JP2023543125A - Ｇｌｐ－１受容体アゴニスト融合物をコードするウイルスベクター及び代謝性疾患の治療におけるその使用 - Google Patents

Abstract

対象における代謝性疾患を治療するための組成物及び方法が提供される。ＧＬＰ－１受容体アゴニスト融合タンパク質をコードする配列及びその発現を指示する調節配列を含む核酸分子を含むウイルスベクターが提供される。【選択図】なし

Description

グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）は、グルコース恒常性において中心的な役割を果たす内因性ペプチドホルモンである。ＧＬＰ－１は、グルカゴンプレタンパク質のタンパク質分解切断から、胃腸（ＧＩ）管で産生されるペプチドホルモンである。ＧＬＰ－１及び他のＧＬＰ－１受容体アゴニストは、インスリン放出を増強し、インスリン感受性を増加させ、β細胞の喪失を防止し、胃内容排出を遅延させることによって、高血糖を制御する能力を有する。しかしながら、ＧＬＰ－１は半減期が短く、それは薬物としてのその使用を妨げてきた。他のＧＬＰ－１受容体アゴニストは、現在、糖尿病の治療のためにヒトで使用されている。アゴニストをより長い半減期を有するタンパク質に融合させることによって、天然ホルモンの短い半減期を克服するように設計されたＧＬＰ－１受容体アゴニストは、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の治療のための重要な治療薬として浮上している。

グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニスト融合タンパク質構築物をコードするウイルスベクターが本明細書で提供される。これらのウイルスベクターは、いくつかの実施形態では、融合パートナーを含まないＧＬＰ－１受容体アゴニストのベクター媒介送達と比較して、対象におけるＧＬＰ－１受容体アゴニストの持続的発現及び／又は循環半減期の増加を達成し得る。そのようなウイルスベクターの製造及び使用方法が更に提供される。

一態様では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を含むウイルスベクターが提供される。融合タンパク質は、（ａ）分泌シグナルペプチドを含むリーダー配列と、（ｂ）グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニストと、（ｃ）（ｉ）ＩｇＧ Ｆｃ若しくはその機能的バリアント、又は（ｉｉ）アルブミン若しくはその機能的バリアントのいずれかを含む融合ドメインと、を含む。一実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。

一実施形態では、（ｉ）リーダー配列の分泌シグナルペプチドが、トロンビンシグナルペプチドを含み、（ｉｉ）リーダー配列が、トロンビンプロペプチドを含み、かつ／又は（ｉｉｉ）リーダー配列が、トロンビンリーダー配列を含む。別の実施形態では、リーダー配列は、ＩＬ－２リーダー配列を含む。一実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及びその機能的バリアントから選択される。

一実施形態では、融合ドメインは、配列番号１１の配列、若しくはそれと少なくとも９０％の同一性を共有する配列、又はその機能的バリアントを有するヒトＩｇＧ４である。別の実施形態では、融合ドメインは、配列番号１２の配列、若しくはそれと少なくとも９０％の同一性を共有する配列、又はその機能的バリアントを有するヒトアルブミンである。一実施形態では、融合ドメインは、配列番号１７の配列、若しくはそれと少なくとも９０％の同一性を共有する配列、又はその機能的バリアントを有するアカゲザルＩｇＧ４ Ｆｃである。

別の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶカプシドと、ＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムとを含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、及び融合タンパク質の発現を指示する調節配列を含む。

別の態様では、対象における代謝性疾患の治療に使用するのに好適な薬学的組成物が提供される。組成物は、水性液体と、本明細書に記載のウイルスベクターとを含む。一実施形態では、対象は、ヒトである。

更に別の態様では、本明細書に記載のウイルスベクターの使用は、代謝性疾患、任意選択で、糖尿病を有する対象を治療するための医薬の製造のために提供される。

別の態様では、代謝性疾患を有する対象を治療する方法が提供される。方法は、有効量の本明細書に記載のウイルスベクター又は組成物を対象に投与することを含む。

本発明の他の態様及び利点は、以下の本発明の詳細な説明から、容易に明らかとなるであろう。

デュラグルチドの概略図である。 アルビグルチドの概略図である。 インビトロでの誘導性ｈＤｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ（Ｔｒｂ）対ＣＢ７．ｆｅＤｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ（ｆｅＴｒｂ）を示す。ＧＬＰ１－Ｆｃ融合物を、プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養上清中で、ヒトトロンビンシグナル配列を有する誘導性ヒトデュラグルチド（ＴＦ．ＧＴ２Ａ．デュラグルチド（Ｔｒｂ））及びＣＢ７．ネコデュラグルチド（ｆｅＴｒｂ）について測定した。上清を、ラパマイシン（Ｒａｐａ）による処理の４８時間後、０、４、及び４０ｎＭで、又はＣＢ７．ｆｅデュラグルチド（ｆｅＴｒｂ）のトランスフェクションの４８時間後に収集した。ＧＬＰ１－Ｆｃを、キットのＳＴＤとともに活性型ＧＬＰ１ ＥＬＩＳＡによって定量化した。 Ｒａｇ１ＫＯ（ＲＡＧ１^－／－）マウス（ｎ＝５／ベクター）におけるＧＬＰ－１の誘導性発現を示す。Ｒａｇ１ＫＯ雌マウスに、示されるベクター（すなわち、ＡＡＶｒｈ９１．ＴＦ．ｈデュラグルチド（Ｔｒｂ）３ｗ．ｒＢＧ及びＡＡＶｒｈ９１．ＴＦ．ｒｈデュラグルチド（ｒｈＴｒｂ）．３ｗ．ｒＢＧ）の筋肉内（Ｉ．Ｍ．又はＩＭ）送達を介して１×１０^１１ＧＣ／マウスを投与した。毎週採血が行われた。活性型ＧＬＰ－１に特異的なＧＬＰ１ ＥＬＩＳＡが行われた。ＡＡＶベクターを０日目に注射し、ラパマイシンを、ＡＡＶ注射後１４日目及び１５日目頃に経口胃管投与によって投与した。 ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＴＦ．ＧＴ２Ａ．デュラグルチド（Ｔｒｂ）．３ｗ．ｒＢＧのプラスミドマップの概略図である。 マウスにおける操作されたＧＬＰ－１構築物のＡＡＶ媒介発現を示す。 ２ベクター系で使用するための誘導性構築物を含む例示的な発現カセットの概略図を示す。 ＩＲＥＳリンカーを含む１ベクター系で使用するための誘導性構築物を含む発現カセットの概略図を示す。 分泌シグナルを有するＦ２Ａ切断配列リンカー及びヒトＧＬＰ１－Ｆｃ（ｈデュラグルチド）を含む、１ベクター系で使用するための誘導性構築物を含む発現カセットの概略図を示す。 ＧＴ２Ａ切断配列の更なる詳細図を示し、ＧＴ２Ａ＿Ｖ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＧＴ２Ａ＿Ｖ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。 様々な構築物でトランスフェクトし、０ｎＭ、４ｎＭ、及び４０ｎＭで、ラパマイシンで処理した後に測定し、ＩＵ／ｍＬのｒｈＴＴとしてプロットしたＨＥＫ２９３細胞上清におけるアカゲザルの例示的な治療用導入遺伝子（ｒｈＴＴ）の発現を示す。 インビトロでの誘導性ヒト（ｈ）及びアカゲザル（ｒｈ）ＧＬＰ－１の発現を示す。ＧＬＰ１－Ｆｃ融合物を、プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養上清中で、トロンビンシグナル配列を含む誘導性ｈデュラグルチド、２ベクター系を含むｒｈデュラグルチド、及びＣＢ７．ｒｈデュラグルチドについて測定した。細胞を０日目に播種し、１日目にトランスフェクトし、２日目に０ｎＭ、４ｎＭ、及び４０ｎＭで、ラパマイシンで処理し、ＣＢ７．ｒｈデュラグルチド（ｒｈＴｒｂ）のトランスフェクションから４日目又は４８時間後に細胞からの上清を収集した。ＧＬＰ１－Ｆｃを、キットのＳＴＤとともに活性型ＧＬＰ１ ＥＬＩＳＡによって定量化した。 ＮＨＰ１（１８－１２８）の抗ｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ ＡＤＡ（抗薬物抗体）検出アッセイのｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ発現及び分析示す。図１０Ａは、０～２００日目に測定された、ｎＭとしてプロットされた血清中のｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ発現レベルを示す。図１０Ｂは、０～２００日目に測定された、μｇ／Ｌとしてプロットされた血清中のラパマイシンレベルを示す。図１０Ｃは、０日目～２００日目に測定された、外径４５０ｎｍとしてプロットされたＡＤＡ検出アッセイの結果を示す。 ＮＨＰ１（１８－０７２）の抗ｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ ＡＤＡアッセイのｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ発現及び分析を示す。図１１Ａは、０～２００日目に測定された、ｎＭとしてプロットされた血清中のｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ発現レベルを示す。図１１Ｂは、０～２００日目に測定された、μｇ／Ｌとしてプロットされた血清中のラパマイシンレベルを示す。図１１Ｃは、０日目～２００日目に測定された、外径４５０ｎｍとしてプロットされたＡＤＡ検出アッセイの結果を示す。 ＮＨＰ１（１８－０１３）の抗ｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ ＡＤＡアッセイのｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ発現及び分析を示す。図１２Ａは、０～２００日目に測定された、ｎＭとしてプロットされた血清中のｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ発現レベルを示す。図１２Ｂは、０～２００日目に測定された、μｇ／Ｌとしてプロットされた血清中のラパマイシンレベルを示す。図１２Ｃは、０日目～２００日目に測定された、外径４５０ｎｍとしてプロットされたＡＤＡ検出アッセイの結果を示す。

長時間作用型ＧＬＰ－１受容体アゴニスト融合タンパク質発現構築物は、ヒトを含む、それを必要とする対象での使用のために開発されている。分泌シグナルペプチドを含むリーダー配列、並びに得られた融合タンパク質の循環時間を延長することを意図した融合ドメインが提供される。

多数の経路を介して、特にｒＡＡＶベクターなどの組換えベクターによって媒介されるインビボでの発現によって、これらの構築物をそれを必要とする対象に送達することが記載される。糖尿病又はメタボリックシンドロームを治療することを必要とする対象におけるレジメンにおいて、これらの構築物を使用し、対象におけるＧＬＰ－１の半減期を増加させる方法も提供される。加えて、対象におけるＧＬＰ－１の活性を増強するための方法が提供される。また、それを必要とする対象における体重減少を誘導するための方法も提供される。

ＧＬＰ－１融合タンパク質
グルカゴン様ペプチド１又はＧＬＰ－１は、プログルカゴン遺伝子の転写産物に由来するインクレチンである。インビボでは、グルカゴン遺伝子は、ＧＬＰ－１及びＧＬＰ－２の２つの形態であるグルカゴンを形成するためにタンパク質分解処理される１８０個のアミノ酸プレプロポリペプチドを発現する。元の配列決定研究は、ＧＬＰ－１が３７個のアミノ酸残基を有することを示した。しかしながら、後続の情報は、このペプチドがプロペプチドであり、更に、アミノ末端から６個のアミノ酸を除去して、ＧＬＰ－１の活性型であるＧＬＰ－１（７－３７）の形態にプロセシングされたことを示した。３７位のグリシンもまた、インビボでアミドに形質転換されて、ＧＬＰ－１（７－３６）アミドを形成する。ＧＬＰ－１（７－３７）及びＧＬＰ－１（７－３６）アミドは、同等の効力を有するインスリン刺激ホルモンである。したがって、本明細書で使用される場合、本明細書で有用であるＧＬＰ－１の生物学的に「活性」な形態は、ＧＬＰ－１－（７－３７）及びＧＬ
Ｐ－１－（７－３６）ＮＨ_２である。

ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、グルカゴン様ペプチドの作用を模倣する抗糖尿病薬のクラスである。ＧＬＰ－１は、消化中に腸から放出された後に体に影響を与えるいくつかの天然に存在するインクレチン化合物の１つである。ＧＬＰ－１受容体に結合し活性化することにより、ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、血糖レベルを低下させることができ、これはＴ２ＤＭ患者が血糖制御を成し遂げるのに役立つ。本明細書で使用される場合、「ＧＬＰ－１受容体アゴニスト」という用語は、少なくともＧＬＰ－１又はその機能的断片、ＧＬＰ－１のアミノ酸配列バリアント又はその機能的断片、及びＧＬＰ－１受容体の他のポリペプチドアゴニスト（例えば、エキセジン－４及びそのバリアント）を指す。本開示は、ＧＬＰ－１受容体アゴニストの１つ以上のコピー、並びにかかる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びベクターを含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、（ａ）分泌シグナルペプチドを含むリーダー配列と、（ｂ）グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニストと、（ｃ）融合ドメインと、を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、トロンビンリーダー配列、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、及びＩｇＧ Ｆｃ又はその機能的バリアントを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、トロンビンリーダー、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、及びアルブミン又はその機能的バリアントを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、トロンビンリーダー、ＧＬＰ－１受容体アゴニストの２つのコピー、及びアルブミン又はその機能的バリアントを含む。

いくつかの実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、野生型配列の機能を保持する、本明細書に記載の、又は当該技術分野で既知のＧＬＰ－１核酸又はアミノ酸配列から最大約１０％のバリエーションを含み得るバリアントを含む。本明細書で使用する場合、「機能を保持する」とは、必ずしも同じレベルの発現又は活性ではないが、核酸又はアミノ酸が野生型配列と同じ方法で機能することを意味する。例えば、一実施形態では、機能的バリアントは、野生型配列と比較して、増加した発現又は活性を有する。別の実施形態では、機能的バリアントは、野生型配列と比較して、発現又は活性が低下している。一実施形態では、機能的バリアントは、野生型配列と比較して、発現又は活性の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上の増加又は減少を有する。

ＧＬＰ－１受容体アゴニストを安定化融合ドメインに融合させるいくつかのヒト用薬物は、当該技術分野において既知である。これらには、アルビグルチド、リラグルチド、デュラグルチド、及びリキシセナチド（化学名デス－３８－プロリン－エキセンジン－４（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）－（１－３９）－ペプチジルペンタ－Ｌ－リシル－Ｌ－リシンアミドとしても知られている）が含まれる。デュラグルチドは、各モノマーが１つのＧＬＰ－１類似体部分及び１つのＩｇＧ４Ｆｃ領域からなるジスルフィド結合ホモ二量体融合ペプチドである。Ｙｕ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂａｔｔｌｅ ｏｆ ＧＬＰ－１ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．デュラグルチドの概略図を、図１Ａに示す。ＷＯ２００５／０００８９２Ａ２を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。

