JP2023543033A - 弱毒化ブタ流行性下痢ウイルス - Google Patents

Abstract

本開示は、ＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質を提供する。それを含む核酸配列及びそれを含むウイルス、並びに使用方法も提供される。【選択図】図３

Description

ブタ流行性下痢（ＰＥＤ）は非常に伝染性が高く、ブタ、特に哺乳子ブタにおける脱水、下痢、及び高い死亡率が特徴である。原因となる病原体、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）は、コロナウイルス科のアルファコロナウイルス属に属する一本鎖の陽性ＲＮＡウイルスである。ＰＥＤＶは、約２８ｋｂの総ゲノムサイズを有し、７つのオープンリーディングフレームを含む。ＰＥＤＶ感染の症状は、同じくコロナウイルス科のメンバーである伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）及びブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）によって引き起こされる症状としばしば類似する。ＰＥＤＶとＴＧＥＶとの間に交差防御は一般的に観察されず、全体的なウイルスヌクレオチド配列が最大で約６０％類似していることに留意されたい。

ＰＥＤは、１９７０年頃にヨーロッパで最初に観察された可能性が高く、その後、原因ウイルスが特徴付けられた（例えば、Ｍ．Ｐｅｎｓａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ，ｖ．５８，ｐｐ ２４３－２４７，１９７８及びＤ．Ｃｈａｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｖｅｔ Ｓｃｉ，ｖ．２５，ｐｐ ２５５－２５６，１９７８を参照されたい）。ＰＥＤＶは、２０１３年まで北米では確認されておらず、その時点で広範に及ぶ流行が始まり、養豚産業に深刻な経済的損失をもたらした。ウイルスは、数日以内に複数の広範囲に分布する経産ブタの群れに出現し、少なくとも３２の州に広がった。生産者は、ナイーブな新生子ブタの最大１００％の損失を予想する可能性がある。感染管理のための現在の推奨事項には、厳格なバイオセキュリティの実施及び／又は免疫を達成するための、群れ全体のＰＥＤＶへの意図的な曝露が含まれる。

ＰＥＤＶは、１９７０年代及び１９８０年代の間にヨーロッパのいくつかの国々で広域流行を引き起こしたが、１９９０年代以降、ＰＥＤはヨーロッパでは時折発生するものの、稀になっている。この古典的なＰＥＤＶ株は、その後、日本、中国、韓国等のアジア諸国に広がった。２０１０年以降、中国で深刻なＰＥＤの家畜流行性の発生が報告されており、これらの発生から回収されたＰＥＤＶは、古典的なＰＥＤＶ株とは遺伝的に異なっていた。米国のブタにおける最初のＰＥＤの流行は、中国で観察されたものと同様の臨床症状を有していた。配列解析により、元の米国ＰＥＤＶ（これ以降、ＵＳ ＰＥＤＶプロトタイプ株と称される）は、２０１１～２１０２年に中国で循環していたいくつかのＰＥＤＶと遺伝的に最も類似していることが明らかになった。２０１４年１月に、ＵＳ ＰＥＤＶプロトタイプ株と比較してスパイク遺伝子に挿入及び欠失（インデル）を有するＰＥＤＶ変異株が、米国のブタ集団で同定された。この変異株は、ＵＳ ＰＥＤＶ Ｓ－ＩＮＤＥＬ変異株と指定された。米国でのＰＥＤの流行後、米国プロトタイプ様ＰＥＤＶの検出が、カナダ、メキシコ、台湾、韓国、及び日本で報告されており、ＵＳ ＰＥＤＶ Ｓ－ＩＮＤＥＬ変異株様ＰＥＤＶの検出が、韓国、日本、ドイツ、ベルギー、フランス、及びポルトガルで報告されている。現在、ＰＥＤＶは世界の養豚産業にとって大きな脅威のままとなっている。ＰＥＤＶに対する弱毒化生ワクチン、特に、経口投与時に有効であり得るワクチンの重要な必要性が依然として存在する。

一態様において、本発明は、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）のＣ末端切断スパイクタンパク質であって、配列番号１（ＹＥＶＦＥＫＶＨＶＱ）又は配列番号１を含む配列を欠き、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列又はそのＣ末端切断変異体を含むが、但し、ＰＥＤＶの上記Ｃ末端切断スパイクタンパク質が少なくとも１２００アミノ酸長であることを条件とする、ＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質を提供する。

本態様の異なる実施形態によれば、ＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質は、少なくとも１２５０アミノ酸長、又は少なくとも１３００アミノ酸長、又は少なくとも１３７０アミノ酸長であり得る。

本態様の異なる実施形態によれば、ＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質は、配列番号２と少なくとも９５％同一であり得るか、又は、配列番号２と少なくとも９６％、若しくは少なくとも９７％、若しくは少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一、若しくは１００％同一であり得る。ある特定の実施形態において、配列番号２と、それと少なくとも９０％（すなわち、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％）同一である配列との間で異なるアミノ酸は、保存的置換である。

第２の態様において、核酸配列が開示され、上記核酸配列は、本発明の第１の態様の実施形態のいずれかによるＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。

第３の態様において、本開示は、本発明の第１の態様の任意の実施形態によるＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質を含むウイルス、又は本発明の第２の態様の実施形態のいずれかによる核酸配列を含むウイルスを提供する。

第４の態様において、本発明は、配列番号５を含むアミノ酸配列を提供する。

第５の態様において、本発明は、本発明の第４の態様によるアミノ酸配列を含むＰＥＤＶを提供する。

第６の態様において、本発明は、ＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質を提供し、上記Ｃ末端切断スパイクタンパク質は、配列番号３と少なくとも９０％同一であるが、但し、ＰＥＤＶのこのＣ末端切断スパイクタンパク質は、配列番号４を含むことを条件とする。この第５の態様の異なる実施形態において、ＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質は、配列番号３と少なくとも９５％同一であり得るか、又は配列番号３と少なくとも９６％若しくは少なくとも９７％若しくは少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一、若しくは１００％同一であり得る。ある特定の実施形態において、配列番号２と、それと少なくとも９０％（すなわち、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％）同一である配列との間で異なるアミノ酸は、保存的置換である。

第７の態様において、本発明は、ＯＲＦ－２及びＯＲＦ３を含むＰＥＤＶであるが、但し、ウイルスが上記ＯＲＦ２／ＯＲＦ３に第１の欠失を含み、上記第１の欠失が、配列番号６の欠失又は配列番号６を含む核酸配列の欠失であることを条件とし、上記ウイルスが、配列番号３、又はそれと少なくとも９０％同一である配列を含むアミノ酸配列を発現することを条件とし、更に、上記配列番号３のＣ末端アミノ酸がＱＰＬＡＬ（配列番号４）であることを条件とする、ＰＥＤＶを提供する。

この第７の態様のある特定の実施形態によれば、本発明のＰＥＤＶは、上記ＯＲＦ－３に第２の欠失を更に含み、上記第２の欠失は、配列番号７の欠失又は配列番号７を含む核酸配列の欠失である。ある特定の実施形態において、第１の欠失と第２の欠失とは異なる。

ある特定の実施形態において、ＰＥＤＶは、Ｅ、Ｍ、及びＮタンパク質をコードする野生型ＯＲＦを含む。ある特定の実施形態において、本発明のＰＥＤＶは、ＯＲＦ－３によって発現される機能性タンパク質を欠いている。

ある特定の実施形態において、ウイルスは、配列番号１０、又はそれと少なくとも９０％同一である配列によるゲノムを有する。

いくつかの実施形態において、ウイルスは、ＰＥＤＶ株ＤＪに由来する。

第８の態様において、本発明は、ワクチンを提供し、ワクチンは、本発明の第３、第５及び／又は第７の態様の任意の実施形態によるウイルスを含む。

この第８の態様のある特定の実施形態において、ウイルスは、弱毒化ウイルスである。

第９の態様において、本発明は、ブタ動物をＰＥＤＶ感染から予防する方法であって、本発明の第８の態様の任意の実施形態によるワクチンを上記ブタに投与することを含む、方法を提供する。

ある特定の実施形態において、ワクチンは経口投与される。

ある特定の実施形態において、ブタ動物は、経産ブタであり、上記ワクチンは、分娩の約２８～４２日前に投与され、更に上記ワクチンは、分娩の約１７～２１日前に投与される。ある特定の実施形態において、第１及び／又は第２のワクチン接種は、経口投与される。

第１０の態様において、本発明は、子ブタをＰＥＤＶ感染から防御する方法であって、本発明の第８の態様の任意の実施形態によるワクチンを予防接種された経産ブタからの初乳を上記子ブタに投与することを含み、経産ブタが、分娩の約２８～４２日前（例えば、３５日）にワクチン接種され、更に上記ワクチンが、分娩の約７～２１日前（例えば、１４日）に投与される、方法を提供する。ある特定の実施形態において、第１及び／又は第２のワクチン接種は、経口投与される。

ある特定の実施形態において、上記小ブタは、少なくとも３日齢である。他の実施形態において、子ブタは、少なくとも５日齢である。

連続継代したウイルスの核酸の電気泳動マップ。 ５回連続継代したウイルスの核酸の電気泳動マップ。 分娩時のワクチン接種された経産ブタにおける抗ＰＥＤＶ抗体レベルの図。 ワクチン接種された経産ブタから初乳を与えられた３～５日齢の子ブタにおける抗ＰＥＤＶ抗体レベルの図。

