JP2024504931A - がん細胞に結合し、放射性核種を前記細胞に標的化するスプリット抗体 - Google Patents

がん細胞に結合し、放射性核種を前記細胞に標的化するスプリット抗体 Download PDF

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Abstract

本発明は、標的細胞上の抗原に結合し、エフェクター部分を前記細胞に標的化する抗体、及びその使用方法に関する。【選択図】図２９

Description

本発明は、二重特異性抗体の新規フォーマットに関する。特定の実施態様では、本発明はさらに、標的細胞上の抗原に結合し、放射性核種を前記細胞に標的化するこの新規フォーマットを有する抗体、及びその使用方法に関する。
個々の細胞又は特定の細胞タイプの選択的破壊は、多くの場合、様々な臨床環境で望ましいものである。例えば、健常細胞及び組織をインタクトで無損傷のままにしながら、腫瘍細胞を特異的に破壊することが、がん治療の主な目標である。
これに関して、標的細胞上の表面抗原に１つの「アーム」で結合し、薬物等のエフェクター部分に第２の「アーム」で結合する二重特異性抗体が設計されている。多種多様な二重特異性フォーマットが開発されてきたが、二重特異性抗体を開発するという課題は決して些細なものではない。
プレターゲティング放射免疫療法（ＰＲＩＴ）では、一方では腫瘍関連抗原に対して、他方では放射性標識化合物に対して親和性を有する抗体コンストラクトが使用される。第１の工程では、抗体を投与し、腫瘍に局在させる。続いて、放射性標識化合物を投与する。放射性標識化合物は小さいため、腫瘍に迅速に送達することができ、非結合化合物は迅速に除去され、腫瘍外への放射線曝露を減少させる（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２０１２，２（５），５２３－５４０）。同様の手順をイメージングにも使用することができる。プレターゲティングは、アビジン－ビオチンを使用する二重特異性抗体又はシステムを使用することができるが、後者はアビジン／ストレプトアビジンが免疫原性であるという欠点を有する。
プレターゲティング放射免疫療法又はイメージングの方法は、一般に、抗体を投与する工程と放射性標識化合物を投与する工程との間に投与される除去剤又はブロッキング剤を利用する。目的は、血液から抗体を除去すること、及び／又は放射性標識化合物に対する循環抗体の結合部位を遮断することである（例えば、Ｋａｒａｃａｙ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ．，１３（５），１０５４－１０７０（２００２）を参照されたい）。除去剤又はブロッキング剤の使用は、有害毒性を制限しながら効率的な治療のために十分なレベルの放射能を投与することを可能にするが、タイミング及び投与量は慎重に選択しなければならず、除去剤が免疫反応等の有害作用のリスクを導入する可能性がある。したがって、除去段階の使用は、プレターゲティング法における複雑な態様である。
本発明は、エフェクター部分のＶＨ及びＶＬドメインが２つの部分に分割されている二重特異性抗体の新規フォーマット、及びそれを使用する方法を提供する。
特に、本発明は、
ｉ）
ａ）標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する抗原結合部分；
ｂ）エフェクター部分に対する抗原結合部位の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むか又はそれからなるポリペプチド；及び
ｃ）２つのサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む第１の抗体であって、
ここで、（ｂ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ａ）の抗体結合部分のＣ末端に融合しており、且つそのＣ末端によって（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
該第１の抗体は、エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＬドメインを含まない、第１の抗体；と
ｉｉ）
ｄ）標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する抗原結合部分；
ｅ）エフェクター部分に対する抗原結合部位の抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むか又はそれからなるポリペプチド；及び
ｆ）２つのサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む第２の抗体であって、
ここで、（ｅ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ｄ）の抗原結合部分のＣ末端に融合しており、且つそのＣ末端によって（ｆ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
該第２の抗体は、エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＨドメインを含まない、第２の抗体と
を含み；
第１の抗体の前記ＶＨドメイン及び第２の抗体の前記ＶＬドメインは、一緒になってエフェクター部分に対する機能的抗原結合部位を形成することができる、抗体のセットに関する。
第１の抗体も第２の抗体も、それ自体は、エフェクター部分に対する機能的抗原結合部位を含まない。第１の抗体は、エフェクター部分に対する機能的結合部位からのＶＨドメインのみを有し、ＶＬドメインを有しない。第２の抗体は、ＶＬドメインだけを有し、ＶＨドメインを有しない。
エフェクター部分に対する機能的抗原結合部位は、第１の抗体のＶＨドメインと、第２の抗体のＶＬドメインとが会合するときに形成される。これは、例えば、第１の抗体及び第２の抗体が同じ個々の標的細胞又は隣接する細胞に結合している場合に起こり得る。
本明細書に記載の第１の抗体及び第２の抗体は、本明細書では「単一ドメインスプリット抗体」、「スプリット抗体」、「ＳＰＬＩＴ」、「ヘミボディ」又は「デミボディ」と呼ばれることがある。エフェクター部分に結合することができる抗原結合部位を一緒に形成するＶＨ及びＶＬドメインは、２つの抗体間で分割され、同じ抗体の一部として存在しない。
スプリットドメインフォーマットは、エフェクター部分が単独で第１の抗体に結合することも、単独で第２の抗体に結合することもできないことを意味する。血液中では、第１の抗体と第２の抗体との間に安定した会合はほとんど又は全くなく、放射性標識化合物の安定した結合もほとんど又は全くない。
標的細胞の表面上に発現する抗原は、本明細書では「標的抗原」、「標的細胞抗原」又は「ＴＡ」と呼ばれることがある。本発明によれば、上記の第１の抗体及び第２の抗体は、異なる標的抗原に結合する抗原結合部分を有していてもよいし、同じ標的抗原に結合する抗原結合部分を有していてもよい。（誤解を避けるため、抗体が同じ標的抗原に結合すると述べられている場合、これは、それらが同じ標的抗原に結合することができる結合部位を有することを意味し、抗体が互いに同じである２つの個々の抗原分子に結合し得る可能性を含む）。例えば、一実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、ＣＥＡに結合する。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は、同じ標的抗原の同じエピトープに結合し得る（これらに対する結合部位を有し得る）。他の実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は、同じ標的抗原の異なるエピトープに結合し得る（これらに対する結合部位を有し得る）。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は、標的抗原に対する同じ抗原結合部位を含み得る。例えば、それらは、ＶＬ配列及びＶＨ配列を含む、標的抗原に結合することができる抗原結合部位を含み得、この抗原結合部位を形成するＶＬ配列及びＶＨ配列は、第１の抗体及び第２の抗体において同じである。
「エフェクター部分」という用語は、標的細胞に対する所望の効果を担う部分を指す。一実施態様では、所望の効果は、細胞死滅である。例えば、エフェクター部分は、標的細胞を死滅させるために使用される放射性核種、薬物、又は毒素であり得る。一実施態様では、エフェクター部分は、放射線療法に適した放射性標識化合物であり得る。別の実施態様では、所望の効果は標識化であり、エフェクター部分はイメージングに適した放射性標識化合物であり得る。
いくつかの実施態様では、（ａ）及び（ｄ）の抗原結合部分は、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’、－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２などの抗体断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ若しくはｓｃＦａｂ）；又はＶＨＨなどの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；又はＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）などの非抗体結合足場；アフィボディ；Ｓｓｏ７ｄ；モノボディ又はアンチカリンであり得る。
いくつかの実施態様では、（ａ）の抗原結合部分及び（ｄ）の抗原結合部分がＦａｂであることが好ましい場合がある。このような実施態様では、（ｂ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって、（ａ）のＦａｂ断片の鎖のうちの１つのＣ末端に融合しており；（ｅ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって、（ｄ）のＦａｂ断片の鎖のうちの１つのＣ末端に融合している。同様に、抗原結合部分が２つ以上の鎖を含む他の実施態様では、ポリペプチドは、そのＮ末端によって鎖のうちの１つのＣ末端に融合していてもよい。
Ｆｃ領域の存在は、免疫療法及びイメージングの文脈において利点を有し、例えば、タンパク質の循環半減期を延長し、及び／又はより小さな断片で観察され得るよりも高い腫瘍取り込みをもたらす。本明細書に記載の「スプリットドメイン」フォーマットは、そうでなければ循環抗体の長時間の存在に起因して起こるであろうエフェクター部分／放射性標識化合物との会合の可能性がより大きくなるのを緩和するため、この文脈において特に有利であり得る。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、エフェクター機能を低減させるか又は排除するように修飾される。
本明細書に記載のフォーマットは、エフェクター部分に対するＶＬ及びＶＨの有意なオフターゲット結合を回避する。さらに、本発明による抗体は、抗薬物抗体応答及び／又は安定性の低下という点で利点を有し得る。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体のセットを含む薬学的組成物を提供する。別の態様では、本発明は、各々が本明細書に記載の抗体の１つ（すなわち、それぞれ第１の抗体及び第２の抗体）を含む２つの別個の薬学的組成物を含むキットを提供する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される抗体又は抗体のセットのいずれかをコードするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセットに関する。別の態様では、本発明は、上記ポリヌクレオチド（複数可）を含むベクター又はベクターのセット、任意に発現ベクター又は発現ベクターのセットに関する。さらなる目的において、本発明は、本発明のベクター又はベクターのセットを含む原核生物若しくは真核生物の宿主細胞又は宿主細胞のセットに関する。さらに、抗体が産生されるように宿主細胞（複数可）を培養することを含む、抗体を産生する方法が提供される。
いくつかの実施態様では、エフェクター分子が放射性標識化合物である場合、本明細書に記載の抗体は、プレターゲティング放射免疫療法（ＰＲＩＴ）の方法又はプレターゲティング放射線イメージングの方法における使用を見出している。
一態様では、本発明は、プレターゲティング放射免疫療法の方法であって、
ｉ）上記の第１の抗体及び第２の抗体を対象に投与すること；並びに
ｉｉ）続いて、前記対象に放射性標識化合物を投与すること
を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、第１の抗体及び第２の抗体を対象に投与し、続いて前記対象に放射性標識化合物を投与することを含む治療の方法における使用のための上記の第１の抗体及び第２の抗体を提供する。別の態様では、本発明は、第１の抗体及び第２の抗体を対象に投与し、続いて前記対象に放射性標識化合物を投与することを含む治療の方法における使用のための上記の第１の抗体を提供する。別の態様では、本発明は、第１の抗体及び第２の抗体を対象に投与し、続いて前記対象に放射性標識化合物を投与することを含む治療の方法における使用のための上記の第２の抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、
ｉ）本明細書に記載の第１の抗体及び第２の抗体を対象に投与することであって、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、第１の抗体及び第２の抗体を対象に投与すること；
ｉｉ）続いて、放射性標識化合物を投与すること；並びに任意選択で、
ｉｉｉ）放射性核種が局在化した組織又は臓器をイメージングすること
を含む、放射線イメージングの方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ヒト又は動物の身体に対して行われる診断方法における使用のための本明細書に記載の第１の抗体及び第２の抗体を提供し、該方法は、
ｉ）本明細書に記載の第１の抗体及び第２の抗体を対象に投与することであって、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、第１の抗体及び第２の抗体を対象に投与すること；
ｉｉ）続いて、放射性標識化合物を投与すること；並びに任意選択で、
ｉｉｉ）放射性核種が局在化した組織又は臓器をイメージングすること
を含む。
イメージング工程の後に、診断を作成する工程、及び任意選択でその診断を対象に送達する工程が続く場合がある。いくつかの実施態様では、本方法は、適切な治療法を決定すること、及び任意選択でその治療法を対象に施すことをさらに含み得る。
上記の方法／使用の各々では、第１の抗体及び第２の抗体の、同じ標的細胞又は隣接する標的細胞への結合は、放射標識化合物に対する抗原結合部位の、ＶＨドメインとＶＬドメインとの会合、及び放射標識化合物に対する機能的抗原結合部位の形成を結果としてもたらす。したがって、放射標識化合物の投与の後、放射性標識化合物は、ＶＨとＶＬとの会合により形成される機能的抗原結合部位に結合する。
本明細書に記載される方法及び使用のいずれにおいても、第１の抗体及び第２の抗体は、いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に投与され得る。
当技術分野では、ＰＲＩＴ又は放射線イメージングの方法は、除去工程を含むことが多い。除去工程は、抗体の投与と放射性標識化合物の投与との間に薬剤を投与することを含み、薬剤は、血液からの抗体の除去速度を増加させ、及び／又は抗体への放射性標識化合物の結合を遮断する。
本明細書に記載の方法及び使用の一実施態様では、本方法は、除去工程を含まない。すなわち、第１の抗体及び第２の抗体の投与と放射性標識化合物の投与との間（すなわち、抗体の投与後であるが放射性標識化合物の投与前）に除去剤又はブロッキング剤を投与する工程を含まない。別の実施態様では、任意に放射線増感剤、免疫療法剤及び／又は化学療法剤以外の薬剤は、第１の抗体及び第２の抗体の投与と放射性標識化合物の投与との間に投与されない。別の実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体の投与と放射性標識化合物の投与との間に薬剤は投与されない。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗体は、併用療法の一部として投与される場合がある。例えば、それらは、１つ又は複数の放射線増感剤、免疫療法剤及び／又は化学療法剤と組み合わせて投与され得：放射線増感剤、免疫療法剤又は化学療法剤及び抗体は、いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に投与され得る。
本明細書に記載の放射線イメージング及び放射免疫療法の方法は、本明細書でさらに論じるように任意選択で組み合わせることができる。
さらなる態様では、本発明は、
ｉ）本明細書に記載の第１の抗体及び第２の抗体と；
ｉｉ）第１の抗体と第２の抗体との会合によって形成される抗原結合部位に結合する放射性標識化合物と
を含む、キットを提供する。
任意選択で、キットは、本明細書に記載されるような除去剤又はブロッキング剤を除外し得る（すなわち、含まない）。
任意選択で、キットは、放射線増感剤、免疫療法剤又は化学療法剤をさらに含み得る。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は、同じ薬学的組成物中に存在し得る。他の実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は、別々の薬学的組成物中に存在し得る。いくつかの実施態様では、放射性標識化合物は、抗体とは別の薬学的組成物中に存在する。
他の実施態様では、本明細書に記載の抗体は、例えばがん治療のための、標的細胞を選択的に死滅させる方法における使用を見出している。
比較例に属する、標的抗原（ＴＡ）－ＤＯＴＡＭ二重特異性抗体（ＴＡ－ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂ）、及び例示的ＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体の概略的構造を示す図である。 腫瘍細胞上の、スプリット－ＶＨ／ＶＬ ＤＯＴＡＭ結合剤のアセンブリを示す概略図である。ＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体は、ＤＯＴＡＭ結合剤の２つのドメインがアセンブルされる標的細胞上の腫瘍抗原（ＴＡ）に結合していない限りにおいて、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに有意に結合しないであろう。 除去剤の使用を伴う、３工程ＴＡ－ＰＲＩＴ概念の例についての図式的概観を示す図である。 除去剤が使用されない、２工程ＴＡ－ＰＲＩＴ概念の例についての図式的概観を示す図である。 ＣＥＡ結合能を実証するための、スプリット抗体の、ＭＫＮ４５細胞への結合を示す図である。抗体の検出は、ヒトＩｇＧに特異的な二次抗体を使用して行う。 ＤＯＴＡＭ結合能を実証するための、スプリット抗体の、ＭＫＮ４５細胞への結合を示す図である。抗体の検出は、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ－ＦＩＴＣを使用して行う。 図７Ａは、ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおいて実行される、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬによる２工程ＰＲＩＴのための例示的プロトコール（ｈ＝時間、ｄ＝日、ｗ＝週）を示す。図７Ｂは、ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおいて実行される、３工程ＰＲＩＴ対照のための例示的プロトコール（ｈ＝時間、ｄ＝日、ｗ＝週）を示す。 ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ単独、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＬ単独、若しくは２つの相補的抗体の組み合わせによりプレターゲティングされるか、又は標準的３工程ＰＲＩＴを使用する、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の６時間後における、ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける、プレターゲティング２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの生体内分布を示す図である（１ｇ当たりのＩＤ％±ＳＤ、ｎ＝４）。 ＳＣＩＤマウスにおけるＩＶ注射の後の、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬの薬物動態を示す図である。 ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける、２工程（上）又は３工程（下）のＣＥＡ－ＰＲＩＴを含む、プロトコール１５８の実験デザインを示す図である。＊ＣＥＡスプリットＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂの用量は、２／４コンストラクトにおけるホール／ホール不純物について補償するように調整した。 ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウス（注射の６時間後）における、プレターゲティング２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの生体内分布を示す図である。分布は、ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂ、又はＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ抗体の二重パラトープの組み合わせによりプレターゲティングされた２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の６時間後の、腫瘍保有ＳＣＩＤマウスにおける、２１２Ｐｂの分布である。臓器内及び組織内の放射性物質の含有量は、１ｇ当たりの平均ＩＤ％±ＳＤとして表される（ｎ＝４）。 ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける、１サイクルの３工程ＣＥＡ－ＰＲＩＴ（上）、２工程ＣＥＡ－ＰＲＩＴ（中）、又は１工程ＣＥＡ－ＲＩＴを含む、プロトコール１６０の実験スケジュールを示す図である。生体内分布（ＢＤ）スカウトを、放射性物質注射の２４時間後に安楽死させるのに対し、有効性群におけるマウスは、維持し、終結基準に達するまで、注意深くモニタリングした。 ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウス（注射の２４時間後）における、プレターゲティング２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ、及び２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ－ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭの生体内分布を示す図である。分布は、ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ－プレターゲティング２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ、又はプレインキュベート２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ－ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭの注射の２４時間後の、腫瘍保有ＳＣＩＤマウスにおける、２１２Ｐｂの分布である。臓器内及び組織内の放射性物質の含有量は、１ｇ当たりの平均ＩＤ％±ＳＤとして表される（ｎ＝３）。 ＢｘＰＣ３モデルにおける、ＰＲＩＴ処置群及び対照（群Ａ～Ｅ）について、標準誤差を伴う腫瘍増殖平均（ｎ＝１０）を示す図である。曲線は、ｎ＜５で切り捨てた。垂直方向の点線は、研究デザインに従う、一部の群又は全ての群について、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの投与（２０μＣｉ）を指し示す。 ＢｘＰＣ３モデルにおける、ＰＲＩＴ処置群及び対照（群Ａ～Ｅ）について、個別の腫瘍増殖曲線（ｎ＝１０）を示す図である。垂直方向の点線は、２１２Ｐｂ標識化合物の投与（２０μＣｉ）を指し示す。 ＢｘＰＣ３モデルにおいて、ＣＥＡ－ＰＲＩＴ及びＣＥＡ－ＲＩＴで処置されたマウスについて、平均体重減少（群Ａ～Ｅ、ｎ＝１０）を示す図である。曲線は、ｎ＜５で切り捨てた。垂直方向の点線は、研究デザインに従う、一部の群又は全ての群について、２１２Ｐｂ標識化合物の投与を指し示す。 ２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の２４時間後における屠殺及び剖検を伴う、ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける、２工程ＣＥＡ－ＰＲＩＴを含む、プロトコール１７５の実験デザインを示す図である。ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ－ＡＳＴの用量は、ホール／ホール不純物について補償するように調整した。 ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体によりプレターゲティングされた、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の２４時間後の、腫瘍保有ＳＣＩＤマウスにおける、２１２Ｐｂの分布を示す図である（プロトコール１７５）。臓器内及び組織内の放射性物質の含有量は、１ｇ当たりの平均ＩＤ％±ＳＤとして表される（ｎ＝４）。 ２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の６時間後における屠殺及び剖検を伴う、ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける、２工程ＣＥＡ－ＰＲＩＴを含む、プロトコール１８５の実験デザインを示す図である。ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ－ＡＳＴ（ＣＨ１Ａ１Ａ）の用量は、ホール／ホール不純物について補償するように調整した。 ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体によりプレターゲティングされた、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の６時間後の、腫瘍保有ＳＣＩＤマウスにおける、２１２Ｐｂの分布を示す図である（プロトコール１８５）。臓器内及び組織内の放射性物質の含有量は、１ｇ当たりの平均ＩＤ％±ＳＤとして表される（ｎ＝５）。 注射の７日後における、２つの選択されたＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍内のＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ対（ＶＨ抗体とＶＬ抗体との組み合わせ）の分布を示す図である。Ａ及びＢは、Ｔ８４．６６を標的とする、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬを注射されたマウスＡ３に由来する腫瘍の切片を示し、この場合、Ａは、ＣＥＡの発現を示し、Ｂは、対応するＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬの分布を示す。Ｃ及びＤは、ＣＨ１Ａ１Ａを標的とする、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬを注射されたマウスＣ５に由来する腫瘍の切片を示し、この場合、Ｃは、ＣＥＡの発現を示し、Ｄは、対応するＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬの分布を示す。 ２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の６時間後における屠殺及び剖検を伴う、ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける、２工程ＣＥＡ－ＰＲＩＴを含む、プロトコール１８９の実験デザインを示す図である。ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ－ＡＳＴ（ＣＨ１Ａ１Ａ）の用量は、ホール／ホール不純物について補償するように調整した。 ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体の二重パラトープ対（Ｔ８４．６６及びＣＨ１Ａ１Ａ）によりプレターゲティングされた、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の６時間後の、腫瘍保有ＳＣＩＤマウスにおける、２１２Ｐｂの、陽性対照（ＣＨ１Ａ１Ａだけ）と比較した分布を示す図である。臓器内及び組織内の放射性物質の含有量は、１ｇ当たりの平均ＩＤ％±ＳＤとして表される。 スプリット抗体について、ＦＡＣＳにより決定される、平均値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。ＦＡＣＳにより決定されるＰｂ－ＤＯＴＡ－ＦＩＴＣの結合は、両方のスプリット抗体の、Ｐｂ－ＤＯＴＡ－ＦＩＴＣとのコインキュベーションだけについて示され得る。単一のスプリット抗体は、有意なシグナルをもたらさなかった。 本明細書で記載される抗体の例示的フォーマットを示す図である。 チップ上において捕捉されたビオチン化ＤＯＴＡＭへの、個別のＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ抗体、及びＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＬ抗体の結合について評価する、実施例１１の実験１からの結果を示す図である。 チップ上において捕捉された、個別のＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ抗体、及びＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＬ抗体への、ＤＯＴＡＭの結合について評価する、実施例１１の実験２からの結果を示す図である。 チップ上において捕捉されたＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体（抗体対）への、ＤＯＴＡＭの結合について評価する、実施例１１の実験３からの結果を示す図である。 さらに例示的なＴＡ－ｓｐｌｉｔ－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体の概略構造を示す図である。図２９Ａは、標的抗原の一価であるフォーマットを示す。図２９Ｂは、標的抗原に対して二価であるフォーマットを示す。 ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける２段階のＳＰＬＩＴ ＰＲＩＴレジメンを含むプロトコール１９３の実験デザインを示す図である。 Ｎ末端ＳＰＬＩＴによってプレターゲティングされた２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射後６時間の腫瘍担持ＳＣＩＤマウスにおける２１２Ｐｂの分布を示す図である（実施例９の結果）。
Ｉ.定義
本明細書の目的のために、「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一の結合部位の間の非共有性相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。一般に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（ＫＤ）によって表される。親和性は、本明細書に記載のものを含む当技術分野で一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示的方法を以下に記載する。
「親和性成熟」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）において１つ又は複数の改変を有し、そのような改変によって抗原に対する抗体の親和性を改善する、抗体を指す。
「標的細胞の表面上に発現する抗原に結合する抗体」という用語は、抗体が当該抗原を標的とする際の診断剤及び／又は治療剤として有用であるように十分な親和性で当該抗原に結合することができる抗体を指す。一態様では、無関係な非抗原タンパク質への抗体の結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、抗原への抗体の結合の約１０％未満である。特定の態様では、標的細胞の表面上に発現する抗原に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。抗体は、ＫＤが１μＭ以下であれば、標的細胞の表面に発現する抗原に「特異的に結合する」と言われる。特定の態様では、抗体は、異なる種からの当該抗原間で保存されている当該抗原のエピトープに結合する。
「エフェクター部分に対する抗原結合部位」又は「エフェクター部分に対する機能的抗原結合部位」という用語は、抗体が、エフェクター部分を抗体と会合させるための診断薬及び／又は治療薬として有用であるように十分な親和性でエフェクター部分に結合することができる、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む抗原結合部位を指す。一態様では、無関係な非抗原化合物に対する抗原結合部位の結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される場合、エフェクター部分に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の態様では、エフェクター部分に結合する抗原結合部位は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ以下、例えば、０．９ｐＭ以下、０．８ｐＭ以下、０．７ｐＭ以下、０．６ｐＭ以下又は０．５ｐＭ以下のＫＤを有することが好ましい場合がある。例えば、機能的結合部位は、約１ｐＭ～１ｎＭ、例えば、約１～１０ｐＭ、１～１００ｐＭ、５～５０ｐＭ、１００～５００ｐＭ又は５００ｐＭ～１ｎＭのＫＤでエフェクター部分に結合し得る。抗原結合部位は、抗原結合部位が１μＭ以下のＫＤを有する場合、抗原結合部位はエフェクター部分に「特異的に結合する」と言われる。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、様々な抗体構造を包含する。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語はまた、機能的抗原結合部位のＶＨドメイン又はＶＬドメインのいずれかを含む個々のヘミボディを包含する。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；並びに、抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。「Ｆａｂ断片」という用語は、免疫グロブリンの重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、軽鎖のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。「Ｆａｂ’断片」は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における、抗体のヒンジ領域に由来する、１つ又は複数のシステインを含む残基の添加により、Ｆａｂ断片と異なる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長させる、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」への言及は、ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片又はｓｃＦａｂ並びに従来のＦａｂ断片（すなわち、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖、並びにＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖断片を含むもの）を含むことを意図している。
「ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域１（ＣＨ１）から構成されるポリペプチド鎖、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるポリペプチド鎖を含む。明確性のために、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域とが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常領域を含むペプチド鎖は、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖の定常領域とＦａｂ重鎖の定常領域とが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変領域を含むペプチド鎖は、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「一本鎖」という用語は、ペプチド結合によって線状に連結されたアミノ酸単量体を含む分子を指す。一本鎖Ｆａｂ分子は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖とがペプチドリンカーによって接続されて単一のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。このような特定の実施態様では、一本鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に接続している。
非対称Ｆａｂアームはまた、荷電アミノ酸突然変異又は非荷電アミノ酸突然変異を、ドメイン接触面に導入して、適正なＦａｂペアリングを誘導することによっても操作され得る。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照されたい。
「単鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」とは、ペプチドリンカーにより接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは１０～２５個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続することも、その逆も可能である。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。
「ブロッキング剤」という用語は、エフェクター分子、特に放射性標識化合物の、そのエフェクター分子に対する機能的結合部位への結合をブロックする薬剤を指す。一般に、当該ブロッキング剤は、エフェクター分子に対する機能的結合部位に結合し、例えば、当該機能的結合部位に特異的に結合する。
「除去剤」という用語は、対象の循環からの抗体のクリアランス速度を増加させる薬剤を指す。一般に、除去剤は抗体に結合し、例えば抗体に特異的に結合する。
本明細書で使用される場合、「除去工程」又は「除去段階」という用語は、ブロッキング剤又は除去剤のいずれかの使用を包含する。いくつかの薬剤は、除去剤及びブロッキング剤の両方として機能することができる。
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する相手である、タンパク質性又は非タンパク質性のいずれかの、抗原上の部位を示す。エピトープは、連続したアミノ酸のストレッチから形成されることも（線状エピトープ）、又は、例えば、抗原の折り畳み、すなわちタンパク質性抗原の三次元折り畳みによって空間的に近接する非連続アミノ酸を含むことも（立体構造エピトープ）可能である。線状エピトープは、典型的には、タンパク質性抗原を変性剤に曝露した後も依然として抗体によって結合されているが、立体構造エピトープは、典型的には、変性剤での処置により破壊される。エピトープは、固有の空間的立体構造の中に少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、又は８～１０個のアミノ酸を含む。
特定のエピトープに結合する抗体（すなわち同じエピトープに結合する抗体）のスクリーニングは、例えば、限定的されないが、アラニンスキャニング、ペプチドブロット（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２００４）４４３－４６３を参照）、ペプチド切断解析、エピトープ切出し、エピトープ抽出、抗原の化学修飾（Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９（２０００）４８７－４９６を参照）、及びクロスブロッキング（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹを参照）など、当技術分野で常套的な方法を使用してなされ得る。
修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）としても知られる抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）では、多数に由来する抗体の各々の、化学的に又は酵素的に修飾された抗原表面に対する結合プロファイルに基づき、抗原に特異的に結合する、多数のモノクローナル抗体をビニングすることを可能とする（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号を参照されたい）。各ビン内の抗体は、別のビンにより表されるエピトープと顕著に異なるか、又は部分的に重複する、固有のエピトープであり得る、同じエピトープに結合する。
また、競合結合を使用して、抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するか、又は参照抗体との結合について競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。また例えば、抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件で抗原に結合させることができる。過剰な参照抗体を除去した後、問題の抗体が抗原に結合する能力が評価される。問題の抗体が参照抗体の飽和結合後に抗原に結合できる場合、その問題の抗体は、参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。しかし、問題の抗体が参照抗体の飽和結合後に抗原に結合できない場合、問題の抗体は参照抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。問題の抗体が同じエピトープに結合しているのか、又は立体的な理由で結合が妨害されているだけなのかを確認するためには、常套的実験を用いることができる（例えばペプチド突然変異や、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、又は当技術分野で利用可能なその他の定量的又は定性的な抗体結合アッセイを用いた結合分析等）。このアッセイは、２つの設定、すなわち、両方の抗体が飽和抗体である状態で実施されるべきである。両方の設定において、第１の（飽和）抗体のみが抗原に結合できる場合、問題の抗体と参照抗体が抗原への結合に関して競合すると結論付けることができる。
いくつかの態様では、競合結合アッセイで測定して、一方の抗体の１、５、１０、２０又は１００倍過剰が他方の結合を少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、さらには９９％以上阻害する場合、２つの抗体は同じ又は重複するエピトープに結合すると見なされる（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０（１９９０）１４９５－１５０２を参照されたい）。
いくつかの態様では、２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減させるか又は排除する、抗原内の本質的に全てのアミノ酸変異が他方の結合も低減させるか又は排除する場合、同じエピトープに結合するとみなされる。２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減させるか又は排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の抗体の結合を低減させるか又は排除する場合、「重複するエピトープ」を有するとみなされる。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。特定の態様では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。特定の態様では、抗体は、Ｆｃ領域エフェクター機能を低下させるためのＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の態様では、抗体はＩｇＧ２アイソタイプのものである。特定の態様では、抗体は、ＩｇＧ４抗体の安定性を改善するためにヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４アイソタイプのものである。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２つの型のうちのいずれかに割り当てることができる。
「Ｆｃエフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、並びにＢ細胞活性化が挙げられる。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び所要期間で有効な量を指す。
「タンデムＦａｂ」という用語は、ペプチドリンカー／テザーを介して接続された２つのＦａｂ断片を含む抗体を指す。いくつかの実施態様では、タンデムＦａｂは、ペプチドリンカー／テザーによって接続された１つのＦａｂ断片及び１つのｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片を含み得る。
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。本明細書における「Ｆｃドメイン」という用語は、第１の定常領域を除く２つの重鎖の定常領域を含む免疫グロブリンのＣ末端領域を定義するために使用される。したがって、Ｆｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指す。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現により宿主細胞によって産生された抗体は、完全長重鎖を含んでいても、完全長重鎖の切断されたバリアントを含んでいてもよい。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されるＦｃ領域を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されるＦｃ領域を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるような、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの一方、すなわち、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの他方と安定に会合することができる免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、通常、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の４つのＦＲドメインで構成される。したがって、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）において次の配列で出現する：ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１（ＣＤＲ－Ｌ１）－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２（ＣＤＲ－Ｌ２）－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３（ＣＤＲ－Ｌ３）－ＦＲ４。
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、天然の抗体構造と実質的に同様の構造を有する抗体、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「融合する」とは、構成要素が、ペプチド結合によって直接的に、又は１つ以上のペプチドリンカーを介して連結することを意味する。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、該細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞と、継代の数に関係なく、それに由来する子孫とが含まれる。子孫は、核酸の含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体のアミノ酸配列又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、或いは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬフレームワーク配列又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を示すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ配列又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３におけるようなサブグループである。一態様では、ＶＬについて、該サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるようなサブグループカッパＩである。一態様では、ＶＨについて、該サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるようなサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲの全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書で使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列内で超可変であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。
一般に、抗体は６つのＣＤＲを含み、３つがＶＨにあり（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、３つがＶＬにある（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））が挙げられる。
特に指示がない限り、ＣＤＲは、上掲のＫａｂａｔらに従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上掲のＣｈｏｔｈｉａ、上掲のＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。上記の代わりに、本明細書に記載のＣＤＲ－Ｈ１の配列は、例えば、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ結合可変ドメインについては、Ｋａｂａｔ２６からＫａｂａｔ３５まで延び得る。
一態様では、ＣＤＲ残基は、配列表又は本明細書の他の箇所で同定されたものを含む。
別途指示がない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ／ＣＤＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１つ又は複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、個体又は対象は、ヒトである。
