특이적 항체는
    PD-1을 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역, 및
    VEGFA를 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역
    을 포함하고;
    제1 단백질 기능 영역은 면역글로불린이고, 제2 단백질 기능 영역은 단일 쇄 항체이고; 면역글로불린은 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 단일 쇄 항체는 각각 서열번호 28-30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
    제1 단백질 기능 영역은 단일 쇄 항체이고, 제2 단백질 기능 영역은 면역글로불린이고; 면역글로불린은 각각 서열번호 28-30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 단일 쇄 항체는 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며;
    면역글로불린은 인간 IgG1 서브타입이고;
    면역글로불린은 EU 넘버링 시스템에 따라 위치 234, 235 및 237 중 어느 2개 또는 3개에서 돌연변이를 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, FcγRIIIa 및/또는 C1q에 대한 이중특이적 항체의 친화도 상수는 돌연변이 전과 비교하여 돌연변이 후 감소되고; 바람직하게는, 친화도 상수는 포르테비오 옥테트 시스템(Fortebio Octet system)에 의해 측정되는 치료 조합.
  2. 제1항에 있어서, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역이 EU 넘버링 시스템에 따라
    L234A 및 L235A; 또는
    L234A 및 G237A; 또는
    L235A 및 G237A; 또는
    L234A, L235A 및 G237A
    의 돌연변이를 갖는 것인 치료 조합.
  3. 적어도 1종의 이중특이적 항체 및 적어도 1종의 PARP 억제제를 포함하는 치료 조합으로서,
    이중특이적 항체는
    PD-1을 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역, 및
    VEGFA를 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역
    을 포함하고;
    제1 단백질 기능 영역은 면역글로불린이고, 제2 단백질 기능 영역은 단일 쇄 항체이고; 면역글로불린은 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 단일 쇄 항체는 각각 서열번호 28-30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
    제1 단백질 기능 영역은 단일 쇄 항체이고, 제2 단백질 기능 영역은 면역글로불린이고; 면역글로불린은 각각 서열번호 28-30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 31-33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 단일 쇄 항체는 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1-LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며;
    면역글로불린은 인간 IgG1 서브타입이고;
    면역글로불린은 EU 넘버링 시스템에 따라
    L234A 및 L235A; 또는
    L234A 및 G237A; 또는
    L235A 및 G237A; 또는
    L234A, L235A 및 G237A
    의 돌연변이를 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하는 치료 조합.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역이 EU 넘버링 시스템에 따라
    N297A, D265A, D270A, P238D, L328E, E233D, H268D, P271G, A330R, C226S, C229S, E233P, P331S, S267E, L328F, A330L, M252Y, S254T, T256E, N297Q, P238S, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, T394D, G236R, G236A, L328R, A330S, P331S, H268A, E318A 및 K320A
    로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 것인 치료 조합.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역글로불린의 중쇄 가변 영역이 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역이 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역이 서열번호 5 및 서열번호 9로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7, 서열번호 11 및 서열번호 17로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖거나;
    면역글로불린의 중쇄 가변 영역이 서열번호 5 및 서열번호 9로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역이 서열번호 7, 서열번호 11 및 서열번호 17로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역이 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인 치료 조합.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 조합이 하기 (1)-(12) 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 치료 조합:
    (1) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
    (2) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
    (3) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
    (4) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
    (5) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
    (6) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
    (7) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
    (8) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
    (9) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
    (10) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가짐;
    (11) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가짐; 및
    (12) 면역글로불린의 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 면역글로불린의 경쇄 가변 영역은 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가짐.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린이 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 것인 치료 조합.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약 10-6 M 미만, 예컨대 약 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 그 미만의 미만의 친화도 상수로 FcγRI에 결합하고; 바람직하게는, 친화도 상수가 포르테비오 옥테트 시스템에 의해 측정되는 것인 치료 조합.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약 10-9M 미만, 예컨대 약 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 그 미만의 미만의 친화도 상수로 C1q에 결합하고; 바람직하게는, 친화도 상수가 포르테비오 옥테트 시스템에 의해 측정되는 것인 치료 조합.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단백질 기능 영역이 직접적으로 또는 링커 단편을 통해 제2 단백질 기능 영역에 연결되고/되거나; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역이 직접적으로 또는 링커 단편을 통해 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역에 연결되는 것인 치료 조합.