本発明をよりよく理解するために、以下の定義が提供される。

[0029] 言及される数字に適用される「約」という用語は、該値のプラス又はマイナス１０である言及される数字を指す。

[0030] 「アジュバント」という用語は、ワクチンの有効性を向上させる化合物を指し、免疫化剤を含む製剤に添加され得る。アジュバントは、単回用量のみのワクチンの投与後であっても、免疫応答を向上させる。アジュバントとしては、例えば、ムラミルジペプチド、ピリジン、水酸化アルミニウム、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、油、水中油型エマルジョン、サポニン、サイトカイン、及び当該技術分野で既知の他の物質を挙げることができる。好適なアジュバントの例は、米国特許出願公開第２００４／０２１３８１７Ａ１号に記載されている。「アジュバント」は、アジュバントを組み込むか、又はアジュバントと組み合わされる組成物を指す。

[0031] 本明細書で使用される「弱毒化」ＰＥＤＶは、感受性宿主に感染する及び／又は感受性宿主において複製することができるが、感受性宿主に対して非病原性であるか、又は病原性が低いＰＥＤＶを指す。例えば、弱毒化ウイルスは、関連する野外単離株と比較して、観察可能／検出可能な臨床症状、若しくはより少ない臨床症状、若しくはより重症度の低い臨床症状を引き起こさないことが可能であるか、又はウイルス複製効率及び／若しくは感染性の低下を示し得る。ＰＥＤＶ感染の臨床症状としては、臨床的な下痢、嘔吐、嗜眠、状態の喪失、及び脱水症を挙げることができるが、これらに限定されない。

[0032] 「保存的置換」という用語は、あるアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸による置き換えを指す。当業者は、それがコードするタンパク質のアミノ酸配列の修飾をもたらす核酸配列の変化が、結果として生じるタンパク質の三次元構造に、たとえあったとしてもほとんど影響を及ぼさないことが可能であることを更に認識するであろう。例えば、アミノ酸アラニン、疎水性アミノ酸のコドンは、グリシン等の別の疎水性がより低い残基、又はバリン、ロイシン、若しくはイソロイシン等の疎水性がより高い残基をコードするコドンによって置換され得る。同様に、ある負に帯電した残基の別の残基への（例えば、アスパラギン酸のグルタミン酸への）置換、又はある正に帯電した残基の別の残基への（例えば、リジンのアルギニンへの）置換をもたらす変化もまた、実質的に同じ機能活性を有するタンパク質を産生することが期待され得る。

[0033] 以下の６つの群は、互いに典型的な保存的置換であるアミノ酸を含む：［１］アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；［２］アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；［３］アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；［４］アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；［５］イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び［６］フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（例えば、米国特許公開第２０１０／０２９１５４９号を参照のこと）。

[0034] 「エピトープ」は、宿主に投与されると、液性（Ｂ細胞）及び／又は細胞型（Ｔ細胞）の免疫応答を誘発することができるという意味で、免疫学的に活性である抗原性決定基である。これらは、抗原性である特定の化学基又は分子上のペプチド配列である。抗体は、ポリペプチド上の特定の抗原エピトープに特異的に結合する。動物において、ほとんどの抗原は、いくつかの、又は更には多くの抗原決定基を同時に提示する。そのようなポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドとしても認定され得、エピトープは、更に記載されるように同定され得る。

[0035] 本明細書で使用される場合、「免疫原性断片」という用語は、ポリペプチド又は断片がＭＨＣ分子に結合して、細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）応答、及び／又はＢ細胞応答（例えば、抗体産生）、及び／又はＴヘルパーリンパ球応答、及び／又は免疫原性ポリペプチド若しくは免疫原性断片が由来する抗原に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を誘導するように、アレル特異的モチーフ、エピトープ又は他の配列を含む、ポリペプチド若しくはポリペプチドの断片、又はそれをコードするヌクレオチド配列を指す。ＤＴＨ応答は、Ｔ細胞依存性マクロファージ活性化及び炎症が組織損傷を引き起こす免疫反応である。抗原の皮下注射に対するＤＴＨ反応は、しばしば、細胞媒介免疫のアッセイとして使用される。

[0036] 「免疫防御応答の誘導」という用語は、健康な対照と比較して、疾患の症状、すなわち、臨床徴候、病変、細菌***及び感染した対象の組織における細菌複製のうちの１つ以上を軽減又は排除する（液性及び／又は細胞性）免疫応答を意味する。好ましくは、上記症状の軽減は、対照と比較して統計的に有意である。

[0037] 「薬学的に許容される担体」とは、ワクチンの製造及び投与のために当該技術分野で使用される、任意の従来の薬学的に許容される担体、ビヒクル、又は賦形剤を意味する。薬学的に許容される担体は、典型的には、非毒性、不活性、固体又は液体の担体である。

[0038] 「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）」及び「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」という用語は、本明細書において互換的に使用され、例えば、ブタ等のイノシシ科のメンバーである任意の動物を指す。

[0039] 本明細書で使用される「感受性」宿主は、ＰＥＤＶに感染し得る細胞又は動物を指す。感受性動物に導入されると、弱毒化ＰＥＤＶは、ＰＥＤＶ又はその抗原に対する免疫応答も誘導し得、それによって動物にＰＥＤＶ感染に対する免疫をもたらす。

[0040] 「治療有効量」は、ウイルス又は細菌等の病原体による感染によって引き起こされる疾患の徴候又は症状（健康への悪影響又はその合併症を含む）を予防又は軽減するのに十分な、抗原又はワクチンを受ける対象において免疫応答を誘導するであろう抗原又はワクチンの量を指す。液性免疫若しくは細胞媒介性免疫、又は液性免疫と細胞媒介性免疫の両方が誘導され得る。ワクチンに対する動物の免疫原性応答は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイを介して間接的に、又は野生型株とのチャレンジ後の徴候及び症状をモニタリングすることを通して直接的に評価され得る。ワクチンによって付与される防御免疫は、例えば、死亡率、罹患率、体温の数値、全体的な身体状態、並びに対象の全体的な健康及びパフォーマンス等の臨床徴候の低減を測定することによって評価することができる。治療的に有効なワクチンの量は、使用される特定のアジュバント、使用される特定の抗原、又は対象の状態に応じて変化し得、当業者によって決定され得る。

[0041]「治療すること」は、そのような用語が適用される障害、状態、若しくは疾患を予防すること、又はそのような障害、状態、若しくは疾患の１つ以上の症状を予防若しくは軽減することを指す。

[0042]「ワクチン」という用語は、感染の影響を予防又は緩和するために、疾患に対する免疫をもたらすために使用される抗原調製物を指す。ワクチンは、典型的には、免疫学的有効量の免疫原と、免疫原に対するワクチン接種された対象の免疫応答を増強するのに有効なアジュバントとの組み合わせを使用して調製される。

[0043]ＰＥＤＶは、５’キャップ及び３’ポリアデニル化尾部を有する、約２８ｋｂの陽性のセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有する包囲ウイルスである。（Ｐｅｎｓａｅｒｔ ａｎｄ Ｄｅ Ｂｏｕｃｋ Ｐ．１９７８）。ゲノムは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、及び４つの構造タンパク質（スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、及びヌクレオカプシド（Ｎ））及び３つの非構造タンパク質（レプリカーゼ１ａ及び１ｂ、並びにＯＲＦ３）をコードする少なくとも７つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む；これらは、５’－レプリカーゼ（１ａ／１ｂ）－ＯＲＦ２（Ｓとしても知られる）－ＯＲＦ３－Ｅ－Ｍ－Ｎ－３’（Ｏｌｄｈａｍ Ｊ．１９７２；及びＢｒｉｄｇｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９３）の順序でゲノム上に配置される。特徴付けられている、最初に出現した３つの北米ＰＥＤＶゲノム配列、ミネソタＭＮ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ４６８７５２．１）、アイオワＩＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ４６８７５３．１）、及びアイオワＩＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ４６８７５４．１）は、２８，０３８ヌクレオチド（ｎｔ）という同じサイズを有し、ポリアデノシン尾部を除いて、プロトタイプＰＥＤＶ ＣＶ７７７株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３５３５１１．１）とゲノム構成を共有する。これら３つの北米ＰＥＤＶ配列は、９９．８～９９．９％のヌクレオチド同一性を共有していた。特に、ＭＮ株とＩＡ２株は、全ゲノムにわたりわずか１１個のヌクレオチド差を有するのみであった。

[0044]本出願の目的のために、配列は、ＤＮＡ形式で提供される。当業者であれば、これらの配列を、ウイルスのゲノムを含むＲＮＡ配列に翻訳することは困難ではないであろう。

[0045]本発明者らは、驚くべきことに、ＯＲＦ－２／ＯＲＦ－３の領域に第１の欠失を有するＰＥＤＶが、弱毒化された免疫原性のウイルスをもたらすこと、すなわち、野生型ＰＥＤに対する防御応答を引き起こすことを発見した。ある特定の実施形態において、第１の欠失は、配列番号６を含む。この配列は、ＯＲＦ－２で開始し、ＯＲＦ－３開始コドンを含むＯＲＦ３の近位部分に及ぶ。第１の欠失は、配列番号６のみに限定されず、配列番号６の上流又は下流の配列を含むことができる。しかしながら、ＯＲＦ２によってコードされるスパイクタンパク質は、ＰＥＤの主要な免疫原であるため、第１の欠失は、スパイクタンパク質を損なうほど配列番号６から離れた上流までは伸長しない場合があることに留意されたい。

[0046]したがって、本発明は、スパイクタンパク質の断片を提供する。スパイクタンパク質の断片は、配列番号１を欠いている。断片は、更にＣ末端が切断されてもよいが、一般に、少なくとも１２００アミノ酸長、好ましくは少なくとも１３００アミノ酸長、より好ましくは少なくとも１３７０アミノ酸長であるべきである。ある特定の実施形態において、スパイクタンパク質の断片は、配列番号２、又はそれと少なくとも９０％（又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％）同一である配列を含む。配列番号２と少なくとも９０％同一である配列と、配列番号２自体との間で異なるアミノ酸は、保存的置換であることが好ましい。