本明細書に記載の分子は「単離される」ことができる。「単離された」抗体は、その天然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）法によって決定される場合、純度が９５％又は９９％より高くなるまで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くの場合、核酸分子は塩基の配列によって記述され、前記塩基は核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’に向かって表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は線状又は環状であり得る。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。天然に存在しないヌクレオチドの例には、誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学的に修飾された残基を有する修飾ヌクレオチド塩基が含まれる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい。（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １２ Ｊｕｎｅ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又はＥＰ２１０１８２３ Ｂ１を参照されたい）。
「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常は核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は染色体外に、又は天然の染色***置とは異なる染色***置に存在する。
「抗体をコードする単離核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１つ又は複数の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内の核酸分子（複数可）を含み、そのような核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ又は複数の場所に存在する。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち集団を構成する個々の抗体が、例えば天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の生成中に生じる、通常少量で存在するバリアントなど、可能性のあるバリアント抗体を除き、同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する。様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、本発明によるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって製造することができ、これらの方法及びモノクローナル抗体を製造するためのその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
「ネイキッド抗体」は、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的組成物中に存在していてもよい。
「天然抗体」は、天然に存在する、様々な構造を有する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は可変重ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その後に定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続いている。
「添付文書」という用語は、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む、治療用製品の市販のパッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要ならばギャップを導入した後、アライメントのためにいかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージであると定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたる最大のアライメントを得るために必要なアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。或いは、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて、同一性パーセント値を生成することもできる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、利用者向け文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、そこで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録され、且つ国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。
本明細書では、特に断らない限り、アミノ酸配列の同一性パーセント値は、ＢＬＯＳＵＭ５０比較行列と共にバージョン３６．３．８ｃ以降のＦＡＳＴＡパッケージのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ （１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：２２７－２５８；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって記載されており、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ．又はｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから公的に入手可能である。代替的に、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的なサーバーを使用して、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用い、ローカルではなくグローバルのアラインメントを確実に行い、配列を比較することができる。アミノ酸の同一性パーセントは、出力アライメントヘッダに示される。
「薬学的組成物」又は「薬学的製剤」という用語は、調製物に含まれる有効成分の生物活性が有効になるような形態をしており、また薬学的組成物が投与されるであろう対象に対して容認できないほど毒性のある追加の成分を含まない、調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」とは、薬学的組成物又は製剤中の有効成分以外の成分を指し、これは対象にとって非毒性である。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、添加物、安定剤又は保存剤が含まれる。
本明細書で使用される標的抗原への言及は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意の天然標的抗原を指す。この用語は、「完全長」のプロセシングされていない標的抗原、並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態の標的抗原を包含する。この用語は、標的抗原の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例えば、標的抗原ＣＥＡは、ヒトＣＥＡ、特にＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｐ０６７３１（バージョン１１９）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４３５４．２．に示されるがん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）のアミノ酸配列を有し得る。標的抗原の別の例は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４４５１．２にて示されている。標的抗原の別の例はＧＰＲＣ５Ｄ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＺＤ１（バージョン１１５）；ヒト配列についてはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０６１１２４．１を参照されたい）である。
本明細書で言及される「スプリット抗体」、「スプリット抗体（複数）」、「単一ドメインスプリット抗体」又は「ＳＰＬＩＴ ＰＲＩＴ」という用語は、共にエフェクター部分に結合することができる抗原結合部位を形成するＶＨドメイン及びＶＬドメインが２つの抗体間で分割され、同じ抗体の一部として（ｉｎ ｖｉｖｏでのアセンブリ前に）存在しないことを意味する。「ＣＥＡ標的ＳＰＬＩＴ ＰＲＩＴ」は、ＣＥＡを標的とするスプリット抗体を指す。「ＳＰＬＩＴ ＰＲＩＴ」という用語はまた、「ＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ」（例えば、「ＴＡ」又は標的抗原がＣＥＡ、ＦＡＰ又はＧＰＲＣ５Ｄである場合）と互換的に使用され得る。「ＣＥＡ標的化ＳＰＬＩＴ ＰＲＩＴ」という用語は、「ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ」という用語と互換的に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「治療（ｔｒｅａｔ）する」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、治療される個体において疾患の本来の経過を変えようとする試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症候の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを備えている。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，９１頁（２００７）を参照されたい）。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインで十分である。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体のＶＨドメイン又はＶＬドメインを用いて単離し、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４６２８（１９９１）を参照されたい。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を伝播させることができる核酸分子を指す。この用語は、導入された宿主細胞のゲノムに組み入れたベクターだけでなく、自己複製核酸構造体としてのベクターも含む。ある種のベクターは、それが作動可能に結合している核酸の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」という。
本明細書で使用される場合、「Ｐｂ」又は「鉛」という用語は、そのイオン、例えばＰｂ（ＩＩ）を含む。他の金属への言及には、そのイオンも含まれる。したがって、当業者は、例えば、鉛、Ｐｂ、２１２Ｐｂ又は２０３Ｐｂという用語が元素のイオン形態、特にＰｂ（ＩＩ）を包含することを意図していることを理解する。
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、部分的に、第１の抗体及び第２の抗体を含む抗体のセットに基づいており、各抗体は標的細胞上の抗原に結合することができるが、エフェクター部分に対する機能的抗原結合部位は、第１の抗体及び第２の抗体が互いに会合している場合にのみ形成される。一実施態様では、本発明による抗体のセットは、細胞死滅／がん治療に有用である。別の実施態様では、本発明の抗体のセットは、例えば、プレターゲティング免疫療法の方法及び／又はプレターゲティングイメージングに有用である。好ましい態様では、そのような方法は、除去剤又はブロッキング剤を投与する工程を排除する。
スプリットフォーマットには、オフターゲット効果を減らすという利点がある。ＰＲＩＴの文脈では、本明細書で実証されているように、除去剤の必要性が回避される。さらに、本明細書に記載の特定のフォーマットは、スプリット抗原結合部位のＶＨドメインの遊離Ｃ末端を回避し、したがって、既存のヒト抗ＶＨ（ＨＡＶＨ）自己抗体が関与する抗薬物抗体反応の可能性を減少させる。さらに、理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、本明細書に記載のフォーマットがＤＯＴＡＭ ＶＨ／ＶＬの疎水性界面の保護を助け、したがって安定性を補助すると考えている。
Ａ．抗体フォーマット
上記のように、本発明は、エフェクター抗原のＶＨ及びＶＬドメインが２つの部分に分割されている二重特異性抗体の新規フォーマット、及びそれを使用する方法を提供する。
特に、本発明は、
ｉ）
ａ）抗原結合部分であって、標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する、抗原結合部分；
ｂ）エフェクター部分に対する抗原結合部位の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むか又はそれからなるポリペプチド；及び
ｃ）２つのサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む第１の抗体であって、
ここで、（ｂ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ａ）の抗原結合部分のＣ末端に融合しており、且つそのＣ末端によって（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
該第１の抗体は、エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＬドメインを含まない、第１の抗体；と
ｉｉ）
ｄ）抗原結合部分であって、標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する、抗原結合部分；
ｅ）エフェクター部分に対する抗原結合部位の抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むか又はそれからなるポリペプチド；及び
ｆ）２つのサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む第２の抗体であって、
ここで、（ｅ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって抗原結合部分のＣ末端に融合しており、且つそのＣ末端によって（ｆ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
該第２の抗体は、エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＨドメインを含まない、第２の抗体と
を含み；
第１の抗体の前記ＶＨドメイン及び第２の抗体の前記ＶＬドメインは、一緒になってエフェクター部分に対する機能的抗原結合部位を形成することができる、抗体のセットに関する。
融合は直接的であってもよく、例えばペプチドリンカーを介して間接的であってもよい。
いくつかの実施態様では、（ａ）及び／又は（ｄ）の抗原結合部分はＦａｂであり得る。
（ｂ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ａ）のＦａｂ断片の重鎖のＣ末端に融合していることが好ましい場合がある。いくつかの実施態様では、（ａ）のＦａｂ断片は、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメインを含む重鎖断片とを含み、（ｂ）のポリペプチドは、そのＮ末端によってＣＨ１ドメインのＣ末端に融合している。
同様に、（ｅ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ｄ）のＦａｂ断片の重鎖のＣ末端に融合していることが好ましい場合がある。いくつかの実施態様では、（ｄ）のＦａｂ断片は、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメインを含む重鎖断片とを含み、（ｅ）のポリペプチドは、そのＮ末端によってＣＨ１ドメインのＣ末端に融合している。
ポリペプチド（ｂ）及び（ｅ）は定常領域（例えば、ＣＨ１又はＣＬ）を含まないことが好ましい場合がある。いくつかの実施態様では、（ｂ）のポリペプチドは、エフェクター部分に対する抗原結合部位の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなること、及び／又は（ｅ）のポリペプチドは、エフェクター部分に対する抗原結合部位の抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）からなることが好ましい場合がある。これは、（ａ）及び（ｄ）のＦａｂ断片の一部を形成する軽鎖の正確なアセンブリを支援し、且つ／又は循環において２つの部分が結合能を有する部分を形成する傾向を減少させる可能性がある。
第１の抗体と第２の抗体の結合により、エフェクター部分に対する機能的抗原結合が１つだけ形成されること、すなわち、会合した２つの抗体がエフェクター部分に対して一価の結合を提供することが好ましい場合がある。したがって、第１の抗体は、エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＨドメインを１つだけ含むことができ、第２の抗体は、エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＬドメインを１つだけ含むことができ、そのため、それらは一緒になって、エフェクター部分に対する完全な機能的結合部位を１つだけ形成する。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体は、標的抗原に結合する別の抗原結合部分、例えば、標的抗原に結合する別のＦａｂ断片などの別の抗体断片をさらに含む。したがって、いくつかの実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体（一般に両方）はそれぞれ、標的抗原に結合できる２つの抗原結合部分を含む。２つの抗原結合部分は、同じ標的抗原に結合できることが好ましい。任意選択で、第１の抗体及び／又は第２の抗体はそれぞれ、標的抗原に結合できる２つ以下の抗原結合部分を含む。他の実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体はそれぞれ、標的抗原に結合できる２つを超える抗原結合部分を含み得る。
一実施態様では、このさらなる抗原結合部分、例えばＦａｂ断片は、そのＣ末端によってＦｃドメインの他のサブユニットのＮ末端に融合している。（２本以上の鎖からなるＦａｂ又は他の部分の場合、その鎖のうちの１本、例えば重鎖のＣ末端によって、Ｆｃドメインの他のサブユニットのＮ末端に融合させることができる）。したがって、一実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体は、各アームが標的抗原に対する結合部位を有する２アーム抗体であってもよい。
したがって、一実施態様では、本発明は、
ｉ）
ａ）第１のＦａｂ断片であって、該Ｆａｂ断片が、標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する、第１のＦａｂ断片；
ｂ）エフェクター部分に対する抗原結合部位の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むか又はそれからなるポリペプチド；及び
ｃ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含み、
ここで、（ｂ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ａ）のＦａｂ断片の鎖の１つのＣ末端に融合しており、且つそのＣ末端によって（ｃ）のＦｃドメインの第１サブユニットのＮ末端に融合しており；
さらに、標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する第２のＦａｂ断片を含み、第２のＦａｂは、その鎖の１つのＣ末端によって（ｃ）のＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、第１の抗体であって；
該第１の抗体は、エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＬドメインを含まない、第１の抗体；と
ｉｉ）
ｄ）第１のＦａｂ断片であって、該Ｆａｂ断片が、標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する、第１のＦａｂ断片；
ｅ）エフェクター部分に対する抗原結合部位の抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むか又はそれからなるポリペプチド；並びに
ｆ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン、
を含み、
ここで、（ｅ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ｄ）のＦａｂ断片の鎖の１つのＣ末端に融合しており、且つそのＣ末端によって（ｆ）のＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており；
さらに、標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する第２のＦａｂ断片を含み、第２のＦａｂは、その鎖の１つのＣ末端によって（ｆ）のＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、
該第２の抗体は、エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＨドメインを含まず；
第１の抗体の前記ＶＨドメイン及び第２の抗体の前記ＶＬドメインは、一緒になってエフェクター部分に対する機能的抗原結合部位を形成することができる、抗体のセットに関する。
第１の抗体の第２のＦａｂ断片は、その重鎖のＣ末端によってＦｃドメインの第２のサブユニットに融合していることが好ましい場合がある。第１の抗体の第２のＦａｂ断片は、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖断片とを含むこと、並びに第２のＦａｂ断片は、そのＣＨ１ドメインのＣ末端によってＦｃドメインの第２のサブユニットに融合していることが好ましい場合がある。同様に、第２の抗体の第２のＦａｂ断片は、その重鎖のＣ末端によってＦｃドメインの第２のサブユニットに融合していることが好ましい場合がある。第２の抗体の第２のＦａｂ断片は、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖断片とを含むこと、並びに第２のＦａｂ断片は、そのＣＨ１ドメインのＣ末端によってＦｃドメインの第２のサブユニットに融合していることが好ましい場合がある。
第１の抗体の第１及び第２の抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ断片）が互いに同じ標的抗原に結合する、すなわち、第１の抗体が標的抗原に対して二価であることが好ましい場合がある。同様に、第２の抗体の第１及び第２の抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ断片）が互いに同じ標的抗原に結合する、すなわち、第２の抗体が標的抗原に対して二価であることが好ましい場合がある。いくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体も、互いに同じ標的抗原に結合する。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体は多価（例えば二価）であり、標的抗原のエピトープに対して単一特異性である。したがって、いくつかの実施態様では、第１の抗体の第１及び第２の抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ断片）は、互いに標的抗原の同じエピトープに結合し、且つ／又は第２の抗体の第１及び第２の抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ断片）は、互いに標的抗原上の同じエピトープに結合する。好ましくは、第１の抗体及び第２の抗体によって結合される標的抗原は同じである。いくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体も、その標的抗体内の同じエピトープに互いに結合する。したがって、第１の抗体の第１及び第２のＦａｂ、又は第２の抗体の第１及び第２のＦａｂ、又は４つ全てのＦａｂの可変ドメイン配列（ＶＨ及びＶＬ）は、いくつかの実施態様では同じであり得る。
他の実施態様では、第１の抗体と第２の抗原は同じ標的抗原に結合するが、それぞれがその標的抗原上の異なるエピトープに結合する－例えば、第１の抗体の第１及び第２のＦａｂ断片は標的抗原のエピトープＡに結合し、第２の抗体の第１及び第２のＦａｂ断片はその標的抗原のエピトープＢに結合する。
いくつかの実施態様では、第１の抗体は以下のペプチド：
ｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＨドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含む第１の重鎖ポリペプチド；
ｉｉ）（ｉ）のＦａｂ重鎖と対合して標的抗原に対する結合部位を形成するＦａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）；
ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含む第２の重鎖ポリペプチド；並びに
ｉｖ）（ｉｉｉ）のＦａｂ重鎖と対合して標的抗原に対する結合部位を形成するさらなるＦａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）
を含み得る。
任意選択で、（ｉ）のＦａｂ重鎖は、（ｉｉｉ）のＦａｂ重鎖と同じ配列を有し、（ｉｉ）及び（ｉｖ）のＦａｂ軽鎖は、互いに同じ配列を有する。
第２の抗体は以下のペプチド：
ｖ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＬドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含む第１の重鎖ポリペプチド；
ｖｉ）（ｖ）のＦａｂ重鎖と対合して標的抗原に対する結合部位を形成するＦａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）；
ｖｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含む第２の重鎖ポリペプチド；並びに
ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）のＦａｂ重鎖と対合して標的抗原に対する結合部位を形成するさらなるＦａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）
を含み得る。
任意選択で、（ｖ）のＦａｂ重鎖は、（ｖｉｉ）のＦａｂ重鎖と同じ配列を有し、（ｖｉ）及び（ｖｉｉｉ）のＦａｂ軽鎖は、互いに同じ配列を有する。
任意選択で、（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉｉ）のＦａｂ重鎖は互いに同じ配列を有し、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉｉ）のＦａｂ軽鎖は互いに同じ配列を有する。
場合によっては好ましい他の実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体はそれぞれ、標的抗原に特異的に結合できる単一の抗原結合部分を有する。したがって、第１の抗体及び／又は第２の抗体は、標的抗原に対して単一特異性及び一価であり得る。好ましくは、第１の抗体及び第２の抗体は、互いに同じ標的抗原に、同じエピトープで、或いは異なるエピトープで結合する。
一実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体は１アーム抗体である。このような実施態様では、（ｂ）のポリペプチドに融合していない第１の抗体のＦｃサブユニットは、他の抗原結合部分にも融合しておらず；且つ／又は（ｅ）のポリペプチドに融合していない第２の抗体のＦｃサブユニットは、他の抗原結合部分にも融合していない。したがって、Ｆｃドメインは、Ｆｄを欠くサブユニットを含み得る。いくつかの実施態様では、抗体を構成するポリペプチドの１つは、Ｆｃサブユニットからなるか、又は本質的にＦｃサブユニットからなり得る。
したがって、いくつかの実施態様では、第１の抗体は以下のポリペプチド：
ｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＨドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含むポリペプチド；
ｉｉ）Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）；並びに
ｉｉｉ）Ｆｃサブユニットポリペプチド（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）
を含み得；
ここで、（ｉ）のＦａｂ重鎖及び（ｉｉ）のＦａｂ軽鎖は、標的抗原に結合することができるＦａｂ断片を形成する。
第２の抗体は以下のポリペプチド：
ｉｖ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＬドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含むポリペプチド；
ｖ）Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）；並びに
ｖｉ）Ｆｃサブユニットポリペプチド（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）
を含み得；
ここで、（ｉｖ）のＦａｂ重鎖及び（ｖ）のＦａｂ軽鎖は、標的抗原に結合することができるＦａｂ断片を形成する。
これらの１アーム抗体のいくつかの実施態様では、（ｉ）及び（ｉｖ）のＦａｂ重鎖は、互いに同じ配列を有し得；且つ、ｉｉ）及び（ｖ）のＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、互いに同じ配列を有し得る。
抗体が異なるパラトープを有する（例えば、異なる抗原及び／又はエピトープに結合する）２つのＦａｂ断片を含む任意の実施態様では、
Ｆａｂの一方が従来のＦａｂ（重鎖ＶＨ－ＣＨ１及び軽鎖ＶＬ－ＣＬを含む）であり、他方がｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ又はｓｃＦａｂであることが好ましい場合がある。第１の特異性／可変ドメイン配列を有するＦａｂは従来のＦａｂであり得、第２の特異性／可変ドメイン配列を有するＦａｂはｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ又はｓｃＦａｂから選択され得る。これにより、軽鎖の誤対合の可能性が減少する。
上記のいずれにおいても、抗原結合部分は、Ｆｃドメインに融合していてもよく、或いは互いに直接的に、又１つ若しくは複数のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合していてもよい。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であり、本明細書に記載される。リンカー（例えば、Ｆａｂ断片とエフェクター部分に対するＶＨ／ＶＬとの間のリンカー、及び／又はエフェクター部分に対するＶＨ／ＶＬとＦｃドメインとの間のリンカー）は、少なくとも５アミノ酸又は少なくとも１０アミノ酸、好ましくは５～１００アミノ酸、例えば、１０～７０、１０～６０、又は１０～５０アミノ酸のペプチドであり得る。いくつかの実施態様では、リンカーは、長さが１５～３０アミノ酸、例えば、１５～２５、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４アミノ酸長であることが好ましい場合がある。リンカーは、剛直なリンカーであっても、柔軟なリンカーであってもよい。いくつかの実施態様では、それは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ及び／又はＡｌａ残基を含むか、又はそれらからなる柔軟なリンカーである。例えば、それは、Ｇｌｙ残基及びＳｅｒ残基を含むか、又はそれらから構成され得る。いくつかの実施態様では、それは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎなどの反復モチーフを有し得、ここで、ｎは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられ、ここで、「ｎ」は典型的には１～１０の間、典型的には２～４の間の数である。前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３）、又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、及びｍ＝０、１、２又は３）、例えば、ｘ＝４及びｎ＝２又は３、例えば、ｘ＝４、ｎ＝２である。いくつかの実施態様では、リンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１）を含む。別の実施態様では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号１４８）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１４９）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号１５０）であるか、又はそれらを含み得る。別の例示的なペプチドリンカーは、ＥＰＫＳＣ（Ｄ）－（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１５１）である。さらに、抗原結合部分がＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合される場合、追加のペプチドリンカーの有無にかかわらず、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して融合されてもよい。
本発明者らは、ｙ個のアミノ酸からなるペプチドリンカーにおいて、ｙ位のＳｅｒ（すなわち、リンカーの最後の／Ｃ末端アミノ酸としてのＳｅｒ）が、このｙ＋２アミノ酸の性質に応じて、ｙ＋２アミノ酸（すなわち、リンカーの最後のアミノ酸からＣ末端方向に２残基に位置するアミノ酸）のグリコシル化を誘導し得ることを決定した。したがって、リンカーの最後のセリン残基がｙ－２位又はｙ－３位に配置されること（すなわち、リンカーの最後のセリン残基が、リンカーの最後のアミノ酸からＮ末端方向に２又は３位のアミノ酸にあること）が好ましい場合がある。いくつかの実施態様では、リンカーは、Ｇｌｙ及びＳｅｒからなる群から選択されるｙ個の連続するアミノ酸残基からなり得、例えば、ここで、ｙ＝少なくとも５、又は少なくとも１０且つ１００以下、例えば、５～１００、１０～７０、１０～６０、又は１０～５０、例えば、１５～３１若しくは１５～３０、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、若しくは２５；最後のセリンは、ｙ－２位又はｙ－３位にある。（したがって、ｙ－２位にセリンが存在し、ｙ－１位及びｙ位にグリシンが存在してもよく；又は、ｙ－３位にセリンが存在し、ｙ－２位、ｙ－１位及びｙ位にグリシンが存在してもよい）。いくつかの実施態様では、ｙ＝２０又は２１であることが好ましい場合がある。いくつかの実施態様では、リンカーは、（ＧｘＳ）ｎ（ＧＧＳＧＧ）又は（ＧｘＳ）ｎ（ＧＧＳＧＧＧ）（Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、ｘ＝４、ｎ＝１～２０、例えば１～１０、例えば２、３、４、５、６、７、８、又は９、例えばｎ＝２～４）であることが好ましい場合がある。例えば、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号１４８）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号１５０）であり得る。
上記の抗体のセットのいずれかの特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。さらにより具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、該ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。
Ｆｃ領域は、Ｆｃエフェクター機能を低減させるか又は排除するように操作されることが好ましい場合がある。これには、Ｆｃ領域残基２３４、２３５、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び／又は３２９のうちの１つ又は複数、例えば、２３４、２３５、及び／又は３２９のうちの１つ又は複数の置換が含まれ得る。いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域は、Ｐｒｏ３２９からＧｌｙへ、Ｌｅｕ２３４からＡｌａへ、及び／又はＬｅｕ２３５からＡｌａへの置換（ＥＵインデックスによる番号付け）を含むように操作され得る。Ｆｃエフェクター機能を低減するための修飾については、以下でさらに説明する。
多重特異性抗体を作製するために知られている技術は、本明細書に記載のヘテロ二量体を作製するためにも使用できる。これらは、異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照されたい）、及び「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；及びＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。他の方法は、抗体Ｆｃヘテロダイマー分子を作製するための、静電ステアリング効果の操作（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照されたい）；２つ又はこれを超える抗体又は断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号；及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）；ロイシンジッパーの使用（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）及び国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照されたい）；及び軽鎖ミスペアリング問題を回避するための一般的な軽鎖技術の使用（例えば、国際公開第９８／５０４３１号を参照されたい）を含む。
上述の完全長抗体のＣＨ３ドメインは、「ノブ・イントゥー・ホール」技術によって改変することができ、この技術については、例えば国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９（１９９６）６１７－６２１；及びＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６（１９９８）６７７－６８１にいくつかの例を示して詳しく記載されている。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面が、これら２つのＣＨ３ドメインを含む両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させるように改変される。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、他方は「ホール」である。例えば、一方はいわゆる「ノブ変異」（Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃの一方）を含み、他方はいわゆる「ホール変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ又及びＹ４０７Ｖ並びに場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃ）（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９６）７３を参照されたい）を含む。
ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体を安定化し（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６（１９９８）６７７－６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６－３５）、収率を高めるために、追加又は代替として使用することができる。
したがって、いくつかの実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体はさらに、以下の点で特徴づけられる：完全長抗体の一方の重鎖のＣＨ３ドメインと完全長抗体の他方の重鎖のＣＨ３ドメインはそれぞれ、抗体ＣＨ３ドメイン間の元の接触面を構成する接触面で会合する；ここで、前記接触面は抗体の形成を促進するように改変され、その改変は以下のことを特徴とする：
ａ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインが、抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の接触面と会合する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の接触面内で、アミノ酸残基が、側鎖の体積が大きなアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの接触面内に***を生成し、これが、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの接触面内の空洞内に配置されるように変更され；
且つ
ｂ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインが、抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の接触面と会合する第２のＣＨ３ドメインの元の接触面内で、アミノ酸残基が、側鎖の体積が小さなアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、第２のＣＨ３ドメインの接触面内に空洞を生成し、この中に、第１のＣＨ３ドメインの接触面内の***が配置されるように変更される。
より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択されてもよい。より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群から選択されてもよい。
場合により、いくつかの実施態様では、両方のＣＨ３ドメインは、両方のＣＨ３ドメイン間にジスルフィド架橋が形成され得るように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置にアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することによってさらに改変される。
いくつかの実施態様では、多重特異性（例えば、バイパラトープ）抗体は、それに含まれるＦａｂ分子（ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ分子を含む）において、結合アームの１つ（又は３つ以上の抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合は複数）でＶＨ／ＶＬ交換を伴うＦａｂベースの二重／多重特異性抗原結合分子の産生中に生じ得る、軽鎖と不一致の重鎖との誤対合（Ｂｅｎｃｅ－Ｊｏｎｅｓ型副生成物）を減少させるのに特に効果的であるアミノ酸置換を含んでもよい（その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１５／１５０４４７号、特にその中の実施例も参照）。所望される多重特異性抗体の、所望されない副産物、特に、それらの結合アームのうちの１つにおいて生じるＢｅｎｃｅ－Ｊｏｎｅｓ型副産物と比較した比率は、Ｆａｂ分子の、ＣＨ１ドメイン内及びＣＬドメイン内の特定のアミノ酸位置において、反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入（本明細書では、場合によって、「電荷修飾」と称される）により改善され得る。
したがって、いくつかの実施態様では、Ｆａｂ分子を含む本発明の抗体は、本明細書に記載の電荷修飾を含む重鎖定常ドメインＣＨ１ドメイン、及び本明細書に記載の電荷修飾を含む軽鎖定常ＣＬドメインを有する少なくとも１つのＦａｂを含む。
電荷修飾は、本発明の抗体に含まれる従来のＦａｂ分子、又は本発明の抗体に含まれるクロスオーバーＦａｂ分子のいずれかで行うことができる（両方ではない）。特定の実施態様では、電荷修飾は、本発明の抗体に含まれる従来のＦａｂ分子において行われる。
いくつかの実施態様では、電荷修飾を含む軽鎖定数ドメインＣＬ及び電荷修飾を含む重鎖定数ドメインＣＨ１を含むＦａｂ又はｃｒｏｓｓ－Ｆａｂにおいて、軽鎖定数ドメインＣＬにおける電荷修飾は、１２４位、任意選択で１２３位（Ｋａｂａｔによる番号付け）にあり、重鎖定数ドメインＣＨ１における電荷修飾は、１４７位及び／又は２１３位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）にある。いくつかの実施態様では、軽鎖定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって（好ましい一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）によって）置換されており、重鎖定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸及び／又は２１３位のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
Ｂ．標的抗原
標的細胞の表面上に発現される抗原は、本明細書では「標的抗原」又は「標的細胞抗原」とも呼ばれる。これらの用語は、本明細書では互換的に使用される。
本発明は、治療方法及びその中で使用するための製品に関する限り、患者の細胞、例えば疾患細胞を標的とする細胞傷害活性によって治療可能な任意の症状に適用可能である。したがって、標的細胞は、細胞傷害性を標的とすることが望ましい任意の細胞、例えば、任意の疾患細胞である。治療は、好ましくは腫瘍又はがんの治療である。しかしながら、本発明の適用性は、腫瘍及びがんに限定されない。例えば、治療はまた、ウイルス感染（感染細胞を標的とすることによる）又はＴ細胞駆動型自己免疫疾患（Ｔ細胞を標的とすることによる）の治療であり得る。感染細胞の表面に発現するウイルス抗原に対する免疫毒素は、ＨＩＶ、狂犬病及びＥＢＶ等の様々なウイルス感染について調査されている。Ｃａｉ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ ２０１１ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９０（３）：１４３－５０は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスに感染した細胞の標的化死滅のために、ＰＥ３８を含有する免疫毒素を使用した。さらに、Ｒｅｓｉｍｍｕｎｅ（登録商標）（Ａ－ｄｍＤＴ３９０－ｂｉｓＦｖ（ＵＣＨＴ１））は、ヒト悪性Ｔ細胞を選択的に死滅させ、正常Ｔ細胞を一過性に枯渇させ、多発性硬化症及び移植片対宿主病等のＴ細胞駆動型の自己免疫疾患、並びに臨床試験を受けているＴ細胞血液がんの治療の可能性を有すると考えられている。同様に、本発明の方法は、がん細胞又は腫瘍細胞を含むがこれらに限定されない、イメージングが望ましい任意の細胞型に適用可能であり得る。
したがって、適切な標的抗原としては、がん細胞抗原、ウイルス抗原又は微生物抗原が挙げられ得る。
抗原は、通常、過剰発現又は異常時のいずれかで発現される正常細胞表面抗原である。理想的には、標的抗原は疾患細胞（腫瘍細胞等）上でのみ発現されるが、これは実際にはめったに観察されない。結果として、標的抗原は、通常、疾患組織と健康な組織との間の差次的発現に基づいて選択される。
細胞表面マーカー又は標的抗原は、例えば、腫瘍関連抗原であり得る。
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」又は「腫瘍特異的抗原」という用語は、抗原が腫瘍（複数可）及び／又はがん（複数可）に関連するように、腫瘍細胞及び／又はがん細胞、又はがん関連線維芽細胞等の腫瘍の間質の他の細胞によって単独で又は優勢に発現又は過剰発現される任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物等）を指す。腫瘍関連抗原は、正常細胞、非腫瘍細胞又は非がん性細胞によってさらに発現され得る。しかしながら、そのような場合、正常細胞、非腫瘍細胞又は非がん性細胞による腫瘍関連抗原の発現は、腫瘍又はがん細胞による発現ほど頑強ではない。これに関して、腫瘍又はがん細胞は、正常細胞、非腫瘍細胞又は非がん性細胞による抗原の発現と比較して、抗原を過剰発現するか、又は有意に高いレベルで抗原を発現することができる。また、腫瘍関連抗原は、発達又は成熟の異なる状態の細胞によってさらに発現され得る。例えば、腫瘍関連抗原は、胚段階又は胎児段階の細胞によってさらに発現され得、この細胞は通常、成体宿主には見られない。或いは、腫瘍関連抗原は、幹細胞又は前駆細胞によってさらに発現され得、これらの細胞は通常、成体宿主には見られない。
腫瘍関連抗原は、本明細書に記載のがん及び腫瘍を含む任意のがん又は腫瘍の任意の細胞によって発現される抗原であり得る。腫瘍関連抗原は、腫瘍関連抗原が１種類のがん又は腫瘍のみに関連する又は１種類のがん又は腫瘍のみに特徴的であるように、１種類のがん又は腫瘍のみの腫瘍関連抗原であり得る。或いは、腫瘍関連抗原は、２種類以上のがん又は腫瘍の腫瘍関連抗原（例えば、特徴的であってもよい）であり得る。例えば、腫瘍関連抗原は、乳がん細胞及び前立腺がん細胞の両方によって発現され得、正常細胞、非腫瘍細胞又は非がん細胞によっては全く発現され得ない。
本発明の抗体が結合し得る例示的な腫瘍関連抗原としては、限定されるものではないが、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ムチン１（ＭＵＣｌ；腫瘍関連上皮ムチン）、優先的に発現するメラノーマの抗原（ＰＲＡＭＥ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＳＣＡ、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２（トロホブラスト－２、ＥＧＰ－１としても知られる）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭ－ＣＳＦＲ）、ＣＤ５６、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）（ｅｒｂＢ－２としても知られる）、ＣＤＳ、ＣＤ７、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）Ｉ及びＴＲＰ２が挙げられる。別の実施態様では、腫瘍抗原は、分化抗原群（ＣＤ）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン３、骨髄系細胞表面抗原）、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３（インターロイキン３受容体アルファ）、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体、メソテリン、カドヘリン、ルイスＹ、グリピカン－３、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質アルファ）、ＧＰＲＣ５Ｄ（Ｇタンパク質共役受容体クラスＣ群５メンバーＤ）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＣＡ９＝ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）、Ｌｌ ＣＡＭ（神経細胞接着分子Ｌ１）、エンドシアリン、ＨＥＲ３（上皮増殖因子受容体ファミリーメンバー３の活性化コンフォメーション）、Ａｌｋｌ／ＢＭＰ９複合体（未分化リンパ腫キナーゼ１／骨形成タンパク質９）、ＴＰＢＧ＝５Ｔ４（トロホブラスト糖タンパク質）、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様表面抗原）、ＨＥＲ１（上皮成長因子受容体の活性化コンフォメーション）及びＣＬＬ１（Ｃ型レクチンドメインファミリー１２、メンバーＡ）からなる群から選択され得る。メソテリンは、例えば、卵巣がん、中皮腫、非小細胞肺がん、肺腺癌腫、卵管がん、頭頸部がん、子宮頸がん、及び膵臓がんにおいて発現される。ＣＤ２２は、例えば、有毛細胞白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）で発現される。ＣＤ２５は、例えば、有毛細胞白血病及びホジキンリンパ腫を含む白血病及びリンパ腫において発現される。ルイスＹ抗原は、例えば、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、肺がん、及び膵臓がんにおいて発現される。ＣＤ３３は、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）、及び骨髄増殖性障害で発現される。
