JP2023551911A - アンジェルマン症候群の治療のための組成物及びその使用 - Google Patents

Abstract

ＵＢＥ３Ａコード配列を含むベクターゲノムを有するｒＡＡＶが提供される。また、ニューロンにＵＢＥ３Ａ発現が欠損している患者における、アンジェルマン症候群（ＡＳ）の１つ以上の症状を治療するための方法であって、ＵＢＥ３Ａをコードする核酸配列を有するｒＡＡＶを送達することを含む、方法も提供される。【選択図】なし

Description

アンジェルマン症候群（ＡＳ）は、世界中の５０万人に影響を及ぼす稀な遺伝性疾患である。ＡＳの主な症状としては、知的障害、運動機能障害、運動失調、失語症、重度の発作、及び特徴的な挙動特徴が挙げられる。ＡＳを有するほとんどの個体は、分解のために標的とするユビキチンを基質に連結するＨＥＣＴ Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードする、母系遺伝のＵＢＥ３Ａ対立遺伝子の機能喪失を呈する。ＡＳ症例のうちの６５～７０％は、母系染色体１５ｑ１１～ｑ１３のデノボ欠失を含むクラスＩ変異から生じる［Ａｎｇｅｌｍａｎ Ｈ．，Ｐｕｐｐｅｔ’ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ａ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｔｈｒｅｅ ｃａｓｅｓ，Ｄｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ，１９６５，７：６８１－８８、Ｍｅｒｔｚ ＬＧ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ Ｄｅｎｍａｒｋ．Ｂｉｒｔｈ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｉｎｄｉｎｇｓ，ａｎｄ ａｇｅ ａｔ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ，２０１３，１６１Ａ（９）：２１９７－２２０３，ｅｐｕｂ Ａｕｇｕｓｔ ２，２０１３、Ｃｌａｙｔｏｎ－Ｓｍｉｔｈ Ｊ．，ａｎｄ Ｌａａｎ Ｌ．，Ａｎｇｅｌｍａｎ
ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｙｐｅｓ，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ，２００３，４０（２）：８７－９５，ｐｕｂ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １，２００３、Ｋｈａｔｒｉ Ｎ ａｎｄ Ｍａｎ Ｈ，Ｔｈｅ Ａｕｔｉｓｍ ａｎｄ Ａｎｇｅｌｍａｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｂｅ３Ａ／Ｅ６ＡＰ：Ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｅ３ Ｌｉｇａｓｅ Ｕｂｉｑｕｉｎａｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００９，１２（１０９）：１－１２，ｅｐｕｂ Ａｐｒｉｌ ３０，２０１９］。

マウスにおける３つのＵＢＥ３Ａアイソフォームについて記載されており、アイソフォーム２及び３がマウスにおける主要なＵＢＥ３Ａスプライスバリアントとして同定されている。（Ｖａｌｌｕｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａ ｃｏｄｉｎｇ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｕｂｅ３ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｄｕｒｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１５，１８（５）：６６６－６７３，ｅｐｕｂ Ａｐｒｉｌ １３，２０１５、Ｔｒｅｚｚａ ＲＡ ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｓｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ＵＢＥ３ａ ｃａｕｓｅｓ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１９，２２（８）：１２３５－１２４７，ｅｐｕｂ Ｊｕｎｅ ２４，２０１９、Ｚａｍｐｅｔａ ＦＩ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＵＢＥ３ａ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｉｓ
ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｂｙ ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｓｏｆｏｒｍｓ，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，２０２０，２９（１８）：３０３２－３０４３，ｅｐｕｂ
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２，２０２０）。ｈＵＢＥ３Ａアイソフォーム１の喪失は、「軽度の」アンジェルマン症候群を有する個人に生じ（Ｓａｄｈｗａｎｉ，Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｗｏ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｗｉｔｈ ｕｎｕｓｕａｌｌｙ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｃａｒｒｙ ａ ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ＵＢＥ３ａ ｉｓｏｆｏｒｍ，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ，２０１８，１７６（７）：１６４１－１６４７，ｅｐｕｂ Ｍａｙ ７，２０１８）、依然として核ｈＵＢ
Ｅ３Ａアイソフォーム３及び細胞質ｈＵＢＥ３Ａアイソフォーム２を発現する。

現在、ＡＳの治療法は存在しない。現在の治療は、緩和的であり、発作を含む医学的問題及び進行に関する問題の管理に焦点を当てている。治療選択肢が存在しないことは、ＡＳの新規治療に対する重要な満たされていないニーズを強調している。

ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１に基づく、有用かつ耐容性の高い新規のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子置き換え療法が本明細書で提供される。組成物及び方法は、アンジェルマンの動物モデルにおいて評価されるように、アンジェルマン症候群（ＡＳ）に関連する運動欠陥及び挙動欠陥を緩和することができる。一実施形態では、組成物は、ＡＳの治療に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のストックを含み、ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムと、を含み、当該ベクターゲノムが、（ａ）ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）配列番号９、又はそれと９５％同一のＵＢＥ３Ａアイソフォーム１タンパク質をコードする配列（配列番号２）を含む、ＵＢＥ３Ａ核酸配列であって、核酸が、ヒト細胞においてＵＢＥ３Ａタンパク質の発現を調節する調節要素に操作可能に連結している、ＵＢＥ３Ａ核酸配列、（ｃ）（ｂ）のＵＢＥ３Ａの発現を指示する調節要素、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、調節要素は、ニューロン特異的プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、ニューロン特異的プロモーターは、シナプシンプロモーターである。ある特定の実施形態では、シナプシンプロモーターは、配列番号１２の核酸配列を有する短縮されたプロモーターである。ある特定の実施形態では、調節要素は、構成的プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、調節要素は、１つ以上のエンハンサー及び１つ以上のイントロンを更に含む。ある特定の実施形態では、調節配列は、ｍｉＲ１８２（配列番号２０）及び／又はｍｉＲ１８３（配列番号１１）の１つ以上の標的化配列を更に含み、当該標的化配列は、ＵＢＥ３Ａ核酸配列に操作可能に連結されている。ある特定の実施形態では、調節配列は、ｍｉＲ１８２及び／又はｍｉＲ１８３から選択されるｍｉＲの１つ以上の標的化配列を更に含み、当該標的化配列は、ＵＢＥ３Ａ核酸配列の下流に位置する。ある特定の実施形態では、調節配列は、ｍｉＲ１８３の４つの標的化配列を更に含み、当該標的化配列は、ＵＢＥ３Ａ核酸配列の下流に位置する。ある特定の実施形態では、調節配列は、配列番号１１の４つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、配列番号１４又は配列番号１６の核酸配列の発現から生成されるＡＡＶｈｕ６８カプシドである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ９１カプシドである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、配列番号１７又は配列番号１９の核酸配列から発現されるＡＡＶｒｈ９１カプシドである。ある特定の実施形態では、組成物は、生理学的に適合する担体、緩衝液、アジュバント、及び／又は希釈剤を更に含む水性懸濁液である。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、アンジェルマン症候群を有する患者の治療における使用に有用である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、アンジェルマン症候群の１つ以上の症状の治療に有用であり、任意選択的に、症状が、発育遅延、知的障害、重度の言語障害、運動失調、及び／又はてんかんのうちの１つ以上から選択される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される発現カセットの送達を介して、ニューロンにＵＢＥ３Ａ発現が欠損している患者におけるアンジェルマン症候群（ＡＳ）の１つ以上の症状を治療するための方法が提供される。ある特定の実施形態では、発現カセットは、発育遅延、知的障害、重度の言語障害、運動失調、及び／又はてんかんのうちの１つ以上から選択される症状を治療する。ある特定の実施形態では、組成物は、患者への髄腔内送達のために提供される。ある特定の実施形態では、患者は、少なくとも１×１０^１０～１×１０^１３ＧＣ／ｋｇの操作されたＵＢＥ３Ａコード配列を
担持するｒＡＡＶを注射される。

ある特定の実施形態では、本方法は、発育遅延、知的障害、重度の言語障害、運動失調、及び／又はてんかんのうちの１つ以上を含む、アンジェルマン疾患の症状の改善を提供する。

