JP2023541262A

JP2023541262A - Ｌｅｍｕｒチロシンキナーゼ３の小分子阻害剤

Info

Publication number: JP2023541262A
Application number: JP2023516150A
Authority: JP
Inventors: ジアマス，ジョージ; スペンサー，ジョン
Original assignee: ザユニバーシティーオブサセックス
Priority date: 2020-09-14
Filing date: 2021-09-14
Publication date: 2023-09-29
Also published as: EP4210697A1; US20230355617A1; WO2022053838A1

Abstract

本発明は、式（Ｉ）の化合物、およびそれを含む組成物に関する。化合物および組成物は、Ｌｅｍｕｒチロシンキナーゼ３（ＬＭＴＫ３）の阻害によって治療可能な疾患、例えば、癌を治療、予防または改善するために使用され得る。

Description

本発明は、癌、特にＬｅｍｕｒチロシンキナーゼ３（ＬＭＴＫ３）の阻害によって治療可能な疾患、例えば、癌の治療、予防または改善に使用するための新規な組成物および療法に関する。

プロテインキナーゼは、増殖、生存、分化、アポトーシス、代謝、血管新生、免疫監視および運動性を含む細胞活性のほぼあらゆる側面を伴う細胞内シグナル伝達経路の調節に極めて重要な役割を果たす。それらのシグナル伝達の撹乱はそれらの活性に影響を及ぼし、これは悪性腫瘍を含むヒト疾患に寄与する。キナーゼに対する標的療法は、過去１０年間に患者の臨床転帰を改善してきた。しかし、これらの治療に対する耐性は、相補的または代償的機能を有する他のキナーゼの異常な活性化に主に起因して発生することが多く、本発明者らは、広範囲なネットワークにおけるキナーゼシグナル伝達における冗長性を示している（ＳｔｅｂｂｉｎｇＪ，ｅｔａｌ．（２０１５）ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＴｙｒｏｓｉｎｅＫｉｎａｓｅ－ＲｅｇｕｌａｔｅｄＰｒｏｔｅｏｍｅｉｎＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒｂｙＣｏｍｂｉｎｅｄｕｓｅｏｆＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ａｎｄＳｔａｂｌｅＩｓｏｔｏｐｅＬａｂｅｌｉｎｇｗｉｔｈＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓｉｎＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（ＳＩＬＡＣ）ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ１４（９）：２４７９－２４９２）。

Ｌｅｍｕｒチロシンキナーゼ３（ＬＭＴＫ３）の発癌性の役割は、過去数年にわたって確立されており、様々な腫瘍型および状況における機構的データおよび翻訳データによって裏付けられている。ＬＭＴＫ３は、乳癌では潜在的な新しい治療標的として提案されており、他の腫瘍に対するその関与が考慮されているため、ＬＭＴＫ３が関与するシグナル伝達経路をさらに解明し、経路の検討を可能にするために使用され得る強力で選択的な細胞透過性小分子阻害剤を同定し、そのようにすることで、将来の翻訳活性のための今後の追跡可能性も確立することが急務である。

本発明は、ＬＭＴＫ３の阻害剤の同定を試みている本発明者らの研究から生じる。

ＳｔｅｂｂｉｎｇＪ，ｅｔａｌ．（２０１５）ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＴｙｒｏｓｉｎｅＫｉｎａｓｅ－ＲｅｇｕｌａｔｅｄＰｒｏｔｅｏｍｅｉｎＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒｂｙＣｏｍｂｉｎｅｄｕｓｅｏｆＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ａｎｄＳｔａｂｌｅＩｓｏｔｏｐｅＬａｂｅｌｉｎｇｗｉｔｈＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓｉｎＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（ＳＩＬＡＣ）ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ１４（９）：２４７９－２４９２

本発明の第１の態様によれば、治療に使用するための、式（Ｉ）の化合物：

（式中、Ｒ^１は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、Ｌ^１Ｌ^２Ｒ^８、またはハロゲンであり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
ｎは０であり、Ｘ^１はＳ、ＯもしくはＮＲ^２であるか、またはｎは１であり、Ｘ^１はＣＲ^２もしくはＮであり、
Ｒ^２～Ｒ^４は、独立して、水素、ハロゲン、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、またはＬ^１Ｌ^２Ｒ^８であり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｒ^６およびＲ^７は、独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^８は、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）Ｒ^６、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルであり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｌ^１は、存在しないか、またはＯ、ＳもしくはＮＲ^６であり、
Ｌ^２は、存在しないか、または置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキレン、もしくは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキリン（ａｌｋｙｌｙｎｅ）である）、
またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形体が提供される。

本発明者らは、式（Ｉ）の化合物がＬＭＴＫ３を阻害することができ、癌を治療するために使用され得ることを見出した。

第２の態様によれば、Ｌｅｍｕｒチロシンキナーゼ３（ＬＭＴＫ３）を阻害することによって治療可能な疾患の治療に使用するための、式（Ｉ）の化合物：

（式中、Ｒ^１は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、Ｌ^１Ｌ^２Ｒ^８、またはハロゲンであり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
ｎは０であり、Ｘ^１はＳ、ＯもしくはＮＲ^２であるか、またはｎは１であり、Ｘ^１はＣＲ^２もしくはＮであり、
Ｒ^２～Ｒ^４は、独立して、水素、ハロゲン、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、またはＬ^１Ｌ^２Ｒ^８であり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｒ^６およびＲ^７は、独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^８は、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）Ｒ^６、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルであり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｌ^１は、存在しないか、またはＯ、ＳもしくはＮＲ^６であり、
Ｌ^２は、存在しないか、または置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキレン、もしくは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキリンである）、
またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形体が提供される。

第３の態様では、対象においてＬｅｍｕｒチロシンキナーゼ３（ＬＭＴＫ３）を阻害することによって治療可能な疾患を治療、予防または改善する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、式（Ｉ）の化合物：

（式中、Ｒ^１は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、Ｌ^１Ｌ^２Ｒ^８、またはハロゲンであり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
ｎは０であり、Ｘ^１はＳ、ＯもしくはＮＲ^２であるか、またはｎは１であり、Ｘ^１はＣＲ^２もしくはＮであり、
Ｒ^２～Ｒ^４は、独立して、水素、ハロゲン、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、またはＬ^１Ｌ^２Ｒ^８であり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｒ^６およびＲ^７は、独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^８は、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）Ｒ^６、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルであり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｌ^１は、存在しないか、またはＯ、ＳもしくはＮＲ^６であり、
Ｌ^２は、存在しないか、または置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキレン、もしくは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキリンである）、
またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形体の治療有効量を投与することを含む方法が提供される。

予防するとは、可能性を低減することを意味すると理解され得る。

疾患は、癌、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、ハイパーソーシャビリティ（ｈｙｐｅｒ－ｓｏｃｉａｂｉｌｉｔｙ）、プレパルス抑制（ＰＰＩ）欠損、認知障害または神経変性疾患であり得る。神経変性疾患は、アルツハイマー病またはパーキンソン病であり得る。

好ましい実施形態では、疾患は癌である。癌は、血液癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、胃癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌または皮膚癌であり得る。肺癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であり得る。リンパ腫は中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫であり得る。皮膚癌は黒色腫であり得る。

好ましくは、癌は乳癌である。さらに好ましくは、癌は乳癌である。乳癌は、ＥＲ＋乳癌のトリプルネガティブ乳癌（例えば、ＥＲ－／ＰＲ－／ＨＥＲ２－）であり得る。

元素が指定される場合、その元素のあらゆる同位体も包含されることが理解され得る。例えば、用語「Ｈ」または「水素」は、重水素およびトリチウムも包含すると理解され得る。特に、化合物の重水素化類似体は、撮像および／または代謝試験に使用され得る。

本明細書で使用される用語「アルキル」は、特に指定されない限り、飽和直鎖または分岐炭化水素を指す。ある特定の実施形態では、アルキル基は、第一級、第二級または第三級炭化水素である。ある特定の実施形態では、アルキル基は、１～１２個の炭素原子、すなわち、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、または１～６個の炭素原子、すなわち、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルを含む。Ｃ_１～Ｃ_６アルキルには、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル、ネオペンチルおよびイソヘキシルが含まれる。アルキル基は、非置換であってよいか、またはハロゲン、ＣＮ、ＯＲ^１４、ＳＲ^１４、ＮＲ^１４Ｒ^１５もしくはＳＸ^３ _５のうちの１つ以上によって置換されていてもよく、式中、Ｒ^１４およびＲ^１５は、Ｈ、フッ素化されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、フッ素化されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、またはフッ素化されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、Ｘ^３はハロゲンである。いくつかの実施形態では、アルキル基は、非置換であるか、またはフッ素、ＳＦ_５、Ｌ^３ＣＦ_３、Ｌ^３ＣＨＦ_２もしくはＬ^３ＣＨ_２Ｆによって置換されており、式中、Ｌ^３は存在しないか、またはＯもしくはＳである。

「アルケニル」は、非分岐状または分岐状であり得るオレフィン性不飽和炭化水素基を指す。ある特定の実施形態では、アルケニル基は、２～６個の炭素を有し、すなわち、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニルである。Ｃ_２～Ｃ_６アルケニルには、例えば、ビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、ペンテニルおよびヘキセニルが含まれる。アルケニル基は、非置換であってよいか、またはハロゲン、ＣＮ、ＯＲ^１４、ＳＲ^１４、ＮＲ^１４Ｒ^１５もしくはＳＸ^３ _５のうちの１つ以上によって置換されていてもよく、式中、Ｒ^１４およびＲ^１５は、Ｈ、フッ素化されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、フッ素化されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、またはフッ素化されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、Ｘ^３はハロゲンである。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、非置換であるか、またはフッ素、ＳＦ_５、Ｌ^３ＣＦ_３、Ｌ^３ＣＨＦ_２もしくはＬ^３ＣＨ_２Ｆによって置換されており、式中、Ｌ^３は存在しないか、またはＯもしくはＳである。

「アルキニル」は、非分岐状または分岐状であり得るアセチレン性（ａｃｅｔｙｌｅｎｉｃａｌｌｙ）不飽和炭化水素基を指す。ある特定の実施形態では、アルキニル基は、２～６個の炭素を有し、すなわち、Ｃ_２～Ｃ_６アルキニルである。Ｃ_２～Ｃ_６アルキニルには、例えば、プロパルギル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニルが含まれる。アルキニル基は、非置換であってよいか、またはハロゲン、ＣＮ、ＯＲ^１４、ＳＲ^１４、ＮＲ^１４Ｒ^１５もしくはＳＸ^３ _５のうちの１つ以上によって置換されていてもよく、式中、Ｒ^１４およびＲ^１５は、Ｈ、フッ素化されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、フッ素化されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、またはフッ素化されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、Ｘ^３はハロゲンである。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、非置換であるか、またはフッ素、ＳＦ_５、Ｌ^３ＣＦ_３、Ｌ^３ＣＨＦ_２もしくはＬ^３ＣＨ_２Ｆによって置換されており、式中、Ｌ^３は存在しないか、またはＯもしくはＳである。

本明細書で使用される用語「アルキレン」は、特に指定されない限り、二価の飽和直鎖または分岐炭化水素を指す。ある特定の実施形態では、アルキレン基は、第一級、第二級または第三級炭化水素である。ある特定の実施形態では、アルキレン基は、１～１２個の炭素原子、すなわち、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキレン、または１～６個の炭素原子、すなわち、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレンを含む。Ｃ_１～Ｃ_６アルキレンには、例えば、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレンおよびイソプロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、イソブチレン、ｓｅｃ－ブチレン、ｔｅｒｔ－ブチレン、イソペンチレン、ネオペンチレン、ならびにイソヘキシレンが含まれる。アルキレン基は、非置換であってよいか、またはハロゲン、ＣＮ、ＯＲ^１４、ＳＲ^１４、ＮＲ^１４Ｒ^１５もしくはＳＸ^３ _５のうちの１つ以上によって置換されていてもよく、式中、Ｒ^１４およびＲ^１５は、Ｈ、フッ素化されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、フッ素化されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、またはフッ素化されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、Ｘ^３はハロゲンである。いくつかの実施形態では、アルキレン基は、非置換であるか、またはフッ素、ＳＦ_５、Ｌ^３ＣＦ_３、Ｌ^３ＣＨＦ_２もしくはＬ^３ＣＨ_２Ｆによって置換されており、式中、Ｌ^３は存在しないか、またはＯもしくはＳである。

本明細書で使用される用語「アルキリン」は、特に指定されない限り、二価の不飽和直鎖または分岐炭化水素を指す。ある特定の実施形態では、アルキリン基は、第一級、第二級または第三級炭化水素である。ある特定の実施形態では、アルキリン基は、２～１２個の炭素原子、すなわち、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキリン、２～６個の炭素原子、すなわち、Ｃ_２～Ｃ_６アルキリンを含む。Ｃ_２～Ｃ_６アルキリンには、例えば、エチリン（ｅｔｈｙｌｙｎｅ）、プロピリン（ｐｒｏｐｙｌｙｎｅ）、ブチリン（ｂｕｔｙｌｙｎｅ）、ペンチリン（ｐｅｎｔｙｌｙｎｅ）またはヘキシリン（ｈｅｘｙｌｙｎｅ）が含まれる。アルキリン基は、非置換であってよいか、またはハロゲン、ＣＮ、ＯＲ^１４、ＳＲ^１４、ＮＲ^１４Ｒ^１５もしくはＳＸ^３ _５のうちの１つ以上によって置換されていてもよく、式中、Ｒ^１４およびＲ^１５は、Ｈ、フッ素化されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、フッ素化されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、またはフッ素化されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、Ｘ^３はハロゲンである。いくつかの実施形態では、アルキリン基は、非置換であるか、またはフッ素、ＳＦ_５、Ｌ^３ＣＦ_３、Ｌ^３ＣＨＦ_２もしくはＬ^３ＣＨ_２Ｆによって置換されており、式中、Ｌ^３は存在しないか、またはＯもしくはＳである。

「アリール」は、芳香族の６～１２員炭化水素基を指す。Ｃ_６～Ｃ_１２アリール基の例には、限定されることなく、フェニル、α－ナフチル、β－ナフチル、ビフェニル、テトラヒドロナフチルおよびインダニルが挙げられる。アリール基は、非置換であってよいか、または置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６のうちの１つ以上によって置換されていてもよい。

「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの環原子がヘテロ原子である単環式または二環式の芳香族５～１０員環系を指す。ヘテロ原子または各ヘテロ原子は、独立して、酸素、硫黄および窒素からなる群から選択され得る。５～１０員ヘテロアリール基の例には、フラン、チオフェン、インドール、アザインドール、オキサゾール、チアゾール、イソキサゾール、イソチアゾール、イミダゾール、Ｎ－メチルイミダゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピロール、Ｎ－メチルピロール、ピラゾール、Ｎ－メチルピラゾール、１，３－ベンゾジオキソール、１，３，４－オキサジアゾール、１，２，４－トリアゾール、１－メチル－１，２，４－トリアゾール、１Ｈ－テトラゾール、１－メチルテトラゾール、ベンゾキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾフラン、ベンズイソキサゾール、ベンズイミダゾール、Ｎ－メチルベンズイミダゾール、アザベンズイミダゾール、インダゾール、キナゾリン、キノリンおよびイソキノリンが挙げられる。二環式の５～１０員ヘテロアリール基には、フェニル環、ピリジン環、ピリミジン環、ピラジン環またはピリダジン環が５または６員の単環式ヘテロアリール環に縮合しているものが含まれる。ヘテロアリール基は、非置換であってよいか、または置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６のうちの１つ以上によって置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、ヘテロ原子は、置換基の１つによって置換されていてもよい。例えば、ヘテロアリールはピリジンであってよく、それをＯ^－によって置換してピリジン－Ｎ－オキシドを提供してもよい。