[0047]当業者であれば、第１の欠失が、ＯＲＦ－２のフレームシフトを引き起こし、したがって、野生型スパイクタンパク質のＣ末端アミノ酸配列を変化させることを理解することができる。本発明によるスパイクタンパク質断片は、配列番号１を欠いている。代わりに、最も好ましい実施形態において、スパイクタンパク質断片は、ＱＰＬＡＬ（配列番号４）で終端する。

[0048]最も好ましい一連の実施形態において、本明細書に記載のスパイクタンパク質断片は、配列番号３、又はそれと少なくとも９０％同一である配列を含むが、但し、配列番号４が、上記スパイクタンパク質断片又は配列番号３と少なくとも９０％同一である配列のＣ末端に存在することを条件とする。配列同一性は、より大きくてもよく（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）、異なるアミノ酸は保存的置換である。

[0049] 本発明によるポリペプチドを得るための技術は、当該技術分野で周知である。例えば、遺伝子工学技術及び組換えＤＮＡ発現系が使用され得る。

[0050] 別の態様において、本発明は、上述の実施形態のいずれかによるスパイクタンパク質断片をコードする核酸配列を提供する。本発明の第１の態様の任意の実施形態によるアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、１つ以上の非ウイルス及び／又はウイルスベクター等のベクター（例えば、組換えベクター）に挿入され得る。非ウイルスベクターは、例えば、プラスミドベクター（例えば、細菌、昆虫、及び／又は哺乳動物宿主細胞と適合性）を含み得る。例示的なベクターとしては、例えば、ＰＣＲ－ｉｉ、ＰＣＲ３、及びｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＢＳｉｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｅｔ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、ｐＥＧＦｐ－ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴ１（Ｂｌｕｅｂａｃｉｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ－ａｌｐｈａ（ＰＣＴ ｐｕｂ．ＷＯ９０／１４３６３号）及びｐＦＡＳＴＢＡＣｄｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、並びにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド誘導体（高コピー数ＣＯＬｅ１に基づくファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＴＡＱ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯ（商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）を挙げることができる。また、細菌ベクターとしては、例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを挙げることができる（例えば、ＷＯ８８／６６２６、ＷＯ９０／０５９４、ＷＯ９１／１３１５７、ＷＯ９２／１７９６、及びＷＯ９２／２１３７６を参照のこと）。ベクターは、当業者に広く利用可能な標準的な組換え技術を使用して構築され得る。多くの他の非ウイルスプラスミド発現ベクター及び系が、当該技術分野で既知であり、使用され得る。

[0051] 第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による核酸配列を含むベクターを提供する。核酸を宿主に導入するために成功裏に利用されている様々なウイルスベクターとしては、とりわけ、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、及びポックスウイルスが挙げられる。ウイルスベクターは、当業者に広く利用可能な標準的な組換え技術を使用して構築され得る。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ：２０００，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）、及びＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８＋ｕｐｄａｔｅｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＩＳＢＮ：０４７１６２５９４９）を参照されたい。

[0052] ある特定の実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり、ウイルスはＰＥＤＶである。

[0053] したがって、本発明は、上述の第１の欠失及び／又はスパイクタンパク質断片を含むＰＥＤＶを提供する。第１の欠失は、ＯＲＦ－３上の開始コドンを含み、それによって上記ＯＲＦを除去することが理解され得よう。したがって、本発明のＰＥＤＶは、野生型ＯＲＦ－３によって発現される機能的タンパク質を欠いている。

[0054] しかしながら、この欠失により、「新しいＯＲＦ」又は「新たに形成されたＯＲＦ」等と称される、新しいＯＲＦが形成される。ＮＣＢＩのウェブサイトから公的に入手可能なＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒソフトウェアによる、この新しいＯＲＦ（配列番号９）の概念的翻訳によって、配列番号５がこの新しいＯＲＦの発現の産物であることが明らかになっている。したがって、別の態様において、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列を発現し、また、ある特定の実施形態において、配列番号９のＯＲＦを含むＰＥＤＶを提供する。

[0055] 上述のタンパク質及び／又は核酸配列同一性の方法は、本明細書に記載の全てのタンパク質及び／又は核酸に適用可能である。配列同一性及び／又は類似性を評価するための多重配列比較アルゴリズム及びプログラムは、当該技術分野で既知である。配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列（例えば、本明細書に開示される配列）として機能し、これに対して試験配列が比較される。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。

[0056] ２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性パーセントは、例えば、コンピュータプログラムＧＡＰ、すなわち、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎのパッケージバージョン１０．０プログラム、ＧＡＰを使用して配列情報を比較することによって決定することができる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７－９５）。パーセント同一性を計算する際、比較される配列は、典型的には、配列間で最大の一致が得られるような方法で整列される。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメータは以下の通りである：（１）ヌクレオチドについての一元比較マトリックス（同一性については１、非同一性については０の値を含む）のＧＣＧ実装、及びＡｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８（１９７９）に記載されるような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ，（（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５）の重み付きアミノ酸比較マトリックス、又は他の同等の比較マトリックス；（２）アミノ酸配列の場合、各ギャップに８のペナルティ、及び各ギャップ中の各記号に２の追加ペナルティ、又は、ヌクレオチド配列の場合、各ギャップに５０のペナルティ、及び各ギャップ中の各記号に３の追加ペナルティ；（３）エンドギャップにはペナルティなし；並びに（４）長いギャップには最大ペナルティなし。

[0057] 配列同一性及び／又は類似性は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）を使用することにより決定されてもよい。

[0058] 有用なアルゴリズムの別の例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ・ペアワイズアラインメントを使用して、一群の関連配列から多重配列アラインメントを作成する。これにより、アライメントを作成するために使用したクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１－３６０のプログレッシブ・アライメント法を簡素化したものを使用する；この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３に記載されているものと同様である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、デフォルトのギャップ重み３．００、デフォルトのギャップ長重み０．１０、及び重み付きエンドギャップを含む。

[0059] 有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５７８７に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０－４８０から入手されるＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメータを使用し、そのほとんどがデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは以下の値に設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップ分数＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰＳ及びＨＳＰＳ２パラメータは、動的な値であり、特定の配列の組成、及びどの対象配列が検索されているかに対する特定のデータベースの組成に応じて、プログラム自体によって確立される；しかしながら、感度を高めるために値を調整してもよい。

[0060] 更なる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２によって報告されているギャップ付きＢＬＡＳＴである。ギャップ付きＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ－６２置換スコア；９に設定された閾値Ｔパラメータ；ギャップなしの伸長を開始するための２ヒット法、ギャップ長ｋに１０＋ｋのコストを負荷、１６に設定されたＸ_ｕ、並びにデータベース検索段階で４０に、及びアルゴリズムの出力段階で６７に設定されたＸ_ｇを使用する。ギャップ付きアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアによって開始される。

[0061] ある特定の実施形態において、本発明によるウイルスは、野生型ＯＲＦ３の一部である配列に第２の欠失も含む。好ましくは、この第２の欠失は、配列番号７を含む（又はそれからなる）。

[0062] ある特定の好ましい実施形態において、ＰＥＤＶが提供され、上記ウイルスは、配列番号６からなる第１の欠失、及び配列番号７からなる第２の欠失を含む。より好ましい一連の実施形態において、ウイルスのゲノム配列は、配列番号１０、又はそれと９０％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、９９．５％以上）同一である配列を含む。好ましくは、異なるヌクレオチドは、発現したアミノ酸配列に著しい（又は任意の）変化をもたらさず、それはコドン最適化の結果である。本発明のＰＥＤＶのＥ、Ｍ、及びＮタンパク質のアミノ酸配列は、好ましくは、遺伝子型１又は遺伝子型２に属し得る野生型ウイルスと比較して変化していない。ＰＥＤＶ遺伝子型１の非限定的な例は、ＣＶ７７７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３５３５１１）であり、遺伝子型２の非限定的な例は、ＤＪ株及びＡＪ１１０２株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ１８８４５４）である。遺伝子型２株の更なる非限定的な例としては、ＣＨ／ＺＪＣＳ０３／２０１２株、ＣＨ／ＪＸＺＳ０３／２０１４株、ＣＨ／ＪＸＦＸ０１／２０１４株、ＣＨ／ＪＸＪＪ０８／２０１５株、ＣＨ／ＪＸＧＺ０４／２０１５株、ＣＨ／ＪＸＪＡ８９／２０１５株、ＣＨ／ＪＸＤＸ１１９／２０１６株、ＣＨ／ＪＸＪＧＳ１１／２０１６株、ＣＨ／ＪＸＷＮ１３／２０１６株、ＣＨ／ＪＸＪＪ１８／２０１７株、ＣＨ／ＪＸＮＣ３８／２０１７株、ＣＨ／ＪＸ／０１株、ＣＨ／ＪＸ－１／２０１３株、ＣＨ／ＪＸ－２／２０１３株、ＡＨ２０１２株、ＧＤ－Ｂ株、ＢＪ－２０１１－１株、ＣＨ／ＦＪＮＤ－３／２０１１株、ＡＪ１１０２株、ＧＤ－Ａ株、ＣＨ／ＧＤＧＺ／２０１２株、ＣＨ／ＺＪＣＸ－１／２０１２株、ＣＨ／ＦＪＺＺ－９／２０１２株が挙げられる。遺伝子型２は、２０１０年～２０２０年まで、中国及び近隣諸国における主要な遺伝子型である。本発明によるウイルスは、培養の継代によって、又は遺伝子工学技術を用いて上述の突然変異を導入することによって、これら及び他の親株に由来し得る。他の実施形態において、上述のウイルスは、細胞培養の継代によって更に弱毒化され得る。したがって、他の実施形態において、上記の更に弱毒化されたウイルスは、配列番号１０又はそれと９０％同一である配列を含むゲノム配列を有するウイルスの子孫である。

