CN113646005A - 用于drg特异性降低转基因表达的组合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了一种重组AAV(rAAV)，所述rAAV包括AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，其中所述载体基因组包括AAV 5'反向末端重复序列(ITR)、对用于在靶细胞中表达的基因产物进行编码的工程化核酸序列以及选择性地抑制背根神经节(DRG)细胞中的表达的miRNA靶序列。还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括在调配物缓冲液中的如本文所描述的rAAV，以及一种在选择性地阻止DRG细胞中的表达的同时用靶向CNS的基因疗法治疗人类受试者的方法。

Description

用于DRG特异性降低转基因表达的组合物
背景技术
用于体内基因疗法的精选载体平台基于灵长类动物源性腺相关病毒(AAV)。在二十世纪六十年代，基因疗法产物源自从腺病毒制剂中分离的AAV(Hoggan,M.D.等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》55:1467-1474,1966)。尽管这些载体是安全的，但由于转导较差，许多程序在临床上失败了。在世纪之交，研究人员发现了内源性AAV家族，其作为载体实现了更高的转导效率，同时保持了良好的安全性特性(Gao,G.等人,《病毒学杂志(J Virol)》78:6381-6388,2004)。
宿主对AAV载体的不良应答很小。与引发强烈急性炎性应答的非病毒和腺病毒载体(Raper,S.E.等人,《分子遗传学与代谢(Mol Genet Metab)》80:148-158,2003；Zhang,Y.等人,《分子疗法(Mol Ther)》3:697-707,2001)相比，AAV载体不是促炎性的。在AAV载体施用之后，对载体转导细胞(如细胞毒性T细胞)的破坏性适应性免疫应答很小。有证据证明，在动物和人中，在某些情况下，AAV可以诱导对衣壳或转基因产物的耐受性，这取决于血清型、剂量、施用途径和免疫抑制方案(Gernoux,G.等人,《人类基因疗法(Hum Gene Ther)》28:338-349,2017；Mays,L.E.和Wilson,J.M.《分子疗法》19:16-27,2011；Manno,C.S.等人,《自然医学(Nat Med)》12:342-347,2006；Mingozzi,F.等人,《血液(Blood)》110:2334-2341,2007)。然而，鉴于目前AAV基因疗法的临床应用的扩展，开始看到可能限制此技术的临床影响的毒性。
最严重的毒性出现在静脉内施用高剂量的AAV以靶向CNS和肌肉骨骼***之后。对非人灵长类动物(NHP)的研究表明，血小板减少症和转氨酶升高会急剧发展，这在一些情况下会演变成致命的出血和休克综合征(Hordeaux,J.等人,《分子疗法》26:664-668,2018；Hinderer,C.等人,《人类基因疗法》29(3):285-298,2018)。在大多数高剂量AAV临床试验中也观察到肝酶急剧升高和/或血小板减少(AveXis,I.《ZOLGENSMA处方信息(ZOLGENSMAPrescribing Information)》,2019；索利德生物科技公司(Solid Biosciences)提供了SGT-001程序更新,2019；辉瑞公司(Pfizer)，辉瑞公司公布了杜氏肌营养不良症(DMD)的1b期基因疗法研究的初步临床数据,2019；Flanigan,K.T.等人,《分子遗传学与代谢》126:S54,2019)。虽然不常见，但严重的毒性以贫血、肾功能衰竭和补体活化为特征(索利德生物科技公司,2019；辉瑞公司,2019)。
最近，已经观察到接受AAV载体进入到脑脊液(CSF)中或以高剂量进入到血液中的NHP和猪的背根神经节(DRG)中的神经元变性的问题(Hinderer,C.等人,《人类基因疗法》29(3):285-298,2018；Hordeaux,J.等人，《分子疗法方法临床发展(Mol Ther Methods ClinDev)》10:68-78,2018；Hordeaux,J.等人,《分子疗法方法临床发展》10:79-88,2018)。这种神经元毒性与外周神经中的外周轴突和通过脊髓背柱上升的中枢轴突两者的变性相关联。
本领域需要用于基因疗法的组合物和方法，所述组合物和方法使基因产物在对毒性更敏感的细胞中的表达最小化。
发明内容
在某些实施例中，提供了组合物和方法，所述组合物和方法抑制DRG神经元中的转基因表达。有利地，这些组合物减少神经元变性和/或减少继发性脊髓背侧轴突变性，所述神经元变性和/或继发性脊髓背侧轴突变性可能由鞘内或全身基因疗法施用之后的过度表达和/或免疫介导的毒性引起。
在某些实施例中，提供了一种用于基因递送的组合物，所述组合物特异性地抑制基因产物在背根神经节(DRG)中的表达，所述组合物包括表达盒。在某些实施例中，所述表达盒是包括以下的核酸序列：(a)在调控序列的控制下的基因产物的编码序列，所述调控序列引导所述基因产物在含有所述表达盒的细胞中的表达；以及(b)至少一个靶序列，所述至少一个靶序列对miR-183、miR-182或miR-96中的至少一个具有特异性，所述至少一个靶序列可操作地连接在所述编码序列(a)的3'端处。在某些实施例中，所述表达盒由非病毒载体、病毒载体或基于非载体的递送***携带。在某些实施例中，所述组合物包括靶向序列的至少两个串联重复序列，所述靶向序列包括可以相同或不同的至少一个第一miRNA靶序列和至少一个第二miRNA靶序列。在某些实施例中，所述表达盒包括定位在3'UTR中的至少两个miRNA串联重复序列。在某些实施例中，所述表达盒包括具有三个miRNA串联重复序列的3'UTR。在某些实施例中，至少两个DRG特异性miRNA靶序列定位在所述5'UTR和所述3'UTR两者中。在某些实施例中，所述表达盒由选自以下的病毒载体携带：重组细小病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺病毒。在某些实施例中，所述表达盒由选自以下的非病毒载体或递送***携带：裸DNA、裸RNA、无机颗粒、脂质颗粒、基于聚合物的载体或基于壳聚糖的调配物。
在某些实施例中，提供了一种组合物，所述组合物包括表达盒，其中所述至少两个miRNA串联重复序列中的第一个的起点在距基因编码序列的3'端20个核苷酸内。在某些实施例中，所述组合物包括表达盒，其中所述至少两个miRNA串联重复序列中的第一个的起点距基因编码序列的3'端至少100个核苷酸。在某些实施例中，提供了一种组合物，所述组合物包括表达盒，其中所述3'UTR和所述miRNA串联重复序列的长度为200到1200个核苷酸。在某些实施例中，所述表达盒包括定位在所述3'UTR中的四个miRNA靶序列。在某些实施例中，提供了一种组合物，其中所述表达盒进一步包括至少一个靶序列，所述至少一个靶序列对5'UTR中的miR-183、miR-182或miR-96具有特异性。在某些实施例中，所述表达盒包括定位在5'UTR和3'UTR两者中的至少两个miRNA靶序列。在某些实施例中，所述表达盒包括至少一个靶序列，所述至少一个靶序列对5'UTR中的miR-183、miR-182或miR-96具有特异性。在某些实施例中，所述表达盒包括定位在5'UTR和3'UTR两者中的至少两个miRNA靶序列。
在某些实施例中，提供了一种组合物，所述组合物包括表达盒，其中两个或更多个连续的miRNA靶序列是连续的并且不由间隔子隔开。在某些实施例中，所述miRNA靶序列中的两个或更多个miRNA靶序列由间隔子隔开，并且每个间隔子不同。在某些实施例中，定位在所述miRNA靶序列之间的所述间隔子定位在第一个miRNA靶序列的3'和/或最后一个miRNA靶序列的5'。在某些实施例中，所述miRNA靶序列之间的所述间隔子是相同的。
在某些实施例中，提供了一种用于向有需要的患者递送基因产物的重组AAV(rAAV)，所述rAAV特异性地抑制基因产物在DRG中的表达，所述rAAV包括其中包装有AAV载体基因组的病毒衣壳，其中所述载体基因组包括：(a)在调控序列的控制下的所述基因产物的编码序列，所述调控序列引导所述基因产物在含有所述载体基因组的细胞中的表达；以及(b)至少一个miRNA靶序列，所述至少一个miRNA靶序列对miR-183、miR-182或miR-96中的至少一个具有特异性。
在某些实施例中，所述组合物包括表达盒或rAAV和适于通过脑室内(ICV)、鞘内(IT)、脑池内或静脉内(IV)注射递送的调配物缓冲液。
在某些实施例中，提供了一种用于抑制DRG神经元中的转基因表达的方法。所述方法包括向患者递送含有表达盒和/或rAAV的组合物。在某些实施例中，与没有miRNA串联重复序列的基因疗法相比，所述方法允许免疫抑制疗法的剂量或持续时间减少。
在某些实施例中，提供了一种用于在鞘内或全身基因疗法施用之后调节神经元变性和/或减少继发性脊髓背侧轴突变性的方法。所述方法包括向患者递送含有表达盒和/或rAAV的组合物。在某些实施例中，与没有miRNA串联重复序列的基因疗法相比，所述方法允许免疫抑制疗法的剂量或持续时间减少。
在某些实施例中，提供了一种用于在鞘内或全身基因疗法施用之后增强转基因在中枢神经***(CNS)的细胞中的表达的方法。所述方法包括向患者递送含有表达盒和/或rAAV的组合物。在某些实施例中，表达盒或rAAV载体基因组包括至少一个miR183靶序列。在某些实施例中，在所述CNS的包含以下中的一种或多种的细胞中增强转基因表达：锥体神经元、浦肯野神经元(purkinje neuron)、颗粒细胞、纺锤形神经元、中间神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞。
根据本发明的以下详细描述，本发明的其它方面和优点将显而易见。
附图说明
图1A-图1C示出了在AAV ICM施用之后的DRG毒性和继发性轴突病。(图1A)DRG含有感觉假单极神经元的细胞体，所述感觉假单极神经元通过定位在外周神经中的外周轴突和定位在脊髓的上升背侧白质束中的中枢轴突将感觉信息从外周中继到CNS。(图1B)轴突病和DRG神经元变性。轴突病(左上)表现为透明液泡，所述透明液泡是空的(缺失轴突)或充满消化髓鞘和细胞碎片的巨噬细胞(箭头)。DRG病变(右上和左下)由神经元细胞体变性(箭头)和单核细胞浸润(圆圈)组成。由于尼氏体(Nissl bodies)溶解(中央染色质溶解)，嗜酸性(粉红)细胞质是变性神经元的特征。增加的细胞性是由于卫星细胞增殖(卫星状态)和炎性细胞浸润而引起的。一些单核细胞浸润并吞噬神经元细胞体(噬神经细胞现象(neuronophia))。右下图片示出了由AAV编码的转基因的免疫染色(在这种情况下为GFP)。表现出退行性变化和单核细胞浸润的神经元是示出最强蛋白质表达的神经元(由IHC上的深棕色染色证明)。(图1C)1级到5级DRG病变和1级到4级脊髓背侧轴突病的实例。严重程度等级定义如下：1轻微(<10％)、2轻度(10-25％)、3中度(25-50％)、4显著(50-95％)和5严重(>95％)。在脊髓中从未观察到5级。箭头和圆圈界定了DRG(左列)和轴突病(右列)中具有单核细胞浸润的神经元变性。
图2A-图2B示出了过表达相关毒性模型和使用miRNA诱导的沉默的缓解策略。(图2A)假单极感觉神经元细胞体定位在DRG内，被卫星细胞和有孔毛细血管包围。假单极感觉神经元的外周轴突定位在外周神经中，并且中央轴突定位在脊髓的背侧束中。AAV载体劫持转录和蛋白质合成机制并使其过载，因此导致ER应激，且继而无法维持远侧轴突。卫星细胞经历反应性增殖并分泌细胞因子，由此吸引如淋巴细胞等炎性细胞。这些可逆的变化最终可能导致细胞死亡。随后，神经胶质细胞和巨噬细胞浸润并吞噬神经元细胞体。(图2B)DRG特异性沉默的示例性AAV表达盒设计。在终止密码子与poly-A之间引入了miRNA反向互补序列(miR靶标或靶序列)的四个短串联重复序列。在DRG神经元中，如miRNA 183等miRNA结合mRNA的3'非翻译区并募集RNA诱导的沉默复合物(RISC)，所述RISC进而通过mRNA切割导致沉默。在不表达miRNA 183的其它细胞类型中，翻译和蛋白质合成发生，而不受3'UTR区的任何影响。
图3A-图3D示出miR183靶标在体外和小鼠DRG神经元中使转基因表达特异性地沉默。(图3A)用含有miR183或miR145靶标的表达GFP的AAV质粒和对照物或miR183表达载体瞬时共转染293细胞。在转染后72小时检测了GFP蛋白质水平，并用蛋白质印迹法对水平进行定量。一式三份地进行实验。误差条指示标准偏差。(图3B)以4×1012gc的剂量用AAV9.CB7.GFP对照载体或AAV9.CB7.GFP-miR载体对C57BL6/J小鼠进行IV注射。筛选了三个富含DRG的miR：miR183、miR145和miR182。在注射后两周采集DRG，并使用IHC对GFP进行染色。使用ImageJ细胞计数器工具，对表达GFP的神经元占总DRG神经元的百分比进行计数。威尔科克森检验(Wilcoxon test)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。(图3C)此处，示出了来自在图3B中的图中定量的DRG的GFP免疫染色的代表性图片。(图3d)用AAV-PHP.B.CB7.GFP对照载体或AAV-PHP.B.CB7.GFP-miR(miR183、miR145、miR182)对C57BL6/J小鼠进行IV注射。在注射后三周采集了CNS和肝脏以使用荧光显微镜进行直接GFP观察。此处，示出了小脑、皮质和肝脏的代表性图片。
图4A-图4C示出了在将AAVhu68.GFP ICM施用于NHP之后，miR183靶标使DRG中的GFP表达特异性地沉默并降低毒性。用3.5×1013GC的AAVhu68.CB7.GFP对照载体(n＝2)或AAVhu68.CB7.GFP-miR183(n＝4)对成年恒河猴进行ICM注射。在注射后两周处死一半动物以进行GFP表达分析，并且在注射后两个月处死另一半动物以用于GFP表达和组织病理学。(图4A)载体施用后两周的DRG、脊髓运动神经元、小脑、皮质、心脏和肝脏的GFP免疫染色切片的代表性图片。(图4B)NHP(n＝2AAV.GFP，n＝4AAV.GFP-miR183)中的DRG(感觉神经元)、脊髓(下运动神经元)、小脑和皮质中的GFP阳性细胞的定量。使用ImageJ细胞计数器工具对每只动物每个区域最少五个20×放大视野进行定量。误差条指示标准偏差。威尔科克森检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。(图4C)注射后两个月的组织病理学示出了脊髓背侧轴突病、外周神经轴突病(正中神经、腓神经和桡神经)和DRG神经元变性和单核浸润的严重程度等级。对载体组不知情的经委员会认证的兽医病理学家确立了严重程度等级，所述严重程度等级定义如下：1轻微(<10％)、2轻度(10-25％)、3中度(25-50％)、4显著(50-95％)和5严重(>95％-未观察到)。每个条表示一只动物。0代表示没有病变。
图5示出了在将AAVhu68.hIDUA ICM施用于NHP之后，miR183靶标使DRG中的hIDUA表达特异性地沉默。使用以下对成年恒河猴进行ICM注射：1)1×1013GC的AAVhu68.CB7.hIDUA对照载体(n＝3)；2)在预防性类固醇治疗的情况下，AAVhu68.CB7.hIDUA对照载体(从第-7天到第30天，1mg/kg/天的***龙，然后逐渐减少，n＝3)；或3)AAVhu68.CB7.hIDUA-miR183(n＝3)。注射后三个月处死动物以分析转基因表达和组织病理学。代表性图片示出了通过抗hIDUA抗体免疫荧光(DRG，第一行)、抗hIDUA IHC(下运动神经元、小脑、皮质)和抗IDUA ISH(DRG，最后一行)对hIDUA表达的分析。hIDUAISH：对于具有和不具有类固醇的AAVhu68.hIDUA，暴露时间为200毫秒。感觉神经元示出大量转基因mRNA表达。对于AAV.hIDUA-miR183，暴露时间为1秒。感觉神经元在细胞核和细胞质中具有低ISH信号(mRNA)。在此较高的暴露时间，mRNA在围绕神经元的卫星细胞中是可见的。
图6A-图6C示出miR183介导的沉默对DRG神经元具有特异性，并且在用AAVhu68.hIDUA ICM治疗的NHP中完全预防DRG毒性。(图6A)NHP(每组n＝3)中的DRG(感觉神经元)、脊髓(下运动神经元)、小脑和皮质中的hIDUA阳性细胞的定量。对每只动物每个区域最少五个20×放大视野进行定量。误差条表示标准偏差。威尔科克森检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。(图6B)注射后三个月的组织病理学评分：背侧轴突病累积评分(来自颈椎、胸椎和腰椎区段的严重程度等级的总和-最高可能评分15)；DRG累积评分(来自颈椎、胸椎和腰椎区段的严重程度等级的总和-最高可能评分15)以及正中神经评分(轴突病和纤维化严重程度等级的总和-最高可能评分10)。对载体组不知情的经委员会认证的兽医病理学家确立了严重程度等级，所述严重程度等级定义如下：1轻微(<10％)、2轻度(10-25％)、3中度(25-50％)、4显著(50-95％)和5严重(>95％-未观察到)。0代表示没有病变。误差条表示标准偏差。(图6C)使用hIDUA转基因特异性探针进行ISH，高放大倍数的DRG感觉神经元和卫星细胞；使用蓝色DAPI核复染剂的暴露时间为1秒。箭头：DRG感觉神经元；箭头状物：卫星细胞。
图7A-图7D示出了对NHP中的hIDUA的T细胞和抗体应答。使用以下对成年恒河猴进行ICM注射：1)1×1013GC的AAVhu68.CB7.hIDUA对照载体(n＝3)；2)在预防性类固醇治疗的情况下，AAVhu68.CB7.hIDUA对照载体(从第-7天到第30天，1mg/kg/天的***龙，然后逐渐减少，n＝3)；或3)AAVhu68.CB7.hIDUA-miR183(n＝3)。(图7A-图7C)注射后90天从PBMC、脾、肝和颈深***中分离的淋巴细胞中的干扰素γELISPOT应答。每只动物具有表示不同肽池的三个值(覆盖整个hIDUA序列的三个重叠肽池)。红色指示被定义为每106个淋巴细胞>55个点形成单位的阳性ELISPOT应答，并且是无刺激时培养基阴性对照物的三倍。(图7D)抗hIDUA抗体ELISA测定，血清稀释度1:1,000。
图8示出了CSF中的细胞因子/趋化因子的浓度。在载体施用时(D0)和载体施用后24小时(24h)、第21天(D21)和第35天(D35)收集样品。
图9示出了NHP中的脑、脊髓和DRG中的载体生物分布。使用以下对成年恒河猴进行ICM注射：1)1×1013GC的AAVhu68.CB7.hIDUA对照载体(n＝3)；2)在预防性类固醇治疗的情况下，AAVhu68.CB7.hIDUA对照载体(从第-7天到第30天，1mg/kg/天的***龙，然后逐渐减少，n＝3)；或3)AAVhu68.CB7.hIDUA-miR183(n＝3)。用QIAamp DNA迷你试剂盒提取NHP组织DNA。使用Taqman试剂和靶向载体的rBG聚腺苷酸化序列的引物/探针，通过实时聚合酶链反应对载体基因组进行定量。结果以每个二倍体基因组的基因组拷贝数表示。误差条表示标准偏差。
具体实施方式
本文所提供的组合物和方法可用于通过使用miRNA抑制DRG神经元中的转基因表达的基因递送疗法。如本文所使用的，术语“抑制”包含转基因表达的部分减少或完全消失或沉默。转基因表达可以使用适于所选转基因的测定来评估。所提供的组合物和方法降低了以神经元变性、继发性脊髓背侧轴突变性和/或单核细胞浸润为特征的DRG的毒性。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包括基因产物编码序列的非翻译区(UTR)3'中的一个或多个miRNA靶序列。适当地，提供串联的两个或更多个miRNA靶序列，所述两个或更多个miRNA靶序列任选地由间隔子序列隔开。在某些实施例中，提供串联的三个或更多个miRNA靶序列，所述三个或更多个miRNA靶序列任选地由间隔子序列隔开。在某些实施例中，提供串联的三个或更多个miRNA靶序列，所述三个或更多个miRNA靶序列任选地由间隔子序列隔开。多种递送***可以用于将表达盒递送到受试者，例如，人类患者。此类递送***可以是病毒载体、非病毒载体或基于非载体的***(例如，脂质体、裸DNA、裸RNA等)。这些递送***可以用于直接递送到中枢神经***(CNS)、外周神经***(PNS)或用于静脉内或替代性递送途径。在其它实施例中，这些组合物和方法用于基因疗法载体(例如，rAAV)的全身递送。在某些实施例中，这些组合物和方法在递送高剂量载体(例如，rAAV)的情况下是有用的。在某些实施例中，本文所提供的组合物和方法使要与基因疗法载体(例如，rAAV介导的基因疗法)共同施用的免疫调节剂的剂量减少、长度减小和/或数量减少。在某些实施例中，本文所提供的组合物和方法消除了在施用病毒载体(例如，rAAV)之前、同时和/或之后共同施用免疫抑制剂或免疫调节疗法的需要。
“5'UTR”位于基因产物编码序列的起始密码子的上游。5'UTR通常比3'UTR短。通常，5'UTR的长度为约3个核苷酸到约200个核苷酸，但可以任选地更长。
“3'UTR”位于基因产物的编码序列的下游，并且通常比5'UTR长。在某些实施例中，3'UTR的长度为约200个核苷酸到约800个核苷酸，但可以任选地更长或更短。
如本文所使用的，“miRNA”是指微RNA，其是一种调控mRNA并阻止其被翻译成蛋白质的小的非编码RNA分子。miRNA含有“种子序列”，所述种子序列是核苷酸区，所述核苷酸区通过互补碱基配对与mRNA特异性地结合，从而导致mRNA破坏或沉默。在某些实施例中，种子序列定位在成熟miRNA上(5'到3')并且通常定位在miRNA的位置2到7或2到8(从有义(+)链的5'端开始)处，虽然其长度可以更长。在某些实施例中，种子序列的长度不小于miRNA序列的长度的约30％，所述miRNA序列的长度可以为至少7个核苷酸到约28个核苷酸、长度为至少8个核苷酸到约28个核苷酸、7个核苷酸到28个核苷酸、8个核苷酸到18个核苷酸、长度为12个核苷酸到28个核苷酸、约20个到约26个核苷酸、约22个核苷酸、约24个核苷酸或约26个核苷酸。
如本文所使用的，“miRNA靶序列”是定位在DNA正链(5'到3')上的序列，并且至少部分地与miRNA序列互补，所述miRNA序列包含miRNA种子序列。miRNA靶序列对于经过编码的转基因产物的非翻译区是外源的，并且被设计成在期望抑制转基因表达的细胞中被miRNA特异性地靶向。术语“miR183簇靶序列”是指对miR183簇(可替代地被称为家族)的一个或多个成员有应答的靶序列，包含miR-183、miR-96和miR-182(如Dambal,S.等人所描述的,《核酸研究(Nucleic Acids Res)》43:7173-7188,2015，所述文献通过引用并入本文中)。不希望受理论束缚，用于转基因(对基因产物进行编码)的信使RNA(mRNA)存在于递送有含有miRNA的表达盒的细胞类型中，使得miRNA与3'UTR miRNA靶序列的特异性结合导致mRNA沉默和切割，由此减少或消除仅在表达miRNA的细胞中的转基因表达。
