JP2023547340A - 新規ii型コラーゲン結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新しいII型コラーゲンαI鎖特異的結合タンパク質に関する。本発明はさらに、さらに治療上又は診断上有効な成分に融合又は結合されたII型コラーゲン結合タンパク質に関する。本発明のさらなる態様は、それらのII型コラーゲン結合タンパク質の医学における使用を包含する。【選択図】 図2A
Description
本発明は、新しいII型コラーゲンαI鎖特異的結合タンパク質に関する。本発明はさらに、本発明はさらに、さらに治療上又は診断上有効な成分に融合又は結合されたII型コラーゲン結合タンパク質に関する。本発明のさらなる態様は、医学におけるこれらのII型コラーゲン結合タンパク質の使用を包含する。
コラーゲンは、3次元の網目構造を形成する構造タンパク質である。II型コラーゲンはホモ三量体を形成し、線維構造をもたらす。様々な種類の多くのコラーゲンのなかで、II型コラーゲンは関節軟骨及び硝子軟骨の基盤を形成する。関節軟骨のコラーゲンの85~90%、眼の硝子体液のコラーゲンの65%を構成している。II型コラーゲンは、特に眼疾患や関節疾患などの重要な臨床標的である。
細菌タンパク質又は他の天然のコラーゲン相互作用タンパク質由来の短いコラーゲン結合ドメインが、膠原病、組織再生、心疾患、又はがんを含む特定の医学的適用に向けて提案された。
しかし、細菌タンパク質又は他の天然のコラーゲン相互作用タンパク質由来のコラーゲン結合ドメインの欠点は、異なる種類のコラーゲンに対して広い交差反応性である。
眼及び関節の構造に関連する疾患は、薬がアクセスしにくいという難点がある。潅流が低いため、非経口又は経口で投与された診断薬及び治療薬は関節の軟骨又は眼の硝子体に十分な量が到達しない。これらの構造への局所適用は可能であるが、局所適用の欠点は、一般的に、特に治療薬が時間の経過とともにあまりにも早く体内から排出されることである、おそらくその物質が有意な薬学的効果を示す前でさえも排出される。
眼の硝子体又は関節への注射による治療的又は診断的介入は、患者にとっても医師にとっても同じように不便である。そのような介入は患者にとってリスクが高く、苦痛を伴う。
言うまでもなく、特に眼疾患及び関節疾患において、患者及び診療所(clinics)を、頻度が高く、且つ負担の大きい不可避の治療から解放することが強く求められている。
したがって、より効果的な治療及び診断、特に眼及び関節へのより効果的な薬物送達に向けた手順を見つける必要がある。本発明の1つの目的は、治療薬剤を病変組織の近くに留めて、その有益な影響を長持ちさせるための分子を提供することである。
眼疾患及び関節疾患、並びに他の疾患を治療するための現在知られている戦略の欠点を克服するために、新規なコラーゲン特異的結合タンパク質は、II型コラーゲンに対する特異的親和性などの特性を含むべきである。特に、眼疾患及び関節疾患に関しては、とりわけ負担が大きく危険な適用を考慮すると、より効果的な治療のためには、より長い滞留時間が望ましいことになる。したがって、適用された物質をより長く局所的に保持することが、介入の頻度を減らして処置の負担を軽減するために非常に望ましい。
Hulme et al.(Journal Of Orthopaedic Research 2017,Vol.36(4),pp.1238-1247)には、II型コラーゲン結合Avimer(商標)ドメインが記述されている。Rothenflu et al.(Nature Materials 2008,Vol.7(3),pp.248-254)には、6つのアミノ酸の配列「WYRGRL」を有するII型コラーゲンリガンドが記述されている。Formica et al.(Journal of Controlled Release 2019,Vol.295,pp.118-129)は、軟骨を標的とするデキサメタゾンプロドラッグの「WYRGRL」リガンドに関する。Brown et al.(Acta Biomater.2019,Vol.93,pp.239-257)は、変形性関節症の治療に向けたナノマテリアルの関節内ターゲティングに関する総説論文である。
本発明は、様々な疾患の治療及び診断における改良された新しい戦略のための、新規II型コラーゲン結合分子を提供する。II型コラーゲンに対する特異性をもつ結合タンパク質は、いくつかの重症疾患において、より少ない医学的介入及びより安全な治療を可能にし、クオリティ・オブ・ライフを向上させることができる。
上記の目的及び利点は、同封の特許請求の範囲の主題によって達成される。本発明は、II型コラーゲン結合タンパク質の例を提供することによって、上記に提示したニーズに応えるものである。上記の概要は、必ずしも本発明によって解決されるすべての課題を記載しているわけではない。
本開示は、特にこれらに限定されることなく、以下の項目[1]~[12]を提供する:
[1]配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むII型コラーゲン結合タンパク質を含めて、配列番号1~44の群から選択されるいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むII型コラーゲン結合タンパク質であって、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有するII型コラーゲン結合タンパク質。
[2]2、3、4、5、又は6つのII型コラーゲンに対する結合タンパク質が、互いに連結した項目[1]に記載のII型コラーゲンに対する結合タンパク質。
[3]ホモ多量体又はヘテロ多量体である項目[2]に記載のII型コラーゲンに対する結合タンパク質。
[4]配列番号27~42のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む項目[3]に記載のII型コラーゲンに対する結合タンパク質。
[5]II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する項目[1]~[4]にいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質。
[6]項目[1]~[5]にいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質を含む二量体又は多量体タンパク質。
[7]モノクローナル抗体及びその断片、結合タンパク質、受容体及び受容体ドメイン、受容体結合リガンド及びアンタゴニスト、受容体の細胞外ドメイン及びその断片、非免疫グロブリン結合タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性化合物、酵素、並びにそれらの誘導体、並びに放射性核種、並びに上記の任意の組み合わせから任意選択で選択される、少なくとも1つの治療上有効な部分にさらに融合又は結合された項目[1]~[5]にいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質、又は項目6に記載の二量体若しくは多量体タンパク質。
[8]放射性核種、蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、及び非免疫グロブリン結合タンパク質、並びに上記の任意の組み合わせから任意選択で選択される少なくとも1つの診断用部分にさらに融合された又は結合された項目[1]~[5]及び[7]にいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質、又は項目[6]若しくは[7]に記載の二量体若しくは多量体タンパク質。
[9]医学に使用するため、好ましくは、眼疾患又は関節の疾患などの疾患の診断又は治療に使用するための項目[1]-[5]、[7]及び[8]のいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質。
[10]項目[1]-[5]、[7]及び[8]のいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質、又は項目[6]~[8]のいずれか一項に記載の二量体若しくは多量体タンパク質を含む組成物。
[11]前述の態様のいずれかに画定されたII型コラーゲン結合タンパク質、又は二量体若しくは多量体タンパク質並びに治療上又は診断上許容可能な担体及び/又は希釈剤を含む、疾患の治療のための医薬組成物。
[12]II型コラーゲン結合タンパク質を得るために好適な条件下で宿主細胞を培養すること及び任意選択で前記II型コラーゲン結合タンパク質を単離することを含む、前述の態様のいずれかに画定されたII型コラーゲン結合タンパク質、又は二量体若しくは多量体タンパク質を製造するための方法。
[1]配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むII型コラーゲン結合タンパク質を含めて、配列番号1~44の群から選択されるいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むII型コラーゲン結合タンパク質であって、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有するII型コラーゲン結合タンパク質。
[2]2、3、4、5、又は6つのII型コラーゲンに対する結合タンパク質が、互いに連結した項目[1]に記載のII型コラーゲンに対する結合タンパク質。
[3]ホモ多量体又はヘテロ多量体である項目[2]に記載のII型コラーゲンに対する結合タンパク質。
[4]配列番号27~42のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む項目[3]に記載のII型コラーゲンに対する結合タンパク質。
[5]II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する項目[1]~[4]にいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質。
[6]項目[1]~[5]にいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質を含む二量体又は多量体タンパク質。
[7]モノクローナル抗体及びその断片、結合タンパク質、受容体及び受容体ドメイン、受容体結合リガンド及びアンタゴニスト、受容体の細胞外ドメイン及びその断片、非免疫グロブリン結合タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性化合物、酵素、並びにそれらの誘導体、並びに放射性核種、並びに上記の任意の組み合わせから任意選択で選択される、少なくとも1つの治療上有効な部分にさらに融合又は結合された項目[1]~[5]にいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質、又は項目6に記載の二量体若しくは多量体タンパク質。
[8]放射性核種、蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、及び非免疫グロブリン結合タンパク質、並びに上記の任意の組み合わせから任意選択で選択される少なくとも1つの診断用部分にさらに融合された又は結合された項目[1]~[5]及び[7]にいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質、又は項目[6]若しくは[7]に記載の二量体若しくは多量体タンパク質。
[9]医学に使用するため、好ましくは、眼疾患又は関節の疾患などの疾患の診断又は治療に使用するための項目[1]-[5]、[7]及び[8]のいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質。
[10]項目[1]-[5]、[7]及び[8]のいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質、又は項目[6]~[8]のいずれか一項に記載の二量体若しくは多量体タンパク質を含む組成物。
[11]前述の態様のいずれかに画定されたII型コラーゲン結合タンパク質、又は二量体若しくは多量体タンパク質並びに治療上又は診断上許容可能な担体及び/又は希釈剤を含む、疾患の治療のための医薬組成物。
[12]II型コラーゲン結合タンパク質を得るために好適な条件下で宿主細胞を培養すること及び任意選択で前記II型コラーゲン結合タンパク質を単離することを含む、前述の態様のいずれかに画定されたII型コラーゲン結合タンパク質、又は二量体若しくは多量体タンパク質を製造するための方法。
この概要は、必ずしも本発明のすべての特徴を説明するものではない。他の実施形態は、後に続く詳細な説明の検討から明らかになる。
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質は、非免疫グロブリン結合タンパク質によって眼II型コラーゲンに特異的に結合している。本発明の発明者らは、配列番号1~26、43、44の群から選択されるいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むII型コラーゲン特異的タンパク質を提供することによって、当該技術分野における継続的な必要性を満たす解決策を生み出した。本明細書で定義されるII型コラーゲン特異的タンパク質は、II型コラーゲンに対する高い親和性によって機能的に特徴付けられる。特に、本発明は、配列番号1~44から選択されるいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むII型コラーゲン結合タンパク質を提供する。新規II型コラーゲン特異的タンパク質は、治療及び診断の選択肢を広げることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも2つのII型コラーゲン結合タンパク質は互いに連結して、例えば配列番号27~42に示される多量体を生成する。