「複素環」または「ヘテロシクリル」は、少なくとも１つの環原子がヘテロ原子である３～８員の単環式、二環式または架橋分子を指す。ヘテロ原子または各ヘテロ原子は、独立して、酸素、硫黄および窒素からなる群から選択され得る。複素環は、飽和であり得るか、または部分的に飽和であり得る。例示的な３～８員ヘテロシクリル基には、限定されることなく、アジリジン、オキシラン、オキシレン、チイラン、ピロリン、ピロリジン、ジヒドロフラン、テトラヒドロフラン、ジヒドロチオフェン、テトラヒドロチオフェン、ジチオラン、ピペリジン、１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－１－イル、テトラヒドロピラン、ピラン、モルホリン、ピペラジン、チアン、チイン、アゼパン、ジアゼパン、オキサジンが含まれる。ヘテロシクリル基は、非置換であってよいか、または置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６のうちの１つ以上によって置換されていてもよい。

薬学的に許容される塩には、その生物学的特性を保持し、毒性ではないか、または薬学的使用に望ましい、本明細書で提供される式（Ｉ）の化合物の任意の塩が含まれる。薬学的に許容される塩は、当技術分野で周知の様々な有機対イオンおよび無機対イオンに由来し得る。

薬学的に許容される塩は、有機酸または無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンチルプロピオン酸、グリコール酸、グルタル酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、ソルビン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ピクリン酸、桂皮酸、マンデル酸、フタル酸、ラウリン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２－エタン－ジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４－クロロベンゼンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、カンフル酸、カンファースルホン酸、４－メチルビシクロ［２．２．２］－オクタ－２－エン－１－カルボン酸、グルコヘプトン酸、３－フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ－ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、安息香酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、キナ酸、ムコン酸などの酸によって形成された酸付加塩を含み得る。あるいは、薬学的に許容される塩は、親化合物中に存在する酸性プロトンが金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、アルミニウムイオン、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属水酸化物、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、リチウム、亜鉛および水酸化バリウムによって置換されるか、または有機塩基、例えば、脂肪族、脂環式もしくは芳香族有機アミン、例えば、アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレン－ジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、Ｎ－メチルグルカミンピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、テトラメチルアンモニウム水酸化物などと配位した場合に形成される塩基付加塩を含み得る。

したがって、塩は、Ｉ族またはＩＩ族金属塩、すなわち、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を含み得る。したがって、塩は、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ベリリウム塩、マグネシウム塩またはカルシウム塩を含み得る。

薬学的に許容される溶媒和物とは、非共有結合分子間力によって結合された化学量論量または非化学量論量の溶媒をさらに含む式（Ｉ）の化合物またはその塩を指す。溶媒が水である場合、溶媒和物は水和物である。

一実施形態では、ｎは１である。Ｘ^１はＣＲ^２であり得る。したがって、化合物は、式（ＩＩ）の化合物であり得る：

Ｒ^２～Ｒ^４は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニルであり得る。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であってよく、好ましくはフッ素である。したがって、Ｒ^２～Ｒ^４は、それぞれ独立して、水素、フッ素または置換されていてもよいメチルであり得る。

Ｒ^２～Ｒ^４のうちの少なくとも１つが、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、または置換されていてもよいアルキニルである実施形態では、アルキル、アルケニルもしくはアルキニル、または各アルキル、アルケニルもしくはアルキニルは、好ましくは、独立して、非置換であるか、またはハロゲンによって置換されている。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であってよく、好ましくはフッ素である。したがって、Ｒ^２～Ｒ^４のうちの１つ以上は、メチルまたはハロゲン化メチルであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ^２～Ｒ^４のうちの１つ以上は、ＣＨ_３、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２またはＣＦ_３であり得る。最も好ましくは、アルキル、アルケニルもしくはアルキニル、または各アルキル、アルケニルもしくはアルキニルは非置換である。

好ましい実施形態では、Ｒ^２～Ｒ^４は、それぞれＨである。

したがって、好ましい実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）の化合物である：

Ｒ^１は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、またはハロゲンであり得る。Ｒ^１は、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいチオフェニル、置換されていてもよいチアゾリル、置換されていてもよいテトラゾリル、置換されていてもよいトリアゾリル、置換されていてもよいピリジニル、置換されていてもよいピリダジニル、置換されていてもよいピリミジニル、置換されていてもよいトリアジニル、置換されていてもよい１，３－ベンゾジオキソリル、置換されていてもよいテトラヒドロピラニル、置換されていてもよいジヒドロピラニル、置換されていてもよいモルホリニル、または塩素であり得る。

Ｒ^１は、好ましくは、置換されていてもよい５または６員ヘテロアリールである。好ましくは、Ｒ^１は、置換されていてもよいチオフェニル、置換されていてもよいチアゾリル、置換されていてもよいテトラゾリル、置換されていてもよいトリアゾリル、置換されていてもよいピリジニル、置換されていてもよいピリダジニル、置換されていてもよいピリミジニル、または置換されていてもよいトリアジニルである。

さらに好ましくは、Ｒ^１は、置換されていてもよい６員ヘテロアリールであり、最も好ましくは、置換されていてもよいピリジニル、または置換されていてもよいピリダジニルである。

Ｒ^１は、以下であり得る：

（式中、Ｘ^２は、ＮまたはＣＲ^９であり、
Ｒ^９～Ｒ^１３は、独立して、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６である。）
好ましくは、Ｒ^９～Ｒ^１３は、独立して、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７またはＣＮであり、式中、Ｒ^６およびＲ^７は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニルである。さらに好ましくは、Ｒ^９～Ｒ^１３は、独立して、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニル、フッ素、塩素、ＯＲ^６、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７またはＣＮであり、式中、Ｒ^６およびＲ^７は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニルである。さらになお好ましくは、Ｒ^９～Ｒ^１３は、独立して、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニル、フッ素、塩素、ＯＲ^６、ＮＨＣＯＣＨ_３、ＮＨＳＯ_２ＣＨ_３またはＣＮであり、式中、Ｒ^６は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニルである。最も好ましくは、Ｒ^９～Ｒ^１３は、独立して、置換されていてもよいメチル、フッ素、ＯＲ^６、ＮＨＣＯＣＨ_３、ＮＨＳＯ_２ＣＨ_３またはＣＮであり、式中、Ｒ^６は、Ｈ、または置換されていてもよいメチルである。Ｒ^９～Ｒ^１３は、それぞれ独立して、Ｈまたはメチルであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ^９～Ｒ^１３は、それぞれＨである。

好ましい実施形態の場合、Ｒ^１は以下である：

好ましくは、Ｘ^２はＣＲ^９である。

Ｒ^１０およびＲ^１２は、それぞれ独立して、Ｈまたはメチルであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ^１０およびＲ^１２は、それぞれＨである。

いくつかの実施形態では、Ｒ^９およびＲ^１３はＨである。

したがって、Ｒ^１は、Ｃｌ、フェニル、

であり得る。好ましくは、Ｒ^１は

である。

Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、または置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルであり得る。Ｒ^５は、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいチオフェニル、置換されていてもよいチアゾリル、置換されていてもよいテトラゾリル、置換されていてもよいトリアゾリル、置換されていてもよいピリジニル、置換されていてもよいピリダジニル、置換されていてもよいピリミジニル、置換されていてもよいトリアジニル、置換されていてもよい１，３－ベンゾジオキソリル、置換されていてもよいテトラヒドロピラニル、置換されていてもよいジヒドロピラニル、置換されていてもよいモルホリニル、または塩素であり得る。

Ｒ^５は、好ましくは、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい５もしくは６員ヘテロアリールである。好ましくは、Ｒ^５は、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいチオフェニル、置換されていてもよいチアゾリル、置換されていてもよいテトラゾリル、置換されていてもよいトリアゾリル、置換されていてもよいピリジニル、置換されていてもよいピリダジニル、置換されていてもよいピリミジニル、または置換されていてもよいトリアジニルである。さらに好ましくは、Ｒ^５は、置換されていてもよいフェニルである。

Ｒ^５は、非置換フェニルであってよい。

好ましい実施形態では、Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＣＯＲ^６およびＣＯＮＲ^６Ｒ^７（式中、Ｒ^６およびＲ^７は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニルである）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されたフェニルまたは５もしくは６員ヘテロアリールである。さらに好ましくは、Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＣＯＲ^６およびＣＯＮＲ^６Ｒ^７（式中、Ｒ^６およびＲ^７は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニルである）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されたフェニルまたは５もしくは６員ヘテロアリールである。さらになお好ましくは、Ｒ^５は、置換されていてもよいメチル、フッ素、塩素、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＣＯＲ^６およびＣＯＮＲ^６Ｒ^７（式中、Ｒ^６は、Ｈ、置換されていてもよいメチル、または置換されていてもよいエチルである）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されたフェニルまたは５もしくは６員ヘテロアリールである。Ｒ^５は、ＣＨ_３、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＣＨ_２ＯＨ、フッ素、塩素、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＣＯＲ^６およびＣＯＮＲ^６Ｒ^７（式中、Ｒ^６は、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３またはＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ（ＣＨ_３）_２である）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されたフェニルであり得る。最も好ましい実施形態では、Ｒ^５は、ＯＣＦ_３によって置換されたフェニルである。

Ｒ^５は、１つまたは２つの置換基によって置換されたフェニルであり得る。置換基は、オルト位、メタ位またはパラ位にあってよい。いくつかの実施形態では、置換基はメタ位にある。

Ｒ^５は、

であり得る。

式（Ｉ）の化合物は、式（１００）～（１２２）の化合物であり得る：

いくつかの実施形態では、化合物は、式（１００）の化合物である。

一実施形態では、ｎは０である。Ｘ^１はＳであり得る。したがって、化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物であり得る：

好ましくは、Ｒ^１はＬ^１Ｌ^２Ｒ^８である。したがって、化合物は、式（ＩＩＩａ）の化合物であり得る：

Ｌ^１は、好ましくはＯ、ＳまたはＮＲ^６であり、さらに好ましくはＮＲ^６である。Ｒ^６は、好ましくはＨである。

Ｌ^２は、好ましくは置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１０アルキレン、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１０アルキリンであり、さらに好ましくは置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_５アルキレン、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_５アルキリンであり、最も好ましくは置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキレン、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキリンである。好ましい実施形態では、Ｌ^２は－ＣＨ_２－である。

Ｒ^８は、好ましくは、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルである。Ｒ^８は、好ましくは、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい５もしくは６員ヘテロアリールである。

Ｒ^８は、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいチオフェニル、置換されていてもよいチアゾリル、置換されていてもよいテトラゾリル、置換されていてもよいトリアゾリル、置換されていてもよいピリジニル、置換されていてもよいピリダジニル、置換されていてもよいピリミジニル、置換されていてもよいトリアジニル、置換されていてもよい１，３－ベンゾジオキソリル、置換されていてもよいテトラヒドロピラニル、置換されていてもよいジヒドロピラニル、または置換されていてもよいモルホリニルであり得る。

さらに好ましくは、Ｒ^８は、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいピリジニル、または置換されていてもよいピリダジニルである。

Ｒ^８は、フェニルまたは

であり得る。

Ｒ^４は、水素、ハロゲン、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニルであり得る。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であってよく、好ましくはフッ素である。したがって、Ｒ^４は、水素、フッ素または置換されていてもよいメチルである。好ましくは、Ｒ^４は水素である。

Ｒ^５は、好ましくは、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルである。Ｒ^５は、好ましくは、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい５もしくは６員ヘテロアリールである。

Ｒ^５は、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいチオフェニル、置換されていてもよいチアゾリル、置換されていてもよいテトラゾリル、置換されていてもよいトリアゾリル、置換されていてもよいピリジニル、置換されていてもよいピリダジニル、置換されていてもよいピリミジニル、置換されていてもよいトリアジニル、置換されていてもよい１，３－ベンゾジオキソリル、置換されていてもよいテトラヒドロピラニル、置換されていてもよいジヒドロピラニル、または置換されていてもよいモルホリニルであり得る。

Ｒ^５は、非置換フェニル、または非置換５もしくは６員ヘテロアリールであり得る。あるいは、Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６およびＳＲ^６（式中、Ｒ^６は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニルである）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されたフェニルまたは５もしくは６員ヘテロアリールであり得る。さらに好ましくは、Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６およびＳＲ^６（式中、Ｒ^６は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニルである）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されたフェニルまたは５もしくは６員ヘテロアリールである。さらになお好ましくは、Ｒ^５は、置換されていてもよいメチル、フッ素、塩素、ＯＲ^６およびＳＲ^６（式中、Ｒ^６は、Ｈまたは置換されていてもよいメチルである）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されたフェニルまたは５もしくは６員ヘテロアリールである。Ｒ^５は、ＣＨ_３、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、塩素、フッ素、ＯＲ^６およびＳＲ^６（式中、Ｒ^６は、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２またはＣＦ_３である）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されたフェニルまたは５もしくは６員ヘテロアリールであり得る。

Ｒ^５は、１つの置換基によって置換されたフェニルまたは６員ヘテロアリールであり得る。置換基は、オルト位、メタ位またはパラ位にあってよい。いくつかの実施形態では、置換基は、メタ位またはパラ位にある。

したがって、Ｒ^５は、フェニル、

であり得る。

式（Ｉ）の化合物は、式（２００）～（２０４）の化合物であり得る：

本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、癌を治療、改善または予防するための単剤療法（すなわち、阻害剤単独の使用）で使用され得る医薬品に使用され得ることが理解されるであろう。あるいは、阻害剤またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、癌を治療、改善もしくは予防するための公知の療法の補助として、またはそれと組み合わせて使用され得る。公知の療法は、公知の内分泌療法および／または化学療法であり得る。例えば、式（Ｉ）の化合物は、タモキシフェンまたはドキソルビシンと組み合わせて使用され得る。

式（Ｉ）の化合物は、特に組成物が使用される様式に応じて、いくつかの異なる形態を有する組成物中で組み合わせられ得る。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液の形態、または治療を必要とする人もしくは動物に投与され得る任意の他の好適な形態であり得る。本発明による医薬品のビヒクルは、それが与えられる対象によって十分に許容されるものでなければならないことが理解されるであろう。

式（Ｉ）の化合物を含む医薬品は、いくつかの方法で使用され得る。式（Ｉ）の化合物を含む組成物は、吸入によって（例えば、鼻腔内）投与され得る。組成物はまた、局所使用のために製剤化され得る。例えば、クリームまたは軟膏を皮膚に塗布してもよい。