腫瘍関連抗原に特異的に結合する例示的な抗体としては、限定されるものではないが、トランスフェリン受容体に対する抗体（例えば、ＨＢ２１及びそのバリアント）、ＣＤ２２に対する抗体（例えば、ＲＦＢ４及びそのバリアント）、ＣＤ２５に対する抗体（例えば、抗Ｔａｃ及びそのバリアント）、メソテリンに対する抗体（例えば、ＳＳ１、ＭＯＲＡｂ－００９、ＳＳ、ＨＮ１、ＨＮ２、ＭＮ、ＭＢ、及びそれらのバリアント）、及びルイスＹ抗原に対する抗体（例えば、Ｂ３及びそのバリアント）が挙げられる。これに関して、標的化部分（細胞結合剤）は、Ｂ３、ＲＦＢ４、ＳＳ、ＳＳ１、ＭＮ、ＭＢ、ＨＮ１、ＨＮ２、ＨＢ２１及びＭＯＲＡｂ－００９、並びにそれらの抗原結合部分からなる群から選択される抗体であり得る。本発明のキメラ分子における使用に適したさらなる例示的な標的化部分は、例えば、米国特許第５，２４２，８２４号（抗トランスフェリン受容体）；特許文献第５，８４６，５３５号（抗ＣＤ２５）；特許文献第５，８８９，１５７号（抗ルイスＹ）；特許文献第５，９８１，７２６（抗ルイスＹ）；５，９９０，２９６号（抗ルイスＹ）；特許文献第７，０８１，５１８号（抗メソテリン）；特許文献第７，３５５，０１２号（抗ＣＤ２２及び抗ＣＤ２５）；特許文献第７，３６８，１１０号（抗メソテリン）；特許文献第７，４７０，７７５号（抗ＣＤ３０）；特許文献第７，５２１，０５４号（抗ＣＤ２５）；及び特許文献第７，５４１，０３４号（抗ＣＤ２２）；米国特許出願公開第２００７／０１８９９６２号（抗ＣＤ２２）；Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６：３２６－３３４（２０００）、及びＫｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，８（３）：Ｅ５３２－Ｅ５５１（２００６）に開示されている（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＣＤ３３、糖タンパク質ＮＭＢ、ＣａｎＡｇ、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ）、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２）、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３）、ＣＤ７９、ＣＤ１３８、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ７０、Ｅ－セレクチン、ＥｐｈＢ２、メラノトランスフェリン、Ｍｕｃ１６及びＴＭＥＦＦ２を含む特定の腫瘍関連抗原を標的とするさらなる抗体が産生されている。これらのいずれか又はその抗原結合断片は、本発明において有用であり得る、すなわち、本明細書に記載される抗体に組み込まれ得る。
本発明のいくつかの実施態様では、腫瘍関連抗原ががん胎児性抗原（ＣＥＡ）であることが好ましい場合がある。
ＣＥＡは、比較的ゆっくりと内在化され、したがって、放射性核種への結合のために、初期処置後に高い割合の抗体が細胞の表面で利用可能なままであるため、本発明との関連において有利である。他の低内在化標的／腫瘍関連抗原も好ましい場合がある。腫瘍関連抗原の他の例としては、ＣＤ２０又はＨＥＲ２が挙げられる。なおさらなる実施態様では、標的は、ＥＧＰ－１（トロホブラスト－２としても知られる上皮糖タンパク質－１）、結腸特異的抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）又は膵臓ムチンＭＵＣ１であり得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ ２０１２ （Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２（５））を参照されたい。この参考文献はまた、ＣＳＡｐに結合するＭｕ－９（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３；６３：３５４－６３も参照されたい）、ＭＵＣ１に結合するｈＰＡＭ４（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８：６８：４８１９－２６も参照されたい）、ＣＤ２０に結合するバルツズマブ（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８；６８：５２８２－９０も参照されたい）、及びＥＧＰ－１に結合するｈＲＳ７（Ｃｕｂａｓ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００９；１７９６：３０９－１４も参照されたい）等の抗体を記載する。これらのいずれか又はその抗原結合部分は、本発明において有用であり得る、すなわち、本明細書に記載される抗体に組み込まれ得る。ＣＥＡに対して産生された抗体の一例は、Ｔ８４．６６（ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＡＡ３６９８０（重鎖）及びＣＡＡ３６９７９（軽鎖）に示される、又は国際公開第２０１６／０７５２７８号の配列番号３１７及び３１８に示される）、並びにそのヒト化型及びキメラ型、例えば国際公開第２０１６／０７５２７８号Ａ１及び／又は国際公開第２０１７／０５５３８９号に記載されているＴ８４．６６－ＬＣＨＡである。別の例は、国際公開第２０１２／１１７００２号及び国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載されている抗ＣＥＡ抗体であるＣＨ１Ａ１ａ、及びＣＥＡ ｈＭＮ－１４である（米国特許第６６７６９２４号及び米国特許第５８７４５４０号も参照されたい）。別の抗ＣＥＡ抗体は、Ｍ．Ｊ．Ｂａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９９７，２９（２），１６１－１７１に記載されているＡ５Ｂ７である。マウス抗体Ａ５Ｂ７に由来するヒト化抗体は、国際公開第９２／０１０５９号及び国際公開第２００７／０７１４２２号に開示されている。また、同時係属出願である、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６７５８２も参照されたい。Ａ５Ｂ７のヒト化型の例は、Ａ５Ｈ１ＥＬ１（Ｇ５４Ａ）である。ＣＥＡに対するさらなる例示的抗体は、米国特許第７６２６０１１号及び／又は同時係属出願ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６７５８２号に記載されているＭＦＥ２３及びそのヒト化バージョンである。ＣＥＡに対する抗体のなおさらなる例は２８Ａ９である。これらのいずれか又はその抗原結合断片は、本発明においてＣＥＡ結合部分を形成するのに有用であり得る。
ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質アルファ）又はＧＰＲＣ５Ｄ（Ｇタンパク質共役受容体クラスＣ群５メンバーＤ）もまた、いくつかの実施態様では好ましい場合がある。ＦＡＰは、多数の腫瘍タイプ（例えば、膵臓がん、乳がん、及び肺がん）の微小環境におけるその広範な発現のため、イメージング及び治療のための確立された標的である（Ｌｉｎｄｎｅｒ，Ｔ．，Ｌｏｋｔｅｖ，Ａ．，Ｇｉｅｓｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．ＥＪＮＭＭＩ ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．ｃｈｅｍ．４，１６（２０１９））。したがって、本発明の一実施態様では、ＦＡＰを標的抗原として使用するＳＰＬＩＴ ＰＲＩＴは、活性化されたがん関連線維芽細胞上に２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの特異的蓄積を生じさせると予想されるであろう。結果として、放出されたアルファ放射線は、隣接する腫瘍細胞に対する限定された直接的な殺腫瘍効果に加えて、ＦＡＰ発現悪性腫瘍の免疫抑制に悪影響を及ぼすと予想されるであろう。Ｇタンパク質共役受容体ファミリーＣ５群メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）は、多発性骨髄腫形質細胞上で、過剰発現され（Ａｔａｍａｎｉｕｋ Ｊ，Ｇｌｅｉｓｓ Ａ，Ｐｏｒｐａｃｚｙ Ｅ，Ｋａｉｎｚ Ｂ，Ｇｒｕｎｔ ＴＷ，Ｒａｄｅｒｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５Ｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１２；４２：９５３－６０）、確立されたＳＣ（皮下）ｉｎ ｖｉｖｏモデル、例えば、ＯＰＭ－２及びＮＣＩ－Ｈ９２９は、多発性骨髄腫患者において見出される発現を反映する（Ｋｏｄａｍａ Ｔ，Ｋｏｃｈｉ Ｙ，Ｎａｋａｉ Ｗ，Ｍｉｚｕｎｏ Ｈ，Ｂａｂａ Ｔ，Ｈａｂｕ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ－ＧＰＲＣ５Ｄ／ＣＤ３ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ－ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２０１９）１８：１５５５－６４）。したがって、本発明の一実施態様では、我々は、標的抗原としてＧＰＲＣ５Ｄを使用するＳＰＬＩＴ ＰＲＩＴにより、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの腫瘍特異的蓄積を生じさせ、続いて放射線誘導性腫瘍細胞死を引き起こすと予想する。
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、標的抗原（例えば、本明細書中で論じられる任意の標的抗原）に特異的に結合し得る。いくつかの実施態様では、それらは、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０－７Ｍ以下、例えば１０－７～１０－１３、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）で結合し得る。
一実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体はそれぞれ、「抗原Ａ」と呼ぶことができる同じ標的抗原に結合することができる（すなわち、それらは同じ標的抗原に対して結合特異性を有する）。それらはそれぞれ、抗原Ａ上の同じエピトープに対して結合特異性を有する可能性がある。あるいは、第１の抗体は抗原Ａ上の第１のエピトープに結合し得、第２の抗体は抗原Ａ上の異なる第２のエピトープに結合し得る。例えば、一実施態様では、抗体の一方はＣＥＡのＴ８４．６６エピトープに結合し得、他方はＣＥＡのＡ５Ｂ７エピトープに結合し得る。いくつかの実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体の一方又は両方は、抗原Ａに対してバイパラトープであってもよい、すなわち、個々の抗体のそれぞれは、抗原Ａの２つの異なるエピトープに結合してもよい。第１の抗体は、抗原Ａの第１のエピトープ及び第２のエピトープにそれぞれ結合する第１の結合部位及び第２の結合部位を含む場合があり、第１のエピトープ及び第２のエピトープは互いに異なる。代替的に又は追加的に、第２の抗体は、抗原Ａの第１のエピトープ及び第２のエピトープに結合する第１の結合部位及び第２の結合部位を含む場合があり、第１のエピトープ及び第２のエピトープは互いに異なる。いくつかの実施態様では、第１の抗体によって結合されるエピトープの一方又は両方は、第２の抗体によって結合されるエピトープの一方又は両方と異なっていてもよい。他の実施態様では、第１の抗体によって結合される２つのエピトープは、第２の抗体によって結合される２つのエピトープと同じであり得る。
別の実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は、それぞれ抗原Ａ及び抗原Ｂと呼ばれ得る異なる標的抗原にそれぞれ結合し得る。
Ｃ．エフェクター部分
本発明によれば、第１の抗体及び第２の抗体の会合は、エフェクター部分に対する機能的結合部位を形成する。
特定の一実施態様では、本発明によるエフェクター部分は、薬物、細胞毒素、造影剤、及び放射性標識化合物から選択される。
特定の実施態様では、本発明によるエフェクター部分は、放射性同位体を含む放射性標識化合物であり、例えば放射性標識ハプテンである。
いくつかの実施態様では、エフェクター分子は、キレート化放射性同位体を含み得る。
いくつかの実施態様では、エフェクター分子に対する機能的結合部位は、キレート剤及び放射性同位体を含むキレートに結合し得る。他の実施態様では、抗体は、キレート化放射性同位体にコンジュゲートされた部分、例えば、ヒスタミン－スクシニル－グリシン（ＨＳＧ）、ジゴキシゲニン、ビオチン又はカフェインに結合し得る。
キレート剤は、例えば、アミノポリカルボン酸若しくはアミノポリチオカルボン酸等の多座分子、又はその塩若しくは官能性バリアントであり得る。キレート剤は、例えば、二座又は三座又は四座であり得る。適切な金属キレート剤の例としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、又はＣａＮａ２ＥＤＴＡ等の塩形態）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０四酢酸）、ＮＯＴＡ（２，２’、２’’－（１，４，７－トリアザノナン－１，４，７トリイル）三酢酸）、ＩＤＡ（イミノ二酢酸）、ＭＩＤＡ（（メチルイミノ）二酢酸）、ＴＴＨＡ（３，６，９，１２－テトラキス（カルボキシメチル）－３，６，９，１２テトラ－アザテトラデカン二酸）、ＴＥＴＡ（２，２’、２’’、２’’’－（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１テトライル）四酢酸）、ＤＯＴＡＭ（１，４，７，１０－テトラキス（カルバモイルメチル）－１，４，７，１０テトラアザシクロドデカン）、ＨＥＨＡ（１，４，７，１０，１３，１６－ヘキサアザシクロヘキサデカン－１，４，７，１０，１３，１６－ヘキサ酢酸、テキサス州プレイノのＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｉｎｃ．入手可能）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）ＥＤＤＨＡ（エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシフェニル酢酸）、ＢＡＬ（２，３，－ジメルカプトプロパノール）、ＤＭＳＡ（２，３－ジメルカプトコハク酸）、ＤＭＰＳ（２，３－ジメルカプト－１－プロパンスルホン酸）、Ｄ－ペニシラミン（Ｂ－ジメチルシステイン）、ＭＡＧ３（メルカプトアセチルトリグリシン）、Ｈｙｎｉｃ（６－ヒドラジノピリジン－３－カルボン酸）、ｐ－イソチオシアナトベンジル－デスフェリオキサミン（例えば、イメージングのためジルコニウムで標識される）、及び金属をキレートすることができるその塩又は機能的バリアント／誘導体を含む分子が挙げられる。いくつかの実施態様では、キレート剤は、金属をキレート化することができるＤＯＴＡ若しくはＤＯＴＡＭ又はその塩若しくは機能的バリアント／誘導体であることが好ましい場合がある。したがって、キレート剤は、放射性同位体がキレート化されたＤＯＴＡ若しくはＤＯＴＡＭであってもよく、又はＤＯＴＡ若しくはＤＯＴＡＭを含んでもよい。
エフェクター分子は、放射性核種と共に、上記のキレート剤の機能的バリアント又は誘導体を含むか、又はそれらからなり得る。適切なバリアント／誘導体は、ある程度異なっており、キレート剤として機能する能力を保持している構造を有する（すなわち、本明細書に記載の目的の１つ又は複数のために使用されるのに十分な活性を保持する）。機能的バリアント／誘導体はまた、小分子、ポリペプチド又は炭水化物を含む１つ又は複数の追加の部分又は置換基にコンジュゲートされた上記のキレート剤を含み得る。この結合は、構成炭素の１つを介して、例えばキレート剤の骨格部分で起こり得る。適切な置換基は、例えば、アルキル、アルケニル、アリール又はアルキニル等の炭化水素基；ヒドロキシ基；アルコール基；ハロゲン原子；ニトロ基；シアノ基；スルホニル基；チオール基；アミン基；オキソ基；カルボキシ基；チオカルボキシ基；カルボニル基；アミド基；エステル基；又はヘテロアリール基を含む複素環であり得る。置換基は、例えば、以下の基「Ｒ１」について定義されるもののうちの１つであり得る。小分子は、例えば、色素（Ａｌｅｘａ ６４７又はＡｌｅｘａ ４８８等）、ビオチン若しくはビオチン部分、又はフェニル若しくはベンジル部分であり得る。ポリペプチドは、例えばオリゴペプチド、例えば２又は３アミノ酸のオリゴペプチドであり得る。例示的な炭水化物としては、デキストラン、直鎖若しくは分岐ポリマー又はコポリマー（例えば、ポリアルキレン、ポリ（エチレン－リジン）、ポリメタクリレート、ポリアミノ酸、ポリ又はオリゴ糖、デンドリマー）が挙げられる。誘導体はまた、上記の化合物がリンカー部分を介して連結されているキレート剤化合物の多量体を含み得る。誘導体はまた、金属イオンをキレート化する能力を保持する上記化合物の機能的断片を含み得る。
誘導体の特定の例としては、ベンジル－ＥＤＴＡ及びヒドロキシエチル－チオウリド－ベンジルＥＤＴＡ、ＤＯＴＡ－ベンゼン（例えば、（Ｓ－２－（４－アミノベンジル）－１，４，７，１０テトラアザシクロドデカン四酢酸）、ＤＯＴＡ－ビオチン、及びＤＯＴＡ－ＴｙｒＬｙｓ－ＤＯＴＡが挙げられる。
本発明のいくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体の会合によって形成される機能的結合部位は、ＤＯＴＡＭと金属、例えば鉛（Ｐｂ）とを含む金属キレートに結合する。上述のように、「ＤＯＴＡＭ」は化学名：
１，４，７，１０－テトラキス（カルバモイルメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン
を有し、これは以下の式の化合物である。
Figure 2024504931000002
ある特定の態様及び実施形態では、本発明はまた、金属イオンを組み込む、ＤＯＴＡＭの機能的バリアント又は機能的誘導体も使用し得る。ＤＯＴＡＭの適切なバリアント／誘導体は、ＤＯＴＡＭの構造とある程度異なっており、機能する能力（すなわち、本明細書に記載の１つ又は複数の目的のために使用されるのに十分な活性を保持する）を保持している構造を有する。そのような態様及び実施態様では、ＤＯＴＡＭ又はＤＯＴＡＭの機能的バリアント／誘導体は、国際公開第２０１０／０９９５３６号に開示されている活性バリアントの１つであり得る。適切な機能的バリアント／誘導体は、以下の式の化合物：
Figure 2024504931000003
又はその薬学的に許容され得る塩であり得、式中
ＲＮは、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７シクロアルキル、Ｃ３～７シクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、フェニル、フェニル－Ｃ１～４－アルキル、Ｃ１～７ヘテロアリール、及びＣ１～７ヘテロアリール－Ｃ１～４－アルキルであり、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、Ｃ２～６アルケニル、及びＣ２～６アルキニルはそれぞれ、１、２、３、又は４個の独立して選択されるＲｗ基により置換されていてもよく、当該Ｃ３～７シクロアルキル、Ｃ３～７シクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、フェニル、フェニル－Ｃ１～４－アルキル、Ｃ１～７ヘテロアリール、及びＣ１～７ヘテロアリール－Ｃ１～４－アルキルはそれぞれ、１、２、３、又は４個の独立して選択されるＲｘ基により置換されていてもよく、
Ｌ１は、独立して、Ｃ１～６アルキレン、Ｃ１～６アルケニレン、又はＣ１～６アルキニレンであり、これらの各々は、独立して選択される１、２、又は３個のＲ１基により置換されていてもよく、
Ｌ２は、Ｃ２～４直鎖アルキレンであり、これは、独立して選択されるＲ１基により置換されていてもよく、Ｃ１～４アルキル及び／又はＣ１～４ハロアルキルから独立して選択される１、２、３又は４個の基により置換されていてもよく、
Ｒ１は、Ｄ１－Ｄ２－Ｄ３、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ１～６ハロアルコキシ、Ｃ１～６アルキルチオ、Ｃ１～６アルキルスルフィニル、Ｃ１～６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１～６アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～６アルキルアミノ、Ｃ１～４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１～６アルコキシカルボニル、Ｃ１～６アルキルカルボニルアミノ、ジＣ１～６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１～６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ１～６アルコキシカルボニル－（Ｃ１～６アルキル）アミノ、カルバミル、Ｃ１～６アルキルカルバミル及びジ－Ｃ１～６アルキルカルバミルから独立して選択され、
各Ｄ１は、Ｃ６～１０アリール－Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～９ヘテロアリール－Ｃ１～４アルキル、Ｃ３～１０シクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～９ヘテロシクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～８アルキレン、Ｃ１～８アルケニレン及びＣ１～８アルキニレンから独立して選択され、当該Ｃ１～８アルキレン、Ｃ１～８アルケニレン、及びＣ１～８アルキニレンは、１、２、３、又は４個の独立して選択されるＲ４基により置換されていてもよく、当該Ｃ６～１０アリール－Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～９ヘテロアリール－Ｃ１～４アルキル、Ｃ３～１０シクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～９ヘテロシクロアルキル－Ｃ１～４アルキルはそれぞれ、１、２、３又は４個の独立して選択されるＲ５基により置換されていてもよく、
各Ｄ２は、独立して、存在しないか、又はＣ１～２０直鎖アルキレンであって、当該Ｃ１～２０直鎖アルキレンの１～６個の隣接しないメチレン基がそれぞれ独立して選択された－Ｄ４－部分によって置き換えられていてもよく、ただし、当該Ｃ１～２０直鎖アルキレン中の少なくとも１つのメチレン単位は－Ｄ４－部分によって置き換えられていなくてもよく、当該Ｃ１～２０直鎖アルキレンは、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～４ハロアルキル、Ｃ１～４アルコキシ、Ｃ１～４ハロアルコキシ、アミノ、Ｃ１～４アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～４アルキルアミノ、Ｃ１～４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１～４アルコキシカルボニル、Ｃ１～４アルキルカルボニルアミノ、ジ－Ｃ１～４アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１～４アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ１～４アルコキシカルボニル－（Ｃ１～４アルキル）アミノ、カルバミル、Ｃ１～４アルキルカルバミル及びジ－Ｃ１～４アルキルカルバミルから独立して選択される１つ又は複数の基により置換されていてもよく、
各Ｄ３は、Ｈ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～１４シクロアルキル、Ｃ３～１４シクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～１４ヘテロシクロアルキル、Ｃ２～１４ヘテロシクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ６～１４アリール、Ｃ６～１４アリール－Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～１３ヘテロアリール、Ｃ１～１３ヘテロアリール－Ｃ１～４アルキルから独立して選択され、当該Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニルはそれぞれ、１、２、３又は４個の独立して選択されるＲ６基により置換されていてもよく、当該Ｃ３～１４シクロアルキル、Ｃ３～１４シクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～１４ヘテロシクロアルキル、Ｃ２～１４ヘテロシクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ６～１４アリール、Ｃ６～１４アリール－Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～１３ヘテロアリール、Ｃ１～１３ヘテロアリール－Ｃ１～４アルキルはそれぞれ、１、２、３又は４個の独立して選択されるＲ７基により置換されていてもよく、
各Ｄ４は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｓ）－、－ＮＲｂＣ（＝Ｏ）ＮＲｃ－、－ＮＲｂＣ（＝Ｓ）ＮＲｃ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲａ－、－ＮＲａ－、－ＮＲｂＳ（＝Ｏ）ＮＲｃ－、及びＮＲｂＳ（＝Ｏ）２ＮＲＯ－から独立して選択され、
各Ｒ４及びＲ６は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１～４アルコキシ、Ｃ１～４ハロアルコキシ、Ｃ１～４アルキルチオ、Ｃ１～４アルキルスルフィニル、Ｃ１～４アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１～４アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～４アルキルアミノ、Ｃ１～４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１～４アルコキシカルボニル、Ｃ１～４アルキルカルボニルアミノ、ジ－Ｃ１～４アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１～４アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ１～４アルコキシカルボニル－（Ｃ１～４アルキル）アミノ、カルバミル、Ｃ１～４アルキルカルバミル及びジ－Ｃ１～４アルキルカルバミルから独立して選択され、
各５は、ハロゲン、シアノ、シアネート、イソチオシアネート、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル、Ｃ２～４アルキニル、Ｃ１～４アルコキシ、Ｃ１～４ハロアルコキシ、Ｃ１～４アルキルチオ、Ｃ１～４アルキルスルフィニル、Ｃ１～４アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１～４アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～４アルキルアミノ、Ｃ１～４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ１～４アルコキシカルボニル、Ｃ１～４アルキルカルボニルアミノ、ジ－Ｃ１～４アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１～４アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ１～４アルコキシカルボニル－（Ｃ１～４アルキル）アミノ、カルバミル、Ｃ１～４アルキルカルバミル及びジ－Ｃ１～４アルキルカルバミルから独立して選択され、
各Ｒ７は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７シクロアルキル、Ｃ３～７シクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、フェニル、フェニル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～７ヘテロアリール、Ｃ１～７ヘテロアリール－Ｃ１～４アルキル、－ＯＲＯ、－ＳＲＯ、－Ｓ（＝Ｏ）ＲＰ、－Ｓ（＝Ｏ）２ＲＰ、－Ｓ（＝Ｏ）ＮＲｓＲｔ、－Ｃ（＝Ｏ）ＲＰ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＰ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｓＲｔ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＲＰ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｓＲｔ、－ＮＲｓＲｔ、－ＮＲｑＣ（＝Ｏ）Ｒｒ、－ＮＲｑＣ（＝Ｏ）ＯＲｒ、－ＮＲｑＣ（＝Ｏ）ＮＲｒ、－ＮＲｑＳ（＝Ｏ）２Ｒｒ、及び－ＮＲＰＳ（＝Ｏ）２ＮＲｓＲｔから独立して選択され、当該Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニルはそれぞれ、１、２、３、又は４個の独立して選択されるＲ’基により置換されていてもよく、当該Ｃ３～７シクロアルキル、Ｃ３～７シクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、フェニル、フェニル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～７ヘテロアリール、Ｃ１～７ヘテロアリール－Ｃ１～４アルキルはそれぞれ、１、２、３、又は４個の独立して選択されるＲ’’基により置換されていてもよく、
各Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、独立して、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７シクロアルキル、Ｃ３～７シクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、フェニル、フェニル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～７ヘテロアリール、Ｃ１～７ヘテロアリール－Ｃ１～４アルキルから選択され、当該Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニルはそれぞれ、１、２、３、又は４個の独立して選択されるＲｗ基により置換されていてもよく、当該Ｃ３～７シクロアルキル、Ｃ３～７シクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、フェニル、フェニル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～７ヘテロアリール、Ｃ１～７ヘテロアリール－Ｃ１～４アルキルはそれぞれ、１、２、３又は４個の独立して選択されるＲｘ基により置換されていてもよく、
各Ｒｏ、Ｒｐ、Ｒｑ、Ｒｒ、Ｒｓ及びＲｔは、独立して、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７シクロアルキル、Ｃ３～７シクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、フェニル、フェニル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～７ヘテロアリール、Ｃ１～７ヘテロアリール－Ｃ１～４アルキルから選択され、当該Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ハロアルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニルはそれぞれ、１、２、３又は４個の独立して選択されるＲｙ基により置換されていてもよく、当該Ｃ３～７シクロアルキル、Ｃ３～７シクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル、Ｃ２～７ヘテロシクロアルキル－Ｃ１～４アルキル、フェニル、フェニル－Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～７ヘテロアリール、Ｃ１～７ヘテロアリール－Ｃ１～４アルキルはそれぞれ、１、２、３又は４個の独立して選択されるＲｚ基により置換されていてもよく、
各Ｒ’、Ｒｗ及びＲｙは、独立して、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ１～４アルコキシ、Ｃ１～４ハロアルコキシ、アミノ、Ｃ１～４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～４アルキルアミノから選択され、
各Ｒ’’、Ｒｘ及びＲｚは、独立して、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１～４アルキル、Ｃ１～４ハロアルキル、Ｃ１～４アルコキシ、Ｃ１～４ハロアルコキシ、アミノ、Ｃ１～４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～４アルキルアミノから選択され、
ただし、置換されていてもよい部分の各原子の原子価を超えないことを条件とする。
適切には、上記式の機能的バリアント／誘導体は、ＤＯＴＡＭのものと同等又はそれを超える本発明の抗体に対する親和性を有し、ＤＯＴＡＭのものと同等又はそれを超えるＰｂに対する結合強度を有する（「親和性」は、上記の解離定数によって測定されるものである）。例えば、機能性／バリアント誘導体と本発明の抗体又は／Ｐｂとの解離定数は、同じ抗体／ＰｂとのＤＯＴＡＭの解離定数の１．１倍以下、１．２倍以下、１．３倍以下、１．４倍以下、１．５倍以下又は２倍以下であり得る。
各ＲＮは、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、又はＣ１～６ハロアルキルであり得る；好ましくは、Ｈ、Ｃ１～４アルキル又はＣ１～４ハロアルキルである。最も好ましくは、各ＲＮはＨである。
ＤＯＴＡＭバリアントの場合、１つ、２つ、３つ、又は、最も好ましくは、各Ｌ２は、Ｃ２アルキレンであることが好ましい。有利には、ＤＯＴＡＭのＣ２アルキレンバリアントは、Ｐｂに対して特に高い親和性を有することができる。Ｌ２の任意の置換基は、Ｒ１、Ｃ１～４アルキル又はＣ１～４ハロアルキルであり得る。適切には、Ｌ２の任意の置換基は、Ｃ１～４アルキル又はＣ１～４ハロアルキルであり得る。
任意選択で、各Ｌ２は、非置換Ｃ２アルキレン－ＣＨ２ＣＨ２－であってもよい。
各Ｌ１は、好ましくはＣ１～４アルキレン、より好ましくは－ＣＨ２－等のＣ１アルキレンである。
ＤＯＴＡＭの機能的バリアント／誘導体は、以下の式の化合物であり得る：
Figure 2024504931000004
（式中、各Ｚは、独立して、上に定義されるＲ１であり、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、０、１又は２であり、ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓは１以上である）。好ましくは、ｐ、ｑ、ｒ、及びｓは０又は１であり、及び／又はｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓは１である。例えば、化合物はｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝１を有してもよく、Ｚはｐ－ＳＣＮ－ベンジル部分であり、そのような化合物はＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｉｎｃ．（テキサス州プレイノ）から市販されている。
本発明で有用な放射性核種には、鉛（Ｐｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、又はイットリウム（Ｙ）等の金属の放射性同位体が含まれ得る。
イメージング用途において特に有用な放射性核種は、ガンマ放射体である放射性核種であり得る。例えば、それらは２０３Ｐｂ又は２０５Ｂｉから選択することができる。
治療用途において特に有用な放射性核種は、アルファ又はベータ放射体である放射性核種である。例えば、それらは、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２２７Ｔｈ、２２３Ｒａから選択することができる。
いくつかの実施態様では、ＤＯＴＡＭ（又はその塩若しくは機能的バリアント）は、上記のＰｂ又はＢｉ放射性同位体の１つ等のＰｂ又はＢｉでキレート化されていることが好ましい場合がある。他の実施態様では、ＤＯＴＡ（又はその塩若しくは機能的バリアント）が、上に列挙したＬｕ又はＹの放射性同位体のうちの１つ等のＬｕ又はＹとキレート化されることが好ましい場合がある。
いくつかの実施態様では、方法及び使用は、放射性同位体、例えば治療に適した放射性同位体とイメージングに適した放射性同位体との混合物を利用する、治療及びイメージングの組み合わせ方法を含み得る。例えば、これらは、同じキレート剤によってキレート化された同じ金属の異なる放射性同位体であり得る。一実施態様では、本方法は、２０３Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ及び２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを混合物として投与することを含み得る。別の実施態様では、本方法は、２０３Ｐｂ又は２０５Ｂｉ等のガンマ放射体を使用する線量測定の第１のサイクルと、それに続く２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２２７Ｔｈ又は２２３Ｒａ等のアルファ又はベータ放射体を使用する１回以上の処置とを含み得る。そのような方法は、以下でさらに説明される。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体の会合によって形成された機能的結合部位は、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭキレートに結合し得る。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体の会合によって形成された機能的結合部位は、放射性標識化合物に特異的に結合し得る。いくつかの実施態様では、機能的結合部位は、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ及び／又は標的に対する解離定数（ＫＤ）が１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下又は０．００１ｎＭ以下（例えば１０－７Ｍ以下、例えば１０－７～１０－１３、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）で、放射性標識化合物、例えばＰｂ－ＤＯＴＡＭキレートに結合し得る。いくつかの実施態様では、機能的結合部位は、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ又はそれ未満、例えば、０．９ｐＭ又はそれ未満、０．８ｐＭ又はそれ未満、０．７ｐＭ又はそれ未満、０．６ｐＭ又はそれ未満又は０．５ｐＭ又はそれ未満の結合親和性のＫＤ値で結合することが好ましい場合がある。例えば、機能的結合部位は、約１ｐＭ～１ｎＭ、例えば、約１～１０ｐＭ、１～１００ｐＭ、５～５０ｐＭ、１００～５００ｐＭ又は５００ｐＭ～１ｎＭのＫＤで金属キレートに結合し得る。
Ｄ．ＤＯＴＡに対する例示的な抗原結合部位
本発明の特定の一実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体が会合して、ＤＯＴＡ（又はその機能的誘導体若しくはバリアント）、例えばＬｕ又はＹとキレート化されたＤＯＴＡ（例えば、１７７Ｌｕ又は９０Ｙ）に対する機能的結合部位を形成する。例えば、機能的結合部位は、約１ｐＭ～１ｎＭ、例えば約１～１０ｐＭ、１～１００ｐＭ、５～５０ｐＭ、１００～５００ｐＭ又は５００ｐＭ～１ｎＭのＫｄで放射性標識化合物に結合し得る。
Ｃ８２５は、１７７Ｌｕ及び９０Ｙ等の放射性金属と複合体を形成したＤＯＴＡ－Ｂｎ（Ｓ－２－（４－アミノベンジル）－１，４，７，１０テトラアザシクロドデカン四酢酸）に対して高い親和性を有する既知のｓｃＦｖである（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅａｌ ｅｔ ａｌ ２０１８，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２０１８、及び国際公開第２０１００９９５３６号を参照されたい）。Ｃ８２５のＣＤＲ配列並びにＶＬ及びＶＨ配列は、本明細書に提供される。一実施態様では、放射性標識化合物に対する抗原結合部位の一部を形成する重鎖可変領域は、（ａ）３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、２つ、又は３つ全てのＣＤＲを含み得る。代替的な実施態様では、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＨ（配列番号１４８）を有し得る。放射性標識化合物に対する結合部位の一部を形成する軽鎖可変領域は、（ｄ）３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ又は３つ全てのＣＤＲを含み得る。
別の実施態様では、放射性標識化合物に対する機能的抗原結合部位の一部を形成する重鎖可変ドメイン（第１の抗体上の）は、配列番号４１、又は配列番号４１に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、そのバリアントのアミノ酸配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む結合部位は、好ましくは本明細書に記載される親和性でＬｕ又はＹと複合体化したＤＯＴＡに結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号４１において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、抗体は、配列番号４１のＶＨ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列又は配列ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＨ（配列番号１４８）を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
任意選択で、放射性標識化合物に対する機能的抗原結合部位の一部を形成する軽鎖可変ドメイン（第２の抗体上の）は、配列番号４２、又は配列番号４２に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、そのバリアントのアミノ酸配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む結合部位は、好ましくは本明細書に記載される親和性でＬｕ又はＹと複合体化したＤＯＴＡに結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号４２において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。任意選択で、抗体は、配列番号４２のＶＬ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に関する実施態様は、組み合わせて明示的に企図される。したがって、機能的抗原結合部位は、それぞれ第１の抗体及び第２の抗体上の上記に定義される重鎖可変領域及び上記に定義される軽鎖可変領域から形成され得る。
上記の実施態様のいずれかにおいて、ＤＯＴＡ複合体に対する結合部位を形成する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、ヒト化されていてもよい。一実施態様では、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、上記の実施態様のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
いくつかの実施態様では、重鎖可変ドメインは、以下でさらに論じられるように、１つ以上のＣ末端アラニン残基などの１つ以上のＣ末端残基、又はＣＨ１ドメインのＮ末端からの１つ以上の残基によって延長され得る。
Ｅ．ＤＯＴＡＭに対する例示的な抗原結合部位
本発明の別の特定の実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は会合して、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭキレート（Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ）に対する機能的抗原結合部位を形成する。例示的な抗原結合部位は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／２０１９５９号に記載されている。
特定の実施態様では、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに結合する機能的抗原結合部位は、以下のうちの１つ又は複数の特性を有し得る。
・ Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ及びＢｉ－ＤＯＴＡＭに特異的に結合する；
・ Ｃｕ－ＤＯＴＡＭ等の他のキレート化金属と比較して、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ（及び任意選択でＢｉ－ＤＯＴＡＭ）に対して選択的である；
・ 非常に高い親和性でＰｂ－ＤＯＴＡＭに結合する；
・ 国際公開第２０１９／２０１９５９号に記載されている抗体（例えばＰＲＩＴ－０２１３又はＰＲＩＴ－０２１４）と同じＰｂ－ＤＯＴＡＭ上のエピトープに結合する、及び／又は当該抗体と同じ接触残基を有する。
Ｐｂの放射性同位体は、診断及び治療の方法において有用である。本発明で使用され得る鉛の特定の放射性同位体としては、２１２Ｐｂ及び２０３Ｐｂが挙げられる。
α粒子放射体である放射性核種は、短い経路長と高い線エネルギー移動の組み合わせのために、β放射体よりも周囲組織への損傷が少なく、より特異的な腫瘍細胞殺傷の可能性を有する。２１２Ｂｉはα粒子放射体であるが、その短い半減期がその直接使用を妨げる。２１２Ｐｂは２１２Ｂｉの親放射性核種であり、２１２Ｂｉのｉｎ ｖｉｖｏ発生剤として機能することができ、それによって２１２Ｂｉの短い半減期を効果的に克服する（Ｙｏｎｇ ａｎｄ Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ，Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．２００１ Ｊｕｎｅ ２１；４０（２３）６０６８－６０７６）。
２０３Ｐｂはイメージング同位体として有用である。したがって、２０３Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに結合した抗体は、放射性免疫イメージング（ＲＩＩ）に有用であり得る。
一般に、放射性金属はキレート化形態で使用される。本発明の特定の態様では、ＤＯＴＡＭがキレート化剤として使用される。ＤＯＴＡＭはＰｂ（ＩＩ）の安定なキレート剤である（Ｙｏｎｇ ａｎｄ Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ，Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．２００１ Ｊｕｎｅ ２１；４０（２３）６０６８－６０７６；Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．９３－１００，２０００）。したがって、ＤＯＴＡＭは、２１２Ｐｂ及び２０３Ｐｂ等の上述の鉛の同位体と併せて特に有用である。
いくつかの実施態様では、抗体は、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ以下、例えば、０．９ｐＭ以下、０．８ｐＭ以下、０．７ｐＭ以下、０．６ｐＭ以下又は０．５ｐＭ以下の結合親和性のＫｄ値でＰｂ－ＤＯＴＡＭに結合することが好ましい場合がある。例えば、機能的結合部位は、約１ｐＭ～１ｎＭ、例えば約１～１０ｐＭ、１～１００ｐＭ、５～５０ｐＭ、１００～５００ｐＭ又は５００ｐＭ～１ｎＭのＫｄで放射性標識化合物に結合し得る。
特定の実施態様では、抗体は、ＤＯＴＡＭによってキレート化されたＢｉにさらに結合する。いくつかの実施態様では、抗体は、１ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ又はそれ未満、例えば９ｐＭ、８ｐＭ、７ｐＭ、６ｐＭ、５ｐＭ又はそれ未満の結合親和性のＫｄ値でＢｉ－ＤＯＴＡＭ（すなわち、本明細書では「Ｂｉ－ＤＯＴＡＭキレート」とも呼ばれる、ビスマスと錯体形成したＤＯＴＡＭを含むキレート）に結合することが好ましい場合がある。例えば、機能的結合部位は、約１ｐＭ～１ｎＭ、例えば約１～１０ｐＭ、１～１００ｐＭ、５～５０ｐＭ、１００～５００ｐＭ又は５００ｐＭ～１ｎＭのＫｄで金属キレートに結合し得る。
いくつかの実施態様では、抗体は、Ｂｉ－ＤＯＴＡＭ及びＰｂ－ＤＯＴＡＭに同様の親和性で結合し得る。例えば、Ｂｉ－ＤＯＴＡＭ／Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する親和性の比、例えばＫｄ値の比は、０．１～１０、例えば１～１０の範囲内であることが好ましい場合がある。
一実施態様では、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する抗原結合部位の一部を形成する重鎖可変領域は、（ａ）ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、２つ、又は３つ全てのＣＤＲを含み得る。Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する結合部位の一部を形成する軽鎖可変領域は、（ｄ）ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ又は３つ全てのＣＤＲを含み得る。
いくつかの実施態様では、抗体は、それぞれ、配列番号１～６のアミノ酸配列と比較して、置換、例えば、１、２又は３つの置換を有する、１つ以上のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及び／若しくはＣＤＲ－Ｈ３、又は１つ以上のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及び／若しくはＣＤＲ－Ｌ３を含み得る。
いくつかの実施態様では、抗体は、本明細書に記載のものと同じ接触残基を共有し得、例えば、これらの残基は不変であり得る。これらの残基は、以下を含み得る：