以下に本発明をより詳細に説明する前に、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール及び試薬は変化する可能性があるので本発明はそれらに限定されないことを理解すべきである。また、ここで使用される用語は、特定の態様及び実施形態を説明する目的のためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によって反映される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解すべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。それには、タンパク質工学及び精製の分野の当業者が含まれるが、技術的用途並びに治療及び診断に使用するための新しい標的特異的結合分子の開発の分野の当業者も含まれる。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC推奨)」、Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.and Kolbl,H.eds.(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010 バーゼル、スイス)に記載の通りに定義される。
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の解釈を必要としない限り、「含む(comprise)」という単語、及び「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」などの変形は、記述された整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップのグループを含むことを意味するが、他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップのグループを除外することは意味しないと理解されたい。「comprise(s)」又は「comprising」という用語は、「からなる(consists of)」又は「からなる(consisting of)」の限定を包含できるが、そのような限定が何らかの理由で、ある程度必要である場合に限る。
いくつかの文書(例えば、特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書、GenBankアクセッション番号配列登録など)が本明細書を通じて引用される場合がある。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明によってそのような開示に先行する権利を有していないことを認めるものとして解釈すべきではない。本書に引用された文献の中には、「参照により組み込まれる」ことを特徴としうるものがある。そのような組み込まれた文献の定義及び教示と、本明細書に記載された定義及び教示が矛盾する場合は、本明細書の本文が優先される。
本明細書で言及される配列はすべて、その全体の内容及び開示とともに、本明細書の開示内容の一部を形成する添付の配列表に開示されている。
本出願で使用される重要な用語の一般的な定義
本明細書で使用される「II型コラーゲンαI鎖」又は「II型コラーゲン」という用語は、uniprotアクセッション番号P02458.2、アミノ酸182~1241(配列番号51)を意味する。「II型コラーゲン」という用語は、配列番号51と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%若しくは97%以上、又は100%の配列同一性を示し、II型コラーゲンの機能性(functionality)を有するすべてのポリペプチドを含む。特に、この用語は、配列番号51と少なくとも少なくとも80%、85%、90%、95%、96%若しくは97%以上、又は100%のアミノ酸配列同一性をもつ他の哺乳類種由来のII型コラーゲンを含む。uniprotアクセッション番号P02458.2の下で特定されるII型コラーゲンへの参照に従って、好ましい実施形態では好ましい実施形態では、本明細書で使用される「II型コラーゲン」という用語はヒトII型コラーゲンを意味する。
本明細書で使用される「II型コラーゲンαI鎖」又は「II型コラーゲン」という用語は、uniprotアクセッション番号P02458.2、アミノ酸182~1241(配列番号51)を意味する。「II型コラーゲン」という用語は、配列番号51と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%若しくは97%以上、又は100%の配列同一性を示し、II型コラーゲンの機能性(functionality)を有するすべてのポリペプチドを含む。特に、この用語は、配列番号51と少なくとも少なくとも80%、85%、90%、95%、96%若しくは97%以上、又は100%のアミノ酸配列同一性をもつ他の哺乳類種由来のII型コラーゲンを含む。uniprotアクセッション番号P02458.2の下で特定されるII型コラーゲンへの参照に従って、好ましい実施形態では好ましい実施形態では、本明細書で使用される「II型コラーゲン」という用語はヒトII型コラーゲンを意味する。
「II型コラーゲン結合タンパク質」又は「II型コラーゲンに対する結合タンパク質」又は「Col2 BP」という用語は、高い親和性でII型コラーゲンに結合するタンパク質を意味する。
「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合で連結された2つ以上のアミノ酸の任意の鎖を意味し、生成物の特定の長さを意味しない。したがって、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は2つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の任意の用語は、「タンパク質」の定義内に含まれ、「タンパク質」という用語はこれらの用語のいずれかの代わりに、又は交換可能に使用することができる。また、「タンパク質」という用語は、当技術分野で周知のポリペプチドの翻訳後修飾の生成物を意味することを意図する。
「改変」又は「アミノ酸改変」という用語は、親ポリペプチド配列の特定の位置における、他のアミノ酸による参照アミノ酸の置換、欠失、又は挿入を意味する。既知の遺伝暗号並びに組換えDNA技術及び合成DNA技術があれば、熟練した科学者(the skilled scientist)はアミノ酸バリアントをコードするDNAを容易に構築することができる。
「結合親和性」及び「結合活性」という用語は、本明細書において交換可能に使用することができ、これらは、ポリペプチドが別のタンパク質、ペプチド、又はそれらの断片若しくはドメインに結合する能力を意味する。典型的には、結合親和性は、平衡解離定数(KD)で測定及び報告され、二分子間相互作用の強さを評価及び順序付けするために使用される。
「融合タンパク質」という用語は、少なくとも第2のタンパク質に遺伝子工学的に(genetically)連結された少なくとも第1のタンパク質を含むタンパク質に関する。融合タンパク質は、もともと別々のタンパク質をコードしていた2つ以上の遺伝子をつなげることによって作り出される。融合タンパク質は、限定されないが、例えば、多量体化部位、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー、半減期延長部位など、標的との結合に関与しない追加のドメインをさらに含みうる。
「アミノ酸配列同一性」という用語は、2つ以上のタンパク質のアミノ酸配列の同一性(又は違い)を定量的に比較したものを意味する。参照ポリペプチド配列に対する「パーセント(%)のアミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大のパーセントの配列同一性を達成した後、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である配列中のアミノ酸残基のパーセント割合と定義される。配列同一性を決定するために、クエリータンパク質の配列は、参照タンパク質又はポリペプチドの配列、例えば、配列番号1~44のいずれかのポリペプチドにアライメントされる。配列アライメントの方法及び配列比較アルゴリズムは、当該技術分野で周知である。例えば、任意のポリペプチドの、例えば配列番号1~44のいずれかのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性の程度を決定するために、当該技術分野で公知のSIM Local類似度プログラム(similarity program)が好ましく採用される。マルチプルアライメント解析には、当業者に公知のClustal Omegaを使用することが好ましい。
この発明の実施の形態の詳細な説明
本明細書で画定されるII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~44の群から選択されるいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む。特に、本明細書で提供されるのは、配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むII型コラーゲン結合タンパク質であり、そのII型コラーゲン結合タンパク質は、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;且つそのII型コラーゲン結合タンパク質は、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する。様々な好ましい実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも85%又は89.5%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、そのII型コラーゲン結合タンパク質は、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;そのII型コラーゲン結合タンパク質は、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する。様々な他の好ましい実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも91%、92%、93%、94%、又は95%の配列同一性のいずれか、より好ましくは少なくとも96%、97%、98%、又は99%の配列同一性のいずれかをもつアミノ酸配列を含み、そのII型コラーゲン結合タンパク質は、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;II型コラーゲン結合タンパク質は、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する。そのようなII型コラーゲン結合タンパク質は、II型コラーゲンに対して特異的な結合親和性を示し、すなわち、図2に示されるように、I型コラーゲン、III型コラーゲン、V型コラーゲン又はフィブロネクチンのドメイン(67B89)への非特異的な結合は検出されなかった。様々な実施形態では、本開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書の他の箇所に記載の結合親和性を測定するための方法で測定して、I型コラーゲン、及び/又はIII型コラーゲン、及び/又はV型コラーゲン及び/又はフィブロネクチンのドメイン(67B89)に対して検出可能な結合親和性を有しない。好ましい実施形態では、I型コラーゲン、及び/又はIII型コラーゲン、及び/又はV型コラーゲン及び/又はフィブロネクチンのドメイン(67B89)に対する結合親和性を測定するための方法は、ELISA、SPR、BLI、KinExAアッセイ、フローサイトメトリー、蛍光分光法、ITC、超遠心分析、RIA又はIRMA、及びECLのいずれか、より好ましくはELISA、SPR、BLI、KinExAアッセイ、及びフローサイトメトリーのいずれか、さらに(even)より好ましくはELISA、SPR、及びKinExAアッセイのいずれか、さらに(still)より好ましくはELISA又はSPR、最も好ましくはELISAである。様々な実施形態では、本開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、I型コラーゲン及び/又はIII型コラーゲンに対して検出可能な結合親和性を有しない。様々な他の実施形態では、本開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、I型コラーゲン及びIII型コラーゲン、及び/又はV型コラーゲンに対して検出可能な結合親和性を有しない。様々な好ましい実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、そのII型コラーゲン結合タンパク質は、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;II型コラーゲンに対して1μM未満、より好ましくは500nM未満の結合親和性(KD)を有する。他の実施形態では、上記のII型コラーゲン結合タンパク質は、II型コラーゲンに対して200nM未満、又は100nM未満、さらには50nM未満の結合親和性(KD)を有する。