  11. 재10항에 있어서, 링커 단편이 (GGGGS)n이고; n이 양의 정수이고, 바람직하게는 n이 1, 2, 3, 4, 5 또는 6인 치료 조합.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역의 수가 각각 독립적으로 1, 2 또는 그 초과인 치료 조합.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 쇄 항체가 면역글로불린의 중쇄의 C 말단에 연결되는 것인 치료 조합.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역이 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되고, 면역글로불린이 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 경쇄 불변 영역으로부터 선택되는 경쇄 불변 영역을 포함하거나;
    바람직하게는, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역이 인간 Ig 감마-1 쇄 C 영역 또는 인간 Ig 감마-4 쇄 C 영역이고, 면역글로불린의 경쇄 불변 영역이 인간 Ig 카파 쇄 C 영역이거나;
    바람직하게는, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역이 인간 Ig 감마-1 쇄 C 영역, ACCESSION: P01857이고; 면역글로불린의 경쇄 불변 영역이 인간 Ig 카파 쇄 C 영역, ACCESSION: P01834이거나;
    바람직하게는, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역이 인간 Ig 감마-4 쇄 C 영역, ACCESSION: P01861.1이고; 면역글로불린의 경쇄 불변 영역이 인간 Ig 카파 쇄 C 영역, ACCESSION: P01834인 치료 조합.
  15. 적어도 1종의 이중특이적 항체 및 적어도 1종의 PARP 억제제를 포함하는 치료 조합으로서,
    이중특이적 항체는
    PD-1을 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역, 및
    VEGFA를 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역
    을 포함하고;
    제1 단백질 기능 영역의 수는 1이고, 제2 단백질 기능 영역의 수는 2이고;
    제1 단백질 기능 영역은 면역글로불린이고, 제2 단백질 기능 영역은 단일 쇄 항체이고;
    면역글로불린은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고;
    단일 쇄 항체는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
    단일 쇄 항체는 면역글로불린의 중쇄의 C 말단에 연결되고;
    제1 단백질 기능 영역은 제1 링커 단편을 통해 제2 단백질 기능 영역에 연결되고; 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역은 제2 링커 단편을 통해 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역에 연결되고; 제1 링커 단편 및 제2 링커 단편은 동일하거나 상이하고;
    바람직하게는, 제1 링커 단편 및 제2 링커 단편의 아미노산 서열은 서열번호 18 및 서열번호 19로부터 독립적으로 선택되고;
    바람직하게는, 제1 링커 단편 및 제2 링커 단편의 아미노산 서열은 서열번호 18에 기재되는 치료 조합.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, PARP 억제제가 올라파립, 루카파립, 니라파립, 탈라조파립, 플루조파립, 벨리파립 ER, ABT-472, ABT-767, 스테노파립, AST-6828, AG-PD, ANG-2864, ANG-3038, ANG-3186, AZD-5305, AZ-0108, AZD-2461, AMXI-5001, AMXI-2001, AMXI-3001, AMXI-7001, AMXI-9001, 파미파립, ZYTP-1, CK-102, XZ-120312, YHP-743, 아이오벤구안 I 131, 루카파립 캄실레이트, CVL-218, CPH-101, CPH-102, CBX-11, CBX-15, 미노사이클린, DB-207, DPS-102, E-7016, 아이오벤구안 I 131, MK-2512, HCX-014, HWH-340, IDX-1197, IDX-1197, 세나파립, IMP-04100, IMP-04111, IMP-04149, IMP-04249, IMP-04307, IMP-04356, JPI-289, JPI-547, JPI-283, 플루조파립, GT-1620, 아이오벤구안 I 131, DR-2313, MP-124, H-10, NT-125, BGP-15, NMSP-293, NMSP-118, NMSP-648, NMSP-914, DB-207, NUV-1156, NUV-1176, JPI-289, 스테노파립, OX-401, NU-1025, NU-1085, PLX-376, R-554, RBN-2397, RBN-012759, PJ-34, INO-1001, WW-46, BSI-401, 이니파립, SOMCL-9112, SC-10914, HTMC-0435, SRX-3128, TSL-1502, PJ-34, CEP-8983, CK-102, THG-009, 탈라조파립 SR, L-2286, 미토파립 및 WB-1340 중 1종 이상으로부터 선택되는 것인 치료 조합.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 항종양 화학치료제를 추가로 포함하고,
    바람직하게는, 항종양 화학치료제는 토포이소머라제 II(TOP2) 억제제로부터 선택되고, 바람직하게는 토포이소머라제 II(TOP2) 억제제는 에토포시드이고;
    바람직하게는, 항종양 화학치료제는 탁산으로부터 선택되고, 바람직하게는 탁산은 파클릭탁셀, 알부민 결합된 파클릭탁셀, 리포좀 파클릭탁셀 및 독세탁셀로부터 선택되고;
    바람직하게는, 항종양 화학치료제는 백금계 약물로부터 선택되고, 바람직하게는 백금계 약물은 시스플라틴, 카르보플라틴, 및 옥살리플라틴으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 항종양 화학치료제는 젬시타빈, 페메트렉세드 및 카페시타빈 중 1종 이상으로부터 선택되는 것인 치료 조합.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 조합이, 예컨대 고체 약학 조성물 또는 액체 약학 조성물 형태의 고정된 조합이거나;
    치료 조합이 비-고정된 조합이고, 예컨대 이중특이적 항체 및 PARP 억제제가 각각 약학 조성물 형태인 치료 조합.
