JP2023534214A - 抗ベータセルリン抗体、その断片、及び多重特異性結合分子 - Google Patents

Abstract

本開示は、抗ＢＴＣ抗体、当該抗体を産生する方法、当該抗体を含む医薬組成物、及び当該抗体の使用方法を提供する。本開示はまた、多重特異性結合分子、例えば、ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む二重特異性抗体を提供する。

Description

関連出願の相互参照及び配列表の組み込み
本出願は、２０２０年７月１６日に出願された、米国仮特許出願第６３／０５２，７８９号、及び２０２１年３月４日に出願された、米国仮特許出願第６３／１５６，７０９号の優先権を主張するものであり、これらの特許出願は、参照により、その全体が本出願に組み込まれる。２０２１年６月２５日に作成された、２０４，７８６バイト（オペレーティングシステムＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）の「ＰＡＴ０５８８８８－ＷＯ－ＰＣＴ ＳＱＬ＿ＳＴ２５」という名称のファイルに含まれる配列表は、本明細書と共に提出され、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、抗体又はその抗原結合断片、その製造方法、それを含む医薬組成物、並びにその使用方法に関する。

上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーであるベータセルリン（ＢＴＣ）は、元々は、マウス膵臓Ｂ腫瘍細胞株の条件培地から単離された（Ｓｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９，１６０４－１６０７，１９９３）。ＢＴＣは、ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼファミリーに対するリガンドであり、主に、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ及びＰＬ３Ｋ／ＡＫＴ経路のような抗アポトーシス及び増殖促進シグナル伝達経路を引き起こすＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４ホモ二量体を活性化する。

ＢＴＣは、最初に１回膜貫通タンパク質として発現され、その後、ＭＭＰファミリーのメンバーによって９ｋＤａの分泌タンパク質に切断（活性化）される。分泌形態を放出するためのＢＴＣの膜固定形態の切断は、主として、ＡＤＡＭ－１０（ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ－１０）によって発生する（Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６４，７６９－７７９，２００４；Ｓａｈｉｎ ａｎｄ Ｂｌｏｂｅｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５８１，４１－４４，２００７；及びＳａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，１８２６－１８３７，２００５）。成熟し、分泌されたヒトＢＴＣは、ｐｒｏ－ＢＴＣの切断によって生成された８０のアミノ酸残基（Ａｓｐ１－Ｔｙｒ８０、１７８の残基のうちの残基３２～１１１、ＮＰ＿００１７２０．１又は配列番号１５６として記載される膜固定前駆体タンパク質（ｐｒｏ－ＢＴＣ））から構成される３２ｋＤａの糖タンパク質である。ＢＴＣのカルボキシル末端の５０残基領域（Ａｒｇ３１－Ｔｙｒ８０）は、タンパク質のＥＧＦファミリーの保存コンセンサス配列を含有する。

心臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、前立腺、精巣、卵巣、及び結腸におけるいくらか低い発現に加えて、膵臓、肝臓、腎臓、及び小腸を含む多くの組織で、ＢＴＣ ｍＲＮＡの強い発現が検出されている（Ｓａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９０，１１７３－１１７９，１９９３；Ｓａｓａｄａ ａｎｄ Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｎｉｈｏｎ．Ｒｉｎｓｈｏ．５１，３３０８－３３１７，１９９３；及びＳｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １３，１８１－１９１，１９９６）。明確な表現型を表さないＢＴＣノックアウトマウスは、生存可能且つ繁殖可能である。

ＢＴＣ ｍＲＮＡの高い発現は、ＢＴＣが膵臓の発生及び機能において生理学的役割を有し得ることを示唆している。ＢＴＣレベルは、正常な膵臓での発現レベルと比較して、１０種の膵臓癌のうち９種で７．５倍まで上昇することが見出されている（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。膵臓では、ＢＴＣ発現は、インスリン産生Ｂ細胞と緊密に関連する島細胞に局在化している（Ｍｉｙａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．４６，７５５－７６４，１９９９）。ＢＴＣは、膵島生理学を調節することができ、胎児膵臓細胞の増殖を誘導し、非β細胞のβ様インスリン産生細胞への変換を刺激することができる。更に、ＢＴＣの過剰発現が、子宮内膜腺癌（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、肝細胞癌（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）、頭頸部扁平上皮癌（Ｏ－ｃｈａｒｏｅｎｒａｔ ｅｔ ａｌ．，２０００）、及び胃癌（Ｊｅｍａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１）で報告されている。

哺乳動物の眼では、ＢＴＣタンパク質は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、内皮及びミュラー細胞によって合成され（Ａｎａｎｄ－Ａｐｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５，ｅ１３４４４，２０１０）、外側血液網膜関門中に位置する。

血管内皮機能におけるＢＴＣの一般的な役割は研究されてきたが、その網膜における特定の役割は、現在不明である。ＢＴＣのＲＰＥ細胞に対する増殖効果（Ｓｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３）及びその血管新生促進機能の初期報告は、それが増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）において役割を果たし得ることを示唆した。糖尿病マウスはＰＤＲを実証してはいないが、それらは網膜血管透過性の増加を確かに示している（Ｐｏｕｌａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９，８０５－８１５，２００２）。加えて、糖尿病のマウスモデルにおいて、可溶型の切断されたＢＴＣが網膜中で増加し、網膜血管透過性の増加に寄与することが決定されている（Ａｎａｎｄ－Ａｐｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

可溶型ＢＴＣを発現するアデノ随伴ウイルスの網膜下注射は、マウスにおいて網膜血管透過性の劇的な増加をもたらした。全体として、ＢＴＣは、糖尿病性網膜症における網膜血管透過性の増加の発現で重要な役割を果たし得る強力な透過性因子であり、この疾患における潜在的治療標的であると思われる。

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、腫瘍及び眼内障害と関連する新血管形成の重要なメディエータであることが示されている。ＶＥＧＦは、強力な血管透過性因子であり、血管漏出を引き起こすのに不可欠である。哺乳動物の眼では、ＶＥＧＦは、内側血管網膜関門中に位置する。ＶＥＧＦレベルは、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）を有する患者の硝子体において、非糖尿病の眼の状態と比較すると著しく上昇している（Ｆｕｎａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ２００９ １１６：７３－９）。

ペガプタニブ（抗ＶＥＧＦアプタマー；Ｍａｃｕｇｅｎ、ＯＳＩ）；ラニビズマブ（抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ；Ｌｕｃｅｎｔｉｓ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ベバシズマブ（完全長ヒト化抗体；Ａｖａｓｔｉｎ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ブロルシズマブ（抗ＶＥＧＦ ｓｃＦＶ；Ｂｅｏｖｕ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；アフリベルセプト（抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ；Ｅｙｌｅａ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）を含む複数の抗ＶＥＧＦ薬が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び／又はＤＭＥなどの眼科障害を治療するために使用されている。他の抗ＶＥＧＦ分子としては、可溶型ＶＥＧＦ受容体類似体、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ベバシラニブ（Ｏｐｋｏ Ｈｅａｌｔｈ）、及びラパマイシン（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ、ＭａｃｕＳｉｇｈｔ）が挙げられる。抗ＶＥＧＦ薬は、局所麻酔下で、硝子体内注射として眼に送達される。

しかしながら、ＤＭＥなどの眼科障害を有する患者において、抗ＶＥＧＦ療法単独では不十分な応答を示すために、満たされないニーズが存在する。抗ＶＥＧＦ試薬は、黄斑浮腫を低減し、血管新生を阻害し、視力を改善するが、全てのＤＭＥ患者が実質的な長期にわたる改善を経験するわけではない。例えば、抗ＶＥＧＦ療法を受けた患者のおよそ２５％は、治療の１２ヶ月後に視力のいかなる改善も示さず、患者のほぼ５０％が２０／４０の法定運転視力を達成することができない（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。レーザー光凝固又は硝子体内ステロイド治療などの代替療法はあまり成功しておらず、副作用を有する（例えば、眼内ステロイド治療による白内障（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｒｅｐ．２０１３ Ｓｅｐ １（３））。

したがって、抗ＶＥＧＦ療法に不十分な応答を有する患者に対して療法を改善するために、抗ＶＥＧＦ療法への応答を更に増強させることができる因子を特定する必要性がある。

ＢＴＣに結合するＦａｂの構造を示す。ＢＴＣは固体表面として示され、Ｆａｂはリボンとして示されている。Ｆａｂによる結合モードにおける変動を図示するために、ＢＴＣ構造は、全てのパネルで同じ配向にある：Ａ）ＢＴＣ／Ｆａｂ ＮＶＳ２複合体、Ｂ）ＢＴＣ／Ｆａｂ ＮＶＳ３複合体、Ｃ）ＢＴＣ／Ｆａｂ ＮＶＳ１複合体、及びＤ）ＢＴＣ／Ｆａｂ ＮＶＳ４複合体である。 ＢＴＣに結合するＦａｂの構造エピトープ残基を示す。ＢＴＣは、表１２、１３、１４、及び１５に列挙されるエピトープ残基を強調するために、様々な配向を有するリボンとして示されている。エピトープ残基は、ボールとスティックとして示され、ラベル付けされている。Ａ）ＢＴＣ／Ｆａｂ ＮＶＳ２複合体、Ｂ）ＢＴＣ／Ｆａｂ ＮＶＳ３複合体、Ｃ）ＢＴＣ／Ｆａｂ ＮＶＳ１複合体、及びＤ）ＢＴＣ／Ｆａｂ ＮＶＳ４複合体である。 単一特異性抗体及び二重特異性抗体のグラフ表示を提供する。 眼底撮影法（左パネル）及びＦＦＡ視覚化（右パネル）からのｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＢＴＣを注射したマウスの網膜画像を示す。 走査型レーザー検眼鏡からのｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＢＴＣを注射したマウスの網膜画像を示す。 図６：図６Ａ～６Ｇは、単一特異性抗体と二重特異性抗体のＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦへの結合を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 図７：図７Ａ～７Ｄは、単一特異性（ＮＶＳ１－４）抗体及び二重特異性（ＮＶＳ１１－１４）抗体の存在下でのＢＴＣのＥｒｂＢ１への結合を示す。 （上記の通り。） 図８：図８Ａ～８Ｄは、単一特異性（ＮＶＳ１－４）抗体及び二重特異性（ＮＶＳ１１－１４）抗体の存在下でのＢＴＣのＥｒｂＢ４への結合を示す。図８Ｅ及び８Ｆは、ＮＶＳ１、ＮＶＳ１１、又はＮＶＳ８の存在下でのＢＴＣのＥｒＢ１若しくはＥｒｂＢ４への結合を示す。図８Ｇは、ＮＶＳ１、ＮＶＳ１１、又はＮＶＳ８の存在下でのＢＴＣ誘発ＥＧＦＲリン酸化を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 図９：図９Ａ～９Ｃは、単一特異性（ＮＶＳ８）抗体及び二重特異性（ＮＶＳ１１、ＮＶＳ１２、並びにＮＶＳ１４）抗体の存在下でのＶＥＧＦ－ＡのＶＥＧＦＲ２への結合を示す。 （上記の通り。） 図１０：図１０Ａ～１０Ｄは、単一特異性（ＮＶＳ１－４）抗体及び二重特異性（ＮＶＳ１１－１４）抗体の存在下でのＥＲＫ１／２のＢＴＣ誘発リン酸化を示す。 （上記の通り。） 図１１：図１１Ａ～１１Ｄは、単一特異性（ＮＶＳ１－４）抗体及び二重特異性（ＮＶＳ１１－１４）抗体の存在下でのＥｒｂＢ３のＢＴＣ誘発リン酸化を示す。 （上記の通り。） 図１２：図１２Ａ～１２Ｄは、単一特異性（ＮＶＳ１－２）抗体及び二重特異性（ＮＶＳ１１－１４）抗体の存在下でのＨＥＲ３のＢＴＣ誘発リン酸化を示す。 （上記の通り。） 図１３Ａ及び１３Ｂは、単一特異性（ＮＶＳ１若しくはＮＶＳ８）抗体及び二重特異性（ＮＶＳ１１）抗体の存在下でのインビトロにおける網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、及びヒト網膜毛細血管内皮（ＨＲＥＣ）細胞のＢＴＣ誘発透過性を示す。 抗ＢＴＣ（ＬＺＲ２３０）抗体及び／又は抗ＶＥＧＦ（４Ｇ３）抗体の存在下での糖尿病ラットの高血糖誘発性網膜漏出を示す。 図１５：図１５Ａは、ＶＥＧＦ又はＢＴＣによる処置後のウサギの眼からの光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）及び病理画像を示す。図１５Ｂは、ＮＶＳ１又はＮＶＳ１１のガラス体内注射後のウサギの網膜に対する硝子体内ベータセルリンの効果を実証する代表的ＯＣＴ画像を示す。 （上記の通り。） ＮＶＳ１又はＮＶＳ１１による処置後のウサギの眼の網膜厚における変化を示す。 ＮＶＳ２又はＮＶＳ１２による処置後のウサギの眼の網膜厚における変化を示す。 図１８：図１８Ａは、ＮＶＳ１、ＮＶＳ１１、ＮＶＳ２、又はＮＶＳ１２による処置後のウサギの眼の網膜厚における変化を示す。図１８Ｂは、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ１の存在下でのＢＴＣ誘発ＲＰＥの形態的変化を示す。図１８Ｃは、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ８の存在下でのウサギにおけるＶＥＧＦ誘発網膜血管漏出（代表的画像）を示す。図１８Ｄは、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ８の存在下でのウサギにおけるＶＥＧＦ誘発網膜血管漏出（フルオレセイン蛍光眼底造影検査による定量）を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） ＶＥＧＦ又はＢＴＣのＩＶＴ送達後のウサギの眼のフルオレセイン蛍光眼底造影検査画像を示す。 ＮＶＳ８、ＮＶＳ１１、又はＮＶＳ１２による処置後の個々のウサギの眼からのフルオレセイン血管漏出値を示す。 ＮＶＳ１１、ＮＶＳ１２、又はＮＶＳ８による処置後の個々のウサギの眼からのフルオレセイン血管漏出値を示す。 ラニビズマブ又はＮＶＳ１による処置後の個々のウサギの眼からの全網膜厚値における変化を示す。 ＮＶＳ１又はＰＮＶＳ１による処置後のウサギにおける網膜厚の変化を示す。

本開示は、ベータセルリン（ＢＴＣ）に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。

一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣのＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ４、又はその両方への結合をブロックする。

一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣ誘発リン酸化－ＥＲＫ１／２活性化をブロックする。

一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣ誘発リン酸化－ＨＥＲ３活性化をブロックする。

本開示はまた、ＢＴＣに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を提供し、この抗体又は抗原結合断片は、５ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。

一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＢＴＣに結合する。

一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｇ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、Ｖ５６、Ａ５７、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６からなる群から選択される配列番号１５７の少なくとも１つの残基に結合する。

一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７のＲ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、及びＲ７３に結合する。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１、２、及び３に記載されるような重鎖可変領域相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖可変領域相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖可変領域相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号１４、１５、及び１６に記載されるような軽鎖可変領域相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖可変領域相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖可変領域相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号４、２、及び３に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号１４、１５、及び１６に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＨＣＤＲ１は、コンセンサス配列ＸＹＡＩＳを含み、及び／又はＨＣＤＲ２は、コンセンサス配列ＧＩＸＰＸＸＧＸＸＸＹＡＱＫＦＱＧを含み、ここでＸは、任意のアミノ酸であり、異なる位置で同じでなくてもよい。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１６８の重鎖配列及び配列番号１６９の軽鎖配列を含むか、又は配列番号１７０の重鎖配列及び配列番号１７１の軽鎖配列を含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６、及び３に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号１７、１８、及び１９に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号７、８、及び９に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号２０、１８、及び１６に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１０及び２１に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

一態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、アミノ酸配列における違いは、保存的置換である。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１０及び２１に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１１及び２２に記載されるような核酸配列によってコード化される。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１２及び２３に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む。

一態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号１３及び２４に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸によってコード化される。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、１）配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ中に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、２）配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＬ中に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む。

一態様では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１、２、３、１４、１５、及び１６；それぞれ配列番号４、２、３、１４、１５、及び１６；それぞれ配列番号５、６、３、１７、１８、及び１９；又はそれぞれ配列番号７、８、９、２０、１８、及び１６を含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここで
ａ． ＨＣＤＲ１が、配列番号１、４、５、及び７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２、６、及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号３及び９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｂ． ＬＣＤＲ１が、配列番号１４、１７、及び２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号１５及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１６及び１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１０及び２１のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１２及び２３に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む。

また、本開示には、それぞれ、配列番号１０及び２１のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、ＢＴＣに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片が提供される。

一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７のＰ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６に結合する。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２５、２６、及び２７に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３８、３９、及び４０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２８、２６、及び２７に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３８、３９、及び４０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２９、３０、及び２７に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４１、４２、及び４３に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３１、３２、及び３３に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４４、４２、及び４０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３４及び４５に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、アミノ酸配列における違いは、保存的置換である。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３４及び４５に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号３５及び４６に記載されるような核酸配列によってコード化される。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３６及び４７に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む。

一態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号３７及び４８に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコード化される。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、１）配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ中に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、２）配列番号４５のアミノ酸配列を有するＶＬ中に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む。

一態様では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２５、２６、２７、３８、３９、及び４０；それぞれ配列番号２８、２６、２７、３８、３９、及び４０；それぞれ配列番号２９、３０、２７、４１、４２、及び４３；又はそれぞれ配列番号３１、３２、３３、４４、４２、及び４０を含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここで
ａ． ＨＣＤＲ１が、配列番号２５、２８、２９、及び３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号２６、３０、及び３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号２７及び３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｂ． ＬＣＤＲ１が、配列番号３８、４１、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号３９及び４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号４０及び４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３４及び４５のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３６及び４７に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む。

本開示は、それぞれ配列番号３４及び４５のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、ＢＴＣに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を更に提供する。

一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７のＧ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、及びＶ５６に結合する。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２５、４９、及び５０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号５８、５９、及び６０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２８、４９、及び５０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号５８、５９、及び６０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＨＣＤＲ１は、コンセンサス配列ＸＸＡＭＸを含み、及び／又はＨＣＤＲ２は、コンセンサス配列ＸＸＸＸ／－ＸＸＸＸＴＸＹＸＤＳＶＫＧを含み、ここでＸは、任意のアミノ酸であり、異なる位置で同じでなくてもよく、Ｘ／－は、任意のアミノ酸又は欠失である。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１９０の重鎖配列及び配列番号１９１の軽鎖配列を含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２９、５１、及び５０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号６１、６２、及び６３に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３１、５２、及び５３に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号６４、６２、及び６０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５４及び６５に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、アミノ酸配列における違いは、保存的置換である。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５４及び６５に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号５５及び６６に記載されるような核酸配列によってコード化される。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５６及び６７に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む。

一態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号５７及び６８に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコード化される。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、１）配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＨ中に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、２）配列番号６５のアミノ酸配列を有するＶＬ中に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む。

一態様では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２５、４９、５０、５８、５９、及び６０；それぞれ配列番号２８、４９、５０、５８、５９、及び６０；それぞれ配列番号２９、５１、５０、６１、６２、及び６３；又はそれぞれ配列番号３１、５２、５３、６４、６２、及び６０を含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここで
ａ． ＨＣＤＲ１が、配列番号２５、２８、２９、及び３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号４９、５１、及び５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号５０及び５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｂ． ＬＣＤＲ１が、配列番号５８、６１、及び６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号５９及び６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号６０及び６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５４及び６５のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５６及び６７に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む。

本開示はまた、それぞれ配列番号５４及び６５のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、ＢＴＣに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。

一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７のＳ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ａ５７、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、及びＥ７５に結合する。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６９、７０、及び７１に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号８２、８３、及び８４に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号７２、７０、及び７１に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号８２、８３、及び８４に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＨＣＤＲ２は、コンセンサス配列ＸＩＸＸＸＸＸＸＸＸＹＡＤＳＶＫＧを含み、及び／又はＬＣＤＲ３は、コンセンサス配列ＱＱＹＤＸＸＸＴを含み、ここでＸは、任意のアミノ酸であり、異なる位置で同じでなくてもよい。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１９４及び１９５；それぞれ配列番号１９６及び１９７；それぞれ配列番号１９８及び１９９；それぞれ配列番号２００及び２０１；それぞれ配列番号２０２及び２０３；それぞれ配列番号２０４及び２０５；並びにそれぞれ配列番号２０６及び２０７からなる群から選択される重鎖及び軽鎖配列を含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号７３、７４、及び７１に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号８５、１８、及び８６に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号７５、７６、及び７７に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号８７、１８、及び８４に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号７８及び８８に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、アミノ酸配列における違いは、保存的置換である。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号７８及び８８に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号７９及び８９に記載されるような核酸配列によってコード化される。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号８０及び９０に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む。

一態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号８１及び９１に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコード化される。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、１）配列番号７８のアミノ酸配列を有するＶＨ中に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、２）配列番号８８のアミノ酸配列を有するＶＬ中に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む。

一態様では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６９、７０、７１、８２、８３、及び８４；それぞれ配列番号７２、７０、７１、８２、８３、及び８４；それぞれ配列番号７３、７４、７１、８５、１８、及び８６；又はそれぞれ配列番号７５、７６、７７、８７、１８、及び８４を含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここで
ａ． ＨＣＤＲ１が、配列番号６９、７２、７３、及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号７０、７４、及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号７１及び７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｂ． ＬＣＤＲ１が、配列番号８２、８５、及び８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号８３及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号８４及び８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号７８及び８８のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号８０及び９０に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む。

本開示はまた、それぞれ配列番号７８及び８８のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、ＢＴＣに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、単離された抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される形式である。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、Ｆａｂである。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、ｓｃＦＶである。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、単離された抗体である。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナルヒト抗体である。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナルヒト化抗体である。

一態様では、Ｆａｂは、Ｆｃ領域を含む。

一態様では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＤからのＦｃ領域からなる群から選択される。

一態様では、Ｆｃ領域は、配列番号１５９に記載されるようなヒト免疫グロブリンカッパ鎖定常領域配列を含む。

一態様では、Ｆｃ領域は、配列番号１６０に記載されるような重鎖のヒト免疫グロブリン第１の定常Ｉｇドメイン（ＣＨ１ドメイン）を含む。

本開示では、ＢＴＣへの結合及びＢＴＣ媒介シグナル伝達の低減に関して、全体を通して記載されるような抗体又はその抗原結合断片と競合することができる単離された抗体又はその抗原結合断片が提供される。

一態様では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１６８及び１６９；それぞれ配列番号１７０及び１７１；それぞれ配列番号１７２及び１７３；それぞれ配列番号１７４及び１７５；それぞれ配列番号１７６及び１７７；それぞれ配列番号１７８及び１７９；それぞれ配列番号１８０及び１８１；それぞれ配列番号１８２及び１８３；それぞれ配列番号１８４及び１８５；それぞれ配列番号１８６及び１８７；又はそれぞれ配列番号１８８及び１８９に記載されるような重鎖及び軽鎖を含む。

本開示は、全体を通して記載されるような、抗体又はその抗原結合断片をコード化するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

一態様では、発現カセットは、全体を通して記載されるような、ポリヌクレオチドを含む。

一態様では、ベクターは、全体を通して記載されるような、発現カセットを含む。

一態様では、宿主細胞は、全体を通して記載されるような、ポリヌクレオチド又はベクターを含む。

また、本開示には、宿主細胞を、抗体又はその抗原結合断片の発現に好適な条件下で培養することを含む、抗体又はその抗原結合断片を産生する方法が提供される。

一態様では、本方法は、抗体又はその抗原結合断片を精製することを更に含む。

本開示では、有効量の、全体を通して記載されるような、抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物が更に提供される。

一態様では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体を含む。

本開示は、全体を通して記載されるような、有効量の抗体又はその抗原結合断片、若しくは医薬組成物を対象に投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法を提供する。

一態様では、対象は、膵臓癌、乳癌、子宮内膜腺癌、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、及び胃癌からなる群から選択される疾患を有する。

一態様では、抗体又はその抗原結合断片若しくは医薬組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、上皮投与からなる群から選択される経路を介して投与される。

一態様では、対象は、眼科障害を有する。

一態様では、眼科障害は、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、新生血管を伴う加齢黄斑変性、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、中心性漿液性脈絡網膜症母斑症に関連する異常血管増殖、及び急性多発性小板状色素上皮症からなる群から選択される。

一態様では、眼科障害は、糖尿病性黄斑浮腫である。

一態様では、投与は、網膜下注射を介して行われる。

一態様では、投与は、硝子体内注射を介して行われる。

一態様では、医薬組成物は、抗ＶＥＧＦアンタゴニストを更に含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ラニビズマブである。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ベバシズマブである。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、アフリベルセプトである。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ブロルシズマブである。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ペガプタニブである。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、それぞれ配列番号１０３及び１１４に記載されるような重鎖及び軽鎖を含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、配列番号１０４及び１１５に記載されるような核酸配列によってコード化される。