通常，miRNA靶序列的长度为至少7个核苷酸到约28个核苷酸、长度为至少8个核苷酸到约28个核苷酸、7个核苷酸到28个核苷酸、长度为8个核苷酸到18个核苷酸、长度为12个核苷酸到约28个核苷酸、约20个到约26个核苷酸、约22个核苷酸、约24个核苷酸或约26个核苷酸，并且其包含至少一个与miRNA种子序列互补的连续区(例如，7或8个核苷酸)。在某些实施例中，靶序列包括与miRNA种子序列具有精确互补性(100％)或部分互补性且具有一些错配的序列。在某些实施例中，靶序列包括与miRNA种子序列100％互补的至少7个到8个核苷酸。在某些实施例中，靶序列由与miRNA种子序列100％互补的序列组成。在某些实施例中，靶序列含有与种子序列100％互补的序列的多个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，100％互补性区包括靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，靶序列的剩余部分与miRNA具有至少约80％到约99％的互补性。在某些实施例中，在含有DNA正链的表达盒中，miRNA靶序列是miRNA的反向补体。
在某些实施例中，本文提供了工程化的表达盒或载体基因组，所述工程化的表达盒或载体基因组包括针对miR-183家族或簇的一个或多个成员的miR靶序列的至少一个拷贝，所述miR靶序列与转基因可操作地连接以抑制转基因在DRG中的表达和/或减少或消除DRG毒性和/或轴突病。在某些实施例中，工程化的表达盒或载体基因组包括多个miRNA靶序列，使得miRNA靶序列的数量足以减少或最小化DRG中的转基因表达以减少和/或消除DRG毒性和/或轴突病。表达盒或载体基因组可以通过任何合适的载体***、病毒载体或非病毒载体、通过任何途径递送，但特别适于鞘内施用。
如本文所使用的，术语“鞘内递送”或“鞘内施用”是指通过注射到椎管中，更具体地注射到蛛网膜下腔中使得其到达脑脊液(CSF)的施用途径。鞘内递送可以包含腰椎穿刺、心室内(包含脑室内(ICV))、枕骨下/脑池内和/或C1-2穿刺。例如，可以通过腰椎穿刺引入材料以在整个蛛网膜下腔扩散。在另一个实例中，可以向小脑延髓池(cisterna magna)中注射。
如本文所使用的，术语“脑池内递送”或“脑池内施用”是指直接进入到小脑延髓池(cisterna magna cerebellomedularis)的脑脊液中，更具体地是通过枕骨下穿刺或通过直接注射到小脑延髓池(cisterna magna)中或通过永久定位的管的施用途径。
出乎意料的是，已观察到包括本文所描述的用于抑制DRG中的表达的miR-183靶序列的组合物在中枢神经***内的一种或多种不同细胞类型(除了DRG之外)中提供增强的转基因表达，所述不同细胞类型包含但不限于神经元(包含例如锥体细胞、浦肯野细胞、颗粒细胞、纺锤形细胞和中间神经元细胞)或神经胶质细胞(包含例如星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞)。虽然这一观察是在鞘内递送途径之后进行的，但此CNS增强效果并不限于CNS递送途径，并且可以使用其它途径(例如，高剂量静脉内、高剂量肌内或其它全身递送途径)实现。
在某些实施例中，可能希望选择miR-182靶序列和/或miR-96靶序列用于包括不靶向CNS的转基因的表达盒，以避免增强转基因的CNS表达(同时抑制DRG表达)。例如，可能希望包括转基因的表达盒用于递送到骨骼肌或肝脏以避免CNS表达的任何增强，但预防可以与可能需要的高剂量相关的DRG毒性和/或轴突病。
在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有作为miR-183靶序列的至少一个miRNA靶序列。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有miR-183靶序列，其包含AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(SEQ ID NO:1)，其中与miR-183种子序列互补的序列加下划线。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有与miR-183种子序列100％互补的序列的多于一个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，miR-183靶序列的长度为约7个核苷酸到约28个核苷酸并且包含与miR-183种子序列至少100％互补的至少一个区。在某些实施例中，miR-183靶序列含有与SEQ ID NO:1具有部分互补性的序列，并且因此当与SEQ ID NO:1比对时，存在一个或多个错配。在某些实施例中，当与SEQ ID NO:1比对时，miR-183靶序列包括具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个错配的序列，其中错配可以不连续。在某些实施例中，miR-183靶序列包含具有100％互补性的区，所述区还包括miR-183靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，具有100％互补性的区包含与miR-183种子序列具有100％互补性的序列。在某些实施例中，miR-183靶序列的剩余部分与miR-183具有至少约80％到约99％的互补性。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含miR-183靶序列，所述miR-183靶序列包括截短的SEQ ID NO:1，即在SEQ ID NO:1的5'或3'端中的任一端或两端处缺少至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸的序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包括转基因和一个miR-183靶序列。在又其它实施例中，表达盒或载体基因组包括至少两个、三个或四个miR-183靶序列。
在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含miRNA靶序列的组合。在某些实施例中，靶序列的组合包含对相同miRNA(如miR-183)具有至少部分互补性的不同靶序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含选自如本文所提供的miR-183、miR-182和/或miR-96靶序列的miRNA靶序列的组合。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包括转基因和至少两个、三个或四个miR-96靶序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包括转基因和至少两个、三个或四个miR-182靶序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR-183靶序列，其任选地与至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR-182靶序列组合和/或任选地与至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR-96靶序列组合。
已观察到包括转基因和miR-182的组合物最小化或消除背根神经节毒性和/或预防轴突病。然而，虽然对于此目的而言是有效的，但尚未观察到含有miR-182靶序列的表达盒或载体基因组增强CNS表达，正如在具有miR-183靶序列的复合物中意外发现的那样。因此，这些组合物对于要在CNS外靶向的基因可能是期望的。
在某些实施例中，本文提供了一种表达盒或载体基因组，所述表达盒或载体基因组包括一个或多个miR-183家族靶序列并且缺乏转基因(即，一个或多个miR-183家族靶序列未与对异源基因产物进行编码的序列可操作地连接)。
在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有作为miR-182靶序列的至少一个miRNA靶序列。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有miR-182靶序列，其包含AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(SEQ ID NO:3)。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有与miR-182种子序列100％互补的序列的多于一个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，miR-182靶序列的长度为约7个核苷酸到约28个核苷酸并且包含与miR-182种子序列至少100％互补的至少一个区。在某些实施例中，miR-182靶序列含有与SEQ ID NO:3具有部分互补性的序列，并且因此当与SEQ ID NO:3比对时，存在一个或多个错配。在某些实施例中，当与SEQ ID NO:3比对时，miR-183靶序列包括具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个错配的序列，其中错配可以不连续。在某些实施例中，miR-182靶序列包含具有100％互补性的区，所述区还包括miR-182靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，具有100％互补性的区包含与miR-182种子序列具有100％互补性的序列。在某些实施例中，miR-182靶序列的剩余部分与miR-182具有至少约80％到约99％的互补性。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含miR-182靶序列，所述miR-182靶序列包括截短的SEQ IDNO:3，即在SEQ ID NO:3的5'或3'端中的任一端或两端处缺少至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸的序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包括转基因和一个miR-182靶序列。在又其它实施例中，表达盒或载体基因组包括至少两个、三个或四个miR-182靶序列。
在某些实施例中，表达盒或载体基因组具有连续的并且不由间隔子隔开的两个或更多个连续的miRNA靶序列。在某些实施例中，其中miRNA靶序列中的两个或更多个miRNA靶序列由间隔子隔开。在某些实施例中，间隔子是长度为约1个到约12个核苷酸或约2个到约10个核苷酸、或长度为约3个到约10个核苷酸、约4个到约6个核苷酸、或长度为3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个核苷酸的非编码序列。任选地，单个表达盒可以含有三个或更多个miRNA靶序列，任选地具有在其间的不同间隔子序列。在某些实施例中，一个或多个间隔子独立地选自：(i)GGAT(SEQ ID NO:5)；(ii)CACGTG(SEQ ID NO:6)；或(iii)GCATGC(SEQ ID NO:7)。在某些实施例中，间隔子定位在第一个miRNA靶序列的3'和/或最后一个miRNA靶序列的5'。在某些实施例中，所述miRNA靶序列之间的所述间隔子是相同的。
在某些实施例中，表达盒包括转基因和一个miR-183靶序列以及一个或多个不同的miRNA靶序列。在某些实施例中，表达盒含有miR-96靶序列：mRNA并且在DNA正链(5'到3')上：AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA(SEQ ID NO:2)；miR-182靶序列：mRNA并且在DNA正链(5'到3')上：和/或AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(SEQ ID NO:3)。
尽管在文献中miR-145与脑相关，但迄今为止的研究表明，miR-145靶序列对减少背根神经节中的转基因表达没有影响。miR-145靶序列：mRNA并且在DNA正链(5'到3')上：AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC(SEQ ID NO:4)。
如本文所提供的，表达盒和载体基因组含有可操作地连接或在调控序列的控制下的转基因，所述调控序列引导转基因产物在靶细胞中的表达。在某些实施例中，表达盒或载体基因组含有转基因，所述转基因与本文所提供的一个或多个miRNA靶序列可操作地连接。在某些实施例中，表达盒或载体基因组被设计成含有多个miRNA靶序列。将miRNA靶序列并入到转基因的UTR(即，基因开放阅读框的3'或下游)。
本文所使用的术语“串联重复序列”是指存在两个或更多个连续的miRNA靶序列。这些miRNA靶序列可以是连续的，即一个接一个地直接定位，使得一个靶序列的3'端直接位于下一个靶序列的5'端的上游，没有中间序列，或者反之亦然。在另一个实施例中，miRNA靶序列中的两个或更多个miRNA靶序列由短间隔子序列隔开。
如本文所使用的，“间隔子”是任何所选核酸序列，例如，长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸的定位在两个或更多个连续miRNA靶序列之间的核酸序列。在某些实施例中，间隔子的长度为1个到8个核苷酸、长度为2个到7个核苷酸、长度为3个到6个核苷酸、长度为四个核苷酸、4个到9个核苷酸、3个到7个核苷酸或更大的值。合适地，间隔子是非编码序列。在某些实施例中，间隔子可以具有四(4)个核苷酸。在某些实施例中，间隔子是GGAT。在某些实施例中，间隔子是六(6)个核苷酸。在某些实施例中，间隔子是CACGTG或GCATGC。
在某些实施例中，串联重复序列含有相同的miRNA靶序列中的两个、三个、四个或更多个。在某些实施例中，串联重复序列含有至少两个不同的miRNA靶序列、至少三个不同的miRNA靶序列或至少四个不同的miRNA靶序列等。在某些实施例中，串联重复序列可以含有相同的miRNA靶序列中的两个或三个以及不同的第四miRNA靶序列。
在某些实施例中，表达盒中可以有至少两组不同的串联重复序列。例如，3'UTR可以含有紧邻转基因下游的串联重复序列、UTR序列和两个或更多个更接近UTR的3'端的串联重复序列。在另一个实例中，5'UTR可以含有一个、两个或更多个miRNA靶序列。在另一个实例中，3'可以含有串联重复序列，并且5'UTR可以含有至少一个miRNA靶序列。
在某些实施例中，表达盒含有两个、三个、四个或更多个串联重复序列，所述串联重复序列在转基因的终止密码子的约0个到20个核苷酸内开始。在其它实施例中，表达盒含有距转基因的终止密码子至少100个到约4000个核苷酸的miRNA串联重复序列。
“包括”是意指包含其它组分或方法步骤的术语。当使用“包括”时，应当理解，相关实施例包含：使用“由……组成”术语的描述，其不包括其它组成或方法步骤；以及使用“基本上由……组成”术语的描述，其不包括基本上改变实施例或本发明的性质的任何组成或方法步骤。应当理解，虽然说明书中的各个实施例是使用“包括”语言来呈现的，但是在各种情况下，也使用“由……组成”或“基本上由……组成”语言来描述相关实施例。
应当注意，术语“一个/一种(a/an)”是指一个或多个/一种或多种，例如，“一种载体”应被理解为表示一种或多种载体。如此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换地使用。
如本文所使用的，除非另有说明，否则术语“约”意指相对于给定参考的正或负10％的变化性。
1.表达盒
如本文所描述的，“表达盒”包含对功能性基因产物进行编码的核酸序列，所述核酸序列与引导所述功能性基因产物在靶细胞中的表达的调控序列和UTR中的miRNA靶序列可操作地连接。如本文所描述的，miRNA靶序列被设计成由存在于细胞中的miRNA特异性地识别，在所述细胞中不期望转基因表达和/或期望降低转基因表达水平。在某些实施例中，miRNA靶序列特异性地降低背根神经节中的转基因的表达。在某些实施例中，miRNA靶序列定位在3'UTR、5'UTR和/或3'和5'UTR两者中。在本说明书中发现的miRNA靶序列的讨论通过引用并入本文中。
在一个实施例中，表达盒被设计成在人类受试者中表达，同时减少或消除转基因产物的DRG表达。在一个实施例中，表达盒被设计成在中枢神经***(CNS)中表达，所述CNS包含脑脊液和脑。在某些实施例中，表达盒或载体基因组被设计成在存在于CNS(不包括背根神经节)中的一种或多种细胞类型中表达或增强转基因的表达，所述细胞类型包含神经细胞(如锥体细胞、浦肯野细胞、颗粒细胞、纺锤形细胞和中间神经元细胞)和神经胶质细胞(如星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞)。在某些实施例中，在一种或多种细胞类型中实现了转基因的增强表达，在CNS的另一种细胞类型中几乎没有或没有转基因表达。在某些实施例中，表达盒可用于在除了CNS的细胞之外的细胞中表达。
如本文所使用的，术语“表达”或“基因表达”是指将来自基因的信息用于功能性基因产物的合成的过程。基因产物可以是蛋白质、肽或核酸聚合物(如RNA、DNA或PNA)。
如本文所使用的，术语“调控序列”或“表达控制序列”是指核酸序列，如起始子序列、增强子序列和启动子序列，所述核酸序列诱导、抑制或以其它方式控制与其可操作地连接的蛋白质编码核酸序列的转录。
如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指与对基因产物进行编码的核酸序列邻接的表达控制序列和/或以反式或在远处起作用以控制其转录和表达的表达控制序列两者。
如用于描述核酸序列或蛋白质的术语“外源性”意指核酸或蛋白质并非天然存在于其在染色体或宿主细胞中的存在位置中。外源性核酸序列还指源自相同宿主细胞或受试者并***到所述相同宿主细胞或受试者中的序列，但其以非天然状态存在，例如，不同的拷贝数或在不同调控元件的控制下。
如用于描述核酸序列或蛋白质的术语“异源性”意指核酸或蛋白质源自与在其中表达所述核酸或蛋白质的宿主细胞或受试者不同的生物体或相同的生物体的不同物种。术语“异源性”当参考质粒、表达盒或载体中的蛋白质或核酸使用时表明蛋白质或核酸与另一序列或子序列一起存在，在自然界中未发现所讨论蛋白质或核酸与所述蛋白质或核酸彼此间的相同关系。
在一个实施例中，调控序列包括启动子。在一个实施例中，启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。在另外的实施例中，启动子是巨细胞病毒立即早期增强子和鸡β-肌动蛋白启动子(CB7启动子)的杂合体。在另一个实施例中，合适的启动子可以包含但不限于以下：延伸因子1α(EF1α)启动子(参见例如Kim DW等人,使用人延伸因子1α启动子作为通用且高效的表达***(Use of the human elongation factor 1alpha promoter as a versatile andefficient expression system).《基因(Gene.)》1990年7月16日；91(2):217-23)；突触蛋白1启动子(参见例如Kügler S等人,人突触蛋白1基因启动子根据转导区域从成年大鼠脑中的腺病毒载体赋予高度神经元特异性的长期转基因表达(Human synapsin1genepromoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression froman adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transducedarea).《基因疗法(Gene Ther.)》2003年2月；10(4):337-47)；神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子(参见例如Kim J等人,富含胆固醇的脂质筏参与白介素6诱导的LNCaP***癌细胞的神经内分泌分化(Involvement of cholesterol-rich lipid rafts in interleukin-6-induced neuroendocrine differentiation of LNCaP prostate cancer cells).《内分泌学(Endocrinology.)》2004年2月；145(2):613-9电子版2003年10月16日)；或CB6启动子(参见例如携带人存活运动神经元基因的腺相关病毒载体血清型9的大规模生产(Large-Scale Production of Adeno-Associated Viral Vector Serotype-9Carrying theHuman Survival Motor Neuron Gene),《分子生物技术(Mol Biotechnol.)》2016年1月；58(1):30-6.doi:10.1007/s12033-015-9899-5)。
可以选择合适的启动子，包含但不限于组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型/调控启动子。组成型启动子的实例是鸡β-肌动蛋白启动子。多种鸡β-肌动蛋白启动子已单独描述，或与各种增强子元件(例如，CB7是具有巨细胞病毒增强子元件的鸡β-肌动蛋白启动子；CAG启动子，其包含启动子、鸡β肌动蛋白的第一外显子和第一内含子以及兔β珠蛋白基因的剪接受体；CBh启动子，SJ Gray等人,《人类基因疗法》,2011年9月；22(9):1143-1153)组合。众所周知，组织特异性启动子的实例用于肝(白蛋白，Miyatake等人,(1997)《病毒学杂志》,71:5124-32；乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人,(1996)《基因疗法》,3:1002-9；甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人,(1996)《人类基因疗法》,7:1503-14)、神经元(如神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子，Andersen等人,(1993)《细胞分子神经生物学(Cell.MolNeurobiol.)》,13:503-15；神经细丝轻链基因，Piccioli等人,(1991)《美国国家科学院院刊》,88:5611-5；以及神经元特异性vgf基因，Piccioli等人,(1995)《神经元(Neuron)》,15:373-84)以及其它组织。可替代地，可以选择可调控的启动子。参见例如WO 2011/126808B2，其通过引用并入本文中。