  19. 제18항에 있어서, 약학 조성물이 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함하는 것인 치료 조합.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 치료 조합, 및 패키지 삽입물을 포함하는 키트 제품.
  21. 악성 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 치료 조합 또는 제20항에 따른 키트 제품의 용도로서,
    바람직하게는, 악성 종양은 난소암, 자궁내막암, 유방암, 자궁경부암, 나팔관암, 복막암, 췌장암, 결장암, 직장암, 폐암, 간암, 피부암, 신경아교종, 흑색종, 림프종, 신장 종양, 전립선암, 방광암, 위장암, 뇌암, 식도암, 예컨대 식도 편평암, 높은 미세부수체 불안정(microsatellite instability-high, MSI-H) 또는 불일치 복구 결함(mismatch repair deficient, dMMR) 암, 요로상피세포 암종, 중피종, 위 선암종, 위식도 접합부 선암종, 백혈병, 골수종, 갑상선암, 두경부암, 골암, 담도암 및 고환암으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 종양은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 종양이고;
    바람직하게는, 종양은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함이 없는 종양이고;
    바람직하게는, 폐암은 비-소세포 폐암 또는 소세포 폐암이고;
    바람직하게는, 비-소세포 폐암은 EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이를 갖는 비-소세포 폐암이고;
    바람직하게는, 비-소세포 폐암은 EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이가 없는 비-소세포 폐암이고;
    바람직하게는, 간암은 간세포 암종이고;
    바람직하게는, 신장암은 신장 세포 암종이고;
    바람직하게는, 유방암은 삼중 음성 유방암이고;
    바람직하게는, 요로상피세포 암종은 방광암이고;
    바람직하게는, 복막암은 원발성 복막암이고;
    바람직하게는, 난소암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 난소암이고;
    바람직하게는, 나팔관암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 나팔관암이고;
    바람직하게는, 복막암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 복막암이고;
    바람직하게는, 유방암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 유방암인 용도.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 악성 종양을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이며,
    바람직하게는, 악성 종양은 난소암, 자궁내막암, 유방암, 자궁경부암, 나팔관암, 복막암, 췌장암, 결장암, 직장암, 폐암, 간암, 피부암, 신경아교종, 흑색종, 림프종, 신장 종양, 전립선암, 방광암, 위장암, 뇌암, 식도암, 예컨대 식도 편평암, 높은 미세부수체 불안정(MSI-H) 또는 불일치 복구 결함(dMMR) 암, 요로상피세포 암종, 중피종, 위 선암종, 위식도 접합부 선암종, 백혈병, 골수종, 갑상선암, 두경부암, 골암, 담도암 및 고환암으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 종양은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 종양이고;
    바람직하게는, 종양은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함이 없는 종양이고;
    바람직하게는, 폐암은 비-소세포 폐암 또는 소세포 폐암이고;
    바람직하게는, 비-소세포 폐암은 EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이를 갖는 비-소세포 폐암이고;
    바람직하게는, 비-소세포 폐암은 EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이가 없는 비-소세포 폐암이고;
    바람직하게는, 간암은 간세포 암종이고;
    바람직하게는, 신장암은 신장 세포 암종이고;
    바람직하게는, 유방암은 삼중 음성 유방암이고;
    바람직하게는, 요로상피세포 암종은 방광암이고;
    바람직하게는, 복막암은 원발성 복막암이고;
    바람직하게는, 난소암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 난소암이고;
    바람직하게는, 나팔관암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 나팔관암이고;
    바람직하게는, 복막암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 복막암이고;
    바람직하게는, 유방암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 유방암인 치료 조합 또는 키트 제품.