ａ）重鎖ＣＤＲ２：Ｐｈｅ５０、Ａｓｐ５６及び／又はＴｙｒ５８、また任意選択でＧｌｙ５２及び／又はＡｒｇ５４；
ｂ）重鎖ＣＤＲ３：Ｇｌｕ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｐｒｏ９８、Ｔｙｒ９９、Ａｌａ１００Ｃ及び／又はＴｙｒ１００Ｄ、また任意選択でＰｒｏ１００Ｅ；
ｃ）軽鎖ＣＤＲ１：Ｔｙｒ２８及び／又はＡｓｐ３２；
ｄ）軽鎖ＣＤＲ３：Ｇｌｙ９１、Ｔｙｒ９２、Ａｓｐ９３、Ｔｈｒ９５ｃ及び／又はＴｙｒ９６；
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２：任意選択でＧｌｎ５０；
これらは全てＫａｂａｔに従って番号付けされる。
例えば、いくつかの実施態様では、ＣＤＲ－Ｈ２は、アミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２）、又は配列番号２において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み得、これらの置換は、Ｐｈｅ５０、Ａｓｐ５６及び／又はＴｙｒ５８を含まず、任意選択で、Ｇｌｙ５２及び／又はＡｒｇ５４も含まず、これらは全てＫａｂａｔに従って番号付けされる。
いくつかの実施態様では、ＣＤＲ－Ｈ２は、以下に示すように１つ又は複数の位置で置換され得る。ここで、及び以下の置換表において、置換は、生殖系列残基（下線）に基づくか、又は理論的に立体的に適合し、その部位の結晶化レパートリーにも生じるアミノ酸によるものである。いくつかの実施態様では、上記の残基は固定されていてもよく、他の残基は以下の表に従って置換されていてもよい：他の実施態様では、任意の残基の置換は以下の表に従って行われてもよい。
Figure 2024504931000005
任意選択で、ＣＤＲ－Ｈ３は、アミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）、又は配列番号３において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み得、これらの置換はＧｌｕ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｐｒｏ９８を含まず、任意選択で、Ａｌａ１００Ｃ、Ｔｙｒ１００Ｄ、及び／又はＰｒｏ１００Ｅも含まず、且つ／又は任意選択で、Ｔｙｒ９９も含まない。例えば、いくつかの実施態様では、置換はＧｌｕ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｐｒｏ９８、Ｔｙｒ９９、Ａｌａ１００Ｃ及びＴｙｒ１００Ｄを含まない。
特定の実施態様では、ＣＤＲ－Ｈ３は、以下に示されるように、１つ又は複数の位置で置換され得る。いくつかの実施態様では、上記の残基は固定されていてもよく、他の残基は以下の表に従って置換されていてもよい：他の実施態様では、任意の残基の置換は以下の表に従って行われてもよい。
Figure 2024504931000006
任意選択で、ＣＤＲ－Ｌ１は、アミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）、又は配列番号４において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み得、これらの置換はＴｙｒ２８及び／又はＡｓｐ３２を含まない（Ｋａｂａｔ番号付け）。
特定の実施態様では、ＣＤＲ－Ｌ１は、以下に示されるように、１つ又は複数の位置で置換され得る。また、いくつかの実施態様では、上記の残基は固定されていてもよく、他の残基は以下の表に従って置換されていてもよい：他の実施態様では、任意の残基の置換は以下の表に従って行われてもよい。
Figure 2024504931000007
任意選択で、ＣＤＲ－Ｌ３は、アミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）、又は配列番号６において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み得、これらの置換は、Ｇｌｙ９１、Ｔｙｒ９２、Ａｓｐ９３、Ｔｈｒ９５ｃ及び／又はＴｙｒ９６（Ｋａｂａｔ）を含まない。
特定の実施態様では、ＣＤＲ－Ｌ３は、以下に示されるように、以下の位置で置換され得る。（ほとんどの残基は溶媒にさらされており、抗原と接触していないため、多くの置換が考えられる）。また、いくつかの実施態様では、上記の残基は固定されていてもよく、他の残基は以下の表に従って置換されていてもよい：他の実施態様では、任意の残基の置換は以下の表に従って行われてもよい。
Figure 2024504931000008
抗体は、任意選択で、配列番号１又は配列番号５のそれぞれの配列、又はこれらに対して、少なくとも１つ、２つ、若しくは３つの置換、任意選択で、保存的置換を有する、これらのバリアントを有する、ＣＤＲ－Ｈ１又はＣＤＲ－Ｌ２をさらに含み得る。
したがって、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する抗原結合部位の一部を形成する重鎖可変ドメインは、少なくとも：
ａ）アミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２）、又は配列番号２において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み、これらの置換は、Ｐｈｅ５０、Ａｓｐ５６及び／又はＴｙｒ５８を含まず、任意選択で、Ｇｌｙ５２及び／又はＡｒｇ５４も含まない、重鎖ＣＤＲ２；
ｂ）アミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）、又は配列番号３において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み、これらの置換は、Ｇｌｕ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｐｒｏ９８を含まず、任意選択で、Ａｌａ１００Ｃ、Ｔｙｒ１００Ｄ、及び／若しくはＰｒｏ１００Ｅも含まず、且つ／又は、任意選択で、Ｔｙｒ９９も含まない、重鎖ＣＤＲ３
を含み得る。
いくつかの実施態様では、重鎖可変ドメインは、任意選択で、
ｃ）アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）、又は配列番号１において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ１
である重鎖ＣＤＲ１をさらに含む。
別の実施態様では、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する抗原結合部位の一部を形成する軽鎖可変ドメインは、少なくとも：
ｄ）アミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）、又は配列番号４において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み、これらの置換はＴｙｒ２８及び／又はＡｓｐ３２を含まない、軽鎖ＣＤＲ１；
ｅ）アミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）、又は配列番号６において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み、これらの置換はＧｌｙ９１、Ｔｙｒ９２、Ａｓｐ９３、Ｔｈｒ９５ｃ及びＴｙｒ９６を含まない、軽鎖ＣＤＲ３
を含む。
いくつかの実施態様では、軽鎖可変ドメインは、任意選択で、
ｆ）アミノ酸配列ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）、又は配列番号５において少なくとも１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み、任意選択で、Ｇｌｎ５０を含まない、軽鎖ＣＤＲ２
である軽鎖ＣＤＲ２をさらに含む。
上記のＣＤＲを含む配列の（例えば、可変ドメインの）バリアントを含む本発明の任意の実施態様では、タンパク質は、上記のＣＤＲ残基の１つ又は複数において不変であり得る。
任意選択で、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する機能的抗原結合部位（第１の抗体上の）の一部を形成する重鎖可変ドメインは、配列番号７及び配列番号９、又は配列番号７又は配列番号９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそれらのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む結合部位は、好ましくは本明細書に記載される親和性でＰｂ－ＤＯＴＡＭに結合する能力を保持する。ＶＨ配列は、上記のように不変残基を保持してもよい。特定の実施態様では、配列番号７又は配列番号９において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、抗体は、配列番号７又は配列番号９のＶＨ配列であって、これらの配列の翻訳後修飾を含むＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
任意選択で、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する機能的抗原結合部位（第２の抗体上の）の一部を形成する軽鎖可変ドメインは、配列番号８、又は配列番号８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントのアミノ酸配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ結合部位は、好ましくは本明細書に記載される親和性でＰｂ－ＤＯＴＡＭに結合する能力を保持する。ＶＬ配列は、上記のように不変残基を保持してもよい。特定の実施態様では、配列番号８において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。任意選択で、抗Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ抗体は、配列番号８のＶＨ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に関する実施態様は、組み合わせて明示的に企図される。したがって、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する機能的抗原結合部位は、それぞれ第１の抗体及び第２の抗体上の上記に定義される重鎖可変領域及び上記に定義される軽鎖可変領域から形成され得る。
任意選択で、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭキレートに対する特異的抗原結合部位は、配列番号７も若しくは配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列又は上記で定義したそのバリアントを含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号８のアミノ酸配列又は上記で定義したそのバリアントを含む軽鎖可変ドメインから形成され得る。例えば、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭキレートに対する特異的抗原結合部位は、配列番号７のアミノ酸配列又はそのバリアントを含む重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列又はそのバリアントを含む軽鎖可変ドメインとを含み得、これらの配列の翻訳後修飾を含む。別の実施態様では、それは配列番号９のアミノ酸配列又はそのバリアントを含む重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列又はそのバリアントを含む軽鎖可変ドメインとを含み得、これらの配列の翻訳後修飾を含む。
上記の実施態様のいずれかにおいて、抗Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ結合部位を形成する軽鎖及び重鎖の可変領域はヒト化されていてもよい。一実施態様では、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、上記の実施態様のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。別の実施態様では、軽鎖及び／又は重鎖可変領域は、上記の実施態様のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、さらに、ｖｋ１３９及び／又はｖｈ２２６に由来するフレームワーク領域を含む。ｖｋ１３９については、いくつかの実施態様では、逆突然変異が存在しない可能性がある。ｖｈ２２６については、生殖系列Ａｌａ４９残基がＧｌｙ４９に逆突然変異する可能性がある。
Ｆ．ＣＥＡに対する例示的な抗原結合部位
上述の実施態様と組み合わせることができる本発明の別の特定の実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体によって結合される標的抗原は、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）であり得る。ＣＥＡに対して惹起されている抗体は、Ｔ８４．６６、並びに国際公開第２０１６／０７５２７８号（Ａ１）及び／又は国際公開第２０１７／０５５３８９号において記載されている、Ｔ８４．６６－ＬＣＨＡなど、そのヒト化形及びキメラ形、国際公開第２０１２／１１７００２号及び国際公開第２０１４／１３１７１２号において記載されている抗ＣＥＡ抗体である、ＣＨ１Ａ１ａ、並びにＣＥＡ ｈＭＮ－１４又はラベツズマブ（例えば、米国特許第６６７６９２４号及び米国特許第５８７４５４０号において記載されている）を含む。ＣＥＡに対する、別の例示的抗体は、Ａ５Ｂ７（例えば、Ｍ．Ｊ．Ｂａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９９７，２９（２），１６１－１７１において記載されている）、又は国際公開第９２／０１０５９号及び国際公開第２００７／０７１４２２号において記載されているマウスＡ５Ｂ７に由来するヒト化抗体である。また、同時係属出願である、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６７５８２も参照されたい。Ａ５Ｂ７のヒト化型の例は、Ａ５Ｈ１ＥＬ１（Ｇ５４Ａ）である。ＣＥＡに対する、さらなる例示的抗体は、米国特許第７６２６０１１号及び／又は同時係属出願である、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６７５８２において記載されているＭＦＥ２３、及びそのヒト化形である。抗ＣＥＡ抗体の、なおさらなる例は、２８Ａ９である。これらの抗体、又はこれらの抗原結合断片のうちのいずれかは、本発明におけるＣＥＡ結合部分を形成するのに使用され得る。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、一価結合について１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、又は１００ｐＭ以下のＫｄ値で結合し得る。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体は、ＣＥＡのＣＨ１Ａ１ａエピトープ、Ａ５Ｂ７エピトープ、ＭＦＥ２３エピトープ、Ｔ８４．６６エピトープ、又は２８Ａ９エピトープに結合し得る。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体の少なくとも１つは、可溶性ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）上に存在しないＣＥＡエピトープに結合する。可溶性ＣＥＡは、ＧＰＩホスホリパーゼによって切断されて血液中に放出されるＣＥＡ分子の一部である。可溶性ＣＥＡには見出されないエピトープの例は、ＣＨ１Ａ１Ａエピトープである。任意選択で、第１の抗体及び／又は第２の抗体の一方は可溶性ＣＥＡ上に存在しないエピトープに結合し、他方は可溶性ＣＥＡ上に存在するエピトープに結合する。
ＣＨ１Ａ１ａ及びその親マウス抗体ＰＲ１Ａ３に対するエピトープは、国際公開第２０１２／１１７００２号（Ａ１）及びＤｕｒｂｉｎ Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４３１３－４３１７，１９９４に記載されている。ＣＨ１Ａ１ａエピトープに結合する抗体は、ＣＥＡ分子のＢ３ドメイン内及びＧＰＩアンカー内の立体構造エピトープに結合する。一態様では、抗体は、本明細書における配列番号２５のＶＨ及び配列番号２６のＶＬを有するＣＨ１Ａ１ａ抗体と同じエピトープに結合する。Ａ５Ｂ７エピトープについては、同時係属出願である、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６７５８２において記載されている。Ａ５Ｂ７エピトープに結合する抗体は、ＣＥＡのＡ２ドメイン、すなわち、配列番号１４１：
ＰＫＰＦＩＴＳＮＮＳＮＰＶＥＤＥＤＡＶＡＬＴＣＥＰＥＩＱＮＴＴＹＬＷＷＶＮＮＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＤＮＲＴＬＴＬＬＳＶＴＲＮＤＶＧＰＹＥＣＧＩＱＮＫＬＳＶＤＨＳＤＰＶＩＬＮ（配列番号１４１）
のアミノ酸を含むドメインに結合する。
一態様では、抗体は、本明細書における配列番号４９のＶＨ及び配列番号５０のＶＬを有するＡ５Ｂ７抗体と同じエピトープに結合する。
一態様では、抗体は、国際公開第２０１６／０７５２７８号において記載されているＴ８４．６６と同じエピトープに結合する。抗体は、本明細書における配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬを有する抗体と同じエピトープに結合し得る。
ＭＦＥ２３エピトープについては、同時係属出願である、ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６７５８２において記載されている。ＭＦＥ２３エピトープに結合する抗体は、ＣＥＡのＡ１ドメイン、すなわち、配列番号１４２：
ＰＫＰＳＩＳＳＮＮＳＫＰＶＥＤＫＤＡＶＡＦＴＣＥＰＥＴＱＤＡＴＹＬＷＷＶＮＮＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＧＮＲＴＬＴＬＦＮＶＴＲＮＤＴＡＳＹＫＣＥＴＱＮＰＶＳＡＲＲＳＤＳＶＩＬＮ（配列番号１４２）
のアミノ酸を含むドメインに結合する。
一態様では、抗体は、本明細書における配列番号１２７のＶＨドメイン及び配列番号１２８のＶＬドメインを有する抗体と同じエピトープに結合し得る。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体は、本明細書で提示される抗体、例えば、Ｐ１ＡＤ８７４９、Ｐ１ＡＤ８５９２、Ｐ１ＡＥ４９５６、Ｐ１ＡＥ４９５７、Ｐ１ＡＦ０７０９、Ｐ１ＡＦ０２９８、Ｐ１ＡＦ０７１０、又はＰ１ＡＦ０７１１と同じＣＥＡエピトープに結合し得る。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は、ＣＥＡの、互いと同じエピトープに結合する。したがって、例えば、第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、ＣＨ１Ａ１ａエピトープ、Ａ５Ｂ７エピトープ、ＭＦＥ２３エピトープ、Ｔ８４．６６エピトープ、又は２８Ａ９エピトープに結合し得る。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、ＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得；又は第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、Ａ５Ｂ７若しくはそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、Ｔ８４．６６若しくはそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、ＭＦＥ２３若しくはそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、２８Ａ９若しくはそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得る。例示的配列は、本明細書で開示される。
他の実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は、ＣＥＡの異なるエピトープに結合する。したがって、例えば、ｉ）一方の抗体は、ＣＨ１Ａ１Ａエピトープに結合し得、他方の抗体は、Ａ５Ｂ７エピトープ、Ｔ８４．６６エピトープ、ＭＦＥ２３エピトープ、又は２８Ａ９エピトープ結合し得；ｉｉ）一方の抗体は、Ａ５Ｂ７エピトープに結合し得、他方の抗体は、ＣＨ１Ａ１Ａエピトープ、Ｔ８４．６６エピトープ、ＭＦＥ２３エピトープ、又は２８Ａ９エピトープ結合し得；ｉｉｉ）一方の抗体は、ＭＦＥ２３エピトープに結合し得、他方の抗体は、ＣＨ１Ａ１Ａエピトープ、Ａ５Ｂ７エピトープ、Ｔ８４．６６エピトープ、又は２８Ａ９エピトープ結合し得；ｉｖ）一方の抗体は、Ｔ８４．６６エピトープに結合し得、他方の抗体は、ＣＨ１Ａ１Ａエピトープ、Ａ５Ｂ７エピトープ、ＭＦＥ２３エピトープ、又は２８Ａ９エピトープ結合し得；ｖ）一方の抗体は、２８Ａ９エピトープに結合し得、他方の抗体は、ＣＨ１Ａ１ａエピトープ、Ａ５Ｂ７エピトープ、ＭＦＥ２３エピトープ、又はＴ８４．６６エピトープに結合し得る。
いくつかの実施態様では、ｉ）一方の抗体は、ＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得、他方は、Ａ５Ｂ７若しくはそのヒト化型、Ｔ８４．６６若しくはそのヒト化型、ＭＦＥ２３若しくはそのヒト化型、又は２８Ａ９若しくはそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；ｉｉ）一方の抗体は、Ａ５Ｂ７又はそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得、他方は、ＣＨ１Ａ１Ａ、Ｔ８４．６６若しくはそのヒト化型、ＭＦＥ２３若しくはそのヒト化型、又は２８Ａ９若しくはそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；ｉｉｉ）一方の抗体は、ＭＦＥ２３又はそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得、他方は、ＣＨ１Ａ１Ａ、Ａ５Ｂ７若しくはそのヒト化型、Ｔ８４．６６若しくはそのヒト化型、又は２８Ａ９若しくはそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；ｉｖ）一方の抗体は、Ｔ８４．６６又はそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得、他方は、ＣＨ１Ａ１Ａ、Ａ５Ｂ７若しくはそのヒト化型、ＭＦＥ２３若しくはそのヒト化型、又は２８Ａ９若しくはそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；ｖ）一方の抗体は、２８Ａ９又はそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得、他方は、ＣＨ１Ａ１Ａ、Ａ５Ｂ７若しくはそのヒト化型、Ｔ８４．６６若しくはそのヒト化型、又はＭＦＥ２３若しくはそのヒト化型に由来するＣＥＡ結合配列を有し得る。
１つの特定の実施態様では、一方の抗体は、ＣＨ１Ａ１Ａエピトープに結合し得、他方は、Ａ５Ｂ７エピトープに結合し得る。第１の抗体は、抗体であるＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列を有し得、第２の抗体は、Ａ５Ｂ７（そのヒト化型を含む）に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体は、抗体であるＡ５Ｂ７（そのヒト化型を含む）に由来するＣＥＡ結合配列を有し得、第２の抗体は、ＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列を有し得る。
別の特定の実施態様では、一方の抗体は、ＣＨ１Ａ１Ａエピトープに結合し得、他方は、Ｔ８４．６６エピトープに結合し得る。第１の抗体は、抗体であるＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列を有し得、第２の抗体は、Ｔ８４．６６（そのヒト化型を含む）に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体は、抗体であるＴ８４．６６（そのヒト化型を含む）に由来するＣＥＡ結合配列を有し得、第２の抗体は、ＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列を有し得る。いくつかの実施態様では、第１の抗体は、Ｔ８４．６６エピトープに結合し得、且つ／又は下記の（ｉ）に記載された抗原結合部位を有し得、第２の抗体は、ＣＨ１Ａ１Ａエピトープに結合し得、且つ／又は下記の（ｉｉ）に記載された抗原結合部位を有し得る。
例示的ＣＥＡ結合配列であるｉ）～ｖ）は、下記に開示される。これらは、ｉ）Ｔ８４．６６、ｉｉ）ＣＨ１Ａ１Ａ、ｉｉｉ）Ａ５Ｂ７、ｉｖ）２８Ａ９、及びｖ）ＭＦＥ２３（又はそのヒト化型に由来する）に由来するＣＥＡ結合配列の例を提示する。
ｉ）．一実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含み得る。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含み得る。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含む。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１３から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。
上記の実施態様のうちのいずれかでは、多重特異性抗体は、ヒト化され得る。一実施態様では、抗ＣＥＡ抗原結合部位は、上記の実施態様のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク、又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＣＥＡに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号１７において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号１７のＶＨ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＣＥＡに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号１８において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、ＣＥＡに対する抗原結合部位は、配列番号１８のＶＬ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＬ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＨ、及び上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＬを含む。一実施態様では、抗体は、配列番号１７及び配列番号１８のそれぞれにおける、ＶＨ配列及びＶＬ配列であって、これらの配列の翻訳後修飾を含む、ＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。
ｉｉ）．さらなる特定の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含み得る。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含み得る。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含む。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２１から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。
上記の実施態様のうちのいずれかでは、多重特異性抗体は、ヒト化され得る。一実施態様では、抗ＣＥＡ抗原結合部位は、上記の実施態様のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク、又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＣＥＡに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号２５において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号２５のＶＨ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＣＥＡに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号２６において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、ＣＥＡに対する抗原結合部位は、配列番号２６のＶＬ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＬ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＨ、及び上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＬを含む。一実施態様では、抗体は、配列番号２５及び配列番号２６のそれぞれにおける、ＶＨ配列及びＶＬ配列であって、これらの配列の翻訳後修飾を含む、ＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。
ｉｉｉ）さらなる特定の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含み得る。いくつかの実施態様では、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＮ（配列番号１５１）を有し得る。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含み得る。いくつかの実施態様では、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＮ（配列番号１５１）を有し得る。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含む。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）（ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４５から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの実施態様では、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＮ（配列番号１５１）を有し得る。
別の態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。いくつかの実施態様では、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＮ（配列番号１５１）を有し得る。
上記の実施態様のうちのいずれかでは、多重特異性抗体は、ヒト化され得る。一実施態様では、抗ＣＥＡ抗原結合部位は、上記の実施態様のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク、又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号４９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＣＥＡに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号４９において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号４９のＶＨ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列又は配列ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＮ（配列番号１５１）を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号５０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＣＥＡに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号５０において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、ＣＥＡに対する抗原結合部位は、配列番号５０のＶＬ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＬ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＨ、及び上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＬを含む。一実施態様では、抗体は、配列番号４９及び配列番号５０のそれぞれにおける、ＶＨ配列及びＶＬ配列であって、これらの配列の翻訳後修飾を含む、ＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。
ｉｖ）なおさらなる特定の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含み得る。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含み得る。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含む。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）（ｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６１から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。
上記の実施態様のうちのいずれかでは、多重特異性抗体は、ヒト化され得る。一実施態様では、抗ＣＥＡ抗原結合部位は、上記の実施態様のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク、又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＣＥＡに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号６５において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号６５のＶＨ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＣＥＡに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号６６において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、ＣＥＡに対する抗原結合部位は、配列番号６６のＶＬ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＬ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＨ、及び上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＬを含む。一実施態様では、抗体は、配列番号６５及び配列番号６６のそれぞれにおける、ＶＨ配列及びＶＬ配列であって、これらの配列の翻訳後修飾を含む、ＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。
ｖ）．なおさらなる特定の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１１７若しくは１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１２０、１２１若しくは１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１２３、１２４若しくは１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含み得る。
任意選択で、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、
（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１１７、若しくは１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３である、ＶＨ ＣＤＲ配列；並びに／又は
（ａ）配列番号１２０、１２１、若しくは１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１２３、１２４、若しくは１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３である、ＶＬ ＣＤＲ配列
を含み得る。
一実施態様では、ＣＥＡに対する抗原結合部位は、配列番号１２７のアミノ酸配列を含むか、又は（より好ましくは）配列番号１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、若しくは１３４から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１２８のアミノ酸配列を含むか、又は（より好ましくは）配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、若しくは１４０から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
上記の実施態様のうちのいずれかでは、多重特異性抗体は、ヒト化され得る。一実施態様では、抗ＣＥＡ抗原結合部位は、上記の実施態様のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク、又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
特定の態様では、ＣＥＡに結合することが可能な抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｃ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｄ）配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｅ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｆ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
（ｇ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、上記のａ）～ｇ）で言及されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＣＥＡに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。ある特定の実施態様では、合計１～１０個のアミノ酸が、置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、上記のａ）～ｇ）で言及されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＣＥＡに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。ある特定の実施態様では、合計１～１０個のアミノ酸が、置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。
別の実施態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＨ、及び上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＬを含む。
Ｇ．ＧＰＲＣ５Ｄ又はＦＡＰに対する例示的な抗原結合部位
上記で論じられた実施態様（例えば、ＤＯＴＡ又はＤＯＴＡＭに対する結合部位）と組み合わされ得る、本発明の別の特定の実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体が結合する標的抗原は、ＧＰＲＣ５Ｄ又はＦＡＰであり得る。
任意選択で、ＧＰＲＣ５Ｄ又はＦＡＰに結合する抗原結合部位は、一価結合について１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、又は１００ｐＭ以下のＫｄ値で結合し得る。
下記では、例示的ＧＰＲＣ５Ｄ結合配列について記載される。
一実施態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含み得る。
任意選択で、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含み得る。
任意選択で、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含む。
任意選択で、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位は、（ａ）（ｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６９から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。
上記の実施態様のうちのいずれかでは、多重特異性抗体は、ヒト化され得る。一実施態様では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位は、上記の実施態様のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク、又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
別の実施態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位は、配列番号７３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＧＰＲＣ５Ｄに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号７３において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位は、配列番号７３のＶＨ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
別の実施態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位は、配列番号７４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＧＰＲＣ５Ｄに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号７４において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合部位は、配列番号７４のＶＬ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＬ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
別の実施態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位は、上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＨ、及び上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＬを含む。一実施態様では、抗体は、配列番号７３及び配列番号７４のそれぞれにおける、ＶＨ配列及びＶＬ配列であって、これらの配列の翻訳後修飾を含む、ＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。
下記では、例示的ＦＡＰ結合配列について記載される。
一実施態様では、ＦＡＰに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含み得る。
任意選択で、ＦＡＰに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含み得る。
任意選択で、ＦＡＰに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含む。
任意選択で、ＦＡＰに結合する抗原結合部位は、（ａ）（ｉ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７７から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様では、ＦＡＰに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。
上記の実施態様のうちのいずれかでは、多重特異性抗体は、ヒト化され得る。一実施態様では、抗ＦＡＰ抗原結合部位は、上記の実施態様のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク、又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
別の実施態様では、ＦＡＰに結合する抗原結合部位は、配列番号８１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＦＡＰに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号８１において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、ＦＡＰに結合する抗原結合部位は、配列番号８１のＶＨ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
別の実施態様では、ＦＡＰに結合する抗原結合部位は、配列番号８２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、この配列を含む抗原結合部位は、ＦＡＰに、好ましくは、上記で明示された親和性で結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号８２において、合計１つ～１０のアミノ酸が、置換され、挿入され、且つ／又は欠失している。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意選択で、ＦＡＰに対する抗原結合部位は、配列番号８２のＶＬ配列であって、この配列の翻訳後修飾を含むＶＬ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
別の実施態様では、ＦＡＰに結合する抗原結合部位は、上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＨ、及び上記で提示された実施態様のうちのいずれかにおけるようなＶＬを含む。一実施態様では、抗体は、配列番号８１及び配列番号８２のそれぞれにおける、ＶＨ配列及びＶＬ配列であって、これらの配列の翻訳後修飾を含む、ＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。
Ｈ．例示的な抗体
標的抗原結合（例えば、ＣＥＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ又はＦＡＰ）に関する態様及び実施態様、並びにエフェクター部分結合（例えば、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡＭ）に関する態様及び実施態様は、組み合わせて明示的に企図される。上記の例示的な標的抗原結合部位のいずれも、上記のエフェクター部分結合部位のいずれかと組み合わせて使用され得る。
いくつかの特定の実施態様では、標的抗原結合（例えば、ＣＥＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、又はＦＡＰ）に関する態様及び実施態様と、ＤＯＴＡＭ結合に関する態様及び実施態様とが組み合わされる。いくつかの実施態様では、標的抗原がＣＥＡであることが好ましい場合がある。
いくつかの実施態様では、第１の抗体は、
ａ）Ｆａｂ断片であって、該Ｆａｂ断片が、ＣＥＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ又はＦＡＰ、任意選択でＣＥＡから選択される標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する、Ｆａｂ断片；
ｂ）Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する抗原結合部位の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、又はそれからなるポリペプチドであって、ここで、重鎖可変ドメインが配列番号１～３の重鎖ＣＤＲを含み、且つ／又は重鎖可変ドメインが、配列番号７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する、ポリペプチド；及び
ｃ）２つのサブユニットを含むＦｃドメイン
を含み得、
ここで、（ｂ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ａ）のＦａｂ断片の鎖の１つのＣ末端に融合しており、且つそのＣ末端によって（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
該第１の抗体は、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する抗原結合部位のＶＬドメインを含まない。
第２の抗体は、
ｄ）Ｆａｂ断片であって、該Ｆａｂ断片が、ＣＥＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ又はＦＡＰ、任意選択でＣＥＡから選択される標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する、Ｆａｂ断片；
ｅ）Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する抗原結合部位の抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、又はそれからなるポリペプチドであって、ここで、軽鎖可変ドメインが配列番号４～６のＣＤＲを含み、且つ／又は軽鎖可変ドメインが、配列番号８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する、ポリペプチド；及び
ｆ）２つのサブユニットを含むＦｃドメイン
を含み得、
ここで、（ｅ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ｄ）のＦａｂ断片の鎖の１つのＣ末端に融合しており、且つそのＣ末端によって（ｆ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
該第２の抗体は、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する抗原結合部位のＶＨドメインを含まない。
第１の抗体の前記ＶＨドメイン及び第２の抗体の前記ＶＬドメインは、一緒になって、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する機能的抗原結合部位を形成することができる。