一態様では、本方法は、対象に抗ＶＥＧＦアンタゴニストを投与することを更に含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ラニビズマブである。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ベバシズマブである。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、アフリベルセプトである。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ブロルシズマブである。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ペガプタニブである。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、配列番号１０３及び１１４に記載されるような重鎖及び軽鎖を含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、配列番号１０４及び１１５に記載されるような核酸配列によってコード化される。

本開示は、全体を通して記載されるような、抗体又はその抗原結合断片若しくは医薬組成物を含むキットを提供する。

一態様では、キットは、使用説明書を更に含む。

一態様では、キットは、注射器を更に含む。

本開示は、１）抗ＢＴＣ結合部分と、２）抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子を提供する。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＢＴＣに結合する。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、Ｇ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、Ｖ５６、Ａ５７、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６からなる群から選択される配列番号１５７の少なくとも１つの残基に結合する。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、配列番号１５７のＲ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、及びＲ７３に結合する。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、配列番号１５７のＰ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６に結合する。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、配列番号１５７のＧ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、及びＶ５６に結合する。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、配列番号１５７のＳ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ａ５７、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、及びＥ７５に結合する。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、全体を通して記載されるような、抗体又はその抗原結合断片である。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片である。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分及び抗ＶＥＧＦ結合部分は、単離された抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなるリストから選択される形式である。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、抗ＢＴＣ Ｆａｂであり、抗ＶＥＧＦ結合部分は、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂである。

一態様では、抗ＢＴＣ Ｆａｂは、重鎖（ＨＡ）及び軽鎖（ＬＡ）を含み、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂは、重鎖（ＨＢ）及び軽鎖（ＬＢ）を含む。

一態様では、ＨＡとＨＢとは、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＨＡ－リンカー１－ＨＢ－Ｃの形式で連結され、ＬＡとＬＢとは、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＬＡ－リンカー２－ＬＢ－Ｃの形式で連結される。

一態様では、ＨＡとＨＢとは、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＨＢ－リンカー１－ＨＡ－Ｃの形式で連結され、ＬＡとＬＢとは、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＬＢ－リンカー２－ＬＡ－Ｃの形式で連結される。

一態様では、リンカー１及びリンカー２は、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。

一態様では、リンカー１及びリンカー２は、配列番号１１９の核酸配列によってコード化される。

一態様では、リンカー１及びリンカー２は、配列番号１６１～１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号１、２、３、１４、１５、及び１６；それぞれ配列番号４、２、３、１４、１５、及び１６；それぞれ配列番号５、６、３、１７、１８、及び１９；又はそれぞれ配列番号７、８、９、２０、１８、及び１６に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号１０及び２１のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１１６及び１２２の核酸配列によってコード化される。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号２５、２６、２７、３８、３９、及び４０；それぞれ配列番号２８、２６、２７、３８、３９、及び４０；それぞれ配列番号２９、３０、２７、４１、４２、及び４３；又はそれぞれ配列番号３１、３２、３３、４４、４２、及び４０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号３４及び４５のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１２７及び１３２の核酸配列によってコード化される。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号２５、４９、５０、５８、５９、及び６０；それぞれ配列番号２８、４９、５０、５８、５９、及び６０；それぞれ配列番号２９、５１、５０、６１、６２、及び６３；又はそれぞれ配列番号３１、５２、５３、６４、６２、及び６０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号５４及び６５のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１３７及び１４２の核酸配列によってコード化される。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号６９、７０、７１、８２、８３、及び８４；それぞれ配列番号７２、７０、７１、８２、８３、及び８４；それぞれ配列番号７３、７４、７１、８５、１８、及び８６；又はそれぞれ配列番号７５、７６、７７、８７、１８、及び８４に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号７８及び８８のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１４７及び１５１の核酸配列によってコード化される。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号９２、９３、及び９４に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７に記述されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号９５、９３、及び９４に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７に記述されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号９６、９７、及び９４に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号１０８、１０９、及び１１０に記述されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号９８、９９、及び１００に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号１１１、１０９、及び１０７に記述されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１０１及び１１２に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、アミノ酸配列における違いは、保存的置換である。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１０１及び１１２に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１０２及び１１３に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１１７及び１２３に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１２８及び１３３に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１３８及び１４３に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１４８及び１５２に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１０３及び１１４に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む。

一態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号１０４及び１１５に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコード化される。

本開示では、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子が提供され、抗ＢＴＣ結合部分は、ＢＴＣに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＡ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＡ）を含み、抗ＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＢ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＢ）を含み、ここで：
ａ． ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号１０及び２１に記載されるようなアミノ酸配列を含み；
ｂ． ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１０１及び１１２に記載されるようなアミノ酸配列を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ａ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＡ）を更に含み、抗ＶＥＧＦ結合部分は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ｂ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＢ）を更に含む。

一態様では、多重特異性結合分子は、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＡ－ＣＨ１Ａ－リンカー－ＶＨＢ－ＣＨ１Ｂ－Ｃ及びＮ－ＶＬＡ－ＣＫＡ－リンカー－ＶＬＢ－ＣＫＢ－Ｃのような形式である。

一態様では、多重特異性結合分子は、ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖を含み、この重鎖は、配列番号１２０に記載される通りである。

一態様では、重鎖は、配列番号１２１に記載されるような核酸配列によってコード化される。

一態様では、多重特異性結合分子は、ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖を含み、この軽鎖は、配列番号１２５に記載される通りである。

一態様では、軽鎖は、配列番号１２６に記載されるような核酸配列によってコード化される。

また、本開示では、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子が提供され、抗ＢＴＣ結合部分は、ＢＴＣに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＡ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＡ）を含み、抗ＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＢ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＢ）を含み、ここで：
ａ． ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号３４及び４５に記載されるようなアミノ酸配列を含み；
ｂ． ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１０１及び１１２に記載されるようなアミノ酸配列を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ａ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＡ）を更に含み、抗ＶＥＧＦ結合部分は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ｂ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＢ）を更に含む。

一態様では、多重特異性結合分子は、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＡ－ＣＨ１Ａ－リンカー－ＶＨＢ－ＣＨ１Ｂ－Ｃ及びＮ－ＶＬＡ－ＣＫＡ－リンカー－ＶＬＢ－ＣＫＢ－Ｃのような形式である。

一態様では、多重特異性結合分子は、ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖を含み、この重鎖は、配列番号１３０に記載される通りである。

一態様では、重鎖は、配列番号１３１に記載されるような核酸配列によってコード化される。

一態様では、多重特異性結合分子は、ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖を含み、この軽鎖は、配列番号１３５に記載される通りである。

一態様では、軽鎖は、配列番号１３６に記載されるような核酸配列によってコード化される。

本開示はまた、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子を提供し、抗ＢＴＣ結合部分は、ＢＴＣに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＡ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＡ）を含み、抗ＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＢ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＢ）を含み、ここで：
ａ． ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号５４及び６５に記載されるようなアミノ酸配列を含み；
ｂ． ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１０１及び１１２に記載されるようなアミノ酸配列を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ａ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＡ）を更に含み、抗ＶＥＧＦ結合部分は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ｂ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＢ）を更に含む。

一態様では、多重特異性結合分子は、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＡ－ＣＨ１Ａ－リンカー－ＶＨＢ－ＣＨ１Ｂ－Ｃ及びＮ－ＶＬＡ－ＣＫＡ－リンカー－ＶＬＢ－ＣＫＢ－Ｃのような形式である。

一態様では、多重特異性結合分子は、ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖を含み、この重鎖は、配列番号１４０に記載される通りである。

一態様では、重鎖は、配列番号１４１に記載されるような核酸配列によってコード化される。

一態様では、多重特異性結合分子は、ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖を含み、この軽鎖は、配列番号１４５に記載される通りである。

一態様では、軽鎖は、配列番号１４６に記載されるような核酸配列によってコード化される。

更に、本開示では、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子が提供され、抗ＢＴＣ結合部分は、ＢＴＣに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＡ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＡ）を含み、抗ＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＢ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＢ）を含み、ここで：
ａ． ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号７８及び８８に記載されるようなアミノ酸配列を含み；
ｂ． ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１０１及び１１２に記載されるようなアミノ酸配列を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ａ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＡ）を更に含み、抗ＶＥＧＦ結合部分は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ｂ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＢ）を更に含む。

一態様では、多重特異性結合分子は、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＡ－ＣＨ１Ａ－リンカー－ＶＨＢ－ＣＨ１Ｂ－Ｃ及びＮ－ＶＬＡ－ＣＫＡ－リンカー－ＶＬＢ－ＣＫＢ－Ｃのような形式である。

一態様では、多重特異性結合分子は、ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖を含み、この重鎖は、配列番号１４９に記載される通りである。

一態様では、重鎖は、配列番号１５０に記載されるような核酸配列によってコード化される。

一態様では、多重特異性結合分子は、ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖を含み、この軽鎖は、配列番号１５４に記載される通りである。

一態様では、軽鎖は、配列番号１５５に記載されるような核酸配列によってコード化される。

本開示は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性結合分子を提供し、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。

一態様では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２１の核酸配列によってコード化され、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１２６の核酸配列によってコード化される。

本開示はまた、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性結合分子を提供し、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む。

一態様では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１３１の核酸配列によってコード化され、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３６の核酸配列によってコード化される。

本開示は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性結合分子を更に提供し、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１４０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む。

一態様では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１４１の核酸配列によってコード化され、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１４６の核酸配列によってコード化される。

本開示はまた、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性結合分子を提供し、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１４９のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む。

一態様では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１５０の核酸配列によってコード化され、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１５５の核酸配列によってコード化される。

本開示は、全体を通して記載されるような、多重特異性結合分子をコード化するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

本開示はまた、全体を通して記載されるような、ポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供する。

また、本開示では、全体を通して記載されるような、発現カセットを含むベクターが提供される。

更に、本開示では、全体を通して記載されるような、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。

本開示は、宿主細胞を、多重特異性結合分子又はその断片の発現に好適な条件下で培養することを含む、多重特異性結合分子を産生する方法を提供する。

一態様では、本方法は、多重特異性結合分子を精製することを更に含む。

本開示は、有効量の、全体を通して記載されるような、多重特異性結合分子を含む医薬組成物を提供する。

一態様では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体を更に含む。

一態様では、医薬組成物は、１つ以上の治療薬を更に含む。

また、本開示では、対象に、有効量の、全体を通して記載されるような、多重特異性結合分子又は医薬組成物を投与することを含む、治療を必要とする対象において眼科障害を治療する方法が提供される。

一態様では、多重特異性結合分子又は医薬組成物は、対象に硝子体内投与される。

一態様では、多重特異性結合分子又は医薬組成物は、網膜下注射を介して投与される。

一態様では、眼科障害は、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、新生血管を伴う加齢黄斑変性、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、及び母斑症に関連する異常血管増殖からなる群から選択される。

一態様では、眼科障害は、糖尿病性黄斑浮腫である。

本開示では、対象に、有効量の、本開示に記載されるような多重特異性結合分子を投与することを含む、眼科障害を予防、治療、又は管理するための方法が提供され、多重特異性結合分子は、対象における網膜漏出及び／又は網膜肥厚を対照の対象に対して低減する。

更に本開示では、全体を通して記載されるような、多重特異性結合分子又は医薬組成物を含むキットが提供される。

一態様では、キットは、使用説明書を更に含む。

一態様では、キットは、注射器を更に含む。

本開示では、対象に、本明細書に記載される多重特異性結合分子を、約０．２５ｍｇ／眼～７．５ｍｇ／眼の範囲の用量で硝子体内投与することを含む、予防又は治療を必要とする対象において黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、新生血管ＡＭＤ、又はＲＶＯを予防又は治療する方法が提供される。

一態様では、用量は、約０．２５ｍｇ／眼、０．７５ｍｇ／眼、２．５ｍｇ／眼、又は７．５ｍｇ／眼である。

一態様では、用量は０．２５ｍｇ／眼である。

一態様では、用量は０．７５ｍｇ／眼である。

一態様では、用量は１ｍｇ／眼である。

一態様では、用量は２．５ｍｇ／眼である。

一態様では、用量は３ｍｇ／眼である。

一態様では、用量は５ｍｇ／眼である。

一態様では、用量は、７．５ｍｇ／眼である。

一態様では、用量は、０．２５ｍｇ／眼、０．３ｍｇ／眼、０．３５ｍｇ／眼、０．４ｍｇ／眼、０．４５ｍｇ／眼、０．５ｍｇ／眼、０．５５ｍｇ／眼、０．６ｍｇ／眼、０．６５ｍｇ／眼、０．７ｍｇ／眼、０．７５ｍｇ／眼、０．８ｍｇ／眼、０．８５ｍｇ／眼、０．９ｍｇ／眼、０．９５ｍｇ／眼、１．０ｍｇ／眼、１．１ｍｇ／眼、１．２ｍｇ／眼、１．３ｍｇ／眼、１．４ｍｇ／眼、１．５ｍｇ／眼、１．６ｍｇ／眼、１．７ｍｇ／眼、１．８ｍｇ／眼、１．９ｍｇ／眼、２．０ｍｇ／眼、２．１ｍｇ／眼、２．２ｍｇ／眼、２．３ｍｇ／眼、２．４ｍｇ／眼、２．５ｍｇ／眼、２．６ｍｇ／眼、２．７ｍｇ／眼、２．８ｍｇ／眼、２．９ｍｇ／眼、３．０ｍｇ／眼、３．１ｍｇ／眼、３．２ｍｇ／眼、３．３ｍｇ／眼、３．４ｍｇ／眼、３．５ｍｇ／眼、３．６ｍｇ／眼、３．７ｍｇ／眼、３．８ｍｇ／眼、３．９ｍｇ／眼、４．０ｍｇ／眼、４．１ｍｇ／眼、４．２ｍｇ／眼、４．３ｍｇ／眼、４．４ｍｇ／眼、４．５ｍｇ／眼、４．６ｍｇ／眼、４．７ｍｇ／眼、４．８ｍｇ／眼、４．９ｍｇ／眼、５．０ｍｇ／眼、５．１ｍｇ／眼、５．２ｍｇ／眼、５．３ｍｇ／眼、５．４ｍｇ／眼、５．５ｍｇ／眼、５．６ｍｇ／眼、５．７ｍｇ／眼、５．８ｍｇ／眼、５．９ｍｇ／眼、６．０ｍｇ／眼、６．１ｍｇ／眼、６．２ｍｇ／眼、６．３ｍｇ／眼、６．４ｍｇ／眼、６．５ｍｇ／眼、６．６ｍｇ／眼、６．７ｍｇ／眼、６．８ｍｇ／眼、６．９ｍｇ／眼、７．０ｍｇ／眼、７．１ｍｇ／眼、７．２ｍｇ／眼、７．３ｍｇ／眼、７．４ｍｇ／眼、又は７．５ｍｇ／眼である。

一態様では、多重特異性結合分子は、１）それぞれ配列番号１０及び２１のアミノ酸配列を含む抗ＢＴＣ結合部分と、２）それぞれ配列番号１０１及び１１２のアミノ酸を含む抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む。

別の態様では、投与は、１ヶ月に１回である。

一般に、本開示は、一部には、ベータセルリン（ＢＴＣ）に特異的な抗体の発見に基づいている。特に、本発明者らは、治療的有用性に適合する特性を有する抗ＢＴＣ抗体を発見した（すなわち、抗体が所望の治療効果を達成するのに十分な親和性及び特異性でＢＴＣに結合する）。この発見に一部は基づいて、本開示は、別の治療用部分、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体断片に結合したＢＴＣに特異的な抗体、又は抗体断片を含む分子を含む治療用組成物を特徴とする。そのような治療用部分は、抗体、又はその断片、及びＢＴＣを有する組織（例えば、硝子体）における治療標的に結合するタンパク質、並びにそのような組織における治療標的を調節する化合物（例えば、低分子量化合物）を含む。そのような治療用部分が抗体を含む場合、全体的な治療用組成物は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）であり得る。特定の態様では、本明細書ではまた、抗ＢＴＣアンタゴニスト及び抗ＶＥＧＦアンタゴニストを投与することによって眼障害（例えば、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲなど）を治療する方法が提供される。

ｉ．用語
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、全ての特許、公開された特許出願及び非特許刊行物を含む、本明細書中に引用されたいかなる参照文献もその全体が参照により援用される。本開示の理解を容易にするために、本明細書で使用されるいくつかの用語及び略語は、次のように以下で定義される：

本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」とは、内容がそうでないことを明らかに指示しない限りにおいて、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ」への言及は、２つ以上のそのような抗体の混合物を含む。

特に明記しない限り又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、数値に関する「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内であること、例えば、平均値の２つの標準偏差内にあることと理解される。したがって、「約」は、表示された値の＋／－１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％、好ましくは表示された値の＋／－１０％以内であり得る。数値範囲又は数値リストの前で用いられる場合、「約」という用語は、各数値に順次適用され、例えば「約１～５」という語句は、「約１～約５」と解釈すべきであり、又は例えば「約１、２、３、４」という語句は、「約１、約２、約３、約４など」と解釈すべきである。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語が、配列（例えば、アミノ酸配列）に関して使用される全ての場合において、当該配列がまた、「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」、「なっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」などの用語によっても限定され得ることが理解されたい。本明細書で使用される場合、「～から本質的になる」という語句は、方法又は組成物に含まれる活性医薬品の属又は種、並びに方法又は組成物の意図された目的のために不活性な賦形剤の属又は種を指す。いくつかの態様では、「～から本質的になる」という語句は、本開示の多重特異性結合分子以外の１つ以上の追加の活性薬剤を含めることを明示的に除外する。いくつかの態様では、「～から本質的になる」という語句は、本開示の多重特異性結合分子及び第２の同時投与薬剤以外の１つ以上の追加の活性薬剤を含めることを明示的に除外する。

「ベータセルリン」又は「ＢＴＣ」という用語は、生物におけるＥＧＦファミリーの増殖因子を指す。ＢＴＣ活性は、その１）ＥｒｂＢ１；２）ＥｒｂＢ４；３）ＥｒｂＢホモ二量体（例えば、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ１ ａｎｄ ＥｒｂＢ４／ＥｒＢ４）並びに／又は４）ＥｒｂＢヘテロ二量体（例えば、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ２、ＥｒＢ１／ＥｒＢ３、ＥｒＢ１／ＥｒＢ４、ＥｒＢ２／ＥｒＢ３、及びＥｒＢ２／ＥｒＢ４）への結合によって測定することができる。Ｄｕｎｂａｒ ａｎｄ Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０００，３２：８０５－８１５を参照されたい。ＢＴＣ活性はまた、リン酸化ＥＲＫ１／２のレベルによって測定することができる。ヒトでは、これは遺伝子座４ｑ１３－ｑ２１において第４染色体上に位置するＢＴＣ遺伝子によってコード化される。ヒトＢＴＣは、ｐｒｏ－ＢＴＣとして１７８残基のタンパク質として発現される（例えば、ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００１７２０．１又は配列番号１５６）。成熟、分泌ヒトＢＴＣは、配列番号１５８に記載されるような８０アミノ酸残基、すなわち、ｐｒｏ－ＢＴＣの残基３２～１１１から構成される。マウスベータセルリンは、１７７アミノ酸残基から構成される（例えば、ＮＣＢＩ：ＮＰ＿０３１５９４．１）。ラットベータセルリンは、１７７アミノ酸残基から構成される（例えば、ＮＣＢＩ：ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ９６７３１．１）。

「血管内皮増殖因子」又は「ＶＥＧＦ」という用語は、生物においてＶＥＧＦ活性を有する、例えば、血管内皮細胞の増殖及び移動を誘導するタンパク質を指し、生理学的及び病理学的血管新生の両方に必須であり得る。哺乳動物では、ＶＥＧＦファミリーは、５つのメンバー：ＶＥＧＦ－Ａ、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、及びＶＥＧＦ－Ｄを含む。ヒトＶＥＧＦは、単一遺伝子のｍＲＮＡの選択的スプライシングから生じた、少なくとも６つのアイソフォーム（ＶＥＧＦ_１２１、ＶＥＧＦ_１４５、ＶＥＧＦ_１６５、ＶＥＧＦ_１８３、ＶＥＧＦ_１８９、及びＶＥＧＦ_２０６）として存在する（Ｆｅｒｒａｒａ Ｎ，Ｄａｖｉｓ Ｓｍｙｔｈ Ｔ．Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ １８：１－２２（１９９７））。最も豊富にあるアイソフォームのＶＥＧＦ_１６５は、約４５，０００ダルトンの分子質量を有する塩基性のヘパリン結合性二量体糖タンパク質である。本明細書で使用される「ヒトＶＥＧＦ」という用語は、１６５アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子、及び関連する１２１アミノ酸、１８９アミノ酸、並びに２０６アミノ酸、（及び他のアイソフォーム）アミノ酸血管内皮細胞増殖因子（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１３０６（１９８９），及びＨｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．５：１８０６（１９９１）に記載されるような）と共に天然に生じる対立遺伝子及びそれらの増殖因子の処理形態を指す。

「抗ＢＴＣ結合部分」という用語は、本明細書で使用される場合、ＢＴＣに特異的に結合するポリペプチド（例えば、抗体、又はその抗原結合断片）を意味する。いかなる誤解も避けるために、「抗ＢＴＣ結合部分」の非限定的な例としては、完全長抗体及びその抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、単一ドメイン抗体などが挙げられる。特定の態様では、抗ＢＴＣ抗体は、Ｆａｂ又はｓｃＦｖである。特定の態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、ヒトＢＴＣ及び／又はカニクイザルＢＴＣに特異的に結合する。

「抗ＶＥＧＦ結合部分」という用語は、本明細書で使用される場合、（以下に定義されるように）ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチド（例えば、以下に記載されるような抗体、又はその抗原結合断片）を意味する。いかなる誤解も避けるために、「抗ＶＥＧＦ結合部分」の非限定的な例としては、完全長抗体及びその抗原結合断片、例えば、以下に記載されるような、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、単一ドメイン抗体などが挙げられる。特定の態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｆａｂ又はｓｃＦｖである。特定の態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、ヒトＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合する。

「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」、又は「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｉｎｄｓ）」という語句は、抗原（例えば、タンパク質）と本開示の多重特異性結合分子との間の相互作用を説明することに関して使用される場合、タンパク質及び他の生物製剤の異種集団中の、例えば、生体サンプル、例えば、血液、血清、血漿又は組織サンプル中の抗原の存在の決定する結合反応を指す。したがって、ある特定の指定の免疫アッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する本開示の多重特異性結合分子は、特定の抗原に対して、バックグラウンドの少なくとも２倍結合し、サンプル中に存在する他の抗原に対して実質的に顕著な量では結合しない。一態様では、指定の免疫アッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する本開示の多重特異性結合分子は、特定の抗原に対して、バックグラウンドの少なくとも１０倍結合し、サンプル中に存在する他の抗原に対して実質的に顕著な量では結合しない。そのような条件下での抗体又は結合薬剤への特異的結合は、本開示の多重特異性結合分子が、特定のタンパク質に対するその特異性について選択されていることを必要とし得る。希望通り又は必要に応じて、この選択は、他の種（例えば、マウス若しくはラット）又は他のサブタイプからの分子と交差反応する多重特異性結合分子を差し引くことによって達成することができる。

いくつかの態様では、本開示の多重特異性結合分子の特異的結合は、少なくとも１０^２Ｍ^－１、少なくとも５×１０^２Ｍ^－１、少なくとも１０^３Ｍ^－１、少なくとも５×１０^３Ｍ^－１、少なくとも１０^４Ｍ^－１、少なくとも５×１０^４Ｍ^－１、少なくとも１０^５Ｍ^－１、少なくとも５×１０^５Ｍ^－１、少なくとも１０^６Ｍ^－１、少なくとも５×１０^６Ｍ^－１、少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも５×１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも５×１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１、少なくとも５×１０^９Ｍ^－１、少なくとも１０^１０Ｍ^－１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^－１、少なくとも１０^１１Ｍ^－１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^－１、少なくとも１０^１２Ｍ^－１、少なくとも５×１０^１２Ｍ^－１、少なくとも１０^１３Ｍ^－１、少なくとも５×１０^１３Ｍ^－１、少なくとも１０^１４Ｍ^－１、少なくとも５×１０^１４Ｍ^－１、少なくとも１０^１５Ｍ^－１、又は少なくとも５×１０^１５Ｍ^－１の平衡定数（Ｋ_Ａ）（ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）を伴う結合を意味する。