  23. 악성 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 악성 종양의 치료 및/또는 예방이 필요한 대상체에게 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 치료 조합 또는 제20항에 따른 키트 제품의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고,
    바람직하게는, 악성 종양은 난소암, 자궁내막암, 유방암, 자궁경부암, 나팔관암, 복막암, 췌장암, 결장암, 직장암, 폐암, 간암, 피부암, 신경아교종, 흑색종, 림프종, 신장 종양, 전립선암, 방광암, 위장암, 뇌암, 식도암, 예컨대 식도 편평암, 높은 미세부수체 불안정(MSI-H) 또는 불일치 복구 결함(dMMR) 암, 요로상피세포 암종, 중피종, 위 선암종, 위식도 접합부 선암종, 백혈병, 골수종, 갑상선암, 두경부암, 골암, 담도암 및 고환암으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 종양은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 종양이고;
    바람직하게는, 종양은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함이 없는 종양이고;
    바람직하게는, 폐암은 비-소세포 폐암 또는 소세포 폐암이고;
    바람직하게는, 비-소세포 폐암은 EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이를 갖는 비-소세포 폐암이고;
    바람직하게는, 비-소세포 폐암은 EGFR 및/또는 ALK 민감성 돌연변이가 없는 비-소세포 폐암이고;
    바람직하게는, 간암은 간세포 암종이고;
    바람직하게는, 신장암은 신장 세포 암종이고;
    바람직하게는, 유방암은 삼중 음성 유방암이고;
    바람직하게는, 요로상피세포 암종은 방광암이고;
    바람직하게는, 복막암은 원발성 복막암이고;
    바람직하게는, 난소암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 난소암이고;
    바람직하게는, 나팔관암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 나팔관암이고;
    바람직하게는, 복막암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 복막암이고;
    바람직하게는, 유방암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 유방암인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 투여가 수술 전후 및/또는 방사선요법 전후에 수행되는 것인 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    이중특이적 항체가 체중 kg당 0.1-100 mg, 바람직하게는 체중 kg당 5-50 mg 또는 5-15 mg의 단위 용량으로 투여되고/되거나,
    3일, 4일, 5일, 6일, 10일, 1주, 2주 또는 3주마다 1회 투여되고/되거나,
    정맥내 점적 주입 또는 정맥내 주사로 투여되는 것인 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    PARP 억제제가 체중 kg당 0.1-100 mg, 바람직하게는 체중 kg당 5-50 mg 또는 5-15 mg의 단위 용량으로 투여되고/되거나,
    3일, 4일, 5일, 6일, 10일, 1주, 2주 또는 3주마다 1회 투여되고/되거나,
    정맥내 점적 주입 또는 정맥내 주사로 투여되는 것인 방법.
  27. 악성 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 치료 조합 중의 이중특이적 항체의 용도로서, 악성 종양은 난소암, 나팔관암, 복막암 및 유방암으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 난소암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 난소암이고;
    바람직하게는, 나팔관암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 나팔관암이고;
    바람직하게는, 복막암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 복막암이고;
    바람직하게는, 유방암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 유방암인 용도.
  28. 악성 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 악성 종양의 치료 및/또는 예방이 필요한 대상체에게 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 치료 조합 중의 이중특이적 항체의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 악성 종양은 난소암, 나팔관암, 복막암 및 유방암으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 난소암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 난소암이고;
    바람직하게는, 나팔관암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 나팔관암이고;
    바람직하게는, 복막암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 복막암이고;
    바람직하게는, 유방암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 유방암인 방법.
  29. 악성 종양의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 치료 조합 중의 이중특이적 항체로서, 악성 종양은 난소암, 나팔관암, 복막암 및 유방암으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 난소암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 난소암이고;
    바람직하게는, 나팔관암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 나팔관암이고;
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    바람직하게는, 유방암은 상동성 재조합에 의해 매개된 복구 기능 결함(예컨대, BRCA1 돌연변이 및/또는 BRCA2 돌연변이)을 갖는 유방암인 이중특이적 항체.
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