これらの方法及び組成物の他の態様及び利点が、以下の詳細な説明において更に説明される。

後根神経節の発現及び毒性を調節するための、ｍｉＲ配列を含まない発現カセット及びベクターゲノムの概略図を提供する。図１Ａは、５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＡＡＶ ＩＴＲがｈＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１の発現カセットに隣接する、ベクターゲノムの概略図を提供する。発現カセットは、修飾されたシナプシンプロモーター制御下の操作されたｈＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１コード配列（８５２アミノ酸をコードする；配列番号２）を含有する。ｈＵＢＥ３Ａコード配列は、Ｕｂｅ３Ａリガーゼ（ＡＺＵＬ）のアミノ末端ジンクフィンガー、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン２（ＨＥＲＣ２）、Ｅ６タンパク質結合ドメイン（Ｅ６ＢＤ）、並びにＥ６－ＡＰカルボキシル末端相同領域（ＨＥＣＴ）、並びにＳＶ４０ポリＡを含む。図１Ｂは、ＡＡＶ ＩＴＲがｈＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム２の発現カセットに隣接する、ベクターゲノムの概略図を提供する。コードされたアイソフォーム２タンパク質は、８７５アミノ酸長（配列番号６）である。図１Ｃは、ＡＡＶ ＩＴＲがｈＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム３の発現カセットに隣接する、ベクターゲノムの概略図を提供する。コードされたアイソフォーム３タンパク質は、８７２アミノ酸長（配列番号２１）である。 非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における、ｍｉＲ１８３（４ｘｍｉＲ１８３）標的配列の４つのコピーを含む（薄い丸印）か、又は４ｘｍｉＲ１８３配列を含まない（濃い配列）、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１のベクター生体分布及びｍＲＮＡ発現の評価の結果を示す。図２Ａは、小脳、尾状核、海馬、前頭皮質、後頭皮質、髄質、頭頂皮質、側頭皮質、視床、頸髄ＤＲＧ、胸髄ＤＲＧ、腰髄ＤＲＧ、頸髄脊髄、胸髄脊髄、腰髄脊髄におけるゲノムコピー（ＧＣ）／二倍体ゲノムで測定した、ＮＨＰにおけるＵＢＥ３Ａアイソフォーム１ベクターの生体分布を示す。図２Ｂは、ＮＨＰの脊髄及びＤＲＧにおける、ｍｉＲ１８３（４ｘｍｉＲ１８３）標的配列の４つのコピーを含む（薄い丸印）か、又は４ｘｍｉＲ１８３配列を含まない（濃い配列）、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１で治療後の、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１ ｍＲＮＡ発現を示す。図２Ｃは、小脳、尾状核、海馬、前頭皮質、後頭皮質髄質、頭頂皮質、側頭皮質、視床、頸髄ＤＲＧ、胸髄ＤＲＧ、腰髄ＤＲＧ、頸髄脊髄、胸髄脊髄、腰髄脊髄、大脳（陰性対照）におけるＵＢＥ３Ａアイソフォーム１を示す。 （３～４歳の）アカゲザルにおいて、ＡＡＶｈｕ６８－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１±４ｘｍｉＲ１８３ベクターが、顕著な後根神経節（ＤＲＧ）毒性を引き起こさないことを示す。ｈＵＢＥ３Ａ－１（群１）又はｈＵｂｅ３ａ－１－４ｘｍｉＲ１８３（群２）ベクターは、３×１０^１３ＧＣ／動物の用量での大槽（ＩＣＭ）投与の３５日後のアカゲザルにおいて、顕著なＡＡＶ誘導性後根神経節毒性を引き起こさない。ＤＲＧ関連毒性は、群１動物１９２２８５の脊髄及び末梢神経においてのみ観察された。両群にわたって、動物のＤＲＧは、普通であり（図３Ａ）、散発的な最小限の単核細胞浸潤（図３Ｂ、丸印）のみを有し、神経変性の証拠は存在しなかった（３／３匹の動物、群１；３／３匹の動物、群２）。 （３～４歳の）アカゲザルの末梢神経におけるｒＡＡＶｈｕ６８．シナプシン－ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１の影響を示す。後肢神経における最小限の局所性軸索障害の影響（矢印）。図４Ａは、末梢神経における動物ＡＡＶｈｕ６８．シナプシン－ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１を示す。図４Ｂは、動物１９２２７５及び１９２２９７が、前肢の右正中神経に軽度の多巣性軸索障害（矢印）及び単核細胞浸潤（楕円）を呈した１９２２８５を呈したこと示す。 治療されたＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}新生児マウスにおけるＵＢＥ３Ａタンパク質陽性ニューロンの定量化を示す。治療は、脳室内（ＩＣＶ）を介した１×１０^１１ＧＣ／動物の用量でのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１の投与で構成される。皮質、海馬、視床、視床下部、及び中脳において、（それぞれのＷＴ組織におけるＵＢＥ３Ａ陽性ニューロンに正規化して）ニューロンの４２～６８％がＵＢＥ３Ａタンパク質を発現した。 治療されたＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}新生児マウスにおけるＵＢＥ３Ａタンパク質陽性ニューロンの定量化を示す。治療は、脳室内（ＩＣＶ）を介した１×１０^１０ＧＣ／動物の用量でのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１の投与を含んでいた。皮質、海馬、視床、視床下部、及び中脳において、（それぞれのＷＴ組織におけるＵＢＥ３Ａ陽性ニューロンに正規化して）ニューロンの２０～５０％がＵＢＥ３Ａタンパク質を発現した。 （ＮＨＰ－１、－２、－３；３５日間の研究において）３匹の治療された非ヒト霊長類由来の後根神経節（頸髄、胸髄、及び腰髄セグメント）における、操作されたヒトＵＢＥ３Ａアイソフォーム１（ｈＵＢＥ３Ａ－１）転写物局在化の蛍光画像を示す。治療は、大槽（ＩＣＭ）経路を介した３×１０^１３ＧＣ／動物の用量でのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１の投与を含んでいた。目的の領域の画像を様々な倍率で撮影し、２０倍の倍率の画像を提示している。図７Ａは、ＮＨＰ－１由来の後根神経節の頸髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｂは、ＮＨＰ－２由来の後根神経節の頸髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｃは、ＮＨＰ－３由来の後根神経節の頸髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｄは、ＮＨＰ－１由来の後根神経節の胸髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｅは、ＮＨＰ－２由来の後根神経節の胸髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｆは、ＮＨＰ－３由来の後根神経節の胸髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｇは、ＮＨＰ－１由来の後根神経節の腰髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｈは、ＮＨＰ－２由来の後根神経節の腰髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｉは、ＮＨＰ－３由来の後根神経節の腰髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。 ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎ－ｈＵＢＥ３Ａ－ｉｓｏ１を用いたＩＣＶ注射後のＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}及び野生型マウスの脳における、操作されたＵＢＥ３Ａアイソフォーム１の発現を示す。 新生児野生型又はＡＳ（ＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}）マウスに、動物当たり１×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）の用量でＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１又はアイソフォーム２ベクターのいずれかを脳室内（ＩＣＶ）注射した後、８～１０週齢で実施した運動協調性挙動試験の結果を示す。図９Ａは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後の、ＷＴ及びＡＳマウスにおける運動協調性を示す。図９Ｂは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム２での治療後の、ＷＴ及びＡＳマウスにおける運動協調性を示す。 新生児野生型又はＡＳ（ＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}）マウスに、動物当たり１×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）の用量でＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１又はアイソフォーム２ベクターのいずれかを脳室内（ＩＣＶ）注射した後、８～１０週齢で実施した巣構築能力挙動試験の結果を示す。図１０Ａは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後の、ＷＴ及びＡＳマウスにおける巣構築スコアを示す。図１０Ｂは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後の、ＷＴ及びＡＳマウスによる未使用の巣材のパーセンテージを示す。図１０Ｃは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム２での治療後の、ＷＴ及びＡＳマウスにおける巣構築スコアを示す。図１０Ｄは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム２での治療後の、ＷＴ及びＡＳマウスによる未使用の巣材のパーセンテージを示す。 新生児野生型又はＡＳ（ＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}））マウスに、動物当たり１×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）の用量でＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１ベクターを脳室内（ＩＣＶ）注射した後、８～１０週齢で実施したキャットウォーク（歩長及び歩行改善）挙動試験の結果を示す。図１１Ａは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後の、ＷＴ及びＡＳマウスにおける右後（ＲＨ）肢の歩長を示す。図１１Ｂは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後の、ＷＴ及びＡＳマウスにおける左後（ＬＨ）肢の歩長を示す。図１１Ｃは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後の、ＷＴ及びＡＳマウスにおける右後（ＲＨ）肢の歩長を示す。図１１Ｄは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後の、ＷＴ及びＡＳマウスにおける左後（ＬＨ）肢の歩長を示す。 大槽（ＩＣＭ）経路を介した、３×１０^１３ＧＣ／動物の用量でのＡＡＶ－ｈｕ６８－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後３５日後のＮＨＰの後根神経節（ｄｒｇ）における毒性研究の結果を示す（病理学的グレードを０～５でスコアリングしてプロットした）。図１２Ａは、ＮＨＰのＤＲＧの頸髄セグメントにおけるスコア化された病理学的グレードを示す。図１２Ｂは、ＮＨＰのＤＲＧの胸髄セグメントにおけるスコア化された病理学的グレードを示す。図１２Ｃは、ＮＨＰのＤＲＧの腰髄セグメントにおけるスコア化された病理学的グレードを示す。 大槽（ＩＣＭ）経路を介した、３×１０^１３ＧＣ／動物の用量でのＡＡＶ－ｈｕ６８－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後３５日後のＮＨＰの脊髄における毒性研究の結果を示す（病理学的グレードを０～５でスコアリングしてプロットした）。図１３Ａは、ＮＨＰの脊髄の頸髄セグメントにおけるスコア化された病理学的グレードを示す。図１３Ｂは、ＮＨＰの脊髄の胸髄セグメントにおけるスコア化された病理学的グレードを示す。図１３Ｃは、ＮＨＰの脊髄の腰髄セグメントにおけるスコア化された病理学的グレードを示す。 大槽（ＩＣＭ）経路を介した、３×１０^１３ＧＣ／動物の用量でのＡＡＶ－ｈｕ６８－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後３５日後のＮＨＰの末梢神経における毒性研究の結果を示す（軸索変性症病理学的グレードを０～５でスコアリングしてプロットした）。 大槽（ＩＣＭ）経路を介した、３×１０^１３ＧＣ／動物の用量でのＡＡＶ－ｈｕ６８－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後１４日及び３５日後の末梢神経伝導研究の結果を示す。図１５Ａは、左正中神経のｍ／秒として測定される速度を示す。図１５Ｂは、ｍＶ単位でピークツーピーク（ＰＰ）振幅を測定した、ＡＡＶ－ｈｕ６８－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後１４及び３５日後の末梢神経伝導研究の結果を示す。図１５Ｃは、ｍＶ単位で負のピーク（ＮＰ）振幅を測定した、ＡＡＶ－ｈｕ６８－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１での治療後１４日及び３５日後の末梢神経伝導研究の結果を示す。 ＷＴ組織におけるＵＢＥ３Ａ陽性ニューロンに対して正規化された、皮質、海馬、視床、視床下部、及び中脳における陽性ニューロンパーセントとしてプロットした、治療されたＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}新生児マウスにおけるＵＢＥ３Ａアイソフォーム１又はアイソフォーム２タンパク質陽性ニューロンの定量化を示す。治療は、脳室内（ＩＣＶ）を介した１×１０^１１ＧＣ／動物の用量でのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１又はアイソフォーム２の投与を含んでいた。図１６Ａは、治療後のマウスの皮質、海馬、視床、視床下部、及び中脳における、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１陽性ニューロンのパーセントを示す。図１６Ｂは、治療後のマウスの皮質、海馬、視床、視床下部、及び中脳における、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム２陽性ニューロンのパーセントを示す。

本明細書で提供されるのは、（例えば、ｒＡＡＶ媒介性遺伝子置き換え療法を介して）送達された場合、アンジェルマン症候群の症状を治療するレベルでＵＢ３Ａアイソフォーム１を発現する、操作されたＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１コード配列を含有する発現カセットである。ある特定の実施形態では、発現カセットにおける調節要素は、後根神経節（ＤＲＧ）発現及び／又は毒性を調節するために、最大８つ、例えば、４～８つのｍｉＲ１８３配列を含む。ある特定の実施形態では、これらのＤＲＧ脱標的化配列は、高レベルでの発現時及び／又は全身送達が意図される場合に使用するために選択される。他の実施形態では、髄腔内送達が利用される場合に、これらの配列が含まれる。

一実施形態では、発現カセットは、標的ヒト細胞においてＵＢＥ３Ａタンパク質の発現を調節する調節要素に操作可能に連結された、操作されたＵＢＥ３Ａコード（核酸配列）を含む。ある特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａコード配列は、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１タンパク質をコードし、配列番号２に再現される。ｈＵＢＥ３Ａアイソフォーム１タンパク質は、Ｕｂｅ３Ａリガーゼ（ＡＺＵＬ）のアミノ末端ジンクフィンガー、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン２（ＨＥＲＣ２）、Ｅ６タンパク質結合ドメイン（Ｅ６ＢＤ）、並びにＥ６－ＡＰカルボキシル末端相同領域（ＨＥＣＴ）を含む、いくつかのドメインを含む。好適には、操作されたＵＢＥ３Ａアイソフォーム１コード配列は、配列番号９の核酸配列、又はそれに対して少なくとも９５％同一のＵＢＥ３Ａアイソフォーム１タンパク質をコードする配列（配列番号２）である。ある特定の実施形態では、配列は、完全長の配列番号９と１００％同一である。他の実施形態では、配列は、配列番号９と少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、９９．５％同一である。ある特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１コード配列は、５’又は３’末端で切断され、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１タンパク質のカルボキシ又はＮ末端の切断を生じる。

ある特定の実施形態では、配列番号６に再現される、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム２タンパク質をコードするＵＢＥ３Ａコード配列。ｈＵＢＥ３Ａアイソフォーム２タンパク質は、Ｕｂｅ３Ａリガーゼ（ＡＺＵＬ）のアミノ末端ジンクフィンガー、ＨＥＣＴドメイン及びＲＣＣ１様ドメイン２（ＨＥＲＣ２）、Ｅ６タンパク質結合ドメイン（Ｅ６ＢＤ）、並びにＥ６－ＡＰカルボキシル末端相同領域（ＨＥＣＴ）を含む、いくつかのドメインを含む。好適には、操作されたＵＢＥ３Ａアイソフォーム２コード配列は、配列番号１０の核酸配列、又はそれに対して少なくとも９５％同一のＵＢＥ３Ａアイソフォーム２タンパク質をコードする配列（配列番号６）である。ある特定の実施形態では、配列は、完全長の配列番号１０と１００％同一である。他の実施形態では、配列は、配列番号１０と少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、９９．５％同一である。ある特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム２コード配列は、５’又は３’末端で切断され、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム２タンパク質のカルボキシ又はＮ末端の切断を生じる。ある特定の実施形態では、配列番号２１（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｎｏ：Ｑ０５０８６－３）に再現される、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム３タンパク質をコードするＵＢＥ３ａコード配列。

ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＵＢＥ３Ａコード配列を含み、任意選択的に、ＵＢＥ３Ａコード配列が、シグナルペプチドと、機能的ＵＢＥ３Ａタンパク質とを含む、融合タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＵＢＥ３Ａコード配列を含み、任意選択的に、ＵＢＥ３Ａコード配列が、機能的ＵＢＥ３Ａタンパ
ク質に融合された取り込みペプチドを含む、融合タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、任意選択的に、ＵＢＥ３Ａコード配列が、シグナルペプチド及び／又は取り込みペプチドに融合されたＵＢＥ３Ａタンパク質を含む、融合タンパク質をコードする、発現カセットＵＢＥ３Ａコード配列。いくつかの実施形態では、発現カセットは、ＵＢＥ３Ａコード配列を含み、任意選択的に、シグナルペプチド及び／又は取り込みペプチドが、ＵＢＥ３Ａコード配列の５’又は３’のいずれかに位置して、ＵＢＥ３Ａタンパク質のＮ末端にシグナルペプチド及び／若しくは取り込みペプチドを含む融合タンパク質、ＵＢＥ３Ａタンパク質のＣ末端にシグナルペプチド及び／若しくは取り込みペプチドを含む融合タンパク質、又はＵＢＥ３Ａタンパク質のＮ末端にシグナルペプチドを含む融合タンパク質、又はＵＢＥ３Ａタンパク質のＣ末端にシグナルペプチド若しくは取り込みペプチドを含む融合タンパク質、又はそれらの組み合わせをもたらす。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）シグナルペプチドである。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ガウシアシグナルペプチドである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第９，２７９，００７Ｂ２（（対応する国際特許出願第２０１２／０７１４２２号、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）シグナルペプチド）、同第１０，８７４，７５０Ｂ２（対応する国際特許出願第２０１９／２１３１８０Ａ１号、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）シグナルペプチド及びガウシアシグナルペプチド）も、参照されたい。ある特定の実施形態では、任意選択的に、ＵＢＥ３Ａは、発現、分泌、及び細胞取り込みを向上させるペプチドを含む、融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、任意選択的に、ＵＢＥ３Ａは、シスタチンペプチド配列であるペプチドを含む、融合タンパク質である。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ９，５６７，３６９も参照されたい。ある特定の実施形態では、任意選択的に、ＵＢＥ３Ａは、ＨＩＶ ＴＡＴｋペプチド（例えば、ＴＡＴｋ２８、ＴＡＴｋ１１）からの誘導体であるペプチドを含む、融合タンパク質である。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／１２８７４６Ａ２（ＵＳ１０，９０７，１３８Ｂ２）、ＷＯ２０１８／００５６１７Ａ２（ＵＳ２０２１／０２６８０７２）、ＷＯ２０１９／１０８９２４Ａ２、ＷＯ２０２０／２５００８１Ａ１、及びＷＯ２０２１／０８７２８２Ａ１も参照されたい。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ＩＧＦ２ペプチドである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／０７２３７２も参照されたい。ある特定の実施形態では、任意選択的に、ＵＢＥ３Ａは、ペネトラチン、Ｒ６Ｗ３、ＨＩＶ ＴＡＴ、ＨＩＶ ＴＡＴｋ及びｐＶＥＣから選択される細胞取り込み配列を含むペプチドを含む、融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、任意選択的に、ＵＢＥ３Ａは、インスリン、ＧＤＮＦ、及びＩｇＫから選択される分泌配列を含むペプチドを含む、融合タンパク質である。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／００６１０７も参照されたい。

ある特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１発現カセットは、遺伝子置き換え療法単独としての送達のために選択される。ある特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１発現カセットは、１つ以上の他の活性成分を含むレジメン（例えば、短期又は長期酵素補充療法及び／又は基質枯渇療法）における遺伝子置き換え療法としての送達のために選択される。

一実施形態では、組成物は、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１の発現カセットを含む、ベクターを含む。好適なベクター及びベクターゲノムは、本明細書に記載されている。