式（Ｉ）の化合物はまた、徐放装置または遅延放出装置内に組み込まれてもよい。そのような装置は、例えば、皮膚の上または下に挿入されてもよく、医薬品は、数週間または数ヶ月にわたって放出されてもよい。装置は、治療部位に少なくとも隣接して配置されてもよい。そのような装置は、本発明に従って使用される阻害剤による長期治療が必要であり、通常、頻繁な投与（例えば、少なくとも連日の注射）を必要とする場合に特に有利であり得る。

式（Ｉ）の化合物、および該化合物を含む組成物は、血流中への注射、または治療を必要とする部位、例えば、癌性腫瘍もしくはそれに隣接する血流中への直接注射によって対象に投与され得る。注射は、静脈内（ボーラスまたは注入）または皮下（ボーラスまたは注入）、皮内（ボーラスまたは注入）または筋肉内（ボーラスまたは注入）であり得る。

好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は経口投与される。したがって、式（Ｉ）の化合物は、例えば、錠剤、カプセルまたは液体の形態で経口摂取され得る組成物内に含有され得る。

必要とされる式（Ｉ）の化合物の量は、その生物学的活性およびバイオアベイラビリティによって決定され、これは、投与様式、式（Ｉ）の化合物の物理化学的特性、および単剤療法として使用されているか、または併用療法で使用されているかに依存することが理解されるであろう。投与頻度はまた、治療される対象内での式（Ｉ）の化合物の半減期による影響を受ける。投与される最適な投与量は、当業者によって決定され得、使用中の特定の阻害剤、医薬組成物の強度、投与様式、および癌の進行によって変動する。対象の年齢、体重、性別、食事および投与時間を含む、治療される特定の対象に依存する追加の因子によって、投与量を調節することが必要になる。

式（Ｉ）の化合物は、治療される癌の発症前、発症中または発症後に投与され得る。１日用量は、単回投与として与えられ得る。あるいは、式（Ｉ）の化合物は、１日に２回以上与えられ、１日に２回与えられてもよい。

一般に、癌を治療、改善または予防するために、式（Ｉ）の化合物の０．０１μｇ／ｋｇ体重～５００ｍｇ／ｋｇ体重の１日用量を使用してもよい。さらに好ましくは、１日用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～４００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重～２００ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重である。

治療を受けている患者は、起床時に第１の用量を服用し、次いで、夕方に第２の用量を服用してもよいか（２回の用量レジメンの場合）、またはその後３時間もしくは４時間間隔で服用してもよい。あるいは、徐放装置を使用して、反復用量を投与する必要なく、本発明による阻害剤の最適用量を患者に提供してもよい。

公知の手順、例えば、製薬業界によって従来使用されている手順（例えば、インビボ実験、臨床試験など）を使用して、本発明による阻害剤を含む特定の製剤、および正確な治療レジメン（例えば、阻害剤の１日用量、および投与頻度）を形成してもよい。本発明者らは、式（Ｉ）の化合物の使用に基づいて、癌を治療するための医薬組成物を最初に記載したと考えている。

したがって、第４の態様では、対象の癌を治療するための医薬組成物であって、式（Ｉ）の化合物、および薬学的に許容されるビヒクル（ここで、式（Ｉ）の化合物は以下である）：

（式中、Ｒ^１は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、Ｌ^１Ｌ^２Ｒ^８、またはハロゲンであり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
ｎは０であり、Ｘ^１はＳ、ＯもしくはＮＲ^２であるか、またはｎは１であり、Ｘ^１はＣＲ^２もしくはＮであり、
Ｒ^２～Ｒ^４は、独立して、水素、ハロゲン、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、またはＬ^１Ｌ^２Ｒ^８であり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｒ^６およびＲ^７は、独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^８は、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）Ｒ^６、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルであり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｌ^１は、存在しないか、またはＯ、ＳもしくはＮＲ^６であり、
Ｌ^２は、存在しないか、または置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキレン、もしくは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキリンである）、
またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形体を含む医薬組成物が提供される。

医薬組成物は、癌の対象の治療的改善、予防または治療に使用することができる。

医薬組成物は、癌を治療、改善または予防するための公知の療法をさらに含み得る。

本発明はまた、第５の態様では、第４の態様による組成物を作製するプロセスであって、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形体の治療有効量、および薬学的に許容されるビヒクルを接触させることを含むプロセスを提供する。

「対象」は、脊椎動物、哺乳動物または家畜であり得る。したがって、本発明による式（Ｉ）の化合物、組成物および医薬品は、任意の哺乳動物、例えば、家畜（例えば、ウマ）、ペットを治療するために使用されてもよいか、または他の獣医学的用途で使用されてもよい。ただし、最も好ましくは、対象はヒトである。

式（Ｉ）の化合物の「治療有効量」は、対象に投与される際に、癌を治療するのに必要な薬物の量である任意の量である。

例えば、使用される式（Ｉ）の化合物の治療有効量は、約０．０１ｍｇ～約８００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇであり得る。式（Ｉ）の化合物の量は、約０．１ｍｇ～約２５０ｍｇ、最も好ましくは約０．１ｍｇ～約２０ｍｇの量であることが好ましい。

本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」は、医薬組成物の製剤化に有用であることが当業者に知られている任意の公知の化合物または公知の化合物の組合せである。

一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であり得、組成物は粉末または錠剤の形態であり得る。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味料、保存剤、染料、コーティングまたは錠剤崩壊剤としても作用し得る１つ以上の物質を含み得る。ビヒクルはまた、カプセル化材料であってもよい。粉末では、ビヒクルは、本発明による微粉化された活性剤（すなわち、阻害剤）と混合された微粉化された固体である。錠剤では、阻害剤は、必要な圧縮特性を有するビヒクルと好適な割合で混合され、所望の形状およびサイズに圧縮され得る。粉末および錠剤は、好ましくは最大９９％の阻害剤を含有する。好適な固体ビヒクルには、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が含まれる。別の実施形態では、医薬ビヒクルはゲルであり得、組成物はクリームなどの形態であり得る。

ただし、医薬ビヒクルは液体であってよく、医薬組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシルおよび加圧組成物の調製に使用される。式（Ｉ）の化合物は、薬学的に許容される液体ビヒクル、例えば、水、有機溶媒、両方の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪に溶解または懸濁され得る。液体ビヒクルは、他の好適な医薬添加剤、例えば、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味料、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤または浸透圧調整剤を含有することができる。経口投与および非経口投与のための液体ビヒクルの好適な例には、水（上記のような添加剤、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えば、グリコールを含む）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分画されたヤシ油および落花生油）が挙げられる。非経口投与の場合、ビヒクルは、油性エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルであってもよい。非経口投与のための滅菌液体形態の組成物では、滅菌液体ビヒクルが有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。

滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内注射、髄腔内注射、硬膜外注射、腹腔内注射、静脈内注射および特に皮下注射によって利用され得る。式（Ｉ）の化合物は、滅菌水、生理食塩水または他の適切な滅菌注射用媒体を使用して、投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。

式（Ｉ）の化合物、および本発明の組成物は、他の溶質または懸濁化剤（例えば、溶液を等張性にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレート、ポリソルベート８０（ソルビトール、およびエチレンオキシドと共重合されたその無水物のオレイン酸エステル）などを含有する滅菌溶液または懸濁液の形態で投与され得る。本発明に従って使用される式（Ｉ）の化合物は、液体または固体の組成物形態のいずれかで経口投与することもできる。経口投与に適した組成物には、固体形態、例えば、丸剤、カプセル、顆粒、錠剤および粉末、ならびに液体形態、例えば、溶液、シロップ、エリキシルおよび懸濁液が含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌溶液、エマルジョンおよび懸濁液が含まれる。

本発明者らは、新規化合物自体を同定したと考えている。

したがって、第６の態様によれば、式（Ｉ）の化合物：

（式中、Ｒ^１は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、Ｌ^１Ｌ^２Ｒ^８、またはハロゲンであり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
ｎは０であり、Ｘ^１はＳ、ＯもしくはＮＲ^２であるか、またはｎは１であり、Ｘ^１はＣＲ^２もしくはＮであり、
Ｒ^２～Ｒ^４は、独立して、水素、ハロゲン、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、またはＬ^１Ｌ^２Ｒ^８であり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｒ^６およびＲ^７は、独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^８は、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）Ｒ^６、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルであり、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｌ^１は、存在しないか、またはＯ、ＳもしくはＮＲ^６であり、
Ｌ^２は、存在しないか、または置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキレン、もしくは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキリンである）、
またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形体が提供され、
ここで、式（１００）、（１１３）～（１２２）および（２００）の化合物は除外される：

第６の態様の化合物は、第１および第２の態様に関して定義される通りであり得る。

本明細書に記載のすべての特徴（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）、および／またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスの工程のすべては、そのような特徴および／または工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組合せを除いて、任意の組合せで上記の態様のいずれかと組み合わされ得る。