[0063] 本発明は、好ましくは、本発明の変異型弱毒化生ＰＥＤＶと、薬学的に許容される担体と、を含むワクチン組成物を含む。本明細書で使用される場合、「本発明の弱毒化生ＰＥＤＶ」という表現は、本明細書に記載される変形例のうちの１つ以上を含む、任意の弱毒化生ＰＥＤＶ株を包含する。薬学的に許容される担体は、例えば、水、安定剤、防腐剤、培地、又は緩衝液であり得る。本発明の弱毒化ＰＥＤＶを含むワクチン製剤は、懸濁液の形態又は凍結乾燥形態で、又は代替として、凍結形態で調製され得る。凍結している場合、グリセロール又は他の同様の薬剤を添加して、凍結時の安定性を向上させることができる。弱毒化生ワクチンの利点は、一般に、天然形態にある感染病原体の全ての関連免疫原決定基が宿主の免疫系に提示されること、及びワクチン接種された宿主内で増殖する薬剤の能力に起因して、比較的少量の免疫化剤が必要であることを含む。

[0064] 生ワクチン用のウイルスの弱毒化は、ワクチン接種された標的動物に実質的に害を及ぼすには不十分な病原性であるように、好ましくは連続継代を含む既知の手順によって達成され得る。以下の参考文献は、コロナウイルスの弱毒化のための様々な一般的な方法を提供しており、本発明の実施において有用な株のいずれかの弱毒化又は更なる弱毒化に好適である。Ｂ．Ｎｅｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７９，Ｎｏ．１５，ｐｐ．９６６５－９６７６，２００５；Ｊ．Ｎｅｔｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖ ３９９（１），ｐｐ．１２０－１２８，２０１０；Ｙ－Ｐ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ３’７．３ｋｂ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｆｔｅｒ ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ ｐａｓｓａｇｅ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ ｅｇｇｓ，Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ｖ．３６（１），（Ａｂｓｔｒａｃｔ），２００７；及びＳ．Ｈｉｎｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖ．２００（１）１９９４，ｐｐ．１－１０；米国特許第３，９１４，４０８号を参照されたい；並びにＯｒｔｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３０８（１），ｐｐ．１３－２２，２００３。

[0065] 本発明において望ましい追加の遺伝子改変ワクチンは、当該技術分野で既知の技術によって生成される。そのような技術は、限定されないが、組換えＤＮＡの更なる操作、組換えタンパク質のアミノ酸配列の修飾又は置換等を含む。

[0066] 組換えＤＮＡ技術に基づく遺伝子改変ワクチンは、例えば、ブタにおいてより強い免疫応答又は防御応答を誘導する役割を果たすタンパク質（例えば、Ｍ、ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４、又はＧＰ５等に由来するタンパク質）をコードするウイルス遺伝子の代替部分を同定することによって作製される。ウイルスタンパク質遺伝子の様々なサブタイプ又は単離株を、ＤＮＡシャフリング法に供することができる。得られた異種キメラウイルスタンパク質は、広範に防御するサブユニットワクチンに使用することができる。代替として、そのようなキメラウイルス遺伝子又は免疫優性断片を、バキュロウイルスベクター等の標準的なタンパク質発現ベクターにクローニングして、適切な宿主細胞を感染させるために使用することができる（例えば、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，”Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，１９９２を参照されたい）。宿主細胞が培養され、したがって所望のワクチンタンパク質を発現し、これが所望の程度まで精製されて、好適なワクチン製品に製剤化され得る。

[0067] クローンが、疾患を引き起こす任意の望ましくない天然の能力を保持する場合、任意の残留する病原性に関与するウイルスゲノム内のヌクレオチド配列を特定し、例えば、部位特異的変異誘発によってウイルスを非病原性になるように遺伝子操作することも可能である。部位特異的変異誘発は、１つ以上のヌクレオチドを付加、欠失、又は変更することができる（例えば、Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ３：４７９－４８８，１９８４を参照のこと）。所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドを合成し、一本鎖ウイルスＤＮＡの一部分にアニーリングする。その手順から生じるハイブリッド分子は、細菌を形質転換するために使用される。次いで、適切な突然変異を含む単離された二本鎖ＤＮＡを使用して、後に好適な細胞培養にトランスフェクトされる後者の制限酵素断片とライゲーションすることにより、全長ＤＮＡを作製する。移入のための好適な転移ベクターへのゲノムのライゲーションは、当業者に既知の任意の標準的な技術によって達成され得る。ウイルス子孫の産生のための宿主細胞へのベクターのトランスフェクションは、リン酸カルシウム又はＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、及び他の周知の技術等の従来の方法のいずれかを使用して行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。次いで、クロー二ングされたウイルスは、所望の突然変異を示す。代替として、適切な突然変異を含む２つのオリゴヌクレオチドを合成することができる。これらをアニーリングして、全長ＤＮＡを生成するためにウイルスＤＮＡに挿入され得る二本鎖ＤＮＡを形成することができる。

[0068] 免疫学的有効量の本発明のワクチンは、ウイルス感染に対する防御を必要とするブタに投与される。ブタに接種する免疫学的有効量又は免疫原性量は、日常的な試験によって難なく決定され得るか又は容易に用量設定され得る。有効量は、ＰＥＤＶに曝露されるブタを防御するために、ワクチンに対する十分な免疫学的応答が獲得される量である。好ましくは、ブタは、ウイルス性疾患の有害な生理学的症状又は影響のうちの１つから全てが有意に軽減されるか、改善されるか、又は完全に予防される程度まで防御される。

[0069] 本発明のワクチンは、標準的な緩衝剤、安定剤、希釈剤、防腐剤、及び／又は可溶化剤等の動物にとって許容される担体を含むように、許容される慣習に従って製剤化され得、また徐放を容易にするようにも製剤化され得る。希釈剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等が挙げられる。等張性のための添加剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが挙げられる。安定剤としては、とりわけアルブミンが挙げられる。修飾生ワクチンの製剤化において特に有用なものを含む、他の好適なワクチンビヒクル及び添加剤は、当業者に既知であるか、又は明らかになるであろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ ｅｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。

[0070] 本発明によるワクチンは、限定されないが、経口、皮下、筋肉内、皮内、静脈内等を含む様々な方法で投与され得る。

[0071] 粘膜投与（経口、経鼻、直腸）のために製剤化された本発明のワクチンは、キトサン等の粘膜接着剤と共に製剤化されてもよい。

[0072] 注射又は注入による投与のために製剤化された本発明のワクチンは、とりわけ、例えば、アジュバント又はサイトカイン等の１つ以上の追加の免疫調節成分を更に含み得る。本発明のワクチンに使用され得るアジュバントの非限定的な例としては、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル等の鉱物ゲル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、例えば、フロイントの完全及び不完全アジュバント、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、ＡｔｌａｎｔａＧａ．）、ＱＳ－２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓ．）、ＳＡＦ－Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ Ｃａｌｉｆ．）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ又は他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、イオン性多糖類、並びにアブリジン脂質－アミンアジュバントが挙げられる。本発明のワクチンにおいて有用な水中油型エマルジョンの非限定的な例としては、修飾ＳＥＡＭ（登録商標）６２及びＳＥＡＭ（登録商標）１／２製剤が挙げられる。修飾ＳＥＡＭ（登録商標）６２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗浄剤（ＩＣＩ界面活性剤）、０．７％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０洗浄剤（ＩＣＩ界面活性剤）、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、２００ｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、１００μｇ／ｍｌのコレステロール、μ及び０．５％（ｖ／ｖ）のレシチンを含有する水中油型エマルジョンである。修飾ＳＥＡＭ（登録商標）１／２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗浄剤、０．７％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０洗浄剤、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、１００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、及び５０ｇ／ｍｌのコレステロールをμ含有する水中油型エマルジョンである。ワクチンに含まれ得る他の免疫調節剤としては、例えば、１つ以上のインターロイキン、インターフェロン、又は他の既知のサイトカインが挙げられる。

[0073] 追加のアジュバントシステムは、Ｔヘルパー細胞及びＢ細胞の両方のエピトープの組み合わせを可能にし、結果として１つ以上の種類の共有結合したＴ－Ｂエピトープ結合構造をもたらし、ＷＯ２００６／０８４３１９、ＷＯ２００４／０１４９５７、及びＷＯ２００４／０１４９５６に記載されるもののように更に脂質付加され得る。

[0074] 本発明のある特定の実施形態において、ＯＲＦＩ ＰＥＤＶタンパク質、又は他のＰＥＤＶタンパク質若しくはその断片は、後述するように、５％ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）と共に製剤化される。

[0075] 好ましいアジュバントは、約５％（ｖ／ｖ）のＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）（水酸化アルミニウムゲル）及び「２０％ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）」を約２５％の最終（ｖ／ｖ）で更に含む緩衝液中に、２ＭＬ用量として提供されてもよい。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）は、米国特許第５，０８４，２６９号に一般的に記載されており、軽油に溶解され、次いで、水中油型エマルジョンとして抗原の水溶液又は懸濁液に分散される、脱油レシチン（好ましくは大豆）を提供する。ＡＭＰＨＩＧＥＮは、米国特許第６，８１４，９７１号（その８～９欄を参照）のプロトコルに従って改善されており、本発明の最終的なアジュバントワクチン組成物で使用するための、いわゆる「２０％ＡＭＰＨＩＧＥＮ」成分を提供する。したがって、１０％レシチン及び９０％担体油（ＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）、Ｐｅｎｒｅｃｏ，Ｋａｒｎｓ Ｃｉｔｙ，Ｐａ．）のストック混合物を、０．６３％のリン酸緩衝生理食塩水溶液で１：４に希釈し、それによってレシチン及びＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）成分をそれぞれ２％及び１８％（すなわち、それらの元の濃度の２０％）に減少させる。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及びＳＰＡＮ（登録商標）８０界面活性剤を組成物に添加し、代表的かつ好ましい最終量を、５．６％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び２．４％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８０とし、この場合、Ｓｐａｎが最初にストックＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）成分中に提供され、ＳＰＡＮ（登録商標）が最初に緩衝生理食塩水成分から提供されるため、生理食塩水及びＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）成分の混合物は、最終的に所望の界面活性剤濃度をもたらす。ＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）／レシチンと生理食塩水溶液との混合物は、Ｉｎ－Ｌｉｎｅ Ｓｌｉｍ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ装置、モデル４０５（Ｃｈａｒｌｅ Ｒｏｓｓ ａｎｄ Ｓｏｎ、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）を使用して得ることができる。