他の実施形態では、組換えパルボウイルスベクター（例えば、組換えアデノ随伴ウイルス）のストックが提供される。ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムと、を含み、当該ベクターゲノムが、（ａ）ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）配列番号９、又はそれと９５％同一のＵＢＥ３Ａアイソフォーム１タンパク質をコードする配列（配列番号２）を含む、ＵＢＥ３Ａ核酸配列であって、核酸
が、ヒト細胞においてＵＢＥ３Ａタンパク質の発現を調節する調節要素に操作可能に連結している、ＵＢＥ３Ａ核酸配列、（ｃ）（ｂ）のＵＢＥ３Ａの発現を指示する調節要素、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。望ましいＡＡＶカプシドは、中枢神経系（ＣＮＳ）における所望の細胞を標的とするＡＡＶｈｕ６８及びＡＡＶｒｈ９１を含む。

ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムと、を含み、当該ベクターゲノムが、（ａ）ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）任意選択的に、ペプチド（例えば、シグナル又は取り込みペプチド）、（ｃ）配列番号９、又はそれと９５％同一のＵＢＥ３Ａアイソフォーム１タンパク質をコードする配列（配列番号２）を含む、ＵＢＥ３Ａ核酸配列であって、核酸配列が、ヒト細胞においてＵＢＥ３Ａタンパク質の発現を調節する調節要素に操作可能に連結している、ＵＢＥ３Ａ核酸配列、（ｄ）任意選択的に、ペプチド（調節及び／又は取り込みペプチド）、（ｅ）（ｂ）のＵＢＥ３Ａの発現を指示する調節要素、及び（ｆ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＢｉＰシグナルペプチドである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ９，２７９，００７Ｂ２（（対応する国際特許出願第２０１２／０７１４２２号）及びＵＳ１０，８７４，７５０Ｂ２（対応する国際特許出願第２０１９／２１３１８０Ａ１号）も参照されたい。ある特定の実施形態では、調節ペプチドは、ＩＧＦペプチドである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１／０７２３７２も参照されたい。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、インスリン、ＧＤＮＦ、及びＩｇＫから選択される分泌配列を含む、分泌シグナルペプチドである。ある特定の実施形態では、ペネトラチン、Ｒ６Ｗ３、ＨＩＶ
ＴＡＴ、ＨＩＶ ＴＡＴｋ、及びｐＶＥＣから選択される細胞取り込み配列を含む、取り込みペプチド。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／００６１０７も参照されたい。

ある特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａは、任意選択的に、本明細書に記載のシグナルペプチド及び／又は取り込みペプチドを含む、融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、シグナルペプチド及び／又は取り込みペプチドは、アミノ（Ｎ）末端又はカルボキシ（Ｃ）末端のいずれかに位置する。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、アミノ（Ｎ）末端に位置する。ある特定の実施形態では、取り込みペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかに位置する。

本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶの「ストック」は、ｒＡＡＶの集団を指す。脱アミド化に起因するカプシドタンパク質の不均一性にもかかわらず、ストック内のｒＡＡＶは、同一のベクターゲノムを５つ共有することが予想される。ストックは、例えば、選択されたＡＡＶカプシドタンパク質及び選択された産生系に特徴的な不均一な脱アミド化パターンを有するカプシドを有するｒＡＡＶを含み得る。ストックは、単一の産生系から産生され得るか、又は産生系の複数の実行からプールされ得る。本明細書に記載されるものを含むが、これらに限定されない様々な産生系が選択され得る。

本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、及び本出願で使用されている多くの用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、及び「状態」は、対象における異常な状態を示すために互換的に使用される。一実施形態では、疾患は、アンジェルマン症候群（ＡＳ）である。

本明細書で使用される場合、「患者」又は「対象」は、ヒト、獣医学用動物又は農業用
動物、家庭用動物又は愛玩動物、並びに通常臨床研究に使用される動物を含む、男性又は女性の哺乳動物を互換的に意味する。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、ヒト患者である。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、男性又は女性のヒトである。

本明細書及び特許請求の範囲全体を通して使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、及びその変形は、他の成分、要素、整数、ステップなどを含む。逆に、「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語及びその変形は、他の成分、要素、整数、ステップなどを除外する。

「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「ニューロン（ａ ｎｅｕｒｏｎ）」は、１つ以上のニューロンを表すと理解されることを留意されたい。したがって、「１つ（ａ）」（又は「１つ（ａｎ）」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照からプラス又はマイナス１０％の変動を意味する。

ある特定の場合では、「Ｅ＋＃」という用語は、指数を指すために使用される。例えば、５Ｅ１０は、５×１０^１０である。これらの用語は、互換的に使用され得る。

本明細書に記載の核酸配列は、通常の分子生物学技術を使用してクローニングすることができるか、又はＤＮＡ合成によってデノボで生成することができる。本明細書に記載のＵＢＥ３Ａ遺伝子の態様をコードする核酸配列は、組み立てられ、例えば、非ウイルス送達系（例えば、ＲＮＡに基づく系、裸のＤＮＡなど）を生成するために、又はパッケージング宿主細胞内でウイルスベクターを生成するために、及び／又は対象の宿主細胞に送達するために、任意の好適な遺伝子要素、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどに配置され、それらに担持される配列を宿主細胞に導入する。一実施形態では、遺伝子要素は、ベクターである。一実施形態では、遺伝子要素は、プラスミドである。かかる操作された構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

発現カセット
本明細書で使用される場合、「発現カセット」とは、生物学的に有用な核酸配列と、核酸配列（例えば、タンパク質、酵素、又は他の有用な遺伝子産物、ｍＲＮＡなどをコードする遺伝子ｃＤＮＡ）及びその遺伝子産物の転写、翻訳、並びに／若しくは発現を指示又は調節する、それと操作可能に連結された調節配列と、を含む、核酸分子を指す。本明細書で使用される場合、「操作可能に連結された」配列は、核酸配列と連続又は非連続である調節配列及びトランス又はシス核酸配列で作用する調節配列の両方を含む。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、コザック配列、ポリアデニル化配列、及びＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。発現カセットは、他の要素の中で、遺伝子配列の上流（５’～）の調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンなどのうちの１つ以上、及びエンハンサー、又は遺伝子配列の下流（３’～）の調節配列、例えば、ポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含有し得る。ある特定の実施形態では、調節配列は、遺伝子産物の核酸配列と操作可能に連結され、調節配列は、介在する核酸配列、すなわち、５’非翻
訳領域（５’ＵＴＲ）によって、遺伝子産物の核酸配列から分離される。ある特定の実施形態では、発現カセットは、１つ以上の遺伝子産物の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、モノシストロン性又はバイシストロン性発現カセットであり得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、標的細胞に挿入される外因性供給源からの１つ以上のＤＮＡ配列を指す。典型的には、かかる発現カセットは、ウイルスベクターを生成するために使用することができ、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載される遺伝子産物のコード配列、及び本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、２つ以上の発現カセットを含有し得る。

いくつかの実施形態では、コード配列を含む核酸分子は、ＵＢＥ３Ａコード配列であり、プロモーターを更に含み、他のそれらの調節配列を含み得る。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）を生成するために使用され、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載のＵＢＥ３Ａのコード配列、及び本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含有する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶウイルスベクターであり、パッケージングシグナルが、５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＡＡＶ ＩＴＲである。任意選択的に、発現カセット（及びベクターゲノム）は、例えば、後根神経節（ｄｒｇ）毒性及び／又は軸索変性症を低減するために、ＵＴＲに１つ以上のｄｒｇ－ｍｉＲＮＡ標的化配列を含み得る。例えば、２０１９年１２月２０日に出願され、現在ＷＯ２０２０／１３２４５５として公開されている、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／６７８７２、２０２０年５月１２日に出願された、米国仮特許出願第６３／０２３５９３号、及び２０２０年６月１２日に出願された、米国仮特許出願第６３／０３８４８８号を参照されたく、全てが“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｒｇ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”と題され、その全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「操作可能に連結された」又は「操作可能に会合された」という用語は、目的の遺伝子に連続している発現制御配列又は調節要素、及びトランスで、又は離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を指す。

本明細書に記載される場合、調節要素は、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、転写因子、転写終結因子、スプライシング及びポリアデニル化シグナル（ポリＡ）などの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節因子（ＷＰＲＥ）、翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）を含む。

一実施形態では、発現カセットは、ＵＢＥ３Ａを送達するための、遺伝子置き換え系の１つ以上の要素をコードする配列の発現を指示する調節要素を含む。一実施形態では、調節要素は、１つ以上のプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、構成的プロモーター又は調節的プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、組織特異的（例えば、ニューロン特異的）プロモーターである。ある特定の実施形態では、好適なプロモーターとしては、限定されないが、伸長因子１アルファ（ＥＦ１アルファ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ ＤＷ ｅｔ ａｌ，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ
ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ．１９９０ Ｊｕｌ １６；９１（２）：２１７－２３を参照されたい）、シナプシン１プロモーター（例えば、Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ａｒｅａ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｆｅｂ；１０（４）：３３７－４７を参照されたい）、本明細書の実施例に提供されるものなどの短縮されたシナプシンプロモーター（例えば、コード配列については配列番号１２を参照されたい）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＣａＰ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４ Ｆｅｂ；１４５（２）：６１３－９．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｏｃｔ １６を参照されたい）、又はＣＢ６プロモーター（例えば、Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ－９ Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊａｎ；５８（１）：３０－６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３３－０１５－９８９９－５を参照されたい）が挙げられ得る。他の好適なプロモーターとしては、（Ｃ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素、（Ａ）プロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子の第１のエクソン及び第１のイントロン、並びに（Ｇ）ウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む、ＣＡＧプロモーターが挙げられる。例えば、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，Ａｎｎｉｋａ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ９．１（２００８）：２を参照されたい。望ましさは低いが、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、調節可能なプロモーターなどの他のプロモーター（例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい）、又は生理学的キューに応答するプロモーターを使用してもよく、本明細書に記載のベクターに利用してもよい。ある特定の実施形態では、発現カセットは、Ｕ６プロモーターを含む。別の実施形態では、調節要素は、エンハンサーを含む。更なる実施形態では、エンハンサーは、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４エンハンサー、ＡｐｏＥエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、又はＲＳＶエンハンサーのうちの１つ以上から選択される。なお別の実施形態では、調節要素は、イントロンを含む。更なる実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトベータグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、アルファ－グロブリン、ベータ－グロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、又はｐ５３から選択される。一実施形態では、調節要素は、ポリＡを含む。更なる実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡ、又は本明細書の実施例で提供されるものなどのウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０（例えば、コード配列については配列番号１３を参照されたい）、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、若しくは修飾されたＲＧＢ（ｍＲＧＢ）からのものである。別の実施形態では、調節要素は、ＷＰＲＥ配列を含み得る。更に別の実施形態では、調節要素は、コザック配列を含む。

ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号２２の核酸配列、又はそれと少なくとも約９０％同一の、配列番号２のアミノ酸配列を含むＵＢＥ３Ａをコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号２３の核酸配列、又はそれと少なくとも約９０％同一の、配列番号４のアミノ酸配列を含むＵＢＥ３Ａをコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号２４の核酸配列、又はそれと少なくとも約９０％同一の、配列番号６のアミノ酸配列を含むＵＢＥ３Ａをコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号２５の核酸配列、又はそれと少なくとも約９０％同一の、配列番号８のアミノ酸配列を含むＵＢＥ３Ａをコードする配列を含む。

「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、ＲＮＡの産生、タンパク質の産生、又はＲＮＡ及びタンパク質の両方の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」又は「翻訳」という用語は、特に、ペプチド又はタンパク質の産生に関する。発現は、一過性又は安定であり得る。

発現カセットは、任意の好適な送達システムを介して送達することができる。好適な非ウイルス送達系は、当該技術分野において既知であり（例えば、Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；９（１）：ＧＥ０１－ＧＥ０６、参照により本明細書に組み込まれる）、当業者によって容易に選択され得、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、デンドリマー、ＰＬＧＡ、ポリメタクリレート、無機粒子、脂質粒子（脂質ナノ粒子若しくはＬＮＰ）又はキトサンベースの製剤を含み得る。

一実施形態では、ベクターは、非ウイルスプラスミドであり、例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物、並びに他のポリマー、脂質、及び／又はコレステロール系－核酸コンジュゲート、並びに本明細書に記載のものなどの他の構築物を含む、様々な組成物及びナノ粒子と結合される、その記載の発現カセット、例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡを含む。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ ７７４－７８７、ウェブ公開：２０１１年３月２１日、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたく、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で提供されるのは、遺伝子置き換え系の１つ以上の要素をコードする核酸配列を含む組成物、及び機能的ＵＢＥ３Ａを置き換えるためにそれを使用する方法である。

任意選択的に、発現カセットは、非翻訳領域にｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子発現が望ましくない、及び／又は導入遺伝子発現のレベルの低減が望ましい細胞に存在するｍｉＲＮＡによって特異的に認識されるように設計される。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、及び／又は３’ＵＴＲと５’ＵＴＲの両方に位置する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、発現カセットの調節配列に操作可能に連結される。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＤＲＧ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも２つのタンデム反復を含み、少なくとも２つのタンデム反復は、少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列と、同じ又は異なり得る少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。ある特定の実施形態では、タンデムｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であるか、又は１～１０個の核酸のスペーサーによって分離されており、当該スペーサーが、ｍｉＲＮＡ標的配列ではない。

ある特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３（又はｍｉＲＮＡ１８３）標的配列である、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。ある特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、