アルビグルチドは、ヒトアルブミンに融合したＧＬＰ－１類似体の２つのコピーで構成される組換えタンパク質である。この分子は、ＤＰＰ－４分解に対する耐性を改善するために、ＧＬＰ－１類似体の両方のコピーにおいてＡｌａに対してＧｌｙ８置換を有する。アルビグルチドの概略図を、図１Ｂに示す。

一実施形態では、融合物は、異種配列と組み合わせたＧＬＰ－１類似体を含む。ＧＬＰ
－１類似体とは、天然ヒトＧＬＰ－１（７－３７）と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有するポリペプチドを意味する。一実施形態では、ＧＬＰ－１類似体は、天然配列と比較して、最大で１、２、又は３個のアミノ酸置換を有する。天然ヒトＧＬＰ－１（１－３７）は、ＨＤＥＦＥＲＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ （配列番号１）の配列を有し、ＧＬＰ－１（７－３７）は、ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号２）の配列を有する。いくつかの実施形態では、天然ＧＬＰ－１配列を変更して、その１つ以上の特徴を最適化することが望ましい。例えば、一実施形態では、ＧＬＰ－１類似体は、天然配列と比較して、Ａ８Ｇ、Ｇ２２Ｅ、及びＲ３６Ｇから選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸置換を含む。これらの置換は、ＤＰＰ－４不活性化からの保護（Ａ８Ｇ）、溶解度の増加（Ｇ２２Ｅ）、及び潜在的なＴ細胞エピトープを除去するために３６位（Ｒ３６Ｇ）のアルギニンをグリシン残基で置換することによる免疫原性の低下を含む、ＧＬＰ－１の臨床プロファイルの有効性を改善することが示されている。一実施形態では、ＧＬＰ－１類似体は、ＧＬＰ－１のＤＰＰ－ＩＶ耐性バリアントである。一実施形態では、ＧＬＰ－１類似体は、配列番号３：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧを含むか、又はそれからなる配列を有する。別の実施形態では、ＧＬＰ－１類似体は、配列番号４：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧを含むか、又はそれからなる配列を有する。別の実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、配列番号５：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳを含むか、若しくはそれからなる配列、又はその機能的バリアントを有する。一実施形態では、バリアントは、配列番号５と少なくとも９０％の同一性、９５％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、又は１００％の同一性を共有する。別の実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、配列番号６：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＳＫＫＫＫＫＫを含むか、若しくはそれからなる配列、又はその機能的バリアントを有する。一実施形態では、バリアントは、配列番号６と少なくとも９０％の同一性、９５％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、又は１００％の同一性を共有する。一実施形態では、ＧＬＰ－１類似体の２つ以上のコピーが融合タンパク質に存在する。別の実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、ＧＬＰ－１（７－３７）又はそのＤＰＰ－ＩＶ耐性バリアントの２つのタンデムコピーである。

融合タンパク質は、分泌シグナルペプチドを含み得るリーダー配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「リーダー配列」という用語は、ポリペプチドの任意のＮ末端配列を指す。

リーダー配列は、投与が最終的に意図されるのと同じ種、例えば、ヒトに由来し得る。本明細書で使用される場合、「由来する」又は「から由来する」という用語は、配列又はタンパク質が特定の対象種に由来するか、又は特定の対象種に由来するタンパク質又は配列と同じ配列を共有することを意味する。例えば、ヒトに「由来する」リーダー配列は、ヒトで発現されるのと同じリーダー配列と同じ配列（又は本明細書で定義されるようなそのバリアント）を共有する。しかしながら、指定された核酸又はアミノ酸は、実際にはヒトから供給される必要はない。類似のタンパク質（例えば、相同体）の突然変異誘発、又は核酸若しくはアミノ酸配列の人工産生を含む、所望の配列を産生することができる様々な技術が当技術分野で既知である。「由来する」核酸又はアミノ酸は、由来する配列の実際の供給源にかかわらず、それが「由来する」種における同じ核酸又はアミノ酸の機能を保持する。

「アミノ酸置換」という用語及びその同義語は、アミノ酸を別の代替アミノ酸で置き換えることによるアミノ酸配列の修飾を包含することを意図している。置換は、保存的置換であり得る。それは、非保存的置換であってもよい。保存的という用語は、２つのアミノ
酸を指す場合、それらのアミノ酸が、当業者によって認識される一般的な特性を共有することを意味することを意図している。例えば、疎水性非酸性側鎖を有するアミノ酸、疎水性酸性側鎖を有するアミノ酸、親水性非酸性側鎖を有するアミノ酸、親水性酸性側鎖を有するアミノ酸、及び親水性塩基性側鎖を有するアミノ酸。一般的な特性はまた、疎水性側鎖を有するアミノ酸、脂肪族疎水性側鎖を有するアミノ酸、芳香族疎水性側鎖を有するアミノ酸、極性中性側鎖を有するアミノ酸、電荷を有する側鎖を有するアミノ酸、電荷を有する酸性側鎖を有するアミノ酸、及び電荷を有する塩基性側鎖を有するアミノ酸であってもよい。天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸の両方が、当該技術分野で既知であり、実施形態では、代替アミノ酸として使用され得る。アミノ酸を置換するための方法は、当業者に周知であり、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の変異を含むが、これに限定されない。本明細書における「１つ以上」への言及は、例えば、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上の個々の実施形態を包含することを意図する。

一実施形態では、リーダーは、ヒトトロンビン（第ＩＩ因子）配列である。一実施形態では、トロンビンリーダーは、配列番号７：ＭＡＨＶＲＧＬＱＬＰＧＣＬＡＬＡＡＬＣＳＬＶＨＳＱＨＶＦＬＡＰＱＱＡＲＳＬＬＱＲＶＲＲで示される配列、又は最大で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を有するその機能的バリアントを有する。いくつかの実施形態では、リーダーは、シグナルペプチド及びプロペプチドを含む。一実施形態では、リーダー配列の分泌シグナルペプチドは、ヒトトロンビンシグナルペプチドを含む。一実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＡＨＶＲＧＬＱＬＰＧＣＬＡＬＡＡＬＣＳＬＶＨＳ（配列番号８）、又は最大で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を有するその機能的バリアントである。別の実施形態では、リーダー配列は、ヒトトロンビンプロペプチドを含む。一実施形態では、プロペプチドは、ＱＨＶＦＬＡＰＱＱＡＲＳＬＬＱＲＶＲＲ（配列番号９）の配列、又は最大で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を有するその機能的バリアントを有する。

一実施形態では、リーダーは、ヒトＩＬ－２配列である。一実施形態では、ＩＬ－２リーダーは、配列番号１０：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳで示される配列、又は最大で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を有するその機能的バリアントを有する。

一実施形態では、所望のリーダーの機能的バリアントは、野生型配列の機能を保持する、本明細書に記載の、又は当該技術分野で既知のリーダー核酸又はアミノ酸配列から最大約１０％のバリエーションを含み得るバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、プロペプチド及びＧＬＰ－１ペプチドの両方についてのコード領域は、プロペプチド及びＧＬＰ－１のコード配列の間にリンカーを伴うことなく単一の核酸配列に組み込まれる。

融合タンパク質は、融合ドメインを更に含む。融合ドメインは、一実施形態では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片又はその機能的バリアントである。免疫グロブリンは、典型的には、インビボで長い循環半減期を有する。ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（及びリーダー）をＩｇＧ Ｆｃに融合させることによって、ＧＬＰ－１の機能が維持されたまま、融合タンパク質の循環時間が延長される。一実施形態では、融合ドメインは、アカゲザルＩｇＧ Ｆｃ断片又はその機能的バリアントである。

本明細書で使用される場合、免疫グロブリンのＦｃ部分は、免疫学の分野における用語に一般的に付与される意味を有する。具体的には、この用語は、抗体からの２つの抗原結合領域（Ｆａｂ断片）を含有しない抗体断片を指す。Ｆｃ部分は、非共有結合相互作用及びジスルフィド結合によって会合する、両方の重鎖からの抗体の定常領域からなる。Ｆｃ
部分は、ヒンジ領域を含み、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを通って抗体のｃ末端まで延在し得る。Ｆｃ部分は、１つ以上のグリコシル化部位を更に含み得る。一実施形態では、融合ドメインは、ヒトＩｇＧ Ｆｃである。高度に保存されている４つのサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４は、それらの定常領域、特にそれらのヒンジ及び上部ＣＨ２ドメインの点で異なる。Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，ＩｇＧ Ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｏｃｔ．２０１４；５：５２０を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、又はヒトＩｇＧ４を含む任意のヒトＩｇＧに由来することができる。一実施形態では、ヒトＩｇＧ Ｆｃは、ＩｇＧ４ Ｆｃである。一実施形態では、ヒトＩｇＧ Ｆｃは、配列番号１１である：
ＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ．別の実施形態では、ヒトＩｇＧ Ｆｃは、配列番号１１と少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は少なくとも１００％の同一性を共有する。

一実施形態では、融合ドメインは、アカゲザルＩｇＧ Ｆｃである。Ｆｃドメインは、アカゲザルＩｇＧ１、アカゲザルＩｇＧ２、アカゲザルＩｇＧ３、又はアカゲザルＩｇＧ４を含む任意のアカゲザルＩｇＧに由来し得る。一実施形態では、アカゲザルＩｇＧ Ｆｃは、ＩｇＧ４ Ｆｃである。一実施形態では、アカゲザルＩｇＧ Ｆｃは、配列番号１７である：
ＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥ ＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦ ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩ ＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶ ＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶ ＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥ ＶＨＮＡＱＴＫＰＲＥ ＲＱＦＮＳＴＹＲＶＶ ＳＶＬＴＶＴＨＱＤＷ ＬＮＧＫＥＹＴＣＫＶ ＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥ
ＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰ ＲＥＰＱＶＹＩＬＰＰ ＰＱＥＥＬＴＫＮＱＶ ＳＬＴＣＬＶＴＧＦＹ ＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳ ＮＧＱＰＥＮＴＹＫＴ ＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳ ＹＬＬＹＳＫＬＴＶＮ ＫＳＲＷＱＰＧＮＩＦ ＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨ ＮＨＹＴＱＫＳＬＳＶ ＳＰＧＫ．別の実施形態では、アカゲザルＩｇＧ Ｆｃは、配列番号１７と少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は少なくとも１００％の同一性を共有する。一実施形態では、アカゲザルＩｇＧは、ヒンジ配列を更に含む。

別の実施形態では、融合ドメインは、ヒトアルブミン又はその機能的バリアントである。一実施形態では、ヒトアルブミンは、
配列番号１２である：
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨ
ＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ．別の実施形態では、ヒトアルブミンは、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は少なくとも１００％の同一性を共有する。

本開示の融合タンパク質のインビボ機能及び安定性は、例えば、潜在的に望ましくないドメイン相互作用を防止するために、又は他の理由で、小さなペプチドリンカーを添加することによって最適化され得る。更に、グリシンリッチリンカーは、ＧＬＰ－１類似体部分が、膵臓のβ細胞等の標的細胞上のＧＬＰ－１受容体と生産的に相互作用することができるように、ある程度の構造的柔軟性を提供し得る。したがって、ＧＬＰ－１類似体のＣ末端及び融合タンパク質の融合ドメインのＮ末端は、一実施形態では、リンカーを介して融合される。一実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３）という配列を有するＧリッチペプチドリンカーの１、１．５、又は２つの反復を含む。

一実施形態では、融合タンパク質は、（ａ）ヒトトロンビンリーダー、（ｂ）ＧＬＰ－１（７－３７）のＤＰＰ－ＩＶ耐性バリアント、リンカー、及び（ｃ）ヒトＩｇＧ Ｆｃを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を有する。
配列番号１４
ＭＡＨＶＲＧＬＱＬＰＧＣＬＡＬＡＡＬＣＳＬＶＨＳＱＨＶＦＬＡＰＱＱＡＲＳＬＬＱＲＶＲＲＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ

一実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、配列番号１５、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列である。
配列番号１５：
ａｔｇｇｃｔｃａｃｇｔｔｃｇａｇｇａｃｔｇｃａｇｃｔｇｃｃｔｇｇａｔｇｔｃｔｇｇｃｔｃｔｔｇｃｃｇｃｔｃｔｇｔｇｔａｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｃａｇｃｃａｇｃａｃｇｔｇｔｔｔｃｔｇｇｃｔｃｃｔｃａｇｃａａｇｃｃａｇａｔｃａｃｔｇｃｔｇｃａｇａｇａｇｔｔａｇａａｇｇｃａｃｇｇｃｇａｇｇｇｃａｃｃｔｔｔａｃｃｔｃｃｇａｃｇｔｇｔｃｔａｇｃｔａｃｃｔｇｇａａｇａａｃａｇｇｃｃｇｃｃａａａｇａｇｔｔｔａｔｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃｇｇａｇｇａａｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｔｃａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｔｃｔｇｃｃｇａｇｔｃｔａａｇｔａｃｇｇｃｃｃｔｃｃｔｔｇｔｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃｔｃｃｃｇａａｇｃｔｇｃｔｇｇｃｇｇｃｃｃａｔｃｃｇｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｃｃｃｔｃｃａａａｇｃｃｔａａｇｇａｃａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃａｇｃａｇａａｃｃｃｃｔｇａａｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｃｇａｃｇｔｇｔｃｃｃａａｇａｇｇａｔｃｃｔｇａｇｇｔｇｃａｇｔｔｃａａｔｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａａｇｔｇｃａｃａａｃｇｃｃａａｇａｃｃａａｇｃｃｔａｇａｇａｇｇａａｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇａｇｔｇｇｔｇｔｃｃｇｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｔｔｇｇｃｔｇａａ
ｃｇｇｃａａａｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｇｔｃｃａａｃａａｇｇｇｃｃｔｇｃｃｔａｇｃｔｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃａａｇａｇａａｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃａｃａｃｔｇｃｃｔｃｃａａｇｃｃａａｇａｇｇａａａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｃｇｔｇａａｇｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｔａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａａｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｃｃａｇｃｃｔｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃａｃｃｔｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃｔｃａｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔａｃａｇｃａｇａｃｔｇａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇａｔｇｇｃａａｇａｇｇｇｃａａｃｇｔｇｔｔｃａｇｃｔｇｃａｇｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇａａｇｔｃｔｃｔｇａｇｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｇｇｃ

一実施形態では、融合タンパク質は、（ａ）ヒトトロンビンリーダー、（ｂ）ＧＬＰ－１（７－３７）のＤＰＰ－ＩＶ耐性バリアント、リンカー、及び（ｃ）アカゲザルＩｇＧ
Ｆｃを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、（ａ）アカゲザルトロンビンリーダー、（ｂ）ＧＬＰ－１（７－３７）のＤＰＰ－ＩＶ耐性バリアント、リンカー、及び（ｃ）アカゲザルＩｇＧ Ｆｃを含む。

一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３７、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を有する。
配列番号３７
ＭＡＨＶＲＧＬＱＬＰＧＣＬＡＬＡＡＬＣＳＬＶＨＳＱＨＶＦＬＡＰＱＱＡＬＳＬＬＱＲＶＲＲＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＥＦＴＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＱＴＫＰＲＥＲＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＴＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＴＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＩＬＰＰＰＱＥＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＴＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＴＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＹＬＬＹＳＫＬＴＶＮＫＳＲＷＱＰＧＮＩＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＶＳＰＧ

一実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、配列番号３６、又はそれと少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の配列である。
配列番号３６
ａｔｇｇｃｔｃａｃｇｔｔｃｇａｇｇａｃｔｇｃａｇｃｔｇｃｃｔｇｇａｔｇｔｃｔｇｇｃｔｃｔｔｇｃｃｇｃｔｃｔｇｔｇｔａｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｃａｇｃｃａｇｃａｔｇｔｇｔｔｔｃｔｇｇｃｔｃｃｔｃａａｃａａｇｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｃｔｇｃａａａｇａｇｔｔａｇａａｇｇｃａｃｇｇｃｇａｇｇｇｃａｃｃｔｔｃａｃｃｔｃｃｇａｃｇｔｇｔｃｃａｇｃｔａｃｃｔｇｇａａｇａａｃａｇｇｃｃｇｃｃａａａｇａｇｔｔｔａｔｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇａａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃｇｇａｔｃｔｇｃｔｇａｇｔｔｔａｃａｃｃｔｃｃｔｔｇｔｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃｔｃｃｃｇａｇｃｔｇｃｔｃｇｇａｇｇｃｃｃｔｔｃｃｇｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｃｃｃｔｃｃａａａｇｃｃｔａａｇｇａｃａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃａｇｃａｇａａｃｃｃｃｔｇａａｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｃｇｔｇｇａｃｇｔｇｔｃｃｃａａｇａｇｇａｔｃｃｔｇａｇｇｔｇｃａｇｔｔｃａａｔｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａａｇｔｇｃａｃａａｃｇｃｃｃａｇａｃａａａｇｃｃｃａｇａｇａｇｃｇｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇａｇｔｇｇｔｇｔｃｃｇｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇａｃａｃａｃｃａｇｇａｔｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａａｇａｇｔａｃａｃｃｔｇｔａａａｇｔｃｔｃｃａａｃａａｇｇｇｃｃｔｇｃｃｔｇｃｔｃｃｔａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｔａｇａｇａａｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃａｔｃｃｔｇｃｃｔｃｃａｃｃｔｃａａｇａｇｇａ
ａｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇａｃｃｔｇｔｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｔａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａａｔｇｇｇａｇａｇｃａａｃｇｇａｃａｇｃｃｃｇａｇａａｃａｃｃｔａｃａａｇａｃｃａｃａｃｃｔｃｃａｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃａｇｃｔａｔｃｔｇｃｔｇｔａｃｔｃｃａａｇｃｔｇａｃａｇｔｇａａｃａａｇａｇｃｃｇｇｔｇｇｃａｇｃｃｃｇｇｃａａｃａｔｃｔｔｃａｃｃｔｇｔｔｃｔｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇａａｇｔｃｔｃｔｇａｇｃｇｔｃａｇｃｃｃｔｇｇｃ

一実施形態では、融合タンパク質は、（ａ）ヒトトロンビンリーダー、（ｂ）ＧＬＰ－１（７－３７）のＤＰＰ－ＩＶ耐性バリアント、リンカー、及び（ｃ）ヒトアルブミンを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、（ａ）ヒトトロンビンリーダー、（ｂ）ヒトＧＬＰ－１（７－３７）又はそのＤＰＰ－ＩＶ耐性バリアントの２つのタンデムコピー、リンカー、及び（ｃ）ヒトアルブミンを含む。

リーダー配列、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、又は融合ドメインのバリアント又は断片が所望される場合、これらのペプチドのコード配列は、野生型核酸配列の部位特異的変異誘発を使用して生成され得る。代替的又は追加的に、ウェブベース又は市販のコンピュータプログラム、並びにサービスベース会社を使用して、アミノ酸配列をＲＮＡ及び／又はｃＤＮＡの両方を含む核酸コード配列に逆翻訳し得る。例えば、ＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／）、Ｇｅｎｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ－／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）、ＥｘＰａｓｙ（ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照されたい。一実施形態では、ＲＮＡ及び／又はｃＤＮＡコード配列は、投与が最終的に意図される対象種、例えば、ヒトにおける最適な発現のために設計される。

コード配列は、コドン最適化を使用して最適な発現のために設計され得る。コドン最適化されたコード領域は、様々な異なる方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法、公開された方法、又はコドン最適化サービスを提供する会社を使用して実行され得る。１つのコドン最適化方法は、例えば、国際特許出願公開第２０１５／０１２９２４号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、生成物をコードする核酸配列は、同義コドン配列で修飾される。好適には、産物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を修飾する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＲＦの断片のみを改変してもよい。これらの方法のうちの１つを使用することによって、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用し、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生し得る。

本明細書に提供されるリーダー配列、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、融合ドメイン、及び融合タンパク質に加えて、これらのポリペプチドをコードする核酸配列が提供される。一実施形態では、本明細書に記載のＧＬＰ－１ペプチドをコードする核酸配列が提供される。いくつかの実施形態では、これは、配列番号１のＧＬＰ－１配列をコードする任意の核酸配列を含み得る。別の実施形態では、これは、配列番号２のＧＬＰ－１配列を含む任意の核酸を含む。別の実施形態では、これは、配列番号３のＧＬＰ－１配列を含む任意の核酸を含む。別の実施形態では、これは、配列番号４のＧＬＰ－１配列を含む任意の核酸を含む。別の実施形態では、これは、配列番号５のＧＬＰ－１配列を含む任意の核酸を含む。別の実施形態では、これは、配列番号６のＧＬＰ－１配列を含む任意の核酸を含む。

一実施形態では、本明細書に記載のＧＬＰ－１融合タンパク質をコードする核酸配列が提供される。別の実施形態では、これは、配列番号１４のＧＬＰ－１融合タンパク質をコードする任意の核酸配列を含む。

発現カセット
別の態様では、本明細書に記載のＧＬＰ－１融合タンパク質をコードする核酸を含む発現カセットが本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、「発現カセット」とは、生物学的に有用な核酸配列と、核酸配列（例えば、タンパク質、酵素、又は他の有用な遺伝子産物、ｍＲＮＡなどをコードする遺伝子ｃＤＮＡ）及びその遺伝子産物の転写、翻訳、並びに／若しくは発現を指示又は調節する、それと作動可能に連結される調節配列と、を含む、核酸分子を指す。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、核酸配列と連続又は非連続である調節配列（エレメントとも称される）及びトランス又はシス核酸配列で作用する調節配列の両方を含む。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写因子、転写終結因子、イントロン、翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、スライシング及びポリアデニル化配列などの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）翻訳後調節要素（ＷＰＲＥ）、及びＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。発現カセットは、他の要素の中で、遺伝子配列の上流（５’）の調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンなどのうちの１つ以上、及びエンハンサー、又は遺伝子配列の下流（３’）の調節配列、例えば、ポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含み得る。特定の実施形態では、調節配列は、遺伝子産物の核酸配列と作動可能に連結され、調節配列は、介在する核酸配列、すなわち、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）によって、遺伝子産物の核酸配列から分離される。特定の実施形態では、発現カセットは、１つ以上の遺伝子産物の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、モノシストロン性又はバイシストロン性発現カセットであり得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、標的細胞に挿入される外因性供給源からの１つ以上のＤＮＡ配列を指す。

一実施形態では、発現カセットは、ＧＬＰ－１構築物コード配列（例えば、ＧＬＰ－１融合タンパク質のコード配列）、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含んでいてもよく、このカセットは、遺伝要素に操作されてもよく、かつ／又はウイルスベクターのカプシド（例えば、ウイルス粒子）にパッケージングされてもよい。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノム（また「ベクターゲノム」とも称される）のパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載のＧＬＰ－１構築物配列と、本明細書に記載されるものなどの他の発現制御配列とを含む。本明細書に記載されるように、発現制御配列のいずれかは、例えば、コドン最適化を含む当該技術分野で既知の技法を使用して特定の種に対して最適化することができる。

特定の実施形態では、発現カセットは、構成的プロモーターを含む。別の実施形態では、ＣＢ７プロモーターが使用される。ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを有するニワトリβアクチンプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＣＢ７プロモーターは、配列番号３３の核酸配列を有する。一実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、配列番号２７の核酸配列である。

別の実施形態では、組織特異的プロモーターが使用される。あるいは、他の肝臓特異的プロモーター、例えば、ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，（ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ）に列挙されているものを使用してもよく、α１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、ヒトアルブミン（Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４ ３２（１９９７））、ｈｕｍＡｌｂ、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２ ９（１９９６））、ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、アルファ－アンチトリプシンプロモータ
ー、肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：２８０－２８９（２００８））、ＴＢＧ肝臓特異的プロモーターを含むが、これらに限定されない。ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能プロモーター（例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい）、又は生理学的キューに応答するプロモーターなどの他のプロモーターが使用され得、本明細書に記載されるベクターに利用され得る。

一実施形態では、プロモーターは、誘導性遺伝子発現系に含まれる。誘導性遺伝子調節／発現系は、少なくとも以下の成分、本明細書に記載されるＧＬＰ－１融合タンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター（調節可能プロモーターとも称される）、活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、及びジンクフィンガーホメオドメイン結合部位を含む。他の実施形態では、本明細書に更に記載されるように、追加の成分が発現系に含まれ得る。例示的な誘導性発現系の設計を示すプラスミドを、図４に示す。

系は、ＧＬＰ－１融合タンパク質のコード配列の上流にプロモーターを含む。ＣＭＶ及びＣＢ７プロモーターなどの本明細書に記載されるプロモーターが使用され得る。一実施形態では、プロモーターは、配列番号２７に示されるものなどのＣＭＶプロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、ＺＦＨＤ１及びＩＬ２最小プロモーターの結合部位の１２個の繰り返しコピーを含む、ユビキタス誘導性プロモーターＺ１２Ｉである。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３
Ａｕｇ；２４（４）：２７０－２７８を参照されたい（本明細書に組み込まれる）。

発現系は、活性化ドメインを含み、それは、好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインの上流に位置する。一実施形態では、活性化ドメインは、ＮＦ－カッパＢのｐ６５サブユニットからのカルボキシ末端と、ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインとの融合である。一実施形態では、活性化ドメインは、ヒト由来のＮＦ－カッパＢのｐ６５サブユニットからのカルボキシ末端に融合されたヒトＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインである。一実施形態では、ＦＲＢドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＦＲＢドメインは、配列番号２３の核酸配列によってコードされる配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ｐ６５サブユニットは、配列番号２６に示される配列を有する。一実施形態では、ｐ６５サブユニットは、配列番号２５の核酸配列によってコードされる配列番号２６に示される配列を有する。

誘導系は、融合タンパク質のコード配列を含む単一のベクター、又は２ベクター系に含まれ得る。ＧＬＰ１融合タンパク質を組み込む２ベクター（図６Ａ）及び１ベクター（図６Ｂ及び図７Ａ）系の例は、本明細書に記載されている。

一実施形態では、トランス活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間にリンカーがあり、リンカーは、Ｆ２Ａ又はＩＲＥＳであり得る。一実施形態では、リンカーは、ＩＲＥＳ又は２Ａペプチドから選択される。一実施形態では、リンカーは、切断可能な２Ａペプチドである。一実施形態では、リンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＧＴ２Ａ＿Ｖ１ペプチドを含む。一実施形態では、リンカーは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＧＴ２Ａ＿Ｖ２ペプチドを含む。一実施形態では、２Ａペプチドは、単一のベクター系を可能にするために、パッケージング限度を増加させるように選択される。

ＤＮＡ結合ドメインは、最大３つのコピーのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に接合されたジンクフィンガーホメオドメイン１（ＺＦＨＤ１）のＤＮＡ結合融合からなる。誘導剤、例えば、ラパマイシンなどのラパログの存在下で、ＤＮＡ結合ドメイン及び活
性化ドメインは、それらのＦＫＢＰ及びＦＲＢドメインの相互作用を介して二量体化され、導入遺伝子の転写活性化をもたらす。いくつかの実施形態では、ＺＦＨＤ１は、ＧＴ２Ａ又はＩＲＥＳとともにフレーム内に含まれる。一実施形態では、ＺＦＨＤ１は、配列番号２９に示される配列を有する。一実施形態では、ＺＦＨＤ１は、配列番号２８の核酸配列によってコードされる配列番号２８の配列を有する。

発現系は、ＦＫＢＰ配列の１、２、又は３つのコピー有するように設計される。これらは、本明細書では、ＦＫＢＰサブユニットと称される。一実施形態では、サブユニットは、組換えを最小限にするために、同じタンパク質を発現するように設計されるが、互いに異なる核酸を有するように設計される。例えば、配列番号３０は、ＦＫＢＰの３つの「揺らいだ」コード配列を提供し、これらの各々は、以下の配列番号３１に示される配列をコードする。ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＦＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ

発現系は、ジンクフィンガーホメオドメイン結合部位を更に含む。核酸分子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のＺＦＨＤに対する結合部位を含む。一実施形態では、発現系は、８個のジンクフィンガーホメオドメイン結合部位（結合パートナー）（８ＸＺＦＨＤ）を含む。しかしながら、本発明は、ジンクフィンガー結合部位の２～約１２個のコピーを有する発現系を包含する。ＺＦＨＤ結合部位の単一コピーの一例は、ａａｔｇａｔｇｇｇｃｇｃｔｃｇａｇｔ（配列番号３２）である。

いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーホメオドメイン結合部位の下流に最小ＩＬ２プロモーターがある。例示的なＩＬ２プロモーターは、配列番号１０に示される。