在一个实施例中，调控序列进一步包括增强子。在一个实施例中，调控序列包括一个增强子。在另一个实施例中，调控序列含有两个或更多个表达增强子。这些增强子可以相同或者可以不同。例如，增强子可以包含αmic/bik增强子或CMV增强子。这种增强子可以存在于彼此相邻定位的两个拷贝中。可替代地，增强子的双拷贝可以被一个或多个序列隔开。
在一个实施例中，调控序列进一步包括内含子。在另外的实施例中，内含子是鸡β-肌动蛋白内含子。其它合适的内含子包含本领域已知的内含子，所述内含子可以是人β-球蛋白内含子和/或可商购获得的
Figure BDA0003221999180000151
内含子以及WO 2011/126808中描述的内含子。
在一个实施例中，调控序列进一步包括聚腺苷酸化信号(polyA)。在另外的实施例中，polyA是兔珠蛋白polyA。参见例如WO 2014/151341。可替代地，另一种polyA(例如，人生长激素(hGH)聚腺苷酸化序列、SV40 polyA或合成polyA)可以包含在表达盒中。
应当理解，本文所描述的表达盒中的组合物旨在应用于本说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。
表达盒可以通过任何合适的非病毒载体递送***或通过合适的病毒载体递送。合适的非病毒载体递送***是本领域已知的(参见例如Ramamoorth和Narvekar.《临床诊断研究(J Clin Diagn Res.)》2015年1月；9(1):GE01-GE06，其通过引用并入本文中)并且可以由本领域技术人员容易地选择并且可以包含例如裸DNA、裸RNA、树状聚合物、PLGA、聚甲基丙烯酸酯、无机颗粒、脂质颗粒、基于聚合物的载体或基于壳聚糖的调配物。
2.载体
如本文所使用的，“载体”是包括核酸序列的生物或化学部分，所述生物或化学部分可以被引入到合适的靶细胞中以复制或表达所述核酸序列。载体的实例包含但不限于重组病毒、质粒、脂质体、聚合物体、复合物、树状聚合物、细胞穿透肽(CPP)缀合物、磁性颗粒或纳米颗粒。在一个实施例中，载体是对功能性基因产物进行编码的外源性或异源性或工程化核酸进入的核酸分子，然后可以将所述核酸分子引入到适当的靶细胞中。此类载体优选地具有一个或多个复制起点以及重组DNA可以***到的一个或多个位点。载体通常具有装置，通过所述装置，可以从没有载体的细胞中选择具有载体的细胞，例如，所述载体对耐药基因进行编码。常见的载体包含质粒、病毒基因组和“人工染色体”。载体的产生、生产、表征或定量的常规方法对于本领域技术人员是可用的。
在一个实施例中，载体是非病毒质粒，所述非病毒质粒包括其描述的表达盒，例如，“裸DNA”、“裸质粒DNA”、RNA和mRNA；与各种组合物和纳米颗粒偶联，包含例如胶束、脂质体、阳离子脂质-核酸组合物、多聚糖组合物和其它聚合物、基于脂质和/或胆固醇的核酸缀合物以及如本文所描述的其它构建体。参见例如X.Su等人,《分子制药学(Mol.Pharmaceutics)》,2011,8(3),第774-787页；网络出版物:2011年3月21日；WO 2013/182683、WO 2010/053572和WO 2012/170930，所有所述文献都通过引用并入本文中。
在某些实施例中，本文所描述的载体是“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”，其是指其中含有对功能性基因产物进行编码的核酸序列和一个或多个DRG去靶miRNA靶序列的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒颗粒，其中也包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列均是复制缺陷型的；即，其不能产生子代病毒粒子，但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包含对复制所需的酶进行编码的基因(基因组可以被工程化成“无肠的(gutless)”-仅含有核酸序列编码，其侧接扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，这被认为可以安全地用于基因疗法，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。
如本文所使用的，重组病毒载体是任何合适的病毒载体。实例提供了说明性重组腺相关病毒(rAAV)。其它合适的病毒载体可以包含例如腺病毒、痘病毒、博卡病毒、杂交AAV/博卡病毒、单纯疱疹病毒或慢病毒。在优选的实施例中，这些重组病毒不能复制。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”可以指其中产生载体(例如，重组AAV)的包装细胞系。宿主细胞可以是原核或真核细胞(例如，人、昆虫或酵母)，所述原核或真核细胞含有通过任何方式(例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、转化、病毒感染、转染、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的团粒、病毒感染和原生质体融合)引入到细胞中的外源性或异源性DNA。宿主细胞的实例可以包含但不限于分离的细胞、细胞培养物、大肠杆菌(Escherichia coli)细胞、酵母细胞、人细胞、非人细胞、哺乳动物细胞、非哺乳动物细胞、昆虫细胞、HEK-293细胞、肝细胞、肾细胞、中枢神经***的细胞、神经元、神经胶质细胞或干细胞。
如本文所使用的，术语“靶细胞”是指其中期望功能性基因产物的表达的任何靶细胞。靶细胞的实例可以包含但不限于肝细胞、肾细胞、中枢神经***的细胞、神经元、神经胶质细胞和干细胞。在某些实施例中，离体将载体递送到靶细胞。在某些实施例中，在体外将载体递送到靶细胞。
如本文所使用的，“载体基因组”是指包装在病毒载体内部的核酸序列。在一个实例中，“载体基因组”从5'到3'至少含有载体特异性序列、核酸序列以及载体特异性序列，所述核酸序列对功能性基因产物进行编码，所述核酸序列与引导所述功能性基因产物在靶细胞中表达的调控序列和一个或多个非翻译区中的miRNA靶序列可操作地连接。例如，AAV载体基因组含有反向末端重复序列和包括例如核酸序列的表达盒，所述核酸序列对功能性基因产物进行编码，所述核酸序列与引导所述功能性基因产物在靶细胞中表达的调控序列和一个或多个非翻译区中的miRNA靶序列可操作地连接。如本文所描述的，miRNA靶序列被设计成由细胞中的miRNA序列特异性地识别，在所述细胞中不期望(例如，背根神经节)转基因表达和/或期望降低转基因表达水平。
应当理解，本文所描述的载体中的组合物旨在应用于本说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。
3.腺相关病毒(AAV)
一方面，本文提供了一种重组AAV(rAAV)，所述rAAV包括AAV衣壳和包装在其中的载体基因组。
在一个实施例中，调控序列如上文所描述。在一个实施例中，载体基因组包括AAV5'反向末端重复序列(ITR)、如本文所描述的表达盒和AAV 3'ITR。在一个实施例中，载体基因组是指包装在形成rAAV载体的rAAV衣壳内部的核酸序列。此类核酸序列含有侧接表达盒的AAV反向末端重复序列(ITR)。在一个实例中，“载体基因组”从5'到3'至少含有AAV5'ITR、核酸序列以及AAV 3'ITR，所述核酸序列对功能性基因产物进行编码，所述核酸序列与引导所述功能性基因产物在靶细胞中表达的调控序列和一个或多个非翻译区中的miRNA靶序列可操作地连接。在某些实施例中，ITR来自AAV2，并且衣壳来自不同的AAV。可替代地，可以使用其它ITR。如本文所描述的，miRNA靶序列被设计成由细胞中的miRNA序列特异性地识别，在所述细胞中不期望转基因表达和/或期望降低转基因表达水平。
ITR是在载体生产期间负责基因组复制和包装的基因元件，并且是产生rAAV所需的唯一病毒顺式元件。在一个实施例中，ITR来自与供应衣壳的AAV不同的AAV。在优选实施例中，来自AAV2的ITR序列或其缺失版本(ΔITR)可以为了方便而使用和加速调控批准。然而，可以选择来自其它AAV来源的ITR。在ITR的来源来自AAV2并且AAV衣壳来自另一个AAV来源的情况下，所得载体可以被称为假型的。通常，AAV载体基因组包括AAV 5'ITR、NAGLU编码序列和任何调控序列以及AAV 3'ITR。然而，这些元件的其它构型可以是合适的。已经描述了被称为ΔITR的5'ITR的缩短版本，其中缺失了D序列和末端解析位点(trs)。在其它实施例中，使用了全长AAV 5'和3'ITR。
如本文所使用的，术语“AAV”是指天然存在的腺相关病毒、本领域技术人员可获得的和/或根据本文所描述的一种或多种组合物和一种或多种方法可获得的腺相关病毒以及人工AAV。腺相关病毒(AAV)病毒载体是具有AAV蛋白衣壳的AAV DNase抗性颗粒，其中包装有侧接AAV反向末端重复序列(ITR)的用于递送到靶细胞的表达盒。AAV衣壳由60个衣壳(帽)蛋白亚基VP1、VP2和VP3构成，其以二十面体对称布置，比率为大约1:1:10到1:1:20，具体取决于所选AAV。可以选择各种AAV作为如上文所鉴定的AAV病毒载体的衣壳的来源。参见例如美国公开专利申请第2007-0036760-A1号；美国公开专利申请第2009-0197338-A1号；EP 1310571。还参见WO 2003/042397(AAV7和其它猿猴AAV)、美国专利7790449和美国专利7282199(AAV8)、WO 2005/033321和US 7,906,111(AAV9)和WO 2006/110689以及WO 2003/042397(rh.10)。这些文档还描述了可以选择用于产生AAV的其它AAV，并且通过引用并入。在从人或非人灵长类动物(NHP)中分离或工程化以及良好表征的AAV中，人AAV2是第一个被开发为基因转移载体的AAV；其已被广泛用于不同靶组织和动物模型中的高效基因转移实验。除非另有说明，否则本文所描述的AAV衣壳、ITR和其它所选AAV组分可以容易地选自任何AAV，包含但不限于通常鉴定为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAVrh10、AAVhu37、AAV7M8和AAVAnc80的AAV、任何已知或提及的AAV或尚未发现的AAV的变体或其变体或混合物。参见例如WO/2005/033321，其通过引用并入本文中。在一个实施例中，AAV衣壳是AAV9衣壳或其变体。在某些实施例中，衣壳蛋白由rAAV载体名称中的术语“AAV”之后的数字或数字和字母的组合指定。
如本文所使用的，关于AAV，术语“变体”意指源自已知AAV序列的任何AAV序列，包含具有保守氨基酸置换的AAV序列以及与氨基酸或核酸序列共享至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或更高的序列同一性的AAV序列。在另一个实施例中，所述AAV衣壳包含变体，所述变体可以包含与任何描述或已知的AAV衣壳序列高达约10％变化。换句话说，所述AAV衣壳与本文所提供的和/或本领域已知的AAV衣壳共享约90％的同一性到约99.9％的同一性、约95％到约99％的同一性或约97％到约98％的同一性。在一个实施例中，所述AAV衣壳与AAV衣壳共享至少95％的同一性。当确定AAV衣壳的同一性百分比时，可以对任何可变蛋白质(例如，vp1、vp2或vp3)进行比较。
ITR或其它AAV组分可以使用本领域技术人员可用的技术从AAV中容易地分离出来或进行工程化。此类AAV可以从学术、商业或公共来源分离、工程化或获得(例如，维吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA))。可替代地，AAV序列可以通过合成或其它适合的方式通过参考公开的序列(如在文献中或在如GenBank、PubMed等数据库中可获得的公开的序列)进行工程化。AAV病毒可以通过常规的分子生物学技术进行工程化，从而可以优化这些颗粒以用于核酸序列的细胞特异性递送、用于最小化免疫原性、用于调节稳定性和颗粒寿命、用于高效降解、用于准确递送到细胞核等。
如本文所使用的，可互换使用的术语“rAAV”和“人工AAV”意指但不限于包括衣壳蛋白和包装在其中的载体基因组的AAV，其中载体基因组包括与AAV异源的核酸。在一个实施例中，衣壳蛋白是非天然存在的衣壳。此类人工衣壳可以通过任何合适的技术使用所选AAV序列(例如，vp1衣壳蛋白的片段)与异源序列的组合产生，所述异源序列可以从不同的所选AAV、同一AAV的非连续部分、从非AAV病毒来源或从非病毒来源获得。人工AAV可以是但不限于假型AAV、嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。假型载体可用于本发明中，其中一个AAV的衣壳被异源衣壳蛋白替代。在一个实施例中，AAV2/5和AAV2/8是示例性假型载体。所选基因元件可以通过任何合适的方法递送，包含转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的团粒、病毒感染和原生质体融合。用于制备此类构建体的方法对核酸操纵技术人员而言是已知的并且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见例如Sambrook和Russell,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,纽约市冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,NY)(2012)。
如本文所使用的，“AAV9衣壳”是指具有以下的氨基酸序列的AAV9：(a)GenBank登录：AAS99264，其通过引用并入本文中，并且AAV vp1衣壳蛋白在SEQ ID NO:17中重现；和/或(b)由GenBank登录：AY530579.1的核苷酸序列编码的氨基酸序列(nt 1...2211)(在SEQID NO:16中重现)。本发明涵盖来自此经过编码的序列的一些变化，其可以包含与GenBank登录：AAS99264和US7906111(也为WO 2005/033321)中的参考氨基酸序列具有约99％的同一性的序列(即与参考序列的变化小于约1％)。此类AAV可以包含例如天然分离物(例如，hu68、hu31或hu32)或具有氨基酸取代、缺失或添加的AAV9的变体，例如包含但不限于选自从与AAV9衣壳比对的任何其它AAV衣壳中的对应位置“招募”的替代性残基；例如，如在US9,102,949、US 8,927,514、US2015/349911；WO 2016/049230A1l；US 9,623,120；US 9,585,971中描述的。然而，在其它实施例中，可以选择与上文所引用的序列具有至少约95％的同一性的AAV9或AAV9衣壳的其它变体。参见例如美国公开专利申请第2015/0079038号。因此已经描述了产生衣壳的方法、编码序列以及用于产生rAAV病毒载体的方法。参见例如Gao等人,《美国国家科学院院刊》100(10):6081-6086(2003)和US 2013/0045186A1。
AAVhu68与另一种进化枝F病毒AAV9的区别在于vp1，SEQ ID NO:9的位置67和157处的两个经过编码的氨基酸。相比之下，其它进化枝F AAV(AAV9，hu31，hu31)具有在位置67处的Ala以及在位置157处的Ala。提供了新颖的AAVhu68衣壳和/或工程化的AAV衣壳，所述衣壳具有在基于SEQ ID NO:9的编号的位置157处的缬氨酸(Val或V)，并且任选地具有在位置67处的谷氨酸(Glu或E)。还参见WO 2018/160582，其以全文引用的方式并入本文中(其包含序列表)。
如本文所使用的，与AAV的组有关的术语“进化枝”是指如基于对AAV vp1氨基酸序列进行的比对，通过(至少1000个复制品的)至少75％的自举值(bootstrap value)和不大于0.05的泊松校正距离测量结果(Poisson correction distance measurement)使用邻接算法(Neighbor-Joining algorithm)确定的一组在***发育上彼此相关的AAV。在文献中已经描述了邻接算法。参见例如M.Nei和S.Kumar,《分子进化和***发育学(MolecularEvolution and Phylogenetics)》(牛津大学出版社,纽约(2000))。提供了可以用于实施此算法的可用计算机程序。例如，MEGA v2.1程序实施了经过修改的Nei-Gojobori方法。使用这些技术和计算机程序以及AAV vp1衣壳蛋白的序列，本领域技术人员可以容易地确定所选AAV是含在本文所鉴定的进化枝之一中，还是在这些进化枝之外的另一个进化枝中。参见例如G Gao等人,《病毒学杂志(J Virol)》,2004年6月；78(10:6381-6388，所述文献鉴定进化枝A、B、C、D、E和F，并提供新颖AAV的核酸序列，GenBank登录号AY530553到AY530629。还参见WO 2005/033321。
在某些实施例中，AAV68衣壳的另外的特征在于以下中的一种或多种。AAV hu68衣壳蛋白包括：通过从对SEQ ID NO:8的1到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列的表达产生的AAVhu68 vp1蛋白、从SEQ ID NO:9产生的vp1蛋白或从与SEQ ID NO:8至少70％相同的对SEQ ID NO:9的1到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列产生的vp1蛋白；通过从对SEQ ID NO:9的至少约氨基酸138到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列的表达产生的AAVhu68 vp2蛋白、从包括SEQ ID NO:8的至少核苷酸412到2211的序列产生的vp2蛋白或从与SEQ ID NO:8的至少核苷酸412到2211至少70％相同的对SEQ ID NO:9的至少约氨基酸138到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列产生的vp2蛋白，和/或通过从对SEQ ID NO:9的至少约氨基酸203到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列的表达产生的AAVhu68 vp3蛋白、从包括SEQ ID NO:8的至少核苷酸607到2211的序列产生的vp3蛋白或从与SEQ ID NO:8的至少核苷酸607到2211至少70％相同的对SEQ ID NO:9的至少约氨基酸203到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列产生的vp3蛋白。
AAVhu68 vp1、vp2和vp3蛋白通常表示为由对SEQ ID NO:9的全长vp1氨基酸序列(氨基酸1到736)进行编码的相同核酸序列编码的替代剪接变体。任选地，单独使用vp1编码序列来表达vp1、vp2和vp3蛋白。可替代地，此序列可以与以下中的一个或多个共表达：对SEQ ID NO:9的AAVhu68 vp3氨基酸序列(约aa 203到736)进行编码的核酸序列，所述AAVhu68 vp3氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1到约aa 137)和/或vp2独特区(约aa 1到约aa 202)或与其互补的链，即对应的mRNA或tRNA(SEQ ID NO:8的约nt 607到约nt 2211)；或与SEQ ID NO:8至少70％到至少99％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的对SEQ ID NO:9的aa 203到736进行编码的序列。另外地或可替代地，vp1编码和/或vp2编码序列可以与以下共表达：对SEQ ID NO:9的AAVhu68 vp2氨基酸序列(约aa 138到736)进行编码的核酸序列，所述AAVhu68 vp2氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1到约aa 137)或与其互补的链，即对应的mRNA或tRNA(例如，SEQ ID NO:8的约nt 412到22121)；或与SEQ ID NO:8至少70％到至少99％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的对SEQ ID NO:9的约aa 138到736进行编码的序列。
如本文所描述的，rAAVhu68具有在生产***中产生的rAAVhu68衣壳，所述rAAVhu68衣壳表达来自以下的衣壳：对SEQ ID NO:9的vp1氨基酸序列进行编码的AAVhu68核酸以及任选地例如对不含vp1和/或vp2独特区的vp 3蛋白进行编码的另外的核酸序列。使用单个核酸序列vp1从生产中产生的rAAVhu68产生vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白的异质群体。更具体地，AAVhu68衣壳含有具有来自SEQ ID NO:9中的预测的氨基酸残基的修饰的vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群体。这些亚群体至少包含脱酰胺化的天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，天冬酰胺-甘氨酸对中的天冬酰胺是高度脱酰胺化的。
在一个实施例中，AAVhu68 vp1核酸序列具有SEQ ID NO:8的序列或与其互补的链，例如，对应的mRNA或tRNA。在某些实施例中，vp2和/或vp3蛋白可以另外地或可替代地由不同于vp1的核酸序列表达，例如以改变所选表达***中的vp蛋白的比率。在某些实施例中，还提供了对SEQ ID NO:9的AAVhu68 vp3氨基酸序列(约aa 203到736)进行编码的核酸序列，所述AAVhu68 vp3氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1到约aa 137)和/或vp2独特区(约aa 1到约aa 202)或与其互补的链，即对应的mRNA或tRNA(SEQ ID NO:8的约nt 607到约nt 2211)。在某些实施例中，还提供了对SEQ ID NO:9的AAVhu68 vp2氨基酸序列(约aa 138到736)进行编码的核酸序列，所述AAVhu68 vp2氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1到约137)或与其互补的链，即对应的mRNA或tRNA(SEQ ID NO:8的nt 412到nt 2211)。