特定の一実施態様では、第１の抗体及び／又は第２の抗体（例えば、第１の抗体及び第２の抗体の各々）は、ＣＥＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ又はＦＡＰ、任意選択でＣＥＡに結合する追加のＦａｂ断片を含み得る。第１の抗体における標的抗原結合Ｆａｂの各々が、互いに同じ標的抗原（例えば、いくつかの実施態様ではＣＥＡ）に結合すること、及び第２の抗体における標的抗原結合Ｆａｂの各々が、互いに同じ標的抗原（例えば、いくつかの実施態様ではＣＥＡ）（これはさらに、第１の抗体によって結合されるものと同じであってもよい）に結合することが好ましい場合がある。さらに、第１の抗体における標的抗原結合Ｆａｂの各々が標的抗原、例えばＣＥＡの同じエピトープに結合すること（すなわち、第１の抗体が標的抗原に関して単一特異性であること）、及び第２の抗体における標的抗原結合Ｆａｂの各々が、標的抗原、例えばＣＥＡの同じエピトープに結合すること（すなわち、第２の抗体が標的抗原に関して単一特異性であること）が好ましい場合がある。２つの抗体が結合するエピトープは、同じであっても異なっていてもよい。
いくつかの実施態様では、第１の抗体は以下のペプチド：
ｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する抗原結合部位のＶＨドメインであって、ここで、重鎖可変ドメインは配列番号１～３の重鎖ＣＤＲを含み、且つ／又は重鎖可変ドメインは配列番号７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する、ＶＨドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含む第１の重鎖ポリペプチド；
ｉｉ）（ｉ）のＦａｂ重鎖と対合して、ＣＥＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、又はＦＡＰ、任意選択でＣＥＡから選択される標的抗原に対する結合部位を形成するＦａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）；
ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含む第２の重鎖ポリペプチド；並びに
ｉｖ）（ｉｉｉ）のＦａｂ重鎖と対合して、ＣＥＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ又はＦＡＰ、任意選択でＣＥＡから選択される標的抗原に対する結合部位を形成するさらなるＦａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）
を含み得る。
任意選択で、（ｉ）のＦａｂ重鎖は、（ｉｉｉ）のＦａｂ重鎖と同じ配列を有し、（ｉｉ）及び（ｉｖ）のＦａｂ軽鎖は、互いに同じ配列を有する。
第２の抗体は以下のペプチド：
ｖ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する抗原結合部位のＶＬドメインであって、ここで、軽鎖可変ドメインは配列番号４～６のＣＤＲを含み、且つ／又は軽鎖可変ドメインは配列番号８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する、ＶＬドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含む第１の重鎖ポリペプチド；
ｖｉ）（ｖ）のＦａｂ重鎖と対合して、ＣＥＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、又はＦＡＰ、任意選択でＣＥＡから選択される標的抗原に対する結合部位を形成するＦａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）；
ｖｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含む第２の重鎖ポリペプチド；並びに
ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）のＦａｂ重鎖と対合して、ＣＥＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ又はＦＡＰ、任意選択でＣＥＡから選択される標的抗原に対する結合部位を形成するさらなるＦａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）
を含み得る。
任意選択で、（ｖ）のＦａｂ重鎖は、（ｖｉｉ）のＦａｂ重鎖と同じ配列を有し、（ｖｉ）及び（ｖｉｉｉ）のＦａｂ軽鎖は、互いに同じ配列を有する。任意選択で、これらも第１の抗体の場合と同じである。
特定の実施態様では、第１の抗体は、抗体ＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｉｉ）及び（ｉｖ）の２つのＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、配列番号２２～２４のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号２６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それらは、配列番号３４に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。いくつかの実施態様では、（ｉｉ）及び（ｉｖ）の２つの軽鎖が互いに同一であることが好ましい場合がある。
（ｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号１９～２１のＣＤＲを含み得、且つ／又は（ｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号２５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、（ｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖が互いに同一であることが好ましい場合がある。
別の特定の実施態様では、第１の抗体は、抗体Ａ５Ｂ７（そのヒト化型を含む）からのＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｉｉ）及び（ｉｖ）の２つのＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、配列番号４６～４８のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号５０に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それらは、配列番号５４に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。いくつかの実施態様では、（ｉｉ）及び（ｉｖ）の２つのＦａｂ軽鎖ポリペプチドが互いに同一であることが好ましい場合がある。
いくつかの実施態様では、（ｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号４３～４５のＣＤＲを含み得、且つ／又は（ｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号４９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、（ｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖が互いに同一であることが好ましい場合がある。
別の特定の実施態様では、第１の抗体は、抗体Ｔ８４．６６（そのヒト化型を含む）からのＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｉｉ）及び（ｉｖ）の２つのＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、配列番号１４～１６のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号１８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それらは、配列番号８９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号１１～１３のＣＤＲを含み得、且つ／又は（ｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号１７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、（ｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖が互いに同一であることが好ましい場合がある。
別の特定の実施態様では、第１の抗体は、抗体２８Ａ９（そのヒト化型を含む）からのＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｉｉ）及び（ｉｖ）の２つのＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、配列番号６２～６４のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号６６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それらは、配列番号９６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号５９～６１のＣＤＲを含み得、且つ／又は（ｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号６５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、（ｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖が互いに同一であることが好ましい場合がある。
いくつかの実施態様では、第２の抗体は、抗体ＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｖｉ）及び（ｖｉｉｉ）の２つのＦａｂ軽鎖は、配列番号２２～２４のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号２６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それらは、配列番号３４に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｖ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号１９～２１のＣＤＲを含み、且つ／又は（ｖ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号２５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含む。いくつかの実施態様では、（ｖ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖が互いに同一であることが好ましい場合がある。
別の特定の実施態様では、第２の抗体は、Ａ５Ｂ７（そのヒト化型を含む）からのＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｖｉ）及び（ｖｉｉｉ）の２つのＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、配列番号４６～４８のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号５０に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それらは、配列番号５８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｖ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号４３～４５のＣＤＲを含み、且つ／又は（ｖ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号４９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含む。いくつかの実施態様では、（ｖ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖が互いに同一であることが好ましい場合がある。
別の特定の実施態様では、第２の抗体は、抗体Ｔ８４．６６（そのヒト化型を含む）からのＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｖｉ）及び（ｖｉｉｉ）の２つの軽鎖ポリペプチドは、配列番号１４～１６のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号１８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それらは、配列番号８９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｖ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号１１～１３のＣＤＲを含み得、且つ／又は（ｖ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号１７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、（ｖ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖が互いに同一であることが好ましい場合がある。
別の特定の実施態様では、第２の抗体は、抗体２８Ａ９（そのヒト化型を含む）からのＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ軽鎖は、配列番号６２～６４のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号６６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それらは、配列番号９６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｖ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号５９～６１のＣＤＲを含み得、且つ／又は（ｖ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖は、配列番号６５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、（ｖ）及び（ｖｉｉ）の２つのＦａｂ重鎖が互いに同一であることが好ましい場合がある。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は、ＣＥＡの同じエピトープに結合する。したがって、例えば、第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、抗体ＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、Ａ５Ｂ７（そのヒト化型を含む）に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、Ｔ８４．６６（そのヒト化型を含む）に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、２８Ａ９（そのヒト化型を含む）に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、ＭＦＥ２３（そのヒト化型を含む）に由来するＣＥＡ結合配列を有し得る。いくつかの実施態様では、（ｖｉ）及び（ｖｉｉｉ）の２つの軽鎖ポリペプチドが、第１の抗体の（ｉｉ）及び（ｉｖ）の軽鎖と同じ配列を有すること、例えば、全ての前記軽鎖が同じ配列を有することが好ましい場合がある。
いくつかの実施態様では、（ｉｉ）及び（ｉｖ）において、第１の抗体の２つのＦａｂ軽鎖ポリペプチドは両方とも、配列番号２６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得；（ｉ）及び（ｉｉｉ）において、第１の抗体の２つのＦａｂ重鎖は両方とも、配列番号２５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含み得；（ｖｉ）及び（ｖｉｉｉ）において、第２の抗体の２つのＦａｂ軽鎖ポリペプチドは両方とも、配列番号２６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得；（ｖ）及び（ｖｉｉ）において、第２の抗体の２つのＦａｂ重鎖は両方とも、配列番号２５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含み得る。
特定の一実施態様では、第１の抗体は、
－ 配列番号１４６の第１の重鎖ポリペプチド；
－ 配列番号１４７の第２の重鎖ポリペプチド；
－ 配列番号１４３の第１及び第２の軽鎖ポリペプチド
を含み；且つ／又は
第２の抗体は、
－ 配列番号１４５の第１の重鎖ポリペプチド；
－ 配列番号１４７の第２の重鎖ポリペプチド；
－ 配列番号１４３の第１及び第２の軽鎖ポリペプチド
を含む。
他の実施態様では、上記で論じたように、第１の抗体及び第２の抗体はＣＥＡの異なるエピトープに結合する。したがって、例えば、第１の抗体は抗体ＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列を有し得、第２の抗体はＡ５Ｂ７に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は、第１の抗体は抗体Ａ５Ｂ７に由来するＣＥＡ結合配列を有し得、第２の抗体はＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列を有し得る。
他の実施態様では、抗体は１アーム抗体である。例えば、いくつかの実施態様では、第１の抗体は以下のポリペプチド：
ｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する抗原結合部位のＶＨドメインであって、ここで、重鎖可変ドメインは配列番号１～３の重鎖ＣＤＲを含み、且つ／又は重鎖可変ドメインは配列番号７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する、ＶＨドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含むポリペプチド；
ｉｉ）Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）；並びに
ｉｉｉ）Ｆｃサブユニットポリペプチド（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）
を含み；
ここで、（ｉ）のＦａｂ重鎖及び（ｉｉ）のＦａｂ軽鎖は、ＣＥＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ又はＦＡＰ、任意選択でＣＥＡから選択される標的抗原に結合することができるＦａｂ断片を形成する。
第２の抗体は以下のポリペプチド：
ｉｖ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する抗原結合部位のＶＬドメインであって、ここで、軽鎖可変ドメインは配列番号４～６のＣＤＲを含み、且つ／又は軽鎖可変ドメインは配列番号８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する、ＶＬドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含むポリペプチド；
ｖ）Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）；並びに
ｉｉｉ）Ｆｃサブユニットポリペプチド（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）
を含み得；
ここで、（ｖｉ）のＦａｂ重鎖及び（ｖ）のＦａｂ軽鎖は、ＣＥＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ又はＦＡＰ、任意選択でＣＥＡから選択される標的抗原に結合することができるＦａｂ断片を形成する。
これらの１アーム抗体のいくつかの実施態様では、（ｉ）及び（ｉｖ）のＦａｂ重鎖は、互いに同じ配列を有し得；且つ、（ｉｉ）及び（ｖ）のＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、互いに同じ配列を有し得る。
特定の実施態様では、第１の抗体は、抗体ＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｉｉ）のＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、配列番号２２～２４のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号２６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それは、配列番号３４に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
（ｉ）のＦａｂ重鎖は、配列番号１９～２１のＣＤＲを含み得、且つ／又は（ｉ）のＦａｂ重鎖は、配列番号２５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含み得る。
別の特定の実施態様では、第１の抗体は、抗体Ａ５Ｂ７（そのヒト化型を含む）からのＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｉｉ）のＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、配列番号４６～４８のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号５０に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それは、配列番号５４に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｉ）のＦａｂ重鎖は、配列番号４３～４５のＣＤＲを含み得、且つ／又は（ｉ）のＦａｂ重鎖は、配列番号４９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含み得る。
別の特定の実施態様では、第１の抗体は、抗体Ｔ８４．６６（そのヒト化型を含む）からのＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｉｉ）のＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、配列番号１４～１６のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号１８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それは、配列番号８９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｉ）のＦａｂ重鎖は、配列番号１１～１３のＣＤＲを含み得、且つ／又は（ｉ）のＦａｂ重鎖は、配列番号１７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含み得る。
別の特定の実施態様では、第１の抗体は、抗体２８Ａ９（そのヒト化型を含む）からのＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｉｉ）のＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、配列番号６２～６４のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号６６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それは、配列番号９６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｉ）のＦａｂ重鎖は、配列番号５９～６１のＣＤＲを含み得、且つ／又は（ｉ）のＦａｂ重鎖は、配列番号６５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含み得る。
いくつかの実施態様では、第２の抗体は、抗体ＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｖ）のＦａｂ軽鎖は、配列番号２２～２４のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号２６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それは、配列番号３４に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｉｖ）のＦａｂ重鎖は、配列番号１９～２１のＣＤＲを含み、且つ／又は（ｉｖ）のＦａｂ重鎖は、配列番号２５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含む。
別の特定の実施態様では、第２の抗体は、Ａ５Ｂ７（そのヒト化型を含む）からのＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｖ）のＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、配列番号４６～４８のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号５０に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それは、配列番号５８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｉｖ）のＦａｂ重鎖は、配列番号４３～４５のＣＤＲを含み、且つ／又は（ｉｖ）のＦａｂ重鎖は、配列番号４９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含む。
別の特定の実施態様では、第２の抗体は、抗体Ｔ８４．６６（そのヒト化型を含む）からのＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｖ）のＦａｂ軽鎖ポリペプチドは、配列番号１４～１６のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号１８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それは、配列番号８９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｉｖ）のＦａｂ重鎖は、配列番号１１～１３のＣＤＲを含み得、且つ／又は（ｉｖ）のＦａｂ重鎖は、配列番号１７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含み得る。
別の特定の実施態様では、第２の抗体は、抗体２８Ａ９（そのヒト化型を含む）からのＣＥＡ結合配列（すなわち、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬドメイン）を有し得る。
例えば、（ｖ）のＦａｂ軽鎖は、配列番号６２～６４のＣＤＲを含み得、且つ／又は配列番号６６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施態様では、それは、配列番号９６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し得る。
いくつかの実施態様では、（ｉｖ）のＦａｂ重鎖は、配列番号５９～６１のＣＤＲを含み得、且つ／又は（ｉｖ）のＦａｂ重鎖は、配列番号６５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含み得る。
いくつかの実施態様では、第１の抗体及び第２の抗体は、ＣＥＡの同じエピトープに結合する。したがって、例えば、第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、抗体ＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、Ａ５Ｂ７（そのヒト化型を含む）に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、Ｔ８４．６６（そのヒト化型を含む）に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、２８Ａ９（そのヒト化型を含む）に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は第１の抗体及び第２の抗体は両方とも、ＭＦＥ２３（そのヒト化型を含む）に由来するＣＥＡ結合配列を有し得る。いくつかの実施態様では、（ｉｉ）の軽鎖ポリペプチドが（ｖ）の軽鎖と同じ配列を有することが好ましい場合がある。
特定の実施態様では、（ｉｉ）及び（ｖ）のＦａｂ軽鎖は両方とも、配列番号２６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み；且つ、（ｉ）及び（ｉｖ）のＦａｂ重鎖は、配列番号２５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する可変ドメインを含む。
特定の一実施態様では、
第１の抗体は、
－ 配列番号１４６の第１の重鎖；
－ 配列番号１４４の第２の重鎖；
－ 配列番号１４３の軽鎖
を含み；且つ／又は
第２の抗体は、
－ 配列番号１４５の第１の重鎖；
－ 配列番号１４４の第２の重鎖；
－ 配列番号１４３の軽鎖
を含む。
他の実施態様では、上記で論じたように、第１の抗体及び第２の抗体はＣＥＡの異なるエピトープに結合する。したがって、例えば、第１の抗体は抗体ＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列を有し得、第２の抗体はＡ５Ｂ７に由来するＣＥＡ結合配列を有し得；又は、第１の抗体は抗体Ａ５Ｂ７に由来するＣＥＡ結合配列を有し得、第２の抗体はＣＨ１Ａ１Ａに由来するＣＥＡ結合配列を有し得る。
Ｉ．抗体バリアント
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適正な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製されてもよい。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせは、最終コンストラクトが、所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終コンストラクトに到達するように行うことができる。
置換、挿入、及び欠失バリアント
ある特定の実施態様では、１種以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換による変異導入のための目的の部位には、ＨＶＲ（ＣＤＲ）及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表１において「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化を表１に「例示的置換」の見出しの下に示し、またアミノ酸側鎖クラスに関して下にさらに記載する。アミノ酸置換が、目的の抗体に導入される場合があり、産物は、所望の活性、例えば、抗原への結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの低減若しくは排除についてスクリーニングされ得る。
Figure 2024504931000009
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することを伴うであろう。
ある種の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる研究のために選択される結果として生じるバリアント（複数可）は、親抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）の修正（例えば、改善）を有し、且つ／又は実質的に保持された親抗体の特定の生物学的特性を有する。例示的な置換バリアントは、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して、簡便に生成され得る。簡潔には、１つ又は複数のＣＤＲ残基が変異され、バリアント抗体がファージにディスプレイされ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
抗体親和性を向上させるために、例えば、ＣＤＲにおいて改変（例えば、置換）を行ってもよい。そのような改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照されたい）中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基、及び／又は抗原に接触する残基で行われてもよく、結果として生じるバリアントＶＨ又はＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリの構築及びそこからの再選択による親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの態様では、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する抗体バリアントを同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６個の残基）をランダム化する、ＣＤＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニン・スキャニング突然変異誘発又はモデル化を用いて、特異的に同定され得る。特にＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が標的とされることが多い。
特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗体の抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ又は複数のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的な変更（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）は、ＣＤＲにおいて行われてもよい。そのような改変は、例えば、ＣＤＲ中の抗原接触残基の外側であってもよい。上述の特定のバリアントＶＨ及びＶＬ配列において、各ＣＤＲは、改変されていないか、又は１つ、２つ、又は３つ以下のアミノ酸置換を有するかのいずれかである。
変異導入の標的となり得る抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５に記載されているように「アラニン・スキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）の残基又はグループを同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）で置換して、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されてもよい。代替的に、又は追加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点が特定され得る。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は排除されてもよい。バリアントは、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに１個以上のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ（抗体指向性酵素プロドラッグ治療法のための）又はポリペプチドへの抗体のＮ末端若しくはＣ末端の融合が挙げられ、これは抗体の血清半減期を増大させる。
グリコシル化バリアント
特定の態様では、本明細書において提供する抗体を変えて、抗体のグリコシル化の程度を増減させる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を変更させることにより好都合に達成され得る。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合するオリゴ糖は変更され得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作製するために行われ得る。
一態様では、非フコシル化オリゴ糖、すなわちＦｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠くオリゴ糖構造を有する抗体バリアントが提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分岐オリゴ糖構造の幹に第１のＧｌｃＮＡｃが結合したフコース残基を欠く、Ｎ結合オリゴ糖である。一態様では、内在性又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した抗体バリアントを提供する。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は場合によっては約１００％（すなわち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定した、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域内のおよそ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体のわずかな配列のバリエーションに起因して、２９７位から上流又は下流に±３アミノ酸、すなわち２９４位から３００位の間に位置する場合もある。Ｆｃ領域において非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したそのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照されたい。
フコシル化が低下した抗体を産生可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が不足しているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）、又はＧＤＰ－フコース合成若しくはトランスポータータンパク質の活性が低下若しくは消滅した細胞（例えば、米国特許出願公開第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号を参照されたい）が挙げられる。
さらなる態様では、抗体バリアントは、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖と共に提供される。そのような抗体バリアントは、上記のように、フコシル化の減少及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。そのような抗体バリアントの例は、例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，１７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号；同第２００４／０６５５４０号、同第２００３／０１１８７８号に記載されている。
Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体バリアントの例は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号；同第１９９８／５８９６４号；及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
抗体は、グリコシル化の程度を低減するように修飾されることが好ましい場合がある。いくつかの実施態様では、抗体は、非グリコシル化される場合もあり、脱グリコシル化される場合もある。抗体は、Ｎ２９７における置換、例えば、Ｎ２９７Ｄ／Ａを含むことができる。
Ｆｃ領域バリアント
ある特定の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸修飾が本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それにより、Ｆｃ領域バリアントが生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
特定の実施態様では、本発明は、エフェクター機能が低減された抗体バリアント、例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、及び／又はＦｃγＲへの結合が低減されるか又は排除されている抗体バリアントを企図する。特定の態様では、本発明は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有することで、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が重要でありながら、特定のエフェクター機能（例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ））が不必要、又は有害である用途に対して望ましい候補となる、抗体バリアントを企図する。
ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／消失を確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏの細胞毒性アッセイを実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがってＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現させるのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現させる。造血細胞におけるＦｃＲの発現については、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は加えて、目的のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２～６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで評価され得る。また、抗体がＣ１ｑに結合することができず、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号における、Ｃ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）、ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定も、当技術分野で知られている方法を使用して行うことができる（Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照されたい）。
エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９において１つ又は複数の置換、例えば、Ｐ３２９Ｇを含むものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を伴ういわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７３３２５８１号）など、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上で置換を有するＦｃ変異体を含む。
特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃγＲ結合を減少させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２３４及び２３５（ＥＵ番号付けの残基）を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。特定の態様では、抗体バリアントは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域に、Ｄ２６５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇをさらに含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ－ＰＧ）である。（例えば、国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照されたい。）別の態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＡ）である。代替置換には、任意選択でＤ２６５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇ及び／又はＰ３３１Ｓと組み合わせた、Ｌ２３４Ｆ及び／又はＬ２３５Ｅが挙げられる。
他の実施態様では、ＩｇＧ４又はＩｇＧ２などの、Ｆｃエフェクター機能が低下したＩｇＧサブタイプを使用することが可能であり得る。
ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号，及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照されたい。）
いくつかの実施態様では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号；国際公開第９９／５１６４２号；及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）において記載されているように、Ｃ１ｑへの結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変更（すなわち、改善又は減弱、好ましくは、減弱）を結果としてもたらすＦｃ領域内の変更が施される。
特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２５３、及び／又は３１０、及び／又は４３５（残基のＥＵ番号付け）における変異を有するＦｃ領域を含む。特定の態様では、抗体バリアントは、位置２５３、３１０、及び４３５におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａである。例えば、Ｇｒｅｖｙｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４（２０１５）５４９７－５５０８を参照されたい。
特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置３１０、及び／又は４３３、及び／又は４３６（残基のＥＵ番号付け）における変異を有するＦｃ領域を含む。特定の態様では、抗体バリアントは、位置３１０、４３３、及び４３６におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａである。（例えば、国際公開第２０１４／１７７４６０号（Ａ１）を参照されたい）。例えば、いくつかの実施態様では、通常のＦｃＲｎ結合が使用され得る。
Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
本明細書で報告される完全長抗体の重鎖Ｃ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫを終端とする、完全Ｃ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうちの１つ又は２つが除去された、短縮Ｃ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、ＰＧを終端とする、短縮Ｃ末端であり得る。本明細書で報告される全ての態様のうちの一態様では、本明細書で指定される、Ｃ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端のグリシン残基（Ｇ４４６；ＥＵインデックスによるアミノ酸位置の番号付け）を含む。これは、本明細書で使用される「完全長抗体」又は「完全長重鎖」という用語によっても、やはり、明示的に包摂されている。
抗体誘導体
ある特定の態様では、本書で提供される抗体は、当技術分野で公知であり容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むように、さらに改変され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例：グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が含まれる（但しこれらに限定されない）。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に付着しているポリマーの数は様々であり、複数のポリマーが付着している場合には、それらは同じ分子であっても、異なった分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定するものではないが、改良される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうか等の考慮事項に基づいて決定することができる。
Ｊ．組換え法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組換え法及び組成物を使用して生成されてもよい。一実施態様では、本明細書に記載される抗体のセットをコードする単離核酸又は単離核酸のセットが提供される。
例えば、核酸のセットは、第１の抗体をコードする以下の核酸：
ｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＨドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含む第１の重鎖ポリペプチドをコードする核酸；
ｉｉ）（ｉ）のＦａｂ重鎖と対合して標的抗原に対する結合部位を形成するＦａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）をコードする核酸；
ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含む第２の重鎖ポリペプチドをコードする核酸；
ｉｖ）（ｉｉｉ）のＦａｂ重鎖と対合して標的抗原に対する結合部位を形成するさらなるＦａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）をコードする核酸
を含み得る。
本発明による核酸のセットは、追加的に又は代替的に、第２の抗体をコードする以下の核酸：
ｖ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＬドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含む第１の重鎖ポリペプチドをコードする核酸；
ｖｉ）（ｖ）のＦａｂ重鎖と対合して標的抗原に対する結合部位を形成するＦａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）をコードする核酸；
ｖｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含む第２の重鎖ポリペプチドをコードする核酸；
ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）のＦａｂ重鎖と対合して標的抗原に対する結合部位を形成するＦａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）をコードする核酸
を含み得る。
いくつかの実施態様では、これらの核酸のうちの特定のものは互いに同じであり得る。例えば、（ｉｉ）の核酸は（ｉｖ）と同じであってもよく、且つ／又は（ｖｉ）の核酸は（ｖｉｉｉ）と同じであってもよく、その結果、セット全体が８個未満の異なる核酸配列を含むことになる。
別の実施態様では、核酸のセットは、第１の抗体をコードする以下の核酸：
ｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＨドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含むポリペプチドをコードする核酸；
ｉｉ）Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）をコードする核酸；並びに