そのような誘導系は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ，Ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐａｇｅｓ １０２８－１０３２（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９６）及びＲｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ，Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＡＡＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，１５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００５，ｖｏｌｕｍｅ １０５，ｎｕｍｂｅｒ ４によって記載される、例えば、ラパマイシン誘導系を含み、これらの両方は、参照により本明に組み込まれる。一実施形態では、誘導性遺伝子発現系は、ＣＭＶプロモーターを含み、活性化ドメインは、ヒト由来のＮＦ－カッパＢのｐ６５サブユニットからのカルボキシ末端に融合されたヒトＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン、ＧＴ２Ａペプチド、ＺＦＨＤ１ ＤＮＡ結合ドメイン、３つのＦＫＢＰサブユニット、ｈＧＨポリＡ、８ＸＺＦＨＤ、及び最小ｓＩＬ２プロモーターである。これらの配列は、ＧＬＰ－１融合タンパク質のコード配列、及び任意選択で他の調節配列に加えられる。

プロモーターに加えて、発現カセット及び／又はベクターは、他の適切な転写開始配列、終結配列、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強させる配列、並びに必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強させる配列を含み得る。好適なポリＡ配列の例としては、例えば、ＳＶ４０、又はウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ウサギグロビンポリＡ
；ＲＧＢとも称される）、修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）、及びＴＫポリＡが挙げられる。好適なエンハンサーの例には、例えば、とりわけαフェトタンパク質エンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモータ／α１－マイクログロブリン／ビクニンエンハンサー）が含まれる。一実施形態では、ポリＡは、ウサギグロビンポリＡである。

これらの制御配列は、ＧＬＰ－１構築物配列に「作動可能に連結されている」。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、目的の遺伝子に連続している発現制御配列、及びトランスで又は離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を指す。

一実施形態では、５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター、ニワトリβアクチンイントロン、配列番号１４の融合タンパク質のコード配列、ウサギグロビンポリＡ、及び３’ＩＴＲを含むｒＡＡＶが提供される。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＣＭＶプロモーターを含むポリヌクレオチドを含み、活性化ドメインは、ヒト由来のＮＦ－カッパＢのｐ６５サブユニットからのカルボキシ末端に融合されたヒトＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン、ＧＴ２Ａペプチド、ＺＦＨＤ１ ＤＮＡ結合ドメイン、３つのＦＫＢＰサブユニット、ｈＧＨポリＡ、８ＸＺＦＨＤ、最小ｓＩＬ２プロモーター、配列番号１４のＧＬＰ－１融合タンパク質のコード配列、及びウサギベータグロビンポリＡである。

一実施形態では、ＣＢ７プロモーター、ニワトリベータ－アクチンイントロン、配列番号１４の融合タンパク質のコード配列、及びウサギグロビンポリＡを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットが提供される。一実施形態では、発現カセットは、配列番号３４に見出されるもの、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有する配列である。別の実施形態では、ベクターゲノムが提供されており、配列番号３４、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有する配列は、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲに隣接している。

別の実施形態では、ＣＢ７プロモーター、ニワトリベータ－アクチンイントロン、配列番号３７の融合タンパク質のコード配列、及びウサギグロビンポリＡを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットが提供される。一実施形態では、発現カセットは、配列番号３５に見出されるもの、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有する配列である。別の実施形態では、ベクターゲノムが提供されており、配列番号３５、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有する配列は、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲに隣接している。

別の実施形態では、ＣＭＶプロモーター、ヒト由来のＮＦ－カッパＢのｐ６５サブユニットからのカルボキシ末端に融合されたヒトＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン、ＧＴ２Ａペプチド、ＺＦＨＤ１ ＤＮＡ結合ドメイン、３つのＦＫＢＰサブユニット、８ＸＺＦＨＤ、最小ＩＬ２プロモーター、配列番号１４のＧＬＰ－１融合タンパク質のコード配列、及びウサギベータグロビンポリＡを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットが提供される。一実施形態では、発現カセットは、配列番号３８に見出されるもの、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有する配列である。別の実施形態では、ベクターゲノムが提供されており、配列番号３８、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有する配列は、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲに隣接してい
る。

別の実施形態では、ＣＭＶプロモーター、ヒト又はアカゲザル由来のＮＦ－カッパＢのｐ６５サブユニットからのカルボキシ末端に融合されたヒト又はアカゲザルＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン、ＧＴ２Ａペプチド、ＺＦＨＤ１ ＤＮＡ結合ドメイン、３つのＦＫＢＰサブユニット、８ＸＺＦＨＤ、最小ＩＬ２プロモーター、配列番号３７のＧＬＰ－１融合タンパク質のコード配列、及びウサギベータグロビンポリＡを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットが提供される。一実施形態では、発現カセットは、配列番号３９に見出されるもの、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有する配列である。別の実施形態では、ベクターゲノムが提供されており、配列番号３９、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有する配列は、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲに隣接している。

別の実施形態では、Ｚ１２Ｉプロモーター（１２個のＺＦＨＤ１部位及び最小ＩＬ２プロモーターを含む）、配列番号３７のＧＬＰ－１融合タンパク質のコード配列、及びウサギベータグロビンポリＡを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットが提供される。一実施形態では、発現カセットは、配列番号４０に見出されるもの、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有する配列である。別の実施形態では、ベクターゲノムが提供されており、配列番号４０、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有する配列は、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲに隣接している。ＣＭＶプロモーター、キメライントロン、ヒト又はアカゲザル由来のＮＦ－カッパＢのｐ６５サブユニットに融合されたヒト又はアカゲザルＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン、ＩＲＥＳ又は２Ａペプチド、ＺＦＨＤ１ ＤＮＡ結合ドメイン、３つのＦＫＢＰサブユニット、８ＸＺＦＨＤ、及びポリＡ配列を含むポリヌクレオチドを含む第２の発現カセットが提供される。一実施形態では、発現カセットは、配列番号４１に見出されるもの、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有する配列である。別の実施形態では、ベクターゲノムが提供されており、配列番号４１、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の同一性を共有する配列は、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲに隣接している。

ウイルスベクター
別の態様では、本明細書に記載の発現カセットを含むウイルスベクターが提供される。本明細書に記載のウイルスベクターの特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクター又は組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。本明細書で使用される場合の「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」という用語は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス、当業者に利用可能な、及び／又は本明細書に記載の組成物及び方法の観点において利用可能なアデノ随伴ウイルス、並びに人工ＡＡＶを指す。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶ ＤＮａｓｅ耐性粒子であり、ＡＡＶタンパク質カプシドの中に、標的細胞に送達するためのＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接した発現カセットがパッケージングされている（併せて「ベクターゲノム」と称される）。ＡＡＶカプシドは、６０カプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３からなり、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で二十面体対称に配置される。上述のＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として、様々なＡＡＶが選択されてもよい。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ９１カプシド又はそのバリアントである。特
定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名称で「ＡＡＶ」という用語の後の数値又は数値と文字との組み合わせによって指定される。特に明記しない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、及び他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、及びＡＡＶｈｕ６８．として特定されているＡＡＶを含む任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０－Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８－Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１及びＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、並びにＷＯ２００６／１１０６８９、及びＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２０１８／１６０５８２（ＡＡＶｈｕ６８）も参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる。他の好適なＡＡＶには、ＡＡＶｒｈ９０［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２７３］、ＡＡＶｒｈ９１［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／０３０２６６、現在の公報ＷＯ２０２０／２２３２３１、公開日２０２０年１１月５日］ＡＡＶｒｈ９２、ＡＡＶｒｈ９３、ＡＡＶｒｈ９１．９３［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２８１］が含まれ得るが、これらに限定されず、これらは参照により本明細書に組み込まれる。他の好適なＡＡＶには、２０１９年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９２４，１１２号、及び２０２０年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０２５，７５３号に記載されるＡＡＶ３Ｂバリアントが含まれ、そこには、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０１、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０２、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０３、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０４、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０５、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０６、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０７、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０８、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１０、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１１、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１２、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１３、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１４、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１５、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１６、又はＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１７が記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年８月１３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／４５９４５号、２０２０年８月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／０６５，６１６号、及び２０２０年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１０９，７３４号を参照にされたく、これらはすべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの文書はまた、ｒＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶカプシドについても記載されており、参照により組み込まれる。ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離又は操作され、十分に特徴付けられたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２は、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、種々の標的組織及び動物モデルにおける効率的な遺伝子導入実験に広く使用されている。

本明細書で使用される場合、ＡＡＶに関して、「バリアント」という用語は、既知のＡＡＶ配列に由来する任意のＡＡＶ配列を意味し、保存的アミノ酸置換を有するＡＡＶ配列、及びアミノ酸配列又は核酸配列にわたって少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％以上の配列同一性を共有するＡＡＶ配列を含む。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、任意の記載又は既知のＡＡＶカプシド配列から最大約１０％のバリエーションを含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶカプシドは、本明細書に提供され、かつ／又は当該技術分野で既知のＡＡＶカプシドと、約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性、又は約９７％～約９８％の同一性を共有する。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶカプシドの同一性パーセントを決定する場合、比較は、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３）のうちのいずれかにわたって行われ
得る。

一実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ８のカプシド又はその機能的バリアントを有するｒＡＡＶである。一実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶｒｈ９１のカプシド又はその機能的バリアントを有するｒＡＡＶである。一実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ３．ＡＲ．２．１２のカプシド又はその機能的バリアントを有するｒＡＡＶである。一実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ３７、又はＡＡＶｒｈ１０から選択されるカプシドを有するｒＡＡＶである。

特定の実施形態では、新規の単離されたＡＡＶｒｈ９１カプシドが提供される。ＡＡＶｒｈ９１カプシドをコードする核酸配列は、配列番号１８に提供され、コードされたアミノ酸配列は、配列番号２０に提供される。ＡＡＶｒｈ９１（配列番号２０）のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３のうちの少なくとも１つを含むｒＡＡＶが、本明細書に提供される。また、ＡＡＶｒｈ９１（配列番号１８）のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３のうちの少なくとも１つによってコードされるＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶも、本明細書に提供される。なお別の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１アミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号１９に提供され、コードされたアミノ酸配列は、配列番号２０に提供される。また、ＡＡＶｒｈ９１ｅｎｇ（配列番号１９）のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３のうちの少なくとも１つによってコードされるＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶも、本明細書に提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１、ｖｐ２、及び／又はｖｐ３は、ＡＡＶｒｈ９１（配列番号２０）の完全長カプシドタンパク質である。他の実施形態では、ｖｐ１、ｖｐ２、及び／又はｖｐ３は、Ｎ末端及び／又はＣ末端の切断（例えば、約１～約１０個のアミノ酸の切断）を有する。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドは、（１）配列番号２０の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号１８から産生されるｖｐ１タンパク質、若しくは配列番号２０の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２０の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号１８の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、若しくは配列番号２０の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１８の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ２タンパク質の異種集団、配列番号２０の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号１８の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、若しくは配列番号２０の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１８の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ３タンパク質の異種集団、並びに／又は（２）配列番号２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２０の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号２０の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団、を含み、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質が、配列番号２０のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択で、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、ＡＡＶｒｈ９１カプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む、ＡＡＶｒｈ９１カ
プシド、並びに（Ｂ）ＡＡＶｒｈ９１カプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸分子、及び宿主細胞における産物の発現を指示する配列に作動可能に連結された産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノム、のうちの１つ以上を特徴とする。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドは、（１）配列番号２０の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号１９から産生されるｖｐ１タンパク質、若しくは配列番号２０の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１９と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２０の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号１９の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、若しくは配列番号２０の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１９の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ２タンパク質の異種集団、配列番号２０の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号１９の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、若しくは配列番号２０の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１９の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ３タンパク質の異種集団、並びに／又は（２）配列番号２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２０の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号２０の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団、を含み、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質が、配列番号２０のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択で、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、ＡＡＶｒｈ９１カプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む、ＡＡＶｒｈ９１カプシド、並びに（Ｂ）ＡＡＶｒｈ９１カプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸分子、及び宿主細胞における産物の発現を指示する配列に作動可能に連結された産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノム、以下のうちの１つ以上を特徴とする。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、配列番号２０のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択で、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸変化をもたらす。配列番号２０の数と比較して、Ｎ－Ｇ対のＮ５７、Ｎ３８３、及び／又はＮ５１２で、高いレベルの脱アミド化が観察される。脱アミド化は、他の残基において観察されている。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１は、脱アミド化された他の残基を有し得（例えば、典型的には１０％未満）、かつ／又はリン酸化（例えば、存在する場合、約２～約３０％、若しくは約２～約２０％、若しくは約２～約１０％の範囲で）（例えば、Ｓ１４９で）、又は酸化（例えば、～Ｗ２２、～Ｍ２１１、Ｗ２４７、Ｍ４０３、Ｍ４３５、Ｍ４７１、Ｗ４７８、Ｗ５０３、～Ｍ５３７、～Ｍ５４１、～Ｍ５５９、～Ｍ５９９、Ｍ６３５、及び／若しくはＷ６９５のうちの１つ以上で）を含む他の修飾を有し得る。任意選択で、Ｗは、キヌレニンに酸化し得る。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドは、上記の表で特定される１つ以上の位置、提供される範囲で修飾されており、トリプシン酵素を用いた質量分析を使用して決定される。特定の実施形態では、１つ以上の位置、又はＮに続くグリシンは、本明細書に記載されるように修飾されている。残基番号は、本明細書に提供されるＡＡＶｒｈ９１配列に基づく。配列番号２０を参照されたい。

特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ９１カプシドは、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２０の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号２０の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。

特定の実施形態では、修飾ＡＡＶｒｈ９１の核酸配列は、天然ＡＡＶｒｈ９１カプシドよりも低い脱アミド化を含むカプシドを有する変異体ｒＡＡＶを生成するために使用され得る。かかる変異ｒＡＡＶは、免疫原性が低下しており、かつ／又は貯蔵、特に懸濁形態での貯蔵の際の安定性を増加させ得る。

一態様では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、アデノ随伴ウイルスｒｈ９１に由来するＡＡＶカプシドと、ＡＡＶカプシドにパッケージングされたベクターゲノムとを含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、配列番号１４のＧＬＰ－１受容体アゴニストのコード配列、及びＧＬＰ－１受容体アゴニストの発現を指示する調節配列を含む。