いくつかの態様では、本開示の多重特異性結合分子の特異的結合は、５×１０^－２Ｍ未満、１０^－２Ｍ未満、５×１０^－３Ｍ未満、１０^－３Ｍ未満、５×１０^－４Ｍ未満、１０^－４Ｍ未満、５×１０^－５Ｍ未満、１０^－５Ｍ未満、５×１０^－６Ｍ未満、１０^－６Ｍ未満、５×１０^－７Ｍ未満、１０^－７Ｍ未満、５×１０^－８Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、５×１０^－９Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満、５×１０^－１０Ｍ未満、１０^－１０Ｍ未満、５×１０^－１１Ｍ未満、１０^－１１Ｍ未満、５×１０^－１２Ｍ未満、１０^－１２Ｍ未満、５×１０^－１３Ｍ未満、１０^－１３Ｍ未満、５×１０^－１４Ｍ未満、１０^－１４Ｍ未満、５×１０^－１５Ｍ未満、又は１０^－１５Ｍ未満、又はそれ以下の解離速度定数（Ｋ_Ｄ）（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）を意味し、標的抗原に、非特異的抗原（例えば、ＨＳＡ）への結合のためのその親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で結合する。

「Ｋ_Ｄ」又は「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。

「治療標的結合部分」という用語は、本明細書で使用される場合、目的の治療標的に特異的に結合する分子を意味する。この分子は、抗体又はその抗原結合断片（以下に記載されるような）、抗原特異的結合部分、例えば、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）、アフィボディ、アドネクチン、アフィリン、アンチカリン、アビマー、センチリン、又はアプタマーのようなＲＮＡ分子であり得る。この治療標的結合部分はまた、目的の治療標的に特異的に結合する受容体又は受容体の一部などのポリペプチドであり得る。いかなる誤解も避けるために、「抗ＢＴＣ結合部分」の非限定的な例としては、完全長抗体及びその抗原結合断片、例えば、以下に記載されるような、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、単一ドメイン抗体などが挙げられる。

用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、全抗体又はその抗原結合フラグメントを指す。全抗体は、ジスルフィド結合により相互接続される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略記する）及び重鎖定常領域で構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、ＣＬの１つのドメインで構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存的な領域が挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに細分することができる。各ＶＨ及び各ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて、以下の順序に配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織又は免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介し得る。「抗体」という用語としては、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科抗体、キメラ抗体、二重特異性若しくは多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１及びＩｇＡ_２）のものであり得る。

「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４）を指す。アイソタイプはまた、これらのクラスのうちの１つの改変バージョンも含み、その改変は、Ｆｃ機能を変える、例えば、エフェクター機能又はＦｃ受容体への結合を増強又は低減するように施されている。抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、及び免疫グロブリンＹ（ＩｇＹ））、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスの抗体であり得る。本明細書で使用される場合における、且つ、そうでないことが指定されない限りにおける「ＩｇＧ」又は「ＩｇＧ抗体」という用語は、Ｇ型全抗体又はＩｇを意味する。

「軽鎖」という用語は、完全長軽鎖及び結合特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長軽鎖は、可変領域ドメイン、Ｖ_Ｌと、定常領域ドメイン、Ｃ_Ｌとを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖は、カッパ鎖及びラムダ鎖を含む。

「重鎖」という用語は、完全長重鎖及び結合特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長重鎖は、可変領域ドメイン、Ｖ_Ｈと、３つの定常領域ドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３とを含む。Ｖ_Ｈドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、Ｃ_Ｈドメインはカルボキシル末端にあり、Ｃ_Ｈ３がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ及びＩｇＥを含む任意のアイソタイプのものであり得る。

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、典型的には、重鎖のアミノ末端のおよそ１２０～１３０のアミノ酸、及び軽鎖のアミノ末端の約１００～１１０のアミノ酸を含む、抗体の軽鎖及び／又は重鎖の一部分を指す。ある特定の態様では、異なる抗体の可変領域は、同じ種の抗体の間でもアミノ酸配列が大きく異なる。抗体の可変領域は、典型的は、その標的に対する特定の抗体の特異性を決定する。

「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原特異性及び結合親和性を付与する抗体可変領域内にあるアミノ酸配列を指す。一般的には、各重鎖可変領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）において３つのＣＤＲ並びに各軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）において３つのＣＤＲがある。所与のＣＤＲの厳密なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）；及びＬｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５－７７（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）により記載されている、周知の多数のスキームのうちのいずれかを使用して、決定することができる。Ｋａｂａｔ定義は、抗体中の残基を番号付けするための基準であり、典型的には、ＣＤＲ領域を特定するために使用される。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｗｕ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２１４－８（２０００）を参照されたい。Ｃｈｏｔｉａ定義は、Ｋａｂａｔ定義と同様であるが、Ｃｈｏｔｉａ定義はある特定の構造ループ領域を考慮に入れる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－１７（１９８６）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８３（１９８９）を参照されたい。

ＣＤＲ領域を描写するための他の方法を代替的に使用することができ、例えば、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることができる（「組み合わせ」システム）。例えば、古典的な形式のために、Ｋａｂａｔの下では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）におけるＣＤＲアミノ酸残基は、３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ；且つ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）におけるＣＤＲアミノ酸残基は、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。Ｃｈｏｔｈｉａに基づき、ＶＨのＣＤＲアミノ酸は、２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ；及びＶＬのアミノ酸残基は、２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、組み合わせＣＤＲは、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）並びにヒトＶＬのアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）からなる。別の例として、ＩＭＧＴによれば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）内のＣＤＲアミノ酸残基は、２６～３３（ＨＣＤＲ１）、５１～５８（ＨＣＤＲ２）、及び９７～１０８（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）内のＣＤＲアミノ酸残基は、２７～３６（ＬＣＤＲ１）、５４～５６（ＬＣＤＲ２）、及び９３～１０１（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。

「抗体フレームワーク」又は「ＦＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、可変ドメイン、ＶＬ又はＶＨのいずれかの部分を指し、この可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のためのスキャフォールドとして機能する。本質的に、それはＣＤＲを有しない可変ドメインである。ＩＭＧＴの下では、抗体のＣＤＲ領域を、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎを用いて決定することができる。

抗体の「抗原結合断片」という用語は、本明細書で使用される場合、所与の抗原（例えば、ＢＴＣ及びＶＥＧＦ）に特異的に結合するための能力を保持する抗体の１つ以上の断片、又はそのような断片を含む１つ以上のポリペプチドを指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体の断片により実行され得る。抗体の抗原結合断片という用語内に包含される結合断片の例としては、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片；Ｆ（ａｂ）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；ＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；リンカー配列により結合されたＶＬ及びＶＨドメインからなる一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；並びにＶＨドメイン又はＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合断片は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ及びビスｓｃＦｖにも取込み可能である（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，９，１１２６－１１３６を参照されたい）。抗体の抗原結合部分は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づくスキャフォールド内にグラフト可能である（フィブロネクチンポリペプチドモノボディが記載されている米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。抗体結合断片は、相補的な軽鎖ポリペプチド（例えば、Ｖ_Ｌ－ＶＣ－Ｖ_Ｌ－ＶＣ）と併せて抗原結合領域の対を形成する、タンデムＦｖセグメント（例えば、Ｖ_Ｈ－ＣＨ１－Ｖ_Ｈ－ＣＨ１）の対を含む単鎖分子へと組み込むことができる（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７－１０６２；及び米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。

本明細書で使用される「Ｆａｂ」断片は、重鎖及び軽鎖の各々の１つの定常ドメインと１つの可変ドメインとを含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。

本明細書で使用される「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣ_Ｈ１ドメイン並びにまたＣ_Ｈ１とＣ_Ｈ２ドメインとの間の領域を含有する１つの重鎖の一部分とを含み、それにより２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、Ｆ（ａｂ’）_２分子を形成することができる。

本明細書で使用される「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、２つの軽鎖と、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間の定常領域の一部分を含有する２つの重鎖とを含有し、これにより２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によって互いに保持されている２つのＦａｂ’断片から構成される。

「Ｆｖ領域」は、重鎖及び軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。

本明細書で使用される「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含む抗体断片を指し、これらのドメインは、一本のポリペプチド鎖で存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間の内部ポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦＶはまた、安定性を増強する操作された内部ジスルフィド架橋を有することができる。ｓｃＦｖの考察については、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（１９９４）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５を参照されたい。好ましい態様では、本開示の多重特異性結合分子で使用されるｓｃＦｖは、一般構造：ＮＨ_２－Ｖ_Ｌ－リンカー－Ｖ_Ｈ－ＣＯＯＨ又はＮＨ_２－Ｖ_Ｈ－リンカー－Ｖ_Ｌ－ＣＯＯＨを有する。

本明細書で使用される「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲにおいて１つ以上の変更を有する抗体であり、これはそれらの変更を有さない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性における改善をもたらす。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又は更にはピコモルの親和性を有するであろう。親和性成熟抗体は、当該技術分野において既知の手法によって製造することができる。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム変異導入法は：Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１：３８０９－３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １６９：１４７－１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４－２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０－９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９－８９６（１９９２）によって記載されている。

本明細書で使用される「親（ｐａｒｅｎｔ）」又は「親（ｐａｒｅｎｔａｌ）」抗体は、親和性成熟抗体又はそのバリアントの調製に使用されるアミノ酸配列によってコード化される抗体である。好ましくは、親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、存在する場合、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体であってもよい。

本明細書で使用される「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、その断片は、同じポリペプチド鎖中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ－ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間を対合させるには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合することを余儀なくされ、２つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８により完全に記載されている。

本明細書で使用される「単一特異性結合分子」又は「単一特異性抗体」という用語は、標的抗原上の１つのエピトープに結合する分子を指す。一態様では、本開示の単一特異性結合分子又は単一特異性抗体は、ＢＴＣに結合する。別の態様では、本開示の単一特異性結合分子又は単一特異性抗体は、ＶＥＧＦに結合する。

本明細書で使用される「多重特異性結合分子」又は「多重特異性抗体」という用語は、２つ以上の異なる抗原に結合する分子を指す。各抗原の認識は、一般的に、「抗原結合ドメイン」（例えば、「ＢＴＣ抗原結合ドメイン」、「ＶＥＧＦ抗原結合ドメイン」）を介して達成される。「多重特異性」という用語は、２つの異なる抗原に結合する「二重特異性」、すなわち、分子を含む。いくつかの態様では、多重特異性結合分子は、各々が１つの抗原結合ドメインを含む１つ以上のポリペプチド鎖を含有する。一態様では、多重特異性結合分子は、ＶＨ又はＶＬを含有する。いくつかの態様では、多重特異性結合分子は、各々が２つ以上（例えば、２つ）の抗原結合ドメインを含む１つ以上のポリペプチド鎖を含有する。いくつかの態様では、多重特異性結合分子は、一緒に、複数の、例えば、２つ以上の、例えば、２つ、３つ、又は４つの抗原結合ドメインを含む２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のポリペプチド鎖を含む。

「二重特異性結合分子」又は「二重特異性抗体」という用語は、単一分子内で２つの抗体の抗原結合部位を組み合わせる分子を指す。一態様では、二重特異性結合分子又は二重特異性抗体は、単一のポリペプチドを含有する。別の態様では、二重特異性結合分子又は二重特異性抗体は、ジスルフィド架橋又は任意の他の共有結合を介して連結された２つのポリペプチドを含有する。したがって、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原に同時に又は順次に結合することができる。二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野において周知である。２つの抗体を組み合わせるための様々な形式も、当該技術分野において既知である。本開示の二重特異性抗体の形態としては、当業者に既知であるように、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、二量体化Ｆａｂ（Ｆａｂ－Ｆａｂ）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、及びタンデム抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「二価分子」という用語は、２つの抗原結合ドメインを有する分子を指す。本明細書で使用される「三価分子」という用語は、３つの抗原結合ドメインを有する分子を指す。いくつかの態様では、本開示の三価分子は、三価抗体様分子である。いくつかの態様では、三価分子は、同じ抗原の同じエピトープに結合することができる２つの抗原結合ドメイン、及び異なる抗原に結合する第３の抗原結合ドメインからなることができる。そのような態様は、三価の二重特異性分子と考えられる。

「多価分子」という用語は、少なくとも２つの抗原結合部位を有する分子を指し、これらの抗原結合分子は、同じ抗原又は異なる抗原に対して特異性を有し得る。いくつかの態様では、本開示の多価分子は、多価抗体様分子である。いくつかの態様では、本開示の多価分子は、多価抗体である。いくつかの態様では、多価分子は、二価分子、三価分子、又は四価分子である。三量体化ドメインは、例えば、欧州特許第１０１２２８０Ｂ１号明細書に記載されている。五量体化モジュールは、ＰＣＴ／欧州特許第９７／０５８９７号明細書に記載されている。

本明細書で使用される「実質的に類似した」、又は「実質的に同一な」という用語は、２つの数値（一般的に、一方は本開示の抗体様分子に関連するものであり、他方は参照／コンパレータ抗体若しくは抗体様分子に関連するものである）の間の十分に高い類似度であり、それによって当業者が２つの値の間の差が、当該値（例えば、ＴＭ値又はアセンブルされた抗体の量）によって測定される生物学的特性の関連の中で、生物学的及び／又は統計的差がほとんど又は全くないと考える高い類似度を指す。当該２つの値の間の差は、参照／コンパレータ抗体についての値の関数として、好ましくは約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。

「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその免疫学的機能性断片を含む）などの選択的結合剤により結合することができる分子又は分子の一部分を指す。いくつかの態様では、抗原は、動物においてその抗原に結合することができる抗体を産生するために使用することができる。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、例えば、抗体と相互作用することができる１つ以上のエピトープを保有し得る。

本明細書で使用される「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、抗体又は抗体様分子に対して、高い親和性で結合することができる任意の決定基を指す。エピトープは、その抗原を特異的に標的とする抗体（又は抗体様分子）によって結合される抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗体又は抗体様分子と直接接触する特異的アミノ酸を含む。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、場合によっては、核酸などの他の種類の分子上に存在することができる。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基群を含むことができ、特定の三次元構造特性、及び／又は特定の荷電特性を有し得る。

一般に、特定の標的抗原に特異的である多重特異性結合分子は、タンパク質及び／又は高分子の複合体混合物中のその標的抗原上のエピトープを優先的に認識するであろう。

エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当該技術分野において既知のいくつものエピトープマッピング技術を使用して特定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．，１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照されたい。例えば、線状エピトープは、例えば、多数のペプチドを固体支持体上で同時に合成し（このペプチドは、タンパク質分子の一部に相当する）、及びペプチドが、依然として支持体に取り付けられながら、ペプチドを抗体と反応させることによって決定することができる。そのような技術は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号明細書；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：３９９８－４００２；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：７８－１８２；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９－７１５に記載されている。同様に、立体構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶構造解析及び二次元核磁気共鳴によるなどアミノ酸の空間立体構造を決定することによって容易に特定される。例えば、上記のエピトープマッピングプロトコルを参照されたい。タンパク質の抗原領域はまた、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されるものなど標準的な抗原性及び疎水性プロットを使用して特定することができる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルの決定のために、Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法、Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：３８２４－３８２８、及び疎水性プロットのために、Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術、Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．、（１９８２）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２を用いる。

「競合する」という用語は、同じエピトープに対して競合する抗原結合タンパク質に関して使用される場合、テストされる抗原結合タンパク質（例えば、抗体若しくはその免疫学的機能性断片）が共通抗原（例えば、ＢＴＣ若しくはその断片）への参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンド、若しくは参照抗体）の特異的結合を防止又は阻害する（例えば、低減する）アッセイによって決定されるような抗原結合タンパク質間の競合を意味する。多数のタイプの競合結合アッセイを用いて、１つの抗原結合タンパク質が他のものと競合するかどうかを決定することができ、例えば：固相直接若しくは間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接若しくは間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２－２５３を参照されたい）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４－３６１９を参照されたい）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）；Ｉ－１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７－１５を参照されたい）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６－５５２を参照されたい）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７－８２）がそうである。典型的には、そのようなアッセイは、固体表面に結合された精製抗原又はこれらのいずれかを有する細胞と、非標識試験抗原結合タンパク質と、標識参照抗原結合タンパク質と、の使用を伴う。競合阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合された標識の量を決定することにより測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は、過剰に存在する。競合アッセイによって特定される抗原結合タンパク質（競合する抗原結合タンパク質）は、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質と、立体障害が発生するために、参照抗原結合タンパク質によって結合されたエピトープに十分に近い隣接するエピトープに結合する抗原結合タンパク質とを含む。競合結合を決定するための方法に関する更なる詳細は、本明細書の実施例で提供されている。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、それは参照抗原結合タンパク質の共通抗原への特異的結合を、少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、又は７５％以上阻害（例えば、低減）するであろう。場合によっては、結合は、少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、９７％以上阻害される。

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では同じ意味で用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この語句はまた、１つ以上のアミノ酸残基が対応する、天然に存在するアミノ酸の人工化学的ミメティック（模倣物質）であるアミノ酸ポリマー、並びに、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーであるアミノ酸ポリマーに適用される。特に指示がない限り、特定のポリペプチド配列は、その保存的に改変されたバリアントも暗に包含する。

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド鎖」という用語は、全ての構成要素領域及びドメインをその中に有する、本開示の多重特異性結合分子の完全なアミノ酸鎖を指す。

「定常領域」又は「定常ドメイン」という用語は、抗体の抗原に対する結合に直接的に関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用などの様々なエフェクター機能を示す軽鎖及び重鎖のカルボキシ末端部分を指す。この用語は、抗原結合部位を含有する免疫グロブリンの他の部分、可変ドメインに対してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン並びに軽鎖のＣＬドメインを含有する。

「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸ミメティック（模倣物質）を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子暗号によってコード化されたもの、並びに、例えば、翻訳後改変のために、後に改変されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、ピログルタメート、Ｃ－末端リジン開裂、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、改変Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は改変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。アミノ酸ミメティック（模倣物質）は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学的化合物を指す。

ポリペプチド配列では、「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸による置換を結果としてもたらす、ポリペプチド配列への個別の置換、欠失、又は付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、よく知られている。このような保存的に改変されたバリアントは、本開示の多型バリアント、種間相同体、及び対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。以下の８つの群：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含有する（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい）。いくつかの態様では、「保存的配列改変」又は「保存的改変」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響しないか又はそれを変化させないアミノ酸改変を指すのに使用される。

ある特定の態様では、「用量」という用語は、対象に一度に全て（単位用量）、又は定義された時間間隔にわたって２回以上の投与で施される治療薬又は治療標的結合部分の量を指し、その治療薬は、タンパク質（例えば、抗体若しくは抗原結合断片）又は核酸であってもよく、治療標的結合部分は小分子（例えば、＜９００ダルトン）治療用化合物であってもよい。例えば、用量は、対象に３週間又は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上の過程にわたって対象に投与される（例えば、１回の投与によって、又は２回以上の投与によって）タンパク質（例えば、抗ＢＴＣ抗体若しくは分子にコンジュゲートしたその機能性断片、又は抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその機能性断片を含むタンパク質）の量を指すことができる。投与間の間隔は、任意の所望の期間であってもよく、「投与間隔」と称される。

用量に言及する場合の「薬学的に有効な」という用語は、所望の効果（例えば、改善された視力又は更なる視力の低下を予防すること）を提供するためのタンパク質（例えば、抗体若しくは抗原結合断片）又はその他の薬学的活性薬剤の十分な量を意味する。「有効な」量は、個体の年齢及び全身状態、特定の薬物又は薬学的活性薬剤などに応じて、対象間で異なるであろう。したがって、全ての患者に適用可能な正確な「有効な」量を指定することは、常に可能なわけではない。しかしながら、任意の個々の症例において、適切な「有効な」用量は、日常的な実験を使用して、当業者によって決定することができる。

「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト起源配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。更に、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域も、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列、若しくはヒト生殖系列配列の変異型又は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ，ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６，５７－８６，２０００）に記載されるような、ヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセスサスフレームワーク配列を含有する抗体に由来する。本開示のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的な変異誘発又はインビボでの体細胞変異により導入される変異或いは安定性又は製造を促進するための保存的置換）を含み得る。しかし、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフとされた抗体を含むことを意図していない。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、又は同じ遺伝源に由来する抗体及び抗原結合断片を含むポリペプチドを指す。この用語には、単一分子組成物の抗体分子の製剤も含まれる。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。ファージディスプレイ技術を使用してモノクローナル抗体を生成するための方法は、当該技術分野において既知である（Ｐｒｏｅｔｚｅｌ，Ｇ．，Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ，Ｈ．（Ｅｄｓ．）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ＩＳＢＮ ９７８－１－６１７７９－９３０－３；２０１２）。

非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、その中のレシピエントの超可変領域からの残基が所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域（ドナー抗体）からの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体中で見出すことができない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能を更に洗練するためになされ得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含み、その中で超可変ループの全て若しくは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的全てが、ヒト免疫グロブリンｌｏ配列に対応する。ヒト化抗体はまた任意選択的に免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリオンのものを含むであろう。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，ＣｕｒｒＯｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。また、レビュー論文及びその中で引用された参考文献も参照されたい：Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５－１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５－１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８－４３３（１９９４）。

本明細書で使用される場合、「同一性」は、２つのポリペプチド、分子間又は２つの核酸間の配列マッチングを指す。２つの比較される配列の両方の位置が、同じ塩基又はアミノ酸によって占有される場合（例えば、２つのポリペプチドの各々における位置が、リジンによって占有される場合）、それぞれの分子がその位置で同一である。２つの配列間の「同一性百分率」は、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮する、これらの配列によって共有される同一位置の数の関数である。一般に、２つの配列が整列される場合、最大の同一性を与えるために比較がなされる。そのようなアライメントは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの方法（Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３（１９７０））（Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、及び１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ重み付け及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重み付けを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているアルゴリズム）を使用して提供することができる。配列比較の場合、典型的には、１つの配列が参照配列としての役割を果たし、それが試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。初期設定のプログラムパラメーターを使用し得るか、又は代替的パラメーターを指定し得る。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。２つの配列を最適に配列決定した後で、配列を、同じ数の連続的な位置による参照配列と比較し得る、２０～６００、通例約５０～約２００、より通例では、約１００～約１５０からなる群から選択される連続的な位置の数のうちのいずれか１つによるセグメントに対して言及される場合、比較ウインドウを使用することができる。比較のために配列のアライメント法は当該技術分野において周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃによる局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０による相同性アライメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８による類似性検索法により、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は手作業のアライメント及び目視（例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｎｇｂｏｕ ｅｄ．，２００３）を参照されたい）により行うこともできる。配列同一性パーセント及び配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの２つの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９７７；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０に記載されている、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）より公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードで配列決定したときに、ある正の値の閾値スコアＴにマッチするか又はこれを満たす、クエリー配列内の短いワード長Ｗを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを伴う。Ｔを、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、前出）と称する。これらの初期の隣接ワードヒットが、これらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして働く。累積アライメントスコアが増大し得る限りにおいて、ワードヒットを、各配列に沿っていずれの方向にも拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリウォードスコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、達成されたその最大値から量Ｘだけ低下した場合；１つ以上の負スコア残基のアライメントの累積のために、累積スコアが、ゼロ以下に低下した場合；又は配列のいずれかの末端に達した場合は、各方向へのワードヒットの拡張を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ、及びＸにより、アライメントの感度及び速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムでは、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）、及び５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５，１９８９を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７，１９９３を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の適合性が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸の参照核酸に対する比較において、最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列と類似していると見なされる。２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、１２のギャップ長ペナルティー、及び４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれた、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１－１７，１９８８）を使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、及び１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ重み付け、及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重み付けを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネット上のｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能である）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３，１９７０）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。上記で言及した配列同一性百分率以外の、２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけによって異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一なことが典型的である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、２つの分子又はそれらの相補体が、厳密な条件下で、互いとハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることの更に別の指標は、同じプライマーを使用して２つの核酸配列を増幅し得ることである。