[0076] ワクチン組成物はまた、追加のアジュバント成分として、ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）ＬＶ（ストック材料中に約２％の水酸化アルミニウム含有量）を含んでもよい（Ｒｅｈｅｉｓ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ、及びＣｈｅｍＴｒａｄｅ Ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ，ＵＳＡから入手可能）。０．６３％ＰＢＳを使用して更に希釈すると、最終ワクチン組成物は、２ＭＬ用量当たり以下の組成物量を含有する：５％（ｖ／ｖ）ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）ＬＶ；２５％（ｖ／ｖ）の「２０％ＡＭＰＨＩＧＥＮ」、すなわち、更に４倍希釈される）、及び０．０１％（ｗ／ｖ）のメルチオレート。

[0077] 当該技術分野で理解されるように、同等の最終ワクチン組成物を提供するために成分の添加順序が異なってもよい。例えば、緩衝液中にウイルスの適切な希釈物を調製することができる。次いで、実際の最終生成物中に所望の５％（ｖ／ｖ）濃度のＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）ＬＶを可能にするために、適切な量のＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）ＬＶ（約２％の水酸化アルミニウム含有量）ストック溶液をブレンドしながら添加することができる。一旦調製されると、この中間体ストック材料を適切な量の「２０％ＡＭＰＨＩＧＥＮ」ストック（上に概説したように、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及びＳＰＡＮ（登録商標）８０の必要量を既に含有している）と組み合わせて、再び２５％（ｖ／ｖ）の「２０％ＡＭＰＨＩＧＥＮ」を有する最終生成物を得る。適切な量のメルチオレート１０％を最終的に添加することができる。

[0078] 本発明のワクチン組成物は、抗原の総用量を、前述の抗原用量と比較して好ましくは１００倍変化させ得る（増加又は減少する）ように、最も好ましくは１０倍以下に変化させ得る（増加又は減少する）ように、全ての成分の変動を許容する。同様に、界面活性剤の濃度（Ｔｗｅｅｎ又はＳｐａｎのいずれか）は、互いに独立して最大１０倍まで変化させることができるか、又は、当該技術分野で十分に理解されている適切な濃度の類似の材料によって置き換えられ、完全に除去されてもよい。

[0079] 最終製品中のＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）の濃度は、最初に他の多くの製造業者から入手可能な同等の材料（すなわち、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）、Ｂｒｅｎｎｔａｇ；Ｄｅｎｍａｒｋ）の使用によって、又は、ＣＧ、ＨＰＡ、又はＨＳ等の、ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）製品種目の更なるバリエーションを使用することによって、変化させることができる。一例としてＬＶを使用すると、０％～２０％を含むその最終有効濃度は、２～１２％がより好ましく、４～８％が最も好ましい。同様に、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）の最終濃度（「２０％ＡＭＰＨＩＧＥＮ」の％として表される）は、好ましくは２５％であり、この量は、５～５０％、好ましくは２０～３０％と異なってもよく、最も好ましくは約２４～２６％である。

[0080] 本発明の免疫原性組成物及びワクチン組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は安定剤を更に含むことができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２００５，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓを参照のこと）。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、投薬量及び濃度でレシピエントにとって無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等の緩衝剤；防腐剤（例えば（（ｏ－カルボキシフェニル）チオ）エチル水銀ナトリウム塩（ＴＨＩＯＭＥＲＳＡＬ（登録商標））、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンズアルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル、若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール等）；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；並びに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、若しくはＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）等の非イオン性界面活性剤を含み得る。

[0081] 本発明のワクチンは、注射による投与のために、又は粘液表面（経口、経鼻、直腸等）への投与のために製剤化されるかどうかにかかわらず、本発明のウイルス、感染性ＤＮＡ分子、プラスミド、又はウイルスベクターの徐放のために任意選択的に製剤化され得る。そのような徐放製剤の例は、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸・グリコール酸共重合体）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン等の生体適合性ポリマーの複合体と組み合わせた、ウイルス、感染性ＤＮＡ分子、プラスミド、又はウイルスベクターを含む。薬物送達ビヒクルにおける分解性ポリマーの構造、選択及び使用は、参照により本明細書に組み込まれるＡ．Ｄｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３：２７９－２９２に概説されている。医薬製剤中のポリマーの選択及び使用に関する更なるガイダンスは、当該技術分野で既知のテキスト、例えば、Ｍ．Ｃｈａｓｉｎ ａｎｄ Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ（ｅｄｓ），１９９０，”Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ”ｉｎ：Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４５，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹに見出すことができ、同様に参照により本明細書に組み込まれる。代替として又は追加として、ウイルス、プラスミド、又はウイルスベクターは、投与及び有効性を改善するためにマイクロカプセル化され得る。抗原をマイクロカプセル化するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第３，１３７，６３１号、米国特許第３，９５９，４５７号、米国特許第４，２０５，０６０号、米国特許第４，６０６，９４０号、米国特許第４，７４４，９３３号、米国特許第５，１３２，１１７号、及び国際特許公開第９５／２８２２７号に記載されている技術を含み、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。

[0082] リポソームも、ウイルス、プラスミド、ウイルスタンパク質、又はウイルスベクターの徐放を提供するために使用され得る。リポソーム製剤の作製及び使用方法に関する詳細は、とりわけ、米国特許第４，０１６，１００号、米国特許第４，４５２，７４７号、米国特許第４，９２１，７０６号、米国特許第４，９２７，６３７号、米国特許第４，９４４，９４８号、米国特許第５，００８，０５０号、及び米国特許第５，００９，９５６号に見出すことができ、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。

[0083] 上述のワクチンのいずれの有効量も、低用量のウイルス、ウイルスタンパク質プラスミド、又はウイルスベクターから開始して、その後、効果をモニタリングしながら投薬量を増加させるという、従来の手段によって決定することができる。有効量は、ワクチンの単回投与後、又はワクチンの複数回投与後に得ることができる。動物当たりの最適な用量を決定する場合、既知の要因を考慮に入れることができる。これらには、動物の種、サイズ、年齢、及び全身の状態、動物における他の薬物の存在等が含まれる。実際の投薬量は、好ましくは、他の動物実験の結果を考慮した後に選択される。

[0084] 十分な免疫応答が達成されたかどうかを検出する１つの方法は、ワクチン接種後の動物における血清転換及び抗体力価を決定することである。ワクチン接種のタイミング、及び存在する場合はブースターの回数は、好ましくは、全ての関連因子（それらのいくつかは上述されている）の分析に基づいて医師又は獣医師によって決定される。

[0085] 本発明のウイルス、タンパク質、感染性ヌクレオチド分子、プラスミド、又はウイルスベクターの有効用量は、ワクチン接種される動物の体重等の当業者によって決定され得る要因を考慮に入れて、既知の技術を使用して決定され得る。本発明のワクチンにおける本発明のウイルスの投与量は、好ましくは、約１０^１～約１０^９ｐｆｕ（プラーク形成単位）、より好ましくは約１０^２～約１０^８ｐｆｕ、最も好ましくは約１０^３～約１０^７ｐｆｕの範囲である。本発明のワクチンにおける本発明のプラスミドの投与量は、好ましくは、約０．１μｇ～約１００ｍｇ、より好ましくは約１μｇ～約１０ｍｇ、更により好ましくは約１０μｇ～約１ｍｇの範囲である。本発明のワクチンにおける本発明の感染性ＤＮＡ分子の投与量は、好ましくは、約０．１μｇ～約１００ｍｇ、より好ましくは約１μｇ～約１０ｍｇ、更により好ましくは約１０μｇ～約１ｍｇの範囲である。本発明のワクチンにおける本発明のウイルスベクターの投与量は、好ましくは、約１０^１ｐｆｕ～約１０^９ｐｆｕ、より好ましくは約１０^２ｐｆｕ～約１０^８ｐｆｕ、更により好ましくは約１０^３～約１０^７ｐｆｕの範囲である。好適な投薬量サイズは、約０．５ｍｌ～約１０ｍｌ、より好ましくは約１ｍｌ～約５ｍｌの範囲である。

[0086] 本発明の実践によるウイルスタンパク質又はペプチドワクチン（例えば、上述のスパイクタンパク質断片）の好適な用量は、一般に、用量当たり１～５０マイクログラムの範囲であるか、又は標準的な方法によって決定され得るそれより多い量の範囲であり、アジュバントの量は、各そのような物質に関して認識されている方法によって決定される。ブタのワクチン接種に関連する本発明の好ましい例において、動物に最適な年齢標的は、離乳前の約１～２１日であり、これはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するワクチン等の他の予定されているワクチン接種にも対応し得る。加えて、交配用の経産ブタに好ましいワクチン接種スケジュールには、毎年の再ワクチン接種スケジュールによる同様の用量が含まれる。