一実施形態では、ｒＡＡＶは、ｓｃＡＡＶである。略称「ｓｃ」は、自己相補性（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）を指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている発現カセットを有するプラスミド又はベクターを指す。感染時には、第２の鎖の細胞媒介性合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補性の片割れが会合して、即時の複製及び転写に備えのある１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成するであろう。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ
（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １
６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補的なＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、本明細書に記載されるＧＬＰ－１構築物をコードする核酸配列は、任意の好適な遺伝子エレメント、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、エピソームなどに操作され、それらは、例えば、パッケージング宿主細胞中でＤＮＡ又はＲＮＡウイルスベクター運ぶナノ粒子を生成するために、及び／又は対象の宿主細胞への送達のために、その上に担持されるＧＬＰ－１配列を宿主細胞へと導入する。一実施形態では、遺伝子エレメントは、プラスミドである。選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ又はｒＡＡＶ）が産生プラスミドから産生されるパッケージング細胞株を指し得る。代替的に、「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載の遺伝子産物の発現が望まれる任意の標的細胞を指し得る。したがって、「宿主細胞」は、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合によって細胞に導入された外因性又は異種ＤＮＡを含有する原核細胞又は真核細胞（例えば、バクテリア細胞、ヒト細胞、若しくは昆虫細胞）を指す。本明細書の特定の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載される組成物のインビトロ評価のための様々な哺乳動物種の細胞の培養物を指す。本明細書の他の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、ウイルスベクター又は組換えウイルスを生成及びパッケージングするために使用される細胞を指す。更なる一実施形態では、「宿主細胞」という用語は、腸細胞、小腸細胞、膵臓細胞、肝臓細胞である。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、異種核酸配列又はタンパク質の発現が所望される任意の標的細胞を指す。一実施形態では、標的細胞は、肝臓細胞である。一実施形態では、標的細胞は、筋細胞である。

一実施形態では、発現カセットを含むベクターゲノムを含むｒＡＡＶが提供されており、発現カセットは、ＣＭＶプロモーターを含み、活性化ドメインは、ヒト由来のＮＦ－カッパＢのｐ６５サブユニットからのカルボキシ末端に融合されたヒトＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン、ＧＴ２Ａ＿Ｖ１ペプチド、ＺＦＨＤ１ ＤＮＡ結合ドメイン、３つのＦＫＢＰサブユニット、ｈＧＨポリＡ、８ＸＺＦＨＤ、最小ｓＩＬ２プロモーター、配列番号１４のＧＬＰ－１融合タンパク質のコード配列、及びウサギベータグロビンポリＡである。別の実施形態では、発現カセットを含むベクターゲノムを含むｒＡＡＶが提供されており、発現カセットは、ＣＭＶプロモーターを含み、活性化ドメインは、ヒト由来のＮＦ－カッパＢのｐ６５サブユニットからのカルボキシ末端に融合されたヒトＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン、ＧＴ２Ａ＿Ｖ２ペプチド、ＺＦＨＤ１ ＤＮＡ結合ドメイン、３つのＦＫＢＰサブユニッ
ト、ｈＧＨポリＡ、８ＸＺＦＨＤ、最小ｓＩＬ２プロモーター、配列番号１４のＧＬＰ－１融合タンパク質のコード配列、及びウサギベータグロビンポリＡである。

発現カセットをＡＡＶウイルス粒子にパッケージングするために必要な最小限の配列は、ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲであり、これらは、カプシドと同じＡＡＶ起源であってもよく、又は（ＡＡＶ擬似型を作製するために）異なるＡＡＶ起源であってもよい。一実施形態では、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列、又はその欠失型バージョン（ΔＩＴＲ）が、利便性のため、及び規制承認を加速させるために使用される。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択され得る。好ましくは、ＩＴＲの供給源は、製造のためにトランスで提供されるＲｅｐタンパク質の供給源と同じである。典型的には、ＡＡＶベクターのための発現カセットは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲと、ＧＬＰ－１融合タンパク質コード配列と、任意の調節配列と、ＡＡＶ ３’ＩＴＲと、を含む。しかしながら、これらのエレメントの他の構成も好適であり得る。Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。

発現カセットをビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、遺伝子と同じ構築物中のシスで必要とされる唯一のＡＡＶ構成要素である。一実施形態では、複製（ｒｅｐ）及び／又はカプシド（ｃａｐ）のコード配列は、ＡＡＶベクターを生成するために、ＡＡＶゲノムから除去され、トランスで供給されるか又はパッケージング細胞株によって供給される。例えば、上述のように、疑似型ＡＡＶは、ＡＡＶカプシドの供給源とは異なる供給源からのＩＴＲを含有し得る。一実施形態では、キメラＡＡＶカプシドが利用されてもよい。更に他のＡＡＶ成分が選択され得る。このようなＡＡＶ配列の供給源は、本明細書で記載されており、かつ学術的、商業的、又は公的資源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離又は入手することができる。ＡＡＶ配列は、文献又はデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）などで利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成又は他の好適な手段を通して入手され得る。

対象に送達するのに適したＡＡＶウイルスベクターを生成し、単離するための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、及びＵＳ７５８８７７２Ｂ２］を参照されたい。１つの系では、プロデューサー細胞株は、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物、並びにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物で一過性にトランスフェクトされる。第２の系では、ｒｅｐ及びｃａｐを安定的に供給するパッケージング細胞株は、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物で一過性にトランスフェクトされる。これらの系の各々では、ＡＡＶビリオンは、ヘルパーアデノウイルス又はヘルペスウイルスへの感染に応答して産生され、ｒＡＡＶを汚染ウイルスから分離することを必要とする。より最近では、ＡＡＶを復元するためにヘルパーウイルスへの感染を必要としない系が開発されており、必要なヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４、又はヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、並びにヘルペスウイルスポリメラーゼ）もまた、トランスで系によって供給される。これらのより新しい系では、ヘルパー機能は、必要とされるヘルパー機能をコードする構築物での細胞の一過性トランスフェクションによって供給され得るか、又は細胞は、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定的に含有するように操作され得、その発現は、転写レベル又は転写後レベルで制御され得る。更に別の系では、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子は、バキュロウイルス由来のベクターによる感染によって、昆虫細胞に導入される。これらの産生系に関するレビューについては、概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ
ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたく、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。これら及び他のＡＡＶ産生系を作製及び使用する方法はまた、以下の米国特許に記載されており、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，” Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、及び以下に引用される参考文献を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の任意の実施形態を構築するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを産生する方法は周知であり、適切な方法の選択は、本発明を限定するものではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。

本明細書に記載のｒＡＡＶは、内側にパッケージングされたベクターゲノムを有する選択されたカプシドを含む。ベクターゲノム（又はｒＡＡＶゲノム）は、５’及び３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、及び融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の宿主細胞のゲノムへの挿入を指示する調節配列を含む。一実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１６に示される配列、又はそれと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の同一性を共有する配列である。

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するパルボウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）カプシドの内側にパッケージングされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含有する。本明細書の例では、ベクターゲノムは、少なくとも５’から３’に、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、コード配列（すなわち、導入遺伝子）、及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。ＡＡＶ２からのＩＴＲ、カプシドとは異なる供給源ＡＡＶ、又は全長ＩＴＲ以外が選択され得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能又はトランス相補性ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。更に、他のＩＴＲ、例えば、自己相補的（ｓｃＡＡＶ）ＩＴＲが使用され得る。一本鎖ＡＡＶ及び自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶの両方がｒＡＡＶに含まれる。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、又は他の遺伝子産物をコードするベクター配列とは異種の核酸コード配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で調節要素に作動可能に連結される。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。一実施例では、「ベクターゲノム」は、最低限でも５’から３’に、ベクター特異的配列と、（標的配列においてその発現を指示する）調
節制御配列に作動可能に連結されたＧＬＰ－１構築物をコードする核酸とを含み、ベクター特異的配列は、ベクターゲノムをウイルスベクターカプシド又はエンベロープタンパク質に特異的にパッケージングする末端反復配列であり得る。例えば、ＡＡＶ逆位末端反復は、ＡＡＶ及び特定の他のパルボウイルスカプシドにパッケージングするために利用される。

ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’及び３’逆位末端反復配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ “Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、ＩＴＲをコードする実質的に完全な配列が分子中で使用されるが、これらの配列のある程度の最小限の修飾は許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当業者の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で使用されるこのような分子の一例は、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドであり、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節エレメントは、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するのとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列である。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択され得る。Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、外部Ａエレメントが欠失している、１３０塩基対の短縮ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。理論に拘束されたくはないが、短縮されたＩＴＲは、内部（Ａ’）要素を鋳型として使用して、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型長に戻されると考えられる。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。しかしながら、これらのエレメントの他の構成も好適であり得る。

任意選択で、本明細書に記載されるＧＬＰ－１構築物は、ｒＡＡＶ以外のウイルスベクターを介して送達されてもよい。かかる他のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなどを含むが、これらに限定されない、遺伝子療法に好適な任意のウイルスが含まれ得る。好適には、これらの他のベクターのうちの１つが生成される場合、それは、複製欠損ウイルスベクターとして産生される。

「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」は、合成又は人工ウイルス粒子を指し、ここで、目的の遺伝子を含有する発現カセットは、ウイルスカプシド又はエンベロープ中にパッケージされ、ウイルスカプシド又はエンベロープ内にパッケージされた任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損である、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含む「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。

本明細書に記載のウイルスベクター構築物を含む組成物も提供される。本明細書に記載
の薬学的組成物は、任意の好適な経路又は異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象に送達されるように設計される。肝臓への直接送達（任意選択で、静脈内、肝動脈を介して、又は移植によって）、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、及び他の非経口投与経路。本明細書に記載のウイルスベクターは、単一の組成物又は複数の組成物で送達されてもよい。任意選択で、２つ以上の異なるＡＡＶ、又は複数のウイルスが送達され得る［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３を参照されたい］。別の実施形態では、複数のウイルスは、異なる複製欠陥ウイルス（例えば、ＡＡＶ及びアデノウイルス）を含有し得る。一実施形態では、投与は、筋肉内である。別の実施形態では、投与は、静脈内である。

複製欠陥ウイルスは、遺伝子導入及び遺伝子療法用途で使用するための生理学的に許容される担体とともに製剤化することができる。ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量化を、製剤中に含有される用量の尺度として使用し得る。当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定することができる。ＡＡＶのＧＣ数滴定を行うための１つの方法は、以下の通りである。精製されたＡＡＶベクター試料は、まずＤＮａｓｅで処理され、非カプシド化ＡＡＶゲノムＤＮＡ又は産生プロセスからの汚染プラスミドＤＮＡを排除する。次いで、ヌクレアーゼ耐性粒子を熱処理に供して、カプシドからゲノムを放出させる。次に、ウイルスゲノムの特定の領域（通常はポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブセットを使用したリアルタイムＰＣＲによって、放出されたゲノムを定量化する。ゲノムコピーを決定するための別の好適な方法は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、特に最適化されたｑＰＣＲ又はデジタル液滴ＰＣＲである［Ｌｏｃｋ Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｐｒｉｌ ２０１４，２５（２）：１１５－１２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１、編集に先立ちオンラインで公開、２０１３月１２月１３日］。

また、複製欠損ウイルス組成物は、約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１５ＧＣの範囲にある量の複製欠損ウイルスを含む投与量単位で製剤化することができる。別の実施形態では、この量のウイルスゲノムは、分割用量で送達され得る。一実施形態では、用量は、約７０ｋｇの平均ヒト対象について、約１．０×１０^１０ＧＣ～約３．０×１０^１４ＧＣである。別の実施形態では、用量は、約１×１０^９ＧＣである。例えば、ＡＡＶウイルスの用量は、約１×１０ ^１０ＧＣ、１×１０^１１ＧＣ、約５×１０^１１ＧＣ、約１×１０^１２ＧＣ、約５×１０^１２ＧＣ、又は約１×１０^１３ＧＣであり得る。別の実施形態では、投薬量は、ヒト対象について、約１．０×１０^９ＧＣ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ＧＣ／ｋｇである。別の実施形態では、約１×１０^９ＧＣ／ｋｇの用量。例えば、ＡＡＶウイルスの用量は、約１×１０^１０ＧＣ／ｋｇ、１×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、約５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、約１×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、約５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、又は約１×１０^１３ＧＣ／ｋｇであり得る。一実施形態では、構築物は、１μＬ～約１００ｍＬの体積で送達され得る。本明細書で使用される場合、「投薬量」又は「量」という用語は、対象に治療の過程で送達される総投薬量若しくは総量、又は単一単位（又は複数単位若しくは分割投薬量）投与で送達される投薬量若しくは量を指し得る。

上述の組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。好ましくは、生理学的に適合性のある担体に懸濁されたｒＡＡＶは、ヒトを含む所望の対象に投与され得る。好適な担体は、導入ウイルスが指向する適応症の観点で、当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝化溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を用いて製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。担体の選択は、本発明の制限ではない。

別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤及び／又はアジュバントを含む。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、食塩水、界面活性剤、並びに薬学的及び／又は生理学的に適合性のある塩、又は塩の混合物を含有する水性溶液中に好適に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、又はｐＨ６．０～７．５、又はｐＨ６．２～７．７、又はｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、又はｐＨ７．２～７．８、又は約ｐＨ７．０の範囲に調整される。特定の実施形態では、製剤は、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、又は約７．８のｐＨに調整される。特定の実施形態では、髄腔内送達の場合、約７．２８～約７．３２、約６．０～約７．５、約６．２～約７．７、約７．５～約７．８、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、又は約７．８のｐＨが望ましい可能性がある。特定の実施形態では、静脈送達のためには、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい場合がある。しかしながら、より広範囲にある他のｐＨ、及びこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。

任意選択で、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び／又はバリアント及び担体（複数可）に加えて、防腐剤又は化学的安定剤などの他の従来の薬学的成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学的安定剤には、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。

本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の及びすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足活性成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギー又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、ミクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などのような送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。詳細には、ｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、又はナノ粒子などに封入化された送達のいずれかのために製剤化され得る。

一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨ及び塩濃度に緩衝される水性液体懸濁液である。任意選択で、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され、投与時に再構築されてもよい。

好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、８４００の平均分子量を有する、ポロキサマー１８８としても知られている、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、第一級ヒドロキシル基末端の二機能的ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエ
ーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含む。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）の後に３桁の数字で命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与え、最後の１桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与える。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在してもよい。