本発明をさらによく理解するために、および本発明の実施形態がどのように実施され得るかを示すために、ここで、例として、添付の図面を参照する。

ＨＴＲＦスクリーニングおよびインビトロキナーゼアッセイによって評価された上位３８の化合物のＩＣ_５０値と、ＦＤＣＰ１／ＦＤＣＰ１－ＬＭＴＫ３細胞ベースのモデルにおけるそれらのＥＣ_５０値とを要約する表である。ｗｔＬＭＴＫ３－ＫＤに対するＣ２８のＩＣ_５０値が、０．５μＭ～５０ｎＭまでの開始用量で、インビトロキナーゼアッセイ（二連で行った）によってどのように決定されたかを示す。漸増濃度（１．２５、２．５、５および１０μＭ）のＣ２８を用いて処理した親ＦＤＣＰ１細胞および形質転換ＦＤＣＰ１－ＬＭＴＫ３細胞の増殖阻害を示すグラフである。エラーバーはいずれも、３つの独立した実験からの平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。リガンド結合時のタンパク質の熱力学的安定性の増加を示す、（Ａ）示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）および（Ｂ）円二色性（ＣＤ）分光法によってモニタリングした際のＬＭＴＫ３（黒色）およびＬＭＴＫ３／Ｃ２８複合体（赤色）の特徴的な熱変性曲線を示すグラフを示す。ＤＳＦからの見かけのＴ_ｍ値は、ボルツマンシグモイドをＣＤデータに当てはめることによって、温度に関する蛍光の一次導関数の最大値、または遷移領域の中間点から決定した。実験は三連で行った。１０μＭのＣ２８阻害剤の非存在下または存在下で２μＣｉ［γ－３２］ＡＴＰの濃度を使用した、ＬＭＴＫ３によるＨＳＰ２７リン酸化の動態分析を示すグラフである。Ｐｒｉｓｍ８を使用して、ミカエリス・メンテン式へのＨＳＰ２７濃度の関数としての初期反応速度の非線形回帰フィットから動態パラメーターを決定した。１０μＭのＣ２８阻害剤の非存在下または存在下での０．６μＭのＨＳＰ２７基質に関するＡＴＰ濃度の関数としての動態分析を示すグラフである。Ｐｒｉｓｍ８を使用して、ミカエリス・メンテン式へのＡＴＰ濃度の関数としての初期反応速度の非線形回帰フィットから動態パラメーターを決定した。１μＭ濃度の１４０個のキナーゼに対するＣ２８の選択性プロファイルを調査するための放射性フィルター結合アッセイの結果を示す。データは、標準偏差とともにアッセイ複製物の残存活性％として表示されている。活性の＞５０％の低下を示すキナーゼのみが示されている。上位ヒットの相対ＩＣ_５０値も表示されている。スクリーニングは、ＭＲＣＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｒｅｆｏｒＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｉｎｇｕｎｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｉｎａｓｅ－ｓｃｒｅｅｎ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｐｒｅｍｉｅｒ－ｓｃｒｅｅｎ）によって行った。Ｃ２８（５μＭ）と相互作用するキナーゼを赤い円として表した、カイノーム系統発生的グループ分け（ｋｉｎｏｍｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｇｒｏｕｐｉｎｇ）を表しているツリースポット相互作用マップ（ｔｒｅｅｓｐｏｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｍａｐ）（ｈｔｔｐ：／／ｔｒｅｅｓｐｏｔ．ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ．ｃｏｍ／）を示す。赤い円の直径が大きいほど、それぞれのキナーゼに対するＣ２８結合親和性が高い。結合がＣ２８によって陰性対照（ＤＭＳＯ）の１０％未満に阻害されたキナーゼの一覧を示す。比較的低い数字は比較的強いヒットを示し、これらのキナーゼがＣ２８に結合する最も可能性の高いヒットを表すことを示唆する。（強調されているのは、放射性フィルター結合アッセイおよび部位特異的競合結合アッセイの両方で同定された重複するキナーゼである）。様々な時点での漸増濃度のＣ２８による処理後のＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株におけるＬＭＴＫ３およびＥＲαのタンパク質レベルのウエスタンブロッティング分析を示す。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＬＭＴＫ３タンパク質半減期に対するＣ２８の影響を示す。様々な時点で、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキサミド（ＣＨＸ）および１０μＭのＣ２８（またはＤＭＳＯ）を用いて細胞を処理した。相対ＬＭＴＫ３タンパク質レベル（－／＋Ｃ２８）を計算し、ＣＨＸによる処理の時間に対してプロットした。ＭＣＦ７細胞、Ｔ４７Ｄ細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＬＭＴＫ３分解に対するＣ２８の影響を示す。細胞を１０μＭのＭＧ１３２プロテアソーム阻害剤（またはＤＭＳＯ）を用いて４時間、次いで、１０μＭのＣ２８（またはＤＭＳＯ）を用いて２４時間処理し、続いて、ＬＭＴＫ３タンパク質レベルのウエスタンブロッティング分析を行った。ＭＣＦ７細胞におけるＬＭＴＫ３のポリユビキチン化に対するＣ２８（１０μＭ；２４時間）の影響を示す。それぞれのインプットは図１１に示されている。１０μＭのＣ２８を用いて２４時間処理した後のＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株におけるＨＳＰ２７の総レベルおよびホスホ－タンパク質レベルのウエスタンブロットを示す。細胞を２５μｇ／ｍｌのアニソマイシンを用いて１時間処理して、ＨＳＰ２７のリン酸化を誘導した。様々な時点での１０μＭのＣ２８による処理後のＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株における様々なキナーゼのタンパク質レベルのウエスタンブロットを示す。漸増濃度（０、１．２５、２．５、５および１０μＭ）のＣ２８を用いて７２時間処理した後の正常細胞株および乳癌細胞株の増殖を示すグラフである。ＩＣ_５０値は、３つの独立した実験の平均である。腫瘍細胞株のＮＣＩ－６０パネルに対するＣ２８（１０μＭ；２４時間）の単回用量スクリーニングの結果を示す。Ｃ２８処理細胞の増殖％が示されている。負の値（＜０％）は致死率を表す。雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４／時点）における単回ＩＶ用量投与、単回ＩＰ用量投与または単回ＰＯ用量投与後のＣ２８の薬物動態パラメーターを示す表である。Ｔ_ｍａｘ：時間ピーク血漿濃度；Ｃ_ｍａｘ：最大血漿濃度；ＡＵＣ_{０→ｔｍｉｎ}：最後に測定した濃度の時間に対する血漿中濃度－時間曲線下面積；ＡＵＣ_０→∞：無限大に外挿した血漿中濃度－時間曲線下面積；Ｔ_１／２：血漿中半減期；Ｋ_ｅｌ：消失速度定数；Ｖ_ｄ：分布容積；Ｆ：経口バイオアベイラビリティ。＊：１ｍｇ／ｋｇＩＶ群に基づく。＊＊：５ｍｇ／ｋｇＩＶ群に基づく。５ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量は一部のマウスにとって致死的であったため、化合物の用量を１ｍｇ／ｋｇに減少させた。Ｃ２８の経口バイオアベイラビリティ当たりの計算値は１３０％であった（１ｍｇ／ｋｇＩＶ群からの完全なデータセットに基づく）。特定の化合物およびＰＫ条件で１００％を超えるＦ％を観察する可能性のある理由には、ＩＶ用量およびＰＯ用量が等しくない場合の「非線形ＰＫ」（代謝飽和）、ならびに腸肝再循環が含まれる。第１の可能性は、５ｍｇ／ｋｇ群からの不完全なデータセットに基づく計算が経口バイオアベイラビリティについてさらに現実的な５４％の数を与えるため、そうであると思われる。ＭＭＴＶ－Ｎｅｕトランスジェニックマウスのビヒクル処置群およびＣ２８処置群（それぞれｎ＝６）における結果を示す腫瘍増殖チャートである。Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェアを使用して、対応のないｔ検定を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す。＊Ｐ＜０．０５。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１マウス異種移植のビヒクル処置群およびＣ２８処置群（それぞれｎ＝１４）における結果を示す腫瘍増殖チャートである。２１日目のＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ルシフェラーゼマウス異種移植群のビヒクル（ｎ＝６）処置群とＣ２８処置群（１０ｍｇ／ｋｇ／ｎ＝６および３０ｍｇ／ｋｇ／ｎ＝５）とを比較する箱ひげ図である。Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェアを使用して、対応のないｔ検定を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す。＊Ｐ＜０．０５。Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期の細胞の割合を示す。結果を平均±ＳＥＭとして表す。実験は２回行った。計数された細胞の総数に対する有糸***細胞の割合としての有糸***指数を示す。実験は２回行った。Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェアを使用して、ＡＮＯＶＡ統計検定を行った。結果を平均±ＳＥＭとして表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。漸増濃度のＣ２８を用いて４８時間処理した後のＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株、ＭＣＦ１２Ａ細胞株におけるホスホ－ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）有糸***マーカーのウエスタンブロッティング分析を示す。ＧＡＤＰＨをローディングコントロールとして使用した。ＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株およびＭＣＦ１２Ａ細胞株を漸増濃度（０、１、５、１０μＭ）のＣ２８を用いて７２時間処理し、アポトーシス細胞および死細胞の割合をＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖおよび７－ＡＡＤ染色によって分析した。結果を平均±ＳＥＭとして表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。各実験は少なくとも３回行った。漸増濃度のＣ２８を用いて７２時間処理した後のＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株、ＭＣＦ１２Ａ細胞株における抗アポトーシスタンパク質および切断ＰＡＲＰレベルのウエスタンブロッティング分析を示す。ＧＡＤＰＨをローディングコントロールとして使用した。１０μＭのＣ２８を用いて４８時間処理した間期ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（左パネル）および有糸***期ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（右パネル）の代表的な共焦点顕微鏡画像を示す。細胞を固定し、α－チューブリン抗体（緑色）によって染色し、核ＤＮＡをＤＡＰＩ（青色）によって染色した。コルヒチン（５０ｎＭ）またはパクリタキセル（５０ｎＭ）をそれぞれ陽性対照または陰性対照とした。スケールバー、２０μｍ。矢印は、間期細胞における無秩序な微小管分布を示す。ＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を漸増濃度（０、１、５、１０および２０μＭ）のＣ２８を用いて４８時間処理した。細胞を遠心分離して不溶性（重合）チューブリンおよび可溶性（非重合）チューブリンを分離し、画分をウエスタンブロッティングによって分析した。コルヒチン（５０ｎＭ）またはパクリタキセル（５０ｎＭ）をそれぞれ陽性対照または陰性対照とした。漸増濃度（０、１、５、１０および２０μＭ）のＣ２８とのインキュベーション後のウシ精製チューブリンのインビトロ重合。ノコダゾール（１０μＭ）またはパクリタキセル（１０μＭ）をそれぞれ陽性対照または陰性対照とした。光学密度（ＯＤ）を３５０ｎｍで測定した。漸増濃度（０、１、５および１０μＭ）のＣ２８を用いて４８時間処理した後のＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株におけるＮＵＳＡＰ１のウエスタンブロッティング分析を示す。ＧＡＤＰＨをローディングコントロールとして使用した。ＬＭＴＫ３のノックダウン（ｓｉＲＮＡ）後のＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株におけるＮＵＳＡＰ１のウエスタンブロッティングを示す。ＧＡＤＰＨをローディングコントロールとして使用した。１０μＭＣ２８による前処理後のＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株におけるＮＵＳＡＰ１タンパク質レベルに対する、ｐＣＭＶ６－ＬＭＴＫ３プラスミドを使用したＬＭＴＫ３過剰発現の影響を示すウエスタンブロッティングを示す。ＧＡＤＰＨをローディングコントロールとして使用した。１０μＭＣ２８による前処理後のＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株における不溶性（重合）チューブリンレベルおよび可溶性（非重合）チューブリンレベルに対する、ｐＣＭＶ６－ＬＭＴＫ３プラスミドを使用したＬＭＴＫ３過剰発現の影響を示すウエスタンブロッティング分析を示す。ＬＭＴＫ３（Ｃ２８）阻害剤の作用機序を示す概略モデルである。Ｃ２８ＡＴＰ競合阻害剤は、ＬＭＴＫ３に選択的に結合し、そのプロテアソーム媒介分解を促進する。ＬＭＴＫ３のダウンレギュレーションは、ＮＵＳＡＰ１タンパク質レベルの低下をもたらし、チューブリン解重合と微小管構築の破壊とをもたらす。その結果、癌細胞はＧ２／Ｍ期で最初に停止し、その後死亡する。１がＤＭＳＯを示し、２がＣ２８を示し、３が３３７－１を示し、３が３４４－５を示し、５が３６９－３を示す、インビトロキナーゼアッセイの結果を示す。（Ａ）５００ｎＭおよび（Ｂ）１μＭの濃度で化合物を提供した。１がＤＭＳＯを示し、２がＣ２８を示し、３が３３７－１を示し、３が３４４－５を示し、５が３６９－３を示す、インビトロキナーゼアッセイの結果を示す。（Ａ）５００ｎＭおよび（Ｂ）１μＭの濃度で化合物を提供した。様々な時点でＣ２８およびその誘導体を用いて処理した後のＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株におけるＬＭＴＫ３タンパク質レベルおよびＥＲαタンパク質レベルのウエスタンブロッティング分析を示す。様々な濃度のＣ２８および３４４－４を用いて２４時間処理した後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株におけるＬＭＴＫ３タンパク質レベルのウエスタンブロッティング分析を示す。

Ｌｅｍｕｒチロシンキナーゼ３（ＬＭＴＫ３）の結晶構造が解明され、それが活性プロテインキナーゼのあらゆる特徴を有することが決定された。特に、Ｋ／Ｅ／Ｄ／Ｄシグネチャーモチーフは、重要な構造的および触媒的役割を果たし、β３鎖の残基Ｌｙｓ１９３、αＣヘリックスの中心のＧｌｕ２１０、触媒ループのＡｓｐ２９５、および活性化セグメントの最初の残基であるＡｓｐ３１３を含む。本発明者らの結晶化実験では、このような試験では一般的である不活性な立体配座でＬＭＴＫ３を安定化させたが、それらの生化学的アッセイでは、ＬＭＴＫ３の触媒活性を明確に検出することができた。

ＬＭＴＫ３では、活性化セグメントＤＦＧモチーフは代わりにＤＹＧ（残基３１３～３１５）である。ＤＹＧモチーフは、一般的ではないが、パーキンソン病および非定型プロテインキナーゼＣ（ａＰＫＣ）に関連するロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）では報告されている。不活性な「Ｄ３１３－ｏｕｔ」状態では、Ｔｙｒ３１４は、ゲートキーパー残基Ｍｅｔ２３９を過ぎて指し示す「ｉｎ」立体配座にあり、結合ＡＴＰのアデニン環と重複する空間領域を占める。本発明者らは、不活性な「ＤＦＧ－ｏｕｔ」立体配座を標的とするキナーゼ阻害剤（ＩＩ型阻害剤）の設計が、細胞活性に対する大きな影響に加えて、活性状態を標的とするＩ型キナーゼ阻害剤よりも高い選択性の可能性をもたらすことを認識した。

［実施例１］－ハイスループット均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）スクリーニングにより、ＬＭＴＫ３を標的とする新規ＡＴＰ競合阻害剤が同定される
方法
組換えＬＭＴＫ３タンパク質産生
ＩｎＦｕｓｉｏｎ（商標）技術を使用して、ＬＭＴＫ３のｗｔキナーゼドメイン（ａａ１３４～ａａ４４４）をＣ末端８ｘヒスチジンタグを付与するｐＯＰＩＮＥｎｅｏにクローニングした（ＢｅｒｒｏｗＮＳ，ｅｔａｌ．（２００７）Ａｖｅｒｓａｔｉｌｅｌｉｇａｔｉｏｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｌｏｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ３５（６）：ｅ４５）。このプラスミドを、ＦｕｇｅｎｅＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２３１１）（ＢｅｒｒｏｗＮＳ，ｅｔａｌ．）を使用して、線状化したオートグラファ・カリフォニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｎｉｃａ）バキュロウイルスバクミドとともに、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞に同時トランスフェクトした（ＺｈａｏＹ，ＣｈａｐｍａｎＤＡ，＆ＪｏｎｅｓＩＭ（２００３）Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ３１（２）：Ｅ６－６）。要約すると、０．５ｍｌのＳｆ９細胞を５×１０^５細胞／ｍｌで２４ウェルプレートに播種し、付着させた。次いで、５０μｌのＳＦ９００ＩＩＩ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１２６５８００１）中、２．５μｌの線状化したバクミドを１００～５００ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合することによって、トランスフェクションカクテルを作製した。これに、１．５μｌのＦｕｇｅｎｅＨＤを加え、混合し、カクテルを室温で３０分間インキュベートした。次いで、２４ウェルプレート内の付着したＳｆ９細胞に、トランスフェクションカクテルを加えた。プレートを２７℃で７日間インキュベートした後、Ｐ０ウイルスを含有する上清を回収した。このウイルスを、懸濁液中の５０ｍｌの細胞を１×１０^６細胞／ｍｌで１００μｌのウイルスに感染させることによって増幅した。細胞を１２０ｒｐｍで振盪しながら２７℃で７日間インキュベートした。Ｐ１ウイルスを回収し、使用前に濾過滅菌した。１×１０^６細胞／ｍｌで２．５ＬのＳｆ９細胞を２．５ｍｌのＰ１ウイルスに感染させ、１２０ｒｐｍで振盪しながら２７℃で３日間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収し、精製前に凍結した。

２．５ＬのＳｆ９培養物から得られたペレットを解凍し、５μｌの２５０Ｕ／μｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号９０２５－６５－４）と５０μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ８８４９）とを含有する約１００ｍｌの溶解緩衝剤（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、５００ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）に再懸濁した。３５ｋＰｓｉでＢａｓｉｃＺ細胞粉砕器を通過させることによって細胞を破壊した後、４℃で３０分間３０，０００ｇで遠心分離することによって細胞残屑を除去した。清澄化後、細胞溶解物を０．２μｍフィルターを通して濾過し、その後、１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＦＦカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１１－０００４－５８）に適用した。５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、５００ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾールを用いて洗浄した後、タンパク質を５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、５００ｍＭＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールに溶出し、その後、２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、２００ｍＭＮａＣｌ中で平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号８－９８９３－３５）に自動的に適用した。全精製工程を４℃で行った。ｗｔＬＭＴＫ３キナーゼドメイン（ｗｔＬＭＴＫ３－ＫＤ）を含有する画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した後、合わせ、濃縮した。感染Ｓｆ９細胞１リットル当たり平均１ｍｇの精製タンパク質（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより純度＞９５％）を得ることができた。タンパク質の同一性は、インタクトタンパク質質量分析によって確認した（測定質量＝３６８０６．４４Ｄａ；１×アセチル化による予測質量＝３６８０５．１３Ｄａ）（ＮｅｔｔｌｅｓｈｉｐＪＥ，ＢｒｏｗｎＪ，ＧｒｏｖｅｓＭＲ，＆ＧｅｅｒｌｏｆＡ（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｂｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ｔｈｅｒｍａｌｓｈｉｆｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ）ａｓｓａｙ，ａｎｄｍｕｌｔｉａｎｇｌｅｏｒｓｔａｔｉｃｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ４２６：２９９－３１８）。ＧＦＰタンパク質（陰性対照）、ならびに以下の変異Ｋ１９３Ａ、Ｄ２９５ＡおよびＤ３１３Ａを含む変異体（キナーゼ死；ｍｕｔＬＭＴＫ３－ＫＤ）組換えＬＭＴＫ３タンパク質（ａａ１３４～ａａ４４４）を生成するために、同様のプロトコルを使用した。

均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）化学化合物スクリーニング
製造者の指示に従って、ＨＴＲＦＫｉｎＥＡＳＥキット（ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓ、カタログ番号６２ＳＴ１ＰＥＢ）からのＳＴＫＳｕｂｓｔｒａｔｅ１（Ｓ１）ビオチン基質を使用して、ＬＭＴＫ３のペプチドリン酸化活性を測定した。分析工程および最適化工程に続いて、３μＭＡＴＰと、５０ｎＭＳＴＫ－Ｓ１ビオチンと、２５ｎｇ／ウェルのＬＭＴＫ３組換えキナーゼドメイン（ｗｔＬＭＴＫ３－ＫＤ）とを含有する１０μｌのアッセイ体積で、低体積の黒色３８４ウェルプレート（ＣｏｒｎｉｎｇＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＡ）においてスクリーニングアッセイを行った。３７℃で２時間インキュベートした後、検出試薬ストレプトアビジン－ＸＬ６６５と、Ｅｕ３＋－クリプテートを用いて標識したＳＴＫ抗体とを含有する緩衝ＥＤＴＡを用いて反応を停止させた。６６５／６２０ｎｍでの蛍光比として計算した、得られたＴＲ－ＦＲＥＴシグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎを用いて読み取ったところ、このシグナルは、ペプチドのリン酸化レベルに比例した。ｗｔＬＭＴＫ３－ＫＤに対してスクリーニングした、キナーゼ阻害剤に偏向した化合物２８，７１６個のライブラリーを最初に単一濃度（２０μＭ）で試験し、ＳＴＫ－Ｓ１ペプチドのリン酸化の阻害％を決定した。＞５０％の平均阻害を示す上位８６８個の化合物のさらなるヒット確認を行った（２０μＭ、二連）。最後に、上位１６０個の阻害剤（＞５０％阻害）の効力およびＬＣ－ＭＳ純度分析を行い（１０の異なる濃度、二連）、ＩＣ_５０値を計算した。Ｌｉｐｉｎｓｋｉのルールオブファイブ特性（１７５＜ＭＷ＜＝５００、ＡｌｏｇＰ＜＝５、ＡＣＣ＜＝１０、Ｄｏｎ＜＝５、ＴＰＳＡ＜＝１４０）を考慮して、スクリーニングに使用した２８，７１６個の化合物をいずれも選択した。