「相補性パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」又は「相補性パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」という用語は、２つのヌクレオチド配列に言及して、本明細書で使用される場合、同一性パーセントの概念と同様であるが、クエリ配列と対象となる配列が直線的に配置され、ループ、ステム又はヘアピンなどの二次折り畳み構造なしで最適に塩基対形成される場合に、対象となる配列のヌクレオチドに最適に塩基対形成又はハイブリダイズするクエリ配列のヌクレオチドの百分率を指す。そのようなパーセント相補性は、２つのＤＮＡ鎖の間、２つのＲＮＡ鎖の間、又はＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖との間のものであり得る。「パーセント相補性」は、（ｉ）２つのヌクレオチド配列を、比較のウインドウにわたって線状及び完全伸長配置で（すなわち、折り畳み又は二次構造なしに）最適に塩基対形成又はハイブリダイズし、（ｉｉ）比較のウインドウにわたって、２つの配列間で塩基対形成する位置の数を決定して相補的位置の数を得て、（ｉｉｉ）比較のウインドウにおいて、相補的位置の数を位置の総数で割って、及び（ｉｖ）この商に１００％を乗じて、２つの配列のパーセント相補性を得ることによって計算される。２つの配列の最適な塩基対形成は、Ｇ－Ｃ、Ａ－Ｔ、及びＡ－Ｕなどの水素結合を通してのヌクレオチド塩基の既知の対合に基づいて決定することができる。「パーセント相補性」が特定の比較ウインドウを指定することなく参照配列に関して計算される場合、パーセント同一性は、２つの線状配列間の相補的位置の数を、参照配列の全長で割ることによって決定される。したがって、本開示の目的のために、２つの配列（クエリ及び対象）が最適に塩基対形成される場合（ミスマッチ又は非塩基対形成ヌクレオチドは許容されるが、折り畳み又は二次構造なしに）、クエリ配列についての「パーセント相補性」は、２つの配列間の塩基対形成した位置の数をその長さにわたるクエリ配列中の位置の総数で割り（又は、比較ウインドウにわたるクエリ配列中の位置の数で割り）、次いで１００％を乗じたものに等しい。

「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体又は他のタンパク質を実質的に含まない抗体を指す。更に、単離された抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質、例えば、細胞上清から単離された抗体を実質的に含まない場合がある。

本明細書に記載の抗ＢＴＣ多重特性結合分子に関しての「連結された」又は「連結」という用語は、例えば、表１に列挙される抗ＢＴＣ抗体又はＢＴＣに結合するその機能性断片などの抗ＢＴＣ結合部分の分子への取り付けを指す。抗ＢＴＣ結合部分のタンパク質への取り付けは、例えば、分子、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその機能性断片のアミノ若しくはカルボキシ末端で起こり得る。抗ＢＴＣ結合部分はまた、タンパク質のアミノ末端及びカルボキシ末端の両方に取り付けることができる。抗ＢＴＣ結合部分はまた、それぞれタンパク質又は核酸分子内の１つ以上のアミノ酸又は核酸に取り付けることができる。抗ＢＴＣ結合部分の分子への連結は、抗ＢＴＣ結合部分と分子との融合タンパク質としての発現、又は翻訳後に抗ＢＴＣ結合部分を分子に、互いに直接的に、又はジスルフィド結合によるリンカーを通してなどのいずれかで化学的に結合させることによることが挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の方法によって達成することができる。

多重特異性結合分子に関しての「リンカー」又は「連結された」という用語は、多重特異性結合分子の一部分が、分子の別の部分に直接的又は間接的に取り付けられる、例えば、抗ＢＴＣ結合部分が抗ＶＥＧＦ結合部分に取り付けられることを指す。リンカーは、抗ＢＴＣ結合部分及び／又はタンパク質若しくは核酸分子のアミノ末端又はカルボキシ末端の一方又は両方に共有結合で取り付けることができる。ペプチドリンカーはまた、それぞれタンパク質又は核酸分子の配列内のアミノ酸又は核酸にコンジュゲートされてもよい。ある特定の態様では、ペプチドリンカーは、例えば、約２～２５残基の長さであり得ることが企図される。

本明細書において、「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に用いられ、一本鎖形態又は二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマーを指す。この用語は、公知のヌクレオチド類似体又は改変された主鎖残基又は結合を含有する核酸であって、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される合成、天然及び非天然の核酸を包含する。そのような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。特に指示されない限り、ある詳細な核酸配列がまた、黙示的に、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補配列並びに明示的に指示される配列も包含する。とりわけ、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３位が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって実現し得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１，１９９１；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８，１９８５；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８，１９９４）。

「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメントの間の機能的関係を指す。典型的には、この用語は、転写調節配列の、転写される配列に対する機能的関係を指す。例えば、プロモーター配列又はエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞内又は他の発現系内のコード配列の転写を刺激又はモジュレートするとき、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列と物理的に隣接する、すなわち、シス作用型である。しかし、エンハンサーなど、一部の転写調節配列は、その転写をそれらが増強するコード配列に物理的に隣接する必要も、近接して配置される必要もない。

本明細書で使用される場合、「最適化された」又は「コドン最適化」という用語は、ヌクレオチド配列を、産生細胞又は産生生物、一般に、真核細胞、例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト細胞、又は原核生物細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコード化するように改変されていることを意味する。コドン最適化とは、コーディングＤＮＡ中の同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）の発生頻度が異なる種で偏っていることの発見を指す。そのようなコドン縮退は、同一のポリペプチドが様々なヌクレオチド配列によってコード化されることを可能にする。様々なコドン最適化法が本明細書で既知であり、例えば、少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号明細書及び同第６，１１４，１４８号明細書に開示される方法を含む。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としてもまた公知の出発ヌクレオチド配列により本来コードされるアミノ酸配列を、完全に、又は可能な限り多く保持するように操作する。本明細書の最適化された配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。しかし、本明細書ではまた、他の真核細胞又は原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現も企図される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されていると称する。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、１つ以上の線状鎖で配置され、三次元立体構造に折り畳まれたアミノ酸から作製された任意の有機化合物を指す。ポリマー鎖中のアミノ酸は、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合によって一緒に連結されている。「タンパク質」という用語には、更に、限定されないが、ペプチド、一本鎖ポリペプチド、又は主としてアミノ酸の２つ以上の鎖からなる任意の複合体分子が含まれる。それには更に、限定されないが、糖タンパク質又は他の既知の翻訳後改変が含まれる。それには更に、限定されないが、糖鎖工学、ペグ化、ヘシル化などの天然タンパク質の既知の天然若しくは人工的な化学改変、非天然アミノ酸の組込み、及び別の分子との化学的結合のためのアミノ酸改変などが含まれる。

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この語句はまた、１つ以上のアミノ酸残基が対応する、天然に存在するアミノ酸の人工化学的ミメティック（模倣物質）であるアミノ酸ポリマー、並びに、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。特に指示がない限り、特定のポリペプチド配列は、その保存的に改変されたバリアントも暗に包含する。

「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、１つ以上の組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すことが意図されていることを理解すべきである。変異又は環境の影響のどちらかにより、特定の改変は後の世代に起こり得るため、このような後代は事実上親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用するときの用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。

「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物には、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、マウス、ラット、ネコ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類などの全ての脊椎動物（例えば、哺乳類及び非哺乳類）が含まれる。注記する場合を除き、用語「患者」又は「対象」は、本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される「カニクイザル（ｃｙｎｏ）」又は「カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）」という用語は、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）（マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））を指す。

「予防」又は「予防すること」は、それが本明細書に記載される適応症、例えば、糖尿病性黄斑浮腫に関連する状態若しくは障害、網膜血管疾患、糖尿病性網膜症に関連する状態若しくは障害、及び／又は黄斑浮腫に関連する状態若しくは障害を含む眼科的状態若しくは障害に関連するとき、以下に記載されるような視覚機能、網膜解剖学的形態、網膜血管疾患パラメータ、糖尿病性網膜症疾患パラメータ、及び／又は黄斑浮腫疾患パラメータにおける悪化を、当該悪化のリスクがある患者において予防するか又は遅らせる任意の行為を意味する。本明細書で使用される場合、「予防」又は「予防すること」は、それが膵臓癌、乳癌、子宮内膜腺癌、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、及び胃癌を含む非眼科的状態又は障害に関するとき、状態の完全な予防をもたらす必要はない。状態若しくは状態の症状の部分的予防若しくは軽減、又は状態を発症するリスクの軽減もまた、この用語に包含される。

糖尿病性黄斑浮腫に関連する状態若しくは障害、加齢黄斑変性に関連する状態若しくは障害、例えば、新生血管加齢黄斑変性、網膜血管疾患に関連する状態若しくは障害、糖尿病性網膜症に関連する状態若しくは障害、及び／又は黄斑浮腫に関連する状態又は障害の「治療すること」又は「治療」という用語は、視覚機能及び／又は網膜解剖学的形態の改善又は保持をもたらすか、それをもたらすことを企図している任意の行為を意味する。本明細書で使用される場合、膵臓癌、乳癌、子宮内膜腺癌、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、及び胃癌を含む非眼科的状態若しくは障害の「治療すること」又は「治療」は、状態若しくは障害の改善又は軽減をもたらすか、又はそれをもたらすことを企図している任意の行為を指す。別の態様では、治療は、繰り返し投与の頻度の低減及び／又は医師／病院の訪問の低減を含む。また、治療が長期間治療、例えば、無期限にわたる繰り返し投与を伴う場合の一態様／態様も含む。疾患の治療及び／又は予防を評価する方法は、当技術分野において知られており、本明細書において以下に記載する。

「治療許容量」又は「治療有効量」又は「治療有効用量」という用語は、互換的に、所望の結果（すなわち、疾患活動性の低減、疾患進行の低減、疾患徴候及び／又は症状の低減など）をもたらすのに十分な量を指す。いくつかの態様では、治療許容量は、望ましくない副作用を誘発しないか又は引き起こさない。治療許容量は、最初に低用量を投与し、次に所望の効果が達成されるまでその用量を徐々に増加することによって決定することができる。本開示の分子の「予防的に有効な投与量」及び「治療的に有効な投与量」は、ＢＴＣ活性及び／又はＶＥＧＦ活性に関連する症状を含む疾患症状のそれぞれ発症を予防するか、又はその重症度の減少をもたらすことができる。

「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド分子が連結されている別のポリヌクレオチドの輸送が可能なポリヌクレオチド分子を指すことを意図する。ベクターの一種である「プラスミド」は、環状２本鎖ＤＮＡループを指し、追加のＤＮＡセグメントがこれに連結され得る。別の態様では、ポリヌクレオチド配列は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２）、レンチウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用して対象に送達させることができ、追加のＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及び哺乳動物のエピソームベクター）は、それらが導入された宿主細胞における自己複製が可能である。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞へと導入すると、宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿主ゲノムと共に複製する。更に、特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能である。このようなベクターは、本明細書においては、「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態である場合に、互換的に用いられ得る。しかし、本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態を含むことを意図している。

ポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）分子、タンパク質、構築物、ベクターなどに言及する「組換え」という用語は、人工であり、通常は自然界で見られず、及び／又は通常は自然界で見られない状況で存在しているポリヌクレオチド又はタンパク質分子若しくは配列を指し、これらには、ヒトの介入なしで同じ方法では一緒に天然には存在しない２つ以上のポリヌクレオチド又はタンパク質配列の組み合わせを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）分子、タンパク質、構築物などが含まれ、例えば、作動可能に連結されているが、互いに異種である少なくとも２つのポリヌクレオチド又はタンパク質配列を含むポリヌクレオチド分子、タンパク質、構築物などである。例えば、「組換え」という用語は、同じ分子（例えば、プラスミド、構築物、ベクター、染色体、タンパク質など）中の２つ以上のＤＮＡ又はタンパク質配列の任意の組み合わせを指すことができ、ここでは、そのような組み合わせは人工であり、通常は自然界で見られない。この定義で使用される場合、「通常は自然界で見られない」という語句は、ヒトよる導入なしで自然界では見られないことを意味する。組換えポリヌクレオチド又はタンパク質分子、構築物などは、（ｉ）自然界では互いに近くに存在する他のポリヌクレオチド又はタンパク質配列とは分離されている、及び／又は（ｉｉ）天然では互いに近くにはない他のポリヌクレオチド又はタンパク質配列に隣接する（又は、近接している）ポリヌクレオチド又はタンパク質配列を含むことができる。そのような組換えポリヌクレオチド分子、タンパク質、構築物などもまた、遺伝子操作されている、及び／又は細胞の外側で構築されているポリヌクレオチド又はタンパク質分子若しくは配列を指すことができる。例えば、組換えＤＮＡ分子は、任意の操作されたか、又は人工のプラスミド、ベクターなどを含むことができ、線状若しくは環状ＤＮＡ分子を含むことができる。そのようなプラスミド、ベクターなどは、原核細胞生物の複製起源及び選択可能マーカーを含む様々なメンテナンスエレメント、並びに恐らくは植物選択可能マーカー遺伝子などに加えて、１つ以上の導入遺伝子又は発現カセットを含有することができる。

本明細書で使用される場合、「コード化領域」又は「コード領域」は、機能単位又は分子をコード化するポリヌクレオチドの一部分を指す（例えば、限定されないが、ｍＲＮＡ、タンパク質、又は非コーディングＲＮＡ配列若しくは分子）。

本明細書で使用される場合、「治療用タンパク質」という用語は、疾患、状態又は障害を治療、予防又は改善するために有用であるタンパク質を指す。

アミノ酸残基／位置の「改変」又は「変異」は、本明細書で使用される場合、開始アミノ酸配列と比較して、一次アミノ酸配列の変化を指し、ここでは、変化は当該アミノ酸残基／位置に関与する配列の変更によるものである。例えば、典型的な改変には、別のアミノ酸による残基の置換（又は当該位置での）（例えば、保存的又は非保存的置換）、当該残基／位置に隣接する１つ以上のアミノ酸の挿入、及び当該残基／位置の欠失が含まれる。「アミノ酸置換」又はそのバリエーションは、所定の（開始）アミノ酸配列中の既存のアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基による置き換えを指す。一般に且つ好ましくは、改変は、開始（又は「野生型」）アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較して、バリアントポリペプチドの少なくとも１つの物理生化学的活性における変更をもたらす。例えば、抗体の場合、変更される物理生化学的活性は、結合親和性、結合能力、及び／又は標的分子に対する結合効果であり得る。

「保存的に改変されたバリアント」という用語は、アミノ酸配列及び核酸配列のいずれにも適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントとは、同一なアミノ酸配列若しくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために、多数の機能的に同一な核酸が、所与の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンであるＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵのいずれも、アミノ酸であるアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを改変することなく、コドンを、記載された対応するコドンのうちのいずれかへと改変することができる。このような核酸バリエーションは、保存的に改変されたバリアントの１種である「サイレントバリエーション」である。ポリペプチドをコードする、本明細書のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレントバリエーションについても記載する。当業者は、核酸内の各コドン（通常、メチオニンのみのコドンであるＡＵＧ及び通常、トリプトファンのみのコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一な分子をもたらし得ることを認識するであろう。したがって、記載される各配列内では、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションが含意されている。

本明細書で使用される場合、「Ｃ－末端」は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有するポリペプチド鎖のカルボキシル末端のアミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、「Ｎ－末端」は、遊離アミン基（－ＮＨ_２）を有するポリペプチド鎖のアミノ末端のアミノ酸を指す。

本明細書で使用される場合、「治療を必要とする患者」又は「治療を必要とする対象」などの語句は、例えば、検出に、診断的処置に、及び／又は治療に使用される本開示の分子又は医薬組成物の投与から恩恵を受ける対象、例えば、哺乳動物対象を含む。

「薬学的に許容される」という語句は、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、又は米薬局方若しくは動物で使用するために、特にヒトで使用するためにその他の一般的に認識されている薬局方で列挙されていることを意味する。

「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの有効成分（例えば、本開示の抗体又は断片）と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体との混合物を指す。

「医薬品」は、医療的処置で使用するための物質を指す。

「ＢＴＣによって媒介される障害」は、ＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦが直接的であれ間接的であれ、疾患若しくは状態の原因、発症、進行、持続、又は病理を含む、疾患若しくは医学的状態に関与する、全ての疾患及び医学的状態を包含する。ＢＴＣによって媒介される障害としては、膵臓癌、乳癌、子宮内膜腺癌、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、胃癌、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、新生血管加齢黄斑変性、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、母斑症に関連する異常血管増殖、中心性漿液性脈絡網膜症、及び急性多発性小板状色素上皮症を挙げることができるが、これらに限定されない。

「ＶＥＧＦによって媒介される障害」は、ＶＥＧＦが直接的であれ間接的であれ、疾患若しくは状態の原因、発症、進行、持続、又は病理を含む、疾患若しくは医学的状態に関与する、全ての疾患及び医学的状態を包含する。ＶＥＧＦによって媒介される障害としては、中枢神経系腫瘍、毛細血管芽腫、髄膜腫、脳浮腫、下垂体腺腫、非星細胞（ｎｏｎａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ）系グリオーマ、腫瘍周辺浮腫、乳癌、腺癌、肺癌、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、新生血管加齢黄斑変性、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、及び母斑症に関連する異常血管増殖を挙げることができるが、これらに限定されない。

ｉｉ．抗ＢＴＣ抗体又は抗ＢＴＣ結合部分
ＢＴＣは、ＥＧＦファミリーのメンバーである。それは、ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼファミリーのためのリガンドであり、主としてＲａｓ／ＭＡＰＫ及びＰＬ３Ｋ／ＡＫＴ経路のような抗アポトーシス及び増殖促進シグナル伝達経路を引き起こすＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４ホモ二量体を活性化する。眼においては、ＢＴＣは、糖尿病性網膜症における網膜血管透過性の増加の発現で重要な役割を果たし得る強力な透過性因子であるように見え、この疾患における潜在的な治療標的である。例示的なヒトｐｒｏ－ＢＴＣアミノ酸配列は、配列番号１５６として提示される。例示的なヒトＢＴＣアミノ酸配列は、配列番号１５８として提示される。本開示で表される例示的なヒトＢＴＣアミノ酸配列は、配列番号１５７として提示される（Ｎ－末端及びＣ－末端では、小文字で残留アミノ酸残基を表している）。

４つの抗ＢＴＣ Ｆａｂ断片に結合されたヒトＢＴＣタンパク質の構造は、Ｘ線結晶構造解析を介して、本出願者が最近解明している。実施例２を参照されたい。ヒトＢＴＣ構造は、３本鎖と２本鎖のシートで５本のベータ鎖を有するＥＧＦ折り畳みである。構造は、３つのジスルフィド結合によって安定化される。

ヒトＢＴＣを含むＢＴＣに結合する抗体又はその抗原結合断片が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、提供される抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されるように、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチドである。いくつかの態様では、ＣＤＲは、「フレームワーク」領域中に埋め込まれており、フレームワーク領域は、ＣＤＲの適切な抗原結合特性が達成されるように、ＣＤＲを方向付ける。いくつかの態様では、本明細書に提供される抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣとＥｒｂＢ受容体との間の相互作用を妨害し、ブロックし、低減し、又は調節することができる。いくつかの態様では、本明細書に提供される抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣ媒介活性（結合を含む）を阻害することができる。いくつかの態様では、これらのエピトープに結合する抗原結合タンパク質は、とりわけ、ＢＴＣ及びＥｒｂＢ受容体とＢＴＣによって媒介されるその他の生理学的作用との間の相互作用を阻害する。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトタンパク質であり、例えば、ＢＴＣに対する完全ヒト抗体又はＦａｂである。

いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、本明細書で論議される抗体によって結合されたエピトープのいずれか１つに結合する。いくつかの態様では、これは、本明細書に開示される抗体と、その他の抗体との間の競合アッセイによって決定することができる。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、表１に記載される抗体のうちの１つによって結合されたエピトープに結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣがＥｒｂＢ受容体と相互作用することを防止するために、ＢＴＣの特定の立体構造状態に結合する。一態様では、本開示の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＢＴＣの５本のベータ鎖のうちの１つ以上に結合する。一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＢＴＣのベータ鎖１に結合し、ＢＴＣがＥｒｂＢ受容体に結合することを妨害する。一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＢＴＣのベータ鎖２に結合し、ＢＴＣがＥｒｂＢ受容体に結合することを妨害する。一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＢＴＣのベータ鎖３に結合し、ＢＴＣがＥｒｂＢ受容体に結合することを妨害する。一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＢＴＣのベータ鎖４に結合し、ＢＴＣがＥｒｂＢ受容体に結合することを妨害する。一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＢＴＣのベータ鎖５に結合し、ＢＴＣがＥｒｂＢ受容体に結合することを妨害する。

本明細書では、ＢＴＣに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片が開示される。いくつかの態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣが様々な方法で機能することを妨げる。いくつかの態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣがその他の物質と相互作用する能力をブロック又は低減する。例えば、いくつかの態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣがＥｒｂＢ受容体に結合する能力をブロック又は低減する。他の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣ誘発リン酸化ＥＲＫ１／２活性化をブロックする。いくつかの態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣ誘発リン酸化ＨＥＲ３活性化をブロックする。

本明細書に提供されるようなある特定の抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７又は１５８に記載されるようなヒトＢＴＣに特異的に及び／又は選択的に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、実施例２及び表１に表示されるようなヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｇ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、Ｖ５６、Ａ５７、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６からなる群から選択される配列番号１５７の少なくとも１つの残基に特異的に及び／又は選択的に結合する。いくつかの態様では、特定されたＢＴＣ残基のうちの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個）は、抗体又はその抗原結合断片によって結合される領域の一部である。

いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７、例えば、ＮＶＳ１のＲ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、及びＲ７３に特異的に及び／又は選択的に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７、例えば、ＮＶＳ２のＰ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６に特異的に及び／又は選択的に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７、例えば、ＮＶＳ３のＧ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、及びＶ５６に特異的に及び／又は選択的に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７、例えば、ＮＶＳ４のＳ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ａ５７、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、及びＥ７５に特異的に及び／又は選択的に結合する。

抗体又はその抗原結合断片が治療用途に使用される態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣの１つ以上の生物学的活性を阻害し、妨害し、又は調節することができる。一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＢＴＣに特異的に結合し、及び／又はヒトＢＴＣのＥｒｂＢ受容体への結合を、少なくとも約２０％～４０％、４０～６０％、６０～８０％、８０～８５％、又はそれ以上実質的に阻害する（例えば、インビトロ競合結合アッセイにおける結合を測定することによって）。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、１０^－７、１０^－８、１０^－９、１０^－１０、１０^－１１、１０^－１２、１０^－１３Ｍ未満のＫ_ｄを有する（より緊密に結合する）。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、１マイクロＭ未満、１０００ｎＭ～１００ｎＭ、１００ｎＭ～１０ｎＭ、１０ｎＭ～１ｎＭ、１０００ｐＭ～５００ｐＭ、５００ｐＭ～２００ｐＭ、２００ｐＭ未満、２００ｐＭ～１５０ｐＭ、２００ｐＭ～１００ｐＭ、１００ｐＭ～１０ｐＭ、１０ｐＭ～１ｐＭのＥｒｂＢ受容体のＢＴＣへの結合のブロックに関するＩＣ_５０を有する。

いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７又は１５８に記載されるようなＢＴＣの形態に対して、少なくとも５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９９％、又はそれ以上のパーセントで同一であるＢＴＣのバリアントに結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、表１に記載される抗体のうちの１つによって結合されるエピトープに結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＢＴＣがＥｒｂＢ受容体と相互作用することを妨害するために、ＢＴＣの特定の立体構造状態に結合する。

本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖可変領域相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、重鎖可変領域相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、軽鎖可変領域相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖可変領域相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖可変領域相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、重鎖可変領域（ＶＨ）中に含まれる。ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、軽鎖可変領域（ＶＬ）中に含まれる。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に記載され、及び以下で記述されるように重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、及び／又は組み合わせＣＤＲ）を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号４、２、３、１４、１５、及び１６に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号５、６、３、１７、１８、及び１９に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、組み合わせ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号１、２、３、１４、１５、及び１６に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号７、８、９、２０、１８、及び１６に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に提供されるようなＮＶＳ１である。特定の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１０及び２１のＶＨ及びＶＬを含む抗体ＮＶＳ１の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、及び／又は組み合わせＣＤＲ）を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号２８、２６、２７、３８、３９、及び４０に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号２９、３０、２７、４１、４２、及び４３に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、組み合わせ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号２５、２６、２７、３８、３９、及び４０に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号３１、３２、３３、４４、４２、及び４０に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に提供されるようなＮＶＳ２である。特定の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３４及び４５のＶＨ及びＶＬを含む抗体ＮＶＳ２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、及び／又は組み合わせＣＤＲ）を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号２８、４９、５０、５８、５９、及び６０に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号２９、５１、５０、６１、６２、及び６３に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、組み合わせ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号２５、４９、５０、５８、５９、及び６０に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号３１、５２、５３、６４、６２、及び６０に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に提供されるようなＮＶＳ３である。特定の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５４及び６５のＶＨ及びＶＬを含む抗体ＮＶＳ３の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、及び／又は組み合わせＣＤＲ）を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号７２、７０、７１、８２、８３、及び８４に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号７３、７４、７１、８５、１８、及び８６に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、組み合わせ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号６９、７０、７１、８２、８３、及び８４に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って、それぞれ配列番号７５、７６、７７、８７、１８、及び８４に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に提供されるようなＮＶＳ４である。特定の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号７８及び８８のＶＨ及びＶＬを含む抗体ＮＶＳ４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、及び／又は組み合わせＣＤＲ）を含む。