投薬
[0087] 好ましい臨床的適応は、交配用の経産ブタ及び分娩前の未経産ブタの両方における治療、管理及び予防、それに続く子ブタのワクチン接種である。代表的な例（経産ブタ及び未経産ブタの両方に適用可能）では、２回の２ＭＬ用量のワクチンが使用されるが、当然、用量の実際の体積は、動物のサイズも考慮に入れた、ワクチンがどのように製剤化されるかの関数であり、０．１～５ＭＬの範囲の実際の投与量である。単回用量のワクチン接種も適切である。

[0088] 第１の用量は、早ければ交配前から分娩前５週間に投与されてもよく、第２の用量は、好ましくは分娩前約１～３週間に投与され得る。ワクチンの用量は、好ましくは、約１０^６～１０^８、より好ましくは約１０^７～１０^７．５のＴＣＩＤ_５０（組織培養感染量）に対応するウイルス材料の量を提供し、当該技術分野で認識されるように、更に変化させることができる。ブースター用量は、任意の後続の分娩の２～４週間前に投与することができる。筋肉内ワクチン接種（全ての用量）が好ましいが、用量のうちの１回以上は皮下投与されてもよい。経口投与も好ましい。ワクチン接種は、計画感染又は自然感染によって達成される場合、ナイーブ動物及び非ナイーブ動物にも有効であり得る。

[0089] 更なる好ましい例では、経産ブタ及び未経産ブタは、分娩前約８週間、次いで分娩前２週間に、筋肉内又は経口的にワクチン接種される。これらの条件下で、ＰＥＤＶ陰性のワクチン接種された経産ブタが中和活性を有する抗体（血清試料からの中和力価を蛍光焦点により測定）を生じ、これらの抗体がそれらの子ブタに受動的に移行されたことから、防御免疫応答を実証することができる。本発明のプロトコルは、既に血清陽性である経産ブタ及び未経産ブタ、並びに子ブタ及び種ブタの処置にも適用可能である。また、ブースターワクチン接種が行われてもよく、これらは、同じ又は異なる投与経路を介してもよい。任意の後続の分娩に先立って経産母ブタに再度ワクチン接種することが好ましいが、経産母ブタが前回の分娩と関連してワクチン接種されたのみの場合であっても、本発明のワクチン組成物は、それでもなお、抗体の継続的な受動的移行により子ブタに防御を提供することができる。

[0090] 子ブタは、その後、早ければ生後１日目にワクチン接種されてもよいことに留意されたい。例えば、特に、経産親ブタが交配前にワクチン接種されたが、分娩前にはワクチン接種されなかった場合、１日目に子ブタにワクチン接種することができ、３週齢でブースター投与を行っても行わなくてもよい。子ブタのワクチン接種は、自然感染又は計画感染のいずれかに起因して、経産親ブタが以前はナイーブではなかった場合にも有効であり得る。子ブタのワクチン接種は、母ブタが以前にウイルスに曝露されたことがない場合、又は分娩前にワクチン接種されていない場合にも、有効であり得る。種ブタ（典型的には交配目的で飼育される）は、６ヶ月ごとに１回ワクチン接種されるべきである。投与量の変動は、十分に当該技術分野の実施の範囲内である。本発明のワクチンは、妊娠中の動物（全ての妊娠期間）及び新生ブタにおける使用に安全であることに留意されたい。本発明のワクチンは、新生ブタを含む最も感受性の高い動物であっても許容される安全性のレベル（すなわち、死亡が見られず、新生ブタにとって正常である一過性の軽度の単数又は複数の臨床徴候のみ）まで弱毒化される。当然のことながら、ＰＥＤＶの流行と持続的な低レベルのＰＥＤＶの発生の両方からブタの群れを防御するという観点からは、継続的な経産ブタのワクチン接種プログラムが非常に重要である。ＰＥＤＶ ＭＬＶで免疫された経産ブタ又は未経産ブタは、ＰＥＤＶ特異的ＩｇＡを含む免疫を子ブタに受動的に移行させ、ＰＥＤＶ関連疾患及び死亡から子ブタを防御することを理解されたい。加えて、一般に、ＰＥＤＶ ＭＬＶで免疫されたブタは、その糞便中に排出されるＰＥＤＶの量及び／若しくは持続時間が少なくなるか、又はＰＥＤＶから防御され、更に、ＰＥＤＶ ＭＬＶで免疫されたブタは、ＰＥＤＶに起因する体重減少及び体重増加の失敗から防御され、更に、ＰＥＤＶ ＭＬＶは、ＰＥＤＶ伝播サイクルの停止又は制御に役立つ。

[0091] また、本発明のワクチンを予防接種された動物は、２１日以下等の任意の長期にわたる屠殺保留期間もなく、直ちに食用として安全であることに留意されたい。

[0092] 治療的に提供される場合、ワクチンは、実際の感染の徴候が検出されてから有効量で提供される。既存の感染症の治療に好適な投与量としては、用量当たり約１０^６～約１０^９ＴＣＩＤ_５０以上のウイルス（ワクチン放出に対する最小免疫量）が挙げられる。組成物は、レシピエントがその投与に耐容性を示し得る場合、「薬理学的に許容される」と言われる。そのような組成物は、投与される量が生理学的に有意である場合、「治療的又は予防的有効量」で投与されると言われる。

[0093] 本発明の少なくとも１つのワクチン又は免疫原性組成物が、本明細書に記載の医薬組成物を使用して、意図される目的を達成する任意の手段によって投与され得る。例えば、そのような組成物の投与経路は、非経口、経口、口腔鼻、鼻腔内、気管内、局所、皮下、筋肉内、経皮、皮内、腹腔内、眼内、及び静脈内投与によるものであり得る。本発明の一実施形態において、組成物は、筋肉内に投与される。非経口投与は、ボーラス注射によって、又は経時的に段階的灌流によって行うことができる。注射器、点滴器、無針注射デバイス、パッチ等を含む任意の好適なデバイスが、組成物を投与するために使用され得る。使用のために選択される経路及びデバイスは、アジュバントの組成、抗原、及び対象に依存し、それらは当業者に周知である。経口投与、又は代替として皮下投与が好ましい。経口投与は、水を介して、又は飼料（固形又は液体飼料）を介して直接的であってもよい。液体形態で提供される場合、飼料に直接添加する（ミックスイン又はトップドレス）ために、又は別様に水若しくは液体飼料に添加するように、ワクチンは、凍結乾燥されて再構成されるか、又はペーストとして提供され得る。

[0094] 更に別の態様において、本発明のタンパク質、核酸配列、及びウイルスは、当業者が、以前に感染した動物と、上述のワクチンを予防接種された動物とを区別することを可能にするであろう。例えば、本発明による切断されたＳタンパク質断片に結合する（例えば、配列番号４を標的とすることによって）が、野生型Ｓタンパク質には結合しない抗体を作製することができる。抗体はまた、新しいＯＲＦ（配列番号５）によって発現されるアミノ酸配列に対して作製することができる。抗体を作製する方法は、当該技術分野で周知であり、当業者は、本発明に好適なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を調製するために過度の実験に従事する必要はない。本発明による単離されたタンパク質も調製することができる。例えば、試験動物の血液試料からの抗体と配列番号５との反応は、動物がワクチン接種されたことを示唆するであろう。

[0095] 他の実施形態において、試験動物由来の試料中の本発明によるウイルスの存在は、第１又は第２の欠失を標的とするプライマーを使用して検出することができる。例えば、プライマーが第１の欠失内の領域を増幅するように設計されている場合、ＰＣＲ反応産物の不在は、試料中の本発明によるウイルスの存在を示し得る。

[0096] 本開示はまた、以下の項目を提供する：

[0097] 項目１．ブタ流行性下痢（ＰＥＤ）ウイルスのＣ末端切断スパイクタンパク質であって、配列番号１（ＹＥＶＦＥＫＶＨＶＱ）又は配列番号１を含む配列を欠き、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列又はそのＣ末端切断変異体を含むが、但し、ＰＥＤＶの上記Ｃ末端切断スパイクタンパク質が少なくとも１２００アミノ酸長であることを条件とする、ＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質。

[0098] 項目２．ＰＥＤＶの上記Ｃ末端切断スパイクタンパク質が少なくとも１２５０アミノ酸長であることを条件とする、項目１に記載のＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質。

[0099] 項目３．ＰＥＤＶの上記Ｃ末端切断スパイクタンパク質が少なくとも１３００アミノ酸長であることを条件とする、項目１に記載のＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質。

[00100] 項目４．ＰＥＤＶの上記Ｃ末端切断スパイクタンパク質が少なくとも１３７０アミノ酸長であることを条件とする、項目１に記載のＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質。

[00101] 項目５．配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～４のいずれか一項に記載のＣ末端切断スパイクタンパク質。

[00102] 項目６．配列番号２と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～４のいずれか一項に記載のＣ末端切断スパイクタンパク質。

[00103] 項目７．配列番号２の保存的に置換された変異体である、項目４～６のいずれか一項に記載のＣ末端切断スパイクタンパク質。

[00104] 項目８．項目１～７のいずれか一項に記載のＣ末端切断スパイクタンパク質をコードする、核酸配列。

[00105] 項目９．項目１～７のいずれか一項に記載のＣ末端切断スパイクタンパク質、又は項目８に記載の核酸配列を含む、ウイルス。

[00106] 項目１０．配列番号３、又はそれと少なくとも９０％同一である配列を含むアミノ酸配列であるが、但し、上記配列番号３のＣ末端アミノ酸がＱＰＬＡＬ（配列番号４）であることを条件とする、アミノ酸配列。

[00107] 項目１１．配列が、配列番号３と少なくとも９５％同一である、項目１０に記載のアミノ酸配列。

[00108] 項目１２．配列が、配列番号３と少なくとも９９％同一である、項目１０に記載のアミノ酸配列。

[00109] 項目１３．配列番号３の保存的に置換された変異体である、項目１０～１２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。

[00110] 項目１４．項目１０～１３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列をコードする、核酸配列。