（配列番号１１）を含むｍｉＲ－１８３標的配列を含有し、ｍｉＲ－１８３シード配列に相補的な配列には、下線が引かれている。ある特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的である配列を、２つ以上のコピー（例えば、２又は３つのコピー）含有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８３シー
ド配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１１に部分的に相補性な配列を含有し、したがって、配列番号１１と整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１１に整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続的であり得る。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、１００％相補的な領域を含み、その領域はまた、ｍｉＲ－１８３標的配列の長さの少なくとも３０％を構成する。ある特定の実施形態では、１００％相補的な領域は、ｍｉＲ－１８３シード配列と１００％の相補性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列の残りは、ｍｉＲ－１８３と少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。ある特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、切断された配列番号１１、すなわち、配列番号１１の５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを欠く配列を含む、ｍｉＲ－１８３標的配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子及び１つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。更に他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。

ある特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。ある特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号２０）を含む、ｍｉＲ－１８２標的配列を含有する。ある特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に１００％相補的である配列の２つ以上のコピー（例えば、２又は３つのコピー）を含有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号２０に部分的に相補的な配列を含有し、したがって、配列番号２０と整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号２０に整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続的であり得る。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補的な領域を含み、その領域はまた、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％を構成する。ある特定の実施形態では、１００％相補的な領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列と１００％の相補性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残りは、ｍｉＲ－１８２と少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。ある特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、切断された配列番号２０（すなわち、配列番号２０の５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む、ｍｉＲ－１８２標的配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８２標的配列とを含む。更に他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。

「タンデム反復」という用語は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の存在を指すために本明細書で使用される。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であり得、すなわち、一方の３’末端が、介在配列なしで、次の配列の５’末端のすぐ上流にあるように、又はその逆で、互いの後に直接的に配置され得る。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、短いスペーサー配列によって分離されている。本明細書で使用される場合、「スペーサー」は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置する、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長の任意の選択さ
れた核酸配列である。ある特定の実施形態では、スペーサーは、１～８ヌクレオチド長、２～７ヌクレオチド長、３～６ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、４～９ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、又はより長い数値である。好適には、スペーサーは、非コード配列である。ある特定の実施形態では、スペーサーは、４つの（４）ヌクレオチドであり得る。ある特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡＴである。ある特定の実施形態では、スペーサーは、６つの（６）ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、スペーサーは、ＣＡＣＧＴＧ又はＧＣＡＴＧＣである。

ある特定の実施形態では、タンデム反復は、２つ、３つ、４つ以上の同じｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。ある特定の実施形態では、タンデム反復は、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、又は少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列などを含む。特定の実施形態では、タンデム反復は、２つ又は３つの同じｍｉＲＮＡ標的配列、及び異なる第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。ある特定の実施形態では、発現カセットには、少なくとも２つの異なるセットのタンデム反復が存在し得る。例えば、３’ＵＴＲは、導入遺伝子のすぐ下流のタンデム反復と、ＵＴＲ配列と、ＵＴＲの３’末端に近接する２つ以上のタンデム反復と、を含有し得る。別の例では、５’ＵＴＲは、１つ、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。別の例では、３’は、タンデム反復を含有し得、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。ある特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内で開始する、２つ、３つ、４つ以上のタンデム反復を含有する。他の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンから少なくとも１００～約４０００ヌクレオチドでｍｉＲＮＡタンデム反復を含有する。

参照により本明細書に組み込まれ、参照により本明細書に組み込まれる２０１８年１２月２１日に出願された米国仮米国特許出願第６２／７８３，９５６に対する優先権を主張する、現在ＷＯ２０２０／１３２４５５として公開されている、２０１９年１２月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２を参照されたい。また、それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年５月１２日に出願された米国特許出願第６３／０２３，５９３号、２０２０年６月１２日に出願された米国特許出願第６３／０３８，４８８号、２０２０年６月２４日に出願された米国特許出願第６３／０４３，５６２号、２０２０年９月１６日に出願された米国特許出願第６３／０７９，２９９号、及び２０２１年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／１５２，０４２号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／３２００３号も参照されたい。

任意選択的に、発現カセットは、本明細書に記載のシグナルペプチド及び／又は取り込みペプチドを含む融合タンパク質である、ＵＢＥ３Ａタンパク質をコードするＵＢＥ３Ａコード配列を含み得る。ある特定の実施形態では、シグナルペプチド及び／又は取り込みペプチドは、ＵＢＥ３Ａコード配列の５’又は３’のいずれかに位置する。

操作されたｈＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１コード配列を含むベクターゲノム、例えば、配列番号１（ｈＳｙｎ．ｈＵｂｅ３ａ－１．ＧＳｃｏ．４ＸｍｉＲＮＡ１８３．ＳＶ４０（ｍｉＲ１８３標的配列を含む））及び配列番号３（ｍｉＲを含まないｈＳｙｎ．ｈＵｂｅ３ａ－１．ＧＳｃｏ．ＳＶ４０）が、本明細書で提供される。

操作されたｈＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム２コード配列を含むベクターゲノム、例えば、配列番号５（ｈＳｙｎ．ｈＵｂｅ３ａ－２．ＧＳｃｏ．４ＸｍｉＲＮＡ１８３．ＳＶ４０（ｍｉＲ１８３標的配列を含む））及び配列番号７（ｍｉＲを含まないｈＳｙｎ．ｈＵｂｅ３ａ－２．ＧＳｃｏ．ＳＶ４０）が、本明細書で示される。

本明細書に記載の発現カセットにおける組成物が、本明細書にわたって記載される組成
物及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

ベクター
ある特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａをコードする発現カセットは、ベクター又はウイルスベクターによってニューロンに送達され、その多くは、当該技術分野で既知であり、かつ利用可能である。一実施形態では、提供されるのは、本明細書に記載のＵＢＥ３Ａ標的化遺伝子を含むベクターである。一実施形態では、本明細書に記載の発現カセットを含むベクターが提供される。一実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。更なる実施形態では、非ウイルスベクターは、プラスミドである。別の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターとしては、ボカウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、又はパルボウイルスを含むが、これらに限定されない、遺伝子療法に好適な任意のウイルスが挙げられる。しかしながら、理解を容易にするために、アデノ随伴ウイルスが、例示的なウイルスベクターとして本明細書で言及される。したがって、一実施形態では、核酸配列と、そのための調節要素に操作可能に連結された発現カセットの１つ以上の要素と、を含む、アデノ随伴ウイルスベクターが提供される。

本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列の複製又は発現のために適切な標的細胞に導入することができる核酸配列を含む、生物学的部分又は化学的部分である。ベクターの例としては、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲート、磁性粒子、又はナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、機能的な遺伝子産物をコードする外因性又は異種の操作された核酸を有する核酸分子であり、そのため、適切な標的細胞に導入することができる。かかるベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点、及び組換えＤＮＡを挿入することができる１つ以上の部位を有する。例えば、薬剤耐性遺伝子をコードするベクターは、多くの場合、ベクターを含む細胞を、含まない細胞から選択することができる手段を有する。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノム、及び「人工染色体」が含まれる。ベクターの生成、産生、特徴評価、又は定量化の従来の方法は、当業者には利用可能である。

本明細書で使用される場合、組換えウイルスベクターは、所望の細胞を標的とする任意の好適なウイルスベクターである。したがって、本明細書に記載の組換えウイルスベクターは、好ましくは、中枢神経系（例えば、脳）の細胞を含む、アンジェルマン症候群に罹患した細胞及び組織のうちの１つ以上を標的化する。実施例は、例示的な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。しかしながら、他の好適なウイルスベクターとしては、例えば、組換えアデノウイルス、組換えボカウイルスなどの組換えパルボウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、組換え単純ヘルペスウイルス、組換えレトロウイルス、又は組換えレンチウイルスが挙げられ得る。好ましい実施形態では、これらの組換えウイルスは、複製欠陥である。

「複製欠損」ウイルス又はウイルスベクターは、合成又は人工ウイルス粒子であって、目的の遺伝子を含有する発現カセットが、ウイルスカプシド又はエンベロープ中にパッケージングされ、ウイルスカプシド又はエンベロープ内にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列が、複製欠損でもある、すなわち、それらが、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができるものを指す。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接して目的の遺伝子のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であり得る）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、後代ビリオンによる複製及び感染は、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じ得ないので、遺伝子療法におけ
る使用のために安全であると考えられる。かかる複製欠損ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス（組み込み又は非組み込み）、又は別の好適なウイルス源であり得る。

「プラスミド」又は「プラスミドベクター」は、一般に、本明細書では、ベクター名の前及び／又は後に小文字のｐで示される。本発明に従って使用することができるプラスミド、他のクローニング及び発現ベクター、それらの特性、並びにそれらの構築／操作方法は、当業者には容易に明らかである。一実施形態では、その上に担持される配列を導入する、本明細書に記載のベクターゲノム又は本明細書に記載の発現カセットの要素は、ウイルスベクターを生成するため、及び／又は宿主細胞、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどへの送達のために有用であり、好適な遺伝子要素（ベクター）内へと操作される。選択されるベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技法、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む、任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法が挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。

本明細書で互換的に使用される「導入遺伝子」又は「目的の遺伝子」という用語は、本明細書に記載の発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、組換えプラスミド、又は産生プラスミド、ベクター、又は宿主細胞におけるプロモーター及び／又は他の調節要素の制御下にある、外因性及び／又は操作されたタンパク質をコードする核酸配列を意味する。

核酸配列又はタンパク質を説明するために使用される場合、「異種」という用語は、核酸又はタンパク質が、それが発現される宿主細胞若しくは対象とは異なる生物又は同じ生物の異なる種に由来していることを意味する。「異種」という用語は、プラスミド、発現カセット、若しくはベクターにおけるタンパク質又は核酸と関連して使用される場合、タンパク質又は核酸が、問題となるタンパク質又は核酸が天然には互いに同じ関係で認められない別の配列若しくはサブ配列で存在することを示す。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生プラスミドから産生されるパッケージング細胞株を指し得る。代替的に、「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載の遺伝子産物の発現が望まれる任意の標的細胞を指し得る。したがって、「宿主細胞」は、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合によって細胞に導入された外因性又は異種ＤＮＡを含有する原核細胞又は真核細胞（例えば、ヒト細胞又は昆虫細胞）を指す。本明細書のある特定の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載される組成物のインビトロ評価のための様々な哺乳動物種の細胞の培養物を指す。本明細書の他の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、ウイルスベクター又は組換えウイルスを生成及びパッケージングするために使用される細胞を指す。更なる実施形態では、「宿主細胞」という用語は、ニューロン、例えば、ＣＮＳのニューロンである。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、異種核酸配列又はタンパク質の発現が所望される任意の標的細胞を指す。ある特定の実施形態では、標的細胞は、ＣＮＳのニューロン、特に、変異若しくは欠損母系ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子を有するニューロン、又はＵＢＥ３Ａ発現を欠くニューロンである。

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するパルボウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）カプシドの内側にパッケージングされた核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含有する。本明細書の例では、ベクターゲノムは、最低限でも、５’から３’へと、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、コード配列、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含有する。ＡＡＶ２からのＩＴＲ、カプシドとは異なる供給源ＡＡＶ、又は全長ＩＴＲ以外が選択され得る。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能又はトランス相補性ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。更に、他のＩＴＲ、例えば、自己相補的（ｓｃＡＡＶ）ＩＴＲが使用され得る。更に、ベクターゲノムは、遺伝子産物の発現を指示する調節配列を含有する。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。一例では、「ベクターゲノム」は、最低限でも、５’から３’へと、ベクター特異的配列と、標的配列においてその発現を指示する調節制御配列に操作可能に連結されたＵＢＥ３Ａをコードする核酸配列）とを含有し、ベクター特異的配列が、ベクターゲノムをウイルスベクターカプシド又はエンベロープタンパク質に特異的にパッケージングする末端反復配列であり得る。例えば、ＡＡＶ逆位末端反復は、ＡＡＶ及びある特定の他のパルボウイルスカプシドにパッケージングするために利用される。レンチウイルスの長い末端反復は、レンチウイルスベクターへのパッキングが所望される場合に利用され得る。同様に、他の末端反復（例えば、レトロウイルス長末端反復）などが選択され得る。

本明細書で提供されるＵＢＥ３Ａアイソフォーム１をコードするベクターゲノムとしては、例えば、配列番号１（ＡＡＶ２－５’ＩＴＲ－ｈＳｙｎ．ｈＵｂｅ３ａ－１．ＧＳｃｏ．４ＸｍｉＲＮＡ１８３．ＳＶ４０－ＡＡＶ２－３’ＩＴＲ）、配列番号３（ＡＡＶ２－５’ＩＴＲ－ｈＳｙｎ．ｈＵｂｅ３ａ－１．ＧＳｃｏ．ＳＶ４０－ＡＡＶ２－３’ＩＴＲ）が挙げられる。

本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス、当業者には利用可能であり、かつ／又は本明細書に記載の組成物及び方法の観点において利用可能であるアデノ随伴ウイルス、並びに人工ＡＡＶを指す。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ）耐性粒子であり、その中にパッケージングされる発現カセットは、標的細胞に送達するためのＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ヌクレアーゼ耐性組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶカプシドが完全に構築されていることを示し、これらのパッケージングされたベクターゲノム配列を、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するために設計される、ヌクレアーゼインキュベーション工程の際の分解（消化）から保護する。多くの場合、本明細書に記載のｒＡＡＶは、ＤＮａｓｅ耐性である。