ｉｉｉ）Ｆｃサブユニットポリペプチド（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）をコードする核酸
を含み得；
ここで、（ｉ）のＦａｂ重鎖及び（ｉｉ）のＦａｂ軽鎖は、標的抗原に結合することができるＦａｂ断片を形成する。
本発明による核酸のセットは、追加的に又は代替的に、第２の抗体をコードする以下の核酸：
ｉｖ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＬドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含むポリペプチドをコードする核酸；
ｖ）Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）をコードする核酸；並びに
ｖｉ）Ｆｃサブユニットポリペプチド（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）をコードする核酸
を含み得；
ここで、（ｉ）のＦａｂ重鎖及び（ｉｉ）のＦａｂ軽鎖は、標的抗原に結合することができるＦａｂ断片を形成する。
再び、いくつかの実施態様では、これらの核酸のうちの特定のものは互いに同じであり得る。例えば、（ｉｉ）の核酸は（ｖ）の核酸と同じであってもよく、その結果、全体のセットは５つの異なる核酸配列のみを含む。
核酸は、１つ又は複数の核酸分子又は発現ベクターに含まれ得る。
したがって、さらなる実施態様では、そのような核酸（複数可）を含む１つ又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。一実施態様では、それぞれの重鎖及び軽鎖の各々は、個々のプラスミドから発現される。
さらなる実施態様では、このような核酸（複数可）又はベクター（複数可）を含む宿主細胞又は宿主細胞のセットが提供される。一実施態様では、第１の抗体を発現する第１の宿主細胞が提供され、第２の抗体を発現する第２の宿主細胞が提供される。
１つのそのような実施態様では、第１の宿主細胞は、第１の抗体の核酸を集合的にコードする１つ又は複数のベクターを含む。第２の宿主細胞は、第２の抗体の核酸を集合的にコードする１つ又は複数のベクターを含む（例えば、それによって形質転換されている）。
一実施態様では、宿主細胞は、真核生物のもの、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、本発明による抗体の作製方法が提供され、本方法は、上述される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意選択で、抗体を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することとを含む。
抗体の組換え産生に関しては、例えば、上述の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために、１つ又は複数のベクター中に挿入される。このような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離及び配列決定され得る。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のための適切な宿主細胞には、本明細書に記載される原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に糖鎖修飾やＦｃエフェクター機能を必要としない場合には、細菌中で産生されてもよい。細菌中の抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号、及び米国特許第５，８４０，５２３号を参照されたい。（また、大腸菌内の抗体断片の発現について記載する、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい）。発現の後、抗体は、可溶型画分中の細菌細胞ペーストから単離され、さらに精製され得る。
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌株及び酵母株を含めた糸状菌類又は酵母などの有用真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９－１４１４；及びＬｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２００６）２１０－２１５を参照されたい。
（グリコシル化）抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が確認されており、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用してもよい。
植物細胞培養物も、宿主として利用し得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号及び米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。
脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４に記載されるような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス***腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載）、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７（１９８０）４２１６－４２２０）を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びに骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｕ，Ａ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４），ｐｐ．２５５－２６８を参照されたい。
一態様では、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
Ｋ．アッセイ
本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られている様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特性決定することができる。
一態様では、本発明の抗体を、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等の公知の方法によって、その抗原結合活性について試験する。
抗体親和性
ある特定の実施態様では、本明細書で提示される抗体は、標的抗原に対する、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭもしくは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）、又は本明細書の他の箇所で言明される通りの解離定数（ＫＤ）を有する。
特定の実施態様では、エフェクター部分、例えば、放射性標識化合物に対する抗原結合部位は、エフェクター部分／放射性標識化合物に対する、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ若しくは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施態様では、ＫＤとは、１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、又は１ｐＭ以下、又は本明細書の他の箇所で言明される通りである。例えば、機能的結合部位は、放射性標識化合物／金属キレートに、約１ｐＭ～１ｎＭ、例えば、約１～１０ｐＭ、１～１００ｐＭ、５～５０ｐＭ、１００～５００ｐＭ、又は５００ｐＭ～１ｎＭのＫＤで結合し得る。
一実施態様では、ＫＤは、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施態様では、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施される。例えば、溶液中における、Ｆａｂの、抗原に対する結合親和性は、非標識抗原の滴定系列の存在下において、Ｆａｂを、最小濃度の（１２５Ｉ標識）抗原で平衡化し、次いで、抗Ｆａｂ抗体でコーティングされたプレートで、結合している抗原を捕捉することにより測定される（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２～５時間にわたって室温（およそ２３℃）で遮断する。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］－抗原を、関心のあるＦａｂの段階希釈物と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」第５７巻第４５９３～４５９９頁（１９９７年）における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ－１２の評価と一致する）。その後、目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションをより長い期間（例えば、約６５時間）続けて、平衡に達することを確実にすることができる。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移す。次に、溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を付加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）上で１０分間、計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイでの使用のために選択する。
別の実施態様によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用するアッセイを、約１０の反応単位（ＲＵ）で、固定化された抗原ＣＭ５チップによって２５℃で実行する。一実施態様では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）に希釈した後で、５μＬ／分の流量で注入し、結合タンパク質のおよそ１０反応単位（ＲＵ）を達成する。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロックする。反応速度を測定するために、Ｆａｂの２倍段階希釈物（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ－２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）と共に、２５℃、約２５μｌ／分の流量でＰＢＳ中に注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ第３．２版）を使用して、会合センサグラム及び解離センサグラムを同時に適合することによって、算出する。平衡解離定数（ＫＤ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ－１ｓ－１を超える場合、会合速度は、流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌型キュベットを伴う８０００シリーズのＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計により測定される、漸増濃度の抗原の存在下における、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の、２５℃における蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過を１６ｎｍとする）の増大又は減少を測定する蛍光消光技術を用いることにより決定され得る。
別の実施態様では、ＫＤは、ＳＥＴ（溶液平衡滴定）を使用して測定される。このアッセイによれば、通常、試験抗体は一定の濃度で適用され、試験抗原の段階希釈物と混合される。インキュベーションして平衡を確立した後、遊離抗体の部分を、抗原コーティング表面上で捕捉し、一般に、電気化学発光（例えば、Ｈａｅｎｅｌ ｅｔ ａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３９（２００５）１８２－１８４において記載されている）を使用して、標識／タグ付き抗種抗体により検出する。
例えば、一実施態様では、３８４ウェルストレプトアビジンプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍｉｃｒｏｃｏａｔ；型番：１１９７４９９８００１）を、ＰＢＳバッファー中に２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、ウェル１つ当たり２５μｌの抗原－ビオチン－異性体ミックスと共に、４℃で、一晩にわたりインキュベートする。抗体試料の、遊離抗原との平衡化のために、０．０１ｎＭ～１ｎＭの抗体を、２５００ｎＭ、５００ｎＭ、又は１００ｎＭの濃度で開始する、１：３、１：２、又は１：１．７の段階希釈で関連抗原で滴定する。試料を、シーリングされたＲＥＭＰ Ｓｔｏｒａｇｅポリプロピレン製マイクロプレート（Ｂｒｏｏｋｓ）内で、４℃で、一晩にわたりインキュベートする。一晩にわたるインキュベーションの後、ストレプトアビジンプレートを、ウェル１つ当たり９０μｌずつのＰＢＳＴで、３回にわたり洗浄する。各試料１５μｌずつを、平衡化プレートから、アッセイプレートに移し、ＲＴで、１５分間にわたりインキュベートするのに続き、ＰＢＳＴバッファー９０μｌずつ３回にわたる洗浄工程にかける。２５μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体－ＰＯＤコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３６－０８８、ＯＳＥＰ中に１：４０００）を添加することにより、検出を実行するのに続き、ＰＢＳＴバッファー９０μｌずつ６回にわたる洗浄工程にかける。２５μｌのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ；型番：１１８３５０３３００１）を、各ウェルに添加する。測定は、Ｓａｆｉｒｅ２リーダー（Ｔｅｃａｎ）上、３７０／４９２ｎｍで行う。
別の実施態様では、ＫｉｎＥｘＡ（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）アッセイを使用して、ＫＤを測定する。このアッセイに従い、典型的に、抗原を、一定濃度の抗体結合部位に滴定し、試料を平衡化させ、次いで、フローセルを介して、速やかに取り出し、遊離抗体結合部位を、抗原コーティングビーズ上で捕捉する一方で、抗原飽和抗体複合体を洗い流す。次いで、ビーズ捕捉抗体を、標識抗種抗体、例えば、蛍光標識により検出する（Ｂｅｅ ｅｔ ａｌ ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２０１２；７（４）：ｅ３６２６１）。例えば、一実施態様では、ＫｉｎＥｘＡ実験は、ＰＢＳ ｐＨ７．４を、ランニングバッファーとして使用して、室温（ＲＴ）で実施される。試料は、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充したランニングバッファー（「試料バッファー」）中で調製する。０．２５ｍｌ／分の流量を使用する。結合部位濃度を５ｐＭとする、一定量の抗体を、１００ｐＭ（濃度範囲：０．０４９ｐＭ～１００ｐＭ）で始める、２倍の段階希釈を介する抗原により滴定する。抗原を伴わない、１例の抗体試料は、１００％のシグナル（すなわち、阻害を伴わないシグナル）として用いられる。抗原－抗体複合体を、ＲＴで、少なくとも２４時間にわたりインキュベートして、平衡に到達させた。次いで、ＫｉｎＥｘＡシステム内、溶液の平衡状態を撹乱せずに、非結合抗体が、ビーズにより捕捉されることを可能とする、５ｍｌの容量で、抗原カップリングビーズのカラムを介して、平衡化混合物を取り出す。捕捉された抗体は、試料バッファー中に２５０ｎｇ／ｍｌのＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（著作権）コンジュゲート抗ヒトＦｃ断片特異的二次抗体を使用して検出する。各試料は、全ての平衡実験について、二連で測定する。ＫＤは、「標準的解析」法を使用する、ＫｉｎＥｘＡソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０．１１）内に含有される、１部位均一結合モデルを使用して、データの非線形回帰分析から得られる。
Ｌ．治療方法及び組成物
本明細書で記載される抗体のセットは、治療法において使用され得る。一態様では、医薬としての使用のための、本明細書で記載される抗体のセットが提供される。特定の態様では、治療法における使用のための抗体のセットが提供される。
いくつかの態様では、本明細書に記載の抗体のセットは、例えばがんなどの増殖性疾患の治療における免疫療法剤として使用することができる。この治療は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導し得る。
上記で論じられた通り、いくつかの態様では、本発明に従う抗体のセットは、放射性核種を、対象における標的細胞に送達することが所望される、任意の治療に適する。例えば、例えば、がん治療のためのプレターゲティング放射免疫療法における使用のための、本明細書で記載される抗体のセットが提供される。
特定の態様では、本発明は、個体における免疫療法又はプレターゲティング放射免疫療法であって、個体に有効量の抗体のセットを投与することを含む免疫療法又はプレターゲティング放射免疫療法における使用のための抗体のセットを提供する。上記の態様のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
上述したように、治療は、患者の疾患細胞にターゲティングされた細胞傷害活性によって治療可能な任意の状態の治療であり得る。治療は、好ましくは腫瘍又はがんの治療である。しかしながら、本発明の適用性は、腫瘍及びがんに限定されない。例えば、治療はまた、ウイルス感染、又は別の病原性生物体、例えば、原核生物の感染の治療でもあり得る。任意選択で、標的化はまた、Ｔ細胞駆動性自己免疫疾患又はＴ細胞性血液がんの治療のためのＴ細胞の標的化でもあり得る。したがって、治療される状態は、ＨＩＶ、狂犬病、ＥＢＶ及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどのウイルス感染、並びに多発性硬化症及び移植片対宿主病などの自己免疫疾患を含むことができる。
本明細書で使用される「がん」という用語は、下記のがんのうちのいずれかの難治性型、上記のがんのうちのいずれかの、チェックポイント阻害剤経験型、又は下記のがんのうちの１つ又は複数の組み合わせを含む、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を含む膵臓がん、皮膚がん、頭部がん又は頸部がん、皮膚黒色腫又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、肛門領域がん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ、ｇａｓｔｒｉｃ）がん、結腸がん及び／又は直腸がんであり得る結腸直腸がん、乳がん、子宮がん、ファローピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がん又は尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、及びユーイング肉腫など、固形がん及び血液がんの両方を含む。
治療方法は、第１の抗体と第２の抗体を同時に又は連続的に投与することを含み得る。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗体は、併用療法の一部として投与される場合がある。例えば、それらは、１つ又は複数の化学療法剤と組み合わせて投与され得、化学療法剤及び抗体は、いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に投与され得る。さらに、又は代わりに、それらは、１つ又は複数の免疫療法剤と組み合わせて投与され得：免疫療法剤及び抗体は、いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に投与され得る。
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤、例えば放射性標識化合物）は、非経口、肺内及び鼻腔内投与、並びに局所治療が必要な場合には病変内投与を含む任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射又は皮下注射などの注射によるものであり得る。
治療のために、放射性同位体を、細胞、組織、又は臓器に標的化する方法は、
ｉ）対象に、本明細書で記載される、第１の抗体及び第２の抗体を投与すること（いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に）であり、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化し；第１の抗体と第２の抗体との会合が、放射性標識化合物に対する機能的結合部位を形成する、本明細書で記載される、第１の抗体及び第２の抗体を投与すること（いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に）；
並びに
ｉｉ）続いて、放射性標識化合物に対する機能的結合部位に結合する放射性標識化合物を投与すること
を含み得る。
放射性標識化合物は、細胞に対して細胞傷害性である、放射性同位体で標識される。適切な放射性同位体には、上で論じたようなアルファ放射体及びベータ放射体が含まれる。
二重特異性抗体（すなわち、本発明に従う「スプリット」抗体ではない抗体）を使用するプレターゲティング放射免疫療法では、抗体の投与と、放射性標識化合物の投与との間に、除去剤又はブロッキング剤を投与することが一般的である。除去剤は、抗体に結合し、それらの体内からのクリアランスの速度を増強する。除去剤は、抗イディオタイプ抗体を含む。ブロッキング剤とは、典型的に、放射性標識化合物に対する抗原結合部位に結合するが、それら自体が放射性標識ではない薬剤である。例えば、放射性標識化合物が、ある特定の化学元素（例えば、金属）の放射性同位体をロードされたキレート剤を含む場合、ブロッキング剤は、それが、抗原結合部位により、なおも結合し得ることを条件として、同じ元素（例えば、金属）の非放射性同位体をロードされた同じキレート剤を含むことができ、非ロードキレート剤又は異なる非放射性部分（例えば、異なる元素の非放射性同位体）をロードされたキレート剤を含んでもよい。一部の場合に、ブロッキング剤は、加えて、分子のサイズ及び／又は流体力学的半径を増大させる部分をさらに含み得る。これらは、分子が、循環中の抗体に結合する能力に干渉せずに、分子が、腫瘍に接近する能力を妨げる。例示的部分は、親水性ポリマーを含む。この部分は、例えば、デキストラン、デキストリン、ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、又はポリ（２－エチル２－オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）のポリマー又はコポリマーであり得る。他の実施態様では、部分は、ＸＴＥＮポリペプチド（非構造化親水性タンパク質ポリマー）、ホモ－アミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリン－アラニン－セリンポリマー（ＰＡＳ）、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）、又はゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）などの非構造化ペプチド又は非構造化タンパク質であり得る。さらに例示的な部分としては、アルブミン、例えばウシ血清アルブミン、又はＩｇＧのようなタンパク質が挙げられる。部分／ポリマーの適切な分子量は、例えば、少なくとも５０ｋＤａ、例えば、５０ｋＤａ～２０００ｋＤａの間の範囲であり得る。例えば、分子量は、２００～８００ｋＤａ、任意選択で、３００、３５０、４００、又は４５０ｋＤａを超え、任意選択で、７００、６５０、６００、又は５５０ｋＤａ未満、任意選択で、約５００ｋＤａであり得る。
本発明の特定の態様によれば、除去剤又はブロッキング剤を、対象に投与する工程は存在しない。特定の態様では、抗体の投与と、放射性標識化合物の投与との間に、第１の抗体又は第２の抗体に結合する、任意の薬剤を投与する工程は存在しない。特定の態様では、任意選択で、化学療法剤、免疫療法剤、及び放射性増感剤から選択される化合物を除き、抗体の投与と、放射性標識化合物の投与との間に、任意の薬剤を投与する工程は存在しない。いくつかの実施態様では、抗体の投与と、放射性標識化合物の投与との間に薬剤は投与されない。いくつかの実施態様では、抗体の投与と、放射性標識化合物の投与との間に、他の任意の薬剤の、対象への注射又は点滴はなくてもよい。
いくつかの実施態様では、本方法は、ｉ）抗体のセットを投与する工程（ここで、第１の抗体及び第２の抗体は、いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に投与され得る）と、ｉｉ）続いて、放射性標識化合物を投与する工程とからなるか、又はこれらから本質的になる、２工程プレターゲティング放射性免疫療法であり得る。治療は、このような治療法の複数のサイクル、すなわち、これらの２つの工程の複数のサイクルを含み得る。例示的治療サイクルの持続期間は２８日間であり、ここでは抗体のセットが、サイクルの１日目に投与され、放射性標識化合物が、任意選択で、サイクルの１、２、３、４、５、６、７、又は８日目に、例えば、７日目に投与される。治療サイクルの数は、変動し得る。一実施態様では、４、５、又は６つの治療サイクルが施され得る。
驚くべきことに、本発明者らは、本発明による抗体を使用して、正常組織中の過剰な放射能の蓄積を回避しながら、治療的に有効な放射性標識化合物の、腫瘍への取り込みを得ることが可能であることを決定した。実際、実施例では、非標的組織中の放射能の蓄積レベルは、二重特異性抗体及び除去工程を使用し、また、より単純な手順を使用する、３工程ＰＲＩＴ法の場合よりも低いことが見出された。
いくつかの実施態様では、放射性標識化合物は、第１の抗体及び第２の抗体が、標的細胞に局在化するのに適する時間を与えられたら、対象に投与され得る。例えば、いくつかの実施態様では、放射性標識化合物は、第１の抗体及び第２の抗体の直後に、対象に投与される場合もあり、第１の抗体及び第２の抗体の、少なくとも４時間、８時間、１日間、又は２日間後に、対象に投与される場合もある。任意選択で、放射性標識化合物は、第１の抗体及び第２の抗体の後、３日間、５日間、又は７日間を超えずに投与され得る。１つの特定の実施態様では、放射性標識化合物は、第１の抗体及び第２の抗体の２～７日後に、対象に投与され得る。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗体は、追加的に又は代替的に、放射線増感剤と組み合わせて投与され得る。放射線増感剤と抗体は、いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に投与され得る。
いくつかの実施態様では、上述のように、１つ又は複数の治療サイクルの前に、１つ又は複数の線量測定サイクルを使用することができる。線量測定サイクルは、ｉ）抗体のセットを投与する工程（この場合、第１の抗体及び第２の抗体は、いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に投与される場合もある）と、ｉｉ）続いて、ガンマ放射体による放射性標識のイメージングに適する化合物を投与する工程（この場合、前記放射性標識化合物は、放射性標識化合物に対する機能的結合部位に結合する）とを含み得る。化合物は、それが、アルファ放射体又はベータ放射体ではなく、ガンマ放射体で標識されることを除き、その後の治療サイクルで使用される化合物と同じであり得る。例えば、一実施態様では、線量測定サイクルで使用される放射性標識化合物は、２０３Ｐｂ－ＤＯＴＡＭであることが可能であり、治療サイクルで使用される放射性標識化合物は、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭであり得る。患者は、腫瘍への化合物の取り込みを決定するため、及び／又は化合物の吸収線量を推定するために、画像診断を受けることができる。この情報は、その後の治療工程で予想される放射線被曝を推定し、治療工程で使用される放射性標識化合物の線量を安全なレベルに調整するために使用され得る。
Ｍ．薬学的製剤
本明細書で記載される第１の抗体及び第２の抗体は、単一の薬学的組成物中に製剤化される場合もあり、個別の薬学的組成物中に製剤化される場合もある。したがって、さらなる態様では、本発明は、例えば、本明細書で記載される治療法又は診断法のうちのいずれかにおける使用のための、本発明の第１の抗体及び第２の抗体、又は本発明の第１の抗体を含む、第１の薬学的製剤と、本発明の第２の抗体を含む、第２の薬学的組成物とを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、例えば、下記で記載される、少なくとも１つのさらなる治療剤をさらに含む。
本明細書で記載される抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有するこのような抗体を、１つ又は複数の任意選択の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することにより調製され得る。
薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、次のものが含まれるが、これらに限定されない：ヒスチジン、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及び、ｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｈａｌｏｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質など、間質性薬物分散剤がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、コンドロイチナーゼなど、１つ又は複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせる。
例示的な凍結乾燥抗体組成物については、米国特許第６，２６７，９５８号において記載されている。水性抗体組成物は、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号において記載されている水性抗体組成物を含み、後者の組成物は、ヒスチジン－アセテートバッファーを含む。
本明細書における製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。例えば、上記で論じられた、化学療法剤、免疫療法剤、及び／又は放射性増感剤をさらにもたらすことが所望であり得る。このような有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わされて存在することが適切である。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、又はマクロエマルジョン中にも取り込まれ得る。このような技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）において開示されている。
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例は、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、成形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態にあるマトリックスを含む。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は一般に、滅菌される。滅菌は、例えば滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成され得る。
Ｎ．診断及び検出のための方法及び組成物
エフェクター薬剤が放射性標識部分である場合、本明細書で記載される抗体のセットはまた、診断法又はイメージング法、好ましくは、プレターゲティングラジオイムノイメージング法、又はこれを含む方法においても使用され得る。したがって、本発明は、診断法及びイメージング法を提供する。本発明は、本明細書で記載されるイメージング法における、抗体のセットの使用、及び対象において、例えば、ヒト又は動物の体内において実行される診断法における使用のための、本明細書で記載される抗体のセット（すなわち、本明細書で記載される、第１の抗体及び第２の抗体）をさらに提供する。
イメージング法は、体内における標的抗原の存在及び／又は分布のイメージングに適している。例えば、方法は、上記で論じられた疾患状態のうちのいずれかなどの疾患と関連する抗原を発現する細胞をイメージングする方法であり得る。任意選択で、方法は、腫瘍又はがんをイメージングするための方法である。方法は、がんなどの増殖性疾患又は感染性疾患を有することが疑われる対象を診断するための方法であり得る。
いくつかの実施態様では、対象は、ヒトであることが好ましい場合がある。
イメージング又は診断のために、放射性同位体を、組織又は臓器に標的化する方法は、
ｉ）対象に、本明細書で記載される第１の抗体及び第２の抗体を投与すること（いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に）であり、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化し、第１の抗体と第２の抗体との会合が、放射性標識化合物に対する機能的結合部位を形成する、本明細書で記載される第１の抗体及び第２の抗体を投与すること（いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に）；
ｉｉ）続いて、放射性標識化合物に対する機能的結合部位に結合する放射性標識化合物を投与すること
を含み得る。
任意選択で、方法は、
ｉｉｉ）組織又は臓器をイメージングすることであって、放射性標識化合物が、局在化しているか、又は局在化していることが予測される、組織又は臓器をイメージングすること
をさらに含み得る。
任意選択で、方法は、診断を形成し、診断を対象に配信し、且つ／又は診断に基づき、適切な治療を決定及び／若しくは投与する、１つ又は複数の工程をさらに含み得る。
別の実施態様では、本発明の方法は、対象が以前に、
ｉ）抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化し、第１の抗体と第２の抗体との会合が、放射性標識化合物に対する機能的結合部位を形成する、本明細書で記載される、第１の抗体及び第２の抗体（いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に）；並びに
ｉｉ）第１の抗体と第２の抗体との会合により形成される、前記放射性標識化合物に対する抗原結合部位に結合する放射性標識化合物
を投与されている、対象の組織又は臓器をイメージングすること
を含み得る。
本明細書で記載されるイメージング法及び／又は診断法では、放射性標識化合物は、イメージングに適する放射性同位体で標識される。適切な放射性同位体は、上記で論じられたガンマ放射体を含む。
従来のプレターゲティング放射線イメージング法では、抗体の投与と、放射性標識化合物の投与との間に、除去剤又はブロッキング剤、例えば、上記で記載された除去剤又はブロッキング剤を投与することが一般的である。
本発明の特定の実施態様では、除去剤又はブロッキング剤を投与する工程は存在しない。特定の態様では、抗体の投与と、放射性標識化合物の投与との間に、第１の抗体又は第２の抗体に結合する、任意の薬剤を投与する工程は存在しない。特定の態様では、任意選択で、化学療法剤、免疫療法剤、及び放射性増感剤から選択される化合物を除き、抗体の投与と、放射性標識化合物の投与との間に、任意の薬剤を投与する工程は存在しない。いくつかの実施態様では、抗体の投与と、放射性標識化合物の投与との間に薬剤は投与されない。いくつかの実施態様では、抗体の投与と、放射性標識化合物の投与との間に、他の任意の薬剤の、対象への注射又は点滴はなくてもよい。
いくつかの実施態様では、放射性標識化合物は、第１の抗体及び第２の抗体が、標的細胞に局在化するのに適する時間を与えられたら、対象に投与され得る。例えば、いくつかの実施態様では、放射性標識化合物は、第１の抗体及び第２の抗体の直後に、又は第１の抗体及び第２の抗体の、少なくとも４時間後、８時間後、１日後、若しくは２日後に、対象に投与され得る。任意選択で、放射性標識化合物は、第１の抗体及び第２の抗体の後、３日間、５日間、又は７日間を超えずに投与され得る。１つの特定の実施態様では、放射性標識化合物は、第１の抗体及び第２の抗体の２～７日後に、対象に投与され得る。
いくつかの実施態様では、イメージング法は、ｉ）抗体のセットを投与する工程（この場合、第１の抗体及び第２の抗体は、いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に投与され得る）、ｉｉ）続いて、放射性標識化合物を投与する工程、及びｉｉｉ）目的の組織又は臓器をイメージングする工程からなるか、又はこれらから本質的になる、プレターゲティング放射線イメージング法であり得る。診断法は、前記工程に続く、診断を形成する工程からなるか、又はこれらから本質的になることができ、次いで、この診断は、患者に送達され、治療レジメンの選択及び／又は治療レジメンの投与のための基礎として使用され得る。
標的抗原は、本明細書で論じられる、任意の標的抗原であり得る。いくつかの実施態様では、標的抗原は、上記で論じられた腫瘍特異的抗原であることが可能であり、イメージングは、１つ又は複数の腫瘍のイメージング法であり得る。個体は、腫瘍を有することが公知であるか、又はこれが疑われる個体であり得る。
例えば、方法は、下記のがんのうちのいずれかの難治性型、又はこれらのがんのうちのいずれかの、チェックポイント阻害剤経験型、又は下記のがんのうちの１つ又は複数の組み合わせを含む、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、ＰＤＡＣを含む膵臓がん、皮膚がん、頭部がん又は頸部がん、皮膚黒色腫又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん及び／又は結腸がんであり得る結腸直腸がん、肛門領域がん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ、ｇａｓｔｒｉｃ）がん、乳がん、子宮がん、ファローピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がん又は尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、及びユーイング肉腫を有するか、又はこれらを有することが疑われる個体における、腫瘍のイメージング法であり得る。
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ＩＶ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。先に提供した一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施態様が実施されてもよいことが理解される。
略語の用語解説
ＡＤＡ 抗薬物抗体
ＡＳＴ アラニン、セリン、スレオニン
ＢｓＡｂ 二重特異性抗体
ＣＡ 除去剤
ＣＥＡ がん胎児性抗原
ＤＯＴＡＭ １，４，７，１０－テトラキス（カルバモイルメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン
ＩＤ 注入（注射）用量
ＥＬＩＳＡ 酵素免疫測定アッセイ
ＦＡＰ 線維芽細胞活性化タンパク質
ＧＰＲＣ５Ｄ Ｇタンパク質共役受容体ファミリーＣ５群メンバーＤ
ＩＶ 静脈内
ＭＷ 分子量
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ｐ．ｉ． 注射後
ＰＫ 薬物動態
ＰＲＩＴ プレターゲティング放射免疫療法
ＲＩＴ 放射免疫療法
ＲＴ 室温
ＳＣ 皮下
ＳＣＩＤ 重度複合免疫不全
ＳＤ 標準偏差
ＳＯＰＦ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ（特異的且つ日和見的病原体を含まない）
ＳＰＬＩＴ ＳｅＰａｒａｔｅｄ ｖ－ｄｏｍａｉｎｓ ＬＩｎｋａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（分離されたＶドメインリンケージ技術）
ＴＡ 標的抗原
ＴＧＩ 腫瘍増殖阻害
ＴＲ 腫瘍縮小
実施例１：ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ ＶＨ／ＶＬ抗体の生成
標的抗原に対する結合部位と放射性標識化合物に対する結合部位を有する二重特異性抗体を用いたＰＲＩＴ（プレターゲティング放射免疫療法）の方法は、効果的な標的化と腫瘍組織対正常組織の高い吸収線量比を確保するために、抗体と放射性リガンドの投与の間に除去剤（ＣＡ）を使用するのが一般的である（図３参照）。そのような方法の１つの例では、注射されたＢｓＡｂは腫瘍に浸透するのに十分な時間（通常は４～１０日間）を与えられ、その後、循環しているＢｓＡｂがＰｂ－ＤＯＴＡＭ－ｄｅｘｔｒａｎ－５００ＣＡを使用して中和される。ＣＡは、腫瘍に浸透することなく、非標的ＢｓＡｂへの２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの結合をブロックし、プレターゲティング部位をブロックするであろう。このプレターゲティングレジメンにより、その後に投与される放射性標識キレート２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの効率的な腫瘍蓄積が可能になる。
しかし、除去剤を含む方法では、ＣＡを使用することは、非効率的なさらなるステップを導入することになる。さらに、ＣＡ投与のタイミングと投与量を慎重に選択することが重要である可能性があり、これが複雑な要因となっている。
除去剤の使用に関連する問題に対処するために、本発明者らは、ＤＯＴＡＭ ＶＬ及びＶＨドメインを分割して、それらが別々の抗体上に見られるようにする戦略を提案した。
例示的なスプリットＤＯＴＡＭ ＶＨ／ＶＬ抗体の生成についてはさらに後述する。
抗体重鎖又は軽鎖の組換え発現のためのプラスミドの生成
所望のタンパク質は、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）の一過性トランスフェクションによって発現された。所望の遺伝子／タンパク質（例えば、完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、又は追加ドメイン（例えば、Ｃ末端に免疫グロブリン重鎖又は軽鎖可変ドメイン）を含む完全長抗体重鎖）の発現には、以下の機能的エレメントを含む転写ユニットを使用した：
－ イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）の即初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列（ＳＳ）、
－ 発現される遺伝子／タンパク質、及び
－ ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットに加えて、基本的／標準的な哺乳動物発現プラスミドは、
－ 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、及び
－ 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子
を含有した。
ａ）抗体重鎖の発現プラスミド
完全で且つ機能的な抗体重鎖に続き、さらなる抗体の重鎖Ｖドメイン又は軽鎖Ｖドメインを含む、Ｃ末端融合遺伝子を含む遺伝子をコードする抗体重鎖は、各々が、Ｇ４Ｓ×４リンカーにより分離された、それぞれの配列エレメント（重鎖Ｖエレメント又は軽鎖Ｖエレメント）をコードするＤＮＡ断片をヒトＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合することによってアセンブルされた（ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ＶＨ又はＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ＶＬ）。２つのＣＨ３ドメインそれぞれのＣ末端に、１つのＶＨドメインと、１つのＶＬドメインとを保有する組換え抗体分子は、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。
ＨＥＫ２９３細胞内の、Ｃ末端にＶＨドメイン又はＶＬドメインを伴う抗体重鎖の一過性発現のための発現プラスミドは、Ｃ末端にＶＨドメイン又はＶＬドメインを伴う抗体重鎖断片の発現カセットに加えて、このプラスミドの、大腸菌内の複製を可能とするベクターである、ｐＵＣ１８に由来する複製起点、及び大腸菌内でアンピシリン耐性を付与する、ベータ－ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。Ｃ末端にＶＨドメイン又はＶＬドメインの融合遺伝子を伴う抗体重鎖断片の転写単位は、以下の機能的エレメント：
－ イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）に由来する、即初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ 抗体重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ＶＨ又はＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ＶＬ）をコードする核酸、及び
－ ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）
を含む。
ｂ）抗体軽鎖の発現プラスミド
完全且つ機能的な抗体軽鎖を含む遺伝子をコードする抗体軽鎖は、それぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片を融合することによってアセンブルされた。
抗体軽鎖の一過性発現のための発現プラスミドは、抗体軽鎖断片に加えて、このプラスミドの、大腸菌内の複製を可能とするベクターである、ｐＵＣ１８に由来する複製起点、及び大腸菌内でアンピシリン耐性を付与する、ベータ－ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。抗体軽鎖断片の転写ユニットは、以下の機能的エレメント：
－ イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）に由来する、即初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ 抗体軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）をコードする核酸、及び
－ ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）
を含む。
抗体分子の一過性発現
抗体分子は、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）で培養された一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞株２９３由来）で生成された。トランスフェクションには、「２９３－Ｆｒｅｅ」トランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用した。上記のそれぞれの抗体重鎖及び軽鎖分子は、個々の発現プラスミドから発現された。トランスフェクションは、製造業者の説明書に明記されているように実施した。免疫グロブリンを含む細胞培養上清をトランスフェクションの３～７日後に回収した。上清を精製するまで低温（例えば、－８０℃）で保存した。
例えば、ＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（２００１）１９７－２０３に与えられる。
ＰＲＩＴヘミボディ（スプリット抗体）をＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（アフィニティークロマトグラフィー）で精製し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（サイズ排除クロマトグラフィー）で精製した。
例示的な抗体／ヘミボディの配列を以下に要約する。
Figure 2024504931000028
ＤＯＴＡＭ－ＶＬ－Ｐ１ＡＤ８５９２を含むＰＲＩＴスプリット抗体では、濃度１．３７２ｍｇ／ｍＬ、分析用ＳＥＣ及びＣＥ－ＳＤＳに基づく純度＞９６％の５ｍｇが生成された。ＤＯＴＡＭ－ＶＨを含むＰＲＩＴスプリット抗体－Ｐ１ＡＤ８７４９では、濃度２．０３ｍｇ／ｍＬ、分析用ＳＥＣ及びＣＥ－ＳＤＳに基づく純度＞９１％の１４ｍｇが生成された。
抗体Ｐ１ＡＥ４９５６及びＰ１ＡＥ４９５７も生成された。ＤＯＴＡＭ－ＶＬ－Ｐ１ＡＥ４９５７を含むＰＲＩＴスプリット抗体では、濃度２．６ｍｇ／ｍＬ、分析用ＳＥＣ及びＣＥ－ＳＤＳに基づく純度＞８１．６％の１９ｍｇが生成された。ＤＯＴＡＭ－ＶＨを含むＰＲＩＴスプリット抗体－Ｐ１ＡＥ４９５６では、濃度１．５ｍｇ／ｍＬ、分析用ＳＥＣ及びＣＥ－ＳＤＳに基づく純度＞９０％の６．９ｍｇが生成された。ＥＳＩ－ＭＳを用いてＰＲＩＴヘミボディの同一性を確認した。
実施例２：スプリット抗体の機能性についてのＦＡＣＳ解析
スプリット抗体又はヘミボディの機能を評価するために、アキュターゼを使用して３７℃で１０分間、ＭＫＮ－４５細胞を培養容器から剥離した。続いて、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、最終密度４×１０６細胞／ウェルとなるように９６ウェルＶ底プレートに播種した。
ヘミボディＰ１ＡＤ８７４９及びＰ１ＡＤ８５９２、並びにヒトＩＳＯコントロールを１：１で混合し、図５に示す濃度で細胞に添加した。その後、細胞を、氷上で、１時間にわたりインキュベートし、ＰＢＳ中で、２回にわたり洗浄した。細胞ペレットを再懸濁し、ＰＢＳ／５％ＦＣＳ中の＜ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）＞ＦＩＴＣ（１０μｇ／ｍｌ）又はＰｂ＿Ｄｏｔａｍ＿ＦＩＴＣ１：１００＝＞（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかの検出試薬を４０μｌ／ウェル添加した。氷上で６０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ ｃａｎｔｏを使用してＦＩＴＣ蛍光を測定するために２００μｌのＰＢＳ／５％ＦＣＳに再懸濁した。
ＭＫＮ－４５細胞上のＣＥＡに対するヘミボディの結合能力を評価するために、ヒトＩｇＧ特異的二次抗体を使用する抗体を使用してヘミボディを検出した（図５）。予想通り、これらの細胞ではヒトＩＳＯコントロールの有意な結合は観察されなかった。同じＩｇＧ濃度に調整すると、両方のヘミボディ及び両者の組み合わせは、ＭＫＮ－４５細胞に対して用量依存的な結合を示し、予想通り非常に高濃度では顕著なフック効果を示した。この実験は、ヘミボディにおいてＣＥＡへの結合が機能的であることを示している。
ＤＯＴＡＭに対するヘミボディの結合能力を評価するために、ヘミボディをヒトＩＳＯ対照又はそれぞれのスプリット抗体パートナーの存在下で１：１の比率で細胞に結合させた。それらのＭＫＮ－４５細胞への結合の後、細胞を洗浄して、非結合抗体を除去した。その後、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ－ＦＩＴＣ（蛍光標識Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ）を添加して、ＤＯＴＡＭの、コンピテント細胞に結合した抗体への結合を検出した（図６）。予測される通り、スプリット抗体のパートナーのうちの一方が、ヒトＩＳＯコントロールと組み合わされている場合は、これらの細胞上で、著明なＦＩＴＣは観察されない。両方のヘミボディの、１：１の比率における組み合わせだけが、用量依存的ＦＩＴＣシグナルを示す。この実験は、両方のヘミボディが、１つの細胞上で一体となった場合に、ＤＯＴＡＭ結合部位は、機能的となることを示す。
実施例３：ｉｎ ｖｉｖｏ試験
実施例３ａ：材料及び方法－一般