[00111] 項目１５．項目１０～１３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列をコードするＯＲＦを含むゲノムを有する、ウイルス。

[00112] 項目１６．配列番号５を含む、アミノ酸配列。

[00113] 項目１７．項目１６に記載のアミノ酸配列をコードするＯＲＦを含むゲノムを有する、ウイルス。

[00114] 項目１８．ＰＥＤＶである、項目９、１５、１７のいずれか一項に記載のウイルス。

[00115] 項目１９．ＯＲＦ－２及びＯＲＦ３を含むＰＥＤＶであるが、但し、ウイルスが上記ＯＲＦ２／ＯＲＦ３に第１の欠失を含み、上記第１の欠失が、配列番号６の欠失又は配列番号６を含む核酸配列の欠失であることを条件とし、上記ウイルスが、配列番号３、又はそれと少なくとも９０％同一である配列を含むアミノ酸配列を発現することを条件とし、更に、上記配列番号３のＣ末端アミノ酸がＱＰＬＡＬ（配列番号４）であることを条件とする、ＰＥＤＶ。

[00116] 項目２０．上記ＯＲＦ－３に第２の欠失を更に含み、上記第２の欠失が、配列番号７の欠失又は配列番号７を含む核酸配列の欠失である、項目２０に記載のＰＥＤＶ。

[00117] 項目２１．上記ウイルスが、Ｅ、Ｍ、及びＮタンパク質をコードする野生型ＯＲＦを含む、項目１９又は２０に記載のＰＥＤＶ。

[00118] 項目２２．第１の欠失と第２の欠失とが異なる、項目１９～２１のいずれか一項に記載のＰＥＤＶ。

[00119] 項目２３．ＯＲＦ－３によって発現される機能的タンパク質を欠く、項目１８～２２のいずれか一項に記載のＰＥＤＶ。

[00120] 項目２４．配列番号１０、又はそれと少なくとも９０％同一である配列によるゲノムを有する、項目１８～２３のいずれか一項に記載のＰＥＤＶ。

[00121] 項目２５．ＤＪ株、ＡＪ１１０２株、ＣＨ／ＺＪＣＳ０３／２０１２株、ＣＨ／ＪＸＺＳ０３／２０１４株、ＣＨ／ＪＸＦＸ０１／２０１４株、ＣＨ／ＪＸＪＪ０８／２０１５株、ＣＨ／ＪＸＧＺ０４／２０１５株、ＣＨ／ＪＸＪＡ８９／２０１５株、ＣＨ／ＪＸＤＸ１１９／２０１６株、ＣＨ／ＪＸＪＧＳ１１／２０１６株、ＣＨ／ＪＸＷＮ１３／２０１６株、ＣＨ／ＪＸＪＪ１８／２０１７株、ＣＨ／ＪＸＮＣ３８／２０１７株、ＣＨ／ＪＸ／０１株、ＣＨ／ＪＸ－１／２０１３株、ＣＨ／ＪＸ－２／２０１３株、ＡＨ２０１２株、ＧＤ－Ｂ株、ＢＪ－２０１１－１株、ＣＨ／ＦＪＮＤ－３／２０１１株、ＡＪ１１０２株、ＧＤ－Ａ株、ＣＨ／ＧＤＧＺ／２０１２株、ＣＨ／ＺＪＣＸ－１／２０１２株、ＣＨ／ＦＪＺＺ－９／２０１２株からなる群から選択されるＰＥＤＶ株に由来する、項目１８～２４のいずれか一項に記載のＰＥＤＶ。

[00122] 項目２６．ＰＥＤＶ株ＤＪに由来する、項目１８～２４に記載のＰＥＤＶ。

[00123] 項目２７．請求項２４に記載の親ＰＥＤＶの子孫である、更に弱毒化されたＰＥＤＶ。

[00124] 項目２８．上記親ＰＥＤＶが、配列番号１０によるゲノムを有する、請求項２７に記載の更に弱毒化されたＰＥＤＶ。

[00125] 項目２９．項目１８～２６のいずれか一項に記載のＰＥＤＶ、又は項目２７若しくは項目２８に記載の更に弱毒化されたＰＥＤＶを含む、ワクチン。

[00126] 項目３０．項目１８～２６のいずれか一項に記載のＰＥＤＶが弱毒化されている、項目２９に記載のワクチン。

[00127] 項目３１．ブタ動物をＰＥＤＶ感染から予防する方法であって、項目２９又は３０に記載のワクチンを上記ブタに投与することを含む、方法。

[00128] 項目３２．上記ワクチンが経口投与される、項目３１に記載の方法。

[00129] 項目３３．上記ブタ動物が、経産ブタであり、上記ワクチンが、分娩の約２８～４２日前に１回目に投与され、更に上記ワクチンが、分娩の約７～２１日前に２回目に投与される、項目３１又は３２に記載の方法。

[00130] 項目３４．子ブタをＰＥＤＶ感染から防御する方法であって、項目２９に記載のワクチンを予防接種された経産ブタからの初乳を上記子ブタに投与することを含む、方法。

[00131] 項目３５．上記第１のワクチン接種及び／又は上記第２のワクチン接種が、経口である、項目３４に記載の方法。

[00132] 項目３６．上記子ブタが少なくとも３日齢である、項目３４又は３５に記載の方法。

[00133] 項目３７．上記子ブタが少なくとも５日齢である、項目３６に記載の方法。

[00134] 項目３８．上記経産ブタが、分娩から約３５日後にワクチン接種された、項目３４～３７のいずれか一項に記載の方法。

[00135] 項目３９．上記経産ブタが、分娩から約１４日後にワクチン接種された、項目３４～３８のいずれか一項に記載の方法。

[00136] 以下の実施例は、例示的な実施形態として提示されるが、本発明の範囲を限定するものとしてとられるべきではない。本発明の多くの変更例、変形例、修正例、並びに他の使用及び用途は、当業者には明らかであろう。

実施例１－ＰＥＤＶワクチンの安全性
[00137] 中国南部からの伝染性の高い流行性ＰＥＤＶ株であり、Ｇ２ａ群に属するＰＥＤＶ－ＤＪを、最大５７回の継代のためにＶｅｒｏ細胞内で連続的に増殖させた。異なる継代のウイルスのＯＲＦ２－ＯＲＦ３領域を配列決定して、病原性関連突然変異及び遺伝的安定性をモニタリングした。配列決定に使用したプライマーは以下の通りであった：
ＯＲＦ３ ２４６５５－Ｆ：５’－ＴＣＡ ＴＴＡ ＣＴＡ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＧＣ ＴＧＣ ＡＴＴ ＴＣ－３’（配列番号１１）、
ＯＲＦ３ ２５５４１－Ｒ：５’－ＣＡＣ ＡＧＡ ＴＴＡ ＡＣＣ ＡＡＴ ＴＧＧ ＡＣＧ ＡＡＧ ＧＴ－３’（配列番号１２）

[00138] 連続継代ウイルスの電気泳動マップを図１に提供する。細胞適応ＰＥＤＶ株の異なる継代のＯＲＦ２－ＯＲＦ３領域。ＯＲＦ２－ＯＲＦ３領域に大きな断片欠失を有する変異体を、Ｐ４９で同定した（矢印）。

[00139] ワクチン株の安全性を検証するために、５～７日齢の哺乳子ブタにＰＥＤＶワクチン株（１０^７ＴＣＩＤ_５０／ブタ）を経口接種した。臨床徴候（全体的な行動、食欲）、特に消化器系の臨床症状を評価した。糞便形態をスコア化し、接種後の死亡／生存子ブタの数を数えた。

[00140] 両方の群の子ブタが生存していた。本発明によるＰＥＤＶをワクチン接種された子ブタ及びワクチン接種されなかった子ブタの小腸において、顕著な目に見える違いは認められなかった。対照的に、ＰＥＤＶの病原性株を接種された子ブタの小腸は、貯留した黄色の液体で膨張し、絨毛萎縮の結果として薄い透明な壁を有していた。

[00141] 糞便の一貫性スコアは、以下の基準に従って評価した：１－正常な糞便（固体）；２－ペースト状；半固体；３－黄色がかり、水様性。ワクチン接種されなかった子ブタと、本発明のＰＥＤＶ株でワクチン接種された子ブタの糞便一貫性スコア間に差は見られなかった。

実施例２－病原性は復帰しない
[00142] ５～７日齢の哺乳子ブタに、１０^７ＴＣＩＤ_５０のＰＥＤＶワクチン株を経口接種した。臨床徴候（全体的な精神状態、食欲）、特に消化器系の臨床症状を評価した。糞便形態をスコア化し、死亡／生存動物の数を数えて、株の安全性を総合的に評価した。接種後３日目に、感染した子ブタを安楽死させた。小腸及び小腸の内容物を採取し、次のラウンドの子ブタに接種するための抗原として使用した。この接種パターンを５回繰り返し、病原性復帰試験を完了した。各ラウンドの接種からの臨床試料をワクチン株の単離のために使用し、ワクチン株の遺伝子マーカーの領域を各ラウンドの接種について配列決定した。２つの基準、すなわち子ブタの遺伝的安定性及び罹患率を使用して、ワクチン株の病原性を評価した。

[00143] 図２は、５回連続継代したウイルスの核酸の電気泳動マップであり、ウイルスが遺伝的に安定であることを示している。実験終了時には、全ての子ブタが生存していた。

[00144] これらの動物試験から、各継代の臨床徴候及び子ブタの生存率に基づいて、ワクチン株の病原性が著しく低下した一方で、ＯＲＦ２－ＯＲＦ３領域の遺伝子マーカーは、子ブタにおける５回の継代後も安定したままであることが明らかになった。結論として、ＰＥＤＶワクチン株は、表現型及び遺伝子型の両方において安定である。