加えて、本開示はまた、全体を通して及び表１に記載されるＣＤＲ配列に相同であるアミノ酸配列を含む抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片を提供し、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片はＢＴＣに結合し、本明細書に記載されるものの所望の機能的特性を保持する。より具体的には、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列は、全体を通して記載され、且つ表１に記載されるＣＤＲ配列に対して、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有することができ、その所望の機能的特性を保持することができる。

本開示はまた、本明細書に記載のＶＨ及びＶＬ配列に相同である抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片を提供する。より具体的には、本開示は、表１に記載されるものなどの配列に相同であるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供し、抗ＢＴＣ抗体又は抗原結合断片は、治療標的、例えば、眼科的標的に結合し、表１及び実施例に記載されるものの所望の機能的特性を保持する。表１に記載されるもののＶＨ及びＶＬ領域に１００％未満の配列同一性を有するＶＨ及びＶＬ領域を有する抗体又はその抗原結合断片は、表１に記載される核酸分子の変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲによる変異誘発）、続いて本明細書に記載され、米国特許出願公開第２０１２００１４９５８号明細書に記載される機能的アッセイを使用して、保持された機能についてコード化され、変更された抗体を試験することによって得ることができる。表１に記載される重鎖及び軽鎖に対して高い（すなわち、８０％以上）同一性を有する重鎖及び軽鎖を有する抗体又はその抗原結合断片は、そのようなポリペプチドをコード化する核酸分子の変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲによる変異誘発）、続いて、例えば、本明細書に記載される機能的アッセイを使用することによって、保持された機能についてコード化され、変更された抗体を試験することによって得ることができる。

本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ、配列番号１０及び２１に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ＣＤＲ又はフレームワーク領域内に変動性があり得ることが企図される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１０及び２１に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に提供されるようなＮＶＳ１である。別の態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１１及び２２に記載されるような核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１０及び２１のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ又は３つの改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、１０を超える改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有さないアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３４及び４５に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。ＣＤＲ又はフレームワーク領域内に変動性があり得ることが企図される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３４及び４５に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に提供されるようなＮＶＳ２である。別の態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号３５及び４６に記載されるような核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３４及び４５のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ又は３つの改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、１０を超える改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有さないアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５４及び６５に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。ＣＤＲ又はフレームワーク領域内に変動性があり得ることが企図される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５４及び６５に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に提供されるようなＮＶＳ３である。別の態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号５５及び６６に記載されるような核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５４及び６５のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ又は３つの改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、１０を超える改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有さないアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号７８及び８８に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。ＣＤＲ又はフレームワーク領域内に変動性があり得ることが企図される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号７８及び８８に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に提供されるようなＮＶＳ４である。別の態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号７９及び８９に記載されるような核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号７８及び８８のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ又は３つの改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、１０を超える改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有さないアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１２及び２３に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１２及び２３に記載されるようなアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体は、ＢＴＣ活性、例えば、ＢＴＣの１）ＥｒｂＢ１；２）ＥｒｂＢ４；３）ＥｒｂＢホモ二量体（例えば、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４／ＥｒＢ４）；４）ＥｒｂＢヘテロ二量体（例えば、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ２、ＥｒＢ１／ＥｒＢ３、ＥｒＢ１／ＥｒＢ４、ＥｒＢ２／ＥｒＢ３、及びＥｒＢ２／ＥｒＢ４）への結合を阻害することができ；及び／又は５）ＥＲＫ１／２リン酸化を阻害することができる。別の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に提供されるようなＮＶＳ１である。別の態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号１３及び２４に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性又は相補性を有する核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１３及び２４に記載されるような核酸配列によってコード化される重鎖及び軽鎖を含み、表１に提供されるようなＮＶＳ１である。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３６及び４７に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３６及び４７に記載されるようなアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体は、ＢＴＣ活性、例えば、ＢＴＣの１）ＥｒｂＢ１；２）ＥｒｂＢ４；３）ＥｒｂＢホモ二量体（例えば、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４／ＥｒＢ４）；４）ＥｒｂＢヘテロ二量体（例えば、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ２、ＥｒＢ１／ＥｒＢ３、ＥｒＢ１／ＥｒＢ４、ＥｒＢ２／ＥｒＢ３、及びＥｒＢ２／ＥｒＢ４）への結合を阻害することができ；及び／又は５）ＥＲＫ１／２リン酸化を阻害することができる。別の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に提供されるようなＮＶＳ２である。別の態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号３７及び４８に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性又は相補性を有する核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３７及び４８に記載されるような核酸配列によってコード化される重鎖及び軽鎖を含み、表１に提供されるようなＮＶＳ２である。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５６及び６７に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５６及び６７に記載されるようなアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体は、ＢＴＣ活性、例えば、ＢＴＣの１）ＥｒｂＢ１；２）ＥｒｂＢ４；３）ＥｒｂＢホモ二量体（例えば、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４／ＥｒＢ４）；４）ＥｒｂＢヘテロ二量体（例えば、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ２、ＥｒＢ１／ＥｒＢ３、ＥｒＢ１／ＥｒＢ４、ＥｒＢ２／ＥｒＢ３、及びＥｒＢ２／ＥｒＢ４）への結合を阻害することができ；及び／又は５）ＥＲＫ１／２リン酸化を阻害することができる。別の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に提供されるようなＮＶＳ３である。別の態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号５７及び６８に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性又は相補性を有する核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５７及び６８に記載されるような核酸配列によってコード化される重鎖及び軽鎖を含み、表１に提供されるようなＮＶＳ３である。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号８０及び９０に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号８０及び９０に記載されるようなアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体は、ＢＴＣ活性、例えば、ＢＴＣの１）ＥｒｂＢ１；２）ＥｒｂＢ４；３）ＥｒｂＢホモ二量体（例えば、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４／ＥｒＢ４）；４）ＥｒｂＢヘテロ二量体（例えば、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ２、ＥｒＢ１／ＥｒＢ３、ＥｒＢ１／ＥｒＢ４、ＥｒＢ２／ＥｒＢ３、及びＥｒＢ２／ＥｒＢ４）への結合を阻害することができ；及び／又は５）ＥＲＫ１／２リン酸化を阻害することができる。別の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表１に提供されるようなＮＶＳ４である。別の態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号８１及び９１に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性又は相補性を有する核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号８１及び９１に記載されるような核酸配列によってコード化される重鎖及び軽鎖を含み、表１に提供されるようなＮＶＳ４である。

更に、保存的改変を有する単離された抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片が、本開示の範囲内に含まれる。より具体的には、本開示は、表１の抗ＢＴＣ結合部分及び抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートした分子に対して保存的改変を有する、抗ＢＴＣ結合部分及びその抗ＢＴＣ部分にコンジュゲートした分子に関する。ある特定の態様では、本開示の抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートした抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを有し、これらのＣＤＲ配列のうちの１つ以上は、本明細書に記載の抗体又はその保存的改変体に基づく特定のアミノ酸配列を有し、この抗体は、本開示の抗体の所望の機能的特性を保持する。

特定の態様では、その配列が、本明細書に記載（例えば、表１）の抗ＢＴＣ抗体又はその断片（例えば、ＶＨ又はＶＬ）をコード化するポリヌクレオチドが本明細書に提供される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、その配列が哺乳動物細胞中での発現のためにコドン最適化されているポリヌクレオチドによってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片の構築物全体は、その配列全体が哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されているポリヌクレオチドによってコード化される。他の態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、哺乳動物細胞中での発現のために最適化されており、完全長重鎖配列及び完全長軽鎖配列を有し、これらの配列のうちの１つ以上は、本明細書に記載の抗体又はその保存的改変体に基づく特定のアミノ酸配列を有し、抗ＢＴＣ結合部分は、本開示の抗ＢＴＣ結合抗体の所望の機能的特性を保持する。したがって、本開示は、例えば、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨが配列番号１０、３４、５４、及び７８のアミノ酸配列と、その保存的改変体を含み；ＶＬが配列番号２１、４５、６５、及び８８のアミノ酸配列と、その保存的改変体を含む、ＢＴＣに特異的に結合する、哺乳動物細胞中での発現のために最適化された単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。

本開示は、表１に記載される抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片と同じ、又は重複するエピトープに結合する抗ＢＴＣ結合部分（例えば、ＢＴＣ結合抗体又はその断片）を提供する。したがって、追加の抗体は、ＢＴＣ結合アッセイで本開示の他の抗体と競合する（例えば、統計的に有意な方法で結合を競合阻害する）それらの能力に基づいて同定可能である。ＢＴＣに対する本開示の分子の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験分子が、ＢＴＣに対する結合についてその抗体と競合することができることを実証し；そのような抗体は、非限定的な理論によれば、競合する抗体と同じ又は関連する（例えば、構造的に類似した又は空間的に近位の）ＢＴＣ上のエピトープに結合し得る。ある特定の態様では、本開示の抗体と同様にＢＴＣの同一のエピトープと結合する分子は、ヒトモノクローナル抗体、Ｆａｂ、又はｓｃＦｖである。かかるヒトモノクローナル抗体、Ｆａｂ、及びｓｃＦｖは、本明細書に記載されるように調製及び単離が可能である。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片と競合する分子は、Ｇ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、Ｖ５６、Ａ５７、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６からなる群から選択される配列番号１５７のうちの少なくとも１つの残基に結合する。一態様では、本開示は、ＢＴＣへの結合のために及びＢＴＣ媒介シグナル伝達を低減させるために、表１に記載されるもの、例えば、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、及びＮＶＳ４と競合することができる単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。別の態様では、競合抗体又はその抗原結合断片は、表５の配列番号１６８～１８９に記載されるような重鎖及び軽鎖を含む。

本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、単離された抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される形式である。好ましい態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片はＦａｂであり、Ｆｃ領域を含むＦａｂが含まれる。別の態様では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＤからのＦｃ領域からなる群から選択される。一態様では、Ｆｃ領域は、配列番号１５９に記載されるようなヒト免疫グロブリンカッパ鎖定常領域配列を含む。別の態様では、Ｆｃ領域は、配列番号１６０に記載されるようなヒト免疫グロブリンの重鎖の第１の定常Ｉｇドメイン（ＣＨ１ドメイン）を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、単離された抗体、例えば、モノクローナルヒト抗体又はモノクローナルヒト化抗体である。ある特定の態様では、抗ＢＴＣ抗体は、ｓｃＦｖ又はＦａｂ形式であり得る。ある特定の態様では、抗ＢＴＣ抗体は、ｓｃＦｖ又はＦａｂ形式であり得る。

ｉｉｉ．抗ＢＴＣ抗体の結合パートナー
上述したように、本開示は、ＢＴＣを有する組織（例えば、ＢＴＣの実質的レベル、例えば、眼、膵臓まで）内に位置するか、又はその近くに位置する標的に特異的な治療標的結合部分にコンジュゲートする（例えば、共有結合する、非共有的に結合する、又は融合する）１つ以上の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片を含む組成物を特徴とする。例えば、本開示は、ＢＴＣ関連状態若しくは疾患（例えば、ＤＲ、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯ）の治療に関連する治療標的結合部分に取り付けられた１つ以上の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片を有する組成物を特徴とする。別の態様では、本開示は、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物及び治療標的結合部分を特徴とし、この医薬組成物は、ＢＴＣ媒介状態若しくは疾患の治療に使用することができる。更に別の態様では、本開示は、有効量の、本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片を対象に投与することと、続いて、対象に治療標的結合部分（例えば、ＶＥＧＦ阻害剤）を投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法を特徴とし、対象はＢＴＣ媒介状態若しくは疾患を有する。

ある特定の好ましい態様では、治療標的結合部分は、治療標的に結合する抗体、又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体、若しくはダイアボディの形式の）であり、又は治療標的（例えば、可溶性受容体）に結合するポリペプチドである。そのような治療標的は、例えば、眼科障害に関連するものであり得、例えば、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、アンジオポイエチン、アンジオポイエチン－２、Ｓ１Ｐ、インデグリンαｖβ３、αｖβ５、α５β１、アペリン／ＡＰＪ、エリスロポイエチン、補体因子Ｄ、ＴＮＦα、Ｃ２、因子Ｂ、因子Ｈ、因子Ｐ、ＣＦＨＲ３、Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ３ａ、ＨｔｒＡ１、ＡＲＭＳ２、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＴＩＭＰ３、ＨＬＡ、ＩＬ８、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＣＥＴＰ、ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１、ＩＬ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＦＧＦＲ２、及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａであり得る。追加の治療標的としては、因子Ｐ、因子Ｄ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ－１、ＣＤ１３２、ＩＬ－６Ｒ、ＣＤ２０、及びＩＧＦ－１が挙げられる。

一態様では、本開示は、抗ＢＴＣ結合部分のそれぞれの少なくとも１つと、１つ以上の治療標的結合部分とを有する多重特異性結合分子を特徴とする。したがって、一態様では、本開示は、例えば、以下から選択される結合選択性の組み合わせを有する二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）を特徴とする：ＢＴＣとＶＥＧＦ、ＢＴＣとＰＤＧＦ、ＢＴＣとＰＤＧＦ－ＢＢ、ＢＴＣとアンジオポイエチン、ＢＴＣとアンジオポイエチン－２、ＢＴＣとＳ１Ｐ、ＢＴＣとインデグリンαｖβ３、ＢＴＣとαｖβ５、ＢＴＣとα５β１、ＢＴＣとアペリン／ＡＰＪ、ＢＴＣとエリスロポイエチン、ＢＴＣと補体因子Ｄ、ＢＴＣとＴＮＦα、ＢＴＣとＣ２、ＢＴＣと因子Ｂ、ＢＴＣと因子Ｈ、ＢＴＣとＣＦＨＲ３、ＢＴＣとＣ１ｑ、ＢＴＣとＣ３、ＢＴＣとＣ３ｂ、ＢＴＣとＣ５、ＢＴＣとＣ５ａ、ＢＴＣとＣ３ａ、ＢＴＣとＨｔｒＡ１、ＢＴＣとＡＲＭＳ２、ＢＴＣとＥＰＯ、ＢＴＣとＥＰＯＲ、ＢＴＣとＴＩＭＰ３、ＢＴＣとＨＬＡ、ＢＴＣとＩＬ８、ＢＴＣとＣＸ３ＣＲ１、ＢＴＣとＴＬＲ３、ＢＴＣとＴＬＲ４、ＢＴＣとＣＥＴＰ、ＢＴＣとＬＩＰＣ、ＢＴＣとＣＯＬ１０Ａ１、ＢＴＣとＩＬ－１β、ＢＴＣとＩＬ－１７Ａ、ＢＴＣとＦＧＦＲ２、ＢＴＣとＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＢＴＣと因子Ｐ、ＢＴＣと因子Ｄ、ＢＴＣとＩＬ－６、ＢＴＣとＩＬ－１２、ＢＴＣとＩＬ－１８、ＢＴＣとｂＦＧ、ＢＴＣとＭＣＰ－１、ＢＴＣとＣＤ１３２、ＢＴＣとＩＬ－６Ｒ、ＢＴＣとＣＤ２０、又はＢＴＣとＩＧＦ－１。

一態様では、治療標的結合部分は、抗ＶＥＧＦアンタゴニストであり得る。一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）；国際公開第９８／４５３３１号パンフレット；国際公開第９８／４５３３１号パンフレット；米国特許第６８８４８７９号明細書；米国特許第６４０７２１３号明細書；米国特許第７０６０２６９号明細書；米国特許第７３６５１６６号明細書）である。一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）；米国特許第６０５４２９７号明細書；米国特許第７１６９９０１号明細書；米国特許第７３７５１９３号明細書；米国特許第７２９７３３４号明細書）である。一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標）；米国特許第７２７９１５９号明細書）である。一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ブロルシズマブ（Ｂｅｏｖｕ（登録商標）；国際公開第２００９／１５５７２４号パンフレット；米国特許第８３４９３２２号明細書；米国特許第９０９０６８４号明細書；米国特許第９８７３７３７号明細書；国際公開第０３／０９７６９７号パンフレット；国際公開第２０１６／０７３９１５号パンフレット；国際公開第／２０１６／０７３９１８号パンフレット）である。一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））である。一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＫＨ９０２（国際公開第２００５／１２１１７６号パンフレット；米国特許第７７５０１３８号明細書）である。一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、それぞれ配列番号１０３及び１１４に記載されるような、重鎖及び軽鎖を含む。一態様では、抗ＶＥＧＦアンタゴニストは、それぞれ配列番号１０４及び１１５に記載されるような、核酸配列によってコード化される。

ｉｖ．多重特異性結合分子
また、本開示において、１）抗ＢＴＣ結合部分と、２）抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子が提供される。

ａ）抗ＢＴＣ結合部分
一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、配列番号１５７又は１５８に記載されるような、ヒトＢＴＣに結合する。いくつかの態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、実施例２及び表４に表示されるヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合する。いくつかの態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、Ｇ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、Ｖ５６、Ａ５７、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６からなる群から選択される、配列番号１５７の少なくとも１つの残基に特異的に及び／又は選択的に結合する。いくつかの態様では、特定されたＢＴＣ残基のうちの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）は、抗ＢＴＣ結合部分によって結合される領域の一部である。特定の態様では、そのような抗ＢＴＣ結合部分は、ヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合し、ＢＴＣ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

いくつかの態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、配列番号１５７、例えば、ＮＶＳ１１のＲ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、及びＲ７３に特異的に及び／又は選択的に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７、例えば、ＮＶＳ１２のＰ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６に特異的に及び／又は選択的に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７、例えば、ＮＶＳ１３のＧ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、及びＶ５６に特異的に及び／又は選択的に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５７、例えば、ＮＶＳ１４のＳ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ａ５７、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、及びＥ７５に特異的に及び／又は選択的に結合する。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、全体を通して記載されるような、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片である。特定の態様では、そのような抗ＢＴＣ結合部分は、ヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合し、ＢＴＣ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

抗ＢＴＣ結合部分が治療用途に使用される態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、ＢＴＣの１つ以上の生物学的活性を阻害し、妨害し、又は調節することができる。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、ヒトＢＴＣに特異的に結合し、及び／又はヒトＢＴＣのＥｒｂＢ受容体への結合を、少なくとも約２０％～４０％、４０～６０％、６０～８０％、８０～８５％、又はそれ以上実質的に阻害する（例えば、インビトロ競合結合アッセイにおいて、結合を測定することによって）。いくつかの態様では、その抗ＢＴＣ結合部分は、１０^－７、１０^－８、１０^－９、１０^－１０、１０^－１１、１０^－１２、１０^－１３Ｍ未満のＫ_ｄを有する（より緊密に結合する）。いくつかの態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、１マイクロＭ、１０００ｎＭ～１００ｎＭ、１００ｎＭ～１０ｎＭ、１０ｎＭ～１ｎＭ、１０００ｐＭ～５００ｐＭ、５００ｐＭ～２００ｐＭ、２００ｐＭ未満、２００ｐＭ～１５０ｐＭ、２００ｐＭ～１００ｐＭ、１００ｐＭ～１０ｐＭ、１０ｐＭ～１ｐＭのＥｒｂＢ受容体のＢＴＣへの結合をブロックするためのＩＣ_５０を有する。特定の態様では、そのような抗ＢＴＣ結合部分は、ヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合し、ＢＴＣ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

いくつかの態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、配列番号１５７又は１５８に記載されるような、ＢＴＣの形態に対して、約少なくとも５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９９％、又はそれ以上のパーセント同一性であるＢＴＣのバリアントに結合する。いくつかの態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に記載される抗体のうちの１つによって結合されるエピトープに結合する。いくつかの態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、ＢＴＣがＥｒｂＢ受容体と相互作用することを防ぐために、ＢＴＣの特定の立体構造状態に結合する。

本開示の多重特異性結合分子の抗ＢＴＣ結合部分は、重鎖可変領域相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖可変領域相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、重鎖可変領域相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、軽鎖可変領域相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖可変領域相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖可変領域相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、重鎖可変領域（ＶＨ）中に含まれる。ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、軽鎖可変領域（ＶＬ）中に含まれる。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、表３に記載され、以下に記述されるような重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、及び／又は組み合わせＣＤＲ）を含む。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号４、２、３、１４、１５、及び１６に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号５、６、３、１７、１８、及び１９に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、組み合わせ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号１、２、３、１４、１５、及び１６に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号７、８、９、２０、１８、及び１６に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に提供されるような、ＮＶＳ１１中に含まれる。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号２８、２６、２７、３８、３９、及び４０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号２９、３０、２７、４１、４２、及び４３に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、組み合わせ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号２５、２６、２７、３８、３９、及び４０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号３１、３２、３３、４４、４２、及び４０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に提供されるような、ＮＶＳ１２中に含まれる。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号２８、４９、５０、５８、５９、及び６０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号２９、５１、５０、６１、６２、及び６３に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、組み合わせ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号２５、４９、５０、５８、５９、及び６０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号３１、５２、５３、６４、６２、及び６０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に提供されるような、ＮＶＳ１３中に含まれる。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号７２、７０、７１、８２、８３、及び８４に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号７３、７４、７１、８５、１８、及び８６に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、組み合わせ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号６９、７０、７１、８２、８３、及び８４に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号７５、７６、７７、８７、１８、及び８４に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に提供されるような、ＮＶＳ１４中に含まれる。

加えて、本開示はまた、全体を通して及び表３に記載されるＣＤＲ配列に相同であるアミノ酸配列を含む抗ＢＴＣ結合部分を提供し、抗ＢＴＣ結合部分はＢＴＣに結合し、本明細書に記載されるものの所望の機能的特性を保持する。より具体的には、抗ＢＴＣ結合部分のアミノ酸配列は、全体を通して記載され、表３に記述されるようなＣＤＲ配列に対して、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性を有することができ、その所望の機能的特性を保持することができる。

本開示はまた、本明細書に記載のＶＨ及びＶＬ配列に相同である抗ＢＴＣ結合部分を提供する。より具体的には、本開示は、表３に記載されるものなどの配列に相同であるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供し、抗ＢＴＣ結合部分は眼科的標的に結合し、表３及び実施例に記載されるものの所望の機能的特性を保持する。表３に記載されるもののＶＨ及びＶＬ領域に対して、１００％未満の配列同一性を有するＶＨ及びＶＬ領域を有する抗ＢＴＣ結合部分は、表３に記載される核酸分子の変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲによる変異誘発）、続いて本明細書に記載され、米国特許出願公開第２０１２００１４９５８号明細書に記載される機能的アッセイを使用して、保持された機能についてコード化され、変更された抗体を試験することによって得ることができる。表３に記載される重鎖及び軽鎖に対して、高い（すなわち、８０％以上）同一性を有する重鎖及び軽鎖を有する抗ＢＴＣ結合部分は、そのようなポリペプチドをコード化する核酸分子の変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲによる変異誘発）、続いて本明細書に記載される機能性アッセイを使用して、保持された機能についてコード化され、変更された抗体を試験することによって得ることができる。

本開示の抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号１０及び２１に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ＣＤＲ又はフレームワーク領域内に変動性があり得ることが企図される。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号１０及び２１に記載されるような、アミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に提供されるようなＮＶＳ１１である。別の態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１１６及び１２２に記載されるような核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号１０及び２１のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ又は３つの改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、１０を超える改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有さないアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号３４及び４５に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。ＣＤＲ又はフレームワーク領域内に変動性があり得ることが企図される。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号３４及び４５に記載されるような、アミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に提供されるようなＮＶＳ１２である。別の態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１２７及び１３２に記載されるような核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号３４及び４５のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ又は３つの改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、１０を超える改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有さないアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号５４及び６５に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。ＣＤＲ又はフレームワーク領域内に変動性があり得ることが企図される。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号５４及び６５に記載されるような、アミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に提供されるようなＮＶＳ１３である。別の態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１３７及び１４２に記載されるような核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号５４及び６５のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ又は３つの改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、１０を超える改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有さないアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号７８及び８８に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。ＣＤＲ又はフレームワーク領域内に変動性があり得ることが企図される。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号７８及び８８に記載されるような、アミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に提供されるようなＮＶＳ１４である。別の態様では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１４７及び１５１に記載されるような核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、それぞれ配列番号７８及び８８のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ又は３つの改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、１０を超える改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有さないアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ結合部分は、１）それぞれ配列番号１、２、３、１４、１５、及び１６（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号４、２、３、１４、１５、及び１６（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号５、６、３、１７、１８、及び１９（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号７、８、９、２０、１８、及び１６（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、２）それぞれ配列番号１０及び２１に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬと、を含む。別の態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に提供されるようなＮＶＳ１１中に含まれる。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ結合部分は、１）それぞれ配列番号２５、２６、２７、３８、３９、及び４０（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号２８、２６、２７、３８、３９、及び４０（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号２９、３０、２７、４１、４２、及び４３（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号３１、３２、３３、４４、４２、及び４０（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、２）それぞれ配列番号３４及び４５に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬと、を含む。別の態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に提供されるようなＮＶＳ１２中に含まれる。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ結合部分は、１）それぞれ配列番号２５、４９、５０、５８、５９、及び６０（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号２８、４９、５０、５８、５９、及び６０（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号２９、５１、５０、６１、６２、及び６３（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号３１、５２、５３、６４、６２、及び６０（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、２）それぞれ配列番号５４及び６５に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬと、を含む。別の態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に提供されるようなＮＶＳ１３中に含まれる。