然而，可以选择对SEQ ID NO:9的氨基酸序列进行编码的其它核酸序列用于产生rAAVhu68衣壳。在某些实施例中，核酸序列具有SEQ ID NO:8的核酸序列或与SEQ ID NO:8至少70％到99％相同、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的对SEQ ID NO:9进行编码的序列。在某些实施例中，核酸序列具有SEQ ID NO:8的核酸序列或与SEQ ID NO:8的约nt 412到约nt 2211至少70％到99％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的对SEQ ID NO:9的vp2衣壳蛋白(约aa 138到736)进行编码的序列。在某些实施例中，核酸序列具有SEQ ID NO:8的约nt 607到约nt 2211的核酸序列或与nt SEQ ID NO:8至少70％到99％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的对SEQ ID NO:9的vp3衣壳蛋白(约aa 203到736)进行编码的序列。
在某些实施例中，AAVhu68衣壳是使用SEQ ID NO:8的核酸序列或具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的如本文所描述的修饰(例如，脱酰胺化的氨基酸)的对SEQ ID NO:9的vp1氨基酸序列进行编码的序列产生的。在某些实施例中，vp1氨基酸序列在SEQ ID NO:9中重现。
如本文所使用的，当用于指vp衣壳蛋白时，术语“异质”或其任何语法变型是指由不相同的元件组成的群体，例如具有带有不同的经过修饰的氨基酸序列的vp1、vp2或vp3单体(蛋白质)。SEQ ID NO:9提供了AAVhu68 vp1蛋白的经过编码的氨基酸序列。与vp1、vp2和vp3蛋白(可替代地被称为同种型)结合使用的术语“异质的”是指衣壳内的vp1、vp2和vp3蛋白的氨基酸序列中的差异。AAV衣壳含有具有来自预测的氨基酸残基的修饰的vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群体。这些亚群体至少包含某些脱酰胺化的天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，某些亚群体包括天冬酰胺-甘氨酸对中的至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)位置，并且任选地进一步包括其它脱酰胺化的氨基酸，其中脱酰胺化引起氨基酸变化和其它任选的修饰。
如本文所使用的，除非另有说明，否则vp蛋白的“亚群体”是指一组vp蛋白，所述一组vp蛋白具有至少一个共同定义的特性，并且由至少一个组成员(少于参考组的所有成员)组成。
例如，除非另有说明，否则vp1蛋白的“亚群体”是至少一种(1)vp1蛋白，并且少于组装的AAV衣壳中的所有vp1蛋白。除非另有说明，否则vp3蛋白的“亚群体”可以是少于组装的AAV衣壳中的所有vp3蛋白的一种(1)vp3蛋白。例如，vp1蛋白可以是vp蛋白的亚群体；vp2蛋白可以是vp蛋白的单独的亚群体，并且vp3是组装的AAV衣壳中的vp蛋白的又另外的亚群体。在另一个实例中，vp1、vp2和vp3蛋白可以含有具有不同修饰的亚群体，例如，至少一种、两种、三种或四种高度脱酰胺化的天冬酰胺，例如在天冬酰胺-甘氨酸对处。
除非另有说明，否则高度脱酰胺化的是指与在参考氨基酸位置处的预测的氨基酸序列相比，在参考的氨基酸位置处被至少45％脱酰胺化的、至少50％脱酰胺化的、至少60％脱酰胺化的、至少65％脱酰胺化的、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或最高约100％脱酰胺化的(例如，在基于SEQ ID NO:9的编号[AAVhu68]的氨基酸57处的天冬酰胺的至少80％可以基于总vp1蛋白脱酰胺化或可以基于总vp1、vp2和vp3蛋白脱酰胺化)。此类百分比可以使用2D凝胶、质谱技术或其它合适的技术来确定。
在AAVhu68衣壳蛋白中，4个残基(N57、N329、N452、N512)跨不同批次常规地显示出脱酰胺化水平>70％，并且在大多数情况下脱酰胺化水平>90％。另外的天冬酰胺残基(N94、N253、N270、N304、N409、N477和Q599)跨不同批次也显示出至多约20％的脱酰胺化水平。最初使用胰蛋白酶消化物鉴定脱酰胺化水平，并用胰凝乳蛋白酶消化对其进行验证。
AAVhu68衣壳含有具有来自SEQ ID NO:9中的预测的氨基酸残基的修饰的vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群体。这些亚群体至少包含某些脱酰胺化的天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，某些亚群体包括SEQ ID NO:9中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)位置，并且任选地进一步包括其它脱酰胺化的氨基酸，其中脱酰胺化引起氨基酸变化和其它任选的修饰。
在其它实施例中，方法涉及增加rAAV的产率，并且因此增加在细胞裂解之前的或在不需要细胞裂解的情况下存在于上清液中的rAAV的量。此方法涉及基于具有AAVhu68vp1衣壳蛋白的氨基酸编号的比对，对AAV VP1衣壳基因进行工程化以表达具有位置67处的Glu、位置157处的Val或两者的衣壳蛋白。在其它实施例中，所述方法涉及对VP2衣壳基因进行工程化以表达具有位置157处的Val的衣壳蛋白。在仍其它实施例中，rAAV具有经过修饰的衣壳，所述经过修饰的衣壳包括具有位置67处的Glu和位置157处的Val的vp1和vp2衣壳蛋白两者。
在某些实施例中，如本文所描述的rAAV是自身互补AAV。“自身互补AAV”是指其中由重组AAV核酸序列所携带的编码区已经被设计成形成分子内双链DNA模板的构建体。感染后，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scAAV将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链DNA(dsDNA)。参见例如D M McCarty等人,“自身互补重组腺相关病毒(scAAV)载体独立于DNA合成而促进高效转导(Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independentlyof DNA synthesis)”,《基因疗法》,(2001年8月),第8卷,第16期,第1248-1254页。自身互补AAV在例如美国专利第6,596,535号；第7,125,717号；第7,456,683号中描述，这些美国专利中的每个美国专利通过引用整体并入本文中。
在某些实施例中，本文所描述的rAAV是抗核酸酶的。此类核酸酶可以是单个核酸酶或核酸酶的混合物，并且可以是核酸内切酶或核酸外切酶。抗核酸酶rAAV表示AAV衣壳已经完全组装并保护这些包装的基因组序列在被设计成去除产生过程中可能存在的污染性核酸的核酸酶温育步骤期间免于降解(消化)。在许多情况下，本文所描述的rAAV是DNase抗性的。
可以使用已知的技术产生本文所描述的重组腺相关病毒(AAV)。参见例如WO2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此类方法涉及培养含有以下的宿主细胞：对AAV衣壳进行编码的核酸序列；功能性rep基因；如本文所描述的侧接AAV反向末端重复序列(ITR)的表达盒；以及足够的辅助功能以允许将表达盒包装到AAV衣壳蛋白中。本文还提供了含有以下的宿主细胞：对AAV衣壳进行编码的核酸序列；功能性rep基因；如所描述的载体基因组；以及足够的辅助功能以允许将载体基因组包装到AAV衣壳蛋白中。在一个实施例中，宿主细胞是HEK 293细胞。在WO 2017160360A2中更详细地描述了这些方法，其通过引用并入本文中。
可以利用本领域技术人员可用的其它产生rAAV的方法。合适的方法可以包含但不限于杆状病毒表达***或通过酵母生产。参见例如Robert M.Kotin等人,大规模重组腺相关病毒产生(Large-scale recombinant adeno-associated virus production).《人类分子遗传学(Hum Mol Genet.)》2011年4月15日；20(R1):R2-R6.于2011年4月29日在线公开.doi:10.1093/hmg/ddr141；Aucoin MG等人,使用三重感染在昆虫细胞中产生腺相关病毒载体：杆状病毒浓度比的优化(Production of adeno-associated viral vectors ininsect cells using triple infection:optimization of baculovirus concentrationratios).《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng.)》2006年12月20日；95(6):1081-92；SAMI S.THAKUR,在酵母中产生重组腺相关病毒载体(Production of Recombinant Adeno-associated viral vectors in yeast).论文提交给佛罗里达大学研究生院(GraduateSchool of the University of Florida),2012年；Kondratov O等人,在人类对昆虫细胞中制造的重组腺相关病毒载体的直接头对头评估(Direct Head-to-Head Evaluation ofRecombinant Adeno-associated Viral Vectors Manufactured in Human versusInsect Cells),《分子疗法》2017年8月10日.pii:S1525-0016(17)30362-3.doi:10.1016/J.ymthe.2017.08.003.[印刷前的电子出版物]；Mietzsch M等人,OneBac 2.0：用于产生使外源DNA的衣壳化最小化的AAV1、AAV2和AAV8载体的Sf9细胞系(OneBac2.0:Sf9 CellLines for Production of AAV1,AAV2,and AAV8 Vectors with Minimal Encapsidationof Foreign DNA).《人类基因疗法方法(Hum Gene Ther Methods.)》2017年2月；28(1):15-22.doi:10.1089/hgtb.2016.164.；Li L等人,新颖的重组腺相关病毒复制型基因组的生产和表征：用于基因转移的真核DNA来源(Production and characterization of novelrecombinant adeno-associated virus replicative-form genomes:a eukaryoticsource of DNA for gene transfer).《公共科学图书馆综合(PLoS One.)》2013年8月1日；8(8):e69879.doi:10.1371/journal.pone.0069879.于2013年印刷；Galibert L等人,在昆虫细胞中大规模生产腺相关病毒载体以趋向治疗神经肌肉疾病的最新进展(Latestdevelopments in the large-scale production of adeno-associated virus vectorsin insect cells toward the treatment of neuromuscular diseases).《无脊椎病理学杂志(J Invertebr Pathol.)》2011年7月；107增刊:S80-93.doi:10.1016/j.jip.2011.05.008；以及Kotin RM,大规模重组腺相关病毒生产(Large-scalerecombinant adeno-associated virus production).《人类分子遗传学》2011年4月15日；20(R1):R2-6.doi:10.1093/hmg/ddr141.电子版2011年4月29日。
在高盐浓度下进行两步亲和色谱纯化，然后通过使用阴离子交换树脂色谱来纯化载体药物产物并去除空衣壳。在题为“AAV9的可分级纯化方法(Scalable PurificationMethod for AAV9)”的WO 2017/160360中更详细地描述了这些方法，其通过引用并入本文中。简而言之，用于从基因组缺陷型AAV9中间体中分离具有包装的基因组序列的rAAV9颗粒的方法涉及使包括重组AAV9病毒颗粒和AAV9衣壳中间体的悬浮液经受高效液相色谱，其中AAV9病毒颗粒和AAV9中间体与在10.2的pH下平衡的强阴离子交换树脂结合并经受盐梯度，同时监测洗脱液在约260和约280下的紫外线吸光度。尽管对于rAAV9不是最佳的，但是pH的范围可以为约10.0到10.4。在此方法中，当A260/A280的比率达到拐点时，从洗脱的级分中收集AAV9完整衣壳。在一个实例中，对于亲和色谱步骤，可以将经过渗滤的产物应用于有效捕获AAV2/9血清型的Capture SelectTM Poros-AAV2/9亲和树脂(生命科技公司(LifeTechnologies))上。在这些离子条件下，显著百分比的残留的细胞DNA和蛋白质流过柱，而AAV颗粒则被有效捕获。
用于表征或定量rAAV的常规方法对于本领域技术人员是可用的。为了计算空颗粒和完整颗粒的含量，将所选样品(例如，在本文的实例中经过碘克沙醇(iodixanol)梯度纯化的制剂，其中GC#＝颗粒#)的VP3带体积相对于加载的GC颗粒进行作图。所得线性等式(y＝mx+c)用于计算测试品峰的带状体积中的颗粒的数量。然后将加载的每20μL颗粒数量(pt)乘以50，以得到颗粒(pt)/mL。将Pt/mL除以GC/mL得到颗粒与基因组拷贝的比率(pt/GC)。Pt/mL-GC/mL得到空pt/mL。空pt/mL除以pt/mL并且×100得到空颗粒的百分比。通常，用于测定具有包装的基因组的空衣壳和AAV载体颗粒的方法是本领域已知的。参见例如Grimm等人,《基因疗法》(1999)6:1322-1330；Sommer等人,《分子疗法》(2003)7:122-128。为了测试变性的衣壳，所述方法包含使经过处理的AAV原液经受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如在缓冲液中含有3-8％三乙酸盐的梯度凝胶)，然后运行凝胶直到分离出样品材料，并且将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜(优选地是尼龙)上。然后，将抗AAV衣壳抗体用作与变性的衣壳蛋白结合的初级抗体，优选地抗AAV衣壳单克隆抗体，最优选地B1抗AAV2单克隆抗体(Wobus等人,《病毒学杂志》(2000)74:9281-9293)。然后使用次级抗体，所述次级抗体与初级抗体结合并且含有一种用于检测与初级抗体的结合的装置，更优选地是含有与其共价结合的检测分子的抗IgG抗体，最优选地是与辣根过氧化物酶共价连接的绵羊抗小鼠IgG抗体。一种用于检测结合的方法用于半定量地确定初级抗体与次级抗体之间的结合，优选地是能够检测放射性同位素发射、电磁辐射或比色变化的检测方法，最优选地是化学发光检测试剂盒。例如，对于SDS-PAGE，可以从柱级分中提取样品并在含有还原剂(例如，DTT)的SDS-PAGE上样缓冲液中加热，并且在预制的梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如，Novex)上解析衣壳蛋白。可以根据制造商的说明使用SilverXpress(加利福尼亚州英杰公司)或其它合适的染色方法(即SYPRO红宝石色或考马斯染色)进行银染色。在一个实施例中，可以通过定量实时PCR(Q-PCR)测量柱级分中的AAV载体基因组(vg)的浓度。将样品稀释并用DNase I(或另一种合适的核酸酶)消化以去除外源性DNA。在核酸酶失活后，使用引物和对引物之间的DNA序列具有特异性的TaqManTM荧光探针进一步稀释和扩增样品。在Applied Biosystems Prism 7700序列检测***上测量每种样品达到定义的荧光水平所需的周期的数量(阈值周期，Ct)。含有与AAV载体中所含序列相同的序列的质粒DNA用于在Q-PCR反应中产生标准曲线。从样品获得的周期阈值(Ct)的值用于通过相对于质粒标准曲线的Ct值对其进行归一化来确定载体基因组效价。也可以使用基于数字PCR的端点测定。
一方面，使用了经过优化的q-PCR方法，所述方法利用了广谱丝氨酸蛋白酶，例如蛋白酶K(如可从凯杰公司(Qiagen)商购获得)。更具体地，经过优化的qPCR基因组效价测定与标准测定类似，不同之处在于在DNase I消化之后，将样品用蛋白酶K缓冲液稀释并用蛋白酶K处理，然后进行热失活。合适地，以等于样品大小的量用蛋白酶K缓冲液稀释样品。蛋白酶K缓冲液可以浓缩2倍或更多倍。通常，蛋白酶K处理为约0.2mg/mL，但是可以在0.1g/mL到约1mg/mL之间变化。处理步骤通常在约55℃下进行持续约15分钟，但是可以在较低温度(例如，约37℃到约50℃)下进行持续较长的时间段(例如，约20分钟到约30分钟)，或者在较高的温度(例如，最高约60℃)下进行持续较短的时间段(例如，约5到10分钟)。类似地，热失活通常在约95℃下持续约15分钟，但是温度可以降低(例如，约70℃到约90℃)并且时间延长(例如，约20分钟到约30分钟)。然后将样品稀释(例如，1000倍)，并如标准测定中所描述的进行TaqMan分析。
另外地或可替代地，可以使用液滴数字PCR(ddPCR)。例如，已经描述了用于通过ddPCR确定单链和自身互补AAV载体基因组效价的方法。参见例如M.Lock等人,《人类基因疗法方法》2014年4月；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.电子出版2014年2月14日。
用于确定衣壳蛋白的vp1、vp2与vp3之间的比率的方法也是可用的。参见例如Vamseedhar Rayaprolu等人,腺相关病毒衣壳稳定性和动力学的比较分析(ComparativeAnalysis of Adeno-Associated Virus Capsid Stability and Dynamics),《病毒学杂志》2013年12月；87(24):13150–13160；Buller RM,Rose JA.1978.KB细胞中腺病毒相关病毒诱导多肽的表征(Characterization of adenovirus-associated virus-inducedpolypeptides in KB cells).《病毒学杂志》25:331-338；以及Rose JA,Maizel JV,InmanJK,Shatkin AJ.1971.腺病毒相关病毒的结构蛋白(Structural proteins ofadenovirus-associated viruses).《病毒学杂志》8:766-770。
应当理解，本文所描述的rAAV中的组合物旨在应用于本说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。
4.药物组合物
包括包含转基因和miRNA靶序列的表达盒的药物组合物可以是液体悬浮液、冻干或冷冻组合物或另一合适的调配物。在某些实施例中，组合物包括表达盒和形成悬浮液的生理上相容的液体(例如，溶液、稀释剂、载体)。此类液体优选地是水基的并且可以含有以下中的一种或多种：一种或多种缓冲剂、一种或多种表面活性剂、一种或多种pH调节剂、一种或多种防腐剂或其它合适的赋形剂。下文更详细地讨论了合适的组分。药物组合物包括水性悬浮液和任何所选赋形剂以及表达盒。
包括转基因和miRNA靶序列的表达盒如贯穿本文说明书所描述的。例如，表达盒可以是包括以下的核酸序列：(a)在调控序列的控制下的基因产物的编码序列，所述调控序列引导基因产物在含有所述重组病毒的细胞中表达；(b)调控序列，所述调控序列引导基因产物在细胞中表达；(c)位于编码序列的5'的5'非翻译区(UTR)序列；(d)位于编码序列3'的3'UTR序列；以及e)至少两个串联背根神经节(DRG)特异性miRNA靶序列，其中所述至少两个miRNA靶序列包括至少一个第一miRNA靶序列和可以相同或不同的至少一个第二miRNA靶序列。
在某些实施例中，药物组合物包括包含转基因和miRNA靶序列的表达盒和非病毒递送***。这可以包含例如裸DNA、裸RNA、无机颗粒、脂质或脂质样颗粒、基于壳聚糖的调配物和本领域已知的并且例如由Ramamoorth和Narvekar描述的其它调配物，如上所述。
在其它实施例中，药物组合物是包括包含转基因的表达盒的悬浮液，并且miRNA靶序列在非病毒或病毒载体***中被工程化。此类非病毒载体***可以包含例如质粒或非病毒基因元件或基于蛋白质的载体。
在某些实施例中，药物组合物包括非复制病毒载体。合适的病毒载体可以包含任何合适的递送载体，例如重组腺病毒、重组慢病毒、重组博卡病毒、重组腺相关病毒(AAV)或另一种重组细小病毒。在某些实施例中，病毒载体是用于向有需要的患者递送基因产物的重组AAV。
在一个实施例中，药物组合物包括包含转基因和miRNA靶序列的表达盒和适于通过脑室内(ICV)、鞘内(IT)、脑池内或静脉内(IV)注射递送的调配物缓冲液。在一个实施例中，包括转基因和miRNA靶序列的表达盒被包装在重组AAV中。
在一个实施例中，如本文所提供的组合物包括溶解于水性悬浮液中的表面活性剂、防腐剂、赋形剂和/或缓冲剂。在一个实施例中，缓冲液是PBS。在另一个实施例中，缓冲液是人工脑脊液(aCSF)，例如艾略特调配物缓冲液(Eliott's formulation buffer)；或哈佛设备灌注液(具有以下最终离子浓度(以mM为单位)的人工CSF：Na 150；K 3.0；Ca 1.4；Mg0.8；P 1.0；Cl 155)。各种合适的溶液是已知的，包含那些包含以下中的一种或多种的溶液：缓冲盐水、表面活性剂和生理上相容的盐或盐的混合物，其离子强度被调节到等同于约100mM氯化钠(NaCl)到约250mM氯化钠，或被调节到等离子浓度的生理上相容的盐。