本明細書で画定されるII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~44の群から選択されるいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む。特に、本明細書で提供されるのは、配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むII型コラーゲン結合タンパク質であり、そのII型コラーゲン結合タンパク質は、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;且つそのII型コラーゲン結合タンパク質は、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する。様々な好ましい実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも85%又は89.5%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、そのII型コラーゲン結合タンパク質は、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;そのII型コラーゲン結合タンパク質は、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する。様々な他の好ましい実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも91%、92%、93%、94%、又は95%の配列同一性のいずれか、より好ましくは少なくとも96%、97%、98%、又は99%の配列同一性のいずれかをもつアミノ酸配列を含み、そのII型コラーゲン結合タンパク質は、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;II型コラーゲン結合タンパク質は、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する。そのようなII型コラーゲン結合タンパク質は、II型コラーゲンに対して特異的な結合親和性を示し、すなわち、図2に示されるように、I型コラーゲン、III型コラーゲン、V型コラーゲン又はフィブロネクチンのドメイン(67B89)への非特異的な結合は検出されなかった。様々な実施形態では、本開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書の他の箇所に記載の結合親和性を測定するための方法で測定して、I型コラーゲン、及び/又はIII型コラーゲン、及び/又はV型コラーゲン及び/又はフィブロネクチンのドメイン(67B89)に対して検出可能な結合親和性を有しない。好ましい実施形態では、I型コラーゲン、及び/又はIII型コラーゲン、及び/又はV型コラーゲン及び/又はフィブロネクチンのドメイン(67B89)に対する結合親和性を測定するための方法は、ELISA、SPR、BLI、KinExAアッセイ、フローサイトメトリー、蛍光分光法、ITC、超遠心分析、RIA又はIRMA、及びECLのいずれか、より好ましくはELISA、SPR、BLI、KinExAアッセイ、及びフローサイトメトリーのいずれか、さらに(even)より好ましくはELISA、SPR、及びKinExAアッセイのいずれか、さらに(still)より好ましくはELISA又はSPR、最も好ましくはELISAである。様々な実施形態では、本開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、I型コラーゲン及び/又はIII型コラーゲンに対して検出可能な結合親和性を有しない。様々な他の実施形態では、本開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、I型コラーゲン及びIII型コラーゲン、及び/又はV型コラーゲンに対して検出可能な結合親和性を有しない。様々な好ましい実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、そのII型コラーゲン結合タンパク質は、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;II型コラーゲンに対して1μM未満、より好ましくは500nM未満の結合親和性(KD)を有する。他の実施形態では、上記のII型コラーゲン結合タンパク質は、II型コラーゲンに対して200nM未満、又は100nM未満、さらには50nM未満の結合親和性(KD)を有する。
様々な実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、
IAAKFDEAQX10AADX14EILHLPNLTEQQRX28YFRX32WLX35DDPSVSX42X43X44LX46X47AQX50LNDX54QAPK(配列番号52)(式中、互いに個別に(individually of each other)、X10はS及びQから選択され、X14はS及びKから選択され、X28はH及びNから選択され、X32はR及びQから選択され、X35はS及びRから選択され、X42はT及びPから選択され、X43はH及びTから選択され、X44はI及びVから選択され、X46はT及びGから選択され、X47はQ及びTから選択され、X50はH及びQから選択され、且つX54はS及びDから選択される)
と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、互いに個別に、25番目がQであり、29番目がYであり、33番目がWである配列番号52と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。
IAAKFDEAQX10AADX14EILHLPNLTEQQRX28YFRX32WLX35DDPSVSX42X43X44LX46X47AQX50LNDX54QAPK(配列番号52)(式中、互いに個別に(individually of each other)、X10はS及びQから選択され、X14はS及びKから選択され、X28はH及びNから選択され、X32はR及びQから選択され、X35はS及びRから選択され、X42はT及びPから選択され、X43はH及びTから選択され、X44はI及びVから選択され、X46はT及びGから選択され、X47はQ及びTから選択され、X50はH及びQから選択され、且つX54はS及びDから選択される)
と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、互いに個別に、25番目がQであり、29番目がYであり、33番目がWである配列番号52と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。
様々な実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、
IAAKFDEAQX10AADX14EILHLPNLTEQQRX28YFRX32WLX35DDPSVSX42X43X44LX46X47AQX50LNDX54QAPK(配列番号52)(式中、X10はS及びQから選択され、X14はS及びKから選択され、X28はH及びNから選択され、X32はR及びQから選択され、X35はS及びRから選択され、X42はT及びPから選択され、X43はH及びTから選択され、X44はI及びVから選択され、X46はT及びGから選択され、X47はQ及びTから選択され、X50はH及びQから選択され、且つX54はS及びDから選択される)
と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、25番目がQであり、29番目がYであり、33番目がWである配列番号52と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。
IAAKFDEAQX10AADX14EILHLPNLTEQQRX28YFRX32WLX35DDPSVSX42X43X44LX46X47AQX50LNDX54QAPK(配列番号52)(式中、X10はS及びQから選択され、X14はS及びKから選択され、X28はH及びNから選択され、X32はR及びQから選択され、X35はS及びRから選択され、X42はT及びPから選択され、X43はH及びTから選択され、X44はI及びVから選択され、X46はT及びGから選択され、X47はQ及びTから選択され、X50はH及びQから選択され、且つX54はS及びDから選択される)
と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、25番目がQであり、29番目がYであり、33番目がWである配列番号52と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。
様々な実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、
IAAKFDEAQSAADSEILHLPNLTEQQRHYFRRWLSDDPSVSTHILTQAQHLNDDQAPK(配列番号2、CID211261)
と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。
IAAKFDEAQSAADSEILHLPNLTEQQRHYFRRWLSDDPSVSTHILTQAQHLNDDQAPK(配列番号2、CID211261)
と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。
本明細書に開示の本発明のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の本発明のII型コラーゲン結合タンパク質は、25番目がQであり、29番目がYであり、且つ33番目がWである配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。
様々な実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号15、CID211519delFcと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。本明細書に開示の本発明のII型コラーゲン結合タンパク質は、
配列番号15のIAAKFDEAQQAADKEILHLPNLTEQQRNYFRQWLRDDPSVSPTVLGTAQQLNDSQAPK
のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の本発明のII型コラーゲン結合タンパク質は、25番目がQであり、29番目がYであり、且つ33番目がWであることを条件として、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。
配列番号15のIAAKFDEAQQAADKEILHLPNLTEQQRNYFRQWLRDDPSVSPTVLGTAQQLNDSQAPK
のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の本発明のII型コラーゲン結合タンパク質は、25番目がQであり、29番目がYであり、且つ33番目がWであることを条件として、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。
機能的な特徴。1つの実施形態は、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)をもつII型コラーゲン結合タンパク質に言及する。II型コラーゲン結合タンパク質は、1μM未満、500nM未満、200nM未満、100nM未満、又は50nM未満の測定可能な結合親和性でII型コラーゲンに結合する。適切な方法は、当業者に公知である、又は文献に記述されている。結合親和性を測定するための方法はそれ自体知られており、例えば、当該技術分野で公知の以下の方法から選択することができる:酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、表面プラズモン共鳴(SPR)、バイオレイヤー干渉法(BLI)、動力学排除分析(KinExAアッセイ)、フローサイトメトリー、蛍光分光法、等温滴定熱量測定(ITC)、超遠心分析、放射免疫測定法(RIA又はIRMA)、及び増強化学発光(ECL)。該方法の一部は後述の実施例で説明される。典型的には、解離定数KDは、20℃、25℃、又は30℃で測定される。別段の具体的に指示のない限り、本明細書に記載のKD値はSPRで25℃にて測定される。KD値が低いほど、生体分子の結合相手に対する結合親和性が大きい。KD値が高いほど、結合相手は互いに弱く結合する。
II型コラーゲン結合タンパク質の構造的特徴
様々な実施形態では、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~44のいずれか1つアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有する。本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~44のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、又は89%の配列同一性を有する。
様々な実施形態では、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~44のいずれか1つアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有する。本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~44のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、又は89%の配列同一性を有する。
本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~44のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。