一態様では、本開示の抗ＢＴＣ結合部分は、１）それぞれ配列番号６９、７０、７１、８２、８３、及び８４（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号７２、７０、７１、８２、８３、及び８４（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号７３、７４、７１、８５、１８、及び８６（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号７５、７６、７７、８７、１８、及び８４（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、２）それぞれ配列番号７８及び８８に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬと、を含む。別の態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、表３に提供されるようなＮＶＳ１４中に含まれる。

ｂ）抗ＶＥＧＦ結合部分
また、本開示では、多重特異性結合分子中に含まれる抗ＶＥＧＦ結合部分も開示される。特定の態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、重鎖可変領域相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖可変領域相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、重鎖可変領域相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、軽鎖可変領域相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖可変領域相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖可変領域相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、重鎖可変領域（ＶＨ）中に含まれる。ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、軽鎖可変領域（ＶＬ）中に含まれる。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は表２又は３に記載され、以下に記述されるように、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、及び／又は組み合わせＣＤＲ）を含む。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片である。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片である。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号９５、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号９６、９７、９４、１０８、１０９、及び１１０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、組み合わせ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号９２、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、それぞれ配列番号９８、９９、１００、１１１、１０９、及び１０７に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、表２に提供されるＮＶＳ８であるか、表３に提供されるようなＮＶＳ１１～ＮＶＳ１４のいずれか１つに含まれる。別の態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、ブロルシズマブ（Ｂｅｏｖｕ（登録商標））である。

加えて、本開示はまた、全体を通して記載され、表２又は３に記載されるＣＤＲ配列に相同であるアミノ酸配列を含む抗ＶＥＧＦ結合部分を提供し、抗ＶＥＧＦ結合部分はＶＥＧＦに結合し、本明細書に記載されるものの所望の機能的特性を保持する。より具体的には、抗ＶＥＧＦ結合部分のアミノ酸配列は、全体を通して記載され、表２又は３に記述されるようなＣＤＲ配列に対して、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有することができ、その所望の機能的特性を保持することができる。

本開示はまた、本明細書に記載のＶＨ及びＶＬ配列に相同である抗ＶＥＧＦ結合部分を提供する。より具体的には、本開示は、表２又は３に記載されるものなどの配列に相同であるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供し、抗ＶＥＧＦ結合部分は眼科的標的に結合し、表２又は３及び実施例に記載されるものの所望の機能的特性を保持する。表２又は３に記載されるもののＶＨ及びＶＬ領域に対して、１００％未満の配列同一性を有するＶＨ及びＶＬ領域を有する抗ＶＥＧＦ結合部分は、表２又は３に記載の核酸分子の変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲによる変異誘発）、続いて本明細書及び米国特許出願公開第２０１２００１４９５８号明細書に記載される機能的アッセイを使用して、保持された機能についてコード化され、変更された抗体を試験することによって得ることができる。表２又は３に記載される重鎖及び軽鎖に対して、高い（すなわち、８０％以上）同一性を有する重鎖及び軽鎖を有する抗ＶＥＧＦ結合部分は、そのようなポリペプチドをコード化する核酸分子の変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲによる変異誘発）、続いて本明細書に記載される機能的アッセイを使用して、保持された機能についてコード化され、変更された抗体を試験することによって得ることができる。

本開示の抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１０１及び１１２に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ＣＤＲ又はフレームワーク領域内に変動性があり得ることが企図される。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１０１及び１１２に記載されるような、アミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、表２に提供されるようなＮＶＳ８であるか、又は表３に提供されるようなＮＶＳ１１～ＮＶＳ１４のいずれか１つに含まれる。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１０１及び１１２のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ又は３つの改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、１０を超える改変（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有さないアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。別の態様では、アミノ酸配列における違いは、相補性決定領域内にはない。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分のＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１０２及び１１３に記載されるような、核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、表２に提供されるようなＮＶＳ８である。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分のＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１１７及び１２３に記載されるような、核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、表３に提供されるような、ＮＶＳ１１中に含まれる。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分のＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１２８及び１３３に記載されるような、核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、表３に提供されるような、ＮＶＳ１２中に含まれる。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分のＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１３８及び１４３に記載されるような、核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、表３に提供されるような、ＮＶＳ１３中に含まれる。

一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分のＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１４８及び１５２に記載されるような、核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、表３に提供されるような、ＮＶＳ１４中に含まれる。

一態様では、本開示の抗ＶＥＧＦ結合部分は、１）それぞれ配列番号９２、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号９５、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号９６、９７、９４、１０８、１０９、及び１１０（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号９８、９９、１００、１１１、１０９、及び１０７（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、２）それぞれ配列番号１０１及び１１２に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬと、を含む。別の態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、表２に提供されるようなＮＶＳ８であるか、又は表３に提供されるようなＮＶＳ１１～ＮＶＳ１４のいずれか１つに含まれる。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

一態様では、本開示の抗ＶＥＧＦ結合部分（例えば、ＶＥＧＦ活性を阻害する抗ＶＥＧＦ結合部分）は、それぞれ配列番号１０３及び１１４に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１０３及び１１４に記載されるような、アミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖を含む。別の態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、表２に提供されるようなＮＶＳ８である。別の態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号１０４及び１１５に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性又は相補性を有する核酸配列によってコード化される。一態様では、抗ＶＥＧＦ結合部分は、それぞれ配列番号１０４及び１１５に記載されるような、核酸配列によってコード化される重鎖及び軽鎖を含み、表２に提供されるようなＮＶＳ８である。

ｃ）二重特異性結合分子
特定の態様では、本発明は、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子である。本開示において、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子が提供され、１）抗ＢＴＣ結合部分が、表１に記載されるような抗ＢＴＣ抗体（例えば、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、又はＮＶＳ４）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、２）抗ＶＥＧＦ結合部分が、表２又は３に記載されているような抗ＶＥＧＦ抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。一態様では、多重特異性結合分子は、表３に提供されるようなＮＶＳ１１である。

本開示において、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子が提供され、１）抗ＢＴＣ結合部分が、１）それぞれ配列番号１、２、３、１４、１５、及び１６（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号４、２、３、１４、１５、及び１６（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号５、６、３、１７、１８、及び１９（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号７、８、９、２０、１８、及び１６（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、並びに２）抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号９２、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号９５、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号９６、９７、９４、１０８、１０９、及び１１０（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号９８、９９、１００、１１１、１０９、及び１０７（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含む。一態様では、多重特異性結合分子は、表３に提供されるようなＮＶＳ１１である。一態様では、そのような多重特異性結合分子は、１）ヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合し、且つＢＴＣ活性を阻害し（例えば、部分的に阻害し）、２）ヒトＶＥＧＦタンパク質に選択的に結合し、且つＶＥＧＦ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

また本開示において、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子が提供され、１）抗ＢＴＣ結合部分が、１）それぞれ配列番号２５、２６、２７、３８、３９、及び４０（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号２８、２６、２７、３８、３９、及び４０（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号２９、３０、２７、４１、４２、及び４３（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号３１、３２、３３、４４、４２、及び４０（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、並びに２）抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号９２、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号９５、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号９６、９７、９４、１０８、１０９、及び１１０（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号９８、９９、１００、１１１、１０９、及び１０７（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含む。一態様では、多重特異性結合分子は、表３に提供されるようなＮＶＳ１２である。

また本開示において、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子が提供され、１）抗ＢＴＣ結合部分が、１）それぞれ配列番号２５、４９、５０、５８、５９、及び６０（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号２８、４９、５０、５８、５９、及び６０（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号２９、５１、５０、６１、６２、及び６３（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号３１、５２、５３、６４、６２、及び６０（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、並びに２）抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号９２、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号９５、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号９６、９７、９４、１０８、１０９、及び１１０（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号９８、９９、１００、１１１、１０９、及び１０７（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含む。一態様では、多重特異性結合分子は、表３に提供されるようなＮＶＳ１３である。

また本開示において、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子が提供され、１）抗ＢＴＣ結合部分が、１）それぞれ配列番号６９、７０、７１、８２、８３、及び８４（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号７２、７０、７１、８２、８３、及び８４（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号７３、７４、７１、８５、１８、及び８６（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号７５、７６、７７、８７、１８、及び８４（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、並びに２）抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号９２、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７（組み合わせ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号９５、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）；それぞれ配列番号９６、９７、９４、１０８、１０９、及び１１０（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）；又はそれぞれ配列番号９８、９９、１００、１１１、１０９、及び１０７（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）を含む。一態様では、多重特異性結合分子は、表３に提供されるようなＮＶＳ１４である。

一態様では、本開示の多重特異性結合分子は、１）ＢＴＣに結合するＶＨＡ及びＶＬＡであって、ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号１０及び２１に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＡ及びＶＬＡと、２）ＶＥＧＦに結合するＶＨＢ及びＶＬＢであって、ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１０１及び１１２に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＢ及びＶＬＢと、を含む。別の態様では、本開示の多重特異性結合分子は、１）それぞれ配列番号１０及び２１のアミノ酸配列を含むＢＴＣに結合するＶＨＡ及びＶＬＡと、２）それぞれ配列番号１０１及び１１２のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦに結合するＶＨＢ及びＶＬＢと、を含む。別の態様では、ＶＨＡ及びＶＬＡは、それぞれ配列番号１１６及び１２２に対して、約少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％，又は１００％の配列同一性の核酸配列によってコード化される。別の態様では、ＶＨＢ及びＶＬＢは、それぞれ配列番号１１７及び１２３に対して、約少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％，又は１００％の配列同一性の核酸配列によってコード化される。一態様では、多重特異性結合分子は、表３に提供されるようなＮＶＳ１１である。一態様では、そのような多重特異性結合分子は、１）ヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合し、且つＢＴＣ活性を阻害し（例えば、部分的に阻害し）、２）ヒトＶＥＧＦタンパク質に選択的に結合し、且つＶＥＧＦ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

一態様では、本開示の多重特異性結合分子は、１）ＢＴＣに結合するＶＨＡ及びＶＬＡであって、ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号３４及び４５に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＡ及びＶＬＡと、２）ＶＥＧＦに結合するＶＨＢ及びＶＬＢであって、ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１０１及び１１２に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＢ及びＶＬＢと、を含む。別の態様では、本開示の多重特異性結合分子は、１）それぞれ配列番号３４及び４５のアミノ酸配列を含むＢＴＣに結合するＶＨＡ及びＶＬＡと、２）それぞれ配列番号１０１及び１１２のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦに結合するＶＨＢ及びＶＬＢと、を含む。別の態様では、ＶＨＡ及びＶＬＡは、それぞれ配列番号１２７及び１３２に対して、約少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％，又は１００％の配列同一性の核酸配列によってコード化される。別の態様では、ＶＨＢ及びＶＬＢは、それぞれ配列番号１２８及び１３３に対して、約少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％，又は１００％の配列同一性の核酸配列によってコード化される。一態様では、多重特異性結合分子は、表３に提供されるようなＮＶＳ１２である。一態様では、そのような多重特異性結合分子は、１）ヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合し、且つＢＴＣ活性を阻害し（例えば、部分的に阻害し）、２）ヒトＶＥＧＦタンパク質に選択的に結合し、且つＶＥＧＦ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

一態様では、本開示の多重特異性結合分子は、１）ＢＴＣに結合するＶＨＡ及びＶＬＡであって、ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号５４及び６５に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＡ及びＶＬＡと、２）ＶＥＧＦに結合するＶＨＢ及びＶＬＢであって、ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１０１及び１１２に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＢ及びＶＬＢと、を含む。別の態様では、本開示の多重特異性結合分子は、１）それぞれ配列番号５４及び６５のアミノ酸配列を含むＢＴＣに結合するＶＨＡ及びＶＬＡと、２）それぞれ配列番号１０１及び１１２のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦに結合するＶＨＢ及びＶＬＢと、を含む。別の態様では、ＶＨＡ及びＶＬＡは、それぞれ配列番号１３７及び１４２に対して、約少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％，又は１００％の配列同一性の核酸配列によってコード化される。別の態様では、ＶＨＢ及びＶＬＢは、それぞれ配列番号１３８及び１４３に対して、約少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％，又は１００％の配列同一性の核酸配列によってコード化される。一態様では、多重特異性結合分子は、表３に提供されるようなＮＶＳ１３である。一態様では、そのような多重特異性結合分子は、１）ヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合し、且つＢＴＣ活性を阻害し（例えば、部分的に阻害し）、２）ヒトＶＥＧＦタンパク質に選択的に結合し、且つＶＥＧＦ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

一態様では、本開示の多重特異性結合分子は、１）ＢＴＣに結合するＶＨＡ及びＶＬＡであって、ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号７８及び８８に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＡ及びＶＬＡと、２）ＶＥＧＦに結合するＶＨＢ及びＶＬＢであって、ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１０１及び１１２に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨＢ及びＶＬＢと、を含む。別の態様では、本開示の多重特異性結合分子は、１）それぞれ配列番号７８及び８８のアミノ酸配列を含むＢＴＣに結合するＶＨＡ及びＶＬＡと、２）それぞれ配列番号１０１及び１１２のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦに結合するＶＨＢ及びＶＬＢと、を含む。別の態様では、ＶＨＡ及びＶＬＡは、それぞれ配列番号１４７及び１５１に対して、約少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％，又は１００％の配列同一性の核酸配列によってコード化される。別の態様では、ＶＨＢ及びＶＬＢは、それぞれ配列番号１４８及び１５２に対して、約少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％，又は１００％の配列同一性の核酸配列によってコード化される。一態様では、多重特異性結合分子は、表３に提供されるようなＮＶＳ１４である。一態様では、そのような多重特異性結合分子は、１）ヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合し、且つＢＴＣ活性を阻害し（例えば、部分的に阻害し）、２）ヒトＶＥＧＦタンパク質に選択的に結合し、且つＶＥＧＦ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

本開示の多重特異性結合分子は、１）ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖であって、重鎖が、配列番号１２０に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖と、２）ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖であって、軽鎖が、配列番号１２５に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。一態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号１２１及び１２６に対して、約少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００の配列同一性の核酸配列によってコード化される。一態様では、多重特異性結合分子は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含み、表３に提供されるＮＶＳ１１に記載されるように、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。一態様では、そのような多重特異性結合分子は、１）ヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合し、且つＢＴＣ活性を阻害し（例えば、部分的に阻害し）、２）ヒトＶＥＧＦタンパク質に選択的に結合し、且つＶＥＧＦ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

本開示の多重特異性結合分子は、１）ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖であって、重鎖が、配列番号１３０に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖と、２）ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖であって、軽鎖が、配列番号１３５に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。一態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号１３１及び１３６に対して、約少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００の配列同一性の核酸配列によってコード化される。一態様では、多重特異性結合分子は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含み、表３に提供されるＮＶＳ１２に記載されるように、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む。一態様では、そのような多重特異性結合分子は、１）ヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合し、且つＢＴＣ活性を阻害し（例えば、部分的に阻害し）、２）ヒトＶＥＧＦタンパク質に選択的に結合し、且つＶＥＧＦ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

本開示の多重特異性結合分子は、１）ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖であって、重鎖が、配列番号１４０に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖と、２）ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖であって、軽鎖が、配列番号１４５に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。一態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号１４１及び１４６に対して、約少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００の配列同一性の核酸配列によってコード化される。一態様では、多重特異性結合分子は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含み、表３に提供されるＮＶＳ１３に記載されるように、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１４０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む。一態様では、そのような多重特異性結合分子は、１）ヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合し、且つＢＴＣ活性を阻害し（例えば、部分的に阻害し）、２）ヒトＶＥＧＦタンパク質に選択的に結合し、且つＶＥＧＦ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

本開示の多重特異性結合分子は、１）ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖であって、重鎖が、配列番号１４９に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖と、２）ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖であって、軽鎖が、配列番号１５４に対して、約少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖と、を含む。一態様では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号１５０及び１５５に対して、約少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００の配列同一性の核酸配列によってコード化される。一態様では、多重特異性結合分子は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含み、表３に提供されるＮＶＳ１４に記載されるように、第１のポリペプチド鎖は、配列番号１４９のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む。一態様では、そのような多重特異性結合分子は、１）ヒトＢＴＣタンパク質に選択的に結合し、且つＢＴＣ活性を阻害し（例えば、部分的に阻害し）、２）ヒトＶＥＧＦタンパク質に選択的に結合し、且つＶＥＧＦ活性を阻害する（例えば、部分的に阻害する）。

本開示の多重特異性結合分子（例えば、ＮＶＳ１１～ＮＶＳ１４）は：
ａ．ＢＴＣ及びＶＥＧＦに同時に結合することができ；
ｂ．可溶性ＢＴＣのＥｒｂＢ１若しくはＥｒＢ４への結合、及びその後のＥｒｂ受容体のリン酸化を阻害することができ；
ｃ．ＥＲＫ１／２の可溶性ＢＴＣ誘発リン酸化を阻害することができ；
ｄ．膜結合ＢＴＣに結合し、ＥｒｂＢ１の膜結合ＢＴＣ誘発リン酸化のジャクスタクリン活性化を阻害することができ；
ｅ．可溶性ＶＥＧＦ－Ａ１６５の可溶性ＶＥＧＦＲ２への結合を阻害することができ；
ｆ．インビトロ外側ＢＲＢモデルにおいて、ＢＴＣ誘発ヒトｉＰＳＣ誘導ＲＰＥ透過性を阻害することができ；
ｇ．インビトロ内側ＢＲＢモデルにおいて、ＶＥＧＦ誘発ヒト網膜内皮細胞（ＨＲＥＣ）透過性を阻害することができ；
ｈ．ＢＴＣ誘発網膜肥厚を阻害することができ；及び／又は
ｉ．ＶＥＧＦ誘発網膜血管漏出を阻害することができる。

ｖ．リンカー
本開示のある特定の態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、リンカーによって分子、例えば、抗ＶＥＧＦ結合部分に連結され得る。より具体的には、抗ＢＴＣ結合部分は、最適化された長さ及び／又はアミノ酸組成を有するペプチドリンカー（例えば、（Ｇｌｙ_ｎ－Ｓｅｒ_ｎ）_ｎ又は（Ｓｅｒ_ｎ－Ｇｌｙ_ｎ）_ｎリンカー）によって、タンパク質又は核酸によって連結されてもよい。ペプチドリンカー長は、連結されているタンパク質がどのように折り畳まれ、相互作用するかに大きく影響を及ぼし得ることが知られている。リンカーの配向及びサイズの例に関しては、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号明細書、同第２００５／０１７５６０６号明細書、同第２００７／００１４７９４号明細書、並びにＰＣＴ公開国際公開第２００６／０２０２５８号パンフレット及び国際公開第２００７／０２４７１５号パンフレットを参照されたい。

ペプチドリンカー配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又はそれ以上のアミノ酸残基の長さであり得る。ペプチドリンカー配列は、天然に存在するアミノ酸、又は天然に存在しないアミノ酸から構成され得る。いくつかの態様では、リンカーは、グリシンポリマーである。いくつかの態様では、アミノ酸のグリシン及びセリンは、リンカー配列内のアミノ酸を含む。ある特定の態様では、リンカー領域は、グリシンリピートのセット（ＧｌｙＳｅｒＧｌｙ_３）_ｎを含み、式中、ｎは１以上の正の整数であり、例えば、ｎ＝３（配列番号１１８）である。より具体的には、リンカー配列は、ＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号１６５）であり得る。或いは、リンカー配列は、ＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙ（配列番号１６６）であり得る。ある特定の他の態様では、リンカー領域配向は、グリシンリピートのセット（ＳｅｒＧｌｙ_３）_ｎを含み、式中、ｎは１以上の正の整数であり、例えば、ｎ＝３（配列番号１６７）である。

ペプチドリンカーとしてはまた、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４（配列番号１６１）又は（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号１６２）を挙げることができるが、これらに限定されない。アミノ酸残基Ｇｌｕ及びＬｙｓは、より良好な溶解性のために、Ｇｌｙ－Ｓｅｒペプチドリンカー内に散在させることができる。ある特定の態様では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ_２Ｓｅｒ）、又は（ＧｌｙＳｅｒ）の多重リピートを含むことができる。ある特定の態様では、ペプチドリンカーは、（ＳｅｒＧｌｙ_３）、（ＳｅｒＧｌｙ_２）、又は（ＳｅｒＧｌｙ）の多重リピートを含むことができる。他の態様では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）＋（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）＋（ＧｌｙＳｅｒ）（配列番号１６３）の倍数組を含むことができる。更に他の態様では、ＳｅｒはＡｌａで置き換えることができ、例えば、（Ｇｌｙ_４Ａｌａ）又は（Ｇｌｙ_３Ａｌａ）である。更に他の態様では、リンカーはモチーフ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）_ｎ（配列番号１６４）を含み、式中、ｎは１以上の整数である。ある特定の態様では、ペプチドリンカーはまた、切断可能なリンカーを含み得る。

ペプチドリンカーは、様々な長さのものであり得る。特に、ペプチドリンカーは、約５～約５０アミノ酸の長さ、約１０～約４０アミノ酸の長さ、約１５～約３０のアミノ酸の長さ、又は約１５～約２０のアミノ酸の長さである。ペプチドリンカーの長さにおける変化は、活性を維持又は増強することができ、活性試験において優れた有効性をもたらす。ペプチドリンカーは、当該技術分野において既知の技術を使用して、ポリペプチド及びタンパク質配列中に導入することができる。例えば、ＰＣＲ変異誘発を使用することができる。改変は、ＤＮＡ配列分析によって確認することができる。プラスミドＤＮＡを使用して、産生されるポリペプチドの安定な産生のために、宿主細胞を形質転換することができる。

ペプチドリンカー、抗ＢＴＣ結合部分及びタンパク質、例えば、抗ＶＥＧＦ結合部分は同じベクター中にコード化され、同じ宿主細胞中で発現且つアセンブリすることができる。或いは、各ペプチドリンカー、抗ＢＴＣ結合部分、抗ＶＥＧＦ結合部分、及びタンパク質若しくは核酸は、別々に生成され、次いで、互いにコンジュゲートすることができる。ペプチドリンカー、抗ＢＴＣ結合部分及びタンパク質若しくは核酸は、当該技術分野において既知の方法を使用して、構成成分をコンジュゲートすることによって調製することができる。部位特異的コンジュゲーションは、ソルターゼ媒介酵素コンジュゲーションを使用して達成することができる（Ｍａｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４ Ｍａｒ １０；１２６（９）：２６７０－１）。様々なカップリング剤又は架橋剤を、共有結合コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８６４８）を参照されたい。他の方法としては、Ｐａｕｌｕｓ，１９８５ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８，１１８－１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１－８３）、及びＧｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７－２３７５）に記載されるものが挙げられる。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡ及びスルホーＳＭＣＣであり、両方ともＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能である。

ｖｉ．多重特性結合分子の形式及びタイプ
いくつかの態様では、多重特異性結合分子は、二重特異性抗体又は二重特異性抗体様分子である。いくつかの態様では、二重特異性抗体又は抗体様分子は、多価、例えば、１つの抗原に対して二価、及び他の抗原に対して一価であり得る。例示的な二重特異性抗体分子又は二重特異性抗体様分子は、第１の抗原又はエピトープ（例えば、ＢＴＣ）に対して結合特異性を有する第１の抗原結合ドメイン（例えば、第１の重鎖及び第１の軽鎖を含む）、及び第２の抗原又はエピトープ（例えば、ＶＥＧＦ）に対して結合特異性を有する第２の抗原結合ドメイン（例えば、第２の重鎖及び第２の軽鎖を含む）によって特徴付けられる。

いくつかの態様では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原上、例えば同じタンパク質（又はある多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある態様では、二重特異性抗体分子又は二重特異性抗体様分子は、第１のエピトープ又は抗原に対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープ又は抗原に対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列とを含む。

いくつかの態様では、二重特異性抗体分子又は抗体様分子は、第１のエピトープ又は抗原に対して結合特異性を有する半抗体と、第２のエピトープ又は抗原に対して結合特異性を有する半抗体とを含む。ある態様では、二重特異性抗体分子又は抗体様分子は、第１のエピトープ又は抗原に対して結合特異性を有する半抗体若しくはその断片と、第２のエピトープ又は抗原に対して結合特異性を有する半抗体若しくはその断片とを含む。