合适地，将调配物调节到生理上可接受的pH，例如，在pH 6到8、或pH 6.5到7.5、pH7.0到7.7或pH 7.2到7.8的范围内。由于脑脊液的pH为约7.28到约7.32，对于鞘内递送，可能期望在此范围内的pH；而对于静脉内递送，可能期望的pH为6.8到约7.2。然而，可以选择最宽范围和这些子范围内的其它pH用于其它递送途径。
可以从无毒的非离子表面活性剂中选择合适的表面活性剂或表面活性剂的组合。在一个实施例中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如
Figure BDA0003221999180000291
F68[BASF]，也被称为泊洛沙姆(Poloxamer)188，其具有中性pH，平均分子量为8400。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即非离子型三嵌段共聚物，所述非离子型三嵌段共聚物由与聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链侧接的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、SOLUTOL HS 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“P”(对于泊洛沙姆)命名，后跟三个数字：前两位数字×100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字×10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择了泊洛沙姆188。表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％的量存在。
在一个实例中，调配物可以含有例如缓冲盐水溶液，所述缓冲盐水溶液包括水中的氯化钠、碳酸氢钠、葡聚糖、硫酸镁(例如，硫酸镁7H2O)、氯化钾、氯化钙(例如，氯化钙2H2O)、磷酸氢二钠及其混合物中的一种或多种。合适地，对于鞘内递送，同渗浓摩在与脑脊液相容的范围内(例如，约275到约290)；参见例如emedicine.medscape.com/article/2093316-overview。任选地，对于鞘内递送，可以将可商购获得的稀释剂用作悬浮剂，或与另一种悬浮剂和其它任选的赋形剂组合。参见例如Elliotts
Figure BDA0003221999180000301
解决方案[LukareMedical]。
在其它实施例中，调配物可以含有一种或多种渗透增强剂。合适的渗透增强剂的实例可以包含例如甘露醇、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸钠、月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或EDTA。
另外提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和包括如本文所描述的核酸序列的载体。如本文所使用的，“载剂”包含任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶质物等。这种介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是熟知的。补充性活性成分也可以并入到组合物中。递送媒剂(如脂质体、纳米胶囊、微颗粒、微球、脂质颗粒、囊泡等)可以用于将本发明的组合物引入到合适的宿主细胞中。具体地，rAAV载体基可以被调配成用于递送或包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中。在一个实施例中，治疗有效量的所述载体包含在药物组合物中。载体的选择不是对本发明的限制。其它常规的药学上可接受的载体，如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包含氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包含明胶和白蛋白。
短语“药学上可接受的”是指当向宿主施用时不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。
如本文所使用的，术语“剂量”或“量”可以指在治疗过程中向受试者递送的总剂量或量或以单一单位(或多单位或分剂量)施用递送的剂量或量。
本文所描述的水性悬浮液或药物组合物被设计成用于通过任何合适的途径或不同途径的组合递送到有需要的受试者。
在一个实施例中，药物组合物被调配用于通过脑室内(ICV)、鞘内(IT)或脑池内注射递送。在一个实施例中，本文所描述的组合物被设计成用于通过静脉内注射递送到有需要的受试者。可替代地，可以选择其它施用途径(例如，口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、肌内和其它肠胃外途径)。
如本文所使用的，术语“鞘内递送”或“鞘内施用”是指通过注射到椎管中，更具体地注射到蛛网膜下腔中使得其到达脑脊液(CSF)的药物施用途径。鞘内递送可以包含腰椎穿刺、心室内、枕骨下/脑池内和/或C1-2穿刺。例如，可以通过腰椎穿刺引入材料以在整个蛛网膜下腔扩散。在另一个实例中，可以向小脑延髓池(cisterna magna)中注射。脑池内递送可以增加载体扩散和/或减少施用引起的毒性和炎症。参见例如Christian Hinderer等人,在将AAV9递送到小脑延髓池中之后食蟹猴的中枢神经***中的广泛基因转移(Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgusmacaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna).《分子疗法方法临床发展》.2014；1:14051.于2014年12月10日在线公开.doi:10.1038/mtm.2014.51。
如本文所使用的，术语“脑池内递送”或“脑池内施用”是指药物直接进入到脑室或小脑延髓池(cisterna magna cerebellomedularis)的脑脊液中，更具体地是通过枕骨下穿刺或通过直接注射到小脑延髓池(cisterna magna)中或通过永久定位的管的施用途径。
一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括调配物缓冲液中如本文所描述的载体。在某些实施例中，可以以剂量单位调配复制缺陷型病毒组合物，以使含有的复制缺陷型病毒的量在约1.0×109GC到约1.0×1016GC的范围内(以治疗平均体重为70kg的受试者)，包含所述范围内的所有整数或分数量，并且对于人类患者而言，优选地为1.0×1012GC到1.0×1014GC。在一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109或9×109GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011或9×1011GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012或9×1012GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013或9×1013GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1014、2×1014、3×1014、4×1014、5×1014、6×1014、7×1014、8×1014或9×1014GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×1015、2×1015、3×1015、4×1015、5×1015、6×1015、7×1015、8×1015或9×1015GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，对于人类应用，剂量的范围可以为每剂量1×1010到约1×1012GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。
在一个实施例中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括调配物缓冲液中如本文所描述的rAAV。在一个实施例中，rAAV以约1×109基因组拷贝(GC)/mL到约1×1014GC/mL调配。在另外的实施例中，rAAV以约3×109GC/mL到约3×1013GC/mL调配。在又另外的实施例中，rAAV以约1×109GC/mL到约1×1013GC/mL调配。在一个实施例中，rAAV以至少约1×1011GC/mL调配。在一个实施例中，包括如本文所描述的rAAV的药物组合物可以每克脑质量约1×109GC到每克脑质量约1×1014GC的剂量施用。
在某些实施例中，可以在合适的水性悬浮介质(例如，缓冲盐水)中调配组合物以通过任何合适的途径递送。本文所提供的组合物可用于高剂量病毒载体的全身递送。对于rAAV，高剂量可以为至少1×1013GC或至少1×1014GC。然而，为了改进安全性，本文所提供的miRNA序列可以包含在以其它较低剂量递送的表达盒和/或载体基因组中。
在某些实施例中，组合物通过两种不同的途径基本上同时递送。
应当理解，本文所描述的药物组合物中的组合物旨在应用于本说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。
5.治疗方法
在某些实施例中，本文所提供的组合物可用于将所期望的转基因产物递送到患者，同时用于抑制背根神经节神经元中的转基因表达。所述方法涉及向患者递送包括表达盒的组合物，所述表达盒包括转基因和miRNA靶序列。
合适转基因的实例可用于治疗一种或多种神经退行性病症。此类病症可以包含但不限于可传播性海绵状脑病(例如，克罗伊茨费尔德-雅各布病(Creutzfeld-Jacobdisease))、杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)、肌管肌病和其它肌病、帕金森氏病(Parkinson's disease)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease)、亨廷顿氏病(Huntington disease)、卡纳万氏病(Canavan'sdisease)、创伤性脑损伤、脊髓损伤(ATI335，诺华公司(Novartis)的抗nogo1)、偏头痛(阿尔德生物制药公司(Alder Biopharmaceuticals)的ALD403；Eli的LY2951742；Labrys生物制剂公司(Labrys Biologics)的RN307)、溶酶体贮积病、中风和影响中枢神经***的感染性疾病。溶酶体贮积病的实例包含例如戈谢病(Gaucher disease)、法布里病(Fabry disease)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、亨特氏综合征(Huntersyndrome)、糖原贮积病II(庞贝病(Pompe disease))或泰-萨克斯病(Tay-Sachsdisease)。对于这些病状中的某些病状，例如DMD和肌病，本文所提供的组合物可用于减少或消除与用于骨骼肌和心肌的转导或发明的高剂量表达盒(例如，由病毒载体携带)相关的轴突病。
仍其它核酸可以对针对富含亮氨酸重复序列和含免疫球蛋白样结构域的蛋白1(LINGO-1)的免疫球蛋白进行编码，所述免疫球蛋白是Nogo受体的功能性组分并且与患有多发性硬化症、帕金森氏病或特发性震颤的患者的特发性震颤相关。一种此类可商购获得的抗体是奥美珠单抗(ocrelizumab)(百健公司(Biogen)，BIIB033)。参见例如美国专利8,425,910。在一个实施例中，核酸构建体对免疫球蛋白构建体进行编码，所述免疫球蛋白构建体对患有ALS的患者有用。合适抗体的实例包含：针对ALS超氧化物歧化酶1(SOD1)的抗体及其变体(例如，ALS变体G93A、C4F6 SOD1抗体)；针对Derlin-1结合区的MS785；针对神经突生长抑制剂(NOGO-A或网状蛋白4)的抗体，例如，GSK1223249、奥扎尼珠单抗(ozanezumab)(人源化，GSK，也被描述为对多发性硬化症有用)。对免疫球蛋白进行编码的核酸序列可以被设计或被选择用于患有阿尔茨海默氏病的患者。此类抗体构建体包含例如：阿杜马努卡布单抗(adumanucab)(百健公司)；巴匹珠单抗(Bapineuzumab)(义隆公司(Elan)，针对Aβ的氨基端的人源化mAb)；礼来公司(Eli Lilly)的索拉珠单抗(Solanezumab)，针对可溶性Aβ的中心部分的人源化mAb；甘特鲁单抗(Gantenerumab)(Chugai和Hoffmann-La Roche，其是针对Aβ的氨基端和中心部分两者的全人mAb)；克伦珠单抗(Crenezumab)(基因泰克公司(Genentech)，人源化mAb，其作用于单体和构象表位，包含Aβ的寡聚和原纤维形式)；BAN2401(亿赛有限公司(Esai Co.,Ltd)，人源化免疫球蛋白G1(IgG1)mAb，其选择性地与Aβ原纤维结合，并且被认为可以增强Aβ原纤维的清除率和/或中和其对脑神经元的毒性作用)；GSK 933776(针对Aβ的氨基端的人源化IgG1单克隆抗体)；AAB-001、AAB-002、AAB-003(Fc工程化的巴匹珠单抗)；SAR228810(针对原纤维和低分子量Aβ的人源化mAb)；BIIB037/BART(针对不溶性纤维状人Aβ的全人IgG1，百健艾迪公司(Biogen Idec))；抗Aβ抗体，如m266、tg2576(对Aβ寡聚体的相对特异性)[Brody和Holtzman,《神经科学年度评论(AnnuRev Neurosci)》,2008；31:175-193]。其它抗体可以靶向β-淀粉样蛋白、Aβ、β分泌酶和/或τ蛋白。在仍其它实施例中，抗β-淀粉样蛋白抗体源自IgG4单克隆抗体以靶向β-淀粉样蛋白以便使效应子功能最小化，或选择除了缺乏Fc区的scFv之外的构建体以避免淀粉样蛋白相关成像异常(ARIA)和炎性应答。在这些实施例中的某些实施例中，scFv构建体中的一个或多个scFv构建体的重链可变区和/或轻链可变区在如本文所提供的另一种合适的免疫球蛋白构建体中使用。与含有Fc区的免疫球蛋白相比，这些scFV和其它工程化免疫球蛋白可能缩短血清中免疫球蛋白的半衰期。降低抗淀粉样蛋白分子的血清浓度可以进一步降低ARIA的风险，因为血清中极高水平的抗淀粉样蛋白抗体可能会使具有高负荷淀粉样蛋白斑块的脑血管不稳定，从而导致血管通透性。对用于治疗患有帕金森氏病的患者的其它免疫球蛋白构建体进行编码的核酸可以被工程化或被设计成表达构建体，包含例如富含亮氨酸的重复激酶2、达尔达林(dardarin)(LRRK2)抗体；抗突触核蛋白和α-突触核蛋白抗体和DJ-1(PARK7)抗体。其它抗体可以包含PRX002(普罗西娜公司(Prothena)和罗氏公司(Roche))帕金森氏病和相关的突触核蛋白病。这些抗体(特别是抗突触核蛋白抗体)也可以用于治疗一种或多种溶酶体贮积病。
可以工程化或选择对免疫球蛋白构建体进行编码的核酸构建体以治疗多发性硬化症。此类免疫球蛋白可以包含或源自抗体，如那他珠单抗(natalizumab)(人源化抗a4-整联蛋白、iNATA、Tysabri，百健艾迪公司和义隆制药公司(Elan Pharmaceuticals))，其于2006年获得批准；阿仑单抗(alemtuzumab)(坎帕斯-1H(Campath-1H)，人源化抗CD52)；利妥昔单抗(rituximab)(瑞图兴(rituzin)，嵌合抗CD20)；达克珠单抗(daclizumab)(赛尼哌(Zenepax)，人源化抗CD25)；奥美珠单抗(人源化、抗CD20，罗氏公司)；优特克单抗(ustekinumab)(CNTO-1275，人抗IL12 p40+IL23p40)；抗LINGO-1和ch5D12(嵌合抗CD40)和rHIgM22(髓鞘再生化单克隆抗体；阿索尔达和梅奥医学教育和研究基金会(Acorda andthe Mayo Foundation for Medical Education and Research))。仍其它抗a4-整联蛋白抗体、抗CD20抗体、抗CD52抗体、抗IL17、抗CD19、抗SEMA4D和抗CD40抗体可以通过如本文所描述的AAV载体递送。
本发明还设想了针对中枢神经***的各种感染的抗体。此类感染性疾病可以包含：真菌疾病，如隐球菌性脑膜炎、脑脓肿、脊髓硬膜外感染，其由例如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、毛霉目(orderMucorales)、曲霉属(Aspergillus spp)和念珠菌属(Candida spp)引起；原生动物，如弓形虫病、疟疾和原发性阿米巴脑膜脑炎，其由例如弓形虫(Toxoplasma gondii)、猪带绦虫(Taenia solium)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparus)、曼森裂头绦虫(Spirometramansonoides)(裂头蚴病(sparaganoisis))、棘球绦虫属(Echinococcus spp，引起神经包囊病)和脑阿米巴病引起；细菌，例如结核病、麻风病、神经梅毒、细菌性脑膜炎、莱姆病(伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))、落基山斑疹热(Rocky Mountain spotted fever)(立克次体立克次体(Rickettsia rickettsia))、CNS诺卡氏菌病(诺卡氏菌属(Nocardiaspp))、CNS结核(结核分枝杆菌)、CNS李斯特菌病(单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes))、脑脓肿和神经疏螺旋体病；病毒感染，例如病毒性脑膜炎、东部马脑炎(EEE)、圣路易斯脑炎(St Louis encepthalitis)、西尼罗河病毒(West Nile virus)和/或脑炎、狂犬病、加利福尼亚脑炎病毒(California encephalitis virus)、拉克罗斯脑炎(LaCrosse encepthalitis)、麻疹脑炎、脊髓灰质炎，其可能由以下引起：例如疱疹家族病毒(HSV)、HSV-1、HSV-2(新生儿单纯疱疹脑炎)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、比克斯塔夫脑炎(Bickerstaff encephalitis)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、巨细胞病毒(CMV，如TCN-202由Theraclone科学公司研发)、人疱疹病毒6(HHV-6)、B病毒(猴疱疹病毒)、黄病毒脑炎、日本脑炎、默里谷热、JC病毒(进行性多灶性白质脑病)、尼帕病毒(NipahVirus，NiV)、麻疹(亚急性硬化性全脑炎)；以及其它感染，例如亚急性硬化性全脑炎、进行性多灶性白质脑病；人免疫缺陷病毒(获得性免疫缺陷综合征(AIDS))；酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)和其它β-溶血性链球菌(例如，与链球菌感染相关的小儿自身免疫性神经精神病症，PANDAS)和/或西登哈姆氏舞蹈病(Syndenham's chorea)以及格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)和朊病毒。
合适的抗体构建体的实例可以包含例如在2015年1月29日的WO 2007/012924A2中描述的抗体构建体，所述文献通过引用并入本文中。
例如，其它核酸序列可以对抗朊病毒免疫球蛋白构建体进行编码。此类免疫球蛋白可以针对主要朊病毒蛋白(PrP，朊病毒蛋白或蛋白酶抗性蛋白，也被称为CD230(分化簇230))。提供了PrP的氨基酸序列，例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_000302，其通过引用并入本文中。蛋白质可以存在于多种同种型、正常的PrPC、引起疾病的PrPSc和定位在线粒体中的同种型中。错误折叠版本的PrPSc与多种认知障碍和神经退行性疾病相关，所述认知障碍和神经退行性疾病如克罗伊茨费尔德-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、牛海绵状脑病、格斯特曼-斯特劳斯勒-舍因克综合征(Gerstmann-
Figure BDA0003221999180000361
-Scheinker syndrome)、致命性家族性失眠症和库鲁病。
合适的基因产物的实例可以包含与家族性高胆固醇血症、肌营养不良、囊性纤维化以及罕见疾或孤儿病相关的基因产物。此类罕见病的实例可以包含脊髓性肌萎缩症(SMA)、亨廷顿氏病、雷特综合征(Rett Syndrome)(例如，甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)；UniProtKB-P51608)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、杜氏肌营养不良、弗里德里希共济失调(Friedrichs Ataxia)(例如，共济蛋白)、颗粒蛋白前体(PRGN)(与非阿尔茨海默氏病的大脑变性相关，包含额颞叶痴呆(FTD)、进行性非流利性失语症(PNFA)和语义性痴呆)等等。其它有用的基因产物包含氨基甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、精氨酸琥珀酸合成酶、用于治疗精氨琥珀酸裂解酶缺乏症的精氨琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、恒河猴甲胎蛋白(AFP)、恒河猴绒毛膜***(CG)、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、胱硫醚β合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧酸盐、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H蛋白、T蛋白、囊性纤维化跨膜调节子(CFTR)序列和肌营养不良蛋白基因产物[例如，迷你或微小肌营养不良蛋白]。仍其它有用的基因产物还包含如可以用于酶替代疗法的酶，所述酶替代疗法可用于由于酶活性不足而导致的多种病状。例如，可以将含有甘露糖-6-磷酸的酶用于溶酶体贮积病的疗法中(例如，合适的基因包含对β-葡糖醛酸酶(GUSB)进行编码的基因)。