結果
最初に、本発明者らは、読出しとして均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを使用して基質リン酸化を検出するために、２８，７１６個の化合物を包含するライブラリーをスクリーニングした。試験した化合物の約１５％が２０μＭの濃度で＞５０％の阻害を示した。次いで、本発明者らは、それらの効力、物理化学的および構造的特性に基づいてヒットをｎ＝１６０に絞り、好ましい範囲のＩＣ_５０値（２４ｎＭ～１６μＭ）を与える１０点濃度反応プロファイリングを行った。最終的に、１６０個の最も活性な化合物（ＩＣ_５０：２４ｎＭ～２．６μＭ；図１を参照）のうち３８個をインビトロでの追跡、および細胞ベースの有効性試験のために選択した。

用量依存性インビトロ^３２Ｐ γ－ＡＴＰ放射性標識キナーゼアッセイにより、試験した化合物の阻害効果の変動性が明らかになり、それらのいくつかは、ＬＭＴＫ３によるＨＳＰ２７のリン酸化によって測定されるように、低濃度（＜１μＭ）でさらに高い効率を示した（図１および図２を参照）。次いで、本発明者らは、ＩＬ－３依存性マウス骨髄由来細胞株ＦＤＣＰ１を使用し（ＣｌｅｌａｎｄＷＷ（１９７７）Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｅｎｚｙｍｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｂｙｋｉｎｅｔｉｃｓｔｕｄｉｅｓ．ＡｄｖＥｎｚｙｍｏｌＲｅｌａｔＡｒｅａｓＭｏｌＢｉｏｌ４５：２７３－３８７）、その生存および増殖について触媒活性ＬＭＴＫ３の構成的発現に依存するＬＭＴＫ３形質転換クローン（ＦＤＣＰ１－ＬＭＴＫ３）を操作した。本発明者らは、この細胞ベースのモデルを使用して、選択された阻害剤の機能的応答および効力を評価し、ＦＤＣＰ１－親細胞株およびＦＤＣＰ１－ＬＭＴＫ３細胞株の生存率をモニタリングすることによって、それらの有効濃度（ＥＣ_５０）値を決定した（図１および図３を参照）。

本発明者らは、図１に要約された結果をいずれも考慮し、上位ヒット化合物の新規性および物理化学的特性／類似性を考慮して、以下の構造を有する化合物Ｃ２８、すなわち、３，６－二置換イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジンに注目した：

有望な結果を示す他の化合物は、以下の構造を有していた：

［実施例２］－化合物Ｃ２８のさらなる分析
材料および方法
ＮＭＲ使用のための重水素化溶媒を含む溶媒を購入時に使用した。ＮＭＲスペクトルをＶａｒｉａｎＮＭＲ６００（１Ｈ６００ＭＨｚ；１３Ｃ｛１Ｈ｝１５１ＭＨｚ）を用いて記録した。化学シフトをｐｐｍ単位で報告する。スペクトルは、対応するプロトン性溶媒（１Ｈ）、または溶媒のシグナル（１３Ｃ）を基準とする。市販のガラス製シリカゲルプレート（６０Å、Ｆ２５４）を使用する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって、反応の進行をモニタリングした。移動相は、通常、溶媒混合物であり、可視化はＵＶ光を使用して行った。クロマトグラフィー精製は、ＩＳＣＯＣｏｍｂｉＦｌａｓｈＲＦ７５、または１５０ＰＳＩ精製ユニット、ゲルカラムを用いて行った。５μｍＣ１８１１０Åカラムを使用して、ＬＣ－ＭＳ純度分析を行った。０．１％ギ酸（５％で５分、２０分かけて５～９５％、９５％で５分）を含む水／アセトニトリルで３０分法を使用し、ＵＶを２５４ｎｍに設定して、純度％分析を行った。ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｕｓｓｅｘで高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）を行った。

Ｃ２８の合成

６－クロロ－３－（３－（トリフルオロメトキシ）フェニル）イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン（Ｃ２８－Ｉｎｔ）の調製
３－ブロモ－６－クロロイミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン（２．００ｇ、８．６０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウム（５．４８ｇ、２５．８０ｍｍｏｌ）、３－（トリフルオロメトキシ）フェニルボロン酸（１．８６ｇ、９．３０ｍｍｏｌ）、水（０．７７ｍＬ、４３．００ｍｍｏｌ）および無水１，４－ジオキサン（３０ｍＬ）の混合物をアルゴン下で３０分間脱気した。混合物に、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）を加えた。ＣＨ２Ｃｌ２（３５２ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）および得られた混合物をアルゴン雰囲気下で１６時間かけて６０℃に加熱した。得られた混合物を周囲温度に冷却し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過し、減圧下で濃縮して、暗橙色ゴム（３．６ｇ）を得た。得られた残渣を自動フラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル、１００：０～０：１００、１００ｇＳｉＯ_２）によって精製した。適切な画分を合わせ、減圧下で濃縮して、６－クロロ－３－（３－（トリフルオロメトキシ）フェニル）イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジンを淡黄色固体として得た（２．３２ｇ、８６％）。ＬＣＭＳ（ＵＶ、ＥＳＩ）Ｒｔ＝２０．３７分、［Ｍ－Ｈ］＋ｍ／ｚ＝３１３．９、純度９６％。１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）：δ＝８．４６（１Ｈ，ｓ），８．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ），８．１７（１Ｈ，ｓ），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．６９（１Ｈ，ｍ），７．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），７．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）．
６－（ピリジン－４－イル）－３－（３－（トリフルオロメトキシ）フェニル）イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン（Ｃ２８）の調製
６－クロロ－３－（３－（トリフルオロメトキシ）フェニル）イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン（９８０ｍｇ、３．１３ｍｍｏｌ）、４－ピリジニルボロン酸（５７８ｍｇ、４．７０ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（３．０６ｇ、９．３９ｍｍｏｌ）、無水１，４－ジオキサン（１５ｍＬ）および水（５ｍＬ）の混合物をアルゴン下で３０分間脱気した。混合物に、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）を加えた。ＣＨ２Ｃｌ２（１２８ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）および得られた混合物をマイクロ波照射下で１時間かけて１５０℃に加熱した。得られた混合物に、酢酸エチル（２０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）を加えた。得られた二相混合物を分離し、水相を酢酸エチル（３×２０ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた有機抽出物に、２ＭＨＣｌ水溶液（１０ｍＬ）を加え、得られた混合物を分離した。得られた有機相を２ＭＨＣｌ水溶液（１０ｍＬ）を用いて抽出した。飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液をゆっくりと加えることによって、合わせた水性抽出物を塩基性化した。混合物に酢酸エチル（２５ｍＬ）を加え、得られた二相混合物を分離した。水相を酢酸エチル（２×２５ｍＬ）を用いて抽出し、合わせた有機抽出物をブライン（５０ｍＬ）を用いて洗浄し、無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、暗黄色固体（１．３ｇ）を得た。得られた残渣を自動カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール、１００：０～７５：２５、４５ｇＳｉＯ２）、続いて逆相クロマトグラフィー（水（＋０．１％ギ酸）／アセトニトリル（＋０．１％ギ酸）、９５：５～５：９５、３０ｇＣ１８）によって精製した。適切な画分を合わせ、減圧下で濃縮して、６－（ピリジン－４－イル）－３－（３－（トリフルオロメトキシ）フェニル）イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン（Ｃ２８）を明黄色固体として得た（９１０ｍｇ、８２％）。ＬＣＭＳ（ＵＶ、ＥＳＩ）Ｒｔ＝１４．４６分、［Ｍ－Ｈ］＋ｍ／ｚ＝３５６．９、純度１００％。１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）：δ＝８．８１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），８．５０（１Ｈ，ｓ），８．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），８．３６（１Ｈ，ｓ），８．２５（１Ｈ，ｓ），８．１１－８．０８（２Ｈ，ｍ），８．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），７．７１（１Ｈ，ｍ），７．４２（１Ｈ，ｍ）．１３ＣＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）：δ＝１５０．６，１４９．２，１４８．７，１４２．３，１３９．９，１３５．０，１３０．９，１３０．４，１２６．９，１２５．２，１２１．０，１２０．２，１１８．２，１１６．１（ｏｎｅｃａｒｂｏｎｎｏｔｏｂｓｅｒｖｅｄ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－［＋Ｈ］）ｍ／ｚ：ＣａｌｃｄｆｏｒＣ_１８Ｈ_１２Ｆ_３Ｎ_４Ｏ３５７．０９５８；Ｆｏｕｎｄ３５７．０９５３．
示差走査蛍光定量法
ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６ＲＴ－ＰＣＲ装置を使用して、励起波長および発光波長をそれぞれ５３３および５７２ｎｍに設定して、示差走査蛍光定量法を行った。２００ｍＭＴｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ８．０）、２００ｍＭＮａＣｌおよび４μｌの５０×ＳＹＰＲＯオレンジ（Ｓｉｇｍａ）中１６μｌの５．４μＭＬＭＴＫ３と、０．２μｌのＤＭＳＯ、またはＣ２８のＤＭＳＯ溶液のいずれか（１０μＭＣ２８、１％ｖ／ｖＤＭＳＯ、４．３μＭＬＭＴＫ３および１０×ＳＹＰＲＯオレンジの最終濃度）とを含む溶液。温度範囲は、１℃／分の走査速度で２５から８０℃に及んだ。融解曲線分析を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６（ｖ１．１）ソフトウェアでデータ分析を行い、Ｔｍ値を温度に対する蛍光の負の一次導関数として決定した。

円二色性分光法
ＪａｓｃｏＪ装置を使用して、円二色性分光法を行った。温度を１℃／分の増分で２０℃から９０℃に上昇させ、２３０ｎｍの波長をモニタリングすることによって０．２℃ごとにデータ点を取得した。熱安定性実験のために、ＤＭＳＯ０．４％（ｖ／ｖ）、または８．３μＭＣ２８のＤＭＳＯ溶液（０．４％）のいずれかを用いて、０．１ｃｍのクルベット（ｃｕｒｖｅｔｓ）で１２０μｌの総体積まで、２００ｍＭＴｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ８．０）、２００ｍＭＮａＣｌ中５．４μＭのＬＭＴＫ３試料を処理した。遷移領域のデータをボルツマンシグモイドに当てはめることによって、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ｖ７．０）でデータ分析を行った。遷移が５０％完了した時点として、見かけのＴｍ値を決定した。

結果
本発明者らは、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）および円二色性（ＣＤ）分光法を使用してＬＭＴＫ３およびＬＭＴＫ３／Ｃ２８複合体の熱変性をモニタリングすることによって、Ｃ２８がＬＭＴＫ３に結合する能力を評価した。図４に示すように、両方法により、リガンド結合に特徴的な、Ｃ２８の存在下でのＬＭＴＫ３の熱安定性の増加が明らかにされた。ＤＳＦ（５０．４→５３．０℃；Ｐ＝０．００１）を使用して２．６℃で、およびＣＤ（５１．１→５４．２℃；Ｐ＝０．００２）を使用して３．１℃で、Ｃ２８結合時のＬＭＴＫ３のＴ_ｍ値の増加を決定した。熱融解曲線では単一の遷移のみが観察され、熱アンフォールディングはタンパク質凝集のために不可逆的であった。

Ｃ２８の作用機序を研究するために、本発明者らは、一定量のＡＴＰの存在下での化合物の阻害活性に対するＨＳＰ２７の基質濃度の増加の影響を調査した。本発明者らの結果により、阻害剤は、Ｋ_ｍ値に影響を及ぼさないが（非存在下で０．２３９μＭ対Ｃ２８の存在下で０．２４９μＭ）、Ｃ２８の存在下で顕著に低いＶ_ｍａｘ（１０８．６μｍｏｌ／分対４１．４４μｍｏｌ／分）をもたらすことが明らかにされた（図５を参照）。漸増濃度のＨＳＰ２７でも変化しないＫ_ｍ値は、阻害が基質非依存性であることを示す。

本発明者らは、次に、一定の基質（ＨＳＰ２７）濃度（０．６μＭ）での漸増濃度のＡＴＰの影響を調査した。図６に示すように、Ｃ２８の存在下で、定常状態分析から得られたデータをミカエリス・メンテン式（ＣｌｅｌａｎｄＷＷ（１９７７）Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｅｎｚｙｍｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｂｙｋｉｎｅｔｉｃｓｔｕｄｉｅｓ．ＡｄｖＥｎｚｙｍｏｌＲｅｌａｔＡｒｅａｓＭｏｌＢｉｏｌ４５：２７３－３８７）に当てはめたところ、本発明者らは、０．００５３μＭから０．０３８μＭへの見かけのＫ_ｍ値の顕著な増加を観察し、Ｃ２８が競合阻害剤であることが示された。

要約すると、本発明者らは、ＬＭＴＫ３に対する新規ＡＴＰ競合阻害剤の証拠を提供する。

［実施例３］－Ｃ２８は、ＬＭＴＫ３のプロテアソーム媒介分解を促進する高度に選択的なＬＭＴＫ３阻害剤である
材料および方法
細胞株
ＭＣＦ７細胞株、Ｔ４７Ｄ細胞株およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。１０％ＦＢＳ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ７５２４－５００ＭＬ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ０７８１－１００ＭＬ）を補充した低グルコースＤＭＥＭ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ６０４６－５００ＭＬ）中で、ＭＣＦ７細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を維持した。１０％ＦＢＳ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ７５２４－５００ＭＬ）および１％Ｌ－グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ１１４６－１００ＭＬ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｒ５８８６－５００ＭＬ）中で、Ｔ４７Ｄ細胞を維持した。ＬＭＴＫ３を安定に過剰発現するＭＣＦ７／ＬＭＴＫ３細胞株は、以前に記載されている（ＪａｃｏｂＪ，ｅｔａｌ．（２０１６）ＬＭＴＫ３ｅｓｃａｐｅｓｔｕｍｏｕｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｍｉＲＮＡｓｖｉａｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＤＤＸ５．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ３７２（１）：１３７－１４６）。細胞はいずれも、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。

プロテインキナーゼアッセイ
^３２Ｐ γ－ＡＴＰインビトロキナーゼアッセイを、以前に記載されたように組織内で行った（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号ＢＬＵ００２Ａ５００Ｕ、ＵＫ）（ＧｉａｍａｓＧ，ｅｔａｌ．（２００９）ＣＫ１ｄｅｌｔａｍｏｄｕｌａｔｅｓｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＥＲａｌｐｈａｖｉａＡＩＢ１ｉｎａｎｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅｓＥＲａｌｐｈａ－ＡＩＢ１ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ３７（９）：３１１０－３１２３、およびＧｉａｍａｓＧ，ｅｔａｌ．（２００７）ＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆＣＫ１ｄｅｌｔａ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｅｒ３７０ａｓｔｈｅｍａｊｏｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅｔａｒｇｅｔｅｄｂｙＰＫＡｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ．ＢｉｏｃｈｅｍＪ４０６（３）：３８９－３９８）。ＭＲＣＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｒｅｆｏｒＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｉｎｇＵｎｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｉｎａｓｅ－ｓｃｒｅｅｎ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｐｒｅｍｉｅｒ－ｓｃｒｅｅｎ）で、１４０個のプロテインキナーゼのパネルに対するＣ２８の選択性「ｐｒｅｍｉｅｒスクリーニング」を行った。