ベクターの用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なる。例えば、ウイルスベクターの治療上有効なヒト投薬量は、概して、約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの範囲の、（体重が７０ｋｇの平均的な対象を治療するために）約１×１０^９～１×１０^１６ゲノムウイルスベクターの濃度（その範囲内のすべての整数又は分数量を含み、好ましくは、ヒト患者に対して、１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１３ＧＣ）を含む溶液である。本発明の組成物は、治療される領域のサイズ、使用されるウイルス力価、投与経路、及び本方法の所望の効果に応じて、範囲内のすべての数値を含めて、約０．１μＬ～約１０ｍＬの容量で送達され得る。一実施形態では、容量は、約５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１７５μＬである。更に別の実施形態では、容量は、約２００μＬである。別の実施形態では、容量は、約２５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約３００μＬである。別の実施形態では、容量は、約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約５００μＬである。別の実施形態では、容量は、約６００μＬである。別の実施形態では、容量は、約７５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約８５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１０００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約２ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約２．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約３ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約３．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約４ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約５．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約６ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約６．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約７ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約８ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約８．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約９ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約９．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約１０ｍＬである。

いくつかの実施形態では、調節配列の制御下にある所望の導入遺伝子をコードする核酸配列を有する組換えアデノ随伴ウイルスの濃度は、組成物中、望ましくは、１ミリリットル当たり約１０^７～１０^１４個のベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）（ゲノムコピー／ｍＬ（ＧＣ／ｍＬ）とも称される）の範囲である。

一実施形態では、組成物中のｒＡＡＶの投薬量は、体重の約１．０×１０^９ＧＣ／ｋｇ～約１．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇである。一実施形態では、投薬量は、約１．０×１０^１０ＧＣ／ｋｇである。一実施形態では、投薬量は、約１．０×１０^１１ＧＣ／ｋｇである。一実施形態では、投薬量は、約１．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇである。一実施形態では、投薬量は、約５．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇである。一実施形態では、投薬量は、約１．０×１０^１３ＧＣ／ｋｇである。本明細書に記載のすべての範囲は、エンドポイントを含む。

一実施形態では、有効投薬量（送達される総ゲノムコピー）は、約１０^７～１０^１３ベクターゲノムである。一実施形態では、総投与量は、約１０^８ゲノムコピーである。一実
施形態では、総投与量は、約１０^９ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^１０ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^１１ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^１２ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^１３ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^１４ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０^１５ゲノムコピーである。

毒性などの望ましくない効果のリスクを低減するために、ウイルスの最低有効濃度を利用することが望ましい。更に、これらの範囲の他の投与量及び投与容量は、治療される対象（好ましくは、ヒト）の身体状態、対象の年齢、特定の障害、及び進行性の場合、発症した障害の程度を考慮して、主治医によって選択され得る。

特定の実施形態では、組成物は、誘導性ＧＬＰ－１アゴニスト構築物を含むｒＡＡＶを含む。特定の実施形態では、誘導剤又は分子は、ラパマイシン又はラパログである。特定の実施形態では、誘導剤はラパマイシンであり、ｒＡＡＶを含む組成物の後に少なくとも１回以上、少なくとも２回以上、少なくとも３回以上投与される。いくつかの実施形態では、ラパマイシンは、少なくとも約４～少なくとも約４０ｎＭの用量で投与される。特定の実施形態では、誘導剤（すなわち、ラパマイシン）は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ～少なくとも約３．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態では、誘導剤（すなわち、ラパマイシン）は、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ～少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

本明細書に記載されるウイルスベクター及び他の構築物は、ＧＬＰ－１融合タンパク質構築物をそれを必要とする対象に送達するための、半減期が増加したＧＬＰ－１を対象に供給するための、及び／又は対象におけるＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病若しくはメタボリックシンドロームを治療するための医薬を調製するために使用されてもよい。したがって、別の態様では、糖尿病を治療する方法が提供される。本方法は、本明細書に記載される組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＧＬＰ－１融合タンパク質発現カセットを含有するウイルスベクターを含む。

本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」という用語は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、又はメタボリックシンドロームの１つ以上の症状を軽減する目的で、本明細書に記載される１つ以上の化合物又は組成物を対象に投与することを包含すると定義される。したがって、「治療」は、所与の対象において、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、又はメタボリックシンドロームの進行を低減すること、症状の重症度を低減すること、疾患の進行を遅延させること、又は療法の有効性を増加させること、のうちの１つ以上を含み得る。

本明細書で使用される場合、「寛解」という用語は、対象がもはや糖尿病の臨床的徴候を示さず、正常な血糖値を有する場合に、インスリン治療を中止する能力を指す。

別の実施形態では、対象におけるＴ２ＤＭを治療する方法が提供される。方法は、本明細書に記載される融合タンパク質をコードする配列を含む核酸分子を含むウイルスベクターを投与することを含む。一実施形態では、対象は、ヒトである。

別の態様では、対象における代謝性疾患を治療する方法が提供される。本方法は、本明細書に記載される組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＧＬＰ－１融合タンパク質発現カセットを含有するウイルスベクターを含む。一実施形態では、代謝性疾患は、Ｉ型糖尿病である。一実施形態では、代謝性疾患は、ＩＩ型糖尿病である。一実施形態では、代謝性疾患は、メタボリ
ックシンドロームである。一実施形態では、対象は、ヒトである。

別の態様では、対象において体重を減少させる方法が提供される。本方法は、本明細書に記載される組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＧＬＰ－１融合タンパク質発現カセットを含有するウイルスベクターを含む。

治療の経過は、任意選択で、同じウイルスベクター（例えば、ＡＡＶｒｈ９１ベクター）又は異なるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶｒｈ９１及びＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１２）の反復投与を伴ってもよい。本明細書に記載のウイルスベクターを使用して、更に他の組み合わせが選択されてもよい。任意選択で、本明細書に記載の組成物は、他の糖尿病薬又はタンパク質ベースの療法（例えば、ＧＬＰ－１類似体、インスリン、経口抗高血糖薬（スルホニル尿素、ビグアナイド、チアゾリジンジオン、及びアルファグルコイダーゼ阻害剤）を含む）を含むレジメンで組み合わせることができる。任意選択で、本明細書に記載される組成物は、食事療法及び運動療法を含む生活習慣の変化を伴うレジメンにおいて組み合わされてもよい。特定の実施形態では、ＡＡＶベクター及び併用療法は、本質的に同時に投与される。他の実施形態では、ＡＡＶベクターが初めに投与される。特定の実施形態では、併用療法が初めに投与される。

一実施形態では、組成物は、有効量のインスリンと組み合わせて投与される。限定されないが、プロタミン亜鉛組換えヒトインスリン（ＰｒｏＺｉｎｃ（登録商標））、ブタインスリン亜鉛懸濁液（Ｖｅｔｓｕｌｉｎ（登録商標））、インスリングラルギン（Ｌａｎｔｕｓ（登録商標））、リスプロ（Ｈｕｍａｌｏｇ）、アスパルト（Ｎｏｖｏｌｏｇ）、グルリジン（Ａｐｉｄｒａ）、ノボリン、及びヴェロスリンを含む、種々の市販のインスリン製品が、当該技術分野で既知である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶとインスリンとの組み合わせは、ウイルスベクターでの治療前と比較して、対象におけるインスリン用量要件を減少させる。そのような用量要件は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上低減され得る。治療する医師は、対象が必要とするインスリンの正しい投薬量を決定することができる。例えば、対象は、インスリン又は他の療法を使用して治療されてもよく、治療医は、ＡＡＶベクターの投与時に継続してもよい。かかるインスリン又は他の併用療法は、その後、必要に応じて、継続、低減、又は中止されてもよい。

一実施形態では、遺伝子療法のための本明細書に記載の発現カセット、ベクターゲノム、ｒＡＡＶを含む組成物、又は他の組成物は、患者当たり単回用量として送達される。一実施形態では、対象は、治療有効量の本明細書に記載の組成物を送達される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、治療目標を達成するために十分なＧＬＰ１－Ｆｃの量を標的細胞に送達して発現する、発現カセット若しくはベクター、又はその組み合わせの量を指す。治療有効量は、治療医によって選択され得るか、又は以前に決定されたガイドラインに基づいてガイドされ得る。例えば、デュラグルチドは、週に１回、０．７５ｍｇの初期用量で皮下に提供され得る。用量は、追加の血糖コントロールのために、１．５ｍｇ単位で増加してもよい。患者は、用量を週に１回３ｍｇに増加させる前に、少なくとも４週間、週に１回１．５ｍｇの用量に留まるべきである。患者は、用量を週に１回４．５ｍｇに増加させる前に、少なくとも４週間、週に１回３ｍｇの用量に留まるべきである。デュラグルチドの維持用量は、週に１回０．７５～４．５ｍｇの皮下で、最大用量は毎週４．５ｍｇであり得る。ｒＡＡＶは、対象に送達され、その後、必要に応じて、経口又は皮下のデュラグルチド、インスリン、又は他の薬物を補充して、毎週０．７５～４．５ｍｇの所望の投薬量の当量に到達させてもよい。

特定の実施形態では、治療目標は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、又はメタボリックシンドロームの症状のうちの１つ以上を緩和又は治療することである。「治療有効量」は、ヒト患者ではなく動物モデルに基づいて決定されてもよい。別の実施形態では、治療目標は、対象の代謝性疾患の寛解である。本明細書で使用される場合、ｖｐカプシドタンパク質を指すために使用されるとき、「異種」という用語又はその任意の文法的変形は、例えば、異なる改変アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。配列番号２０は、ＡＡＶｒｈ９１ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、予測されたアミノ酸残基の修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含む。これらの亜集団は、最低限、特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対における少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸変化及び他の任意選択的な修飾をもたらす。

本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから、参照群のすべてのメンバーよりも少ないメンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、少なくとも１つのｖｐ１タンパク質であり、すべてのｖｐ１タンパク質よりも少ない。ｖｐ３の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、１つのｖｐ３タンパク質から、すべてのｖｐ３タンパク質よりも少なくてもよい。例えば、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別の亜集団であり得、ｖｐ３はなお、ｖｐタンパク質の更なる亜集団である。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含み得る。

本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶの「ストック」は、ｒＡＡＶの集団を指す。脱アミド化に起因するカプシドタンパク質の不均一性にもかかわらず、ストック内のｒＡＡＶは、同一のベクターゲノムを５つ共有することが予想される。ストックは、例えば、選択されたＡＡＶカプシドタンパク質及び選択された産生系に特徴的な不均一な脱アミド化パターンを有するカプシドを有するｒＡＡＶを含み得る。ストックは、単一の産生系から産生されてもよく、又は産生系の複数の実行からプールされてもよい。本明細書に記載されるものを含むが、これらに限定されない様々な産生系が選択され得る。本明細書で使用される場合、「ＧＬＰ－１構築物」、「ＧＬＰ－１発現構築物」、及び同義語は、リーダー及び融合ドメインと組み合わせて本明細書に記載されるＧＬＰ－１配列を含む。「ＧＬＰ－１構築物」、「ＧＬＰ－１発現構築物」という用語、及び同義語は、ＧＬＰ－１融合タンパク質をコードする核酸配列又はその発現産物を指すために使用され得る。

核酸配列の文脈において、「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、又は「同一パーセント」という用語は、対応のために整列させたときに同じである２つの配列中の塩基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、又は、少なくとも約１００～１５０個のヌクレオチドの断片にわたってもよく、又はこれが所望される。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個の
ヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。多重配列整列プログラムはまた、核酸配列についても利用可能である。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会及び検索配列の間の最良の重複領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、本明細書に参考として組み込まれる、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１で提供される、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）を用いるＦａｓｔａ（商標）を使用して決定することができる。

「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％を超える同一性を意味する。同一性は、当業者に既知のアルゴリズム及びコンピュータプログラムを用いることによって、当業者によって容易に決定される。

上限範囲で特に明記しない限り、同一性のパーセンテージは、同一性の最小レベルであり、参照配列に対して最大１００％の同一性までのすべてのより高いレベルを包含することが理解されるであろう。特に明記しない限り、同一性のパーセンテージは、同一性の最小レベルであり、参照配列に対して最大１００％の同一性までのすべてのより高いレベルを包含することが理解されるであろう。例えば、「９５％の同一性」及び「少なくとも９５％の同一性」は、互換的に使用され得、参照配列に対する９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最大１００％の同一性、及びそれらの間のすべての画分を含む。

アミノ酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、又は「同一なパーセント」という用語は、対応するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。同一性パーセントは、タンパク質の全長ポリペプチド、ポリペプチド、約７０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、若しくはそのペプチド断片にわたるアミノ酸配列、又は配列をコードする対応する核酸配列について容易に決定することができる。好適なアミノ酸フラグメントは、長さが少なくとも約８個のアミノ酸であり得、最大で約１５０個であり得る。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、又は「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、又は「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列された」配列又は「整列」とは、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損又は追加塩基又はアミノ酸についての補正を含む。整列は、公的又は商業的に利用可能な様々な多重配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。配列整列プログラムは、アミノ酸配列について利用可能であり、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムが挙げられる。一般的に、これらのプログラムのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者は、これらの設定を必要に応じて変更し得る。あるいは、当業者は、参照のアルゴリズム及びプログラムによって提供されるものと少なくとも同じレベルの同一性又は整列を提供する、別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（
１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「なっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語、及びその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。明細書中の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語を使用して提示されるが、他の状況下では、関連する実施形態は、「～からなる」又は「～から本質的になる」という言語を使用して解釈され、記載されることも意図している。

本明細書で使用される場合、「患者」又は「対象」は、哺乳動物を意味し、ヒト、獣医学用動物又は農業用動物、家庭用動物又は愛玩動物、並びに通常臨床研究に使用される動物が含まれる。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、ヒトである。別の実施形態では、対象は、ネコではない。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照から１０％（±１０％、例えば、±１、±２、±３、±４、±５、±６、±７、±８、±９、±１０、又はそれらの間の値）の可変性を意味する。

特定の例では、「Ｅ＋＃」という用語又は「ｅ＋＃」という用語は、指数を指すために使用される。例えば、「５Ｅ１０」又は「５ｅ１０」は、５×１０^１０である。これらの用語は、同義的に使用され得る。

本明細書で使用される「調節」又はその変形形態という用語は、生物学的経路の１つ以上の成分を阻害する組成物の能力を指す。

本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、及び「状態」は、対象における異常な状態を示すために互換的に使用される。

本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって、及び本明細書で使用される多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する、公開された文献を参照することによって、一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

一実施形態を説明する際の「一実施形態」又は「別の実施形態」への言及は、別段の明示的な指定がない限り、参照される実施形態が別の実施形態（例えば、参照される実施形態の前に説明される実施形態）と相互に排他的であることを意味するものではない。