可以通过rAAV递送的另外的说明性基因包含但不限于与糖原贮积病或1A型缺乏症(GSD1)相关的葡萄糖-6-磷酸酶；与PEPCK缺乏症相关的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)；细胞周期蛋白依赖性激酶样5(CDKL5)，其也被称为与癫痫发作和严重的神经发育障碍相关的丝氨酸/苏氨酸激酶9(STK9)；与半乳糖血症相关的半乳糖-1磷酸尿嘧啶转移酶；与苯丙酮尿症(PKU)相关的苯丙氨酸羟化酶；与枫糖尿病相关的支链α-酮酸脱氢酶；与1型酪氨酸血症相关的延胡索酰乙酰乙酸水解酶；与甲基丙二酸血症相关的甲基丙二酰辅酶A变位酶；与中链乙酰辅酶A缺乏症相关的中链酰基辅酶A脱氢酶；与鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症相关的鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)；与瓜氨酸血症相关的精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)；卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)缺乏症；甲基丙二酸血症(MMA)；尼曼-皮克病，C1型；丙酸血症(PA)；与家族性高胆固醇血症(FH)相关的低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白；与克里格勒-纳贾尔病(Crigler-Najjar disease)相关的UDP-葡萄糖醛糖基转移酶；与严重联合免疫缺陷病相关的腺苷脱氨酶；与痛风和莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)相关的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶；与生物素酶缺乏症相关的生物素酶；与法布里病(Fabry disease)相关的α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)；与威尔逊氏病(Wilson's Disease)相关的ATP7B；与戈谢病(Gaucher disease)2和3型相关的β-葡糖脑苷脂酶；与泽尔韦格氏综合征(Zellwegersyndrome)相关的过氧化物酶体膜蛋白70kDa；与变质性脑白质营养不良相关的芳基硫酸酯酶A(ARSA)；与克拉伯病(Krabbe disease)相关的半乳糖脑苷脂酶(GALC)；与庞贝病(Pompedisease)相关的α-葡糖苷酶(GAA)；与尼曼-皮克病(Nieman Pick disease)A型相关的鞘磷脂酶(SMPD1)基因；与成人II型瓜氨酸血症(CTLN2)相关的精氨琥珀酸合酶；与脲循环病症相关的氨基甲酰磷酸合酶1(CPS1)；与脊髓性肌萎缩症相关的存活运动神经元(SMN)蛋白；与法伯脂肪肉芽肿病相关的神经酰胺酶；与GM2神经节苷脂病和泰伊-萨克斯二氏病和山霍夫氏病(Tay-Sachs and Sandhoff diseases)相关的b-己糖胺酶；与天冬氨酰葡糖尿症相关的天冬氨酰葡糖胺酶；与岩藻糖苷贮积症相关的a岩藻糖苷酶；与α甘露糖苷贮积症相关的α-甘露糖苷酶；与急性间歇性卟啉症(AIP)相关的胆色素原脱氨酶；用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症(肺气肿)的α-1抗胰蛋白酶；用于治疗因地中海贫血或肾衰竭引起的贫血的***；用于治疗缺血性疾病的血管内皮生长因子、血管生成素-1和成纤维细胞生长因子；用于治疗如例如在动脉粥样硬化、血栓形成或栓塞中所看见的阻塞的血管的血栓调节蛋白和组织因子途径抑制剂；用于治疗帕金森氏病的芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)和酪氨酸羟化酶(TH)；与受磷蛋白、肌浆(内质)网腺苷三磷酸酶2(SERCA2)呈反义或为其突变体形式的β肾上腺素能受体；用于治疗充血性心力衰竭的心脏腺苷酸环化酶；用于治疗各种癌症的肿瘤抑制基因，如p53；用于治疗炎症和免疫病症以及癌症的细胞因子，如各种白细胞介素之一；用于治疗肌营养不良的肌营养不良蛋白或迷你肌营养不良蛋白以及肌萎缩相关蛋白或迷你肌萎缩相关蛋白；以及用于治疗糖尿病的胰岛素或GLP-1。另外所关注的基因和疾病包含例如肌张力异常蛋白基因相关的疾病，如遗传性感觉和自主神经病VI型(DST基因对肌张力异常蛋白进行编码)；由于蛋白质的大小(约7570aa)可能需要双重AAV载体；SCN9A相关疾病，其中功能突变体的丧失导致无法感觉疼痛，并且功能突变体的获得引起疼痛病状，如红斑性肢痛症。由于NEFL基因(神经丝轻链)发生突变，另一种病状是腓骨肌萎缩症1F和2E型，其由具有可变临床和电生理表达的进行性周围运动和感觉神经病表征。在某些实施例中，本文所描述的载体可以用于治疗黏多糖贮积症(MPS)病症。这种载体可以含有携带对用于治疗MPS I(贺勒、贺勒-施艾氏和施艾氏综合征(Hurler,Hurler-Scheie andScheie syndromes))的α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)进行编码的核酸序列；对用于治疗MPS II(亨特氏综合征)的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)进行编码的核酸序列；对用于治疗MPSIIIA、B、C和D(沙费利波综合征(Sanfilippo syndrome))的磺酰胺酶(SGSH)进行编码的核酸序列；对用于治疗MPS IV A和B(莫基奥综合征(Morquio syndrome))的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶(GALNS)进行编码的核酸序列；对用于治疗MPS VI(马罗托-拉米氏综合征(Maroteaux-Lamy syndrome))的芳基硫酸酯酶B(ARSB)进行编码的核酸序列；对用于治疗MPSI IX(透明质酸酶缺乏症)的透明质酸酶进行编码的核酸序列；以及对用于治疗MPS VII(斯赖综合征(Sly syndrome))的β-葡糖醛酸苷酶进行编码的核酸序列。参见例如www.orpha.net/consor/cgi-bin/Disease_Search_List.php；rarediseases.info.nih.gov/diseases。
其它合适的基因的实例可以包含例如激素以及生长和分化因子，包含但不限于胰岛素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP1)、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)、人绒毛膜***(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管抑素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞产生素(EPO)(包含例如人、犬或猫epo)、***生长因子(CTGF)、神经营养因子包含例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、转化生长因子α超家族(包含TGFα、激活素、抑制素)中的任一种、或骨形态发生蛋白(BMP)BMP 1-15中的任一种、生长因子的调蛋白/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白、集聚蛋白中的任一种、信号素/脑衰蛋白、纺锤蛋白-1和纺锤蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音猬因子和酪氨酸羟化酶的家族中的任一种。
其它有用的转基因产物包含调控免疫***的蛋白质，包含但不限于细胞因子和淋巴因子，如血小板生成素(TPO)、白细胞介素(IL)IL-1到IL-36(包含例如人白细胞介素IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-11、IL-12、IL-13、IL-18、IL-31、IL-35)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体。由免疫***产生的基因产物也可用于本发明。这些包含但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、MHC I类和II类分子以及经过工程化的免疫球蛋白和MHC分子。例如，在某些实施例中，可以将rAAV抗体设计成递送犬或猫抗体，例如抗IgE、抗IL31、抗CD20、抗NGF、抗GnRH。有用的基因产物还包含补体调控蛋白，如补体调控蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CR1、CF2、CD59和C1酯酶抑制剂(C1-INH)。仍其它有用的基因产物包含用于激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调控蛋白和免疫***蛋白的受体中的任一种。本发明涵盖用于胆固醇调控和/或脂质调节的受体，包含低密度脂蛋白(LDL)受体、高密度脂蛋白(HDL)受体、极低密度脂蛋白(VLDL)受体和清除剂受体。本发明还涵盖基因产物，如类固醇激素受体超家族的成员，包含糖皮质激素受体和***受体、维生素D受体和其它核受体。另外，有用的基因产物包含转录因子，如jun、fos、max、mad、血清应答因子(SRF)、AP-1、AP2、myb、MyoD和肌生成素、含ETS盒的蛋白质、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT盒结合蛋白、干扰素调控因子(IRF-1)、威尔姆斯肿瘤蛋白、ETS结合蛋白、STAT、GATA盒结合蛋白(例如，GATA-3)和带翼螺旋蛋白的叉头家族。
用于对蛋白质、肽或多肽(例如，作为免疫球蛋白)进行测序的方法是本领域技术人员已知的。一旦已知蛋白质的序列，就会有基于网络的和可商购获得的计算机程序以及基于服务的公司，所述基于服务的公司将氨基酸序列回译为核酸编码序列。参见例如EMBOSS的backtranseq，其可从www.ebi.ac.uk/Tools/st/获得；Gene Infinity，其可从geneinfinity.org/sms/sms_backtranslation.html获得)；ExPasy，其可从expasy.org/tools/获得。在一个实施例中，RNA和/或cDNA编码序列被设计成在人细胞中最佳表达。
在某些实施例中，本文提供了一种组合物，所述组合物可用于在鞘内或全身基因疗法施用之后调节神经元变性和/或减少继发性脊髓背侧轴突变性的方法。因此，虽然本文所提供的组合物特别适于向CNS递送基因疗法，但其也可以用于其它递送途径，包含例如全身IV递送，其中高剂量的基因疗法可能导致DRG转导和毒性。所述方法涉及向患者递送包括表达盒或载体基因组的组合物，所述表达盒或载体基因组包括转基因和一个或多个miRNA靶标。
在某些实施例中，本文所提供的组合物可在用于抑制DRG中的转基因表达的方法中使用。在某些实施例中，所述方法包括递送包含miR-183靶序列的表达盒或载体基因组以抑制DRG中的转基因表达水平。在某些实施例中，所述方法增强存在于CNS中的选自以下中的一种或多种的一个或多个细胞中的表达：锥体神经元、浦肯野神经元、颗粒细胞、纺锤形神经元、中间神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和/或室管膜细胞。
在某些实施例中，提供了一种可用于递送和/或增强下运动神经元、视网膜、内耳和嗅觉受体中的转基因表达的方法，所述方法包括递送表达盒或载体基因组，所述表达盒或载体基因组包含与一个或多个miR-183靶序列可操作地连接的转基因和/或多个miR-183靶序列。在某些实施例中，细胞或组织可以是肝脏或心脏中的一种或多种。
在又另一个实施例中，提供了一种方法，所述方法包括将表达盒或载体基因组递送到存在于CNS中的细胞，其中表达盒或载体基因组包括一个或多个miR-183靶序列并且缺乏转基因(即，对异源基因产物进行编码的序列)。在此类实施例中，实现了将miR-183递送到CNS的细胞。在某些实施例中，包括miR-183序列的表达盒或载体基因组的递送导致存在于CNS中的某些其它细胞中的DRG表达的抑制和基因表达的增强。
在某些实施例中，本文所提供的组合物可用于增强CNS外的细胞中的转基因表达的方法中。在某些实施例中，用于增强CNS外的细胞中的表达的方法包括向患者递送包含miR-182靶序列的表达盒或载体基因组。
在一个实施例中，悬浮液的pH为约6.8到约7.32。
可以由本领域的技术人员确定用于递送这些剂量和浓度的合适的体积。例如，可以选择约1μL到150mL的体积，其中对于成人而言，选择更大的体积。通常，对于新生婴儿，合适的体积为约0.5mL到约10mL，对于年龄较大的婴儿，可以选择约0.5mL到约15mL。对于幼儿，可以选择约0.5mL到约20mL的体积。对于儿童，可以选择最大约30mL的体积。对于***前的少年和青少年，可以选择最大约50mL的体积。在仍其它实施例中，患者可以接受鞘内施用的体积选择为约5mL到约15mL或约7.5mL到约10mL。可以确定其它合适的体积和剂量。将调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且这种剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。
在一个实施例中，包括如本文所描述的rAAV的组合物以每克脑质量约1×109GC到每克脑质量约1×1014GC的剂量施用。在某些实施例中，rAAV以每千克体重约1×109GC到每千克体重约1×1013GC的剂量全身共同施用。
在一个实施例中，向受试者递送治疗有效量的如本文所描述的表达盒。如本文所使用的，“治疗有效量”是指包括对基因产物进行编码的核酸序列和miRNA靶序列的表达盒的量，所述表达盒在靶细胞中递送和表达并且特异性地使DRG表达脱靶。
先前已经描述了使用rAAV进行递送以治疗各种病状。这些rAAV的表达盒可以被修饰以包含本文所描述的miRNA靶序列(包含例如miR-183靶序列、miR-182靶序列和miR-96靶序列或其组合)以例如减少DRG中的转基因表达和/或减少或消除DRG毒性和/或轴突病。可以修饰以包含miRNA靶序列的rAAV载体基因组的实例包含在以下中描述的基因：WO 2017/136500(MPSI)、WO 2017/181113(MPSII)、WO 2019/108857(MPSIIIA)、WO 2019/108856(MPSIIIB)、WO 2017/106354(SMN1)、WO 2018/160585(SMN1)、WO 2018/209205(巴藤病(Batten disease))、WO 2015/164723(AAV介导的抗HER2抗体递送)、WO 2015/138348(OTC)、WO 2015/164778(FH的LDLR变体)；WO2017/106345(克里格勒-纳贾尔(Crigler-Najjar))、WO 2017/106326(抗PCSK9 Ab)、WO 2017/180857(血友病A、因子VIII)、WO 2017/180861(血友病B、因子IX)以及用于治疗肌管性肌病的试验中的载体(如AT132、AAV8、Audentes)。
在某些实施例中，AAV.α-L-艾杜糖醛酸酶(AAV.IDUA)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与IDUA基因的编码序列(参见例如SEQ ID NO:15的nt1938-3908)可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR-183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)(AAV.IDS)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与IDS基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.N-磺基葡糖胺磺基水解酶(AAV.SGSH)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与SGSH基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷酶(AAV.NAGLU)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与NAGLU基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.存活运动神经元1(AAV.SMN1)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与SMN1基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.三肽基肽酶1(AAV.TPP1)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与TPP1基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.抗人表皮生长因子受体2抗体(AAV.抗HER2)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与抗HER2基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.鸟氨酸转氨甲酰酶(AAV.OTC)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与OTC基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.低密度脂蛋白受体(AAV.LDLR)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与LDLR基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(AAV.UGT1A1)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与UGT1A1基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型抗体(AAV.抗PCSK9 Ab)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与抗PCSK9 Ab基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.因子VIII(AAV.FVIII)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与FVIII基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.因子IX(AAV.IX)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与FIX基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在某些实施例中，AAV.肌微管素1(AAV.MTM1)基因疗法载体包括载体基因组，所述载体基因组包括与MTM1基因的编码序列可操作地连接的miRNA183簇(包含miR-183、miR-182和miR183靶序列或其组合)的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括相同miR靶序列的多个拷贝，每个拷贝由间隔子隔开，所述间隔子可以相同或彼此不同。在另一个实施例中，载体基因组包括miR183簇靶序列的三到六个拷贝，任选地其中靶序列中的一个或多个靶序列与miR-183簇成员具有至少约80％到约99％的互补性。在另一个实施例中，载体包括miR183靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝。这种载体基因组可以任选地含有对应于miR183簇成员的另外的靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的单个miR靶序列。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇成员的两个miR靶序列和任选地至少一个间隔子。在某些实施例中，载体含有针对miR183簇成员的三个miR靶序列和任选地至少两个间隔子。在某些实施例中，载体基因组含有针对miR183簇的两个或更多个miR靶序列，所述两个或更多个miR靶序列的序列彼此不同。在某些实施例中，本文所描述的载体基因组由非AAV载体携带。
在一个实施例中，表达盒在载体基因组中以每克脑质量约1×109GC到每克(g)脑质量约1×1013个基因组拷贝(GC)的量递送，包含所述范围内的所有整数或分数量和端点。在另一个实施例中，剂量为每克脑质量1×1010GC到每克脑质量约1×1013GC。在具体实施例中，向患者施用的载体的剂量为至少约1.0×109GC/g、约1.5×109GC/g、约2.0×109GC/g、约2.5×109GC/g、约3.0×109GC/g、约3.5×109GC/g、约4.0×109GC/g、约4.5×109GC/g、约5.0×109GC/g、约5.5×109GC/g、约6.0×109GC/g、约6.5×109GC/g、约7.0×109GC/g、约7.5×109GC/g、约8.0×109GC/g、约8.5×109GC/g、约9.0×109GC/g、约9.5×109GC/g、约1.0×1010GC/g、约1.5×1010GC/g、约2.0×1010GC/g、约2.5×1010GC/g、约3.0×1010GC/g、约3.5×1010GC/g、约4.0×1010GC/g、约4.5×1010GC/g、约5.0×1010GC/g、约5.5×1010GC/g、约6.0×1010GC/g、约6.5×1010GC/g、约7.0×1010GC/g、约7.5×1010GC/g、约8.0×1010GC/g、约8.5×1010GC/g、约9.0×1010GC/g、约9.5×1010GC/g、约1.0×1011GC/g、约1.5×1011GC/g、约2.0×1011GC/g、约2.5×1011GC/g、约3.0×1011GC/g、约3.5×1011GC/g、约4.0×1011GC/g、约4.5×1011GC/g、约5.0×1011GC/g、约5.5×1011GC/g、约6.0×1011GC/g、约6.5×1011GC/g、约7.0×1011GC/g、约7.5×1011GC/g、约8.0×1011GC/g、约8.5×1011GC/g、约9.0×1011GC/g、约9.5×1011GC/g、约1.0×1012GC/g、约1.5×1012GC/g、约2.0×1012GC/g、约2.5×1012GC/g、约3.0×1012GC/g、约3.5×1012GC/g、约4.0×1012GC/g、约4.5×1012GC/g、约5.0×1012GC/g、约5.5×1012GC/g、约6.0×1012GC/g、约6.5×1012GC/g、约7.0×1012GC/g、约7.5×1012GC/g、约8.0×1012GC/g、约8.5×1012GC/g、约9.0×1012GC/g、约9.5×1012GC/g、约1.0×1013GC/g、约1.5×1013GC/g、约2.0×1013GC/g、约2.5×1013GC/g、约3.0×1013GC/g、约3.5×1013GC/g、约4.0×1013GC/g、约4.5×1013GC/g、约5.0×1013GC/g、约5.5×1013GC/g、约6.0×1013GC/g、约6.5×1013GC/g、约7.0×1013GC/g、约7.5×1013GC/g、约8.0×1013GC/g、约8.5×1013GC/g、约9.0×1013GC/g、约9.5×1013GC/g或约1.0×1014GC/g脑质量。