キナーゼ阻害剤競合結合アッセイ
４５６個のキナーゼのパネルに対するＤｉｓｃｏｖｅＲｘＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ競合結合アッセイを使用して（ｗｗｗ．ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ．ｃｏｍ）、５μＭでのＣ２８キナーゼ阻害剤の選択性プロファイリングを分析した。

ウエスタンブロッティング
新鮮なプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ、カタログ番号１１６９７４９８００１およびカタログ番号４９０６８４５００１）を含むＲＩＰＡ緩衝剤（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｒ０２７８－５０ＭＬ）を使用してタンパク質溶解物を抽出し、標準的なウエスタンブロッティングプロトコルを以前に記載されたように行った（ＧｉａｍａｓＧ，ｅｔａｌ．（２００７）ＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆＣＫ１ｄｅｌｔａ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｅｒ３７０ａｓｔｈｅｍａｊｏｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅｔａｒｇｅｔｅｄｂｙＰＫＡｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ．ＢｉｏｃｈｅｍＪ４０６（３）：３８９－３９８）。要約すると、ＰｉｅｒｃｅＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２３２２７）を使用して溶解物のタンパク質濃度を決定し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ４２０１２およびカタログ番号Ｍ００６５３）を用いて３０／５０μｇのタンパク質抽出物を分離した。次いで、ｉＢｌｏｔ２ドライブロッティングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＩＢ２１００１）を使用して、ニトロセルロースブロッティング膜（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＩＢ２３００１）にタンパク質を転写した。膜を、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０と５％（ｗ／ｖ）無脂肪乳または５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ＶＷＲＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４２１５０１Ｊ）とを含有するＴＢＳ中で１時間ブロッキングした後、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。ＨＲＰコンジュゲート二次抗ウサギ（１：５０００、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号７０７４Ｐ２）抗体または抗マウス（１：５０００、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号７０７６Ｐ２）抗体を使用した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＰｉｃｏＰＬＵＳＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３４５７７）を使用して化学発光検出を行った。ＵＶＰＣｈｅｍＳｔｕｄｉｏＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ（Ａｎａｌｉｔｙｋｊｅｎａ）を使用して発光を捕捉した。

結果
Ｃ２８の選択性のさらに詳細なプロファイルを決定するために、本発明者らは、記載されるように^３３Ｐγ－ＡＴＰを使用して（ＢａｉｎＪ，ｅｔａｌ．（２００７）Ｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａｆｕｒｔｈｅｒｕｐｄａｔｅ．ＢｉｏｃｈｅｍＪ４０８（３）：２９７－３１５、およびＨａｓｔｉｅＣＪ，ＭｃＬａｕｃｈｌａｎＨＪ，＆ＣｏｈｅｎＰ（２００６）ＡｓｓａｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓｕｓｉｎｇｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＡＴＰ：ａｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｎａｔｕｒｅｐｒｏｔｏｃｏｌｓ１（２）：９６８－９７１）放射性フィルター結合アッセイを行うことによって、一連の１４０個のキナーゼに対してＣ２８をスクリーニングした（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｉｎａｓｅ－ｓｃｒｅｅｎ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｐｒｅｍｉｅｒ－ｓｃｒｅｅｎ）。興味深いことに、本発明者らは、１μＭＣ２８の存在下で活性が＞５０％低下した１８／１４０個のキナーゼのみを同定し、そのうち４個（ＣＬＫ：５ｎＭ；ＤＹＲＫ１α：６ｎＭ；ＨＩＰＫ２：４８ｎＭおよびＩＲＡＫ４：４１ｎＭ）のみがＬＭＴＫ３のＩＣ_５０値（６７ｎＭ）と同様に低いＩＣ_５０値を有していた（図７）。

続いて、Ｃ２８の特異性をさらに調査するために、本発明者らは、活性部位特異的競合結合アッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ）を使用し、Ｃ２８と４０３個の精製ヒトキナーゼとの間の相互作用を定量的に測定した（ＦａｂｉａｎＭＡ，ｅｔａｌ．（２００５）Ａｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅ－ｋｉｎａｓｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｍａｐｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２３（３）：３２９－３３６、およびＫａｒａｍａｎＭＷ，ｅｔａｌ．（２００８）Ａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２６（１）：１２７－１３２）（図８）。Ｃ２８のＳ（３５）選択性指数は、この濃度で対照の３５％未満で阻害されたカイノームの割合によって測定した場合、０．１８６であった（Ｓ［３５］＝［％Ｃｔｒｌ＜３５を有するキナーゼの数］／［試験したキナーゼの数］）。興味深いことに、臨床腫瘍学で現在使用されている７１個のキナーゼ阻害剤の定量分析（ＫａｒａｍａｎＭＷ，ｅｔａｌ．（２００８）Ａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２６（１）：１２７－１３２）は、Ｃ２８と同等に低いＳ（３５）スコアを示した。Ｃ２８は３３／４０３個のみのキナーゼの活性を＞９０％阻害し、その大部分（２０／３３個）は同じタンパク質の様々なアイソフォームであり、Ｃ２８の全体的に低い乱雑性が強調された。阻害剤の選択性を調査するために使用した２つのアッセイ（活性部位特異的競合結合アッセイおよび放射性フィルター結合アッセイ）の異なる原理にもかかわらず、図７および図８で強調された、Ｃ２８によって標的とされる同定されたキナーゼのかなりの重複があり、この結果の精度をさらに検証したことは言及する価値がある。

漸増濃度のＣ２８を用いて様々なＢＣ細胞株を処理すると、ＬＭＴＫ３の時間依存的分解および用量依存的分解が起こり（図９）、これを、Ｃ２８の存在下でのＬＭＴＫ３の半減期の減少によって示されるように、シクロヘキサミドによる処理後にさらに検証した（図１０）。その結果、次いで、本発明者らは、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２との同時処理後のＬＭＴＫ３タンパク質ターンオーバーに対するＣ２８の影響を分析し、ＭＧ１３２がＬＭＴＫ３のＣ２８誘導性ダウンレギュレーションを防止することができることを観察した（図１１）。これらの結果は、Ｃ２８がＬＭＴＫ３のプロテアソーム分解を促進するとともに、ＬＭＴＫ３ユビキチン化の増加に関連することを示唆している（図１２）。

本発明者らは、ＬＭＴＫ３のサイレンシングがエストロゲン受容体アルファ（ＥＲα）のダウンレギュレーションをもたらし、実際に、Ｃ２８による処理がＥＲαのタンパク質レベルを低下させることを以前に報告している（図９）。さらに、本発明者らはまた、ＢＣ細胞内のＨＳＰ２７のリン酸化状態の減少を観察し、ＨＳＰ２７がＬＭＴＫ３のインビボ（インビトロとは別の）基質でもあることが示唆された。合わせて、これらの結果は、ＬＭＴＫ３に対するＣ２８阻害剤の特異性をさらに裏付けた（図１３）。最後に、本発明者らはまた、選択性スクリーニングから潜在的なＣ２８標的として同定されたＣＬＫ２キナーゼ、ＤＹＲＫ１αキナーゼ、ＨＩＰＫ２キナーゼ、ＩＲＡＫ４キナーゼおよびＴＲＫＡキナーゼに対するＣ２８の影響（それらの活性に関連する総レベルおよび蛍光体部位）を調査した。図１４に示すように、様々な時点に関する１０μＭのＣ２８によるＢＣ細胞株の処理は、ＩＲＡＫ４およびＨＩＰＫ２の分解をもたらした。

全体として、これは、ＩＲＡＫ４およびＨＩＰＫ２に対する二次選択性を有すると思われる、高度に選択的なＬＭＴＫ３阻害剤を同定した最初の報告である。

［実施例４］－Ｃ２８阻害剤は、様々なるヒト癌細胞株では強力な抗癌活性を示し、マウスモデルでは腫瘍増殖を阻害する
材料および方法
細胞株
ＭＣＦ１２Ａ細胞株はＡＴＣＣから購入した。１０％ＦＢＳ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ７５２４－５００ＭＬ）と、１％Ｌ－グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ１１４６－１００ＭＬ）と、１％乳腺上皮増殖サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｓ０１５５）と、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）由来の１００ｎｇ／ｍｌコレラ毒素（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ８０５２－５ＭＧ）とを補充したＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ培地１７１（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１７１Ｍ－１７１－５００）中でＭＣＦ１２Ａ細胞を維持した。

他の細胞株は実施例３に記載の通りであった。細胞はいずれも、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。

動物実験
異種移植片作製のために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（１×１０^６個）を４～５週齢のＮＳＧマウス（ＮＯＤ－ｓｃｉｄＩＬ２Ｒｇａｍｍａｎｕｌｌ、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）の左側腹部および右側腹部に皮下注射した。腫瘍が触知可能になると（直径約０．４～０．５ｃｍ）、マウスに対して連日の強制経口投与による３週間の処置を開始し、週に１回中断した。処置群には、ビヒクル（１：１の比で５％デキストロース／ＰＥＧ４００）またはＣ２８のいずれかを投与した。製剤を調製するために、Ｃ２８を必要な体積のＰＥＧ４００に最初に溶解し、１分間ボルテックスし、次いで、４０℃で３０分間超音波処理した。次に、５％デキストロース水溶液を激しくボルテックスしながら製剤に加えた。ノギス測定によって、腫瘍を週２回モニタリングした。合計で、マウス３匹が処置中に死亡した（Ｃ２８処置動物）。

ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃ異種移植実験のために、２×１０^６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃ細胞を５０μｌの１×ＰＢＳおよび５０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（１：１の比）に懸濁し、５週齢の雌ＮＵ／Ｊホモ接合マウス（Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）の側腹部に皮下注射した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃ細胞（注射前）および腫瘍移植マウスを、ＰＢＳに溶解したＤ－ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して細胞注射直後に撮像し、ＩＶＩＳ１００Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ／光学撮像システム（ＸｅｎｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して発光を測定する１５分前に、マウス１匹当たり１．５ｍｇの用量で腹腔内注射した。不快感、腫瘍増殖および体重について、マウスを連日モニタリングした。腫瘍が約１ｃｍのサイズに達すると、マウスを３つの群、すなわち、（ｉ）ビヒクル：５％デキストロース／ＰＥＧ４００２５％：７５％、ｖ／ｖ（ｎ＝６）、（ｉｉ）Ｃ２８：１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）、および（ｉｉｉ）Ｃ２８：３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）に無作為に分けた。腫瘍増殖を測定するために、処置開始前（処置の０日目）に動物を撮像した。強制経口投与によって２１日間にわたり連日処置を行った。処置後１４および２１日目にマウスを撮像した。

腫瘍が触知可能になるとすぐに、合計１９日間にわたり強制経口投与によって、ＭＭＴＶ－Ｎｅｕマウス（ＤａｎｋｏｒｔＤ，ｅｔａｌ．（２００１）Ｇｒｂ２ａｎｄＳｈｃａｄａｐｔｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓｐｌａｙｄｉｓｔｉｎｃｔｒｏｌｅｓｉｎＮｅｕ（ＥｒｂＢ－２）－ｉｎｄｕｃｅｄｍａｍｍａｒｙｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ２１（５）：１５４０－１５５１）を連日処置した。処置群には、ビヒクル（１：１の比で５％デキストロース／ＰＥＧ４００）またはＣ２８のいずれかを投与した。ノギス測定によって、腫瘍を週２回モニタリングした。以下の式を使用して腫瘍体積を計算した：Ｖ＝ａ×ｂ２／２、式中、「ａ」は最大直径であり、「ｂ」は最小である。動物試験はいずれも、国内規制および国際的な規制に従って行い、ＢＲＦＡＡ倫理委員会によって承認された。

結果
次いで、本発明者らは、漸増濃度のＣ２８の存在下で様々なＢＣ細胞株（および１つの非形質転換***細胞株；ＭＣＦ１２Ａ）の増殖を調査することによって、抗癌戦略としてのＣ２８の潜在的な使用を研究した。図１５に示すように、Ｃ２８は、６．５～８．６４μＭの範囲のＩＣ_５０値でＢＣ細胞の増殖を阻害することができたが、非癌性細胞株（ＭＣＦ１２Ａ）は、Ｃ２８に対する感受性が低いように思われた（ＩＣ_５０：１４．７７μＭ）。

本発明者らは、次に、Ｃ２８をＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）のＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＰｒｏｇｒａｍ（ＤＴＰ）に提出し、それを６０個のヒト癌細胞株のパネルに対してスクリーニングした（ＳｈｏｅｍａｋｅｒＲＨ（２００６）ＴｈｅＮＣＩ６０ｈｕｍａｎｔｕｍｏｕｒｃｅｌｌｌｉｎｅａｎｔｉｃａｎｃｅｒｄｒｕｇｓｃｒｅｅｎ．Ｎａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｎｃｅｒ６（１０）：８１３－８２３）。注目すべきことに、１０μＭの用量では、Ｃ２８は、全癌細胞株を＞５０％阻害した（図１６）。実証された顕著な増殖阻害を考慮して、ＮＣＩは、５つの用量でＣ２８をさらに評価することを決定した。結果から、白血病細胞株、黒色腫細胞株、卵巣細胞株およびＣＮＳ細胞株のほとんどがＣ２８に対してさらに耐性であるが、腎癌細胞はさらに感受性であるように思われることが明らかにされた。これらのデータは、様々な腫瘍型に対するＣ２８の抗癌適用可能性を実証している。

マウスモデルを対象としてＣ２８の有用性を試験する前に、その溶解度を様々な製剤ビヒクルおよび溶解条件で評価した。本発明者らはまた、静脈内（ＩＶ）投与、腹腔内（ＩＰ）投与および経口（ＰＯ）投与後の異なる用量で、ヌードＢａｌｂ／ｃマウスを対象としてＣ２８の薬物動態（ＰＫ）特性を研究した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる血漿試料の分析により、ＩＶ投与されたＣ２８（５ｍｇ／ｋｇ）は、注射後５分で１５３３ｎｇ／ｍｌのピーク濃度（Ｃ_ｍａｘ）を有し、これが短い半減期（Ｔ_１／２約１０分）によって打ち消されたのに対して、用量を１ｍｇ／ｋｇに低下させると、曝露が非常に少なくなった（Ｃ_ｍａｘ＝１８５ｎｇ／ｍｌ）ことが明らかにされた。最適な投与経路は、Ｃ_ｍａｘが８３９ｎｇ／ｍｌであり、Ｔ_１／２が約５９分である）１０ｍｇ／ｋｇのＩＰ、またはＰＯ（Ｃ_ｍａｘ＝６３２ｎｇ／ｍｌ；Ｔ_１／２約６２分）であると思われた。図１７を参照されたい。