実施例３－免疫原性
[00145] ６頭のナイーブ経産ブタを経口免疫し、分娩の６０日前及び１４日前にそれぞれブーストした。各用量のワクチンは、実施例１に記載の１×１０^５ＴＣＩＤ_５０／ｍｌのウイルスを含有していた。経産ブタからの子ブタを、ＰＥＤＶ ＴＭ株、１０^２ＴＣＩＤ_５０／ｍｌを用いて５～７日齢で経口チャレンジし、チャレンジ後１０日間、臨床症状及び死亡／生存を観察した。

[00146] 加えて、経産ブタ（最初の免疫日及び分娩時）及び哺乳子ブタ（５～７日齢及びチャレンジ後１０日）から血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ ＰＥＤＶ－ＩｇＡ ＥＬＩＳＡキット）及びＳＮアッセイ（自己確立型のアッセイ、検証済み）によって評価した。

[00147] 免疫された経産ブタからの子ブタの生存率は１００％であったが、陰性対照からの子ブタはいずれもチャレンジ後に生存していなかった。免疫された経産ブタ及びチャレンジ後の子ブタは、清潔かつ活動的であり、積極的に乳を飲み、下痢の臨床徴候を示さなかった。

[00148] 図３は、予備免疫日及び分娩日（２回目の免疫の１４日後）の経産ブタのＰＥＤＶ抗体レベルを示す。経産ブタＣは、免疫失敗のために更なる分析から除外され、経産ブタＤは、ＰＥＤＶ抗原の代わりにＰＢＳのみで経口免疫された対照経産ブタである。残りの６頭の経産ブタにおいて、抗体レベルが防御力価に達した。

[00149] 図４は、３～５日齢の哺乳ブタにおける抗体レベルを示す。これらは、上述のように、以前にワクチン接種された母ブタの初乳によって子ブタに移行される母体抗体である。

[00150] 総合すると、これらのデータは、分娩前の経産ブタへの本発明によるウイルスの経口投与が、防御免疫を哺乳子ブタに移行させるのに十分であり、上記子ブタを病原性株ＰＥＤＶによるチャレンジから防護することを示す。

[00151] 本明細書に引用される全ての刊行物、特許刊行物及び非特許刊行物の両方は、本発明が関連する当業者の技能のレベルを示す。これらの全ての刊行物は、各々の個々の刊行物が参照によって組み込まれるものとして具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照によって完全に本明細書に組み込まれる。

[00152] 本明細書の本発明は、特定の実施形態を参照して説明されてきたが、これらの実施形態は、本発明の原理及び用途の単なる例示であることを理解されたい。したがって、例示的な実施形態に多数の修正が加えられ得、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、他の構成が考案され得ることを理解されたい。

Claims (39)

1. ＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質であって、配列番号１（ＹＥＶＦＥＫＶＨＶＱ）又は配列番号１を含む配列を欠き、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列又はそのＣ末端切断変異体を含むが、但し、ＰＥＤＶの前記Ｃ末端切断スパイクタンパク質が少なくとも１２００アミノ酸長であることを条件とする、ＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質。
2. ＰＥＤＶの前記Ｃ末端切断スパイクタンパク質が少なくとも１２５０アミノ酸長であることを条件とする、請求項１に記載のＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質。
3. ＰＥＤＶの前記Ｃ末端切断スパイクタンパク質が少なくとも１３００アミノ酸長であることを条件とする、請求項１に記載のＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質。
4. ＰＥＤＶの前記Ｃ末端切断スパイクタンパク質が少なくとも１３７０アミノ酸長であることを条件とする、請求項１に記載のＰＥＤＶのＣ末端切断スパイクタンパク質。
5. 配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣ末端切断スパイクタンパク質。
6. 配列番号２と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣ末端切断スパイクタンパク質。
7. 配列番号２の保存的に置換された変異体である、請求項４～６のいずれか一項に記載のＣ末端切断スパイクタンパク質。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載のＣ末端切断スパイクタンパク質をコードする、核酸配列。
9. 請求項１～７のいずれか一項に記載のＣ末端切断スパイクタンパク質、又は請求項８に記載の核酸配列を含む、ウイルス。
10. 配列番号３、又はそれと少なくとも９０％同一である配列を含むアミノ酸配列であるが、但し、前記配列番号３のＣ末端アミノ酸がＱＰＬＡＬ（配列番号４）であることを条件とする、アミノ酸配列。
11. 前記配列が、配列番号３と少なくとも９５％同一である、請求項１０に記載のアミノ酸配列。
12. 前記配列が、配列番号３と少なくとも９９％同一である、請求項１０に記載のアミノ酸配列。
13. 配列番号３の保存的に置換された変異体である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
14. 請求項１０～１３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列をコードする、核酸配列。
15. 請求項１０～１３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列をコードするＯＲＦを含むゲノムを有する、ウイルス。
16. 配列番号５を含む、アミノ酸配列。
17. 請求項１６に記載のアミノ酸配列をコードするＯＲＦを含むゲノムを有する、ウイルス。
18. ＰＥＤＶである、請求項９、１５、１７のいずれか一項に記載のウイルス。
19. ＯＲＦ－２及びＯＲＦ３を含むＰＥＤＶであるが、但し、前記ウイルスが前記ＯＲＦ２／ＯＲＦ３に第１の欠失を含み、前記第１の欠失が、配列番号６の欠失又は配列番号６を含む核酸配列の欠失であることを条件とし、前記ウイルスが、配列番号３、又はそれと少なくとも９０％同一である配列を含むアミノ酸配列を発現することを条件とし、更に、前記配列番号３のＣ末端アミノ酸がＱＰＬＡＬ（配列番号４）であることを条件とする、ＰＥＤＶ。
20. 前記ＯＲＦ－３に第２の欠失を更に含み、前記第２の欠失が、配列番号７の欠失又は配列番号７を含む核酸配列の欠失である、請求項２０に記載のＰＥＤＶ。
21. 前記ウイルスが、Ｅ、Ｍ、及びＮタンパク質をコードする野生型ＯＲＦを含む、請求項１９又は２０に記載のＰＥＤＶ。
22. 前記第１の欠失と前記第２の欠失とが異なる、請求項１９～２１のいずれか一項に記載のＰＥＤＶ。
23. ＯＲＦ－３によって発現される機能的タンパク質を欠く、請求項１８～２２のいずれか一項に記載のＰＥＤＶ。
24. 配列番号１０、又はそれと少なくとも９０％同一である配列によるゲノムを有する、請求項１８～２３のいずれか一項に記載のＰＥＤＶ。
25. ＤＪ株、ＡＪ１１０２株、ＣＨ／ＺＪＣＳ０３／２０１２株、ＣＨ／ＪＸＺＳ０３／２０１４株、ＣＨ／ＪＸＦＸ０１／２０１４株、ＣＨ／ＪＸＪＪ０８／２０１５株、ＣＨ／ＪＸＧＺ０４／２０１５株、ＣＨ／ＪＸＪＡ８９／２０１５株、ＣＨ／ＪＸＤＸ１１９／２０１６株、ＣＨ／ＪＸＪＧＳ１１／２０１６株、ＣＨ／ＪＸＷＮ１３／２０１６株、ＣＨ／ＪＸＪＪ１８／２０１７株、ＣＨ／ＪＸＮＣ３８／２０１７株、ＣＨ／ＪＸ／０１株、ＣＨ／ＪＸ－１／２０１３株、ＣＨ／ＪＸ－２／２０１３株、ＡＨ２０１２株、ＧＤ－Ｂ株、ＢＪ－２０１１－１株、ＣＨ／ＦＪＮＤ－３／２０１１株、ＡＪ１１０２株、ＧＤ－Ａ株、ＣＨ／ＧＤＧＺ／２０１２株、ＣＨ／ＺＪＣＸ－１／２０１２株、ＣＨ／ＦＪＺＺ－９／２０１２株からなる群から選択されるＰＥＤＶ株に由来する、請求項１８～２４のいずれか一項に記載のＰＥＤＶ。
26. ＰＥＤ株ＤＪに由来する、請求項１８～２４に記載のＰＥＤＶ。
27. 請求項２４に記載の親ＰＥＤＶの子孫である、更に弱毒化されたＰＥＤＶ。
28. 前記親ＰＥＤＶが、配列番号１０によるゲノムを有する、請求項２７に記載の更に弱毒化されたＰＥＤＶ。
29. 請求項１８～２６のいずれか一項に記載のＰＥＤＶ、又は請求項２７若しくは２８に記載の更に弱毒化されたＰＥＤＶを含む、ワクチン。
30. 請求項１８～２６のいずれか一項に記載のＰＥＤＶが弱毒化されている、請求項２９に記載のワクチン。
31. ブタ動物をＰＥＤＶ感染から予防する方法であって、請求項２９又は３０に記載のワクチンを前記ブタに投与することを含む、方法。
32. 前記ワクチンが経口投与される、請求項３１に記載の方法。
33. 前記ブタ動物が、経産ブタであり、前記ワクチンが、分娩の約２８～４２日前に１回目に投与され、更に前記ワクチンが、前記分娩の約７～２１日前に２回目に投与される、請求項３１又は３２に記載の方法。
34. 子ブタをＰＥＤＶ感染から防御する方法であって、請求項２９又は３０に記載のワクチンを予防接種された経産ブタからの初乳を前記子ブタに投与することを含む、方法。
35. 前記第１のワクチン接種及び／又は前記第２のワクチン接種が、経口である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記子ブタが少なくとも３日齢である、請求項３４又は３５に記載の方法。
37. 前記子ブタが少なくとも５日齢である、請求項３６に記載の方法。
38. 前記経産ブタが、分娩から約３５日後にワクチン接種された、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記経産ブタが、分娩から約１４日後にワクチン接種された、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。