以下の実施例では、クレードＦアデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶｈｕ６８である。ＷＯ２０１８／１６０５８２を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、別のＡＡＶカプシドは、異なるクレード、例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、若しくはＥから、又はこれらのクレードのいずれかからも外れたＡＡＶ供給源から選択される。例えば、別の好適なカプシドは、ＡＡＶｒｈ９１である。参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１１月５日に出願されたＷＯ２０２０／２２３２３１、２０２０年８月１４日に出願された米国特許出願第６３／０６５，６１６号、及び２０２０年１１月４日に出願された米国特許出願第６３／１０９，７３４号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／５５４３６号を参照されたい。ある特定の実施形態では、カプシド脱アミド化が低減しているＡＡＶカプシドが選択され得る。例えば、ともに２０１９年２月２７日に出願され、参照によりそれらの全体が組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８０４及びＰＣＴ／ＵＳ１８／１９８６１を参照されたい。また、参照により本明細書に組み
込まれる、２０２０年４月２９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／０３０２６６、現在公開されているＷＯ２０２０／２２３２３１、及び２０２１年８月１３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／４５９４５号も参照されたい。

他の実施形態では、ＡＡＶカプシドの供給源は、数十種の、天然に存在し利用可能なアデノ随伴ウイルス、並びに操作されたＡＡＶ又は人工ＡＡＶのうちのいずれかのうちの１つであり得る。ＡＡＶカプシドは、６０個のカプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３で構成され、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で二十面体対称に配置される。上述のＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として、様々なＡＡＶが選択され得る。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０－Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８－Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１及びＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、並びにＷＯ２００６／１１０６８９及びＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶｒｈ１０）も参照されたい。これらの文献は、ＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶも記載し、参照により組み込まれる。ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離又は操作され、十分に特徴付けられたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２は、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、種々の標的組織及び動物モデルにおける効率的な遺伝子導入実験に広く使用されている。別途指定されない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、及び他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８、及びＡＡＶＡｎｃ８０として一般に特定されているＡＡＶを含む、任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシド又はそのバリアントである。ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名称で「ＡＡＶ」という用語の後の数値又は数値と文字との組み合わせによって指定される。また、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる“Ｎｏｖｅｌ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｃａｐｓｉｄ Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ”と各々題され、２０１９年２月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８０４及びＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８６１を参照されたい。

ＩＴＲ又は他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用して、ＡＡＶから容易に単離又は操作され得る。かかるＡＡＶは、学術的、商業的、又は公的供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離、操作、又は入手することができる。代替的に、ＡＡＶ配列は、文献又は例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどのデータベースで利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成又は他の好適な手段を通して操作され得る。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学的な技術によって操作することができ、これらの粒子を、核酸配列の細胞特異的送達のため、免疫原性を最小限に抑えるため、安定性及び粒子寿命を調整するため、効率的な分解のため、核への正確な送達のためなどに最適化することを可能にする。

本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ」及び「組換えＡＡＶベクター」という用語は、互換的に使用され、限定されないが、カプシドタンパク質と、その中にパッケージングされるベクターゲノムとを含むＡＡＶを意味し、ベクターゲノムが、ＡＡＶとは異種の核酸を含む。ｒＡＡＶとしては、「擬似型ｒＡＡＶ」が挙げられ、ウイルスベクターが、異なるＡＡＶカプシドタンパク質のカプシドにパッケージングされる１つのＡＡＶ（例えば
、ＡＡＶ２）の逆位末端反復を含有するベクターゲノムを含有する。一実施形態では、カプシドタンパク質は、非天然に存在するプシドである。かかる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を、同じＡＡＶの非隣接部分である異なる選択されたＡＡＶからか、非ＡＡＶウイルス供給源からか、又は非ウイルス供給源から得ることができる異種配列と組み合わせて使用して、任意の好適な技術によって生成され得る。選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

本明細書で使用される場合、ｖｐカプシドタンパク質を指すために使用される場合、「異種」という用語又はその任意の文法的な変形は、例えば、異なる改変アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。配列番号１５は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、予測されたアミノ酸残基の修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低限でも、ある特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、ある特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対に少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化及び他の任意選択的な修飾を生じる。

本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから、参照群の全てのメンバーよりも少ないメンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、少なくとも１つのｖｐ１タンパク質であり、全てのｖｐ１タンパク質よりも少ない。ｖｐ３の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、１つのｖｐ３タンパク質から、全てのｖｐ３タンパク質よりも少なくてもよい。例えば、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別の亜集団であり得、ｖｐ３はなお、ｖｐタンパク質の更なる亜集団である。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含有し得る。

一態様では、本明細書で提供されるのは、ＡＡＶベクターであって、ＡＡＶカプシドと、発現カセットと、を含み、発現カセットが、ＵＢＥ３Ａ遺伝子の１つ以上の要素をコードする核酸配列、及び宿主細胞においてＵＢＥ３Ａ遺伝子の要素の発現を指示する調節要素を含む、ＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列も含む。

ＩＴＲは、ベクター産生の際にゲノムの複製及びパッケージングを担う遺伝子要素であり、ｒＡＡＶを生成するために必要とされる唯一のウイルスシス要素である。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。好ましい実施形
態では、利便性のため、及び規制当局の承認を促進させるために使用され得る、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、又はその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択され得る。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲと、遺伝子産物をコードする核酸配列と、任意の制御性配列と、ＡＡＶ３’ＩＴＲと、を含む。しかしながら、これらの要素の他の構成も好適であり得る。一実施形態では、自己相補性ＡＡＶが使用される。Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮されたバージョンについてが記載されている。ある特定の実施形態では、ベクターゲノムは、１３０塩基対の短縮されたＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、ここで、外部「ａ」要素は欠失している。短縮されたＩＴＲは、内部Ａ要素をテンプレートとして使用して、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型長に戻される。他の実施形態では、完全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。

一実施形態では、調節配列は、総ｒＡＡＶベクターゲノムが、約２．０～約５．５キロ塩基のサイズであるように選択される。一実施形態では、調節配列は、総ｒＡＡＶベクターゲノムが、約２．９～約５．５キロ塩基のサイズであるように選択される。一実施形態では、調節配列は、総ｒＡＡＶベクターゲノムが約２．９ｋｂのサイズであるように選択される。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、天然ＡＡＶゲノムのサイズに近似することが望ましい。したがって、一実施形態では、調節配列は、総ｒＡＡＶベクターゲノムが約４．７ｋｂのサイズであるように選択される。別の実施形態では、総ｒＡＡＶベクターゲノムは、約５．２ｋｂ未満のサイズである。ベクターゲノムのサイズは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡなどを含む調節配列のサイズに基づいて操作され得る。参照により本明細書に組み込まれるＷｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，Ｊａｎ ２０１０，１８（１）：８０－６を参照されたい。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、アンジェルマン症候群（ＡＳ）を有する対象の治療のためのＣＮＳ指向性療法として有用なｒＡＡＶであって、ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされるベクターゲノムと、を含み、当該ベクターゲノムが、（ａ）ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）宿主細胞において発現を指示する調節要素に操作可能に連結された、ＵＢＥ３Ａをコードする配列、（ｃ）発現を指示する調節要素、及び（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む、ｒＡＡＶである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、アンジェルマン症候群（ＡＳ）を有する対象の治療のためのＣＮＳ指向性療法として有用なｒＡＡＶであって、ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされるベクターゲノムと、を含み、当該ベクターゲノムが、（ａ）ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）宿主細胞において発現を指示する調節要素に操作可能に連結された、ＵＢＥ３Ａをコードする配列、（ｃ）任意選択的に１つのペプチド／複数のペプチド（例えば、シグナルペプチド及び／又は取り込みペプチド）、（ｄ）発現を指示する調節要素、及び（ｅ）ＡＡＶ３’ＩＴＲを含む、ｒＡＡＶである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＣＮＳの細胞に対してトロピズムを有し（例えば、ＡＡＶｈｕ６８カプシド又はＡＡＶｒｈ９１カプシドを担持するｒＡＡＶ）、及び／又はニューロン特異的発現制御要素（例えば、シナプシンプロモーター）を含有する。一態様では、ウイルスベクターの生成に有用なベクター（例えば、プラスミド）である構築物が提供される。一実施形態では、ＡＡＶ５’ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、ＡＡＶ３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、本明細書に記載のＡＡＶカプシドを含む。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを含む。他の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを含む。配列番号１８は、ＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。

本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知である技術を使用して
生成することができる。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列と、機能的ｒｅｐ遺伝子と、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接する本明細書に記載の発現カセットと、発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするように機能する適切なヘルパーと、を含有する宿主細胞を培養することを含む。また、本明細書で提供されるのは、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列と、機能的ｒｅｐ遺伝子と、記載のベクターゲノムと、発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするように機能する適切なヘルパーと、を含有する宿主細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１６０３６０Ａ２に更に詳細に記載されている。

当業者に利用可能なｒＡＡＶを産生する他の方法を利用してもよい。好適な方法としては、限定されないが、バキュロウイルス発現系又は酵母を介した産生が挙げられ得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ Ｍ．Ｋｏｔｉｎ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－Ｒ６．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１１ Ａｐｒ ２９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１、Ａｕｃｏｉｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉｐｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００６ Ｄｅｃ ２０；９５（６）：１０８１－９２、ＳＡＭＩ Ｓ．ＴＨＡＫＵＲ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｔｈｅｓｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ
ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ，２０１２、Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ Ｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅａｄ－ｔｏ－Ｈｅａｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７ Ａｕｇ １０．ｐｉｉ：Ｓ１５２５－００１６（１７）３０３６２－３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０８．００３．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ，ＯｎｅＢａｃ ２．０：Ｓｆ９ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ａｎｄ ＡＡＶ８ Ｖｅｃｔｏｒｓ
ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｆｅｂ；２８（１）：１５－２２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１６．１６４．、Ｌｉ Ｌ ｅｔ
ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍ ｇｅｎｏｍｅｓ：ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ａｕｇ １；８（８）：ｅ６９８７９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９．Ｐｒｉｎｔ ２０１３、Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｌａｔｅｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ．２０１１ Ｊｕｌ；１０７ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８０－９３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｐ．２０１１．０５．００８、及びＫｏｔｉｎ ＲＭ，Ｌａｒｇ
ｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２９を参照されたい。

高塩濃度での２ステップアフィニティクロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを使用して、ベクター薬物産生物を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれる、“Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９”と題されたＷＯ２０１７／１６０３６０、及び“Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１”と題されたＷＯ２０１７／１００６７４により詳述されている。簡潔に言うと、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ粒子をゲノム欠損ＡＡＶ中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶ９又はＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶカプシド中間体を含む懸濁物を高速液体クロマトグラフィーに供することを含み、ＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ中間体が、ｒＡＡＶ９では約１０．２又はＡＡＶ１では約９．８のｐＨで平衡化された強アニオン交換樹脂に結合され、約２６０及び約２８０での紫外吸光度で溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。この方法では、ＡＡＶ完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が感染ポイントに到達すると溶出する画分から回収される。一例では、アフィニティクロマトグラフィーステップでは、選択されたＡＡＶ血清型を効率的に捕捉するＡＡＶ特異的樹脂に、ダイアフィルトレーションされた産生物を適用してもよい。これらのイオン性条件下での、かなりのパーセンテージの残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質は、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。

ｒＡＡＶの特徴評価又は定量化のための従来の方法は、当業者に利用可能である。空及び充填粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配で精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド体積が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物品ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。次いで、ロードした２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割り算し、ゲノムコピーに対する粒子の比率（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割り、１００を掛け算することによって、空粒子のパーセンテージを得る。一般に、空のカプシド及びパッケージされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性カプシドについて試験するために、本方法は、治療されたＡＡＶストックを、３つのカプシドタンパク質を分離することが可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、緩衝液中に３～８％のトリス酢酸塩を含有する勾配ゲル）に供することと、次いで、試料材料が分離されるまでゲルを試行することと、ナイロン又はニトロセルロース膜、好ましくはナイロンの上でゲルをブロッティングすることと、を含む。次いで、抗ＡＡＶカプシド抗体を、変性したカプシドタンパク質に結合する一次抗体として、好ましくは、抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）を使用する。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出
キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料を取って、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。銀染色は、ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、あるいは他の好適な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー又はクマシー染色を使用して実施され得る。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（又は別の好適なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活性化後、試料は、更に希釈され、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用いて、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）の値を使用して、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することによって、ベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用可能である。

一態様では、広域スペクトル血清プロテイナーゼ、例えば、プロテイナーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから購入可能）を利用する最適化ｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料がプロテイナーゼＫバッファーで希釈され、プロテイナーゼＫで治療され、続いて熱不活性化されることを除き、標準的なアッセイと同様である。好適には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫバッファーで希釈される。プロテイナーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮され得る。典型的に、プロテイナーゼＫ治療は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。治療ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間、実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、又はより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施され得る。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度は低下され得（例えば、約７０～約９０℃）、時間は延長され得る（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準的なアッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。

加えて又はあるいは、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用してもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価を決定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

カプシドタンパク質のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３間の比を決定するための方法も利用可能である。例えば、Ｖａｍｓｅｅｄｈａｒ Ｒａｙａｐｒｏｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；８７（２４）：１３１５０－１３１６０、Ｂｕｌｌｅｒ ＲＭ，Ｒｏｓｅ ＪＡ．１９７８．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ＫＢ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２５：３３１－３３８、及びＲｏｓｅ
ＪＡ，Ｍａｉｚｅｌ ＪＶ，Ｉｎｍａｎ ＪＫ，Ｓｈａｔｋｉｎ ＡＪ．１９７１．Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８：７６６－７７０を参照されたい。

本明細書に記載のベクターにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

組成物
提供されるのは、ＡＳを治療することを必要とする対象においてそれを行うための投与に好適な水性懸濁物であって、当該懸濁物が、水性懸濁液と、本明細書に記載の調節要素に操作可能に連結されたＵＢＥ３Ａ遺伝子をコードする、操作された核酸配列を含むベクターと、を含む、水性懸濁物である。一実施形態では、治療有効量の当該ベクターが、懸濁液に含まれる。