全ての実験プロトコールは、地域の規制機関（Ｃｏｍｉｔｅ Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄ’Ｅｔｈｉｑｕｅ ｄｅ ｌ’Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌｅ ｄｕ Ｌｉｍｏｕｓｉｎ［ＣＲＥＥＡＬ］、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｄｅｐａｒｔｅｍｅｎｔａｌ ｄ’Ａｎａｌｙｓｅｓ ｅｔ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ ｄｅ ｌａ Ｈａｕｔｅ－Ｖｉｅｎｎｅ）により審査及び承認された。雌重度複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、倫理的ガイドラインと共に、毎日の明暗周期（１２時間／１２時間）を伴う、特異的且つ日和見的病原体を含まない（ＳＯＰＦ）（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）条件下で維持した。動物を、新たな環境に馴らすように、到着後、最初の５日間は、操作を実施しなかった。臨床症状及び有害事象の検出のために、動物を毎日制御下に置いた。
固形異種移植片は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル（登録商標）基底膜マトリックス（増殖因子低減型；型番：３５４２３０）と、１：１で混合された細胞培養物中のＣＥＡ発現腫瘍細胞の皮下（ＳＣ）注射により確立した。腫瘍体積は、毎週３回、手作業のノギスによる計測を介して推定し、式：体積＝０．５×長さ×幅２に従い計算した。腫瘍増殖速度に応じて必要とされる場合は、さらなる腫瘍測定を行った。
腫瘍負荷、注射の副作用、又は他の原因による、不適切な苦痛又は疼痛の徴候を示した場合は、マウスを、予定の終点の前に安楽死させた。疼痛、苦痛、又は不快感の徴候は、急性体重（ＢＷ）減少、毛並みの乱れ、下痢、猫背の姿勢、及び嗜眠を含むがこれらに限定されない。治療動物の体重は、毎週３回測定し、健康状態により、必要に応じてさらに測定した。放射性物質注射の翌日から始めて、７日間にわたり、又は全ての個体が、任意の急性体重減少から十分に回復するまで、全てのマウスに含水食餌を与えた。体重減少が、それらの初期体重の２０％を超えるか、又は腫瘍体積が、３０００ｍｍ３に達したマウスは、速やかに安楽死させた。倫理的理由による安楽死のために考慮される他の因子は、腫瘍状態（例えば、壊死領域、血液／体液の漏出、自傷の徴候）、及び動物の一般的な外見（例えば、毛並み、姿勢、動き）であった。
放射性尿／糞便の再摂取を最小化するため、全ての有効性研究用マウスを、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの投与後、４時間にわたり、床面を格子状としたケージに入れてから、標準的な寝藁を備えた、新たなケージに移した。次いで、注射の２４時間後（ｐ．ｉ．）に、全てのケージを交換した。この手順は、放射性物質注射後２４時間以内における、生体内分布を目的として屠殺されたマウスには実施しなかった。
プロトコールにより指示される通りに、安楽死時に、頸椎脱臼を介する終結の前に、麻酔下マウスにおける眼窩後採血を使用して、静脈洞から血液を回収するのに続き、放射能の測定及び／又は組織学的解析のために、さらなる組織採取を行った。予測外の状態又は異常な状態は記録した。ホルマリン固定のために回収された組織は、速やかに、１０％の中性緩衝ホルマリン（４℃）中に入れ、次いで、５日後に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；４℃）に移した。生体内分布目的で回収された臓器及び組織を秤量し、２４７０ ＷＩＺＡＲＤ２自動式ガンマカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して放射能について測定し、その後、減衰及びバックグラウンドについての補正を含む、組織１グラム当たりの注入用量パーセント（１ｇ当たりのＩＤ％）を計算した。
統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）及びＪＭＰ １２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）を使用して実施した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）についての曲線解析は、式：
Figure 2024504931000029
［式中、ｄは、研究日を指し示し、０は、ベースライン値を指し示す］
を使用する、平均値腫瘍体積に基づき実施した。ビヒクルを、参照群として選択した。腫瘍縮小（ＴＲ）は、
Figure 2024504931000030
［式中、正の値は、腫瘍縮小を指し示し、－１を下回る値は、ベースライン値の２倍を上回る増殖を指し示す］
に従い計算した。
試験化合物
記載される研究で利用された化合物を、それぞれ、二重特異性抗体、除去剤、及び放射性標識キレートについて、下記の表に示されている。
ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ（ＲＯ７１９８４２７、ＰＲＩＴ－０２１３）は、ＣＥＡのＴ８４．６６エピトープを標的とする完全ヒト化ＢｓＡｂである（国際公開第２０１９／０９５９号も参照）。ＰＲＩＴ－０２１３は、
ｉ）以下に示す第１の重鎖；
ｉｉ）以下に示す第２の重鎖；及び
ｉｉｉ）以下に示す２つの抗体軽鎖
からなる。
Figure 2024504931000031
Figure 2024504931000032
ＤＩＧ－ＤＯＴＡＭ（ＲＯ７２０４０１２）は、陰性対照として使用される、非ＣＥＡ結合ＢｓＡｂである。
Ｐ１ＡＤ８７４９、Ｐ１ＡＤ８５９２、Ｐ１ＡＥ４９５６、及びＰ１ＡＥ４９５７は、ＣＥＡのＣＨ１Ａ１Ａ又はＡ５Ｂ７エピトープを標的とするＣＥＡスプリットＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体である。それらの配列は上で説明されている。全ての抗体コンストラクトを、注射日まで－８０℃で保管し、そこで、これらを解凍させ、標準ビヒクルバッファー（２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ６．０）又は０．９％ＮａＣｌ中で、静脈内（ＩＶ）投与又は腹腔内（ＩＰ）投与のための、それらそれぞれの最終濃度に希釈した。
Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ－デキストラン－５００ ＣＡ（ＲＯ７２０１８６９）を、注射日まで－２０℃で保管し、そこで、これらを解凍させ、ＩＶ投与又はＩＰ投与のために、ＰＢＳ中で希釈した。
放射性標識のためのＤＯＴＡＭキレートは、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓにより提供され、Ｏｒａｎｏ Ｍｅｄ（Ｒａｚｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）により実施される放射性標識の前に、－２０℃で維持された。２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ（ＲＯ７２０５８３４）は、トリウム発生装置からのＤＯＴＡＭによる溶出によって生成され、続いて標識後にＣａでクエンチされた。この２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ溶液を、０．９％ＮａＣｌで希釈して、ＩＶ注射に所望の２１２Ｐｂ活性濃度を得た。
ビヒクル対照群内のマウスには、ＢｓＡｂ、ＣＡ、及び２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの代わりに、ビヒクルバッファーの複数回の注射を施した。
Figure 2024504931000033
Figure 2024504931000034
Figure 2024504931000035
腫瘍モデル
使用される腫瘍細胞株、及びマウスにおける接種のための注入量については、下記の表において記載される。ＢｘＰＣ３とは、天然でＣＥＡを発現させる、ヒト初代膵腺癌細胞株である。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００８８．０３）で濃縮された、ＲＰＭＩ １６４０培地、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ；型番：７２４００－０２１）中で培養した。固形異種移植片は、研究０日目に、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル（登録商標）基底膜マトリックス（増殖因子低減型；型番：３５４２３０）と、１：１で混合されたＲＰＭＩ培地中の細胞の、右脇腹への皮下注射により、各ＳＣＩＤマウスにおいて確立した。
Figure 2024504931000036
＊Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）
実施例３ｂ：プロトコール１４４
プロトコール１４４の目的は、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ ＢｓＡｂを使用する２工程ＰＲＩＴ後の、ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける、プレターゲティング２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭについてのＰＫデータ及びｉｎ ｖｉｖｏ分布データを提示することであった。
２工程ＰＲＩＴは、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ及びＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＬ（Ｐ１ＡＤ８７４９及びＰ１ＡＤ８５９２）を個別に又は一緒に注入し、７日後に２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを注入することにより実施した。マウスを、放射性物質注射の６時間後に屠殺し、放射能の測定のために、血液及び臓器を採取した。２工程スキームを、標準的なＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ二重特異性抗体の７日後における、Ｃａ－ＤＯＴＡＭ－デキストラン－５００ ＣＡ、及びＣＡの２４時間後における２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを使用する、３工程ＰＲＩＴと比較した。
ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬのクリアランスについてのＰＫデータは、抗体注射の１時間～７日間後における採血の反復により回収し、その後、ＥＬＩＳＡにより解析した。
研究の概要を、図７に示す。図７ａは、ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ ＰＫのための採血を含む、２工程ＰＲＩＴレジメンについての概略を示す。図７ｂは、ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおいて実施された、３工程ＰＲＩＴレジメンについての概略（ｈ＝時間、ｄ＝日）を示す。
研究デザイン
プロトコール１４４の時間経過及びデザインを、下記の表に示す。
Figure 2024504931000037
Figure 2024504931000038
固形異種移植片は、研究０日目に、ＲＰＭＩ／マトリゲル中の細胞５×１０６個（第２６継代）の、右脇腹へのＳＣ注射により、各ＳＣＩＤマウスにおいて確立した。腫瘍細胞注入の１４日後に、マウスを、平均腫瘍体積を１１６ｍｍ３とする実験群に分けた。２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを、接種後２２日目に注入した；平均腫瘍体積は、２１日目において、１４０ｍｍ３であった。
群Ａａ、Ｂａ、及びＣａにおけるマウスからの血液は、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬの注射の１時間（右眼）、２４時間（左眼）、及び１６８時間（右眼、終結時）後の麻酔下において、眼窩後採血を介して回収した。同様に、試料を、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬの注射の４時間（右眼）、７２時間（左眼）、及び１６８時間（右眼、終結時）後に、群Ａｂ、Ｂｂ、及びＣｂにおけるマウスから採取した。
群Ａａ、Ｂａ、Ｃａ、及びＤ内のマウスを屠殺し、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の６時間後に剖検し、放射性物質の含有量の測定のために、以下の臓器及び組織：血液、皮膚、膀胱、胃、小腸、結腸、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、肺、心臓、大腿骨、筋肉、脳、尾、耳、及び腫瘍を採取した。
結果
注射の６時間後における全ての回収組織中の平均２１２Ｐｂ蓄積及びクリアランスを、図８に提示する。ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ又はＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＬ単独によるプレターゲティングは、腫瘍内の放射能の蓄積を結果としてもたらさなかった。２つの相補的抗体の組み合わせは、標準的な３工程ＰＲＩＴレジメンのための１ｇ当たり８７±１５％のＩＤと比較される、１ｇ当たり６５±１２％のＩＤによる２工程ＰＲＩＴの後に、腫瘍への取り込みを結果としてもたらした。チューキーの多重比較検定による二元分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、２つのＰＲＩＴ処置の間の、腫瘍への取り込みの差違は、膀胱における差違と同様に有意であること（２工程ＰＲＩＴ及び３工程ＰＲＩＴについて、それぞれ、１ｇ当たり１±２％のＩＤ及び１ｇ当たり３８±１７％のＩＤ）を示したが；この検定（ｐ＝０．０５）を使用する、他の組織蓄積の差違は、統計学的に有意ではなかった。
酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により解析される、ＩＶ注入ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬコンストラクトのクリアランスを、図９に示す。
有害事象及び毒性
本研究と関連する有害事象又は毒性は見られなかった。
結論
研究結果は、相補的ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体を使用する、ＣＡ非依存型２工程プレターゲティングの概念実証を実証した。２工程ＰＲＩＴ及び標準的３工程ＰＲＩＴを使用して、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの、腫瘍への、高度且つ特異的な取り込みを達成したところ、相補的ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体を使用した場合の正常組織中の放射能の蓄積は、ごくわずかしか見られなかった。
実施例３ｃ：プロトコール１
プロトコール１５８の目的は、除去剤非依存型２工程ＣＥＡ－ＰＲＩＴのための、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体の二重パラトープ（ＣＨ１Ａ１Ａ及びＡ５Ｂ７）対によりプレターゲティングされたマウスにおける、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの、皮下ＢｘＰＣ３腫瘍との会合について評価することであった。腫瘍への取り込みを、標準的な３工程ＣＥＡ－ＰＲＩＴの場合と比較した。
皮下ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するマウスに、
・ ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体の７日後における、放射性標識２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ（２工程ＰＲＩＴ）、又は
・ ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂの７日後における、ＣＡ、及び、最後の２４時間後における、放射性標識２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ（３工程ＰＲＩＴ）
を注入した
２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける分布を、放射性物質注射の６時間後に評価した。研究の概要を、図１０に示す。
研究デザイン
プロトコール１５８の時間経過及びデザインを、下記の表に示す。
Figure 2024504931000039
Figure 2024504931000040
＊Ｐ１ＡＤ８７４９の用量は、３５％のホール／ホール不純物について補償するように、１５４μｇへと調整した；＊＊Ｐ１ＡＤ８５９２の用量は、４０％のホール／ホール不純物について補償するように、１６７μｇへと調整した。
固形異種移植片は、研究０日目に、ＲＰＭＩ／マトリゲル中の細胞５×１０６個（第２７継代）の、右脇腹へのＳＣ注射により、各ＳＣＩＤマウスにおいて確立した。腫瘍細胞注入の１４日後に、マウスを、平均腫瘍体積を１７７ｍｍ３とする実験群に分けた。２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを、接種後２０日目に注入した；平均腫瘍体積は、２１日目において、２４３ｍｍ３であった。
全ての群内のマウスを屠殺し、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の６時間後に剖検し、放射性物質の含有量の測定のために、以下の臓器及び組織：血液、皮膚、膀胱、胃、小腸、結腸、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、肺、心臓、大腿骨、筋肉、脳、尾、及び腫瘍を採取した
結果
注射の６時間後における全ての回収組織内の平均２１２Ｐｂ分布を、図１１に示す。チューキーの多重比較検定による二元ＡＮＯＶＡは、いずれの二重パラトープ型ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ対も、標準的３工程ＰＲＩＴより低量の蓄積をもたらした膀胱を除き、３つの処置の間で、正常組織内の２１２Ｐｂの取り込みに有意差は見られないことを示した。腎臓への取り込みは、３つの処置全てについて、１ｇ当たり３～４％のＩＤであった。二重パラトープの組み合わせは、３工程ＰＲＩＴについての１ｇ当たりのＩＤを６７％と比較して、１ｇ当たりのＩＤを約５６％とする腫瘍蓄積を結果としてもたらし；２工程ＰＲＩＴと、３工程ＰＲＩＴとの差違は、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０００１）。
有害事象及び毒性
本研究と関連する有害事象又は毒性は見られなかった。
結論
本研究は、ＣＡ非依存型２工程ＣＥＡ－ＰＲＩＴのための、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体の二重パラトープ対によりプレターゲティングされたマウスにおける、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの、ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍との会合を、標準的な３工程ＰＲＩＴと比較して評価した。注入の６時間後における２１２Ｐｂの分布は、２工程ＰＲＩＴと３工程ＰＲＩＴとで同等であり、腫瘍内の蓄積は高度であり、健常組織内の放射能は、極微量であった。これは、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体を使用する、２工程ＣＥＡ－ＰＲＩＴのための、ＣＥＡ発現腫瘍の、二重パラトープによるプレターゲティングの概念実証を実証した。
実施例３ｄ：プロトコール１６０
プロトコール１６０の目的は、ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するマウスの、相補的なＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体を使用する、３サイクルにわたる、ＣＡ非依存型２工程ＣＥＡ－ＰＲＩＴの後における治療有効性を、標準的な３工程ＣＥＡ－ＰＲＩＴの場合と比較することであった。比較はまた、注入の前に、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭと共にプレインキュベートされた、ＢｓＡｂを使用する、１工程ＣＥＡ－ＲＩＴによっても行った。
ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するマウスに、
・ ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂの７日後における、ＣＡ、及び、最後の２４時間後における、放射性標識２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ（３工程ＰＲＩＴ）、
・ ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体の７日後における、放射性標識２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ（２工程ＰＲＩＴ）、又は
・ ２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ－ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂ（プレインキュベートあり；１工程ＲＩＴ）
を注入した。
治療は、非ＣＥＡ結合対照抗体（ＤＩＧ－ＤＯＴＡＭ）、及び非処置（ビヒクル）との比較もまた含む、２０μＣｉの２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭによる、３回にわたる反復サイクルで投与した。各治療サイクルにおける、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの標的化及びクリアランスを確認するように、特化マウスを、生体内分布を目的として屠殺した。処置の有効性を、ＴＧＩ及びＴＲについて評価し、処置の忍容性について評価するように、マウスを、研究の持続期間にわたり、注意深くモニタリングした。研究の概要を、図１２に示す。
プロトコール１６０の時間経過及びデザインを、下記の表に示す。
Figure 2024504931000041
Figure 2024504931000042
Figure 2024504931000043
固形異種移植片は、研究０日目に、ＲＰＭＩ／マトリゲル中の細胞５×１０６個（第２４継代）の、右脇腹へのＳＣ注射により、ＳＣＩＤマウスにおいて確立した。腫瘍細胞注入の１５日後に、マウスを、平均腫瘍体積を１２２ｍｍ３とする実験群に分けた。２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを、接種後２３日目に注入した；平均腫瘍体積は、２２日目において、１５５ｍｍ３であった。
ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ、及びＤＩＧ－ＤＯＴＡＭ抗体を、上記の表に従うＩＰ投与（プロトコール１６０における研究群）のために、ビヒクルバッファー中で、２００μＬ当たり１００μｇの最終濃度に希釈した。ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体を、２００μＬ当たり１００μｇの各コンストラクトを含有する、ＩＰ投与のための、単一の注射溶液に、併せて混合した。Ｐ１ＡＤ８７４９のために、用量は、原液中に３５％のホール／ホール不純物について補償するように、１５４μｇに調整した（ＶＨ／ＶＬを保有しない側の分子）。Ｃａ－ＤＯＴＡＭ－デキストラン－５００ ＣＡを、ＢｓＡｂ注射の７日後にＩＰ投与し（ＰＢＳ ２００μＬ当たり２５μｇ）、２４時間後に、図１２における実験スケジュールに従い、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ（ＲＯ７２０５８３４）を投与した。ＰＲＩＴ処置マウス（２工程及び３工程）に、１００μＬのＣａクエンチング２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ溶液（０．９％ＮａＣｌ １００μＬ中に２０μＣｉ）をＩＶ注入した。
１工程ＲＩＴで処置されるマウスには、１回の注射：あらかじめ結合している２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ－ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ（ＩＶ注射のための０．９％ＮａＣｌ １００μＬ中に２０μＣｉ／２０μｇのＢｓＡｂ）だけを施した。直接標識化抗体は、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを、ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂと共に、３７℃で、１０分間にわたりインキュベートすることにより調製した。
安楽死時に、群Ａ～Ｅのマウスから、以下の臓器及び組織：血清、肝臓、脾臓、腎臓、膵臓、及び腫瘍を採取した。安楽死の前に、眼窩後採血による血液回収のために、生存マウスに麻酔をかけた。回収された血液試料を、１００００ｒｃｆで、５分間にわたり遠心分離し、結果として得られる血清画分を分離し、凍結させ、－２０℃で保管した。切り出された組織は、速やかに、１０％中性緩衝ホルマリン（４℃）中に入れ、次いで、２４時間後に、１倍濃度のＰＢＳ（４℃）に移した。さらなる加工及び解析のために、ホルマリン固定試料を、Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｅａｓｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂａｓｅｌに送付した。
群Ｆ、Ｇ、Ｊ、及びＭ内のマウスを屠殺し、それらの１回目ので唯一の２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ又は２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ－ＢｓＡｂの注射の２４時間後に剖検し；群Ｈ及びＫ内のマウスを屠殺し、それらの２回目の２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の２４時間後に剖検し；群Ｉ及びＬ内のマウスを屠殺し、それらの３回目の２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の２４時間後に剖検した。血液は、安楽死時に、頸椎脱臼を介する終結の前に、麻酔下マウスにおける眼窩後採血を使用して、静脈洞から回収した。生体内分布を目的として、以下の臓器及び組織：膀胱、脾臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、尾、皮膚、及び腫瘍もまた採取した。
結果
注射の２４時間後における全ての回収組織中の平均２１２Ｐｂ蓄積及びクリアランスを、各治療及び治療サイクルについて、図１３に示す。陰性対照は、腫瘍内の取り込みを結果としてもたらさなかった（１ｇ当たり０．４％のＩＤ）。チューキーの多重比較検定による二元分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、２工程ＰＲＩＴ及び３工程ＰＲＩＴについて、いかなるサイクルにおいても、分布は、有意に異ならないが；陰性対照及び１工程ＲＩＴと比較した差違は、全てのサイクルにおいて、統計学的に有意（ｐ＜０．０５）であることを示した。腫瘍への取り込みは、３工程ＰＲＩＴについて、１ｇ当たり２５～４５％のＩＤであり、２工程ＰＲＩＴについて、１ｇ当たり２５～３０％のＩＤであり、いずれの処置又はサイクルの間でも、統計学的有意差を伴わなかった。１工程ＲＩＴについて、腫瘍への取り込みは、唯一の治療サイクルにおいて、９９％であった。正常組織内の取り込みは、いずれのＰＲＩＴレジメンについても、極めて低度であったが、１工程ＲＩＴの後では、プレインキュベート抗体の循環時間が、低分子放射性標識ＤＯＴＡＭキレートと比較して、はるかに長いために、全ての臓器内及び組織内で、有意に高度であった。
平均腫瘍発症数及び個別の腫瘍増殖曲線を、それぞれ、図１４及び図１５に示す。非処置ビヒクル群及びＤＩＧ－ＤＯＴＡＭ群における腫瘍は、後者では、３回目の処置の後に、倍加速度がわずかに低下したが、着実に増殖した。これに対し、ＰＲＩＴ群及びＲＩＴ群における腫瘍は、第１の治療サイクルの後でサイズが減少し、腫瘍のサイズが増大し始める、接種の約１０週間後まで、腫瘍コントロールを維持した。２工程ＰＲＩＴ処置及び３工程ＰＲＩＴ処置は、ほぼ同一な腫瘍コントロールを結果としてもたらした。腫瘍の完全な退縮は、見られなかった。
全ての処置群を、平均値に基づき解析し得る最後の日である、研究８３日目に、ＴＧＩは、それぞれ、ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ（３工程）及びＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ（２工程）を使用するＰＲＩＴについて、ビヒクル対照と比較して、９１．７％及び８８．４％であった。１工程ＲＩＴについて対応する数が、７２．６％であったのに対し、非特異的ＤＩＧ－ＤＯＴＡＭ対照についてのＴＧＩは、－５９．７％であった。同じ日に、平均値に基づくＴＲは、３工程ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ ＰＲＩＴについての－３９．３、－２．９ｆｏｒ２工程ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ ＰＲＩＴ、１工程ＲＩＴについての－４．７、ＤＩＧ－ＤＯＴＡＭ ＰＲＩＴについての－２８．８、及びビヒクル対照についての－３９．３であった。
下記に記載される有害事象のために、生存解析は、統計学的に関与性であると考えられなかった。
有害事象及び毒性
全ての治療群における体重の推移を、図１６に示す。複数のサイクルにわたる、２０μＣｉの２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを伴う、２工程ＰＲＩＴ及び３工程ＰＲＩＴは、良好な耐容性を示したが、１工程ＲＩＴを施されるマウスでは、急性の体重減少が生じ、群Ｅのマウス１０匹中８匹を、第１のＲＩＴサイクルの後（２１２Ｐｂ照射の６～１１日後）に、２０％又はこれを超える体重の降下のために安楽死させた。残りの２匹のＲＩＴマウスには、さらなる２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ－ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭの注射を施さず、腫瘍増殖の評価のために、継続的に追跡した。
さらに、腫瘍の状態が悪化する、つまり腫瘍が開いたり漏れたりするため、倫理的な理由から多くのマウスが屠殺された。ＤＩＧ－ＤＯＴＡＭ群では、この理由で、１０匹中９匹のマウスを、３０００ｍｍ３の腫瘍容量に達する前に安楽死させた；非処置ビヒクル対照について、対応する数は、１０匹中５匹であった。ＰＲＩＴ群及びＲＩＴ群では、問題は、それほど顕著ではなく、３工程ＰＲＩＴ群、２工程ＰＲＩＴ群、及び１工程ＲＩＴ群では、それぞれ、１０匹中１匹、１０匹中２匹、及び１０匹中２匹のマウスをこの理由で安楽死させた。これは、図１５の個別の腫瘍増殖曲線に反映されている。
最後に、群Ｃ内の１匹のマウスを、肛門下方の創傷の増悪のために安楽死させた。
全ての有害事象を、下記の表に列挙する。
Figure 2024504931000044
結論
３工程スキーム（ＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂ、ＣＡ、及び２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ）を使用するＣＥＡ－ＰＲＩＴと、２工程スキーム（ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体及び２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ）を使用するＣＥＡ－ＰＲＩＴとの間に、差違は見られなかった；ＴＧＩは、２つの処置について、著明且つ同一であり、いずれの場合にも、３サイクルにわたる２０μＣｉは、安全に投与された。対照的に、注射の前にＣＥＡ－ＤＯＴＡＭにあらかじめ結合している、２０μＣｉの２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ（１工程ＲＩＴ）は、処置されたマウスの大部分により忍容されなかった。
こうして、研究は、開発されたＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬコンストラクトを使用する、ＣＡ非依存型２工程ＰＲＩＴの忍容性及び治療有効性を実証した。
実施例４：プロトコール１７５
プロトコール１７５の目的は、注入されるプレターゲティング抗体量の増大の、その後における、腫瘍組織内及び健常組織内の２１２Ｐｂの蓄積に対する影響について評価することであった。ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体の２つの異なる用量：標準量（１００μｇ）と、２．５倍の高用量（２５０μｇ）とを比較した。さらに、そのＶＨを伸長させて、抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の形成を回避するように、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨコンストラクトに修飾を施した（これを、既に調べられたＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＬコンストラクトと併せて使用した）。抗体のＣＨ１ドメインに由来する、最初の３つのアミノ酸：アラニン、セリン、及びスレオニン（ＡＳＴ）を含むようにＶＨを伸長させ、本明細書の以下では、該コンストラクトをＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ－ＡＳＴと称する。
抗体Ｐ１ＡＤ８５９２については、上記の実施例１で既に記載した。Ｐ１ＡＦ０１７１は、融合ＨＣが、残基ＡＳＴにより伸長される点を除き、Ｐ１ＡＤ８７４９と同じである。したがって、抗体Ｐ１ＡＤ０１７１は、上記で記載された軽鎖Ｄ１ＡＡ３３８４（配列番号３４）、上記で記載された第１の重鎖Ｄ１ＡＣ４０２２（配列番号２８）、及び下記に示される第２の重鎖Ｄ１ＡＥ３６６９：
Ｄ１ＡＥ３６６９（ＨＣｋｎｏｂ＜ＣＥＡ＞ＣＨ１Ａ１Ａ Ｄｏｔａｍ－ＶＨ－ＡＳＴ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＦＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧＲＶＴＦＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＤＦＡＹＹＶＥＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＴＬＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＧＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＳＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴ （配列番号１５３）
からなる。
ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するマウスに、
・ 標準用量の１倍容量のＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ ＢｓＡｂの７日後における、放射性標識２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ、又は
・ 標準用量の２．５倍容量のＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ ＢｓＡｂの７日後における、放射性標識２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ
を注入した。
２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける分布を、放射性物質注射の２４時間後に評価した。研究の概要を、図１７に示す。
研究デザイン
プロトコール１７５の時間経過及びデザインを、下記に示す。
Figure 2024504931000045
＊低化合物濃度のために要求されるＩＰ注射量（コンストラクト１つ当たり２００μＬ＝合計４００μＬ）
Figure 2024504931000046
＊Ｐ１ＡＦ０１７１の用量は、約３０％のホール／ホール不純物について補償するように、１４３～３５７μｇへと調整した。
固形異種移植片は、研究０日目に、ＲＰＭＩ／マトリゲル中の細胞５×１０６個（第２４継代）の、右脇腹へのＳＣ注射により、各ＳＣＩＤマウスにおいて確立した。腫瘍細胞注入の２１日後に、マウスを、平均腫瘍体積を３１０ｍｍ３とする実験群に分けた。２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを、接種後２９日目に注入した；平均腫瘍体積は、３０日目において、４６２ｍｍ３であった。
全てのマウスを屠殺し、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の２４時間後に剖検し、放射性物質の含有量の測定のために、以下の臓器及び組織：血液、皮膚、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、筋肉、尾、及び腫瘍を採取した。
結果
注射の２４時間後における全ての回収組織内の平均２１２Ｐｂ分布を、図１８に示す。２つの用量レベルの間で、腫瘍組織又は正常組織内の２１２Ｐｂの取り込みに有意差は見られなかった。腫瘍蓄積は、両方の処置群について１ｇ当たり３０～３１％のＩＤであり、腎臓への取り込みは、この時点において１ｇ当たり＜２％のＩＤであった。１匹のマウスは、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射問題のために、尾内に、１ｇ当たり約１％のＩＤを有したが、他の回収健常組織は、相当量の２１２Ｐｂ蓄積を示さなかった。
有害事象及び毒性
本研究と関連する有害事象又は毒性は見られなかった。
結論
このｉｎ ｖｉｖｏモデルでは、プレターゲティングＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体の用量の、２．５倍の増大は、続いて投与された２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの腫瘍への蓄積を改善しなかった。しかし、プレターゲティングＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体はまた、正常組織中の放射能の蓄積も増大させなかったことから、この２工程プレターゲティングレジメンを使用して達成される、強力な特異性を強調した。最後に、結果は、伸長型ＶＨ ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ－ＡＳＴコンストラクトの機能について検証した。
実施例５：プロトコール１８５
プロトコール１８５の目的は、Ｔ８４．６６エピトープを標的とする、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬについて評価することであった。本明細書では、Ｐ１ＡＦ０７０９及びＰ１ＡＦ０２９８の配列が提示される。Ｐ１ＡＦ０７０９は、Ｄ１ＡＥ４６８８（配列番号８３）の第１の重鎖と、Ｄ１ＡＡ４９２０（配列番号８４）の第２の重鎖とを有する。Ｐ１ＡＦ０２９８は、Ｄ１ＡＥ４６８７（配列番号８６）の第１の重鎖と、Ｄ１ＡＥ３６６８（配列番号８７）の第２の重鎖とを有する。いずれも、Ｄ１ＡＡ４１２０（配列番号８９）の軽鎖を有する。
ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するマウスに、標準用量のＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ ＢｓＡｂ（抗体１つ当たり１００μｇ）を注入した６日後に、放射性標識２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを注入した。２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける分布を、放射性物質注射の６時間後に評価した。研究の概要を、図１９に示す。
研究デザイン
プロトコール１８５の時間経過及びデザインを下記に示す。
Figure 2024504931000047
Figure 2024504931000048
＊Ｐ１ＡＦ０１７１の用量は、約３０％のホール／ホール不純物について補償するように、１４３μｇへと調整した。
固形異種移植片は、研究０日目に、ＲＰＭＩ／マトリゲル中の細胞５×１０６個（第２７継代）の、右脇腹へのＳＣ注射により、各ＳＣＩＤマウスにおいて確立した。腫瘍細胞注入の２２日後に、マウスを、平均腫瘍体積を２２４ｍｍ３とする実験群に分けた。２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを、接種後２８日目に注入した；この時点で、平均腫瘍体積は、３８５ｍｍ３に達していた。
全てのマウスを屠殺し、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の６時間後に剖検し、放射性物質の含有量の測定のために、以下の臓器及び組織：血液、皮膚、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、筋肉、尾、及び腫瘍を採取した。回収された腫瘍を、２つの小片の分けた：一方を、放射性物質の含有量について測定し、他方を、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）最適切断温度（ＯＣＴ）用包埋培地を含有するクリオモルド中に入れ、急速凍結のために、ドライアイス上に置いた。ＯＣＴ中で凍結させた試料を、凍結切片化、免疫蛍光染色、及びＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃｏｐｅ．Ａ１型モジュラー顕微鏡を使用する解析の前に、－８０℃で維持した。
結果
注射の６時間後における全ての回収組織内の平均２１２Ｐｂ分布を、図２０に示す。腫瘍蓄積は、１ｇ当たり４０％のＩＤ（ＣＨ１Ａ１Ａ）、又は１ｇ当たり４４％のＩＤ（Ｔ８４．６６）であった。他の相当量の放射能蓄積は、腎臓内だけで見出された：２つの群について、注射の６時間後において、１ｇ当たり３～５％のＩＤであった。
Ｔ８４．６６（群Ａ）又はＣＨ１Ａ１Ａ（群Ｂ）を標的とする、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ対の腫瘍内分布の例を、図２１に示す。パネルＡ及びＣは、ＣＥＡの発現が、ＢｘＰＣ３腫瘍内で、高度且つ均一であることを示し、パネルＢ及びＤは、注入の７日後における抗体分布が同様であることを実証する。しかし、群Ａからの試料は、群Ｂからの腫瘍試料と比較して、全体として強いシグナルを提示し、Ｔ８４．６６が、ＣＨ１Ａ１Ａより強い結合剤であることの証拠を提示する。
有害事象及び毒性
本研究と関連する有害事象又は毒性は見られなかった。
結論
結果は、ＣＥＡのＴ８４．６６エピトープを標的とする、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬコンストラクトの機能について検証した。結果として得られるプレターゲティングされたＣＥＡ発現腫瘍内の２１２Ｐｂの蓄積は、高度且つ特異的であり、ＣＨ１Ａ１Ａエピトープ又はＴ８４．６６エピトープを標的とするＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ対は、ＣＥＡ発現腫瘍の内部において均一に分布した。
実施例６：プロトコール１８９
プロトコール１８９の目的は、Ｔ８４．６６ ＶＨ－ＡＳＴ／ＣＨ１Ａ１Ａ ＶＬ及びＴ８４．６６ ＶＬ／ＣＨ１Ａ１ ＶＨ－ＡＳＴを標的とする、二重パラトープＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体対について、ＣＨ１Ａ１Ａ ＶＨ－ＡＳＴ／ＶＬを標的とする陽性対照対と比較して評価することであった。この二重パラトープの組み合わせは、２つのエピトープのうちの１つ（例えば、Ｔ８４．６６エピトープ）だけを発現させる可溶型ＣＥＡ上における完全なＰｂ－ＤＯＴＡＭ結合剤の形成を排除し、これにより、循環放射能の増大、及び関連する放射線誘導性毒性、並びに腫瘍以外の標的との競合による有効性の減少などの潜在的有害作用を緩和する。
ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するマウスに、標準用量のＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ ＢｓＡｂ（抗体１つ当たり１００μｇ）を注入した７日後に、放射性標識２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを注入した。２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける分布を、放射性物質注射の６時間後に評価した。研究の概要を、図２２に示す。
研究デザイン
プロトコール１８９の時間経過及びデザインを下記に示す。
Figure 2024504931000049
Figure 2024504931000050
＊Ｐ１ＡＦ０１７１の用量は、約３０％のホール／ホール不純物について補償するように、１４３μｇへと調整した。
固形異種移植片は、研究０日目に、ＲＰＭＩ／マトリゲル中の細胞５×１０６個（第３１継代）の、右脇腹へのＳＣ注射により、各ＳＣＩＤマウスにおいて確立した。腫瘍細胞注入の１４日後に、マウスを、平均腫瘍体積を３４３ｍｍ３とする実験群に分けた。Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを、接種後２２日目に注入した；平均腫瘍体積は、２１日目において、５５７ｍｍ３に達していた。
全てのマウスを屠殺し、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の６時間後に剖検し、放射性物質の含有量の測定のために、以下の臓器及び組織：血液、皮膚、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、筋肉、尾、及び腫瘍を採取した。
結果
注射の６時間後における全ての回収組織内の平均２１２Ｐｂ分布を、図２３に示す。二重パラトープの腫瘍への蓄積の変動は、Ｔ８４．６６ ＶＨ－ＡＳＴ＋ＣＨ１Ａ１Ａ ＶＬ及びＴ８４．６６ ＶＬ＋ＣＨ１Ａ１Ａ ＶＨ－ＡＳＴのそれぞれについて、１ｇ当たり７１％のＩＤ～１ｇ当たり４６％のＩＤであった。陽性対照である、ＣＨ１Ａ１Ａは、１ｇ当たり３７％のＩＤを結果としてもたらした。チューキーの多重比較検定による二元ＡＮＯＶＡは、３つの群全ては、腫瘍への取り込みの点で、互いと著明に異なること（他の２つの群と対比した、Ｔ８４．６６ ＶＨ－ＡＳＴ＋ＣＨ１Ａ１Ａ ＶＬについてのｐ＜０．０００１；ＣＨ１Ａ１Ａだけと対比した、Ｔ８４．６６ ＶＬ＋ＣＨ１Ａ１Ａ ＶＨ－ＡＳＴについてのｐ＝０．００２０）を示した。他の臓器は群間で統計学的有意差を示さなかったが、Ｔ８４．６６ＶＨ－ＡＳＴ＋ＣＨ１Ａ１ＡＶＬの組み合わせでは、他の２つの群と比較してわずかに高い血中滞留性が示された：＜１％ＩＤ／ｇと比較して２％ＩＤ／ｇ。腎臓での取り込みは、統計的に有意ではないが、同様にわずかに高かった：Ｔ８４．６６ ＶＨ－ＡＳＴ＋ＣＨ１Ａ１Ａでは１ｇ当たり４．５％のＩＤであったのに対し、他の２つは１ｇ当たり３％のＩＤであった。
有害事象及び毒性
本研究と関連する有害事象又は毒性は見られなかった。しかし、本研究におけるＢｘＰＣ３腫瘍の増殖は、標準的な増殖速度と比較して、有意に速く、ばらつきの増大を伴った。剖検時に、大型の腫瘍（大部分）は、放射能の測定の前に、腫瘍を半分に切断するとなくなる液体で充たされていることが結論づけられた；この液体は、増殖速度の加速化により引き起こされた可能性が高いが、腫瘍は、開口させた後で秤量し、測定したので、１ｇ当たりのＩＡ％に大きな程度で影響を及ぼすことはなかった。
結論
結果は、試験したＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬコンストラクトを使用して、ＣＥＡのＴ８４．６６エピトープ及びＣＨ１Ａ１Ａエピトープを標的とする二重パラトープの機能が検証され、陽性ＣＨ１Ａ１Ａ対照と比較して、この組み合わせの驚くべき高い有効性が実証された。結果として得られるプレターゲティングされたＣＥＡ発現腫瘍内の２１２Ｐｂの蓄積は、高度且つ特異的であり、Ｔ８４．６６ ＶＨ－ＡＳＴ＋ＣＨ１Ａ１Ａ ＶＬ対について特定の利点を示している。
実施例７
これらの例は、本明細書で記載されるスプリット抗体による、Ｐｂ－ＤＯＴＡの、細胞への動員について探索する。
Ｐ１ＡＦ０７１２は、配列番号９７の第１の重鎖、配列番号９８の第２の重鎖、及び配列番号１０３の軽鎖を有する。Ｐ１ＡＦ０７１３は、配列番号１００の第１の重鎖、配列番号１０１の第２の重鎖、及び配列番号１０３の軽鎖を有する。
トリプシンを使用して、ＭＫＮ－４５細胞を、培養ボトルから解離させ、Ｃａｓｙ細胞カウンターを使用してカウントした。４℃でペレット化した後、３００ｇの細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中２．５％ＦＣＳ）に再懸濁し、２．０Ｅ＋０６細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルＰＰ Ｖ底プレート（２５μＬ／ウェル＝５．０Ｅ＋０４ゼレン／ウェル）に分注した。
ＤＯＴＡ－ＦＩＴＣを使用するＦＡＣＳ染色
ＣＥＡ特異的スプリット抗体（それぞれ、Ｐ１ＡＦ０７１２又はＰ１ＡＦ０７１３）を、ＦＡＣＳバッファー中に４０μｇ／ｍＬに調整し、１０μｇ／ｍＬの最終濃度をもたらした。その後、Ｐｂ－ＤＯＴＡ標識ＦＩＴＣを、抗体に対する等モル比で細胞に添加し、４℃で１時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳバッファー中で２回にわたり洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用する測定のために、ウェル１つ当たり７０μｌのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させた。その結果（図２４）、ＳＰＬＩＴの半分のどちらも蛍光シグナルを発しなかったことから、Ｐｂ－ＤＯＴＡ結合能力がないことが示された。ＳＰＬＩＴの両半分の組み合わせだけが、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ－ＦＩＴＣを標的細胞に動員することができた（図２４）。
＜ｈｕＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａ４８８＞を使用するＦＡＣＳ染色
ＣＥＡ特異的スプリット抗体（それぞれ、Ｐ１ＡＦ０７１２又はＰ１ＡＦ０７１３）を、ＦＡＣＳバッファー中に４０μｇ／ｍＬに調整し、１０μｇ／ｍＬの最終濃度をもたらした。両方の抗体を、細胞に個別に添加するのに続き、バッファーを添加するか又は組み合わせて添加し、４℃で１時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳバッファー中で２回にわたり洗浄した。洗浄した後で、細胞を二次抗体（＜ｈｕＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）＞－Ａｌｅｘａ４８８、濃度＝１０μｇ／ｍＬ）を含有する５０μＬのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させ、４℃で１時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳバッファー中で２回にわたり洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用する測定のために、ウェル１つ当たり７０μｌのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させた。両方のスプリット抗体についてのＥＣ５０が同等であったことは、両方のスプリット抗体の、ＣＥＡ特異的細胞への結合を指し示す。これらの状況下では、下記の表において示される通り、混合物中の抗体の量が多いため、低値のＥＣ５０が得られた。