ある態様では、二重特異性抗体分子又は二重特異性抗体様分子は、第１のエピトープ又は抗原に対して結合特異性を有するｓｃＦｖ又はＦａｂ若しくはその断片と、第２のエピトープ又は抗原に対して結合特異性を有する抗体若しくはその断片と、を含む。ある態様では、二重特異性抗体分子又は二重特異性抗体様分子は、第１のエピトープ又は抗原に対して結合特異性を有する２つのｓｃＦｖ又はＦａｂ若しくはその断片と、第２のエピトープ又は抗原に対して結合特異性を有する抗体若しくはその断片と、を含む。ある態様では、二重特異性抗体分子又は二重特異性抗体様分子は、第１のエピトープ又は抗原に対して結合特異性を有するｓｃＦｖ若しくはその断片と、第２のエピトープ又は抗原に対して結合特異性を有するＦａｂ若しくはその断片と、を含む。

ある特定の態様では、抗体又は抗体様分子は、多重特異性（例えば、二重特異性若しくは三重特異性）抗体又は抗体様分子である。二重特異性若しくはヘテロ二量体抗体又は抗体様分子を作製するためのプロトコルは、当技術分野において知られ；例えば、米国特許第５７３１１６８号明細書に記載される「ノブインホール」法；例えば、国際公開第０９／０８９００４号パンフレット、国際公開第０６／１０６９０５号パンフレット及び国際公開第２０１０／１２９３０４号パンフレットに記載されるとおりの静電ステアリングＦｃ対形成；例えば、国際公開第０７／１１０２０５号パンフレットに記載されるとおりの鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ヘテロ二量体形成；例えば、国際公開第０８／１１９３５３号パンフレット、国際公開第２０１１／１３１７４６号パンフレット及び国際公開第２０１３／０６０８６７号パンフレットに記載されるとおりのＦａｂアーム交換；例えば、米国特許第４４３３０５９号明細書に記載されるとおり、例えば、アミン反応性基及びスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性試薬を使用して二重特異性構造を作製する抗体架橋による二重の抗体コンジュゲート；例えば、米国特許第４４４４８７８号明細書に記載されるとおり、２つの重鎖間のジスルフィド結合の還元及び酸化のサイクルにより異なる抗体又は抗体様分子から半抗体（重－軽鎖対又はＦａｂ）を組み合わせることによって作製される二重特異性抗体又は抗体様分子決定基；例えば、米国特許第５２７３７４３号明細書に記載されるとおりの三機能性抗体、例えば、スルフヒドリル反応性基を介して架橋された３つのＦａｂ’断片；例えば、米国特許第５５３４２５４号明細書に記載されるとおりの生合成結合タンパク質、例えば、Ｃ－末端鎖を介して、好ましくはジスルフィド又はアミン反応性の化学的架橋を介して架橋されたｓｃＦｖの対；例えば、米国特許第５５８２９９６号明細書に記載されるとおりの、二機能性抗体、例えば定常ドメインを置き換えたロイシンジッパー（例えば、ｃ－ｆｏｓ及びｃ－ｊｕｎ）を介して二量体化された異なる結合特異性を有するＦａｂ断片；例えば、米国特許第５５９１８２８号明細書に記載されるとおりの二重特異性及びオリゴ特異性一価並びにオリゴ価受容体、例えば、一方の抗体のＣＨ１領域と、通常、軽鎖と会合した他方の抗体のＶ_Ｈ領域との間でポリペプチドスペーサーを介して連結された２つの抗体（２つのＦａｂ断片）のＶ_Ｈ－ＣＨ１領域（Ｆｄ領域）；例えば、米国特許第５６３５６０２号明細書に記載されるとおりの二重特異性ＤＮＡ抗体コンジュゲート、例えば、ＤＮＡの二重鎖の断片を介する抗体又はＦａｂ断片の架橋；例えば、米国特許第５６３７４８１号明細書に記載されるとおりの二重特異性融合タンパク質、例えば、その間に親水性のらせん状ペプチドリンカーを有する２つのｓｃＦｖ及び完全な定常領域を含有する発現コンストラクト；例えば、米国特許第５８３７２４２号明細書に記載されるとおりの多価及び多重特異性結合タンパク質、例えば、一般にダイアボディと呼ばれるＩｇ重鎖可変領域の結合領域を有する第１のドメイン及びＩｇ軽鎖可変領域の結合領域を有する第２のドメインを有するポリペプチドの二量体（二重特異性、三重特異性又は四重特異性分子を生成する高次構造も包含される）；例えば、米国特許第５８３７８２１号明細書に記載されるとおりの、二量体化されて二重特異性／多価分子を形成できる、ペプチドスペーサーにより抗体ヒンジ領域及びＣＨ３領域に更に結合された、連結されたＶ_Ｌ及びＶ_Ｈを有するミニボディコンストラクト；二量体を形成して二重特異性ダイアボディを形成できる、いずれかの向きで短ペプチドリンカー（例えば、５又は１０アミノ酸）により連結された又はリンカーを全く有しないで連結されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメイン；例えば、米国特許第５８４４０９４号明細書に記載されるとおりの三量体及び四量体；例えば、米国特許第５８６４０１９号明細書に記載されるとおりの一連のＦＶ（又はｓｃＦｖ）を形成するＶ_ＬドメインとＣ－末端で更に会合した架橋可能な基を伴ってペプチド結合により結合されたＶ_Ｈドメイン（又はファミリーメンバーにおけるＶ_Ｌドメイン）の連なり；例えば、国際公開第２０１１／０２８９５２号パンフレットに記載されるような、任意にヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む、抗原のうちの１つが一価結合され、抗原のうちの１つが二価結合されているＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメイン、ｓｃＦｖ、又はＦａｂ；並びに、例えば、米国特許第５８６９６２０号明細書に記載されるとおりの、例えば、ｓｃＦｖ又はダイアボディタイプの形式の両方を用いてホモ二価、ヘテロ二価、三価、及び四価構造を形成する非共有結合性又は化学的架橋を介して多価構造に複合されるペプチドリンカーを介して連結したＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインの両方を有する単鎖結合ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

更なる例示的な多重特異性及び二重特異性分子並びにその作製方法は、例えば、米国特許第５９１０５７３号明細書、米国特許第５９３２４４８号明細書、米国特許第５９５９０８３号明細書、米国特許第５９８９８３０号明細書、米国特許第６００５０７９号明細書、米国特許第６２３９２５９号明細書、米国特許第６２９４３５３号明細書、米国特許第６３３３３９６号明細書、米国特許第６４７６１９８号明細書、米国特許第６５１１６６３号明細書、米国特許第６６７０４５３号明細書、米国特許第６７４３８９６号明細書、米国特許第６８０９１８５号明細書、米国特許第６８３３４４１号明細書、米国特許第７１２９３３０号明細書、米国特許第７１８３０７６号明細書、米国特許第７５２１０５６号明細書、米国特許第７５２７７８７号明細書、米国特許第７５３４８６６号明細書、米国特許第７６１２１８１号明細書、米国特許出願公開第２００２００４５８７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００２０７６４０６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００２１０３３４５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００３２０７３４６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００３２１１０７８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００４２１９６４３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００４２２０３８８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００４２４２８４７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５００３４０３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５００４３５２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５０６９５５２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５０７９１７０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５１００５４３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５１３６０４９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５１３６０５１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５１６３７８２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５２６６４２５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６０８３７４７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６１２０９６０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６２０４４９３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６２６３３６７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７００４９０９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７０８７３８１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７１２８１５０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７１４１０４９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７１５４９０１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７２７４９８５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８０５０３７０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８０６９８２０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８１５２６４５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８１７１８５５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８２４１８８４Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８２５４５１２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８２６０７３８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１３０１０６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１４８９０５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１５５２７５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１６２３５９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１６２３６０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１７５８５１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１７５８６７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９２３２８１１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９２３４１０５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９２６３３９２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９２７４６４９Ａ１号明細書、欧州特許出願公開第３４６０８７Ａ２号明細書、国際公開第０００６６０５Ａ２号パンフレット、国際公開第０２０７２６３５Ａ２号パンフレット、国際公開第０４０８１０５１Ａ１号パンフレット、国際公開第０６０２０２５８Ａ２号パンフレット、国際公開第２００７０４４８８７Ａ２号パンフレット、国際公開第２００７０９５３３８Ａ２号パンフレット、国際公開第２００７１３７７６０Ａ２号パンフレット、国際公開第２００８１１９３５３Ａ１号パンフレット、国際公開第２００９０２１７５４Ａ２号パンフレット、国際公開第２００９０６８６３０Ａ１号パンフレット、国際公開第９１０３４９３Ａ１号パンフレット、国際公開第９３２３５３７Ａ１号パンフレット、国際公開第９４０９１３１Ａ１号パンフレット、国際公開第９４１２６２５Ａ２号パンフレット、国際公開第９５０９９１７Ａ１号パンフレット、国際公開第９６３７６２１Ａ２号パンフレット、国際公開第９９６４４６０Ａ１号パンフレットにおいて見出される。上で参照した出願の内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

したがって、いくつかの態様では、本開示のＢＴＣ／ＶＥＧＦ多重特異性結合分子は、ＢＴＣ結合ドメインとＶＥＧＦ結合ドメインとを、当該技術分野において既知であり、全体を通して記載される多重特異性又は二重特異性形式のうちのいずれか１つで含む。本開示の多重特異性結合分子のための好ましい形式は、以下により詳細に記載される。

本開示の多重特異性結合分子は、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含み、抗ＢＴＣ結合部分は、ＢＴＣに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＡ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＡ）を含み、抗ＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＢ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＢ）を含む。一態様では、ＶＨＡとＶＬＡとは、共有結合、例えば、ジスルフィド結合を介して連結されている。一態様では、ＶＨＢとＶＬＢとは、共有結合、例えば、ジスルフィド結合を介して連結されている。一態様では、多重特異性結合分子は、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＡ－リンカー１－ＶＨＢ－Ｃ及びＮ－ＶＬＡ－リンカー２－ＶＬＢ－Ｃの形式である。別の態様では、多重特異性結合分子は、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＢ－リンカー１－ＶＨＡ－Ｃ及びＮ－ＶＬＢ－リンカー２－ＶＬＡ－Ｃの形式である。リンカー１及びリンカー２は、同じであっても異なっていてもよい。

一態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ａ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＡ）を更に含み、抗ＶＥＧＦ結合部分は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ｂ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＢ）を更に含む。一態様では、多重特異性結合分子は、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＡ－ＣＨ１Ａ－リンカー－ＶＨＢ－ＣＨ１Ｂ－Ｃ及びＮ－ＶＬＡ－ＣＫＡ－リンカー－ＶＬＢ－ＣＫＢ－Ｃの形式であり、例えば、表３に提供されるようなＮＶＳ１１、ＮＶＳ１２、ＮＶＳ１３、及びＮＶＳ１４である。別の態様では、多重特異性結合分子は、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＢ－ＣＨ１Ｂ－リンカー－ＶＨＡ－ＣＨ１Ａ－Ｃ及びＮ－ＶＬＢ－ＣＫＢ－リンカー－ＶＬＡ－ＣＫＡ－Ｃの形式である。一態様では、２つのリンカーは同じである。別の態様では、２つのリンカーは異なっている。

ある特定の態様では、ＣＨ１定常領域はＶＨと共に存在し、Ｃκ定常領域はＶＬと共に存在し、これにより、Ｆａｂ断片は、それぞれの軽鎖及び重鎖の二量体化によって形成される（すなわち、ＶＨＡ－ＣＨ１はＶＬＡ－Ｃκを有するＦａｂ断片を形成することになり、ＶＨＢ－ＣＨ１はＶＬＢ－Ｃκを有するＦａｂ断片を形成することになる）。特定の態様では、本開示の多重特異性結合分子は、Ｆａｂ－Ｆａｂ形式であり、この中で、抗ＢＴＣ結合部分及び抗ＶＥＧＦ結合部分の両方は、Ｆａｂ断片を形成する。別の態様では、ＣＨ１定常領域はＶＨと共に存在し、Ｃλ定常領域はＶＬと共に存在し、これにより、Ｆａｂ断片は、それぞれの軽鎖及び重鎖の二量体化によって形成される（すなわち、ＶＨＡ－ＣＨ１はＶＬＡ－Ｃλを有するＦａｂ断片を形成することになり、ＶＨＢ－ＣＨ１はＶＬＢ－Ｃλを有するＦａｂ断片を形成することになる）。

本開示の多重特異性結合分子は、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含み、抗ＢＴＣ結合部分はＦａｂであり、重鎖（ＨＡ）及び軽鎖（ＬＡ）を含み、抗ＶＥＧＦはＦａｂであり、重鎖（ＨＢ）及び軽鎖（ＬＢ）を含む。一態様では、ＨＡとＨＢとは、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＨＡ－リンカー１－ＨＢ－Ｃの形式で連結され、ＬＡとＬＢとは、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＬＡ－リンカー２－ＬＢ－Ｃの形式で連結されている。別の態様では、ＨＡとＨＢとは、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＨＢ－リンカー１－ＨＡ－Ｃの形式で連結され、ＬＡとＬＢとは、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＬＢ－リンカー２－ＬＡ－Ｃの形式で連結されている。リンカー１及びリンカー２は、同じであっても異なっていてもよい。一態様では、リンカー１及びリンカー２は、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１１９の核酸配列によってコード化される。別の態様では、リンカー１及びリンカー２は、配列番号１６１～１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一態様では、本開示のＦａｂ多重特異性結合分子は、図１～２に表示される構造を有する。

一態様では、本開示の二重特異性抗体は、２つのポリペプチド鎖を含み、一方の鎖は、リンカーペプチドによって互いに連結された抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ、及び軽鎖定常領域ＣＬも有する抗ＢＴＣ抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬＢ）（ＶＬＢ－ＣＬ）を含み、他方の鎖は、重鎖定常領域ＣＨ１も有する抗ＢＴＣ抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨＢ）（ＶＨＢ－ＣＨ１）を含む。別の態様では、本開示の二重特異性抗体は、２つのポリペプチド鎖を含み、一方の鎖は、リンカーペプチドによって互いに連結された抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ、及び重鎖定常領域ＣＨ１も有する抗ＢＴＣ抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨＢ）（ＶＨＢ－ＣＨ１）を含み、他方の鎖は、軽鎖定常領域ＣＬも有する抗ＢＴＣ抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬＢ）（ＶＬＢ－ＣＬ）を含む。

ある特定の態様では、本開示の二重特異性抗体の１つのポリペプチド鎖上のｓｃＦｖの配向は、ＮＨ２－ＶＬＢ－ＣＬ－リンカー２－ｓｃＦｖ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨＢ－ＣＨ１－リンカー２－ｓｃＦｖ－ＣＯＯＨであり得る。一態様では、ｓｃＦｖ上のＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカー配列は、（ＧＧＧＧＳ）_４の配列（配列番号６３）を有し、ＶＬ及びＶＨが、ＮＨ２－ＶＬＡ－リンカー２－ＶＨＡ－ＣＯＯＨの形式である。

別の態様では、本開示の二重特異性抗体の結合ドメインのうちの一方は、Ｆａｂを形成し、他方の結合ドメインは、一本鎖（ｓｃＦｖ）抗体断片を形成する。当業者であれば、示されたものに加えて、他の配向が可能であることを認識するであろう。例えば、ｓｃＦｖ－Ｆａｂ形式が可能であり、又は結合特異性を再編成することができる。

いくつかの態様では、多重特異性結合分子は、二重特異性抗体又は二重特異性抗体様分子である。別の態様では、本開示は、ＢＴＣに対して特異性を有するドメイン（すなわち、抗ＢＴＣ結合部分）、及び別の治療標的、例えば、ＶＥＧＦに対して特異性を有する別のドメイン（治療標的結合部分）を含む多重特異性分子を特徴とする。例えば、多重特異性分子は、抗ＢＴＣ結合部分、抗体、又はその抗原結合断片と本開示の核酸部分とを含むことができる。抗ＢＴＣ抗体は、例えば、米国特許第６１８３９７１号明細書及び国際公開第２００４／０８３２４１Ａ２号パンフレットに記載されるように、当該技術分野において既知である。

本開示の抗体、又はその抗原結合断片は、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、別の機能的分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、別の抗体又は受容体に対するリガンド）に誘導体化されるか、又はそれに連結され得る。本開示の抗体は、実際には、３つ以上の異なる結合部位及び／又は標的分子に結合する多重特異性分子（そのような多重特異性分子も本明細書で使用される「二重特異性分子」という用語によって包含されることが意図される）を生成するために、２つ以上の他の機能的分子に誘導体化されるか、又は連結され得る。本開示の二重特異性分子を作り出すために、本開示の抗体は、別の抗体、抗原結合断片、ペプチド、又は結合ミメティックなどの１つ以上の他の結合分子に機能的に連結することができ（例えば、化学結合、遺伝子融合、非共有結合又は他のものによって）、これにより二重特異性分子をもたらす。

したがって、本開示は、少なくとも１つのＢＴＣに対する第１の結合特異性、及び第２の標的エピトープ、例えば、別の治療標的に対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。例えば、第２の標的エピトープは、ＶＥＧＦのエピトープである。

一態様では、多重特異性結合分子内に含まれる抗ＢＴＣ結合部分及び抗ＶＥＧＦ結合部分は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む形式である。別の態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、抗ＢＴＣ Ｆａｂであり、抗ＶＥＧＦ結合部分は、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂである。別の態様では、抗ＢＴＣ結合部分は、ｓｃＦｖであり、抗ＶＥＧＦ結合部分は、ｓｃＦｖである。多重特異性結合分子内に含まれる抗ＢＴＣ結合部分及び抗ＶＥＧＦ結合部分はまた、軽鎖若しくは重鎖二量体、又はＦｖ若しくはＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号明細書に記載されるような一本鎖構築物などのその任意の最小断片であり得る。

一態様では、本開示の多重特異性結合分子は、ダイアボディであり得る。ダイアボディは、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによって連結された、その中のＶＨ及びＶＬドメインが、一本鎖ポリペプチド上で表される二価の二重特異性分子である。ＶＨ及びＶＬドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合し、それによって２つの抗原結合部位を作り出す（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８；Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３を参照されたい）。ダイアボディは、構造ＶＨＡ－ＶＬＢ及びＶＨＢ－ＶＬＡ（ＶＨ－ＶＬ構成）、又はＶＬＡ－ＶＨＢ及びＶＬＢ－ＶＨＡ（ＶＬ－ＶＨ構成）のいずれかを有する２つのポリペプチド鎖を同じ細胞内で発現させることによって産生することができる。それらの大部分は、細菌中で、可溶性形態で発現され得る。一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を、約１５アミノ酸残基のリンカーと連結することによって産生される（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９７ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４５（３－４）：１２８－３０；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２（１）：２１－３６を参照されたい）。ｓｃＤｂは、可溶性の活性単量体形態で、細菌中で発現され得る（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９７ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４５（３４）：１２８－３０；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２（１）：２１－３６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｐａｃｋ，１９９７ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２）：８３－１０５；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９（７）：６１７－２１を参照されたい）。ダイアボディは、Ｆｃに融合されて「ジダイアボディ」を生成することができる（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（４）：２８５６－６５を参照されたい）。本開示の二重特異性分子で用いることができる他の抗体は、ネズミ、キメラ、及びヒト化モノクローナル抗体である。

二重特異性若しくはヘテロ二量体抗体又は抗体様分子を作製するためのプロトコルは、当技術分野において知られ；例えば、米国特許第５７３１１６８号明細書に記載される「ノブインホール」法；例えば、国際公開第０９／０８９００４号パンフレット、国際公開第０６／１０６９０５号パンフレット及び国際公開第２０１０／１２９３０４号パンフレットに記載されるとおりの静電ステアリングＦｃ対形成；例えば、国際公開第０７／１１０２０５号パンフレットに記載されるとおりの鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ヘテロ二量体形成；例えば、国際公開第０８／１１９３５３号パンフレット、国際公開第２０１１／１３１７４６号パンフレット及び国際公開第２０１３／０６０８６７号パンフレットに記載されるとおりのＦａｂアーム交換；例えば、米国特許第４４３３０５９号明細書に記載されるとおり、例えば、アミン反応性基及びスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性試薬を使用して二重特異性構造を作製する抗体架橋による二重の抗体コンジュゲート；例えば、米国特許第４４４４８７８号明細書に記載されるとおり、２つの重鎖間のジスルフィド結合の還元及び酸化のサイクルにより異なる抗体又は抗体様分子から半抗体（重－軽鎖対又はＦａｂ）を組み合わせることによって作製される二重特異性抗体又は抗体様分子決定基；例えば、米国特許第５２７３７４３号明細書に記載されるとおりの三機能性抗体、例えば、スルフヒドリル反応性基を介して架橋された３つのＦａｂ’断片；例えば、米国特許第５５３４２５４号明細書に記載されるとおりの生合成結合タンパク質、例えば、Ｃ－末端鎖を介して、好ましくはジスルフィド又はアミン反応性の化学的架橋を介して架橋されたｓｃＦｖの対；例えば、米国特許第５５８２９９６号明細書に記載されるとおりの、二機能性抗体、例えば定常ドメインを置き換えたロイシンジッパー（例えば、ｃ－ｆｏｓ及びｃ－ｊｕｎ）を介して二量体化された異なる結合特異性を有するＦａｂ断片；例えば、米国特許第５５９１８２８号明細書に記載されるとおりの二重特異性及びオリゴ特異性一価並びにオリゴ価受容体、例えば、一方の抗体のＣＨ１領域と、通常、軽鎖と会合した他方の抗体のＶＨ領域との間でポリペプチドスペーサーを介して連結された２つの抗体（２つのＦａｂ断片）のＶＨ－ＣＨ１領域（Ｆｄ領域）；例えば、米国特許第５６３５６０２号明細書に記載されるとおりの二重特異性ＤＮＡ抗体コンジュゲート、例えば、ＤＮＡの二重鎖の断片を介する抗体又はＦａｂ断片の架橋；例えば、米国特許第５６３７４８１号明細書に記載されるとおりの二重特異性融合タンパク質、例えば、その間に親水性のらせん状ペプチドリンカーを有する２つのｓｃＦｖ及び完全な定常領域を含有する発現コンストラクト；例えば、米国特許第５８３７２４２号明細書に記載されるとおりの多価及び多重特異性結合タンパク質、例えば、一般にダイアボディと呼ばれるＩｇ重鎖可変領域の結合領域を有する第１のドメイン及びＩｇ軽鎖可変領域の結合領域を有する第２のドメインを有するポリペプチドの二量体（二重特異性、三重特異性又は四重特異性分子を生成する高次構造も包含される）；例えば、米国特許第５８３７８２１号明細書に記載されるとおりの、二量体化されて二重特異性／多価分子を形成できる、ペプチドスペーサーにより抗体ヒンジ領域及びＣＨ３領域に更に結合された、連結されたＶＬ及びＶＨを有するミニボディコンストラクト；二量体を形成して二重特異性ダイアボディを形成できる、いずれかの向きで短ペプチドリンカー（例えば、５又は１０アミノ酸）により連結された又はリンカーを全く有しないで連結されたＶＨ及びＶＬドメイン；例えば、米国特許第５８４４０９４号明細書に記載されるとおりの三量体及び四量体；例えば、米国特許第５８６４０１９号明細書に記載されるとおりの一連のＦＶ（又はｓｃＦｖ）を形成するＶＬドメインとＣ－末端で更に会合した架橋可能な基を伴ってペプチド結合により結合されたＶＨドメイン（又はファミリーメンバーにおけるＶＬドメイン）の連なり；例えば、国際公開第２０１１／０２８９５２号パンフレットに記載されるような、任意にヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む、抗原のうちの１つが一価結合され、抗原のうちの１つが二価結合されているＶＬ及びＶＨドメイン、ｓｃＦｖ、又はＦａｂ；並びに、例えば、米国特許第５８６９６２０号明細書に記載されるとおりの、例えば、ｓｃＦｖ又はダイアボディタイプの形式の両方を用いてホモ二価、ヘテロ二価、三価、及び四価構造を形成する非共有結合性又は化学的架橋を介して多価構造に複合されるペプチドリンカーを介して連結したＶＬ及びＶＨドメインの両方を有する単鎖結合ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