様々な実施形態では、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1(CID211190)のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するタンパク質を含んでいる、又はそれからなる。様々な実施形態では、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号2(CID211261)のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するタンパク質を含んでいる、又はそれからなる。様々な実施形態では、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号20(CID210970)のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するタンパク質を含んでいる、又はそれからなる。様々な実施形態では、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号15(CID211519delFc)のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するタンパク質を含んでいる、又はそれからなる。本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~44のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号5のアミノ酸配列:
IAAKFDEAQQLAFYQILHLENLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSX42EVLGEAX49KLNX53SQAPK(式中、Xはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、X42はL及びA及びTから選択され、X49はI、R、及びEから選択され、X53はL、K、及びYから選択される)
と少なくとも80%の同一性をもつアミノ酸配列を含む。具体的な例が、配列番号6、7、8、又は配列番号32、33、36の二量体に示されている。
IAAKFDEAQQLAFYQILHLENLTEEQRNAFIQSLRDDPSVSX42EVLGEAX49KLNX53SQAPK(式中、Xはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、X42はL及びA及びTから選択され、X49はI、R、及びEから選択され、X53はL、K、及びYから選択される)
と少なくとも80%の同一性をもつアミノ酸配列を含む。具体的な例が、配列番号6、7、8、又は配列番号32、33、36の二量体に示されている。
いくつかの実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号9のアミノ酸配列:
IAAKFDEAQQAAFYEILHLPNLTEQQRNYFIQWLRDDPSVSX42X43VLGX47AQX50LNDSQAPK(式中、Xはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、X42はL及びPから選択され、X43はE及びTから選択され、X47はH及びTから選択され、X50はQ、L、及びRから選択される)
と少なくとも80%の同一性をもつアミノ酸配列を含む。具体的な例が、配列番号10~12、25、又は配列番号27、32~37の二量体に示されている。
IAAKFDEAQQAAFYEILHLPNLTEQQRNYFIQWLRDDPSVSX42X43VLGX47AQX50LNDSQAPK(式中、Xはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、X42はL及びPから選択され、X43はE及びTから選択され、X47はH及びTから選択され、X50はQ、L、及びRから選択される)
と少なくとも80%の同一性をもつアミノ酸配列を含む。具体的な例が、配列番号10~12、25、又は配列番号27、32~37の二量体に示されている。
いくつかの実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号13のアミノ酸配列:
IAAKFDEAQQAAFYEILHLPNLTEQQRNYFIQWLRDDPSVSX42X43VLGX47AQX50LNDSQAPK(式中、Xはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、X42はL及びPから選択され、X43はE及びTから選択され、X47はH及びTから選択され、X50はQ、L、及びRから選択される)
と少なくとも80%の同一性をもつアミノ酸配列を含む。具体的な例が、配列番号14、15、23、配列番号28、29、30、31、30の二量体、及び配列番号42の四量体に示されている。
IAAKFDEAQQAAFYEILHLPNLTEQQRNYFIQWLRDDPSVSX42X43VLGX47AQX50LNDSQAPK(式中、Xはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、X42はL及びPから選択され、X43はE及びTから選択され、X47はH及びTから選択され、X50はQ、L、及びRから選択される)
と少なくとも80%の同一性をもつアミノ酸配列を含む。具体的な例が、配列番号14、15、23、配列番号28、29、30、31、30の二量体、及び配列番号42の四量体に示されている。
いくつかの実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号16のアミノ酸配列:
IAAKFDEAQWAAX13LEIVHLPNLTEEQRLX29FX31YSLRDDPSVSLEVLGEAQKLNDSQAPK(式中、Xはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、X13はD及びFから選択され、X29はK及びAから選択され、X31はR及びIから選択される)
と少なくとも80%の同一性をもつアミノ酸配列を含んでいる。具体的な例が、配列番号17~21、又は配列番号28、29、30、31、35の二量体に示されている。
IAAKFDEAQWAAX13LEIVHLPNLTEEQRLX29FX31YSLRDDPSVSLEVLGEAQKLNDSQAPK(式中、Xはいずれのアミノ酸であってもよく、好ましくは、X13はD及びFから選択され、X29はK及びAから選択され、X31はR及びIから選択される)
と少なくとも80%の同一性をもつアミノ酸配列を含んでいる。具体的な例が、配列番号17~21、又は配列番号28、29、30、31、35の二量体に示されている。
いくつかの実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号43のアミノ酸配列:
NAAXXDXAQXSAXXEIXXLPNLTTRQKQKFIYSLQRDPSVSKEVLGEAQKLNDSQAPK
と少なくとも80%の同一性をもつアミノ酸配列を含んでいる。具体的な例が配列番号1及び26に示されている。
NAAXXDXAQXSAXXEIXXLPNLTTRQKQKFIYSLQRDPSVSKEVLGEAQKLNDSQAPK
と少なくとも80%の同一性をもつアミノ酸配列を含んでいる。具体的な例が配列番号1及び26に示されている。
いくつかの実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号44のアミノ酸配列:
IAAKFDEAQSAADSEILHLPNLTEQQRHYFRRWLSDDPSVSXXXLXXAQXLNDXQAPK
と少なくとも80%の同一性をもつアミノ酸配列を含んでいる。具体的な例が、配列番号2、24、配列番号38、39の二量体、及び配列番号41の四量体に示されている。
IAAKFDEAQSAADSEILHLPNLTEQQRHYFRRWLSDDPSVSXXXLXXAQXLNDXQAPK
と少なくとも80%の同一性をもつアミノ酸配列を含んでいる。具体的な例が、配列番号2、24、配列番号38、39の二量体、及び配列番号41の四量体に示されている。
本発明の様々な実施形態では、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~44のいずれかのN末端において、1つ又は複数、好ましくは2つのアミノ酸残基の欠失を有しうる。本発明の様々な実施形態では、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号22~26で例示される配列番号1~26、43、及び44の単量体配列のいずれかのN末端において、1つ又は複数、好ましくは2つのアミノ酸残基の欠失を有しうる。本明細書に開示の二量体及び多量体II型コラーゲン結合タンパク質の好ましい実施形態では、二量体又は多量体のN末端に位置する単量体のみ、その単量体のN末端において1つ又は複数、好ましくは2つのアミノ酸残基の欠失を有しうる。本発明の様々な実施形態では、本明細書に開示の単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~26、43及び44のいずれかの少なくとも47個のアミノ酸残基を含む。本発明の様々な他の実施形態では、本明細書に開示の単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~26、43及び44のいずれかの少なくとも48又は49個のアミノ酸残基を含む。本発明のさらに他の実施形態では、本明細書に開示の単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~26、43及び44のいずれかの少なくとも50又は51個のアミノ酸残基を含む。本発明の様々な好ましい実施形態では、本明細書に開示の単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~26、43及び44のいずれかの少なくとも52個のアミノ酸残基を含む。本発明の様々な他の好ましい実施形態では、本明細書に開示の単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~26、43及び44のいずれかの少なくとも53個のアミノ酸残基を含む。より好ましくは、本明細書に開示の単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~26、43及び44のいずれかの少なくとも54又は55個のアミノ酸残基を含む。本発明の特に好ましい実施形態では、本明細書に開示の単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~26、43及び44のいずれかの少なくとも56個のアミノ酸残基を含む。本発明の様々な好ましい実施形態では、本明細書に開示の単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~26、43及び44のいずれかの少なくとも57個又はさらには58個のアミノ酸残基を含む。
本発明の様々な実施形態では、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号22~26で例示される配列番号1~26、43、及び44の単量体配列のいずれかのN末端において、1つ又は複数、好ましくは2つのアミノ酸残基の欠失を有しうる。本明細書に開示の二量体及び多量体II型コラーゲン結合タンパク質の好ましい実施形態では、二量体又は多量体のN末端に位置する単量体のみが、1つ又は複数、好ましくは2つのアミノ酸残基の欠失を有しうる。
図1Cは、2つの単量体ドメインの少なくとも1つがモチーフ25Q-29Y-33Wを特徴とする、本発明の二量体II型コラーゲン結合タンパク質を例示している。したがって、様々な実施形態では、本発明の二量体又は多量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むII型コラーゲン結合タンパク質である少なくとも1つの単量体を含み、その単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有する。様々な好ましい実施形態では、本発明の二量体又は多量体II型コラーゲン結合タンパク質によって含まれる単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書の他の箇所に記載のように、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する。本発明の二量体又は多量体II型コラーゲン結合タンパク質によって含まれる単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、二量体又は多量体II型コラーゲン結合タンパク質のN末端に位置してもよく、又はC末端に位置してもよい。
本発明の多量体II型コラーゲン結合タンパク質は、1つ又は複数の、配列番号1~26、43及び44のいずれかと少なくとも80%の配列同一性単量体II型コラーゲン結合タンパク質を含むことができ、1つ又は複数の、配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつ単量体II型コラーゲン結合タンパク質を含むことができ、その単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;その単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書の他の箇所に記載のように、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する。