本発明者らは、Ｃ２８のＰＯバイオアベイラビリティを示したことから、構成的に活性なマウスＮｅｕタンパク質がマウス乳癌ウイルスプロモーターの制御下で発現されるＭＭＴＶ－Ｎｅｕ乳癌モデルトランスジェニックモデルを対象として、その抗腫瘍活性を評価した。腫瘍が触知可能になると、対照ビヒクル（１：１の比で５％デキストロース／ＰＥＧ４００）、または１０ｍｇ／ｋｇの最終濃度のＣ２８のいずれかを用いて、マウスを連日ＰＯ処置した。図１８に示すように、Ｃ２８は、ビヒクル処置群と比較して腫瘍増殖をほぼ完全に抑止した。異なる群間の腫瘍切片および他の臓器（肺、胃、心臓、腎臓、肝臓、脾臓）の組織病理学的分析は、有意差を何ら示さず、Ｃ２８阻害剤の毒性の欠如がさらに実証された。さらに、Ｋｉ－６７免疫組織化学（ＩＨＣ）分析は、Ｃ２８による処置後に増殖の減少を示し（図１９）、ＩＨＣはまた、本発明者らの細胞ベースの観察結果と同様に、ＬＭＴＫ３タンパク質レベルの減少を明らかにした（図２０）。

次に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＴＮＢＣ細胞を免疫無防備状態のマウスに皮下注射したＢＣ異種移植マウスモデルを使用して、ＬＭＴＫ３阻害剤の抗腫瘍活性も評価した。腫瘍が触知可能になると、マウスを異なる群に分け、対照ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇの最終濃度のＣ２８のいずれかで、連日ＰＯ処置した。２３日後、Ｃ２８による処置は、対照群と比較して増殖を有意に妨げ（図１９）、体重の変化は観察されなかった（ビヒクル群：０日目：２１．２２ｇｒ→１５日目：２１．４２ｇｒ対Ｃ２８群０日目：２１．７７ｇｒ→１５日目：２１．８４ｇｒ）。ルシフェラーゼ標識されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１、および１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのいずれかのＣ２８による処置を使用した別個の試験でも同様の結果が得られた（図１９）。

全体として、データは、インビトロでのＣ２８の強力な前臨床抗癌活性と、マウスモデルにおけるインビボでの腫瘍発症の遅延とを実証する。

［実施例５］－Ｃ２８は、チューブリン重合を阻害し、微小管構築を破壊することによって、Ｇ２／Ｍ停止およびアポトーシスを促進する
材料および方法
細胞株
他の細胞株は実施例３および４に記載の通りであった。

ウエスタンブロッティング
実施例３に記載されるようにウエスタンブロッティングを行った。

細胞周期分析
細胞を血清飢餓によって同期させ、次いで、完全培地中で４８時間かけて、漸増濃度のＣ２８を用いて処理した。回収後、製造者の指示に従ってＢＤＣｙｃｌｅｔｅｓｔＰｌｕｓＤＮＡＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３４０２４２）を使用して、ＤＮＡをヨウ化プロピジウムによって標識した。ＢＤＡｃｃｕｒｉＣ６フローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。

有糸***指数アッセイ
カバーガラス上で増殖させた細胞を４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、０．３％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液とともに室温で３０分間インキュベートした。次いで、カバーガラスを抗チューブリン抗体（１：１００、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ａ０１４１０－１００）およびＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｓ３６９４２）によって染色した。有糸***指数は、少なくとも１０００個の核をスコア化する、有糸***の割合を計数して評価した。

細胞死およびアポトーシス
漸増濃度のＣ２８を用いて、細胞を４８時間または７２時間処理した。回収後、ＭｕｓｅＡｎｎｅｘｉｎＶＤｅａｄＣｅｌｌＫｉｔを用いて、製造者のプロトコルに従って（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＣＨ１００１０５）細胞を染色した。次いで、ＭｕｓｅＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して細胞を分析した。

免疫蛍光染色
カバーガラス上で増殖させた細胞を４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、０．３％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液とともに室温で３０分間インキュベートした。次いで、カバーガラスを、同じ緩衝剤で希釈したα－チューブリン一次抗体（１：１００、カタログ番号Ａ０１４１０－１００）とともに４℃で一晩インキュベートした。細胞を洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ（登録商標）－４８８ヤギ抗マウス二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１１０２９）を用いて室温で６０分間プローブした。洗浄後、カバーガラスを、ＤＡＰＩを含むＳｌｏｗｆａｄｅＧｏｌｄ褪色防止試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｓ３６９４２）を用いてガラススライドに取り付けた。ＣＣＤカメラを備えたＺｅｉｓｓＬＳＭ８８０共焦点顕微鏡の６３倍油浸レンズを通して画像を取得した。

インビボ微小管集合アッセイ
可溶性チューブリン二量体由来の不溶性重合微小管の分離を以前に記載されたように行った（ＢｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙＭＶ，ｅｔａｌ．（１９９５）Ｔａｘｏｌｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐ２１ＷＡＦ１ａｎｄｐ５３ｒｅｑｕｉｒｅｓｃ－ｒａｆ－１．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５５（２０）：４６２３－４６２６）。要約すると、漸増濃度のＣ２８、５０ｎＭパクリタキセル（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ１９１２－１ＭＧ）および５０ｎＭコルヒチン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ９７５４－１００ＭＧ）を用いて、細胞を４８時間処理した。次いで、細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を補充した低張溶解緩衝剤（２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８、１ｍＭＭｇＣｌ_２、２ｍＭＥＧＴＡ、１％ＮＰ４０）を使用して溶解した。室温で１０分間１３，０００ｒｐｍで遠心分離した後、可溶性画分を含有する上清を回収した。新鮮なプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ、カタログ番号１１６９７４９８００１およびカタログ番号４９０６８４５００１）を含むＲＩＰＡ緩衝剤（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｒ０２７８－５０ＭＬ）を使用して、ペレットを抽出した。上清およびペレットをＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプリングローディング緩衝剤に９５℃で１０分間かけて溶解し、ウエスタンブロッティングの前にＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に供した。抗α－チューブリン一次抗体（０．５μｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ａ０１４１０－１００）および西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体によって、チューブリンの相対量を検出した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＰｉｃｏＰＬＵＳＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３４５７７）を使用して化学発光検出を行った。ＵＶＰＣｈｅｍＳｔｕｄｉｏＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ（Ａｎａｌｉｔｙｋｊｅｎａ）を使用して発光を捕捉した。

インビトロ微小管重合アッセイ
製造者の指示に従って、インビトロチューブリン重合アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号１７－１０１９４－１）を使用して、漸増濃度のＣ２８とのインキュベーション後に、精製チューブリンの重合を検出した。ＤＭＳＯをビヒクル対照として使用した。陽性チューブリン標的化剤対照として、ノコダゾール（１０μＭ）およびパクリタキセル（１０μＭ）を使用した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３ｘプレートリーダーを使用した３５０ｎｍでの濁度変化の連続モニタリングによって、チューブリン重合を測定した。

ＬＭＴＫ３サイレンシング
製造者の指示に従って、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＯＮＺＡ）を使用して、３つのＬＭＴＫ３ｓｉＲＮＡのプール（ｓ４１５８８、ｓ４１５８９、ｓ４１５８９０Ａｍｂｉｏｎ）、またはスクランブル対照（４３９０８４３、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて細胞をトランスフェクトした。要約すると、５００，０００個の細胞を２０μｌの完全緩衝剤ＳＥ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＰＢＣ１－００６７５）に再懸濁し、３００ｎＭｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションの前に加えた。次いで、細胞を温かい完全培地に播種した。ウエスタンブロッティングによってサイレンシングを確認した。

ＬＭＴＫ３過剰発現
１ウェル当たり３００，０００個の細胞を６ウェルプレートに播種した。次いで、製造者の指示に従って、ＦｕｇｅｎｅＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、２μｇのｐＣＭＶ６－ＬＭＴＫ３プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ、カタログ番号ＲＣ２２３１４０）またはｐＣＭＶ６空ベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ、カタログ番号ＰＳ１００００１）を用いて、細胞をトランスフェクトした。次いで、ウエスタンブロッティングによって過剰発現を確認した。

結果
Ｃ２８の作用機序を解明するために、本発明者らは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を行い、Ｃ２８による処理がＢＣ細胞のＧ２／Ｍ期停止をもたらすことを明らかにした（図２１）。この結果は、有糸***指数の増加を評価することによって（図２２）、および有糸***マーカーホスホ－ヒストンＨ３－Ｓｅｒ１０の高発現によって（図２３）確認された。Ｃ２８への長期曝露後、アポトーシスの同時誘導が観察され（図２４）、細胞性老化に影響はなかった（データは示さず）。

有糸***停止とアポトーシスの誘導との間の記録された関連性を考慮して、本発明者らは、様々なアポトーシス促進タンパク質および抗アポトーシスタンパク質の発現を調査した。予測され、細胞死アポトーシス機構と一致したように、本発明者らは、ＢＣ細胞株では、ＢＣＬ－ＸＬ抗アポトーシスタンパク質およびＢＣＬ２抗アポトーシスタンパク質の減少と、切断されたＰＡＲＰの増加とを観察した（図２５）。興味深いことに、非形質転換ＭＣＦ１２Ａ***細胞株は、高濃度のＣ２８およびさらに長い時点であっても、Ｇ２／Ｍ停止後に低い細胞死％（＜５％）を示し（図２４）、非形質転換***上皮細胞が細胞周期停止からの回復に取り組みながら死を逃れることが示唆された（図２１）。まとめると、これらの結果は、Ｃ２８が癌細胞に対して選択的にその効果を示し、臨床的探索を必要とする結果であることを示唆している。

細胞周期停止、および細胞死の誘導に対するＣ２８の効果を念頭に置いて、本発明者らは、Ｃ２８がチューブリン重合に影響を及ぼし、それが細胞骨格の組織化を妨げ、細胞***に影響を及ぼし得る可能性を研究した。間期および中期での細胞の免疫蛍光により、Ｃ２８処理細胞が、破壊された微小管分布、異常な微小管紡錘体構築および変化した染色体凝縮パターンを含む有糸***欠陥を示すことが明らかにされた（図２６）。微小管動態を標的とする２つの公知の薬物であるコルヒチンおよびパクリタキセルによって処理した細胞を対照として使用した。

本発明者らは、細胞ベースの微小管重合アッセイを使用して微小管動態に対するＣ２８の影響を確認し、処理後の不溶性重合チューブリン画分の用量依存的減少を観察した（図２７）。微小管に作用するキナーゼ阻害剤の記録された役割を考慮して、本発明者らは、対照としてパクリタキセルおよびノコダゾール（別のよく記載された微小管不安定化剤）を使用するインビトロチューブリン重合アッセイを使用することによって、Ｃ２８が直接チューブリン標的化剤である可能性を研究した。Ｃ２８の濃度の増加はチューブリン重合に影響を及ぼさず（図２８）、Ｃ２８が、微小管集合に関連するＬＭＴＫ３調節経路を調節することによってその影響を付与することが示唆された。

微小管構築に関与するいくつかのタンパク質の役割が広範囲に研究されている。中でも、核小体および紡錘体関連タンパク質１（ＮＵＳＡＰ１；ＡＮＫＴとしても知られている）は、強力な微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）であり、クロマチンに隣接する微小管の安定化および架橋を促進することにより、紡錘体集合にとって極めて重要であると報告されている。さらに、癌に対するＮｕＳＡＰ１の関与は十分に実証されているが、その過剰発現が転移性ＢＣでは観察されており、予後不良に関連している。したがって、本発明者らは、Ｃ２８がＮｕＳＡＰ１に影響を及ぼし得るかどうかを研究し、様々なＢＣ細胞株のＣ２８処理後にそのタンパク質レベルの低下を観察した（図２９）。同様に、ＢＣ細胞株におけるＬＭＴＫ３のサイレンシング（ｓｉＲＮＡ）後、ＮＵＳＡＰ１タンパク質がダウンレギュレートされた（図３０）。これがＬＭＴＫ３が媒介する影響であることをさらに確立するために、本発明者らは、Ｃ２８処理後にＬＭＴＫ３を過剰発現させることによってＬＭＴＫ３レベルを回復させ、チューブリン重合の部分的な回復とともに（図３２）ＮＵＳＡＰ１レベルの救済を観察した（図３１）。最後に、本発明者らは、ＬＭＴＫ３およびＮＵＳＡＰ１のｍＲＮＡ発現レベルと生存との関連を研究した。本発明者らの分析により、ＬＭＴＫ３およびＮＵＳＡＰ１の高発現が、総生存率および無病生存率の悪化と相関することが明らかにされ、ＢＣ進行におけるＬＭＴＫ３とＮＵＳＡＰ１との協調が示唆された。

要約すると、本発明者らは、Ｃ２８がＬＭＴＫ３を分解することによってその抗腫瘍効果を発揮し、これにより、その後の細胞周期停止および細胞死を伴う微小管解重合がもたらされることを実証した（図３３）。

［実施例６］－Ｃ２８の誘導体
材料および方法
本発明者らは、４－ピリジンボロン酸の代わりに２－ピリジンボロン酸、３－ピリジンボロン酸または２，５－ジメチル－４－ピリジンボロン酸を使用したことを除いて、Ｃ２８について実施例２に記載されているのと同じ方法を使用して、以下の化合物を合成した、

生物学的活性
実施例１～５に記載されている方法を使用して、誘導体の生物学的活性を評価した。

結果
図３４に見られるように、インビトロキナーゼアッセイにより、Ｃ２８が誘導体のいずれよりも優れた阻害剤であることが示された。ただし、試験した３つの誘導体のうち、３４４－４が最良の阻害剤であった。おおよそのＩＣ_５０値を以下の表１に示す。

同様に、図３５および図３６は、Ｃ２８がまた、癌細胞株を対象に試験した際に最良の阻害剤であったことを示す。ただし、誘導体はいずれも、いくらかの活性を示し、３４４－４がＬＭＴＫ３およびＥＲαの両方の最良の阻害剤であった。

最後に、本発明者らは、化合物３４４－４を使用してマウスミクロソーム安定性アッセイを行った。この化合物は、中程度のクリアランスを示した。

［実施例７］－Ｃ２８のさらなる誘導体
材料および方法
本発明者らは、実施例２で示された方法と類似の方法を使用して、Ｃ２８のさらなる誘導体を合成した。

次いで、これらの化合物がＦＤＣＰ１－ＬＭＴＫ３を阻害する能力を評価した。

結果
結果を表２に示す。

結論
本発明者らは、ＬＭＴＫ３の構造の知識に起因して、ＬＭＴＫ３に対する薬物開発の有望な候補となり得る化合物を同定するためにハイスループットスクリーニング手法を採用することができた。この手法を使用して、本発明者らは、ＬＭＴＫ３に高い選択性で結合し、それを阻害し、様々な癌細胞株およびインビボＢＣマウスモデルにおいて有効な抗癌効果を示し、正常な上皮に明らかに害を及ぼさない化合物（ＡＴＰ競合阻害剤）、すなわちＣ２８を同定することができた。