核酸
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１をコードする核酸と、非ウイルス送達系と、を含む、発現カセットを含む。これとしては、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質又は脂質様粒子、キトサンに基づく製剤、及び当該技術分野で既知であり、例えば、上に引用されるＲａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒによって記載されている）他のものが挙げられ得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、ウイルスベクター系にＵＢＥ３Ａ遺伝子を含む発現カセットを含む、懸濁物である。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、非複製ウイルスベクターを含む。好適なウイルスベクターには、例えば、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えボカウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又は別の組換えパルボウイルスなどの任意の好適な送達ベクターが含まれ得る。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１の送達を必要とする患者においてそれを行うための組換えＡＡＶである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＵＢＥ３ａアイソフォーム３の送達を必要とする患者においてそれを行うための組換えＡＡＶである。

一実施形態では、組成物は、対象への送達に好適な最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨ及び塩濃度まで緩衝された水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され、投与時に再構築されてもよい。

一実施形態では、懸濁物は、水性懸濁液中に溶解される界面活性剤、防腐剤、賦形剤、及び／又は緩衝剤を更に含む。一実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳである。緩衝生理食塩水、界面活性剤、約１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭの塩化ナトリウムに相当するイオン強度まで調整された生理学的に適合する塩若しくは塩の混合物、又は同等のイオン濃度まで調整された生理学的に適合する塩のうちの１つ以上を含むものを含む、様々な好適な溶液が既知である。好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、ポロキサマーの中から、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖で構成される非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ
１５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールから選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。ｐＨは、６．５～８．５、又は７～８．５、又は７．５～８の範囲であり得る。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるため、髄腔内送達では、この範囲内のｐＨが望ましいものであり得、一方、静脈内送達のためには、６．８～約７．２のｐＨが望ましいものであり得る。しかしな
がら、他の送達経路では、最も広い範囲内の他のｐＨ、及びこれらの部分範囲が選択され得る。

加えて提供されるのは、薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体と、本明細書に記載の調節要素に操作可能に連結されたＵＢＥ３Ａの１つ以上の成分をコードする核酸配列を含むベクターと、を含む、薬学的組成物である。本明細書で使用される場合、「担体」としては、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁物、コロイドなどが挙げられる。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足活性成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されると、アレルギー又は同様の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが使用され得る。特に、ＵＢＥ３Ａ導入遺伝子を送達するｒＡＡＶベクターは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、又はナノ粒子などのいずれかにカプセル化された送達のために製剤化され得る。一実施形態では、治療有効量の当該ベクターが、薬学的組成物に含まれる。好適な担体は、ベクターが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体としては、生理食塩水が挙げられ、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）とともに製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。担体の選択は、本発明の制限ではない。防腐剤又は化学的安定剤などの他の従来の薬学的に許容される担体。好適な例示的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学的安定剤には、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。

「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されると、アレルギー又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。

本明細書で使用される場合、「投薬量」又は「量」という用語は、治療の過程で対象に送達される総投薬量若しくは総量、又は単一単位（又は複数単位若しくは分割投薬量）投与で送達される投薬量若しくは量を指し得る。

任意の好適な経路又は異なる経路の組み合わせによって、本明細書に記載の水性懸濁液又は薬学的組成物を必要とする対象にそれを送達するように設計される。一実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載の発現カセット又はベクターと、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、又は静脈内（ＩＶ）の投与経路を介した送達に好適な製剤緩衝液とを含む。あるいは、他の投与経路（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、筋内、及び他の非経口経路）が選択され得る。

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」又は「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への、より具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔内への注射を介した、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達としては、腰髄穿刺、脳室内、側脳室内（ｉｃｖ）、後頭下／槽内、及び／又はＣ１－２穿刺が挙げられ得る。例えば、材料は、腰髄穿刺によって、クモ膜下腔空間全体にわたって拡散させるために導入され得る。別の例では、注射は、大槽内（嚢内マンガ；ＩＣＭ）であり得る。嚢内送達は、ベクター拡散を増加させ、かつ／又は投与によって引き起こされる毒性及び炎症を低減し得る。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ
ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１４；１：１４０５１．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ
ｏｎｌｉｎｅ ２０１４ Ｄｅｃ １０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１４．５１を参照されたい。本明細書で使用される場合、「大槽内送達」又は「大槽内投与」という用語は、脳室の脳脊髄液への、又は小脳延髄槽内への直接的な薬物の投与経路、より具体的には、後頭下穿刺を介した、又は大槽内への直接的な注射若しくは永久的に配置されたチューブを介した薬物の投与経路を指す。

一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるベクターを製剤緩衝液中に含む薬学的組成物である。ある特定の実施形態では、複製欠損ウイルス組成物は、ヒト患者に対して、範囲内の全ての整数又は小数の量、及び好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣの範囲を含む、（体重７０ｋｇの平均対象を治療するには）約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１６ＧＣの範囲にある量の複製欠損ウイルスを含有するように、投薬量単位で製剤化される。一実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、又は９×１０^９ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、又は９×１０^１０ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、又は９×１０^１１ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、又は９×１０^１２ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、又は９×１０^１３ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、又は９×１０^１４ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、又は９×１０^１５ＧＣを含有するように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、用量当たり１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣの範囲であり得る。

一実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを製剤緩衝液中に含む薬学的組成物が提供される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ～約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬで製剤化される。更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約３×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約３×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。なお更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０^１１ＧＣ／ｍＬで製剤化される。

これらの用量及び濃度の送達のために好適な体積は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの体積が選択されてもよく、成人にはより高体積が選択される。典型的には、新生児のために、好適な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児のために、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児のために、約０．５ｍ
Ｌ～約２０ｍＬの容量が選択され得る。小児のために、最大約３０ｍＬの容量が選択され得る。１０代前半及び１０代のために、最大約５０ｍＬの容量が選択され得る。更に他の実施形態では、患者は、約５ｍＬ～約１５ｍＬの容量での髄腔内投与を受け得、これが選択されるか、又は約７．５ｍＬ～約１０ｍＬを受け得る。他の好適な容量及び投薬量が、決定され得る。投薬量は、任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために調整され、かかる投薬量は、組換えベクターが用いられる治療用途に応じて変動し得る。

ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量化は、水性懸濁液又は薬学的組成物中に含有される用量の尺度として使用され得る。当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定することができる。ＡＡＶのＧＣ数滴定を行うための１つの方法は、以下の通りである。精製されたＡＡＶベクター試料は、まずＤＮａｓｅで処理され、非カプシド化ＡＡＶゲノムＤＮＡ又は産生プロセスからの汚染プラスミドＤＮＡを排除する。次いで、ＤＮａｓｅ耐性粒子を熱処理して、カプシドからゲノムを放出させる。次いで、ウイルスゲノムの特定の領域（通常はポリＡシグナル）を標的化するプライマー／プローブセットを使用して、放出されたゲノムをリアルタイムＰＣＲ又は定量的ＰＣＲによって定量化する。複製欠損ウイルス組成物は、ヒト患者に対して、約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１５ＧＣの範囲、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣの範囲にある量の複製欠損ウイルスを含有する投薬量単位で製剤化され得る。好ましくは、製剤中の複製欠損ウイルス組成物の濃度は、約１．０×１０^９ＧＣ、約５．０×１０^９ＧＣ、約１．０×１０^１０ＧＣ、約５．０×１０^１０ＧＣ、約１．０×１０^１１ＧＣ、約５．０×１０^１１ＧＣ、約１．０×１０^１２ＧＣ、約５．０×１０^１２ＧＣ、約１．０×１０^１３ＧＣ、約５．０×１０^１３ＧＣ、約１．０×１０^１４ＧＣ、約５．０×１０^１４ＧＣ、又は約１．０×１０^１５ＧＣである。ＡＡＶ ＧＣ数の滴定を実施するための代替的な又は追加の方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４に記載のｏｑＰＣＲ又はデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を介した方法である。

本明細書に記載の薬学的組成物における組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるよう意図されることを理解されたい

方法
ある特定の実施形態では、発現カセット、核酸、又はウイルス若しくは非ウイルスベクターが、医薬品の調製に使用される。ある特定の実施形態では、アンジェルマン症候群の治療を必要とする対象において、アンジェルマン症候群を治療するためのその使用が提供される。

本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」という用語は、ＵＢＥ３Ａ欠損又はアンジェルマン症候群（ＡＳ）の１つ以上の症状を軽減する目的で、本明細書に記載される１つ以上の化合物又は組成物を対象に投与することを包含すると定義される。したがって、「治療」は、所与の対象において、ＡＳの発生若しくは進行を低減すること、疾患を予防すること、疾患の症状の重症度を低減すること、その進行を遅延させること、疾患の症状を除去すること、疾患の進行を遅らせること、又は療法の有効性を増加させること、のうちの１つ以上を含み得る。

記載の療法は、所望の結果、すなわち、アンジェルマン症候群（ＡＳ）又はその１つ以上の症状の治療を達成するために、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１発現を提供する。かかる
症状としては、限定されないが、知的障害、言語障害、運動失調、てんかん、発作障害、小頭症、精神運動遅延、及び反射亢進を伴う筋緊張低下のうちのより多くのうちの１つが挙げられ得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｕｉｔｉｎｇ Ｋ ｅｔ
ａｌ．，Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ａ ｒａｒｅ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ，２０１６，１２（１０）：５８４－５９３，ｅｐｕｂ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １２，２０１６を参照されたい）。本明細書に記載されるように、所望の結果は、発育遅延、知的障害、重度の言語障害、運動及びバランスに関する問題を含む神経物理学的合併症を減少させるか、又は排除することを含み得る。

本明細書で提供される組成物の「治療有効量」は、所望の結果を達成するか、又は治療目標に到達するために、対象に送達される。一実施形態では、ＡＳを治療するための治療目標は、患者のニューロンにおける又はニューロンの集団におけるＵＢＥ３Ａアイソフォーム１発現を、正常範囲内であるか、又は非ＡＳレベルである機能レベルまで復元することである。別の実施形態では、ＡＳの治療のための治療目標は、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１発現を、正常レベル若しくは非ＡＳレベルの、又は治療前のＵＢＥ３Ａ発現レベルと比較して、少なくとも約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約２％、約１％まで増加させることである。ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１を送達することによって機能を１００％未満の活性レベルまで救済された患者は、任意選択的に、更なる治療を受けてもよい。別の実施形態では、ＡＳの治療のための治療目標は、選択された集団におけるニューロンの約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約２％、又は約１％を含む標的ニューロンの割合で、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１発現を増加させることである。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１を提供する発現カセット、ベクター、又はｒＡＡＶを必要とする対象に投与し、ニューロンにおいて機能的ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１の発現を生じることによって、ＡＳを治療する方法である。ある特定の実施形態では、本方法は、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１（配列番号２のアミノ酸配列）を発現する核酸配列を送達することを含む。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＵＢＥ３ａアイソフォーム１を提供する発現カセット、ベクター、又はｒＡＡＶを必要とする対象に投与し、ニューロンにおいて機能的ＵＢＥ３ａアイソフォーム１の発現を生じることによる、酵素補充の方法である。ある特定の実施形態では、本方法は、ＵＢＥ３ａアイソフォーム１（配列番号２のアミノ酸配列）を発現する核酸配列を送達することを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＵＢＥ３ａアイソフォーム３を提供する発現カセット、ベクター、又はｒＡＡＶを必要とする対象に投与し、ニューロンにおいて機能的ＵＢＥ３ａアイソフォーム３の発現を生じることによる、酵素補充の方法である。ある特定の実施形態では、本方法は、ＵＢＥ３ａアイソフォーム３（配列番号２１のアミノ酸配列）を発現する核酸配列を送達することを含む

本明細書に記載される遺伝子療法は、ウイルス性であるか、又は非ウイルス性であるかにかかわらず、他の治療（二次療法）、すなわち、対象の（患者の）診断及び状態のための標準的なケアと併せて使用され得る。本明細書で使用される場合、「二次療法」という用語は、ＡＳの治療のために本明細書に記載される遺伝子療法と組み合わせることができる療法を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子療法は、ＡＳの治療のための１つ以上の二次療法、例えば、抗けいれん剤又は食事制限（例えば、ケトジェニッ
ク及び低血糖）の投与と組み合わせて投与される。二次療法は、ＡＳのこれらの症状を予防し、停止し、又は緩和するのに役立つ任意の療法であり得る。二次療法は、上に記載の組成物の投与の前、投与と同時、又は投与の後に投与することができる。対象は、彼らの担当医の裁量によって、遺伝子療法治療の前に、及びそれと同時に、彼らの標準的なケア治療を継続することを許可されてもよい。代替として、医師は、遺伝子療法治療を投与する前に標準的なケア療法を停止し、任意選択的に、遺伝子療法の投与後に併用療法として標準的なケア療法を再開することを選び得る。別の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法を、当該技術分野で日常的である遺伝子型分析又は遺伝子スクリーニングと組み合わせることができ、ＵＢＥ３Ａ遺伝子の核酸配列における１つ以上の変異を特定するためのＰＣＲの使用を含み得る。上述されるように、人生の初期（例えば、１～３ヶ月）にＡＳの症状を示す対象、並びに人生の後期にＡＳを有すると診断された対象は、本明細書に記載の組成物及び方法の意図されるレシピエントである。