本発明の多量体II型コラーゲン結合タンパク質によって含まれる単量体II型コラーゲン結合タンパク質は、多量体II型コラーゲン結合タンパク質のN末端又はC末端に位置してもよく、そこに位置しなくてもよい。
様々な実施形態では、本発明によって提供されるII型コラーゲンに対する結合タンパク質は、配列番号27~40の二量体のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、その2つの単量体の少なくとも1つは、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;本明細書の他の箇所に記載のように、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有するII型コラーゲン結合タンパク質である。その少なくとも1つの単量体は、配列番号27~40のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつ二量体II型コラーゲン結合タンパク質のN末端又はC末端のいずれかに位置しうる。様々な好ましい実施形態では、二量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号27~40のいずれか1つと少なくとも85%又は89.5%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、その2つの単量体の少なくとも1つは、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;本明細書の他の箇所に記載のように、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有するII型コラーゲン結合タンパク質である。さらに他の好ましい実施形態では、二量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号27~40のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも91%、92%、93%、94%、又は95%の配列同一性のいずれか、より好ましくは少なくとも96%、97%、98%、又は99%の配列同一性のいずれかをもつアミノ酸配列を含み、その2つの単量体の少なくとも1つは、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;本明細書の他の箇所に記載のように、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有するII型コラーゲン結合タンパク質である。
様々な実施形態では、本発明によって提供されるII型コラーゲンに対する結合タンパク質は、配列番号41又は42の四量体と少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、その4つの単量体の1つ、2つ、3つ、又はすべては、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;本明細書の他の箇所に記載のように、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有するII型コラーゲン結合タンパク質である。最大4つの単量体のうちの1つは、配列番号41又は42と少なくとも80%の配列同一性をもつ四量体II型コラーゲン結合タンパク質のN末端又はC末端のいずれかに位置しうる。様々な好ましい実施形態では、四量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号41又は42と少なくとも85%又は89.5%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、その4つの単量体の1つ、2つ、3つ、又はすべては、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;本明細書の他の箇所に記載のように、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有するII型コラーゲン結合タンパク質である。さらに他の好ましい実施形態では、四量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号41又は42と少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも91%、92%、93%、94%、又は95%の配列同一性のいずれか、より好ましくは少なくとも96%、97%、98%、又は99%の配列同一性のいずれかをもつアミノ酸配列を含み、その4つの単量体の1つ、2つ、3つ、又はすべては、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;本明細書の他の箇所に記載のように、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有するII型コラーゲン結合タンパク質である。
本明細書でさらに開示されるように、様々な実施形態では、本発明の二量体又は多量体II型コラーゲン結合タンパク質は、二量体又は多量体II型コラーゲン結合タンパク質によって含まれる単量体II型コラーゲン結合タンパク質を連結する1つ又は複数のリンカー配列を含むことができる。様々な実施形態では、リンカー配列はアミノ酸配列GGGS(配列番号45)を含む。様々な他の実施形態では、リンカー配列はアミノ酸配列GGGGS(配列番号46)を含む。さらに他の実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号47)を含む、又はアミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号48)を含む。
本発明はさらに、免疫グロブリンのFcドメインに対する検出可能な結合親和性をもたない(免疫グロブリンのFcドメインに対する結合親和性を欠く)II型コラーゲンに対する結合タンパク質を提供し、そのII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~44のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインに対する検出可能な結合親和性をもたないII型コラーゲンに対する結合タンパク質を提供し、そのII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、そのII型コラーゲン結合タンパク質は、(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;本明細書の他の箇所に記載のように、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する。免疫グロブリンのFcドメインに対する検出可能な結合親和性をもたない本発明のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号1~21のいずれかの以下のアミノ酸残基の1つ又は複数、好ましくは2又は3つを含む:配列番号1~21のいずれかの13番目に対応する位置のアスパラギン酸(D)(13D);配列番号1~21のいずれかの14番目に対応する位置のリジン(K)(14K);及び/又は配列番号1~21のいずれかの31番目に対応する位置のアルギニン(R)(31R)。好ましい実施形態では、免疫グロブリンのFcドメインに対する検出可能な結合親和性をもたない本発明のII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの以下のアミノ酸残基の1つ又は複数、好ましくは2又は3つを含む:配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかんの13番目に対応する位置のアスパラギン酸(D)(13D);配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれか14番目に対応する位置のリジン(K)(14K);及び/又は配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの31番目に対応する位置のアルギニン(R)(31R)。特に好ましいのは、配列番号15の以下のアミノ酸残基の1つ又は複数、好ましくは2又は3つを含む免疫グロブリンのFcドメインに対する検出可能な結合親和性をもたないII型コラーゲン結合タンパク質である:配列番号15のいずれかの13番目に対応する位置のアスパラギン酸(D)(13D);配列番号15の14番目に対応する位置のリジン(K)(14K);及び/又は配列番号15の31番目に対応する位置のアルギニン(R)(31R)。したがって、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインに対する検出可能な結合親和性をもたないII型コラーゲンに対する結合タンパク質を提供し、そのII型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号15と少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、配列番号15の以下のアミノ酸残基の1つ又は複数、好ましくは2又は3つを含む:配列番号15のいずれかの13番目に対応する位置のアスパラギン酸(D)(13D);配列番号15の14番目に対応する位置のリジン(K)(14K);及び/又は配列番号15の31番目に対応する位置のアルギニン(R)(31R)。様々な好ましい実施形態では、免疫グロブリンのFcドメインに対する検出可能な結合親和性をもたないII型コラーゲン結合タンパク質は、(i)配列番号15の25番目に対応する位置のグルタミン(Q);(ii)配列番号15の29番目に対応する位置のチロシン(Y);及び(iii)配列番号15の33番目に対応する位置のトリプトファン(W)をさらに含み;本明細書の他の箇所に記載のように、II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する。
本発明の様々な実施形態では、免疫グロブリンのFcドメインに対する検出可能な結合親和性をもたない(又は免疫グロブリンのFcドメインに対する結合親和性を欠く)II型コラーゲンに対する結合タンパク質は、本明細書の他の箇所に記載の結合親和性を測定するための方法で測定して、免疫グロブリンのFcドメインに対する検出可能な結合親和性を有しない(又は免疫グロブリンのFcドメインに対する結合親和性を欠く)。好ましい実施形態では、免疫グロブリンのFcドメインに対する結合親和性を測定するための方法は、ELISA、SPR、BLI、KinExAアッセイ、フローサイトメトリー、蛍光分光法、ITC、超遠心分析、RIA又はIRMA、及びECLのいずれか、より好ましくはELISA、SPR、BLI、KinExAアッセイ、及びフローサイトメトリーのいずれか、さらに(even)より好ましくはELISA、SPR、及びKinExAアッセイのいずれか、さらに(still)より好ましくはELISA又はSPR、最も好ましくはSPRである。
「Fc領域」及び「Fcドメイン」という用語は、本明細書において交換可能に使用することができる。Fc領域は、例えばFc受容体と呼ばれる細胞表面の受容体と相互作用する免疫グロブリン、特に抗体の尾部領域である。したがって、Fc領域又はFcドメインは、免疫グロブリン、特に抗体のFc領域又はFcドメインを意味する。様々な実施形態では、Fc領域は、ヒトIgG、マウスIgG、ラットIgG、ヤギIgG、ウシIgG、モルモットIgG、及びウサギIgGを含む哺乳類IgG(抗体)に由来する。Fc領域はまた、ヒトIgM又はヒトIgA由来であることができる。様々な実施形態では、Fc領域は、ヒトIgG1(抗体)、ヒトIgG2(抗体)、又はヒトIgG4(抗体)由来など、ヒトIgG(抗体)に由来し、さらにより好ましくはヒトIgG1(抗体)に由来する。
Avimer(商標)ドメインは、特にジスルフィド結合によって安定化された剛直な構造を有する30~35個のアミノ酸の人工タンパク質である。本発明の様々な実施形態では、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質においてジスルフィド結合を生じさせるアミノ酸配列を有してもよく、有しなくてもよい。したがって、本発明の様々な実施形態において、本明細書に開示されるII型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質においてジスルフィド結合を生じさせることになるシステイン(Cys)残基を含むアミノ酸配列を有してもよく、有しなくてもよい。より具体的には、本発明の様々な実施形態では、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質において1つ又は複数のジスルフィド結合を生じさせることになる2つ以上のシステイン(Cys)残基を含むアミノ酸配列を有してもよく、有しなくてもよい。様々な実施形態では、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質は、システイン(Cys)残基(単数又は複数)を含まないアミノ酸配列を有してもよく、有しなくてもよい。
多量体。好ましい実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、複数の本明細書で画定されるII型コラーゲン結合タンパク質を含む多量体である。多量体は、2つ、3つ、4つ、又はより多くのII型コラーゲン結合タンパク質を含みうる。1つの実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、互いに連結した2つ、3つ、4つ、又はより多くのII型コラーゲン結合タンパク質を含む、すなわち、II型コラーゲン結合タンパク質は、二量体、三量体、又は四量体などであることができる。いくつかの実施形態では、多量体は、上記で画定されたII型コラーゲン結合タンパク質の二量体である。