具体的な実施形態
１．ＧＬＰ－１類似体及びＩｇＧ４ Ｆｃを含む融合タンパク質をコードする配列を含む核酸を含むウイルスベクター。
２．ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、実施形態１に記載のベクター。
３．融合タンパク質が、トロンビンリーダー配列を更に含む、実施形態１又は実施形態２に記載のウイルスベクター。
４．トロンビンリーダー配列が、配列番号７の配列、又は最大で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を有するその機能的バリアントを含む、実施形態３に記載のウイルスベク
ター。
５．融合タンパク質が、スペーサーを更に含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
６．融合タンパク質が、ヒトトロンビンリーダー、ＧＬＰ－１類似体、スペーサー、及びヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
７．融合タンパク質が、配列番号１４の配列、又はそれと少なくとも９９％同一の配列を有する、実施形態１～６に記載のウイルスベクター。
８．融合タンパク質をコードする配列が、配列番号１５である、実施形態１～７のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
９．
（ａ）ＡＡＶカプシドと、
（ｂ）ＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムと、を含み、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、融合タンパク質のコード配列、及び融合タンパク質の発現を指示する調節配列を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
１０．ウイルスベクターが、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）又はその機能的バリアントである、実施形態１～９のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
１１．ウイルスベクターが、ＡＡＶｒｈ９１のＡＡＶカプシド又はその機能的バリアントを有するｒＡＡＶである、実施形態１～９のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
１２．ウイルスベクターが、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１２のＡＡＶカプシド又はその機能的バリアントを有するｒＡＡＶである、実施形態１～９のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
１３．ウイルスベクターが、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ３７、又はＡＡＶｒｈ１０から選択されるＡＡＶカプシド又はその機能的バリアントを有するｒＡＡＶである、実施形態１～９のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
１４．誘導性遺伝子発現系、調節可能なプロモーター、融合タンパク質をコードする配列、及びポリアデニル化シグナルを含むベクターゲノムを含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
１５．ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）が、融合タンパク質コード配列及び調節配列に隣接する、ＡＡＶ２ ５’ ＩＴＲ及びＡＡＶ２ ３’ ＩＴＲである、実施形態９～１４のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
１６．ベクターゲノムが、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター及びウサギグロビンポリＡを含む、実施形態９～１５のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
１７．誘導性遺伝子発現系を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
１８．誘導性遺伝子発現系が、
（ａ）トランス活性化ドメイン及びＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインを含む活性化ドメインと、
（ｂ）ジンクフィンガーホメオドメイン（ＺＦＨＤ）及び１、２、又は３個のＦＫ５０６結合タンパク質ドメイン（ＦＫＢＰ）サブユニット遺伝子を含むＤＮＡ結合ドメインと、
（ｃ）ＺＦＨＤ、それに続く最小ＩＬ２プロモーターに対する結合部位の少なくとも１つのコピーと、
（ｄ）調節可能なプロモーターと、を含み、
有効量のラパマイシン又はラパログの存在が、宿主細胞における導入遺伝子の発現を誘導する、実施形態１７に記載のウイルスベクター。
１９．ＦＫＢＰサブユニット遺伝子配列が、互いに約８５％未満の同一性を共有する、実施形態１８に記載のウイルスベクター。
２０．ＦＫＢＰサブユニット遺伝子配列のうちの１つが、天然のＦＫＢＰ遺伝子配列である、実施形態１８又は１９に記載のウイルスベクター。
２１．トランス活性化ドメインが、ＮＦ－κＢ ｐ６５の一部分を含む、実施形態１８～２０のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
２２．調節可能なプロモーターが、構成的プロモーターである、実施形態１８～２１のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
２３．調節可能なプロモーターが、組織特異的プロモーターである、実施形態１８～２１のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
２４．調節可能なプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、実施形態１８～２２のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
２５．ＩＲＥＳ又は２Ａを更に含む、実施形態１８～２４のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
２６．ＧＴ２Ａ＿Ｖ１（配列番号２１）又はＧＴ２Ａ＿Ｖ２（配列番号２２）から選択される２Ａリンカーを更に含む、実施形態１８～２５のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
２７．ＺＦＨＤに対する結合部位の少なくとも８つのコピーを含む、実施形態１８～２６のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
２８．ベクターゲノムが、配列番号１６の配列、又はそれと少なくとも９５％～９９．９％同一の配列を含む、実施形態１８～２７のいずれか１つに記載のウイルスベクター。
２９．調節可能なプロモーターと、ｐ６５トランス活性化ドメイン及びＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインを含む活性化ドメインと、ジンクフィンガーホメオドメイン（ＺＦＨＤ）及び３個のＦＫ５０６結合タンパク質ドメイン（ＦＫＢＰ）サブユニット遺伝子を含むＤＮＡ結合ドメインと、ＺＦＨＤに対する結合部位の８つのコピーと、ＧＬＰ－１類似体及びヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含む融合タンパク質をコードする配列と、を含む核酸分子を含む、ウイルスベクター。
３０．水性液体と、実施形態１～２０のいずれか１つに記載のウイルスベクターと、を含む、対象における代謝性疾患の治療に使用するのに好適な薬学的組成物。
３１．融合タンパク質が、ヒトトロンビンリーダー、ＧＬＰ－１類似体、スペーサー、及びヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含む、実施形態３０に記載の薬学的組成物。
３２．代謝性疾患を有する対象を治療する方法において使用するための、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のウイルスベクター、又は実施形態３０若しくは３１に記載の薬学的組成物。
３３．代謝性疾患を有する対象を治療するための医薬の製造における、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のウイルスベクター、又は実施形態２９～３１のいずれか１つに記載の薬学的組成物の使用。
３４．組成物が、１×１０^９ＧＣ／ｋｇ～５×１０^１３ＧＣ／ｋｇの用量のｒＡＡＶを投与されるように製剤化されている、実施形態３２又は３３に記載のウイルスベクター又は使用。
３５．患者が、ヒトであり、１×１０^１０～１．５×１０^１５ＧＣの用量のｒＡＡＶを投与される、実施形態３２又は３３に記載のウイルスベクター又は使用。
３６．ｒＡＡＶが、筋肉内又は静脈内に送達される、実施形態３２～３５のいずれか１つに記載のウイルスベクター又は使用。
３７．代謝性疾患を有する対象を治療する方法であって、アデノ随伴ウイルスｒｈ９１由来のＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、ＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムと、を対象に送達することを含み、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、ＧＬＰ－１類似体及びヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含む融合タンパク質をコードする配列と、融合タンパク質の発現を指示する調節配列と、を含む、方法。
３８．患者が、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のウイルスベクター又は実施形
態３０若しくは３１に記載の薬学的組成物を投与される、実施形態３７に記載の方法。
３９．患者が、１×１０^９ＧＣ／ｋｇ～５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ体重の用量のｒＡＡＶを投与される、実施形態３７又は３８に記載の方法。
４０．ｒＡＡＶが、筋肉内又は静脈内に送達される、実施形態３７～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．ヒトにおける糖尿病を治療するための、実施形態１～２９、３２、若しくは３４～３６のいずれか１つに記載のウイルスベクター、実施形態３０～３２のいずれか１つに記載の組成物、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載の使用、又は実施形態３７～４０のいずれか１つに記載の方法。

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示するために提供される。本実施例は、本発明をいかなる方法でも限定することを意図するものではない。

グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）は、胃腸（ＧＩ）管におけるグルカゴンプレタンパク質のタンパク質分解切断から産生されるホルモンである。ＧＬＰ－１は、ベータ細胞からのインスリン放出を増強し、いくつかの組織のインスリン感受性を増加させ、胃内容排出を遅くし（低血糖を引き起こすことなく）、満腹感を高めることによって、グルコース恒常性を広く調節する。ＧＬＰ－１は、半減期が極めて短いため、薬剤として効果的に使用することができなかったが、ＧＬＰ－１の長時間作用型類似体は、２型糖尿病の治療に広く使用されている薬剤となっている。ＧＬＰ－１アゴニストは、優れた安全性プロファイルを有し、繰り返し、しばしば生涯にわたる非経口投与を必要とし、単回投与後に長期発現を達成することができるＡＡＶ媒介遺伝子導入のための良好な候補となる。ＧＬＰ－１及びＧＬＰ－１アゴニストは、タンパク質が、小腸のＬ細胞に特異的なプロテアーゼによる処理を必要とするその天然の内容物（グルカゴンタンパク質）で発現することができないため、ＡＡＶベクターから発現することが困難である。異種シグナルペプチドを用いてＧＬＰ－１を発現する試みは、高レベルの発現を達成することに失敗した。シグナルペプチドは、受容体結合に関与するＧＬＰ－１のＮ末端の適切な処理をもたらさないため、信頼できる発現を達成しない場合があることを提案した。代わりに、遊離ＧＬＰ－１タンパク質を産生するために切断されるプロペプチドを使用してＧＬＰ－１を発現させた。これらは、ユビキタスプロテアーゼ（例えば、フリン）によって切断することができ、免疫原性にはならない内因性ペプチドであるため、ＧＬＰ－１発現のためのトロンビン及び第ＩＸ因子などの凝固因子からプロペプチドを選択した。トロンビンプロペプチドは、シグナルペプチド単独と比較して、ヒトＧＬＰ－１類似体の発現を少なくとも１００倍増加させた。この技術を用いて、両方がヒトプロペプチドを担持する、ＩｇＧ４ Ｆｃ融合を含むものと、アルブミン融合を含むものの、ＡＡＶベクターから発現され得る２つの長時間作用型ＧＬＰ－１類似体を開発した。ＧＬＰ－１アゴニスト配列の転写を活性化する小分子薬物の投与を介して、これらのタンパク質を構成的に又は制御された様式で発現する発現カセットを開発した。標的産物プロファイルは、単回筋肉内注射として設計される。一実施形態では、単回注射は、治療用ＧＬＰ－１アゴニストレベルを維持するように設計された、２～４週間毎の単一の錠剤としての誘導性バージョンを含む。別の実施形態として、単回注射は、１回の用量後の治療用レベルでの継続的な生涯にわたる発現のために設計された構成的バージョンを含む。設計された産物は、非ヒト霊長類における薬理学及び安全性を調べるための前臨床モデルにおける精巣であった。アッセイは、ＧＬＰ－１アゴニストの発現及び活性のために開発された。安全性及び薬物動態は、既知の治療濃度を達成する能力を分析するために調査されている。

このイノベーションは、特に、３ヶ月後にメトホルミン単独又は他の経口薬剤で糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ、ＨｂＡ１ｃ、又はＡ１ｃとも称される）の目標を達成していない患者において、２型糖尿病の単発の、潜在的に生涯にわ
たる治療を可能にする。ケアの標準は、現在、リラグルチド（毎日投与）、デュラグルチド（毎週投与）、ＤＰＰ（例えば、ジペプチジルペプチダーゼ－４）ＩＶ阻害剤（ＰＯ）、及びセマグルチドＰＯ（毎日投与）などの長時間作用型皮下ＧＬＰ－１アゴニストを含む。ＡＡＶ媒介ＧＬＰ－１発現を達成するための以前の試みは、劇的により低い発現をもたらすか、又は免疫原性であり、かつ臨床応用に好適でない異種リーダー配列の使用を必要とするかのいずれかであった。

実施例１－ＧＬＰ－１ベクターの構築
ＧＬＰ－１アゴニストは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して発現することが困難である。ＧＬＰ－１は通常、グルカゴン前駆体タンパク質から発現され、それは組織特異的プロテアーゼを必要とし、望まれないタンパク質を産生する。従来の異種シグナルペプチドを使用する発現系は、低発現をもたらす。ユニバーサルプロテアーゼ切断部位を有する異種プロペプチドを使用する発現系は、Ｔ細胞の標的となり得る外来タンパク質配列をもたらす。外来タンパク質配列を導入することなく、肝臓又は筋細胞からＧＬＰ－１発現を約３００倍増加させる系を開発した。図５は、マウスにおける操作されたＧＬＰ－１構築物のＡＡＶ媒介発現を示す。マウスは、開発された標準ＩＬ－２シグナルペプチド又は内因性前駆体を用いて、ＧＬＰ－１アゴニストを発現するＡＡＶベクターの筋肉内注射を受けた。血清ＧＬＰ－１濃度は、注射の３週間後にＥＬＩＳＡによって測定した。

より具体的には、いくつかのＧＬＰ－１受容体アゴニストアミノ酸配列の１つの上流にリーダー配列を配置し、続いて融合ドメインを配置して、ベクターを構築した。例えば、図４を参照されたい。得られたタンパク質配列を逆翻訳し、続いて、コザックコンセンサス配列、終止コドン、及びクローニング部位を追加した。配列を作製し、誘導性発現系の制御下で、ＣＭＶプロモーターを含む発現ベクターにクローニングした。発現構築物は、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接していた。得られたプラスミドは、ｐＡＡＶ．ＴＦ．ＧＴ２Ａ．デュラグルチド（ｔｒｂ）．３ｗ．ｒＢＧと称される。ヒトトロンビン－デュラグルチドアミノ酸配列は、配列番号１４に示され、コード配列は、配列番号１５に示され、ベクターゲノムは、配列番号１６に示される。

現在利用可能な誘導性構築物としては、２ベクター及び１ベクター誘導性系が挙げられる。例えば、図６Ａ及び図６Ｂを参照されたい。図６Ａは、２ベクター系で使用するための誘導性構築物を含む例示的な発現カセットの概略図を示す。図６Ｂは、ＩＲＥＳリンカーを含む１ベクター系で使用するための誘導性構築物を含む発現カセットの概略図を示す。

更に、ＧＬＰ１－Ｆｃ導入遺伝子を含む発現ベクターにＧＴ２Ａペプチドを導入した。分泌シグナルを有するヒトＧＬＰ１－Ｆｃ（ｈデュラグルチド）は、９５４ｂｐである。上記のように、ｈデュラグルチド構築物の発現については、図６Ｂに示されるような発現ベクターにおいて、ＩＲＥＳリンカーをＧＴ２Ａ切断配列に置き換え、これにより、ＩＲＥＳリンカーがパッケージング限界に適合することを可能にする（図７Ａ；ＧＬＰ－１ Ｆｃ用の単一誘導性カセット）。ＧＴ２Ａペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＧＴ２Ａ＿Ｖ１ペプチド、又は配列番号２２のアミノ酸配列を含むＧＴ２Ａ＿Ｖ２ペプチドから選択される。図７Ａは、分泌シグナルを有するＦ２Ａ切断配列リンカー及びヒトＧＬＰ１－Ｆｃ（ｈデュラグルチド）を含む、１ベクター系で使用するための誘導性構築物を含む発現カセットの概略図を示す。