在某些实施例中，本文所提供的含有miR靶序列的组合物使患者所需的免疫抑制共疗法的剂量、持续时间和/或量最小化。目前，用于此类共疗法的免疫抑制剂包含但不限于糖皮质激素、类固醇、抗代谢药、T细胞抑制剂、大环内酯类(例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物)以及细胞生长抑制剂，包含烷化剂、抗代谢药、细胞毒性抗生素、抗体或对免疫亲和素具有活性的药剂。免疫抑制剂可以包含氮芥(nitrogen mustard)、亚硝基脲(nitrosourea)、铂化合物、甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、更生霉素(dactinomycin)、蒽环霉素(anthracycline)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)、IL-2受体(CD25)或CD3定向抗体、抗IL-2抗体、环孢素(ciclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、阿片类或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在某些实施例中，可以在施用基因疗法之前或之后的第0天、第1天、第2天、第7天或更多天开始免疫抑制疗法。此类疗法可以涉及在同一天内共施用两种或更多种药物(例如，强的松、霉酚酸酯(MMF)和/或西罗莫司(即，雷帕霉素))。可以在基因疗法施用之后以相同的剂量或经过调整的剂量继续使用这些药物中的一种或多种药物。此类疗法可以持续约1周(7天)，约60。在某些实施例中，本文所提供的含有miR靶序列的组合物在递送基因治疗(例如，rAAV)载体之前、期间或之后消除对免疫抑制疗法的需要。
在一个实施例中，将包括如本文所描述的表达盒的组合物施用于有需要的受试者一次。在某些实施例中，表达盒通过rAAV递送。
应当理解，本文所描述的方法中的组合物旨在应用于本说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。
6.试剂盒
在某些实施例中，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含悬浮于调配物(任选地冷冻)中的浓缩表达盒(例如，在病毒或非病毒载体中)、任选的稀释缓冲液以及鞘内、脑室内或脑池内施用所需的装置和组件。在另一个实施例中，试剂盒可以另外地或可替代地包含用于静脉内递送的组件。在一个实施例中，试剂盒提供足够的缓冲液以允许注射。此类缓冲液可以允许浓缩载体的稀释度为约1:1到1:5或更多。在其它实施例中，包含更高或更低量的缓冲液或无菌水以允许治疗临床医生进行剂量滴定和其它调整。在仍其它实施例中，装置的一个或多个组件包含在试剂盒中。合适的稀释缓冲液，如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或甘油/PBS是可用的。
应当理解，本文所描述的试剂盒中的组合物旨在应用于本说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。
7.装置
一方面，本文所提供的组合物可以通过例如在WO 2017/136500中描述的方法和/或装置鞘内施用，所述文献以全文引用的方式并入本文中。可替代地，可以选择其它装置和方法。总之，所述方法包括以下步骤：使脊髓针前进到患者的小脑延髓池中；将一定长度的柔性管连接到脊髓针的近侧毂，并且将阀的输出端口连接到柔性管的近端；以及在所述前进和连接步骤之后并且在允许使用患者的脑脊液对管进行自身致敏后，将含有一定量的等渗溶液的第一容器连接到阀的冲洗入口，并且之后将含有一定量的药物组合物的第二容器连接到阀的载体入口。在将第一血管和第二血管连接到阀之后，在阀的载体入口与出口之间打开流体流动路径，并将药物组合物通过脊髓针注射到患者中，并且在注射药物组合物之后，通过阀的冲洗入口和出口打开流体流动路径，并将等渗溶液注射到脊髓针中以将药物组合物冲洗到患者中。此方法和此装置可以各自任选地用于鞘内递送本文所提供的组合物。可替代地，其它方法和装置可以用于此类鞘内递送。
应当理解，本文所描述的装置中的组合物旨在应用于本说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。
实例
现在将参考以下实例描述本发明。提供这些实例仅为了说明目的，并且本发明绝不应理解为限制于这些实例，而是应理解为涵盖由于本文所提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
实例1：方法
动物
所有动物手术均经宾夕法尼亚大学的机构动物护理和使用委员会(theInstitutional Animal Care and Use Committee of the University ofPennsylvania)批准。从科文斯研究产品公司(Covance Research Products,Inc.)(Alice，TX)和Primgen/Prelabs灵长类动物公司(Hines，IL)采购恒河猴(普通猕猴(MacacaMulatta))。在宾夕法尼亚大学的实验室动物护理评估和认证协会(AAALAC)国际认可的非人类灵长类动物研究计划设施中，将动物圈养在不锈钢挤压回笼中。动物接受了各种富集，如食物款待、视觉和听觉刺激、操纵和社会互动。
从杰克逊实验室(Jackson Laboratory)购买C56BL/6J小鼠(库存编号000664)。将动物圈养在宾夕法尼亚大学基因疗法项目的AAALAC国际认可的小鼠屏障动物园中，使用富集每笼标准笼养2到5只动物(Nestlets筑巢材料)。在屏障设施中对笼、水瓶和寝具基板进行高压灭菌，并且每周更换一次笼。维持自动控制的12小时光/暗循环。每个暗周期开始于1,900小时(±30分钟)。随意提供辐射的实验室啮齿动物食物。
载体
AAV9.PHP.B反式质粒(pAAV2/PHP.B)是用QuikChange闪电定点诱变试剂盒(加利福尼亚州圣克拉拉安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，目录号210515)，使用pAAV2/9(宾夕法尼亚大学载体核心公司(Penn Vector Core))作为模板，遵循制造商的手册来产生的。pAAV2/9和pAAV2/hu68由宾夕法尼亚大学载体核心公司提供。AAV载体由宾夕法尼亚大学载体核心公司生产和滴定(如先前由Lock,M.等人所描述的,《人类基因疗法》21:1259-1271,2010)。简而言之，HEK293细胞被三重转染，并且采集培养物上清液，浓缩并用碘克沙醇梯度纯化。使用靶向兔β-珠蛋白polyA序列的引物，通过液滴数字PCR滴定经过纯化的载体(如先前Lock,M.等人,《人类基因疗法方法》25:115-125,2014)。人α-L-艾杜糖醛酸酶(hIDUA)序列是通过反向翻译和密码子优化hIDUA同种型(即前体蛋白序列NP_000194.2)获得的，并且在CB7启动子(宾夕法尼亚大学载体核心公司)下克隆。从可从mirbase.org获得的公共数据库中选择富含背根神经节(DRG)的微RNA序列。将富含DRG的miR的靶标的四个串联重复序列克隆到绿色荧光蛋白(GFP)或hIDUA顺式质粒的3'非翻译区(UTR)中。
体内研究
小鼠通过侧尾静脉接受具有或不具有miR靶标的对1×1012个基因组拷贝(GC；5×1013GC/kg)的AAV-PHP.B或4×1012GC(2×1014GC/kg)的AAV9载体进行编码的0.1mL增强的GFP(宾夕法尼亚大学载体核心公司)，并在注射后21天通过吸入CO2实施安乐死。从脑开始迅速收集组织，并且浸泡固定在10％中性缓冲***中持续约24小时，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中短暂洗涤，并在4℃下在含15％和30％蔗糖的PBS中依次平衡。然后将组织冷冻在最佳切割温度包埋介质中，并冷冻切片以进行直接GFP可视化(脑以30μm切片，并且其它组织以8μm厚度切片)。用Nikon Eclipse Ti-E荧光显微镜获取图像。通过免疫组织化学(IHC)分析DRG中的GFP表达。将具有DRG的脊柱固定在***中持续24小时，在10％乙二胺四乙酸(pH 7.5)中脱钙直到***，并按照标准方案进行石蜡包埋。将切片通过乙醇和二甲苯系列脱蜡，在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸持续6分钟以进行抗原修复，用2％H2O2(15分钟)、亲和素/生物素阻断试剂(各15分钟；加利福尼亚州伯林盖姆载体实验室(VectorLaboratories))和阻断缓冲液(含1％驴血清的PBS+0.2％Triton持续10分钟)依次阻断，然后与在阻断缓冲液中稀释的初级抗体(在37℃下持续1小时)和生物素化次级抗体(以1:500稀释，45分钟；宾夕法尼亚州西格罗夫杰克逊免疫研究实验室有限公司(JacksonImmunoResearch,West Grove,Pa))一起温育。当针对GFP的兔抗体用作初级抗体(NB600-308，科罗拉多州森特尼尔诺伟思生物制剂公司(Novus Biologicals,Centennial,CO)；以1:500稀释)时，使用DAB作为底物的Vectastain Elite ABC试剂盒(加利福尼亚州伯林盖姆载体实验室)使得将所结合的抗体可视化为棕色沉淀物。
非人灵长类动物(NHP)在荧光镜引导下接受3.5×1013GC的AAVhu68.GFP载体或1×1013GC的AAVhu68.hIDUA载体，总体积为1mL，注射到小脑延髓池中(如先前由Katz,N.等人所描述的,《人类基因疗法方法》29:212-219,2018)。为了安全读数，进行定期采血和脑脊液(CSF)抽液。血清化学、血液学、凝血和CSF分析由合同设施Antech诊断公司(北卡罗来纳州莫里斯维尔)进行。通过在静脉内注射过量戊巴比妥对动物实施安乐死并进行尸检；然后采集组织以进行全面的组织病理学检查。将所收集的组织立即用***固定并进行石蜡包埋。对于组织病理学，按照标准方案，用苏木精和曙红对组织切片进行染色。GFP表达的IHC如小鼠研究所描述的进行，但使用不同的针对GFP的抗体(山羊抗体NB100-1770，诺伟思生物制剂公司；以1:500稀释，在4℃下温育过夜)。按照上述IHC方案，使用针对hIDUA的绵羊抗体(AF4119，明尼苏达州明尼阿波利斯R&D***公司(R&D Systems)；以1:200稀释)对hIDUA进行免疫染色。另外，使用相同的初级抗体通过免疫荧光(IF)对切片进行hIDUA染色。对于IF，使切片脱蜡并如上文所描述的处理以进行抗原修复，并且然后用含1％驴血清的PBS+0.2％Triton进行阻断持续15分钟，然后与在阻断缓冲液中稀释的初级抗体(在室温下持续2小时，以1:50稀释)和FITC标记的次级抗体(45分钟；杰克逊免疫研究实验室有限公司；以1:100稀释)依次温育。将切片安装在Fluoromount G中，其中DAPI作为核复染剂。
使用对从载体基因组转录的密码子优化的RNA具有特异性的探针进行原位杂交(ISH)，所述探针不与内源性猴IDUA RNA结合。Z形探针对由生命科技公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德)合成，并且使用生命科技公司ViewRNA ISH组织测定试剂盒(ViewRNA ISHTissue Assay kit)根据制造商的方案对石蜡切片进行ISH。使用罗丹明滤光片组通过荧光显微镜对指示阳性信号的固红沉淀物的沉积进行成像。使用Aperio Versa玻片扫描仪(伊利诺伊州布法罗格罗夫莱卡生物***公司(Leica Biosystems,Buffalo Grove,IL))对具有IDUA IHC的组织切片进行扫描以进行定量。
组织病理学和形态测量学
对载体组不知情的经委员会认证的兽医病理学家确立了严重程度等级，定义0为无病变，1为轻微(<10％)，2为轻度(10-25％)，3为中度(25-50％)，4为显著(50-95％)，5为严重(>95％)。在每只动物的至少3个颈椎切片、3个胸椎切片和3个腰椎切片中确立背侧轴突病评分；从至少3个颈椎区段、3个胸椎区段和3个腰椎区段确定DRG严重程度等级；并且正中神经评分是轴突病和纤维化严重程度等级的总和，其中最大可能评分为10，并且所述正中神经评分是在左右神经的远侧和近侧部分上确立的。为了对转基因表达进行定量，经委员会认证的兽医病理学家通过与从未经处理的动物获得的对照载玻片的信号进行比较，对用抗GFP或抗hIDUA抗体进行免疫染色的细胞进行计数。使用ImageJ细胞计数器工具在每个结构和每只动物至少五个视野上对每个×20放大视野的阳性细胞总数进行计数。
载体生物分布
使用QIAamp DNA迷你试剂盒(德国凯杰公司(Qiagen)，目录号51306)提取NHP组织DNA，并且使用Taqman试剂(应用生物***公司，生命科技公司，加利福尼亚州福斯特城(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA))和靶向载体的rBG聚腺苷酸化序列的引物/探针通过实时PCR对载体基因组进行定量。
免疫学
根据先前公布的方法(Gao等人,2009)，使用对hIDUA转基因具有特异性的肽库，通过干扰素γ酶联免疫吸附点测定测量外周血T细胞对hIDUA的应答。阳性应答标准是>55个点形成单位每106个淋巴细胞并且是无刺激时培养基阴性对照物的三倍。另外，在研究第90天尸检之后，在从脾脏、肝脏和颈深***中提取的淋巴细胞中测定T细胞应答。在血清(1:1,000样品稀释度)(如先前由Hinderer,C.等人所描述的,《分子疗法》23:1298-1307,2015)中测量针对hIDUA的抗体。
细胞因子/趋化因子分析：收集CSF样品并将其储存在-80℃下直到分析时为止。使用含有以下分析物的Milliplex MAP试剂盒分析CSF样品：sCD137、嗜酸性粒细胞趋化因子、sFasL、FGF-2、趋化因子分形素、颗粒酶A、颗粒酶B、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-16、IL-17A、IL-17E/IL-25、IL-21、IL-22、IL-23、IL-28A、IL-31、IL-33、IP-10、MIP-3α、穿孔素、TNFβ。一式两份地评估CSF样品，并在FLEXMAP 3D仪器中使用
Figure BDA0003221999180000531
4.2；Bio-PlexManagerTM软件6.1进行分析。仅CV％小于20％的样品包含在分析中。
体外研究
通过使对GFP进行编码的KpnI-PstI片段和部分内部核糖体进入位点缺失，由Origene MI0000273载体修饰miR183人微RNA表达质粒。通过瞬时转染和抗GFP免疫印迹证实了经过修饰的载体缺乏GFP表达。在HEK293细胞中进行聚乙烯亚胺介导的瞬时转染，其中GFP顺式质粒含有定位在GFP表达盒的3'-UTR中的微RNA结合位点。在转染后72小时，在pH为8.0的50mM Tris-HCl、150mM NaCl和0.5％Triton X-100中用蛋白酶抑制剂裂解细胞。总共13μg的细胞裂解物用于抗GFP免疫印迹，然后进行基于电化学发光的信号检测和定量。一式三份地进行实验以进行统计分析。
统计分析
使用威尔科克森秩和检验(Wilcoxon rank sum test)评估组间的统计差异。
实例2：微RNA介导的转基因表达抑制通过AAV降低了背根神经节毒性
通过血液或脑脊液将腺相关病毒(AAV)载体递送到非人灵长类动物(NHP)的CNS中与背根神经节(DRG)毒性相关联。这可能是由高转导率引起的，所述高转导率可能会因转基因产物的过度产生而导致内质网应激。开发了通过在对应的转基因mRNA的3'非翻译区内将miRNA靶序列引入到载体基因组中来消除与CNS定向的AAV基因疗法相关的毒性的方法。在SEQ ID NO:10中提供了ITR.CB7.CI.eGFP.miR145(四个拷贝).兔β珠蛋白,3'ITR的表达盒，在SEQ ID NO:11中提供了ITR.CB7.CI.GFP.miR182(四个拷贝).兔β珠蛋白,3'ITR的表达盒，在SEQ ID NO:12中提供了ITR.CB7.CI.GFP.miRNA96(四个拷贝).兔β珠蛋白,3'ITR的表达盒，并且在SEQ ID NO:13中提供了ITR.CB7.CI.GFP.miR183(四个拷贝).兔β珠蛋白,3'ITR的表达盒。
AAV载体使NHP中的DRG变性
基于在NHP中的DRG毒性方面的经验，开发了用于对毒性的严重程度进行定量的***。评估了沿DRG中的脊髓定位的细胞体、外周神经内的轴突和沿背侧白质束上升的轴突(图1B)。据信原发病变是定位在DRG中的感觉神经元细胞体的变性。病变的组织学特征在于嗜曙红细胞过多、细胞形状不规则、尼氏物质破坏(中央染色质溶解)和核边界丢失以及单核细胞浸润(图1B)。表达高水平的转基因蛋白的细胞更可能经历变性，如在接受ICM施用表达绿色荧光蛋白(GFP；图1B)的AAV载体的动物中的转基因产物免疫染色所证明的。继发于细胞体死亡的是轴突病，所述轴突病是远侧轴突和近侧轴突的变性。轴突病的特征在于缺失轴突、围绕细胞碎片的扩张的髓鞘和巨噬细胞(图1B)。图1C展示了不同水平的DRG毒性和脊髓轴突病的实例。等级基于高倍视野组织病理学检查中受影响的组织的比例：1轻微(<10％)、2轻度(10-25％)、3中度(25-50％)、4显著(50-95％)和5严重(>95％)。
通过ICM或腰椎穿刺(LP)途径将AAV载体施用到CSF中的青少年/成年NHP的总体经验总计101只猴子，跨越21项研究，所述研究涵盖先前公开的毒理学研究(Hordeaux,J.等人,《分子疗法方法临床发展》10:68-78,2018；Hordeaux,J.等人,《分子疗法方法临床发展》10:79-88,2018)和下文实例中以及多个未公开的研究中描述的两个NHP实验。此经验包含七种衣壳、12种转基因、三个启动子(CB7、UBC、hSyn)、从1×1012GC到5.7×1013GC的剂量、通过梯度或柱纯化的载体、三种调配物(磷酸盐缓冲盐水和两种不同的人工CSF)以及处于不同发育阶段的恒河猴和食蟹猴。在每个实验组中，观察到DRG毒性和轴突病。病理在注射后约一个月达到峰值，并且在长达六个月(其是在成熟猕猴中评估的最长时间段)内没有进展。在大多数情况下，病理是轻度到中度的。然而，表达GFP注射的ICM的高剂量载体可能导致与共济失调相关的严重病理。
在DRG神经元中特异性表达的miRNA可以消除AAV转基因表达
在考虑减轻DRG毒性的方法时，评估了若干种机制。在先前的研究中，通过对施用表达人IDUA或人IDS的ICM AAV9载体的NHP进行免疫抑制来分析对经过转导的DRG的破坏性适应性免疫应答的作用。用霉酚酸酯(MMF)和雷帕霉素进行处理减弱了对载体和转基因产物的适应性免疫应答，但没有显著影响DRG毒性和轴突病(Hordeaux,J.等人,《分子疗法方法临床发展》10:68-78,2018；Hordeaux,J.等人,《分子疗法方法临床发展》10:79-88,2018)。
先前尚未研究的一种可能性是，在高度转导的DRG中的转基因产物的过度表达是否是神经元损伤和细胞体和相关轴突的变性、随后的反应性炎性应答的原因(图2A)。因此，为了特异性地消除DRG中的转基因表达，将仅在DRG神经元中表达的miRNA靶标克隆到转基因的3'非翻译区中(图2B)。从载体表达的任何mRNA将会被内源表达的miRNA破坏。
使用体外测定来评估miRNA策略的活性和特异性。构建了AAV顺式质粒以在表达盒的3'非翻译区中包含靶miRNA序列的四个重复串联体(图2B)。将AAV顺式质粒与表达miR183的质粒共转染到HEK293细胞中。在存在miR183的情况下，只有当miR183含有同源识别序列时，转基因GFP的表达才会降低(图3A)。
在C57Bl/6J小鼠中筛选了AAV载体内的潜在miRNA靶标的体内活性和特异性。评估了具有或不具有来自miRNA183复合物的两个成员(miR182和miR183)以及miR145的miRNA靶标的表达GFP的载体。最初测试了miR96(即183复合物的另一个成员)，但由于小鼠皮质中转基因表达的降低(未示出)而将其消除。动物接受高剂量静脉内(IV)注射AAV9以靶向DRG，并接受高剂量AAV-PHP.B(AAV9-PHP.B.CB7.CI.GFP.rBG)注射以靶向CNS。在第21天对动物进行尸检，并通过脑和肝脏中的免疫组织化学(IHC)和直接荧光显微镜检查分析DRG中的GFP表达。使用含有miR183和miR182靶标的载体，DRG神经元中的GFP的表达显著降低，然而miR145靶标则没有影响(图3B和图3C)。使用含有miR靶标中的任何miR靶标的载体，肝脏或其它CNS隔室中的表达没有明显降低。使用miR183载体，CNS中的表达似乎略微增强(图3D)。在此小鼠实验中，无法评估miR183转基因抑制对病理的影响，因为仅在NHP中观察到载体诱导的DRG毒性。
通过miR183进行的限制性转基因表达降低NHP中的DRG毒性