様々な実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質はホモ-二量体である。ホモ-二量体II型コラーゲン結合タンパク質は、同一のアミノ酸配列をもつ2つのII型コラーゲン結合タンパク質が互いに連結したタンパク質である。いくつかの実施形態では、ホモ多量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号11の少なくとも2つのモジュール(module)を含むことができ、配列番号37(211519)のアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ホモ多量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号15の少なくとも2つのモジュールを含むことができ、配列番号40(212705)のアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する。例えば、ホモ-二量体II型コラーゲン結合タンパク質は、ヘッドトゥーテールの方向(head-to-tail orientation)で互いに連結した2つの配列番号15の単量体を含むことができる。いくつかの実施形態では、ホモ多量体II型コラーゲン結合タンパク質は、配列番号2の少なくとも2つのモジュールを含むことができ、配列番号38(211999)のアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する。例えば、ホモ-二量体II型コラーゲン結合タンパク質は、ヘッドトゥーテールの方向で互いに連結した2つの配列番号2の単量体を含むことができる。いくつかの実施形態では、ホモ多量体II型コラーゲン結合タンパク質は、少なくとも2つの配列番号1のモジュールを含むことができる。例えば、ホモ-二量体II型コラーゲン結合タンパク質は、ヘッドトゥーテールの方向で互いに連結した2つの配列番号1(211190)の単量体を含むことができる。
様々な実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質はホモ-四量体である。四量体II型コラーゲン結合タンパク質は、同一のアミノ酸配列をもつ4つのII型コラーゲン結合タンパク質が互いに連結したタンパク質である(例えば、限定されないが、配列番号41及び配列番号42を参照)。
他の実施形態では、多量体はヘテロ-二量体であり、例えば、II型コラーゲンに特異的なタンパク質の2つのアミノ酸配列は、異なるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ヘテロ-二量体II型コラーゲン結合タンパク質は配列番号10を含むことができ、配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する(例えば、配列番号36(210987)、配列番号32(210992)、又は配列番号33(211027)のヘテロ二量体のN末端単量体)。
いくつかの実施形態では、ヘテロ-二量体結合タンパク質は配列番号14を含むことができ、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する(例えば、配列番号28(210970)、配列番号29(210971)のヘテロ二量体のN末端単量体、又は配列番号30(210972)若しくは配列番号31(210973)のヘテロ二量体のC末端単量体)。
例えば、配列番号27(209130)のヘテロ-二量体結合タンパク質は、ヘッドトゥーテール(N末端からC末端)の方向で互いに連結した配列番号4及び配列番号11を含む。例えば、配列番号35(208585)のヘテロ-二量体結合タンパク質は、ヘッドトゥーテール(N末端からC末端)の方向で互いに連結した配列番号17及び配列番号12を含む。例えば、配列番号36(210987)のヘテロ-二量体結合タンパク質は、ヘッドトゥーテール(N末端からC末端)の方向で互いに連結した配列番号10及び配列番号6を含む。二量体II型コラーゲン結合タンパク質の例を図1Cに示す。
いくつかの実施形態では、2つ以上のII型コラーゲン結合タンパク質は直接連結している。いくつかの実施形態では、2つ以上のII型コラーゲン結合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して連結している。様々な実施形態では、2つ以上のII型コラーゲン結合タンパク質は、最大30個のアミノ酸のペプチドリンカーを介して連結している。他の実施形態では、2つ以上のII型コラーゲン結合タンパク質は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個のアミノ酸のペプチドリンカーを介して連結している。リンカーの例を配列番号45~48に示す。
結合タンパク質の多量体は、一般に当業者に周知の組換えDNA技術によって人工的に生成される。
II型コラーゲン結合タンパク質は、さらなる部分に融合される。様々な実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、治療上有効な部分に融合又は結合される。他の実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、1つより多くの治療上有効な部分に融合又は結合される。いくつかの実施形態では、そのような治療上有効な部分は、モノクローナル抗体及びその断片、受容体の細胞外ドメイン及びその断片、非免疫グロブリンスキャフォールドタンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性化合物、酵素、並びにそれらの誘導体、放射性核種、並びに上記の任意の組み合わせから選択することができる。
様々な実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、診断用部分に融合又は結合される。他の実施形態では、II型コラーゲン結合タンパク質は、1つより多くの診断用部分に融合又は結合される。いくつかの実施形態では、そのような診断用部分は、放射性核種、蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、及び非免疫グロブリンスキャフォールドタンパク質、並びに上記の任意の組み合わせから選択することができる。
様々な実施形態は、治療上有効なタンパク質又は診療上有効なタンパク質に融合されたII型コラーゲン結合タンパク質に関する。
医学における使用。様々な実施形態は、医学に使用するための本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質に関する。特定の実施形態は、眼疾患及び関節疾患の診断又は治療に使用するための前記II型コラーゲン結合タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、眼疾患は血管新生眼疾患でありうる。血管新生眼疾患は、限定されないが、血管新生を伴う加齢黄斑変性、近視性脈絡膜血管新生、特発性脈絡膜血管新生、脈絡膜血管新生、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、糖尿病黄斑浮腫の群から選択されうる。いくつかの実施形態では、眼疾患は炎症性眼疾患でありうる。炎症性眼疾患は、限定されないが、非感染性後部ぶどう膜炎、非感染性中間ぶどう膜炎、非感染性前部ぶどう膜炎、特発性ぶどう膜炎、非感染性汎ぶどう膜炎、ベーチェット、サルコイド、ループス、若年性特発性関節炎、関節リウマチ、ウェゲナー肉芽腫症などの原発性炎症性全身性疾患に合併するぶどう膜炎、強膜炎、及び眼窩炎症性疾患の群から選択されうる。関節関連疾患の例には、関節リウマチ、関節症、及び他の関節関連疾患がある。
組成物。様々な実施形態は、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質を含む組成物に関する。
様々な実施形態は、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質、並びに薬学的に許容可能な担体及び/又は希釈剤を含む、疾患の治療のための医薬組成物に関する。医薬組成物は、任意選択で、それ自体既知のさらなる補助剤及び賦形剤を含むことができる。それらには、例えば、安定化剤、界面活性剤、塩、緩衝剤、着色剤などが含まれるが、これらに限定されない。組成物は、液体製剤の形態、凍結乾燥物、クリーム、局所塗布用ローション、エアロゾル、粉末の形態、顆粒、乳剤の形態、又はリポソーム製剤の形態であることができる。
本明細書で画定されるII型コラーゲン結合タンパク質を含む医薬組成物は、上記のように、眼疾患及び関節疾患の治療のために使用することができる。
様々な実施形態は、本明細書で画定されるII型コラーゲン結合タンパク質並びに診断的上許容可能な担体及び/又は希釈剤を含む疾患の診断のための診断用組成物に関する。それらには、例えば、安定化剤、界面活性剤、塩、緩衝剤、着色剤などが含まれるが、これらに限定されない。組成物は、液体製剤の形態、凍結乾燥物、顆粒、エマルションの形態又はリポソーム製剤であることができる。
本明細書に記載のII型コラーゲン結合タンパク質を含む診断用組成物は、上記のように、眼疾患及び関節疾患の診断のために使用することができる。
組成物は、本明細書で画定されるII型コラーゲン結合タンパク質の治療上又は診断上有効な量を含有する。投与されるタンパク質の量は、治療される生物、疾患の種類、患者の年齢及び体重、さらにそれ自体が周知の要因に依存する。ガレノス製剤に応じて、これらの組成物は、注射又は点滴による非経口投与、全身投与、硝子体内投与、関節内投与、又は他の従来から採用されている適用方法によって投与することができる。医薬製剤の種類は、治療すべき疾患の種類、投与経路、疾患の重症度、治療を受ける患者、及び医学の当業者に公知の他の要因に依存する。
様々な実施形態は、対象の眼に、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質の治療有効量を投与することを含む、眼疾患をもつ対象を治療又は診断する方法に関する。好ましいのは、血管新生を伴う加齢黄斑変性(AMD)や、糖尿病黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症などの網膜血管新生疾患から選択される眼疾患をもつ対象を治療するための方法である。
II型コラーゲン結合タンパク質の調製。本明細書に記載のII型コラーゲン結合タンパク質は、平易な有機合成戦略、固相補助合成技術、フラグメントライゲーション技術、又は市販の自動合成装置などの多くの従来から周知の技術のいずれかによって調製することができる。一方、それらタンパク質は、従来の組換え技術単独で、又は従来の合成技術と組み合わせて調製することもできる。さらに、無細胞インビトロ転写/翻訳によって調製してもよく、通常の合成技術と組み合わせて調製してもよい。
様々な実施形態は、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記単離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
様々な実施形態は、前記II型コラーゲン結合タンパク質の発現を可能にする好適な条件下で宿主細胞を培養すること、及び任意選択で前記II型コラーゲン結合タンパク質を単離することを含む、本明細書に開示のII型コラーゲン結合タンパク質の作製方法に関する。
例えば、II型コラーゲン結合タンパク質をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを好適な宿主で発現させることができ、生成したII型コラーゲン結合タンパク質を単離することができる。前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、本明細書に包含される。さらなる実施形態は、前記核酸分子を含むベクターに関する。ベクターとは、宿主細胞にタンパク質コード情報を移すために使用できる任意の分子又は実体(例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス)を意味する。さらに、前記核酸分子又は前記ベクターを含む単離細胞が開示される。好適な宿主細胞には、原核生物又は真核生物が含まれる。また、様々な哺乳類細胞又は昆虫細胞の培養系を組換えタンパク質の発現に採用することもできる。
一実施形態はまた、前記ベクターを保有する宿主細胞又は非ヒト宿主に関する。宿主細胞は、核酸配列で形質転換され、それによって目的の遺伝子を発現する細胞である。
原核生物又は真核生物の宿主細胞を培養する好適な条件は、当業者に周知である。タンパク質の生産を目的とした細胞の培養及びタンパク質の発現は、当業者に周知の技術を適用して、小容量の振盪フラスコから大型の発酵槽まで、任意のスケールで行うことができる。
1つの実施形態は、上記で詳述した結合タンパク質の調製方法を対象とし、前記方法は以下のステップを含む:(a)本明細書で画定されるII型コラーゲン結合タンパク質をコードする核酸を調製すること;(b)前記核酸を発現ベクターに導入すること;(c)前記発現ベクターを宿主細胞に導入すること;(d)宿主細胞を培養すること;(e)宿主細胞をII型コラーゲン結合タンパク質が発現する培養条件に供し、それによって、本明細書で画定されるII型コラーゲン結合タンパク質を産生させること;(f)任意選択で、ステップ(e)で作られたII型コラーゲン結合タンパク質を単離すること;及び(g)任意選択で、II型コラーゲン結合タンパク質を、本明細書で画定されるさらなる機能部分と結合させること。