実施例２－インビトロ発現
ＧＬＰ１－Ｆｃ融合物を、プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養上清中で、ヒトトロンビンシグナル配列を有する誘導性ヒトデュラグルチド（ＴＦ．ＧＴ２Ａ．デュラグルチド（Ｔｒｂ））及びＣＢ７．ネコデュラグルチド（ｆｅＴｒｂ）につ
いて測定した。ネコデュラグルチドとは、デュラグルチドのＩｇＧ Ｆｃ部分がネコＩｇＧ配列に置き換えられ、任意選択で、ネコトロンビンリーダー（ｆｅＴｒｂ）と組み合わせられている構築物を意味する。上清を、ラパマイシン（Ｒａｐａ）による処理の４８時間後、０、４、及び４０ｎＭで、又はＣＢ７．ｆｅデュラグルチド（ｆｅＴｒｂ）のトランスフェクションの４８時間後に収集した。ＧＬＰ１－Ｆｃを、キットのＳＴＤとともに活性型ＧＬＰ１ ＥＬＩＳＡによって定量化した。３つの構築物の発現を図２に示す。ラパマイシンの投薬量の増加は、ＧＬＰ－１の発現の増加をもたらした。

更に、ＧＴ２Ａ＿Ｖ１又はＧＴ２Ａ＿Ｖ２ペプチドを含む設計された構築物におけるアカゲザルの例示滴な治療用導入遺伝子（ｒｈＴＴ）の発現を評価した（図６Ｂ、７Ａ、及び７Ｂ）。図８は、ＧＴ２Ａペプチドを含む様々な構築物でトランスフェクトし、０ｎＭ、４ｎＭ、及び４０ｎＭで、ラパマイシンで処理した後に測定し、ＩＵ／ｍＬのｒｈＴＴとしてプロットしたＨＥＫ２９３細胞上清におけるアカゲザルの治療用導入遺伝子（ｒｈＴＴ）の発現を示す。次に、ＧＴ２Ａ＿Ｖ１及びＧＴ２Ａ＿Ｖ２ペプチドを含む設計された単一誘導性カセットを使用して、インビトロでのヒト及びアカゲザルＧＬＰ－１ Ｆｃ発現の発現を調査した。図９は、インビトロでの誘導性ヒト（ｈ）及びアカゲザル（ｒｈ）ＧＬＰ－１の発現を示す。ＧＬＰ１－Ｆｃ融合物を、プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養上清中で、トロンビンシグナル配列を含む誘導性ｈデュラグルチド、２ベクター系を含むｒｈデュラグルチド、及びＣＢ７．ｒｈデュラグルチドについて測定した。細胞を０日目に播種し、１日目にトランスフェクトし、２日目に０ｎＭ、４ｎＭ、及び４０ｎＭで、ラパマイシンで処理し、ＣＢ７．ｒｈデュラグルチド（ｒｈＴｒｂ）のトランスフェクションから４日目又は４８時間後に細胞からの上清を収集した。ＧＬＰ１－Ｆｃを、キットのＳＴＤとともに活性型ＧＬＰ１ ＥＬＩＳＡによって定量化した。

実施例３－Ｒａｇ１ＫＯマウスにおけるパイロット発現
以下の構築物を、前述のように、トリプルトランスフェクション及びヨウジキサノール勾配精製により、ＡＡＶｒｈ９１ベクター中にパッケージングした。
ヒトトロンビンシグナルを有するＡＡＶｒｈ９１．ＴＦ．ｈデュラグルチド（Ｔｒｂ）．３ｗ．ｒＢＧ
アカゲザルトロンビンシグナルを有するＡＡＶｒｈ９１．ＴＦ．ｒｈデュラグルチド（ｒｈＴｒｂ）．３ｗ．ｒＢＧ
Ｒａｇ１ＫＯ雌マウス（ｎ＝５／ベクター）を、ＩＭ投与経路を介してベクター（１×１０^１１ＧＣ／マウス）の注射で処置した。血清を、５マイクロリットルのＤＰＰ－ＩＶ阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む血清分離管中で全血を分離することによって連続的に採取し、上記の活性ＧＬＰ－１発現及び活性についてアッセイした。０日目にベクターを注射し、１４日目及び１５日頃にラパマイシンを投与した。血清活性ＧＬＰ－１濃度を、図３に示す。血清レベルは、ラパマイシン投与の約１週間後に最大値に達した。

実施例４－ＮＨＰにおける長期発現研究
この研究では、非ヒト霊長類（ＮＨＰ；すなわち、アカゲザル）におけるアカゲザルＧＬＰ－１（ｒｈデュラグルチド）の発現を調査した。表１Ａ及び１Ｂは、ＡＡＶ投与及びラパマイシン投与（すなわち、導入）を含む研究の概要を示す。簡潔には、ＮＨＰ１～３に、筋肉内注射（ＩＭ）を介して、ＡＡＶｒｈ９１指定ベクターを投与した－ＮＨＰ１：１×１０^１２（１ｅ１２）ＧＣ／ｋｇの用量でのＡＡＶｒｈ９１．ＣＢ７．ｒｈデュラグルチド．ｒＢＧ；ＮＨＰ２：それぞれ５×１０^１２（５ｅ１２）ＧＣ／ｋｇの用量でのＡＡＶｒｈ９１．ＣＭＶ．ＴＦＮｃ．３ ＡＡＶｒｈ９１．Ｚ１２Ｉ．ｒｈデュラグルチド．ｒＢＧ及びＡＡＶｒｈ９１．Ｚ１２Ｉ．ｒｈデュラグルチド．ｒＢＧ；並びにＮＨＰ３：１×１０^１３（１ｅ１３）ＧＣ／ｋｇ。ＮＨＰ２については、ラパマイシンを、２１日目に０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、５６日目に０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、及び１２６日目
に２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。ＮＨＰ３については、ラパマイシンを、２１日目に０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、７８日目に０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、及び１４８日目に２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。

図１０Ａ～１０Ｃは、ＮＨＰ１（１８－１２８）の抗ｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ ＡＤＡ（抗薬物抗体）検出アッセイのｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ発現及び分析を示す。図１０Ａは、０～２００日目に測定された、ｎＭとしてプロットされた血清中のｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ発現レベルを示す。図１０Ｂは、０～２００日目に測定された、μｇ／Ｌとしてプロットされた血清中のラパマイシンレベルを示す。図１０Ｃは、０日目～２００日目に測定された、外径４５０ｎｍとしてプロットされたＡＤＡ検出アッセイの結果を示す。

図１１Ａ～１１Ｃは、ＮＨＰ１（１８－０７２）の抗ｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ ＡＤＡアッセイのｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ発現及び分析を示す。図１１Ａは、０～２００日目に測定された、ｎＭとしてプロットされた血清中のｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ発現レベルを示す。図１１Ｂは、０～２００日目に測定された、μｇ／Ｌとしてプロットされた血清中のラパマイシンレベルを示す。図１１Ｃは、０日目～２００日目に測定された、外径４５０ｎｍとしてプロットされたＡＤＡ検出アッセイの結果を示す。

図１２Ａ～１２Ｃは、ＮＨＰ１（１８－０１３）の抗ｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ ＡＤＡアッセイのｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ発現及び分析を示す。図１２Ａは、０～２００日目に測定された、ｎＭとしてプロットされた血清中のｒｈＧＬＰ１－Ｆｃ発現レベルを示す。図１２Ｂは、０～２００日目に測定された、μｇ／Ｌとしてプロットされた血清中のラパマイシンレベルを示す。図１２Ｃは、０日目～２００日目に測定された、外径４５０ｎｍとしてプロットされたＡＤＡ検出アッセイの結果を示す。

要約すると、ヒトＧＬＰ１－Ｆｃ融合の発現のための１ベクター誘導系を開発した。加えて、Ｒａｇ１ＫＯマウスにおけるラパマイシン時のヒトＧＬＰ１－Ｆｃの誘導を確認した。ＮＨＰにおいて、サルＧＬＰ１－Ｆｃを発現する１ベクター及び２ベクター誘導性ベクターがラパマイシンに応答し、２０日を超える持続時間で１ｎＭを超える血清ＧＬＰ１－Ｆｃの一過性増加をもたらすことを観察した。ベクターを構成的に発現する低用量が、ＮＨＰにおける血清ＧＬＰ１－Ｆｃの高く持続的な発現を提供することを観察した。
（配列表フリーテスト）

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本明細書に引用されるすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０６９，５００号は、その全体が参照により、その配列表とともに本明細書に組み込まれる。「２０－９４２９ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５」とラベルされた本明細書とともに出願された配列表、並びにその中の配列及びテキストは、参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に収まることが意図される。

Claims (30)

1. ＧＬＰ－１類似体及びＩｇＧ４ Ｆｃを含む融合タンパク質をコードする配列を含む核酸を含むウイルスベクターであって、前記融合タンパク質が、配列番号１４の配列、又はそれと少なくとも９９％同一の配列を有する、ウイルスベクター。
2. 前記融合タンパク質をコードする前記配列が、配列番号１５、又はそれと少なくとも７５％同一の配列である、請求項１～７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
3. （ａ）ＡＡＶカプシドと、
   （ｂ）ＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムと、を含み、前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、前記融合タンパク質のコード配列、及び前記融合タンパク質の発現を指示する調節配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
4. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶｒｈ９１の前記ＡＡＶカプシドを有するｒＡＡＶである、請求項１～９のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
5. 誘導性遺伝子発現系、調節可能なプロモーター、前記融合タンパク質をコードする前記配列、及びポリアデニル化シグナルを含むベクターゲノムを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
6. 前記ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）が、前記融合タンパク質コード配列及び調節配列に隣接する、ＡＡＶ２ ５’ ＩＴＲ及びＡＡＶ２ ３’ ＩＴＲである、請求項９～１４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
7. 前記ベクターゲノムが、ＣＢ７プロモーター及びウサギグロビンポリＡを含む、請求項９～１５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
8. 誘導性遺伝子発現系を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
9. 前記誘導性遺伝子発現系が、
   （ａ）トランス活性化ドメイン及びＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインを含む活性化ドメインと、
   （ｂ）ジンクフィンガーホメオドメイン（ＺＦＨＤ）及び１、２、又は３個のＦＫ５０６結合タンパク質ドメイン（ＦＫＢＰ）サブユニット遺伝子を含むＤＮＡ結合ドメインと、
   （ｃ）ＺＦＨＤ、それに続く最小ＩＬ２プロモーターに対する結合部位の少なくとも１つのコピーと、
   （ｄ）調節可能なプロモーターと、を含み、
   有効量のラパマイシン又はラパログの存在が、宿主細胞における前記導入遺伝子の発現を誘導する、請求項１７に記載のウイルスベクター。
10. 前記ＦＫＢＰサブユニット遺伝子配列が、互いに約８５％未満の同一性を共有する、請求項１８に記載のウイルスベクター。
11. 前記ＦＫＢＰサブユニット遺伝子配列のうちの１つが、天然のＦＫＢＰ遺伝子配列である、請求項１８又は１９に記載のウイルスベクター。
12. 前記トランス活性化ドメインが、ＮＦ－κＢ ｐ６５の一部分を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
13. 前記調節可能なプロモーターが、構成的プロモーターである、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
14. 前記調節可能なプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項１８～２２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
15. ＩＲＥＳ又は２Ａを更に含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
16. ＧＴ２Ａ＿Ｖ１（配列番号２１）又はＧＴ２Ａ＿Ｖ２（配列番号２２）から選択される２Ａリンカーを更に含む、請求項１８～２５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
17. 前記ＺＦＨＤに対する結合部位の少なくとも８つのコピーを含む、請求項１８～２６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
18. 前記ベクターゲノムが、配列番号１６の配列、又はそれと少なくとも７０％同一の配列を含む、請求項１８～２７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
19. 調節可能なプロモーターと、ｐ６５トランス活性化ドメイン及びＦＫＢＰ１２－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）のＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインを含む活性化ドメインと、ジンクフィンガーホメオドメイン（ＺＦＨＤ）及び３個のＦＫ５０６結合タンパク質ドメイン（ＦＫＢＰ）サブユニット遺伝子を含むＤＮＡ結合ドメインと、前記ＺＦＨＤに対する結合部位の８つのコピーと、ＧＬＰ－１類似体及びヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含む融合タンパク質をコードする配列と、を含む核酸分子を含む、ウイルスベクター。
20. 水性液体と、請求項１～２０のいずれか一項に記載のウイルスベクターと、を含む、対象における代謝性疾患の治療に使用するのに好適な薬学的組成物。
21. 代謝性疾患を有する対象を治療する方法において使用するための、請求項１～２９のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は請求項３０若しくは３１に記載の薬学的組成物。
22. 代謝性疾患を有する対象を治療するための医薬の製造における、請求項１～２９のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は請求項２９～３１のいずれか一項に記載の薬学的組成物の使用。
23. 前記組成物が、１×１０^９ＧＣ／ｋｇ～５×１０^１３ＧＣ／ｋｇの用量の前記ｒＡＡＶを投与されるように製剤化されている、請求項３２又は３３に記載のウイルスベクター又は使用。
24. 患者が、ヒトであり、１×１０^１０～１．５×１０^１５ＧＣの用量の前記ｒＡＡＶを投与される、請求項３２又は３３に記載のウイルスベクター又は使用。
25. 前記ｒＡＡＶが、筋肉内又は静脈内に送達される、請求項３２～３５のいずれか一項に記載のウイルスベクター又は使用。
26. 代謝性疾患を有する対象を治療する方法であって、アデノ随伴ウイルスｒｈ９１由来のＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、前記ＡＡ
    Ｖカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムと、を前記対象に送達することを含み、前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、ＧＬＰ－１類似体及びヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含む融合タンパク質をコードする配列と、前記融合タンパク質の発現を指示する調節配列と、を含む、方法。
27. 前記患者が、請求項１～２９のいずれか一項に記載のウイルスベクター又は請求項３０若しくは３１に記載の薬学的組成物を投与される、請求項３７に記載の方法。
28. 前記患者が、１×１０^９ＧＣ／ｋｇ～５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ体重の用量の前記ｒＡＡＶを投与される、請求項３７又は３８に記載の方法。
29. 前記ｒＡＡＶが、筋肉内又は静脈内に送達される、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
30. ヒトにおける糖尿病を治療するための、請求項１～２９、３２、若しくは３４～３６のいずれか一項に記載のウイルスベクター、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の組成物、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の使用、又は請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。

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