「投与すること」又は「投与経路」とは、薬学的担体又は賦形剤の有無にかかわらず、本明細書に記載の組成物を対象に送達することである。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。いくつかの実施形態では、投与は、周期的に繰り返される。連続的な投与は、数日間、数週間、数ヶ月間、又は数年の間隔からの複数の投与の時間ギャップを意味し得る。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、それを必要とする対象に１回以上投与される。一実施形態では、複数回の投与は、数日間、数週間、数ヶ月又は数年間離れている。一実施形態では、１回、２回、３回、又はそれ以上再投与することが許される。かかる再投与は、同じ種類のベクター、又は異なるベクターによるものであってもよい。更なる実施形態では、本明細書に記載のベクターは、単独で、又は患者の診断及び状態のための標準的なケアと組み合わせて使用され得る。本明細書に記載の核酸分子及び／又はベクターは、単一の組成物又は複数の組成物で送達されてもよい。任意選択的に、２つ以上の異なるＡＡＶ、又は複数のウイルスが送達され得る［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３を参照されたい］。

一実施形態では、遺伝子療法のための本明細書に記載の発現カセット、ベクター、又は他の組成物は、患者当たり単回用量として送達される。一実施形態では、対象は、治療有効量の本明細書に記載の組成物を送達される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、発現カセット若しくはベクター、又はそれらの組み合わせの量を指す。

一実施形態では、発現カセットは、ベクターゲノムにおいて、範囲内の全ての整数又は小数及びエンドポイントを含む、脳質量のグラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量のグラム（ｇ）当たり約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）の量で送達される。別の実施形態では、投薬量は、脳質量１グラム当たり１×１０^１０ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣである。特定の実施形態では、患者に投与されるベクターの用量は、少なくとも約１．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．０×
１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、又は約１．０×１０^１４ＧＣ／ｇ脳質量である。

ある特定の実施形態では、レジメンは、遺伝子編集系を含む組成物を含む、追加の治療を含み得る。例えば、“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ”と題された、２０２０年４月２８日に出願された米国特許出願第６３／０１６，７１２号、及び２０２０年１１月２５日に出願された米国特許出願第６３／１１８，２９９号を参照されたい。この治療は、本明細書に記載の遺伝子置き換え療法での治療の前であってもよく、初期の治療に利用されたものとは異なるカプシドを有するベクターを利用してもよい。当業者によって、更に他のＡＡＶカプシドの組み合わせが選択され得る。

ある特定の実施形態では、治療レジメンは、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１とＵＢＥ３Ａアイソフォーム３との同時発現を含み得る。ある特定の実施形態では、治療薬は、（例えば、アイソフォーム３及び／又はアイソフォーム１酵素との）ＡＡＶ．ｈＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１及びｈＵＢＥ３Ａ酵素補充療法の併用療法を含み得る。ある特定の実施形態では、治療レジメンは、ＡＡＶ．ｈＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１遺伝子療法ベクター及び免疫調節レジメンとの同時療法を含み得る。かかる免疫調節レジメンとしては、例えば、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシン又はラパログ）、及びアルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、又はイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む細胞***阻害剤などの免疫抑制剤が挙げられ得る。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体又はＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、又はＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。ある特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の前に開始され得る。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、及び／又はシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を含み得る。これらの薬物のうちの１つ以上は、遺伝子療法投与後に、同じ用量又は調整された用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約１週間、約１５日間、約３０日間、約４５日間、６０日間、又はそれ以上であり得る。更に他の同時治療薬は、例えば、抗ＡＡＶ抗体を枯渇させる
（したがって、試験する患者への、選択されたＡＡＶカプシドの閾値レベルを超える抗体の投与を可能にし得る）のに有用であると記載されている抗ＩｇＧ酵素、並びに／又は、例えば、“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐａｔｉｅｎｔｓ”と題された２０２０年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／０４０，３８１号に記載されている抗ＦｃＲＮ抗体の送達、並びに／又はａ）ステロイド若しくはステロイドの組み合わせ、及び／若しくは（ｂ）ＩｇＧ切断酵素、ｃ）Ｆｃ－ＩｇＥ結合の阻害剤、（ｄ）Ｆｃ－ＩｇＭ結合の阻害剤、（ｅ）Ｆｃ－ＩｇＡ結合の阻害剤、及び／若しくは（ｆ）ガンマインターフェロンのうちの１つ以上を含み得る。

一般に、本方法は、調節配列の制御下で、ＵＢＥ３Ａ遺伝子置き換え（発現）系の１つ以上の要素をコードする核酸配列を担持する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む、薬学的に有効量の組成物、及び薬学的に許容される担体を必要とする哺乳動物対象に投与することを含む。一実施形態では、かかる方法は、哺乳動物対象においてＡＳを治療し、遅延させ、又はその進行を停止するために設計される。

一実施形態では、本明細書に記載されるベクター、ｒＡＡＶ、水性懸濁液、又は薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することによる、ＡＳを治療する方法が提供される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^１０～約１×１０^１５ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ体重で送達される。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、１回より多く投与される。更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、数日間、数週間、数ヶ月又は数年間に分けて投与される。

ここで、以下の実施例を参照しながら、本発明が説明される。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、いかなる方式でも本発明がこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。

アンジェルマン症候群（ＡＳ）は、世界中の約５０万人に影響を及ぼす稀な神経発達障害である。ＡＳは、知的及び身体障害、睡眠中の発作及び障害、並びに腸機能を特徴とする。これらの欠陥の多くは、母系遺伝性のユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）対立遺伝子の喪失によって引き起こされる。現在、ＡＳの治療選択肢は限られている。ＡＡＶに基づく遺伝子置き換え療法は、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム発現を回復させ、ＡＳの重症度を緩和するための有望な戦略の代表である。しかしながら、ＵＢＥ３Ａ遺伝子は３つのアイソフォームをコードし、どのＵＢＥ３Ａアイソフォームが最も有効な候補となるかは現在のところ不明である。我々は、操作されたヒトＵＢＥ３Ａアイソフォームを送達するＡＡＶベクターの有効性を、ＡＳのマウスモデル（ＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}）において比較することによって、この不確実性に対処する。ウェスタンブロッティング及び免疫組織化学分析は、新生児対照及びＡＳマウスへのＡＡＶ－ＵＢＥ３Ａヒトアイソフォーム１及び２ベクターの脳室内注射が、堅牢なタンパク質発現を生じたことを示した。アイソフォーム１置き換えは、ＡＳマウスにおいて、用量依存的様式で、歩行、巣構築能力、及び運動協調性を顕著に改善した。アイソフォーム１とは異なり、アイソフォーム２は、ＡＳマウスにおいて巣構築能力及び運動協調性を更に損なう。非ヒト霊長類における毒性研究は、大槽に高用量のＡＡＶ－ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１ベクターを注射しても顕著な有害作用は認められなかったことを示唆している。まとめると、これらのデータは、ＡＡＶ－ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１ベクターが、有望な安全性プロファイルによって、最も治療的に有効であることを示唆する。これらの前臨床所見は、ＡＳの遺伝子置き換え療法の開発における重要な前進を示す。

実施例１－修飾されたヒトシナプシンプロモーターの指示の下での、操作されたｈＵＢＥ３Ａアイソフォーム１及び操作されたｈＵＢＥ３Ａアイソフォーム２コード配列
マウスにおける研究の第１のセットでは、修飾されたヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーター（配列番号１２）の制御下にある操作されたヒトＵＢＥ３Ａアイソフォーム１（配列番号９）又はＵＢＥ３Ａアイソフォーム２（配列番号１０）導入遺伝子を含有する一連のプラスミドを操作した。転写安定性を促進するために、ＳＶ４０ポリアデニル化配列（配列番号１３）を含めた。プロモーター－導入遺伝子－ＳＶ４０構築物は、逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接させた。プラスミドを、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの中枢神経系のニューロン及びグリアを堅牢に形質導入するＡＡＶ９バリアントである、ＰＨＰ．Ｂにパッケージングした。

修飾されたヒトシナプシンプロモーターのコード配列を、配列番号１２に提供する。

生じたベクターゲノムは、配列番号３（ｈＳｙｎ．ｈＵｂｅ３ａ－１．ＧＳｃｏ．ＳＶ４０）及び配列番号７（アイソフォーム２ｈＳｙｎ．ｈＵｂｅ３ａ－２．ＧＳｃｏ．ＳＶ４０）に再現する。

ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシド（ＵＳ９，５８５，９７１）を、パッケージング宿主細胞において、３重トランスフェクション技術を使用して、ＡＡＶ２ ｒｅｐコード配列及びＰＨＰ．Ｂ ＶＰ１コード配列を含むトランスプラスミド中に生成し、ベクターゲノムを含有するシスプラスミド及びパッケージング宿主細胞によって提供されない必要なアデノウイルスヘルパー機能を発現するトランスプラスミドとともに同時トランスフェクトする。

実施例２－マウス及びＮＨＰへのｈＵＢＥ３ＡのｒＡＡＶ媒介性送達
Ａ．成体マウス脳におけるｈＵＢＥ３Ａアイソフォーム１及び２の発現試験
野生型成体マウスの脳にＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１及びＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム２ベクターを（脳室内－ＩＣＶ）注射し、ウエスタンブロットによって導入遺伝子発現を定量化することによって、最も発現の高いものを同定した（図８）。

方法：成体野生型ＷＴ（ＵＢＥ３Ａ^{ｍ＋／ｐ＋}）及びＵＢＥ３Ａ ＫＯ／ｎｕｌｌ（ＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}）同腹仔にレトロオービタル（ＩＶ）注射によって送達される５×１０^１１ＧＣ／マウス。ウェスタンブロッティングのために注射１４日後に脳を採取した。次いで、最適な発現のために、完全に無傷のＩＴＲを含むプラスミドにｃＤＮＡをサブクローニングした。

Ｂ．最も治療的に有効なＡＡＶ－ＵＢＥ３Ａアイソフォームベクターの決定
ＡＳのマウスモデルにおいて運動欠陥及び挙動欠陥を救済するのに、最も発現の高いＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１（アイソフォーム１）及びＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム２（アイソフォーム２）ベクターの能力を直接比較した。新生児野生型又はＡＳ（ＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}）マウスに、動物当たり１×１０^１１ゲノムコピーの用量で、アイソフォーム１又はアイソフォーム２ベクターのいずれかを脳室内（ＩＣＶ）注射した。挙動試験（８～１０週齢）、試験順序：（１）キャットウォーク、（２）自発運動、（３）ロータロッド、（４）巣構築。２ヶ月後、アイソフォーム２ではなくアイソフォーム１を注射されたＡＳマウスは、歩行（歩長図１１Ａ～１１Ｄ）、巣構築能力（図１０Ａ及び１０Ｂ）、及び運動協調性（図９Ａ及び９Ｂ）において統計的に顕著な改善を示した。実際、アイソフォーム２の発現は、ＡＳマウスにおける巣構築能力の欠陥を悪化させた（図１０Ｃ及び１０Ｄ）。動物当たり１×１０^１０ゲノムコピーの低用量でのアイソフォーム１の注射は、有効性が低かったが、ＡＳマウスにおける巣構築能力を改善した。また、野生型マウスにおけるアイソフォ
ーム１又は２の過剰発現は、いくつかの挙動領域に悪影響を有したことが観察され、ＵＢＥ３Ａアイソフォーム発現の厳密な制御の重要性を示した。要約すると、直接試験は、核ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１ベクターが、ＡＳマウスにおける挙動欠陥を低減することにおいて、細胞質アイソフォーム２ベクターよりも高い治療能力を有することを示した。操作されたヒトＵＢＥ３Ａアイソフォーム１タンパク質の発現及び局在化は、野生型、ＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}マウス、及び治療されたＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}マウスからの矢状方向の脳セクション（すなわち、皮質、海馬、視床、視床下部、中脳）において、ニューロンマーカーＮｅｕＮ及び核での同時染色による免疫蛍光画像によって確認した。Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍソフトウェアを使用して、異なる脳領域におけるＵＢＥ３Ａアイソフォーム１（図５及び６）及びＵＢＥ３Ａアイソフォーム２（図７）タンパク質陽性ニューロンの割合（パーセンテージ）を決定及び定量化した（図５及び６）。

１×１０^１０ＧＣ用量では、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１投与は、野生型内因性ＵＢＥ３Ａアイソフォーム発現の約５０％を達成し、自発運動、運動協調性、又は巣構築における挙動欠陥に顕著な影響を及ぼさず、歩行異常をいくらか改善した。図５は、治療されたＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}マウスにおけるＵＢＥ３Ａタンパク質陽性ニューロンの定量化を示す（統計分析：平均±ＳＤ、対応のないスチューデントｔ検定）。治療は、脳室内（ＩＣＶ）を介した１×１０^１０ＧＣ／動物の用量でのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１の投与を含んでいた。

１×１０^１１ＧＣの高用量では、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１投与は、野生型内因性ＵＢＥ３Ａアイソフォーム発現の約１００％を達成し、巣構築能力を顕著に改善した（図１０Ａ）。Ｄｅａｃｏｎ ＲＭＪ，２００６，Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｎｅｓｔ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １（３）：１１１７－９の方法に従って実施すると、治療されたＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}マウスは、巣を構築するのに顕著に多くの巣材料を使用した（図１０Ｂ）。ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１投与は、活動低下状態に影響を及ぼさなかったが、ＵＢＥ３Ａ^ｍｐ＋マウスにおいて、以前公開された歩行異常と比較して正常化した（Ｈｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｕｂｅ３ａ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｂｅｈａｖｉｏｒｓ，２００８，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７（１４）：２１８１－２１８９；ｅｐｕｂ Ａｐｒｉｌ １５，２００８に記載されるように歩長を評価した）。アイソフォーム２投与（図９Ｂ）ではなくＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１投与（図９Ａ）は、ＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}マウスにおける運動協調生欠陥を顕著に低減した。図６は、治療されたＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}マウスにおけるＵＢＥ３Ａタンパク質陽性ニューロンの定量化を示す（統計分析：対応のないｔ検定）。治療は、脳室内（ＩＣＶ）を介した１×１０^１１ＧＣ／動物の用量でのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１の投与で構成される。図５からのタンパク質発現の定量化を、以下の表１に要約する。

ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム置き換えの治療効果：アイソフォーム１：（ｉ）歩長を正
常化する（臨床的に関連する歩行欠陥）、（ｉｉ）運動協調性を改善する、（ｉｉｉ）巣構築挙動を改善する、（ｉｖ）ＵＢＥ３欠損（ＵＢＥ３Ａ^{ｍ－／ｐ＋}）マウスの自発運動低下状態に影響を及ぼさない。アイソフォーム２：（ｉ）巣構築挙動を損ない、（ｉｉ）自発運動低下状態（アイソフォーム１のように）又は運動協調性に影響を及ぼさない。

加えて、上述のデータは、堅牢なＵＢＥ３Ａアイソフォーム１タンパク質発現が、いくつかの脳領域のニューロンの大部分に見られたことを示す。ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１タンパク質発現は、用量依存性を示し、１×１０^１０ＧＣ／動物に対して、１×１０^１１ＧＣ／動物で治療された動物では、ＵＢＥ３Ａ陽性ニューロンがより高いパーセンテージであった。

ＡＳマウスにおける前臨床研究は、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１が良好に発現し、ＡＳマウスにおける運動及び挙動欠陥を緩和することを示した。次に、ヒトに対する免疫系及び脳構造の類似性を理由に、アカゲザルにおける高用量でのその安全性プロファイルを評価することによって、アイソフォーム１ベクターの治療潜在性を調査した。まず、ＡＡＶ－ｈｕ６８－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１ベクターを生成した。ＡＡＶｈｕ６８はまた、非ヒト霊長類において良好に機能する、社内で開発されたＡＡＶ９バリアントである。３匹のアカゲザル（ＮＨＰ－１、ＮＨＰ－２、ＮＨＰ－３）の大槽の脳脊髄液に、ＡＡＶｈｕ６８－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１ベクターを３×１０^１３ＧＣ／動物の高用量で注射した。３５日後、サルを捕獲し、導入遺伝子発現、免疫応答、及び有害作用について評価した。ケージ側面評価からは、臨床的に著しい状態又は神経学的懸念を有した動物はなかった。血液化学検査は、治療されたサルでは正常な凝固、肝臓及び腎臓機能を示した。髄質、並びに頭頂及び側頭皮質を含むいくつかの脳領域に低レベルの、並びに脊椎の後根神経節に高いレベルのアイソフォーム１ベクターを観察した（図２Ａ）。加えて、脊椎の後根神経節を含むいくつかの脳領域において、低発現のヒトＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１ ｍＲＮＡを検出した（図２Ｂ及び２Ｃ）。操作されたヒトＵＢＥ３Ａアイソフォーム１転写産物の局在化を、３匹の治療されたＮＨＰ由来の後根神経節（頸髄、胸髄、及び腰髄セグメント）の蛍光画像によって確認した。ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１転写産物局在化を、操作されたヒト配列に特異的なＲＮＡｓｃｏｐｅプローブ（図７Ａ～７Ｉ）を使用して決定し、ＤＡＰＩ（核）で対比染色した。目的の領域の画像を様々な倍率で撮影し、２０倍の倍率の画像を提示している。図７Ａ～７Ｉは、（ＮＨＰ；３５日間の研究において）３匹の治療された非ヒト霊長類由来の後根神経節（頸髄、胸髄、及び腰髄セグメント）における、操作されたヒトＵＢＥ３Ａアイソフォーム１（ｈＵＢＥ３Ａ－１）転写物局在化の蛍光画像を示す。治療は、大槽（ＩＣＭ）経路を介した３×１０^１３ＧＣ／動物の用量でのＡＡＶ－ｈｕ６８－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１の投与を含んでいた。目的の領域の画像を、２０倍の倍率で示す。図７Ａは、ＮＨＰ－１由来の後根神経節の頸髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｂは、ＮＨＰ－２由来の後根神経節の頸髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｃは、ＮＨＰ－３由来の後根神経節の頸髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｄは、ＮＨＰ－１由来の後根神経節の胸髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｅは、ＮＨＰ－２由来の後根神経節の胸髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｆは、ＮＨＰ－３由来の後根神経節の胸髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｇは、ＮＨＰ－１由来の後根神経節の腰髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｈは、ＮＨＰ－２由来の後根神経節の腰髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。図７Ｉは、ＮＨＰ－３由来の後根神経節の腰髄セグメントにおける、操作されたｈＵＢＥ３Ａ－１転写産物局在化の蛍光画像を示す。

免疫応答は最小限であり、ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、予想されるように、ｈｕ６８カプシドに対する中等度の免疫応答を示した。最後に、後根神経節（ＤＲＧ）毒性は、非ヒト霊長類及び潜在的にヒトにおいて、中枢神経系指向性及び高用量ＡＡＶの土台となる問題である。しかしながら、軽度のＤＲＧ（図１２～１２Ｃ）及びニューロン毒性は、１匹の動物の脊髄（図１３Ａ～１３Ｃ）及び末梢神経（図１３Ａ～１３Ｃ）でのみ観察された。要約すると、これらの所見は、ＡＡＶｈｕ６８－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１ベクターの高用量ＩＣＭ送達が、非ヒト霊長類において良好に耐容されたことを示唆する。加えて、このデータセットからの結論は、ｐＰＣＲ分析と一致して、堅牢なＵＢＥ３Ａアイソフォーム１転写産物局在化が全てのＤＲＧセグメントで検出することができたことである。治療されたＮＨＰでは、堅牢な導入遺伝子ＤＲＧ発現にもかかわらず、顕著なＡＡＶ毒性は存在しない。

実施例３－アカゲザルにおけるｈＵＢＥ３Ａアイソフォーム１±ｍｉＲ１８３標的配列の安全性及び発現を調査するＮＨＰパイロット研究
非ヒト霊長類及びヒトにおける高用量ＡＡＶ誘導性ＤＲＧ毒性に関する懸念を理由に、同時に、ＤＲＧにおけるアイソフォーム１タンパク質発現を下方制御し、したがって、ＤＲＧ毒性を緩和するために、マイクロＲＮＡ戦略を用いた。ｍｉＲ１８３標的部位を導入遺伝子の３’ＵＴＲ（この場合、ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１）に含めることは、脳内の標的ニューロンへの治療的導入遺伝子発現を維持しながら、ＤＲＧの感覚ニューロンにおけるアイソフォーム１導入遺伝子ｍＲＮＡのＲＩＳＣ複合体媒介性分解を選択的に促進する。最も高発現の操作されたアイソフォーム１又はアイソフォーム２の３’末端とＳＶ４０ポリアデニル化部位との間に、ｍｉＲ１８３結合部位の４つのコピーを挿入し、ＡＡＶｈｕ６８カプシドにパッケージングした。配列番号１１は、ｍｉＲＮＡ１８３（又はｍｉＲ１８３）標的化配列の１つのコピーの配列を提供する。この方式で、ＡＡＶ－ｈｕ６８－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１－４ｘｍｉＲ１８３を生成した。ＡＡＶｈｕ６８カプシドを、パッケージング宿主細胞において、３重トランスフェクション技術を使用して、ＡＡＶ２ ｒｅｐコード配列及び配列番号１４のｈｕ６８ ＶＰ１コード配列を含むトランスプラスミド中に生成し、ベクターゲノムを含有するシスプラスミド及びパッケージング宿主細胞によって提供されない必要なアデノウイルスヘルパー機能を発現するトランスプラスミドとともに同時トランスフェクトする。

４×ｍｉＲ１８３カセットを含めることは、成体野生型又は１×１０^１１ＧＣ／動物の用量で静脈内注射されたＡＳマウスにおいて、ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１又はアイソフォーム２タンパク質発現に顕著な影響を及ぼさなかった。

次に、アカゲザルにおけるｒＡＡＶｈｕ６８－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１－４ｘｍｉＲ１８３ベクターの安全性及び発現プロファイルを、以前に分析したｒＡＡＶｈｕ６８－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１－ｍｉＲ１８３ベクターと比較した。ＡＡＶ－ｈｕ６８－シナプシン－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１－４ｘｍｉＲ１８３を３×１０^１３ＧＣ／動物で３匹のサルの大槽に注射し、３５日後に分析のためにサルを捕獲した。全ての動物は、研究期間中、臨床的に普通の状態であった。予想されるように、髄質などのいくつかの脳領域で、低レベルのアイソフォーム１－ｍｉＲ１８３ベクターが観察され、後根神経節及び脊髄においてレベルはより高かった。加えて、後根神経節及び脊髄では、低いヒトアイソフォーム１－ｍｉＲ１８３ ｍＲＮＡ発現を検出したが、これは多くの場合、アイソフォーム１と同等であった。アイソフォーム１のように、アイソフォーム１－ｍｉＲ１８３は、非ヒト霊長類において良好に耐容され、免疫原性はわずかであり、凝固、肝臓及び腎臓機能に影響を及ぼさなかった。同様に、アイソフォーム１－ｍｉＲ１８３で治療したサルでは、顕著なＤＲＧ又はニューロン毒性は観察されなかった。図３Ａ～３Ｂを参照されたい。末梢神経におけるｒＡＡＶｈｕ６８．シナプシン－
ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１の影響を、図４Ａ～４Ｂに示す。

ベクター生体分布及びｍＲＮＡ発現を評価し、図２Ａ～２Ｃに示した。

要約すると、これらの所見は、ＡＡＶｈｕ６８－ｈＳｙｎ－ＵＢＥ３Ａ－アイソフォーム１－ｍｉＲ１８３ベクターの高用量ＩＣＭ送達が、非ヒト霊長類において良好に耐容されたことを示唆する。このベクターは、非ヒト霊長類では有用ではないが、ヒト臨床試験で行う場合、ＤＲＧ及びニューロン毒性を緩和するのに有用であり得る。

本明細書で引用される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。「２１－９５７９ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」という名前で本明細書とともに提出された配列表、並びにその中の配列及びテキストは、参照により組み込まれる。２０２０年１２月１日に出願された米国仮出願第６３／１１９，８６０号、及び２０２１年４月２６日に出願された米国仮出願第６３／１７９，８０７号は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して説明されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (22)

1. アンジェルマン症候群（ＡＳ）の治療に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のストックを含む組成物であって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムと、を含み、前記ベクターゲノムが、
   （ａ）ＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、
   （ｂ）配列番号９、又はそれと少なくとも９５％同一のＵＢＥ３Ａアイソフォーム１タンパク質をコードする配列（配列番号２）を含む、ＵＢＥ３Ａ核酸配列であって、前記核酸配列が、ヒト細胞において前記ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現を調節する調節要素に操作可能に連結している、ＵＢＥ３Ａ核酸配列、
   （ｃ）（ｂ）の前記ＵＢＥ３Ａの発現を指示する調節要素、及び
   （ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲ、を含む、組成物。
2. 前記調節要素が、ニューロン特異的プロモーターを含む、請求項１に記載の組成物
3. 前記ニューロン特異的プロモーターが、シナプシンプロモーターである、請求項２に記載の組成物。
4. 前記シナプシンプロモーターが、配列番号１２の核酸配列を有する短縮されたプロモーターである、請求項３に記載の組成物。
5. 前記調節要素が、構成的プロモーターを含む、請求項１に記載の組成物。
6. 前記調節要素が、１つ以上のエンハンサー及び１つ以上のイントロンを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記調節配列が、ｍｉＲ１８２及び／又はｍｉＲ１８３から選択される後根神経節におけるｍｉＲの１つ以上の標的化配列を更に含み、前記標的化配列が、前記ＵＢＥ３Ａ核酸配列に操作可能に連結されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記調節配列が、ｍｉＲ１８２及び／又はｍｉＲ１８３から選択される後根神経節におけるｍｉＲの１つ以上の標的化配列を更に含み、前記標的化配列が、前記ＵＢＥ３Ａ核酸配列の下流に位置する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記調節配列が、ｍｉＲ１８３の４つの標的化配列を更に含み、前記標的化配列が、前記ＵＢＥ３Ａ核酸配列の下流に位置する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記調節配列が、配列番号１１の４つのコピーを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記ＡＡＶカプシドが、配列番号１４又は配列番号１６の核酸配列の発現から生成されるＡＡＶｈｕ６８カプシドである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｒｈ９１カプシドである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
14. 前記ＡＡＶカプシドが、配列番号１７又は配列番号１９の核酸配列の発現から生成され
    るＡＡＶｒｈ９１カプシドである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
15. 生理学的に適合する担体、緩衝液、アジュバント、及び／又は希釈剤を更に含む水性懸濁液である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. アンジェルマン症候群を有する患者の治療に使用するための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
17. アンジェルマン症候群の１つ以上の症状であって、任意選択的に、発育遅延、知的障害、重度の言語障害、運動失調、及び／又はてんかんのうちの１つ以上から選択される、症状の治療に使用するための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
18. アンジェルマン症候群を治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
19. ニューロンにＵＢＥ３Ａ発現が欠損している患者における、アンジェルマン症候群の１つ以上の症状を治療するための方法であって、前記方法が、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物を送達することを含む、方法。
20. 前記症状が、発育遅延、知的障害、重度の言語障害、運動失調、及び／又はてんかんのうちの１つ以上から選択される、請求項１８又は１９に記載の方法。
21. 前記組成物が、前記患者に髄腔内送達される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物、請求項１６若しくは１７に記載の使用、又は請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記患者が、少なくとも１×１０^１０～１×１０^１３ＧＣ／ｋｇの前記ｒＡＡＶを注射される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物、請求項１６若しくは１７に記載の使用、又は請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。

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