興味深いことに、本発明者らは、Ｃ２８がＬＭＴＫ３のプロテアソーム媒介分解を促進することを見出し、これは、キナーゼとして、およびそれを介してその生物学的効果を付与することができる足場タンパク質としてのＬＭＴＫ３の二重の役割を考慮すると極めて重要である。生物学的安定性についてＨＳＰ９０－ＣＤＣ３７に依存するいくつかの異なる発癌性プロテインキナーゼのＡＴＰ競合阻害剤は、キナーゼのＡＴＰ結合部位へのＣＤＣ３７動員因子の結合に拮抗することによって、それらの分解を促進することが示されている。これは、キナーゼからシャペロン系へのアクセスを剥奪し、それらをユビキチン化およびその後の分解に導く。ＬＭＴＫ３はＨＳＰ９０「クライアントタンパク質」の古典的な特徴を有することから、Ｃ２８はこの「シャペロン剥奪」機構を介してその分解を促進している可能性が高い。Ｃ２８がＬＭＴＫ３の触媒機能および足場機能の両方を無効にする能力により、本発明者らは、ＬＭＴＫ３のホスホ－基質、およびＬＭＴＫ３の足場特性に依存する相互作用パートナーの両方を同定することが可能になった。

機構的には、Ｃ２８は、微小管解重合剤による処理後に頻繁に観察される表現型であるＧ２／Ｍ期停止とアポトーシスの誘導とを引き起こした。本発明者らの実験データから、Ｃ２８がチューブリンに直接結合することができず、その重合に影響を及ぼすことができないことが明らかにされ、別の作用機序が示唆された。興味深いことに、本発明者らは、Ｃ２８による処理後またはＬＭＴＫ３のサイレンシング後にダウンレギュレートされるべきである、微小管の束化および安定化に関与するよく記載されたＭＡＰであるＮＵＳＡＰ１を同定した。合わせて、本発明者らの知見は、Ｃ２８の前臨床治療的利点が、微小管機能の破壊を引き起こす、チューブリンとの相互作用を介してそれらの細胞傷害性を付与するビンカアルカロイド、タキサンまたはエリブリンを含む化学療法剤の確立された役割とは異なって作用する、微小管構築に関連するＬＭＴＫ３標的化経路に対するその影響から生じることを提案する。さらに、Ｃ２８は、ＢＣマウスモデルでは、正常組織または体重に対して毒性を有しなかったが、非形質転換***細胞株（ＭＣＦ１２Ａ）に対するその抗増殖作用およびアポトーシス促進作用は、他のＢＣ細胞株と比較して顕著に低かった。

全体として、経口ＬＭＴＫ３阻害剤の開発は、単剤療法または併用療法（すなわち、ＣＤＫ４／６阻害剤と同じ方法で、例えば、ＥＲ^＋ＢＣに対するアロマターゼ阻害剤と組み合わせられる）のいずれかとして、広範囲な臨床的有用性の可能性を有し得る。さらに正確には、免疫療法が、あるレベルでは有用であるにもかかわらず、ＴＮＢＣの場合、承認された標的療法はない。したがって、ＴＮＢＣにおけるＬＭＴＫ３の異常な発現、ならびにＬＭＴＫ３のゲノム阻害が細胞の増殖、浸潤および遊走の阻害をもたらすことを示す研究に基づいて、ＬＭＴＫ３阻害剤は臨床試験の魅力的な候補となるであろう。一方、ＢＣにおける内分泌抵抗性および化学療法抵抗性の機序は、依然としてほとんど説明されていないため、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤を用いて進行している状況では、これらの患者をさらに集中的に治療する必要性が依然として存在する。これまでの結果（患者検体コホートから得られたインビトロ、インビボおよび臨床データ）に基づいて、ＬＭＴＫ３の阻害は、タモキシフェン（Ｔａｍ）およびドキソルビシン（Ｄｏｘ）の再感作では重要であり得る。その結果、ＬＭＴＫ３阻害剤は、腫瘍の感受性を増加させ、および／または耐性を潜在的に克服するために、確立された治療法（例えば、Ｔａｍ、Ｄｏｘ）とともに使用される可能性がある。

上記実施例の一般的な材料
ＭＧ－１３２（カタログ番号４７４７９０）、およびストレプトマイセス・グリセオルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）由来のアニソマイシン（カタログ番号１７６８８０－１０ＭＧ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入し、ＤＭＳＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号Ｄ／４１２５／ＰＢ０８）に再懸濁した。シクロヘキサミド（カタログ番号３５７４２００１０）をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ＤＭＳＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号Ｄ／４１２５／ＰＢ０８）に再懸濁した。パクリタキセル（カタログ番号Ｔ１９１２－１ＭＧ）およびコルヒチン（カタログ番号Ｃ９７５４－１００ＭＧ）をＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから購入し、ＤＭＳＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号Ｄ／４１２５／ＰＢ０８）に再懸濁した。ＥＲ－アルファ（１：１０００、カタログ番号８６４４）抗体、ユビキチン（１：１０００、カタログ番号３９３６）抗体、ホスホ－ＨＳＰ２７（Ｓｅｒ１５）（１：１０００、カタログ番号２４０４）抗体、ホスホ－ＨＳＰ２７（Ｓｅｒ８２）（１：１０００、カタログ番号９７０９）抗体、ＨＳＰ２７（１：１０００、カタログ番号３９３６）抗体、ホスホ－ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）（１：１０００、カタログ番号３３７７）抗体、ＢＣＬ２（１：１０００、カタログ番号２８７０）抗体、ＢＣＬ－ＸＬ（１：１０００、カタログ番号２７６４）抗体、切断－ＰＡＲＰ（１：１０００、カタログ番号５６２５）抗体、Ｈｉｓ－Ｔａｇ（Ｄ３Ｉ１Ｏ）ＸＰ（登録商標）（カタログ番号１２６９８）抗体、ならびに抗ウサギＩｇＧ（１：５０００、カタログ番号７０７４Ｐ２）ＨＲＰ結合抗体および抗マウスＩｇＧ（１：５０００、カタログ番号７０７６Ｐ２）ＨＲＰ結合抗体をＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した。蛍光体－ＤＹＲＫ１／Ａ（Ｔｙｒ３２１／２７３；１：１０００、カタログ番号１２４９７）およびホスホ－ＴＲＫＡ（Ｔｙｒ６８０／６８１；１：１０００、カタログ番号１１９０４）をＳＡＢから購入し、ＦＬＡＧ抗体（１：１０００、カタログ番号Ｆ７４２５）をＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから購入し、ＮＵＳＡＰ１（抗ＡＮＫＴ）（１：１０００、カタログ番号ＳＴＪ９１５９８）をＳｔＪｏｈｎ’ｓＬａｂｓから購入し、ＧＡＰＤＨ（１μｇ／ｍｌ、カタログ番号３９－８６００）をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ＴＲＫＡ（１：１０００、カタログ番号Ａ０１４０４）、β－アクチン（０．１μｇ／ｍｌ、カタログ番号Ａ００７０２－１００）およびａ－チューブリン（０．５μｇ／ｍｌまたは１：１００、カタログ番号Ａ０１４１０－１００）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入した。ＣＬＫ２（１：１０００、カタログ番号Ａ７８８５）、ＤＹＲＫ１Ａ（１：１０００、カタログ番号Ａ０５９５）およびＩＲＡＫ４（１：１０００、カタログ番号Ａ６２０８）をＡＢＣｌｏｎａｌから購入した。ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ抗体（１：５００、カタログ番号ＷＨ０１１４７８３Ｍ２）を使用して総ＬＭＴＫ３を検出し、Ａｂｃａｍ抗体（１：５００、カタログ番号１１０５１６）を使用してそのキナーゼドメインを検出した。ｐＣＭＶ６－ＬＭＴＫ３過剰発現プラスミド（ＲＣ２２３１４０）およびｐＣＭＶ６空ベクター（ＰＳ１００００１）をＯｒｉｇｅｎｅから購入した。他の試薬はいずれも、特に指定されない限り、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。

細胞株およびクローニング
親ＦＤＣＰ１細胞をＡｄｖａｎｃｅｄＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．から購入した。１０％熱不活性化ＦＢＳ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ７５２４－５００ＭＬ）、１％Ｌ－グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ１１４６－１００ＭＬ）および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－３（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｐ０１５８６）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＦＤＣＰ１インターロイキン３（ＩＬ３）依存性細胞株を増殖させた。

ＦＤＣＰ－ＬＭＴＫ３を作製するために、ＦＤＣＰ１細胞に、ａａ１３４～４４４（キナーゼドメイン）を包含するＦｌａｇエピトープタグ付きＬＭＴＫ３遺伝子に融合したＢＣＲタンパク質をコードするｐＡＣＤ３２０レトロウイルスベクターを形質導入した。この融合－ドナー手法が使用されるのは、様々なキナーゼが、二量体化するそれらの能力に基づいて優先的な形質転換能力を示すことが多く、これは、展開された特定の融合パートナーに依存するためである（ＭｅｌｎｉｃｋＪＳ，ｅｔａｌ．（２００６）Ａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｒａｐｉｄｓｙｓｔｅｍｆｏｒｐｒｏｆｉｌｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｉｂｒａｒｉｅｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０３（９）：３１５３－３１５８）（ＮＰＭ、ＴＰＲ、ｂＴＥＬおよびｎＴＥＬを含む他のタンパク質との融合は、ＢＣＲで観察されるようなＬＭＴＫ３の高いトランス活性化をもたらさなかった）。細胞はいずれも、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。

一般的な合成方法
式（Ｉ）の様々な化合物を生成するための一般的な合成方法を逆合成分析の形態で以下に示す。

Claims

治療に使用するための、式（Ｉ）の化合物：

（式中、Ｒ^１は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、Ｌ^１Ｌ^２Ｒ^８、またはハロゲンであり、前記アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
ｎは０であり、Ｘ^１はＳ、ＯもしくはＮＲ^２であるか、またはｎは１であり、Ｘ^１はＣＲ^２もしくはＮであり、
Ｒ^２～Ｒ^４は、独立して、水素、ハロゲン、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、またはＬ^１Ｌ^２Ｒ^８であり、前記アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｒ^６およびＲ^７は、独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^８は、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）Ｒ^６、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルであり、前記アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｌ^１は、存在しないか、またはＯ、ＳもしくはＮＲ^６であり、
Ｌ^２は、存在しないか、または置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキレン、もしくは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキリンである）、
またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形体。
Ｌｅｍｕｒチロシンキナーゼ３（ＬＭＴＫ３）を阻害することによって治療可能な疾患の治療に使用するための、式（Ｉ）の化合物：

（式中、Ｒ^１は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、Ｌ^１Ｌ^２Ｒ^８、またはハロゲンであり、前記アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
ｎは０であり、Ｘ^１はＳ、ＯもしくはＮＲ^２であるか、またはｎは１であり、Ｘ^１はＣＲ^２もしくはＮであり、
Ｒ^２～Ｒ^４は、独立して、水素、ハロゲン、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、またはＬ^１Ｌ^２Ｒ^８であり、前記アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｒ^６およびＲ^７は、独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^８は、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）Ｒ^６、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルであり、前記アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｌ^１は、存在しないか、またはＯ、ＳもしくはＮＲ^６であり、
Ｌ^２は、存在しないか、または置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキレン、もしくは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキリンである）、
またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形体。
前記疾患が、癌、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、ハイパーソーシャビリティ、プレパルス抑制（ＰＰＩ）欠損、認知障害または神経変性疾患である、請求項２に記載の使用のための化合物。
前記疾患が癌である、請求項３に記載の使用のための化合物。
前記化合物が、式（ＩＩ）の化合物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
Ｒ^２～Ｒ^４が、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニルである、請求項５に記載の使用のための化合物。
Ｒ^２～Ｒ^４がそれぞれＨである、請求項６に記載の使用のための化合物。
Ｒ^１が、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、またはハロゲンである、請求項５～７のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
Ｒ^１が、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいチオフェニル、置換されていてもよいチアゾリル、置換されていてもよいテトラゾリル、置換されていてもよいトリアゾリル、置換されていてもよいピリジニル、置換されていてもよいピリダジニル、置換されていてもよいピリミジニル、置換されていてもよいトリアジニル、置換されていてもよい１，３－ベンゾジオキソリル、置換されていてもよいテトラヒドロピラニル、置換されていてもよいジヒドロピラニル、置換されていてもよいモルホリニル、または塩素である、請求項８に記載の使用のための化合物。
Ｒ^１が以下である、請求項９に記載の使用のための化合物：

（式中、Ｘ^２は、ＮまたはＣＲ^９であり、
Ｒ^９～Ｒ^１３は、独立して、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６である。）
Ｒ^１が、Ｃｌ、フェニル、

である、請求項１０に記載の使用のための化合物。
Ｒ^１が

である、請求項１１に記載の使用のための化合物。
Ｒ^５が、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい５もしくは６員ヘテロアリールである、請求項５～１２のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
Ｒ^５が、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい５もしくは６員ヘテロアリールであり、前記フェニルまたはヘテロアリールが、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＣＯＲ^６およびＣＯＮＲ^６Ｒ^７（式中、Ｒ^６およびＲ^７は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニルである）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよい、請求項１３に記載の使用のための化合物。
Ｒ^５が、

である、請求項１４に記載の使用のための化合物。
Ｒ^５が、ＯＣＦ_３によって置換されたフェニルである、請求項１４に記載の使用のための化合物。
式（Ｉ）の前記化合物が、式（１００）～（１２２）の化合物である、請求項１または２に記載の使用のための化合物。
前記化合物が、式（ＩＩＩ）の化合物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
前記化合物が、式（ＩＩＩａ）の化合物である、請求項１８に記載の使用のための化合物。
前記化合物が、式（２００）～（２０４）の化合物である、請求項１８に記載の使用のための化合物。
対象の癌を治療するための医薬組成物であって、式（Ｉ）の化合物、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物（ここで、式（Ｉ）の化合物は以下の化合物またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形体である）：

（式中、Ｒ^１は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、Ｌ^１Ｌ^２Ｒ^８、またはハロゲンであり、前記アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｒ^２～Ｒ^４は、独立して、水素、ハロゲン、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、またはＬ^１Ｌ^２Ｒ^８であり、前記アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｒ^６およびＲ^７は、独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^８は、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６であり、
Ｌ^１は、存在しないか、またはＯ、ＳもしくはＮＲ^６であり、
Ｌ^２は、存在しないか、または置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキレン、もしくは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキリンである）。
式（Ｉ）の化合物：

（式中、Ｒ^１は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、Ｌ^１Ｌ^２Ｒ^８、またはハロゲンであり、前記アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
ｎは０であり、Ｘ^１はＳ、ＯもしくはＮＲ^２であるか、またはｎは１であり、Ｘ^１はＣＲ^２もしくはＮであり、
Ｒ^２～Ｒ^４は、独立して、水素、ハロゲン、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^５は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリル、またはＬ^１Ｌ^２Ｒ^８であり、前記アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、ＯＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｒ^６およびＲ^７は、独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニルであり、
Ｒ^８は、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）Ｒ^６、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい３～１０員ヘテロシクリルであり、前記アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルは、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキニル、ハロゲン、Ｏ^－、ＯＲ^６、ＳＲ^６、ＮＲ^６Ｒ^７、ＣＯＮＲ^６Ｒ^７、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＯ_２、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^６Ｒ^７およびＯＣ（Ｏ）Ｒ^６からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、
Ｌ^１は、存在しないか、またはＯ、ＳもしくはＮＲ^６であり、
Ｌ^２は、存在しないか、または置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_１５アルキレン、もしくは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_１５アルキリンである）、
またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形体（ここで、式（１００）、（１１３）～（１２２）および（２００）の化合物は除外される）。