基于小鼠中令人鼓舞的数据，评估了NHP中的GFP miR183表达盒。在恒河猴中ICM注射表达来自CB7启动子的GFP(AAV9.CB7.CI.GFP.rBG)(N＝2)或GFP miR183(AAV9.CB7.CI.GFP.miR183.rBG)(N＝4)的AAVhu68载体(3.5×1013GC)。在第14天对一半动物进行尸检以检测GFP表达(图4B-GFP表达的代表性IHC；图4B-表达的定量)。在第60天对其余动物进行尸检以评估表达和DRG毒性(图4C-DRG变性、脊髓背侧轴突病和外周神经轴突病)。动物耐受ICM施用的载体而没有临床后遗症。使用miR183载体的DRG中的GFP表达在统计学上显著降低，并且包含腰椎运动神经元、小脑、皮质、心脏和肝脏的其它地方的表达增强或类似(图4A和图4B)。这与跨九个区的病理的显著减少相关(DRG和颈椎、胸椎和腰椎处的脊髓背侧轴突病以及正中神经、腓神经和桡神经的轴突病；图4C)。在载体中没有miR183靶标的情况下，所有区都存在病理，并且在4级、2级和1级之间均匀分布。在使用miR183载体的情况下，最大的病理为2级，并且存在于仅11％的区中；其余区为1级(72％)或无病理(16％)。
这些研究表明，在具有含有miR183靶标的载体的DRG感觉神经元中选择性地抑制GFP表达。其它CNS神经元和外周器官不受影响。因此，在高免疫原性/毒性转基因(GFP)的背景下，DRG毒性和继发性轴突病从显著/严重降低到轻微水平。
实例3：在通过AAV递送具有miRNA靶序列的载体基因组之后背根神经节中的治疗性蛋白质表达的特异性抑制
使用表达人IDUA——一种患有黏多糖贮积症I的患者中缺乏的酶的载体进一步评估NHP中的miR183靶序列。对此人转基因的研究首先突显NHP中的DRG毒性(Hordeaux,J.等人,《分子疗法方法临床发展》10:79-88,2018)。实验包含三组(N＝3/组)：1)第1组-不具有miR183靶标的单独对照载体(AAVhu68.CB7.CI.hIDUAcoV1.rBG)；2)第2组-在用类固醇(从第-7天到第30天，***龙1mg/kg/天，然后逐渐减少)处理的动物中不具有miR183靶标的对照载体(AAVhu68.CB7.CI.hIDUAcoV1.rBG)；以及3)第3组-具有miR183靶标的载体(AAVhu68.CB7.CI.hIDUAcoV1.miR183.rBG)。所有载体基因组都包含在以下的控制下的hIDUA编码序列：鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子元件(被称为CB7启动子)、由鸡β-肌动蛋白剪接供体(973bp，GenBank：X00182.1)和兔β-珠蛋白剪接受体元件组成的嵌合内含子(CI)以及兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(rBG，127bp，GenBank：V00882.1)。SEQ ID NO:14中提供了ITR.CB7.CI.hIDUAcoV1.rBG.ITR的载体基因组。SEQ ID NO:15中提供了ITR.CB7.CI.hIDUAcoV1.miRNA183.rBG.ITR的载体基因组。所有动物都接受了ICM注射表达来自组成型启动子CB7的hIDUA的AAVhu68载体(1×1013GC)。在第90天进行尸检以评估转基因表达和DRG相关毒性。
来自所有组的动物都耐受ICM载体，其中没有载体相关的临床发现或临床病理学异常(表1和表2)。CSF中的脑脊液细胞增多非常低，并且限于第2组中的一只动物和第3组中的一只动物(表3)。在所有三组中均检测到T细胞应答(通过ELISPOT测量)和针对hIDUA的抗体两者(图7A-图7D)。在注射后第21天和第35天，第3组中的CSF细胞因子与第1组相比降低，而第2组(类固醇)的水平在24小时降低(图8)。第21-35天对应于预期过表达诱导应激时的转基因的峰值表达。
使用直接荧光和原位杂交(ISH)，在使用对照载体(没有miR183靶标；图5和图6A)的第1组和第2组中观察到hIDUA在DRG中的高表达。在其它CNS隔室中检测到中等水平的hIDUA表达，包含脊髓和小脑的下运动神经元和皮质神经元(图5和图6A)。将miR183靶标包含到载体中(第3组)消除了DRG神经元中的hIDUA表达，而不降低CNS中的表达(图5和图6A)。由于载体在整个CNS和DRG中的生物分布跨所有组基本上相同(图9)，因此miR183对DRG中的hIDUA表达的降低不是由于基因转移的减少而造成的。与第1组相比，类固醇适度降低DRG中的表达并增加其在下运动神经元中的表达(图5和图6A)。正如预期的那样，第1组在DRG、背柱和外周神经中表现出病理。然而，当使用具有miR183靶标的载体时，这些发现完全不存在(第3组，图6B)。感兴趣的是，与类固醇(第2组)共处理并没有降低亲本载体(即，不含miR183)的毒性。实际上，注意到毒性恶化的趋势(图6B)。
表1：ICM注射有AAV.hIDUA载体的NHP的血液化学
Figure BDA0003221999180000571
Figure BDA0003221999180000581
Figure BDA0003221999180000591
表2：ICM注射有AAV.hIDUA载体的NHP中的全血细胞计数
Figure BDA0003221999180000592
Figure BDA0003221999180000601
Figure BDA0003221999180000611
表3：ICM注射有AAV.hIDUA载体的NHP中的CSF白血细胞计数(每μL细胞)
Figure BDA0003221999180000612
DRG的毒性很可能发生在任何依赖于高全身剂量载体或将载体直接递送到CSF中的疗法中。此安全问题仅限于灵长类动物，并且通常是无症状的。然而，DRG毒性可能导致大量发病率，如由于本体感受缺陷引起的共济失调(Hinderer,C.等人,《人类基因疗法》29(3):285-298,2018)或难治性神经性疼痛。由于NHP DRG毒性，美国食品和药物管理局最近暂停了一项针对迟发性SMA的鞘内AAV9临床试验，这强调了此风险可能如何限制AAV疗法的发展(诺华公司.诺华公司宣布AVXS-101鞘内研究更新,2019)。
最初假设此毒性是由针对外源衣壳或转基因表位的DRG中的经过转导的神经元的破坏性T细胞免疫引起的。然而，强免疫抑制方案(如MMF和雷帕霉素)并不能阻止毒理学研究中的毒性(Hordeaux,J.等人,《分子疗法方法临床发展》10:68-78,2018；Hordeaux,J.等人,《分子疗法方法临床发展》10:79-88,2018)，在此研究中类固醇也不能阻止毒性。延迟但非进行性DRG变性的时程不支持适应性免疫起作用的观点。如果涉及细胞毒性T细胞，则将会观察到早期开始并随时间进展的DRG变性和单核细胞浸润。
高水平的DRG转导可能会产生细胞应激，所述细胞应激导致高度转导的DRG神经元变性。由于可以通过抑制转基因mRNA和蛋白质表达来防止毒性，因此衣壳或载体DNA不能成为细胞应激源。组织学分析表明，变性仅限于表达最高水平的转基因蛋白的DRG神经元。延迟但自限性DRG神经元变性的时程与非免疫毒性仅限于高度转导的细胞的子集的观点一致。尚不清楚DRG毒性和轴突病是否可逆。在跟踪成年动物六个月后，没有观察到病理的持续减少。在ICM注射后在NHP中观察到DRG毒性的唯一实验是将载体施用到一个月大的猕猴身上，所述猕猴在四年后进行尸检(Hordeaux等人,2019)。有可能的是，灵长类婴儿对DRG毒性有抗性，或者其DRG神经元具有再生能力，或者病变在此延长的时间段内消退。
所提出的发现支持DRG毒性是由转基因过度表达引起的。因此，DRG毒性的严重程度应受剂量、启动子强度和转基因性质的影响。仍然不了解为什么感觉神经元是灵长类动物中最高效的转导细胞之一。DRG很容易被全身施用的载体进入，因为其驻留在CNS之外并且具有多孔的、有孔的毛细血管。全身性载体也可以在从外周轴突摄取后通过逆行运输进入DRG神经元。驻留在鞘内空间内的感觉神经元隔室的解剖结构可能会促进递送到CSF中的载体的高转导。背根中的DRG神经元的轴突暴露于CSF中，从而在ICM/LP施用后轻松获得载体。蛛网膜下腔到DRG细胞外液的开放通路应允许ICM/LP载体与神经元细胞体和DRG的其它细胞直接接触。用miR183抑制DRG神经元内的转基因表达促进了对不应受此miR影响的DRG中的其它细胞的转基因表达的分析。ISH揭示了周围神经胶质卫星细胞中的转基因mRNA，这可能表明直接转导(图6C)。尚不清楚胶质细胞中的转基因mRNA的功能后果。
选择性抑制载体转基因表达应减少并可能地消除DRG毒性。用于实现这一目标的关键是在不影响其它地方表达的情况下特异性地消除DRG神经元中的表达的策略。目前没有办法通过衣壳修饰或组织特异性启动子来实现此特异性。将miR183的靶标包含到载体中实现了减少/消除DRG毒性的期望结果，而不会影响载体制造、效力或生物分布。上述hIDUANHP研究中包含一组接受非miR183载体和伴随类固醇—这是在AAV试验中减轻免疫介导毒性的标准方法。类固醇处理组的DRG毒性没有降低；实际上，存在毒性恶化的趋势。此实验证明了预防性类固醇在AAV基因疗法试验中的局限性。
这种减少DRG毒性的方法的模块性表明其可用于考虑用于CNS基因疗法的任何AAV载体中，其中期望减轻AAV诱导的DRG毒性。这种方法可以跨用于治疗性应用的广泛的AAV载体阵列使用。
实例4：具有miR183簇靶序列的表达构建体的体外评估
体外测定用于评估含有miRNA靶序列的构建体的活性和特异性。如上文实例2中所描述的，用具有GFP转基因的顺式质粒和表达一种或多种miRNA(如miR-182和miR-183)的质粒共转染HEK293细胞(或另一种合适的细胞系)。顺式质粒被设计成在表达盒的3'UTR中有不同数量的对应靶miRNA序列，并引入了替代性间隔子序列。在转染后72小时，对GFP的表达进行定量以确定相对表达水平。
例如，测试含有靶miR183序列的一个、两个、三个或四个拷贝的构建体。单独靶序列由间隔子序列(如SEQ ID NO:5-7中提供的间隔子序列)直接连接或隔开。基于体外研究的结果，鉴定了减少或消除GFP表达的序列(包含多个重复序列)和间隔子的合适组合。然后通过递送具有表达构建体的AAV载体(例如，AAV9或AAV-PHP.B)在体内筛选来自此研究的候选者，所述表达构建体与靶miRNA序列和间隔子序列的布置相同或类似。实例2中提供了评估CNS表达水平的示例性体内小鼠研究，包含例如DRG的脱靶(即，GFP表达的减少)。
还使用具有miR182的靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝的组合的构建体进行类似的研究，所述靶序列具有和不具有各种间隔子序列。另外，产生了具有miR182和miR183识别序列的组合和不同布置的构建体。然后在体内评估具有仅miR182靶序列以及miR182和miR183靶序列的组合的构建体，所述靶序列在体外示出有利的降低的表达水平，例如，在施用AAV载体之后，确定CNS和DRG的细胞中的毒性和转基因表达水平(脱靶程度)。
可替代地，产生了具有miR182靶序列和/或其它mir183簇靶序列(即对应于miR-183、miR-96或miR-182的靶序列)的组合的一个、两个、三个或四个拷贝的构建体。使用如上文实例2中描述的GFP表达测定在体外测试含有组合miR182-mir183簇靶序列的构建体。如上所述，经过测试的表达盒具有不同数量的由或不由间隔子序列隔开的miRNA靶序列。然后，通过产生然后以高剂量IV施用的AVV载体，在体内评估具有miR182靶序列和其它mir183簇靶序列的组合的某些构建体的活性。如上所述，在各种细胞和组织(包含DRG)中以及具体地在肝脏组织中评估了AAV载体转基因的表达。
进一步地，评估了转基因表达的miR182靶序列的一个、两个、三个或四个拷贝的效应。如上所述，产生用于体外测试的实验构建体，将miR182靶序列引入到表达盒的3'UTR中。在引入多个miR182序列的情况下，序列可以是连续的，或者可替代地由各个中间间隔子序列中的任一个隔开。所产生的AAV载体具有带有miR182靶序列以及(如果适用的话)间隔子序列的任何组合的表达盒，并在体内进行测试。具体地，在具有miR182靶序列的表达盒的情况下，在高剂量IV施用AAV载体之后评估肌肉组织中的转基因表达。
实例5：用于治疗黏多糖贮积症II型(MPS II)的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hIDS)转基因的脱靶
治疗MPS II(亨特氏综合征)的一种策略是通过基于rAAV的CNS定向的基因疗法功能性地置换患者有缺陷的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(参见例如国际专利申请第PCT/US2017/027770号，所述国际专利申请通过引用并入本文中)。为了降低DRG毒性，通过引入miR靶序列来修饰用于治疗MPSII的AAV载体基因组。因此，含有hIDS编码序列的AAV载体基因组被设计成具有一个、两个、三个或四个miR183靶序列。例如，在将对hIDS进行编码的AVV载体鞘内施用到NHP之后，测量体内DRG脱靶的有效性。
实例6：用于治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)的SMN1转基因的脱靶
SMA是由hSMN1基因的突变或缺失引起的常染色体隐性病症。通过rAAV载体递送功能性SMN蛋白已有效治疗SMA，但已观察到DRG毒性。合适的载体包含：在国际专利申请第PCT/US2018/019996号中描述的载体，所述国际专利申请通过引用并入本文中；以及
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一种基于AAV9的基因疗法。通过将miRNA靶序列(如由miR182和miR183识别的靶序列)并入到载体基因组中，可以在递送对人SMN1进行编码的AAV载体之后减少或消除DRG毒性。因此，产生了AAV载体，包含具有AAV9或AAVhu68衣壳的AAV载体，所述AAV载体具有对hSMN1转录物进行编码的核酸序列与一个、两个、三个或四个miRNA靶序列的组合。靶序列选自例如miR182和miR183靶序列或其组合。在NHP模型中评估IV或鞘内施用表达hSMN1的AAV载体之后的DRG毒性。
实例7：具有miRNA靶序列的肝脏定向的基因疗法载体
在基因疗法期望肝脏组织中的转基因的经过改进的表达的情况下，可以对AAV载体基因组进行修饰以包含miRNA靶序列。例如，被设计成表达功能性低密度脂蛋白受体(hLDLR)基因并带有AAV8衣壳的rAAV适于治疗家族性高胆固醇血症(FH)(参见例如国际专利申请第PCT/US2016/065984号，所述国际专利申请通过引用并入本文中)。hLDLR转基因在肝脏组织中的增强的表达是使用具有载体基因组的rAAV实现的，所述载体基因组具有hLDLR编码序列与一个、两个、三个或四个miR182靶序列的组合。同样，用于治疗血友病A(因子VIII)和血友病B(因子IX)的基因疗法包含具有肝脏趋向性的载体(参见例如国际专利申请第PCT/US2017/027396号和国际专利申请第PCT/US2017/027400号，所述国际专利申请都通过引用并入本文中)。通过将具有一个、两个、三个或四个miR182靶序列的载体基因组与转基因组合递送rAAV，可以更有效地递送和表达肝脏中的人因子VIII和因子IX。
(序列表自由文本)
对于在数字标识符<223>下含有自由文本的序列，提供了以下信息。
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本说明书中所引用的所有出版物以全文引用的方式并入本文中。于2018年12月21日提交的美国临时专利申请第62/783,956号、于2019年10月23日提交的美国临时专利申请第62/924,970号以及于2019年11月13日提交的美国临时专利申请第62/934,915号特此以全文引用的方式并入。类似地，本文中所引用的并出现在所附序列表中的SEQ ID NO通过引用并入。尽管已经参考特定实施例描述了本发明，但是应当理解的是，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行修改。这种修改旨在落入所附权利要求的范围内。
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Claims (25)

1.一种用于基因递送的组合物，所述组合物特异性地抑制基因产物在背根神经节(DRG)中的表达，所述组合物包括表达盒，所述表达盒是包括以下的核酸序列：
(a)在调控序列的控制下的基因产物的编码序列，所述调控序列引导所述基因产物在含有所述表达盒的细胞中的表达；以及
(b)至少一个靶序列，所述至少一个靶序列对miR-183、miR-182或miR-96中的至少一个具有特异性，所述至少一个靶序列可操作地连接在所述编码序列(a)的3'端处。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括靶向序列的至少两个串联重复序列，所述靶向序列包括可相同或不同的至少一个第一miRNA靶序列和至少一个第二miRNA靶序列。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述至少两个miRNA串联重复序列定位在3'UTR中。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的组合物，其中所述表达盒包括具有三个miRNA串联重复序列的3'UTR。
5.根据权利要求2到4中任一项所述的组合物，其中所述串联miRNA靶序列是连续的或由1到10个核酸的间隔子隔开，其中所述间隔子不是miRNA靶序列。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的组合物，其中存在两组定位在所述3'UTR中的至少两个miRNA靶序列。
7.根据权利要求2到6中任一项所述的组合物，其中所述至少两个miRNA串联重复序列中的第一个的起点在距基因编码序列的3'端20个核苷酸内。
8.根据权利要求2到6中任一项所述的组合物，其中所述至少两个miRNA串联重复序列中的第一个的起点距基因编码序列的3'端至少100个核苷酸。
9.根据权利要求2到6中任一项所述的组合物，其中所述3'UTR和所述miRNA串联重复序列的长度为200到1200个核苷酸。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的组合物，其中所述表达盒包括定位在所述3'UTR中的四个miRNA靶序列。
11.根据权利要求1到8中任一项所述的组合物，其中所述表达盒进一步包括至少一个靶序列，所述至少一个靶序列对5'UTR中的miR-183、miR-182或miR-96具有特异性。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述表达盒包括定位在所述5'UTR和所述3'UTR两者中的至少两个miRNA靶序列。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的组合物，其中表达盒mRNA或DNA正链的所述至少一个miRNA靶序列是
(a)AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(SEQ ID NO:1)；
(b)AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA(SEQ ID NO:2)；
(c)AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(SEQ ID NO:3)；或
(d)AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC(SEQ ID NO:4)。
14.根据权利要求2到13中任一项所述的组合物，其中两个或更多个连续的miRNA靶序列是连续的并且不由间隔子隔开。
15.根据权利要求1到13中任一项所述的组合物，其中所述miRNA靶序列中的两个或更多个miRNA靶序列由间隔子隔开，并且每个间隔子独立地选自以下中的一个或多个：(i)GGAT(SEQ ID NO:5)；(ii)CACGTG(SEQ ID NO:6)；或(iii)GCATGC(SEQ ID NO:7)。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的组合物，其中定位在所述miRNA靶序列之间的所述间隔子定位在第一个miRNA靶序列的3'和/或最后一个miRNA靶序列的5'。
17.根据权利要求15或16所述的组合物，其中所述miRNA靶序列之间的所述间隔子是相同的。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的组合物，其中所述表达盒由选自以下的病毒载体携带：重组细小病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒和重组腺病毒。
19.根据权利要求1到17中任一项所述的组合物，其中所述表达盒由选自以下的非病毒载体携带：裸DNA、裸RNA、无机颗粒、脂质颗粒、基于聚合物的载体和基于壳聚糖的调配物。
20.一种用于向有需要的患者递送基因产物的重组AAV(rAAV)，所述rAAV特异性地抑制基因产物在背根神经节中的表达，所述rAAV包括其中包装有AAV载体基因组的病毒衣壳，其中所述载体基因组包括：
(a)在调控序列的控制下的所述基因产物的编码序列，所述调控序列引导所述基因产物在含有所述载体基因组的细胞中的表达；以及
(b)至少一个miRNA靶序列，所述至少一个miRNA靶序列对miR-183、miR-182或miR-96中的至少一个具有特异性。
21.一种药物组合物，其包括根据权利要求20所述的rAAV和适于通过脑室内(ICV)、鞘内(IT)、脑池内或静脉内(IV)注射递送的调配物缓冲液。
22.一种用于抑制DRG神经元中的转基因表达的方法，所述方法包括向患者递送根据权利要求1到19中任一项所述的组合物、根据权利要求20所述的rAAV或根据权利要求21所述的组合物。
23.一种用于在鞘内或全身基因疗法施用之后调节神经元变性和/或减少继发性脊髓背侧轴突变性的方法，所述方法包括向患者递送根据权利要求1到19中任一项所述的组合物、根据权利要求20所述的rAAV或根据权利要求21所述的组合物。
24.一种用于增强转基因在中枢神经***(CNS)的细胞中的表达的方法，所述方法包括向患者递送根据权利要求1到19中任一项所述的组合物、根据权利要求20所述的rAAV或根据权利要求21所述的组合物，其中所述miRNA靶序列包括至少一个miR183靶序列。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述CNS的所述细胞包含以下中的一种或多种：锥体神经元、浦肯野神经元(purkinje neuron)、颗粒细胞、纺锤形神经元、中间神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞。
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