一般に、培養混合物からの精製II型コラーゲン結合タンパク質の単離は、遠心分離や、沈殿、凝集、クロマトグラフィーの異なる実施形態、濾過、透析、濃縮、それらの組み合わせなど、当該技術分野で周知の従来の方法及び技術を適用して行うことができる。クロマトグラフィーの方法は当該技術分野で周知であり、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー(サイズ排除クロマトグラフィー)、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーを含む。
精製を簡便にするために、II型コラーゲン結合タンパク質は、分離材料に対する増加した親和性を有する他のペプチド配列と融合させることができる。好ましくは、II型コラーゲン結合タンパク質の機能性に対して有害な影響を与えない、又は特異的なプロテアーゼ切断部位の導入により精製後に分離できるそのような融合体が選択される。このような方法も当業者に公知である。
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために示される。本発明は、上記のようにII型コラーゲン結合タンパク質によって特に例示される。しかし、本発明はそれに限定されず、以下の実施例は、上記の説明に基づいて本発明の実施可能性を示すに過ぎない。本発明の完全な開示のために、本出願で引用される文献も参照され、その文献は参照により本出願に完全に組み込まれる。
実施例1 II型コラーゲンαI鎖結合タンパク質の選択及びスクリーニング
ライブラリー。ランダムな位置でシステインや他のアミノ酸残基を同時に排除して、バランスの良い(well-balanced)アミノ酸分布を達成するように、合成トリヌクレオチドホスホラミダイト(ELLA Biotech)で生成したランダム化オリゴヌクレオチドを使って独自のcDNAライブラリーを自社内(in house)で合成した。対応するcDNAライブラリーをPCRで増幅し、pCD33-OmpAファージミドにライゲーションした。大腸菌SS320(Lucigen)のエレクトロポレーションに、ライゲーション混合物のアリコートを使用して、ファージライブラリーを作製及び精製し、その凍結ストックを保存した。別段の指示のない限り、確立された組換え遺伝学工学的方法を使用した。
ライブラリー。ランダムな位置でシステインや他のアミノ酸残基を同時に排除して、バランスの良い(well-balanced)アミノ酸分布を達成するように、合成トリヌクレオチドホスホラミダイト(ELLA Biotech)で生成したランダム化オリゴヌクレオチドを使って独自のcDNAライブラリーを自社内(in house)で合成した。対応するcDNAライブラリーをPCRで増幅し、pCD33-OmpAファージミドにライゲーションした。大腸菌SS320(Lucigen)のエレクトロポレーションに、ライゲーション混合物のアリコートを使用して、ファージライブラリーを作製及び精製し、その凍結ストックを保存した。別段の指示のない限り、確立された組換え遺伝学工学的方法を使用した。
ファージディスプレイによる選択。ファージディスプレイを選択系として用いて、それぞれのオンターゲット(ON-target)(免疫グレードヒトII型コラーゲン、Chondrex社より購入)に対してネイティブライブラリーを濃縮した。各ラウンドにおいて、オフターゲット(OFF-target)としてSigmablockerでブロックした空のビーズを用いた事前選択(pre-selection)ステップを行った。AIT法を適用した。これは各ラウンドで標的タンパク質を磁性Epoxy M-270 Dynabeadsに固定化したことを意味する。大腸菌ER2738(Lucigene)を、クライオファージライブラリーの感染及び各ラウンド後のファージプールの再増幅に使用した。ファージの増幅及び精製は、当業者に公知の標準的な方法を使用して実施した。自動化されたKingFisher-System(サーモフィッシャー)を用いて4回の選択ラウンドを行い、所望のファージ-ターゲット複合体を単離及び捕捉した。標的をカップリングさせたビーズの量を少なくすることによって、ラウンドごとに標的量を減らした。結合したファージをトリプシンで溶出し、再増幅した。選択の成功を、免疫グレードヒトII型コラーゲン(Chondrex社、5μg/ml)、ブタコラーゲンII型(ブタの目から自社内で調製、5μg/ml)、BSA(5μg/ml)又はSigmablockerをコートした中結合マイクロタイタープレート(Greiner Bio-One)でのファージプールELISAで分析した。結合したファージは、α-M13 HRP結合抗体(GEヘルスケア)を使用して検出した。
標的結合ファージプールの発現ベクターへのクローニング ファージプールELISAにおいてヒト及び/又はブタコラーゲンタイプII型に特異的な結合を示す選択プールを、当該技術分野で公知の方法に従ってPCRで増幅し、適切な制限ヌクレアーゼで切断し、C末端strep-タグを含む発現ベクターpET-28a(メルク、ドイツ)の誘導体にライゲーションした。
結果:様々なファージディスプレイ選択プールは、それぞれのオンターゲットに対して特異的なシグナルをもたらした。BSA及びSigmablockerを用いた対照は、ほとんどのプールに対して結合を示さなかった。選択したプールを配列決定し、サブクローニングし、ハイスループットスクリーニングに進めた。
一次スクリーニング:直接固定化した免疫グレードヒトII型コラーゲン(Chondrex社)[c=1μg/ml]に対する単一バリアントの一次スクリーニングを行った。Strep-Tactin(登録商標)HRPコンジュゲートを使用して、結合バリアントを検出した。ヒットは次のように選択した:試料のシグナルが陰性対照のシグナルより大きいこと。
二次スクリーニング。免疫グレード(Immunization Grade)ヒトII型コラーゲン(Chondrex社;オンターゲット)[c=1μg/ml]及びBSA(オフターゲット)[c=1μg/ml]に対する二次スクリーニングを行った。ヒットは次のように同定した:オンターゲットに対するバリアントのシグナルがオフターゲットに対するシグナルより10倍大きい。
PhyNexus/SPR。ヒットをμスケールで作製及び精製し(PhyNexus)、SPR測定で解析した。免疫グレードヒトII型コラーゲン(Chondrex社)をアミンカップリングによってCM5チップ(GEヘルスケア)に固定化した。結合すると、分析対象物(ヒットの可能性があるもの)が表面に蓄積し、屈折率を増加させる。屈折率の変化をリアルタイムに測定し、時間に対する応答単位としてプロットした。ヒットしたバリアントを、配列解析及びラボスケール生産作製に向けて選択した。
実施例2 2型コラーゲン結合タンパク質の発現
アフィニティータグをもつバリアントを、大腸菌BL21(DE3)でT7プロモーターの制御のもと、低コピープラスミド系を使用して発現させた。タンパク質を、培地(自己誘導培地)に含まれるラクトースによって誘導した後、可溶性の形態で産生させた。BL21(DE3)コンピテントセルを発現プラスミドで形質転換し、選択寒天培地プレート(カナマイシン)に広げ、37℃で一晩インキュベートした。単一コロニーから50μg/mlのカナマイシンを補充した3mlの2×YT培地に単一コロニーを播種して前培養とし、培養管中で、通常のオービタルシェーカーで37℃、200rpmで6時間培養した。1L容三角フラスコ中で、アフィニティータグをもつバリアントの場合、350mlのZYM-5052(0.5%グリセロール、0.2%ラクトース、0.05%グルコース、0.5%酵母エキス、1.0%カザミノ酸、25mM Na2HPO4、25mM KH2PO4、5mM Na2SO4、2mM MgSO4及び微量元素)に、又はアフィニティータグをもたないバリアントの場合、50μg/mlカナマイシンを補充した、350mlのH15培地(0.89%グリセロール、0.76%ラクトース、2.2%グルコース、5%酵母エキス、250mM MOPS、200mM Tris、10mM MgCl2及び微量元素)に、0.3/ODの前培養を播種し、主培養とした。培養物をオービタルシェーカーに移し、30℃、200rpmでインキュベートした。グルコースを代謝させ、その後ラクトースを細胞内に取り込ませることによって、組換えタンパク質の発現を誘導した。細胞を一晩、約17時間培養して、約2~4の最終OD600に達した。収集前にOD600を測定し、0.6/OD600に調整した試料を取り出し、ペレット化し、-20℃で凍結した。バイオマスを集めるため、細胞を12000×g、22℃で15分間遠心分離した。ペレットの重量(湿重量)を測定した。細胞を-20℃で保存した後、処理した。
アフィニティータグをもつバリアントを、大腸菌BL21(DE3)でT7プロモーターの制御のもと、低コピープラスミド系を使用して発現させた。タンパク質を、培地(自己誘導培地)に含まれるラクトースによって誘導した後、可溶性の形態で産生させた。BL21(DE3)コンピテントセルを発現プラスミドで形質転換し、選択寒天培地プレート(カナマイシン)に広げ、37℃で一晩インキュベートした。単一コロニーから50μg/mlのカナマイシンを補充した3mlの2×YT培地に単一コロニーを播種して前培養とし、培養管中で、通常のオービタルシェーカーで37℃、200rpmで6時間培養した。1L容三角フラスコ中で、アフィニティータグをもつバリアントの場合、350mlのZYM-5052(0.5%グリセロール、0.2%ラクトース、0.05%グルコース、0.5%酵母エキス、1.0%カザミノ酸、25mM Na2HPO4、25mM KH2PO4、5mM Na2SO4、2mM MgSO4及び微量元素)に、又はアフィニティータグをもたないバリアントの場合、50μg/mlカナマイシンを補充した、350mlのH15培地(0.89%グリセロール、0.76%ラクトース、2.2%グルコース、5%酵母エキス、250mM MOPS、200mM Tris、10mM MgCl2及び微量元素)に、0.3/ODの前培養を播種し、主培養とした。培養物をオービタルシェーカーに移し、30℃、200rpmでインキュベートした。グルコースを代謝させ、その後ラクトースを細胞内に取り込ませることによって、組換えタンパク質の発現を誘導した。細胞を一晩、約17時間培養して、約2~4の最終OD600に達した。収集前にOD600を測定し、0.6/OD600に調整した試料を取り出し、ペレット化し、-20℃で凍結した。バイオマスを集めるため、細胞を12000×g、22℃で15分間遠心分離した。ペレットの重量(湿重量)を測定した。細胞を-20℃で保存した後、処理した。
実施例3 2型コラーゲン結合タンパク質の精製
アフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除によって、アフィニティータグをもつタンパク質を精製した。Strep-Tactin Superflow高容量カートリッジ(IBA Lifesciences)を使用してアフィニティークロマトグラフィー精製した後、Akta システム及びSuperdex(商標)200 Hiload 16/600カラム(Cytiva)を使用してサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行った。Afliberceptとの融合バリアントは、MabSelect SuRe(Cytiva)アフィニティークロマトグラフィー、それに続くAktaシステム及びSuperdex(商標)200 Hiload 16/600カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で精製した。クロマトグラフィー処理ステップはすべて、Cytivaのマトリックスを使用したAKTAシステムで実施した。すべての精製したリガンドについて均一な種(Homogenous species)が得られ、凝集は検出されなかった。SDS-PAGE分析後、陽性(positive)画分をプールし、そのタンパク質濃度を測定した。さらなる分析には、SDS-PAGE、SE-HPLC及びRP-HPLCを含めた。タンパク質濃度、モル吸光係数を用いた280nmでの吸光度測定によって決定した。Dionex HPLCシステム及びPLRP-S(5μm、300Å)カラム(Agilent)を使用して、逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)を行った。Dionex HPLCシステム及びSuperdex200 increase 5/150 GL(Cytiva)を使用して、分析用サイズ排除クロマトグラフィー(SE-HPLC)を行った。ビアコア3000システムを用いたSPR測定によって、コラーゲンIIの結合を評価した。Chondrex社から精製コラーゲンIIを、MilliporeからVEGF-165を入手した。ターゲットをNHS/EDC化学によってCM5-Sensor上に固定化した(固定化レベル~1000RU)。結合分子を異なる濃度で注入し、ラングミュア1:1結合モデルによって親和性を計算した。表2に、選択した2型コラーゲン結合タンパク質(又はそのようなタンパク質を含む多量体)の発現及び精製の結果を示す。
アフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除によって、アフィニティータグをもつタンパク質を精製した。Strep-Tactin Superflow高容量カートリッジ(IBA Lifesciences)を使用してアフィニティークロマトグラフィー精製した後、Akta システム及びSuperdex(商標)200 Hiload 16/600カラム(Cytiva)を使用してサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行った。Afliberceptとの融合バリアントは、MabSelect SuRe(Cytiva)アフィニティークロマトグラフィー、それに続くAktaシステム及びSuperdex(商標)200 Hiload 16/600カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で精製した。クロマトグラフィー処理ステップはすべて、Cytivaのマトリックスを使用したAKTAシステムで実施した。すべての精製したリガンドについて均一な種(Homogenous species)が得られ、凝集は検出されなかった。SDS-PAGE分析後、陽性(positive)画分をプールし、そのタンパク質濃度を測定した。さらなる分析には、SDS-PAGE、SE-HPLC及びRP-HPLCを含めた。タンパク質濃度、モル吸光係数を用いた280nmでの吸光度測定によって決定した。Dionex HPLCシステム及びPLRP-S(5μm、300Å)カラム(Agilent)を使用して、逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)を行った。Dionex HPLCシステム及びSuperdex200 increase 5/150 GL(Cytiva)を使用して、分析用サイズ排除クロマトグラフィー(SE-HPLC)を行った。ビアコア3000システムを用いたSPR測定によって、コラーゲンIIの結合を評価した。Chondrex社から精製コラーゲンIIを、MilliporeからVEGF-165を入手した。ターゲットをNHS/EDC化学によってCM5-Sensor上に固定化した(固定化レベル~1000RU)。結合分子を異なる濃度で注入し、ラングミュア1:1結合モデルによって親和性を計算した。表2に、選択した2型コラーゲン結合タンパク質(又はそのようなタンパク質を含む多量体)の発現及び精製の結果を示す。
実施例4 SPRによるタンパク質の結合解析
精製したタンパク質を、PDEA活性化後にNHS/EDCを用いてCM-5センサーチップ(GEヘルスケア)に固定化し、ビアコア3000システム(GEヘルスケア)で110~140RUを得た。チップをSPRランニングバッファー(PBS 0.05%ツイーン pH7.3)で平衡化した。
精製したタンパク質を、PDEA活性化後にNHS/EDCを用いてCM-5センサーチップ(GEヘルスケア)に固定化し、ビアコア3000システム(GEヘルスケア)で110~140RUを得た。チップをSPRランニングバッファー(PBS 0.05%ツイーン pH7.3)で平衡化した。
結合すると、標的分析物が表面に蓄積され、屈折率を増加させた。この屈折率の変化をリアルタイムに測定し、時間に対する応答又はレゾナンスユニットとしてプロットした。分析物を連続希釈して30μl/分の流速でチップに塗布した。結合を120秒間、解離を120秒間行った。各ランの後、チップ表面を30μlの再生バッファ(10mMグリシン pH2.0)で再生し、ランニングバッファーで平衡化した。
ビアコア3000(GEヘルスケア)を使用して結合試験を実施した。ラングミュア1:1モデル(RI=0)を使用して、製造業者提供のBIAevaluation 3.0ソフトウェアを介してデータ評価を行った。評価した解離定数(KD)は、固定化したタンパク質に対して標準化して示した。リアルタイムに測定し、時間[秒]に対する応答又はレゾナンスユニット[RU]としてプロットした屈折率の変化を示す。結果を表3並びに図3及び図4に示す。211190(配列番号1)は、I型コラーゲン及びIII型コラーゲンへの追加の結合(II型コラーゲンへの追加結合)を示したが、V型コラーゲンへの追加の結合を示さなかった(対照、BSA又はフィブロネクチンのエクストラドメインBへの追加の結合も示さなかった)。
実施例5. 結合タンパク質のKDの測定(ELISA)
高結合プレート(グレーナー、781061)を、2.5μg/mlの組換えヒトコラーゲンII型(h Col II、Chondrex、CHX-20051)、ウサギコラーゲンII型(ウサギの眼から調製したrbCol II)、ブタコラーゲンII型(p Col II、ブタの眼から調製)、ヒトコラーゲンI型、(h Col I、シグマ、C5483-1MG)、ヒトコラーゲンV型(h Col V、アブカム、ab7537)ヒトコラーゲンIII型(h Col III、アブカム、ab7535)、及び67B89(大腸菌で産生されるフィブロネクチンのドメイン)で、それぞれ4℃で一晩固定化した。ELISAプレートをPBST(PBS+0.1%ツイーン)で3回洗浄し、3% BSA/0.5%ツイーン/PBSで室温にて2時間ブロックした。PBSTで洗浄した後、1.1μM~7×10-4nMの二量体(CID211999、CID212000)の希釈系列、100nM~7×10-6nMの四量体(CID212001及びCID212704)の希釈系列、並びに10μM~2nMの二量体(CID212705)の希釈系列を、ELISAプレート上で室温にて1時間インキュベートした。プレートをPBSTで洗浄し、ビオチン標識抗StrepTag抗体(Antikorper-online、ABIN1573895)で1:10.000の希釈物とともに室温で1時間インキュベートした。結合は、1:10.000希釈のa-ウサギIgG-HRP(シグマ、A9169)と、及び基質としてTMB Plus von KEM EN TEC Diagnostic、Kat-Nr.4395を用いて可視化した。
高結合プレート(グレーナー、781061)を、2.5μg/mlの組換えヒトコラーゲンII型(h Col II、Chondrex、CHX-20051)、ウサギコラーゲンII型(ウサギの眼から調製したrbCol II)、ブタコラーゲンII型(p Col II、ブタの眼から調製)、ヒトコラーゲンI型、(h Col I、シグマ、C5483-1MG)、ヒトコラーゲンV型(h Col V、アブカム、ab7537)ヒトコラーゲンIII型(h Col III、アブカム、ab7535)、及び67B89(大腸菌で産生されるフィブロネクチンのドメイン)で、それぞれ4℃で一晩固定化した。ELISAプレートをPBST(PBS+0.1%ツイーン)で3回洗浄し、3% BSA/0.5%ツイーン/PBSで室温にて2時間ブロックした。PBSTで洗浄した後、1.1μM~7×10-4nMの二量体(CID211999、CID212000)の希釈系列、100nM~7×10-6nMの四量体(CID212001及びCID212704)の希釈系列、並びに10μM~2nMの二量体(CID212705)の希釈系列を、ELISAプレート上で室温にて1時間インキュベートした。プレートをPBSTで洗浄し、ビオチン標識抗StrepTag抗体(Antikorper-online、ABIN1573895)で1:10.000の希釈物とともに室温で1時間インキュベートした。結合は、1:10.000希釈のa-ウサギIgG-HRP(シグマ、A9169)と、及び基質としてTMB Plus von KEM EN TEC Diagnostic、Kat-Nr.4395を用いて可視化した。
結果。ELISA分析から、II型コラーゲンに対する特異的結合が明確に確認された。配列番号2のホモ二量体(CID211999及びCID212000)並びに配列番号15のホモ二量体(CID212705)は高い結合親和性(1~2桁nMのKD)を示す。配列番号15の四量体(CID212704)及び配列番号2の四量体(CID212001)は高い結合親和性、例えば異なる種のII型コラーゲンに対して3桁ピコモルの結合親和性を示す。I型コラーゲン、III型コラーゲン、V型コラーゲン又はフィブロネクチンのドメイン(67B89)に対して非特異的な結合は検出されなかった(図2)。
さらに、II型コラーゲン結合タンパク質を結合についてELISAで分析した。例えば、209130(配列番号27)は、ヒトII型コラーゲンに対して0.22μM、ブタII型コラーゲンに対して0.11μMの特異的結合を示した。211138(配列番号34)は、ヒトII型コラーゲンに対して0.45μM、ブタII型コラーゲンに対して0.81μMの特異的結合を示した。210987(配列番号36)は、ヒトII型コラーゲンに対して0.46μMの特異的結合を示した。211519(配列番号37)は、ヒトII型コラーゲン及びブタII型コラーゲンに対して0.7μMの特異的結合を示した。211190(配列番号1)は、ヒトII型コラーゲン、さらにはヒトI型コラーゲン、ヒトIII型コラーゲンの特異的結合を示したが、ヒトV型コラーゲンに対しては示さなかった。
実施例6:IHCによるタンパク質の特異的結合の解析 ホルマリン固定したパラフィン包埋ブタ眼の切片をキシロールで脱パラフィンし、エタノールを用いて、その濃度を下げていく系列で再水和した。抗原賦活化のため、スライスを、TEバッファー、pH9.0で、110℃にて5分間インキュベートした。ペルオキシダーゼブロッキング溶液(Novolink PolymerTM Detection System、Leica、RE7140-K)で内在性ペルオキシダーゼをブロッキングした後、スライスを5μM又は500nMのCID211999(二量体)、CID212000(二量体)、CID212001(四量体)とともに室温で45分間インキュベートした。次に、1:500希釈のウサギ抗StrepTag抗体(Genscript、A00026)及びNovolink PolymerTM Detection Systemを用いてタンパク質の結合を検出した。1:10希釈の抗コラーゲンII型抗体(アブカム、#ab34712)を陽性対照とした。組織スライスを抗体と30分間インキュベートした。洗浄ステップをTBS pH7.6で行った。可視化には、AEC染色(Dako、K3461)を用い、水で洗浄後、マイヤーヘマトキシリン溶液(メルク、1.09249.0500)で核を染色した。結果は図5を参照されたい。図5に示すものと同様の結果が、配列番号38(二量体配列番号2、CID211999)及び配列番号41(配列番号2の四量体、CID212001)で得られた。
Claims (11)
- 配列番号2、10、11、12、14、及び15のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むII型コラーゲン結合タンパク質であって、
(i)グルタミン(Q)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの25番目に対応する位置に;
(ii)チロシン(Y)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの29番目に対応する位置に;且つ
(iii)トリプトファン(W)を、配列番号2、10、11、12、14及び15のいずれかの33番目に対応する位置に有し;II型コラーゲンに対して10μM未満の結合親和性(KD)を有する
II型コラーゲン結合タンパク質。 - 2、3、4、5、又は6つのII型コラーゲンに対する結合タンパク質が、互いに連結した、請求項1に記載のII型コラーゲンに対する結合タンパク質。
- ホモ多量体又はヘテロ多量体である、請求項2に記載のII型コラーゲンに対する結合タンパク質。
- 配列番号27~42のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む、請求項1又は2に記載のII型コラーゲンに対する結合タンパク質。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質を含む二量体又は多量体タンパク質。
- モノクローナル抗体及びその断片、結合タンパク質、受容体及び受容体ドメイン、受容体結合リガンド及びアンタゴニスト、受容体の細胞外ドメイン及びその断片、非免疫グロブリン結合タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒性化合物、酵素、並びにそれらの誘導体、並びに放射性核種、並びに上記の任意の組み合わせから任意選択で選択される、少なくとも1つの治療上有効な部分にさらに融合又は結合された、請求項1~4のいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質、又は請求項5に記載の二量体若しくは多量体タンパク質。
- 放射性核種、蛍光化合物、光増感剤、タグ、酵素、及び非免疫グロブリン結合タンパク質、並びに上記の任意の組み合わせから任意選択で選択される少なくとも1つの診断用部分にさらに融合された又は結合された、請求項1~4及び6のいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質、又は請求項5又は6に記載の二量体若しくは多量体タンパク質。
- 医学に使用するため、好ましくは、眼疾患又は関節の疾患などの疾患の診断又は治療に使用するための、請求項1~4、6及び7のいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質、又は請求項5~7のいずれか一項に記載の二量体若しくは多量体タンパク質。
- 請求項1~4、6及び7のいずれか一項に記載のII型コラーゲン結合タンパク質、又は請求項5~7のいずれか一項に記載の二量体若しくは多量体タンパク質を含む組成物。
- 請求項1~4、6及び7のいずれか一項に画定されたII型コラーゲン結合タンパク質、又は請求項5~7のいずれか一項に記載の二量体若しくは多量体タンパク質、並びに治療上又は診断上許容可能な担体並びに/又は希釈剤を含む、疾患の治療のための医薬組成物。
- II型コラーゲン結合タンパク質を得るために好適な条件下で宿主細胞を培養すること及び任意選択で前記II型コラーゲン結合タンパク質を単離することを含む、請求項1~4、6及び7のいずれか一項に画定されたII型コラーゲン結合タンパク質、又は請求項5~7のいずれか一項に記載の二量体若しくは多量体タンパク質を製造するための方法。
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