Figure 2024504931000051
二次抗体ベースの検出（＜ｈｕ＞４８８；上パネル）又はＰｂ－ＤＯＴＡ－ＦＩＴＣ（ＤＯＴＡ－ＦＩＴＣ；下パネル）を使用して、スプリット抗体について、ＥＣ５０を決定した。
実施例８：Ｂｉａｃｏｒｅ結合実験
本実施例は、ＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ、及びＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＬの、ＤＯＴＡＭへの結合について、参照抗体であるＣＥＡ－ＤＯＴＡＭ（ＲＯ７１９８４２７、ＰＲＩＴ－０２１３）と比較して、個別に調べる。本実施例は、ＤＯＴＡＭの、ＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ対への結合について、参照抗体と比較してさらに調べる。
これらの例において使用されるコード化と、本出願の別の箇所で使用されるタンパク質番号との対応を下記に示す。配列もまた提示される。本実施例では、参照抗体は、「ＰＲＩＴ＿ＲＳ」とコード化される。
Figure 2024504931000052
これらの実験のために、ＰＲＩＴスプリット抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（親和性クロマトグラフィー）による第１の工程、及びイオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＰＯＲＯＳ ＸＳ）による第２の工程により精製し、次いで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（サイズ排除クロマトグラフィー）により精製した。
実験はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用し、測定温度２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００実験は、ｐＨ７．４のＨＢＳ－Ｐ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｒ－１００８－２７）ランニングバッファー中で実施した。２つの実験は、異なるＤＯＴＡＭ画分を使用して、被験抗体／抗体対について実施した。
１． 第１の実験では、個別のＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ抗体、及びＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＬ抗体のチップ上に捕捉されたビオチン化ＤＯＴＡＭへの結合を、参照抗体と比べて評価した。
ＤＯＴＡＭ（ＨＢＳ－Ｐ＋中の１２０ｎＭ溶液）が、ＣＡＰ Ｃｈｉｐ表面上で高密度で捕捉された（１０μｌ／分、６０秒間）。次いで、プロドラッグ＿Ａ又はプロドラッグ＿Ｂの、ＨＢＳ－Ｐ＋中の６００ｎＭ溶液を、ＤＯＴＡＭ表面上に注入した（１０μｌ／分、９０秒間）。解離を、１０μｌ／分の流量で、２４０秒間にわたりモニタリングした。相対最大応答の決定は、Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して評価された。
結果を図２６に示す。個別の抗体のうちのいずれも、捕捉されたＤＯＴＡＭへの結合を示さなかった。
２． 第２の実験では、固定化抗ｈＦａｂを使用して、まず、個別のＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ抗体、及びＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＬ抗体を、チップ内に捕捉し、次いで、ＤＯＴＡＭ－モノストレプトアビジン複合体の結合（ＲＴで１時間にわたる、１：１のモル比による、６００ｎＭのＤＯＴＡＭ＋モノストレプトアビジンカップリング）を評価した。
プロドラッグ＿Ａ又はプロドラッグ＿Ｂの、ＨＢＳ－Ｐ＋中の６００ｎＭ溶液を、抗ｈＦａｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ－１００８－２７）ＣＭ５ Ｃｈｉｐ表面上に注入した（１０μｌ／分、１２０秒間）。プロドラッグ＿Ａ溶液又はプロドラッグ＿Ｂ溶液の、高密度捕捉の後、ＤＯＴＡＭ－モノストレプトアビジン複合体を注入した（２０μｌ／分、９０秒間）。解離を、２０μｌ／分の流量で、１８０秒間にわたりモニタリングした。新たなサイクルのために、Ｇｌｙｃｉｎ ２．１及び１０μｌ／分で、７５秒間の再生時間を使用することにより、表面を再生した。相対最大応答の決定は、Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して評価された。
結果を図２７に示す。低百分率の最大応答（図中に、＊でマークした）は、ＤＯＴＡＭ－ＳＡとの、「微量」相互作用又は非特異的相互作用であると考えられ、アッセイを最適化する必要を反映する。
３． 第３の実験では、ＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ対のＤＯＴＡＭへの結合を、参照抗体と比較して評価する。固定化抗ｈＦａｂを使用して、まず、抗体を、チップ内に捕捉し、次いで、ＤＯＴＡＭ－モノストレプトアビジン複合体の結合（ＲＴで１時間にわたる、１：１のモル比による、６００ｎＭのＤＯＴＡＭ＋モノストレプトアビジンカップリング）を評価した。
プロドラッグ＿Ａ及びプロドラッグ＿Ｂの、ＨＢＳ－Ｐ＋中の３００ｎＭ溶液を、抗ｈＦａｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ－１００８－２７）ＣＭ５ Ｃｈｉｐ表面上に注入した（１０μｌ／分、１２０秒間）。プロドラッグ＿Ａ溶液及びプロドラッグ＿Ｂ溶液の、高密度捕捉の後、ＤＯＴＡＭ－モノストレプトアビジン複合体を注入した（２０μｌ／分、９０秒間）。解離を、２０μｌ／分の流量で、１８０秒間にわたりモニタリングした。新たなサイクルのために、Ｇｌｙｃｉｎ ２．１及び１０μｌ／分で、７５秒間の再生時間を使用することにより、表面を再生した。相対最大応答の決定は、Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して評価された。
結果を図２８に示す。全てのＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ対は、ＤＯＴＡ結合剤である、Ｐ６＿ＡＢ（Ｐ１ＡＦ０７１２／Ｐ１ＡＦ０７１３）対を除き、ＤＯＴＡＭに対して有意な量の結合を示した。
ＦＡＰ結合剤である、Ｐ１ＡＦ８２８６及びＰ１ＡＦ８２８７についてもまた、有意な量のＤＯＴＡＭの、ＴＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ対に対する結合を示すが、対の個々のメンバーに対する有意な量の結合は示さない、同様の結果が得られた。Ｐ１ＡＦ８２８６は、配列番号１０８の第１の重鎖、配列番号１０９の第２の重鎖、及び配列番号１１１の軽鎖から構成され、Ｐ１ＡＦ８２８７は、配列番号１０８の第１の重鎖、配列番号１１０の第２の重鎖、及び配列番号１１１の軽鎖から構成される。しかし、このアッセイは、最適化されることをさらに必要とする。
実施例９
材料及び方法
概要
全ての実験プロトコールは、地域の規制機関（Ｃｏｍｉｔｅ Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄ’Ｅｔｈｉｑｕｅ ｄｅ ｌ’Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌｅ ｄｕ Ｌｉｍｏｕｓｉｎ［ＣＲＥＥＡＬ］、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｄｅｐａｒｔｅｍｅｎｔａｌ ｄ’Ａｎａｌｙｓｅｓ ｅｔ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ ｄｅ ｌａ Ｈａｕｔｅ－Ｖｉｅｎｎｅ）により審査及び承認された。雌重度複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、倫理的ガイドラインと共に、毎日の明暗周期（１２時間／１２時間）を伴う、特異的且つ日和見的病原体を含まない（ＳＯＰＦ）（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）条件下で維持した。動物を、新たな環境に馴らすように、到着後、最初の５日間は、操作を実施しなかった。臨床症状及び有害事象の検出のために、動物を毎日制御下に置いた。
固形異種移植片は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル（登録商標）基底膜マトリックス（増殖因子低減型；型番：３５４２３０）と、１：１で混合された細胞培養物中のＣＥＡ発現腫瘍細胞の皮下（ＳＣ）注射により確立した。腫瘍体積は、毎週３回、手作業のノギスによる計測を介して推定し、式：体積＝０．５×長さ×幅２に従い計算した。腫瘍増殖速度に応じて必要とされる場合は、さらなる腫瘍測定を行った。
腫瘍負荷、注射の副作用、又は他の原因による、不適切な苦痛又は疼痛の徴候を示した場合は、マウスを、予定の終点の前に安楽死させた。疼痛、苦痛、又は不快感の徴候は、急性体重（ＢＷ）減少、毛並みの乱れ、下痢、猫背の姿勢、及び嗜眠を含むがこれらに限定されない。即時安楽死の一般的な基準は、初期体重の２０％を超える体重減少、又は腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達することである。治療動物の体重は、毎週３回測定し、健康状態により、必要に応じてさらに測定した。倫理的理由による安楽死のために考慮される他の因子は、腫瘍状態（例えば、壊死領域、血液／体液の漏出、自傷の徴候）、及び動物の一般的な外見（例えば、毛並み、姿勢、動き）であった。
安楽死時に、頸椎脱臼を介する終結の前に、麻酔下マウスにおける眼窩後採血を使用して、静脈洞から血液を回収するのに続き、放射能の測定及び組織学的解析のために、さらなる組織採取を行った。予測外の状態又は異常な状態は記録した。生体内分布目的で回収された臓器及び組織を秤量し、２４７０ ＷＩＺＡＲＤ２自動式ガンマカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して放射能について測定し、その後、減衰及びバックグラウンドについての補正を含む、組織１グラム当たりの注入用量パーセント（１ｇ当たりのＩＤ％）を計算した。
統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して実施した。
試験化合物
Ｐ１ＡＦ６２４１、Ｐ１ＡＦ６２３９、Ｐ１ＡＦ７８８７、及びＰ１ＡＦ７８８９は、ＣＥＡのＣＨ１Ａ１Ａエピトープを標的とするＮ末端ＣＥＡスプリットＤＯＴＡＭ－ＶＨ／ＶＬ抗体である。Ｐ１ＡＦ６２４１及びＰ１ＡＦ６２３９はＣＥＡの一価であるが、Ｐ１ＡＦ７８８７及びＰ１ＡＦ７８８９はＣＥＡ二価である。それらの配列は以下の通りである。
Figure 2024504931000053
全ての抗体コンストラクトを、注射日まで－８０℃で保管し、そこで、これらを解凍させ、標準ビヒクルバッファー（２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ６．０）又は０．９％ＮａＣｌ中で、静脈内（ＩＶ）投与のための、それらそれぞれの最終濃度に希釈した。
放射性標識のためのＤＯＴＡＭキレートは、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓにより提供され、Ｏｒａｎｏ Ｍｅｄ（Ｒａｚｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）により実施される放射性標識の前に、－２０℃で維持された。２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ（ＲＯ７２０５８３４）は、トリウム発生装置からのＤＯＴＡＭによる溶出によって生成され、続いて標識後にＣａでクエンチされた。この２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ溶液を、０．９％ＮａＣｌで希釈して、ＩＶ注射に所望の２１２Ｐｂ活性濃度を得た。
腫瘍モデル
ＢｘＰＣ３とは、天然でＣＥＡを発現させる、ヒト初代膵腺癌細胞株である。細胞は、ＥＣＡＣＣ （Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ））から供給され、１０％ウシ胎児血清（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００８８．０３）で濃縮された、ＲＰＭＩ １６４０培地、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ；型番：７２４００－０２１）中で培養された。固形異種移植片は、研究０日目に、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル（登録商標）基底膜マトリックス（増殖因子低減型；型番：３５４２３０）と、１：１で混合されたＲＰＭＩ培地中の細胞の、右脇腹への皮下注射により、各ＳＣＩＤマウスにおいて確立した。マウス１匹につき５ｘ１０６個のＢｘＰＣ３細胞を１００μＬの注入量で注入した。
研究
プロトコール１９３
プロトコール１９３の目的は、Ｎ末端ＳＰＬＩＴコンストラクトを使用する２工程ＰＲＩＴ後の、ＳＣ ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける、プレターゲティング２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭについてのｉｎ ｖｉｖｏ分布データを提示することであった。
２工程ＰＲＩＴは、ＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＨ及びＣＥＡ－スプリット－ＤＯＴＡＭ－ＶＬ（Ｐ１ＡＤ８７４９及びＰ１ＡＤ８５９２）を同時注入し、７日後に２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを注入することにより実施した。マウスを、放射性物質注射の６時間後に屠殺し、放射能の測定のために、血液及び臓器を採取した。
研究の概要を、図３０に示す。
研究デザイン
プロトコール１９３の時間経過及びデザインを、下記の表に示す。
Figure 2024504931000054
Figure 2024504931000055
固形異種移植片は、研究０日目に、ＲＰＭＩ／マトリゲル中の細胞５×１０６個（第２８継代）の、右脇腹へのＳＣ注射により、各ＳＣＩＤマウスにおいて確立した。腫瘍細胞注入の１５日後に、マウスを、平均腫瘍体積を２７２ｍｍ３とする実験群に分けた。２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭを、接種後２２日目に注入した；この時点で、平均腫瘍体積は、４００ｍｍ３であった。
全てのマウスを屠殺し、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの注射の６時間後に剖検し、放射性物質の含有量の測定のために、以下の臓器及び組織：血液、皮膚、卵巣、胃、小腸、結腸、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、肺、心臓、大腿骨、筋肉、脳、尾、及び腫瘍を採取した
結果
注射の６時間後における全ての回収組織中の平均２１２Ｐｂ蓄積及びクリアランスを、図３１に提示する。ＣＥＡ一価Ｎ末端ＳＰＬＩＴ（Ｐ１ＡＦ６２４１＋Ｐ１ＡＦ６２３９）によるプレターゲティングにより、１ｇ当たり２４．３±５．４％のＩＤの平均腫瘍取り込みをもたらした。ＣＥＡ二価Ｎ末端ＳＰＬＩＴ（Ｐ１ＡＦ７８８７＋Ｐ１ＡＦ７８８９）は、１ｇ当たり７．１±２．２％のＩＤの平均腫瘍取り込みをもたらした。Ｓｉｄａｋの多重比較検定を使用した二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により、腫瘍２１２Ｐｂ蓄積の差が治療ごとに統計的に有意であることが示された（ｐ＜０．０００１）。この試験を使用した場合、組織蓄積における他の差異は統計的に有意ではなく（ｐ＝０．０５）、どちらのＳＰＬＩＴ対でも予期せぬ取り込みは見られなかった。腎臓への取り込みは、２つの処置群において１ｇ当たり２．７－３．８％のＩＤであった。
有害事象及び毒性
本研究と関連する有害事象又は毒性は見られなかった。
結論
研究結果は、Ｎ末端ＳＰＬＩＴコンストラクトを使用する、ＣＡ非依存型２工程プレターゲティングの概念実証を実証した。正常組織への放射能の蓄積はほとんどなく、２１２Ｐｂ－ＤＯＴＡＭの高度且つ特異的な腫瘍への取り込みが達成された。
上述の発明を、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によって、ある程度詳細に説明してきたが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。

Claims (88)

  1. ｉ）
    ａ）抗原結合部分であって、標的抗原に結合する、抗原結合部分；
    ｂ）エフェクター部分に対する抗原結合部位の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むか又はそれからなるポリペプチド；及び
    ｃ）２つのサブユニットを含むＦｃドメイン
    を含む第１の抗体であって、
    ここで、（ｂ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ａ）の抗原結合部分のＣ末端に融合しており、且つそのＣ末端によって（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
    該第１の抗体は、エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＬドメインを含まない、第１の抗体；と
    ｉｉ）
    ｄ）抗原結合部分であって、標的抗原に結合する、抗原結合部分；
    ｅ）エフェクター部分に対する抗原結合部位の抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むか又はそれからなるポリペプチド；及び
    ｆ）２つのサブユニットを含むＦｃドメイン
    を含む第２の抗体であって、
    ここで、（ｅ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ｄ）の抗原結合部分のＣ末端に融合しており、且つそのＣ末端によって（ｆ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；
    該第２の抗体は、エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＨドメインを含まない、第２の抗体と
    を含み；
    第１の抗体の前記ＶＨドメイン及び第２の抗体の前記ＶＬドメインは、一緒になってエフェクター部分に対する機能的抗原結合部位を形成することができる
    抗体のセット。
  2. （ａ）の抗原結合部分及び（ｄ）の抗原結合部分がＦａｂである、請求項１に記載の抗体のセット。
  3. 第１の抗体及び第２の抗体が１アーム抗体である、請求項１又は請求項２に記載の抗体のセット。
  4. 第１の抗体及び第２の抗体が、標的抗原に対して単一特異性及び一価である、請求項３に記載の抗体のセット。
  5. 第１の抗体は以下のポリペプチド：
    ｉ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＨドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含むポリペプチド；
    ｉｉ）Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）；並びに
    ｉｉｉ）Ｆｃサブユニットポリペプチド（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）
    を含み；
    ここで、（ｉ）のＦａｂ重鎖及び（ｉｉ）のＦａｂ軽鎖は、標的抗原に結合することができるＦａｂ断片を形成し；且つ
    第２の抗体は以下のポリペプチド：
    ｉｖ）Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆａｂ重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１）；任意のリンカー；エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＬドメイン；任意のリンカー；及びＦｃサブユニット（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）を含むポリペプチド；
    ｖ）Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド（例えば、ＶＬ－ＣＬ）；並びに
    ｖｉ）Ｆｃサブユニットポリペプチド（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３）
    を含み；
    ここで、（ｉｖ）のＦａｂ重鎖及び（ｖ）のＦａｂ軽鎖は、標的抗原に結合することができるＦａｂ断片を形成する
    請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  6. 第１の抗体が、標的抗原に結合するさらなる抗原結合部分を含む、請求項１又は請求項２に記載の抗体のセット。
  7. 第１の抗体のさらなる抗体部分が、（ａ）の抗原結合部分と同じ標的抗原に結合する、請求項６に記載の抗体のセット。
  8. 第２の抗体が、標的抗原に結合するさらなる抗原結合部分を含む、請求項１、２、６又は７のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  9. 第２の抗体のさらなる抗原結合部分が、（ｄ）の抗原結合部分と同じ標的抗原に結合する、請求項８に記載の抗体のセット。
  10. 第１の抗体は、
    ａ）第１のＦａｂ断片であって、該Ｆａｂ断片が、標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する、第１のＦａｂ断片；
    ｂ）エフェクター部分に対する抗原結合部位の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むか又はそれからなるポリペプチド；並びに
    ｃ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
    を含み、
    ここで、（ｂ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ａ）のＦａｂ断片の鎖の１つのＣ末端に融合しており、且つそのＣ末端によって（ｃ）のＦｃドメインの第１サブユニットのＮ末端に融合しており；
    さらに、標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する第２のＦａｂ断片を含み、第２のＦａｂは、その鎖の１つのＣ末端によって（ｃ）のＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しており；
    第２の抗体は、
    ｄ）第１のＦａｂ断片であって、該Ｆａｂ断片が、標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する、第１のＦａｂ断片；
    ｅ）エフェクター部分に対する抗原結合部位の抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むか又はそれからなるポリペプチド；並びに
    ｆ）第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン、
    を含み、
    ここで、（ｅ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ｄ）のＦａｂ断片の鎖の１つのＣ末端に融合しており、且つそのＣ末端によって（ｆ）のＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており；
    さらに、標的細胞の表面上に発現される抗原に結合する第２のＦａｂ断片を含み、第２のＦａｂは、その鎖の１つのＣ末端によって（ｆ）のＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、
    該第２の抗体は、エフェクター部分に対する抗原結合部位のＶＨドメインを含まず；
    第１の抗体の前記ＶＨドメイン及び第２の抗体の前記ＶＬドメインは、一緒になってエフェクター部分に対する機能的抗原結合部位を形成することができる
    請求項６～９のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  11. ＦｃドメインがＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  12. Ｆｃ領域が、Ｆｃエフェクター機能を低減させるか又は排除するように操作されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  13. 第１の抗体では、（ｂ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ａ）のＦａｂ断片の鎖の１つのＣ末端にリンカーを介して融合しており、且つそのＣ末端によって（ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端にリンカーを介して融合しており；
    第２の抗体では、（ｅ）のポリペプチドは、そのＮ末端によって（ｄ）のＦａｂ断片の鎖の１つのＣ末端にリンカーを介して融合しており、且つそのＣ末端によって（ｆ）のＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端にリンカーを介して融合している
    請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  14. リンカーが、１０～７０、１０～６０、１０～５０アミノ酸、又は１５～３０アミノ酸の柔軟なリンカーである、請求項１３に記載の抗体のセット。
  15. リンカーが、Ｇｌｙ及びＳｅｒから選択される１５～３０個の連続する残基、任意選択で、Ｇｌｙ及びＳｅｒから選択される１５～２５個の連続する残基、任意選択で、Ｇｌｙ及びＳｅｒから選択される１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４個の連続する残基を含む柔軟なリンカーである、請求項１３に記載の抗体のセット。
  16. リンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号１４８）若しくはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１４９）若しくはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号１５０）、任意選択でＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号１４８）若しくはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号１５０）であるか、又はそれを含む、請求項１５に記載の抗体のセット。
  17. エフェクター部分が、薬物、細胞毒素、造影剤又は放射性標識化合物から選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  18. エフェクター部分が放射性標識化合物である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  19. 放射性標識化合物が放射性標識ＤＯＴＡ又はその塩若しくは機能的バリアントを含む、請求項１８に記載の抗体のセット。
  20. 放射性標識化合物が、Ｌｕ又はＹの放射性同位体で放射性標識されたＤＯＴＡ又はその塩若しくは機能的バリアントである、請求項１９に記載の抗体のセット。
  21. 放射性標識化合物に対する抗原結合部位のＶＨドメインが、（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、請求項１９又は２０に記載の抗体のセット。
  22. 放射性標識化合物に対する抗原結合部位のＶＨドメインが、配列番号４１、又は配列番号４１に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、そのバリアントのアミノ酸配列を含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  23. 放射性標識化合物に対する抗原結合部位のＶＬドメインが、（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；（ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  24. 放射性標識化合物に対する抗原結合部位のＶＬドメインが、配列番号４２、又は配列番号４２に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、そのバリアントのアミノ酸配列を含む、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  25. 放射性標識化合物がＰｂ－ＤＯＴＡＭを含む、請求項１８に記載の抗体のセット。
  26. Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する機能的結合部位が、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ以下、例えば、０．９ｐＭ以下、０．８ｐＭ以下、０．７ｐＭ以下、０．６ｐＭ以下又は０．５ｐＭ以下の結合親和性のＫＤ値で結合する、請求項２５に記載の抗体のセット。
  27. Ｐｂ－ＤＯＴＡＭに対する機能的結合部位が、Ｐｂ－ＤＯＴＡＭ及びＢｉ－ＤＯＴＡＭに結合する、請求項２５又は請求項２６に記載の抗体のセット。
  28. 放射性標識化合物に対する抗原結合部位のＶＨドメインが、
    ａ）アミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２）、又は配列番号２において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み、これらの置換は、Ｐｈｅ５０、Ａｓｐ５６及び／又はＴｙｒ５８を含まず、任意選択で、Ｇｌｙ５２及び／又はＡｒｇ５４も含まない、重鎖ＣＤＲ２；
    ｂ）アミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）、又は配列番号３において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み、これらの置換は、Ｇｌｕ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｐｒｏ９８を含まず、任意選択で、Ａｌａ１００Ｃ、Ｔｙｒ１００Ｄ、及び／若しくはＰｒｏ１００Ｅも含まず、且つ／又は、任意選択で、Ｔｙｒ９９も含まない、重鎖ＣＤＲ３；
    並びに、任意選択で、
    ｃ）アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）、又は配列番号１において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ１である、重鎖ＣＤＲ１
    を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  29. 放射性標識化合物に対する抗原結合部位のＶＨドメインが、（ａ）ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、請求項２８に記載の抗体のセット。
  30. 放射性標識化合物に対する抗原結合部位のＶＨドメインが、配列番号７及び配列番号９、又は配列番号７又は配列番号９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそれらのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  31. 放射性標識化合物に対する抗原結合部位のＶＬドメインが、
    ｄ）アミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）、又は配列番号４において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み、これらの置換はＴｙｒ２８及び／又はＡｓｐ３２を含まない、軽鎖ＣＤＲ１；
    ｅ）アミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）、又は配列番号６において、最大で、１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み、これらの置換はＧｌｙ９１、Ｔｙｒ９２、Ａｓｐ９３、Ｔｈｒ９５ｃ及びＴｙｒ９６を含まない、軽鎖ＣＤＲ３、
    並びに、任意選択で、
    ｆ）アミノ酸配列ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）、又は配列番号５において少なくとも１つ、２つ若しくは３つの置換を有するそのバリアントを含み、任意選択で、Ｇｌｎ５０を含まない、軽鎖ＣＤＲ２
    である、軽鎖ＣＤＲ２
    を含む、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  32. 放射性標識化合物に対する抗原結合部位のＶＬドメインが、（ｄ）ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む、請求項３１に記載の抗体のセット。
  33. 放射性標識化合物に対する抗原結合部位のＶＬドメインが、配列番号８、又は配列番号８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントのアミノ酸配列を含む、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  34. 第１の抗体及び第２の抗体が同じ標的抗原に結合する、請求項１～３３のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  35. 第１の抗体及び第２の抗体が、同じ標的抗原の同じエピトープに結合する、請求項３４に記載の抗体のセット。
  36. 第１の抗体及び第２の抗体が、同じ標的抗原の異なるエピトープに結合する、請求項３４に記載の抗体のセット。
  37. 標的抗原が腫瘍関連抗原である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  38. 標的抗原が、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＥＧＰ－１（トロホブラスト－２としても知られる上皮糖タンパク質－１）、結腸特異的抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）、膵臓ムチンＭＵＣ１、ＧＰＲＣ５Ｄ及びＦＡＰからなる群から選択される、請求項１～３７のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  39. 標的抗原が、ＣＥＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、及びＦＡＰからなる群から選択される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  40. 標的抗原がＣＥＡである、請求項１～３９のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  41. 第１の抗体が、
    （ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；並びに
    （ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０に記載の抗体のセット。
  42. 第１の抗体が、配列番号２５、又は配列番号２５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０又は請求項４１に記載の抗体のセット。
  43. 第１の抗体が、配列番号２６、又は配列番号２６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  44. 第１の抗体が、（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；並びに（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０に記載の抗体のセット。
  45. 第１の抗体が、配列番号４９、又は配列番号４９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０又は４４に記載の抗体のセット。
  46. 第１の抗体が、配列番号５０、又は配列番号５０に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０、４４又は４５のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  47. 第１の抗体が、
    （ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；並びに
    （ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０に記載の抗体のセット。
  48. 第１の抗体が、配列番号１７、又は配列番号１７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０又は４７に記載の抗体のセット。
  49. 第１の抗体が、配列番号１８、又は配列番号１８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０、４７又は４８のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  50. 第１の抗体が、
    （ａ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；並びに
    （ｄ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０に記載の抗体のセット。
  51. 第１の抗体が、配列番号６５、又は配列番号６５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０又は請求項５０に記載の抗体のセット。
  52. 第１の抗体が、配列番号６６、又は配列番号６６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０、５０又は５１のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  53. 第１の抗体が、（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１１７若しくは１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；並びに（ｄ）配列番号１２０、１２１若しくは１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１２３、１２４若しくは１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０に記載の抗体のセット。
  54. 第１の抗体が、配列番号１２９、１３０、１３１、１３２、１３３若しくは１３４、又はこれらに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、１３９若しくは１４０、又はこれらに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０又は５３に記載の抗体のセット。
  55. 第１の抗体が、
    （ａ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
    （ｂ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
    （ｃ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
    （ｄ）配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
    （ｅ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
    （ｆ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
    （ｇ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
    を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０、５３又は５４に記載の抗体のセット。
  56. 第２の抗体が、
    （ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；並びに
    （ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０～５５のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  57. 第２の抗体が、配列番号２５、又は配列番号２５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０～５６のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  58. 第２の抗体が、配列番号２６、又は配列番号２６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０～５７のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  59. 第２の抗体が、（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；並びに（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０～５５のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  60. 第２の抗体が、配列番号４９、又は配列番号４９に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０～５５又は５９のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  61. 第２の抗体が、配列番号５０、又は配列番号５０に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０～５５、５９又は６０のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  62. 第２の抗体が、
    （ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；並びに
    （ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０～５５のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  63. 第２の抗体が、配列番号１７、又は配列番号１７に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０～５５又は６２のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  64. 第２の抗体が、配列番号１８、又は配列番号１８に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０～５５、６２又は６３のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  65. 第２の抗体が、
    （ａ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；並びに
    （ｄ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０～５５のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  66. 第２の抗体が、配列番号６５、又は配列番号６５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０～５５又は６５のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  67. 第２の抗体が、配列番号６６、又は配列番号６６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む、ＣＥＡに対する抗原結合部位を含む、請求項４０～５５、６５又は６６のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  68. 第２の抗体が、（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１１７若しくは１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；並びに（ｄ）配列番号１２０、１２１若しくは１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１２３、１２４若しくは１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０～５５のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  69. 第２の抗体が、配列番号１２９、１３０、１３１、１３２、１３３若しくは１３４、又はこれらに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、１３９若しくは１４０、又はこれらに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０～５０又は６８のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  70. 第２の抗体が、
    （ａ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
    （ｂ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
    （ｃ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
    （ｄ）配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
    （ｅ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
    （ｆ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は
    （ｇ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
    を含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項４０～５５、６８又は６９に記載の抗体のセット。
  71. 第１の抗体が、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の抗体であり、第２の抗体が、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の抗体である、請求項４０に記載の抗体のセット。
  72. 第１の抗体及び第２の抗体が、配列番号２６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン、及び配列番号２５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む、ＣＥＡに結合する抗原結合部位を含む、請求項７１に記載の抗体のセット。
  73. 第１の抗体及び第２の抗体が、標的抗原に対して単一特異性及び一価である、請求項７１又は７２に記載の抗体のセット。
  74. 第１の抗体及び第２の抗体がそれぞれ、配列番号２６に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン、及び配列番号２５に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む、ＣＥＡに結合する２つの抗原結合部位を含む、請求項７３に記載の抗体のセット。
  75. 第１の抗体が、配列番号１４６の第１の重鎖；配列番号１４４の第２の重鎖；及び配列番号１４３の軽鎖を含み；且つ／又は
    第２の抗体が、配列番号１４５の第１の重鎖；配列番号１４４の第２の重鎖；及び配列番号１４３の軽鎖を含む
    請求項１又は７２に記載の抗体のセット。
  76. 第１の抗体が、配列番号１４６の第１の重鎖ポリペプチド；配列番号１４７の第２の重鎖ポリペプチド；並びに配列番号１４３の第１及び第２の軽鎖ポリペプチドを含み；且つ／又は
    第２の抗体が、配列番号１４５の第１の重鎖ポリペプチド；配列番号１４７の第２の重鎖ポリペプチド；並びに配列番号１４３の第１及び第２の軽鎖ポリペプチドを含む
    請求項１又は請求項７４に記載の抗体のセット。
  77. 請求項１～７６のいずれか一項に記載の抗体のセットを発現する核酸のセット。
  78. 請求項７７に記載の核酸のセットを含む、発現ベクター又は発現ベクターのセット。
  79. 請求項７８に記載の発現ベクター又は発現ベクターのセットを含む、宿主細胞又は宿主細胞のセット。
  80. 放射免疫療法をプレターゲティングする方法であって、
    ｉ）対象に、請求項１～７６のいずれか一項に記載の抗体のセットを投与することであり、第１の抗体及び第２の抗体が、いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に投与され、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化し；第１の抗体と第２の抗体との会合が、放射性標識化合物に対する機能的結合部位を形成する、請求項１～７６のいずれか一項に記載の抗体のセットを投与すること；
    及び
    ｉｉ）続いて、放射性標識化合物に対する機能的結合部位に結合する放射性標識化合物を投与すること
    を含む、方法。
  81. 除去剤又はブロッキング剤を投与する工程を含まない、請求項８０に記載の方法。
  82. 対象が、ヒトである、請求項８０又は８１に記載の方法。
  83. 標的抗原が、がん又は腫瘍関連抗原であり、方法が腫瘍又はがんの放射免疫療法の方法である、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 請求項８０～８３のいずれか一項に記載の放射免疫療法をプレターゲティングする方法における使用のための、請求項１～７６のいずれか一項に記載の抗体のセット。
  85. 放射線イメージングのために、放射性同位体を組織又は臓器に標的化する方法であって、
    ｉ）対象に、請求項１～７６のいずれか一項に記載の抗体のセットを投与することであり、第１の抗体及び第２の抗体が、いずれかの順序で、同時に、又は逐次的に投与され、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化し、第１の抗体と第２の抗体との会合が、放射性標識化合物に対する機能的結合部位を形成する、請求項１～７６のいずれか一項に記載の抗体のセットを投与すること；
    並びに
    ｉｉ）続いて、放射性標識化合物に対する機能的結合部位に結合する放射性標識化合物を投与すること
    を含む、方法。
  86. 除去剤又はブロッキング剤を投与する工程を含まない、請求項８５に記載の方法。
  87. イメージングする工程をさらに含む、請求項８５又は８６に記載の方法。
  88. 標的抗原が、がん又は腫瘍関連抗原であり、方法が腫瘍又はがんをイメージングする方法である、請求項８７に記載の方法。
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