更なる例示的な多重特異性及び二重特異性分子並びにその作製方法は、例えば、米国特許第５９１０５７３号明細書、米国特許第５９３２４４８号明細書、米国特許第５９５９０８３号明細書、米国特許第５９８９８３０号明細書、米国特許第６００５０７９号明細書、米国特許第６２３９２５９号明細書、米国特許第６２９４３５３号明細書、米国特許第６３３３３９６号明細書、米国特許第６４７６１９８号明細書、米国特許第６５１１６６３号明細書、米国特許第６６７０４５３号明細書、米国特許第６７４３８９６号明細書、米国特許第６８０９１８５号明細書、米国特許第６８３３４４１号明細書、米国特許第７１２９３３０号明細書、米国特許第７１８３０７６号明細書、米国特許第７５２１０５６号明細書、米国特許第７５２７７８７号明細書、米国特許第７５３４８６６号明細書、米国特許第７６１２１８１号明細書、米国特許出願公開第２００２００４５８７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００２０７６４０６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００２１０３３４５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００３２０７３４６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００３２１１０７８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００４２１９６４３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００４２２０３８８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００４２４２８４７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５００３４０３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５００４３５２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５０６９５５２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５０７９１７０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５１００５４３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５１３６０４９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５１３６０５１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５１６３７８２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５２６６４２５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６０８３７４７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６１２０９６０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６２０４４９３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６２６３３６７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７００４９０９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７０８７３８１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７１２８１５０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７１４１０４９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７１５４９０１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７２７４９８５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８０５０３７０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８０６９８２０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８１５２６４５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８１７１８５５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８２４１８８４Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８２５４５１２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８２６０７３８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１３０１０６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１４８９０５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１５５２７５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１６２３５９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１６２３６０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１７５８５１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１７５８６７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９２３２８１１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９２３４１０５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９２６３３９２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９２７４６４９Ａ１号明細書、欧州特許出願公開第３４６０８７Ａ２号明細書、国際公開第０００６６０５Ａ２号パンフレット、国際公開第０２０７２６３５Ａ２号パンフレット、国際公開第０４０８１０５１Ａ１号パンフレット、国際公開第０６０２０２５８Ａ２号パンフレット、国際公開第２００７０４４８８７Ａ２号パンフレット、国際公開第２００７０９５３３８Ａ２号パンフレット、国際公開第２００７１３７７６０Ａ２号パンフレット、国際公開第２００８１１９３５３Ａ１号パンフレット、国際公開第２００９０２１７５４Ａ２号パンフレット、国際公開第２００９０６８６３０Ａ１号パンフレット、国際公開第９１０３４９３Ａ１号パンフレット、国際公開第９３２３５３７Ａ１号パンフレット、国際公開第９４０９１３１Ａ１号パンフレット、国際公開第９４１２６２５Ａ２号パンフレット、国際公開第９５０９９１７Ａ１号パンフレット、国際公開第９６３７６２１Ａ２号パンフレット、国際公開第９９６４４６０Ａ１号パンフレットにおいて見出される。上で参照した出願の内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

二重特異性分子は、当該技術分野において既知の方法を使用して、結合特異性成分をコンジュゲートすることによって調製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性成分は別々に生成され、次いで、互いにコンジュゲートされ得る。

結合特異性成分が抗体である場合、それらは２つの重鎖のＣ－末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートされ得る。特定の態様では、ヒンジ領域は、コンジュゲーションの前に奇数のスルフヒドリル残基、例えば、１つのスルフヒドリル残基を含有するように改変される。或いは、両方の結合特異性成分は、同じベクター内でコード化され、同じ宿主細胞中で発現及びアセンブリされ得る。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２、リガンド×Ｆａｂ、抗ＢＴＣ抗体若しくはその機能的断片×ｍＡｂ、Ｃｒｏｓｓｍａｂフォーマット、ＢＩＴＥフォーマット、抗ＢＴＣ抗体若しくはその機能的断片×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本開示の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体及び結合決定基を含む一本鎖分子、又は２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含むことができる。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；及び米国特許第５，４８２，８５８号明細書に記載されている。

多重特異性結合又は多価分子のそれらの特定の標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、又はウエスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイの各々は、一般に、目的の複合体に特異的な標識試薬（例えば、抗体）を用いることによって、特定の目的のタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。

別の態様では、本開示は、ＢＴＣなどの標的に結合する本開示の抗体の少なくとも２つの同一又は異なる抗原結合部分を含む多価分子を提供する。更なる態様では、本開示は、ＢＴＣ結合部分及び／又は治療標的結合部分の少なくとも２つの同一又は異なる抗原結合部分を含む多価化合物を提供する。抗原結合部分は、タンパク質融合又は共有性若しくは非共有性結合を介して、互いに結合され得る。或いは、連結の方法は、多重特異性分子について記載されている。四価化合物は、例えば、本開示の抗体を、本開示の抗体の定常領域、例えば、Ｆｃ又はヒンジ領域に結合する抗体と架橋結合することによって得ることができる。

ｖｉｉ．本開示の分子の改変
本出願は、可変領域及び／又は定常領域中に様々な改変を有する、本明細書に記載の分子及び／若しくはその断片のバリアント、並びに開示された分子の融合体及びコンジュゲートを含む。例えば、開示された多重特異性結合分子のＦｃ領域、例えば、ＣＨ１及び／又はＣκは、野生型であり得るか、又はそれは様々な結果を達成するために改変され得る。Ｆｃに対する好ましい改変としては、半減期延長のための「ＬＳ」変異（Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、（ＥＵ番号付け））及び「ＹＴＥ」変異（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ（ＥＵ番号付け））、エフェクターサイレンシングのための「ＤＡＰＡ」変異（Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ（ＥＵ番号付け））、並びに適切な鎖対形成を促進するノブインホール変異（例えば、ノブＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ；ホールＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け））が挙げられる。

Ｆｃ領域もまた、例えば、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を媒介するＢＴＣ結合分子の能力を低減させるか又は消去するために、エフェクター機能を「抑制（ｓｉｌｅｎｃｅ）」するように改変され得る。これは、例えば、Ｆｃ領域中に変異を導入することによって達成され得る。このような変異は当該技術分野において記載されている：ＬＡＬＡ及びＮ２９７Ａ（Ｓｔｒｏｈｌ，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（６）：６８５－６９１）；並びにＤ２６５Ａ（Ｂａｕｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：６６６４－６９；Ｓｔｒｏｈｌ、上記）。サイレントなＦｃ ＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列においてＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を含む、いわゆるＬＡＬＡ変異体を含む。サイレントなＩｇＧ１抗体の別の例は、Ｄ２６５Ａ変異を含む。別のサイレントなＩｇＧ１抗体は、ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列においてＤ２６５Ａ及びＰ３２９Ａを含む、いわゆるＤＡＰＡ変異体を含む。別のサイレントなＩｇＧ１抗体は、アグリコシル化／非グリコシル化抗体をもたらすＮ２９７Ａ変異を含む。

本開示の抗ＢＴＣ抗体若しくはその抗原結合断片及び／又は多重特異性結合分子のＶＨ及びＶＬドメインの各々は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む。ある特定の態様では、これらのＣＤＲ配列のうちの１つ以上は、アミノ酸配列の保存的改変を有し、改変された分子は、親抗体と比較して、増強された結合特性を保持又は有する。

加えて、特定の場合には、フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、抗体の抗原結合能力を維持又は増強することが有益であると見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。本開示の分子は、結合特性を改善するために、そのような変異をその可変領域フレームワークに導入することによって改変することができる。

可変領域改変の別の種類は、「親和性成熟」として公知の、ＶＨ ＣＤＲ１ドメイン内、ＶＨ ＣＤＲ２ドメイン内、及び／若しくはＶＨ ＣＤＲ３ドメイン内、並びに／又はＶＬ ＣＤＲ１ドメイン内、ＶＬ ＣＤＲ２ドメイン内、及び／若しくはＶＬ ＣＤＲ３ドメイン内のアミノ酸残基を変異させて、これにより、目的の分子（例えば、抗体又は抗体様分子）の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善することである。部位特異的変異誘発又はＰＣＲによる変異誘発を実施して、変異を導入することができ、且つ目的の抗体の結合、又は他の機能特性に対する効果は、本明細書に記載されるとおりのインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価され得る。保存的改変（上記で論じた）を導入することができる。変異は、アミノ酸の置換、付加又は欠失であり得る。更に、ＣＤＲ領域内の、典型的には１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ以下の残基も改変される。

本発明の分子のアミノ酸配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化をコード化ＤＮＡに導入することによって、又は所望のバリアントの合成によって調製することができる。そのようなバリアントとしては、例えば、本発明の分子のアミノ酸配列内の残基からの欠失、又はその残基の挿入若しくは置換が挙げられる。最終構築物が、所望の抗原結合特性を所有するという条件で、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが行われ、最終構築物に到達する。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数又は位置の変化など、分子の翻訳後プロセスを変更することができる。

本出願は、可変領域及び／又は定常領域中に、アミノ酸の保存的改変を有する本明細書に記載される分子、及び／若しくはその断片のバリアントを含む。

ｖｉｉｉ．核酸、発現ベクター、及び宿主細胞
本開示は、抗ＢＴＣ抗体若しくはその抗原結合断片、及び／又はＢＴＣ結合部分、及び本明細書に記載される別の結合部分（例えば、抗ＶＥＧＦ結合部分）を含む多重特異性結合分子をコード化する精製された核酸分子（例えば、実質的に精製された核酸分子）を提供する。ある特定の態様では、本開示は、表１に記載される抗ＢＴＣ結合部分をコード化する精製された核酸分子（例えば、実質的に精製された核酸分子）を提供する。別の態様では、本開示は、表３に記載されるＢＴＣ結合部分及び抗ＶＥＧＦ結合部分を含む多重特異性結合分子をコード化する精製された核酸分子（例えば、実質的に精製された核酸分子）を提供する。

本開示の核酸分子は、抗体の可変領域及び定常領域の両方をコード化することができる。本開示の核酸配列の一部は、元の重鎖配列に対して、実質的な同一性（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％）（例えば、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ４、ＮＶＳ１１、ＮＶＳ１２、ＮＶＳ１３、又はＮＶＳ１４の重鎖に対して実質的な同一性）を有する、改変された重鎖配列をコード化するヌクレオチドを含む。いくつかの他の核酸配列は、元の軽鎖配列に対して、実質的な同一性（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％）（例えば、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、ＮＶＳ４、ＮＶＳ１１、ＮＶＳ１２、ＮＶＳ１３、又はＮＶＳ１４の軽鎖に対して実質的な同一性）を有する、改変された軽鎖配列をコード化するヌクレオチドを含む。

抗ＢＴＣ抗体又はその結合断片をコード化するポリヌクレオチド配列は、ｄｅ ｎｏｖｏ固相ＤＮＡ合成によって、又は既存の配列（例えば、以下の実施例に記載されるような配列）のＰＣＲ変異誘発によって産生することができる。核酸の直接的な化学合成は、Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９，１９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９，１９８１のジエチルホスホルアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体支持体法など、当該技術分野において既知の方法により達成することができる。ＰＣＲによる変異のポリヌクレオチド配列への導入は、例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（Ｅｄ．），Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１；及びＥｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：１７，１９９１において記載されているとおりに実施することができる。

また、本開示では、抗ＢＴＣ結合部分及び／又はＢＴＣ結合部分と、抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子を産生するための発現カセット、ベクター、及び宿主細胞が提供される。より具体的には、本開示は、表１に記載されるような配列を有する抗ＢＴＣ結合部分をコード化する核酸を含む発現カセット及び／又はベクター、又は或いは本明細書に記載されるような分子にコンジュゲートされた抗ＢＴＣ結合部分をコード化する核酸を含む発現カセット及び／又はベクターを提供する。ある特定の態様では、発現カセット及び／又はベクターは、表１に記載されるその抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされた分子のうちのいずれか１つをコード化する核酸を含む。別の態様では、本開示は、表３に記載されるようなＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む、多重特異性結合分子をコード化する核酸を含む発現カセット及び／又はベクターを提供する。

一態様では、本開示は、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片のＶＨ及びＶＬをコード化する核酸分子を含む発現カセット及び／又はベクターを提供し、この核酸分子は、それぞれ配列番号１１及び２２；それぞれ配列番号３５及び４６；それぞれ配列番号５５及び６６；又はそれぞれ配列番号７９及び８９に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一若しくは相補的である。

一態様では、本開示は、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖をコード化する核酸分子を含む発現カセット及び／又はベクターを提供し、この核酸分子は、それぞれ配列番号１３及び２４；それぞれ配列番号３７及び４８；それぞれ配列番号５７及び６８；又はそれぞれ配列番号８１及び９１に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一若しくは相補的である。

一態様では、本開示は、１）ＢＴＣに結合するＶＨＡ及びＶＬＡであって、ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号１１６及び１２２に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一若しくは相補的である核酸配列によってコード化される、ＶＨＡ及びＶＬＡと、２）ＶＥＧＦに結合するＶＨＢ及びＶＬＢであって、ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１１７及び１２３に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一若しくは相補的である核酸配列によってコード化される、ＶＨＢ及びＶＬＢと、を含む多重特異性結合分子をコード化する核酸分子を含む発現カセット及び／又はベクターを提供する。

一態様では、本開示は、１）ＢＴＣに結合するＶＨＡ及びＶＬＡであって、ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号１２７及び１３２に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一若しくは相補的である核酸配列によってコード化される、ＶＨＡ及びＶＬＡと、２）ＶＥＧＦに結合するＶＨＢ及びＶＬＢであって、ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１２８及び１３３に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一若しくは相補的である核酸配列によってコード化される、ＶＨＢ及びＶＬＢと、を含む多重特異性結合分子をコード化する核酸分子を含む発現カセット及び／又はベクターを提供する。

一態様では、本開示は、１）ＢＴＣに結合するＶＨＡ及びＶＬＡであって、ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号１３７及び１４２に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一若しくは相補的である核酸配列によってコード化される、ＶＨＡ及びＶＬＡと、２）ＶＥＧＦに結合するＶＨＢ及びＶＬＢであって、ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１３８及び１４３に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一若しくは相補的である核酸配列によってコード化される、ＶＨＢ及びＶＬＢと、を含む多重特異性結合分子をコード化する核酸分子を含む発現カセット及び／又はベクターを提供する。

一態様では、本開示は、１）ＢＴＣに結合するＶＨＡ及びＶＬＡであって、ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号１４７及び１５１に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一若しくは相補的である核酸配列によってコード化される、ＶＨＡ及びＶＬＡと、２）ＶＥＧＦに結合するＶＨＢ及びＶＬＢであって、ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１４８及び１５２に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一若しくは相補的である核酸配列によってコード化される、ＶＨＢ及びＶＬＢと、を含む多重特異性結合分子をコード化する核酸分子を含む発現カセット及び／又はベクターを提供する。

一態様では、本開示は、それぞれ配列番号１２１及び１２６；それぞれ配列番号１３１及び１３６；それぞれ配列番号１４１及び１４６；又はそれぞれ配列番号１５０及び１５５に対して、約少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一若しくは相補的である核酸配列によってコード化される、重鎖及び軽鎖を含む多重特異性結合分子をコード化する核酸分子を含む発現カセット及び／又はベクターを提供する。

一態様では、本出願は、多重特異性結合分子の１つ以上の主なポリペプチド鎖を組換え的に産生する方法であって、１）多重特異性結合分子のポリペプチド鎖の各々をコード化する核酸分子を含む１つ以上のＤＮＡ構築物を産生することと、２）当該ＤＮＡ構築物を１つ以上の発現ベクター中に導入することと、３）当該発現ベクターを１つ以上の宿主細胞中でコトランスフェクトすることと、４）分子を宿主細胞中又は溶液中で発現及びアセンブリすることと、を含む方法を提供する。

これに関して、本開示は、単離された核酸、例えば、本明細書に記載の多重特異性結合分子、例えば、ＢＴＣ結合ドメイン及びＶＥＧＦ結合ドメインを含む多重特異性結合分子（例えば、本明細書に記載されるような）をコード化する１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、単離された核酸は、単一の連続ポリヌクレオチド上に配置される。他の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、２つ以上の連続する核酸配列上に配置される。いくつかの態様では、単離された核酸分子は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。

複数の態様では、単離された核酸は、ＢＴＣ結合ドメイン若しくはその断片をコード化する配列、及び／又はＶＥＧＦ結合ドメイン若しくはその断片をコード化する配列を含む。複数の態様では、ＢＴＣ結合ドメイン若しくはその断片をコード化する配列とＶＥＧＦ結合ドメインをコード化する配列とは、別個のポリヌクレオチド上に配置される。複数の態様では、ＢＴＣ結合ドメイン若しくはその断片をコード化する配列とＶＥＧＦ結合ドメインをコード化する配列とは、単一のポリヌクレオチド上に配置される。

例示的な態様では、多重特異性結合分子の軽鎖をコード化するＤＮＡ配列と多重特異性結合分子の重鎖をコード化するＤＮＡ配列とは、別個の発現ベクター中に置かれる。次いで、発現ベクターは、最適なアセンブリを生じさせる比率で宿主細胞中にコトランスフェクトされる。コード化された重鎖及び軽鎖は、宿主細胞中で発現され、機能的分子にアセンブリされる。本明細書には、これらのクローニング及び発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。

別の例示的な態様では、多重特異性結合分子の重鎖及び軽鎖をコード化するＤＮＡ配列は、１つの発現ベクター中に置かれる。次いで、発現ベクターは、宿主細胞中にトランスフェクトされ得る。コード化された重鎖及び軽鎖は、宿主細胞中で発現され、機能的分子にアセンブリされる。或いは、発現ベクターは、異なる宿主細胞集団中にトランスフェクトされ、多重特異性結合分子が溶液中でアセンブリされ得る。

本明細書に記載される多重特異性結合分子をコード化する１つ以上の核酸分子又は核酸分子のセットを含むクローニング及び発現ベクターが本明細書に提供され、このベクターは、多重特異性結合分子の組換え産生に好適である。本明細書には、本明細書に記載される多重特異性結合分子の産生のためのプロセスであって、本明細書に開示される宿主細胞を、多重特異性結合分子を発現するのに十分な条件下で培養することと、その後、多重特異性結合分子を宿主細胞培養物から精製及び回収することと、を含むプロセスが提供される。

本開示の所望の分子をコードする核酸配列は、例えば、標準的な技術を用いて、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすること、遺伝子を含むことが知られるベクターから遺伝子を派生させること、又は遺伝子を含有する細胞及び組織から直接的に単離することなどによる、当該技術分野において知られる組換え法を用いて得ることができる。或いは、目的の核酸は、クローン化の代わりに合成的に産生され得る。本開示はまた、細胞中に直接的にトランスフェクトされ得るＲＮＡ構築物を含む。トランスフェクションにおける使用のためのｍＲＮＡを作製するための方法は、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップ及び／又は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現されることになる核酸、並びにポリＡテールを含有する、通常長さが５０～２０００塩基の構築物を産生するための、特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）、それに続くポリＡ付加を含む。そのように作製されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に効率的にトランスフェクトすることができる。一態様では、鋳型は、多重特異性結合分子、例えば、二重特異性分子、例えば、二重特異性抗体又は二重特異性抗体様分子のポリペプチドについての配列を含む。ある態様では、ＲＮＡベクターは、エレクトロポレーションによって細胞中に形質導入され得る。

本開示の所望の分子を発現するために、様々なベクターを用いることができる。ウイルスベースの発現ベクター及び非ウイルス発現ベクターの両方を使用して、哺乳動物宿主細胞内でタンパク質を産生することができる。非ウイルスベクター及び非ウイルス系は、プラスミド、典型的には、タンパク質又はＲＮＡを発現させるための発現カセットを伴うエピソームベクター、及びヒト人工染色体を含む（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １５：３４５，１９９７を参照されたい）。例えば、抗ＢＴＣ結合部分及び／又はＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子の哺乳動物（例えば、ヒト）細胞中での発現に有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、Ｂ＆Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓＡ、Ｂ＆Ｃ、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、及び他のタンパク質を発現するために、当該技術分野において既知の他の多くのベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター及びセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。各々の内容がこの目的のために参照により本明細書に組み込まれるＢｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３，１９９２を参照されたい。ウイルスベクターを生成する方法は、当技術分野において周知であり、当業者が、ウイルスベクターを含む本開示のウイルスベクターを生成することを可能にするであろう（例えば、米国特許第７，４６５，５８３号明細書を参照されたい）。

ＡＡＶは、効率的な複製を容易にするために、ヘルパーウイルスを必要とする小さな一本鎖ＤＮＡウイルスである。ウイルスベクターは、ベクターゲノムとカプシドタンパク質とを含む。ウイルスベクターカプシドは、現在特定されているヒト及び非ヒトＡＡＶ血清型、並びにまだ特定されていないＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２を含む、当該技術分野において既知のＡＡＶ血清型のいずれか１つから供給され得る。ウイルスカプシドは、他のウイルス成分と混合及び適合され、ハイブリッドウイルスベクターを形成することができる。例えば、ウイルスベクターのＩＴＲ及びカプシドは、異なるＡＡＶ血清型から由来し得る。一態様では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２血清型由来であり得る一方、カプシドは、例えば、ＡＡＶ２又はＡＡＶ８血清型由来である。加えて、当業者は、ベクターカプシドがモザイクカプシド（例えば、異なる血清型由来のカプシドタンパク質の混合物から構成されるカプシド）又はキメラカプシド（例えば、マーカーを生成するため及び／又は組織親和性を変化させるための外来又は関係のないタンパク質配列を含有するカプシドタンパク質）であり得ることを認識するであろう。本開示のウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９カプシドを含み得ることが企図される。本開示は、ＡＡＶ８カプシドを含むウイルスベクターによって、本開示の分子を産生するための方法を提供することが更に企図される。別の態様では、本開示は、ＡＡＶ９カプシドを含むウイルスベクターによって、本開示の分子を産生するための方法を提供する。ある特定の態様では、本開示は、ＡＡＶ５カプシド又はＡＡ６カプシドを含むウイルスベクターによって、本開示の分子を産生するための方法を提供する。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、ＡＡＶベクターを使用して発現され得る。一態様では、多重特異性結合分子の抗ＢＴＣ結合部分は、ＡＡＶベクターを使用して発現され得る。別の態様では、多重特異性結合分子の抗ＶＥＧＦ結合部分は、ＡＡＶベクターを使用して発現され得る。

発現ベクターの選択は、その中でベクターが発現されることになる、意図される宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターはプロモーターと、抗体鎖若しくは断片、又は抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされた抗体鎖若しくは断片をコード化するポリヌクレオチドに作動可能に連結された他の調節配列（例えば、エンハンサー）とを含有する。いくつかの態様では、誘導条件下を除き、挿入された配列の発現を防止するのに、誘導的プロモーターを利用する。誘導的プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、又は熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞により良好に許容されるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させることができる。プロモーターに加えて、他の調節配列もまた、抗体鎖若しくは断片、又は抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされた抗体鎖若しくは断片の効率的な発現に必要であるか、又は望ましい場合がある。これらのエレメントは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接のリボソーム結合性部位又は他の配列を典型的に含む。加えて、発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れることにより増強され得る（例えば、各々の内容がこの目的のために参照により本明細書に組み込まれるＳｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４；及びＢｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞内の発現を増大させ得る。

発現ベクターはまた、抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされたポリペプチドの配列又は抗体の配列との融合タンパク質又は二重特異性抗体を形成するために、位置付けられた分泌シグナル配列を提供することができる。より多くの場合、そのような挿入された配列は、ベクター中に含める前にシグナル配列に連結される。抗体軽鎖及び重鎖可変ドメイン、又は抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされた抗体をコードする配列を受容するのに使用されるベクターはまた、定常領域又はその部分をコードすることがある。そのようなベクターは、定常領域との融合タンパク質又は二重特異性抗体としての可変領域の発現を可能とし、これにより、インタクトな抗体又はそれら抗原結合断片の産生をもたらす。典型的には、このような定常領域は、ヒト定常領域である。

本開示には、抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、以下に記載されるような宿主細胞を、抗ＢＴＣ抗体若しくはその抗原結合断片、及び／又はＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子の発現に好適な条件下で培養することを含む、方法が提供される。一態様では、本方法は、抗ＢＴＣ抗体若しくはその抗原結合断片、及び／又はＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子を精製することを更に含む。

抗ＢＴＣ結合部分及び／又はＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子を担持し、発現するための宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞のいずれかであり得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本開示のポリヌクレオチドをクローニングし、発現させるのに有用な１つの原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの桿菌、及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属種、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属種、及び様々なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属種など、他の腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主内ではまた、典型的には、宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターも作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ－ラクタマーゼプロモーター系、又はファージラムダに由来するプロモーター系など、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在する。プロモーターは、典型的には、任意選択的に、オペレーター配列により発現を制御し、転写及び翻訳を開始して終結させるためのリボソーム結合性部位配列なども有する。酵母などの他の微生物もまた、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分及び／又はＢＴＣ結合部分とＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子を発現するために用いることができる。また、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。

いくつかの好ましい態様では、哺乳動物宿主細胞を使用して、本開示の抗ＢＴＣ結合部分及び／又はＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子を発現し、産生する。例えば、それらは、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株又は外来性発現ベクターを担持する哺乳動物細胞株のいずれかであり得る。これらは、任意の正常致死又は正常若しくは異常不死動物細胞又はヒト細胞を含む。例えば、インタクトな免疫グロブリンを分泌することが可能ないくつかの好適な宿主細胞株が開発されており、当業者に既知であり、これらにはＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞及びハイブリドーマが挙げられる。ポリペプチドを発現させるための、哺乳動物組織細胞培養物の使用については、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７において一般に論じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製開始点、プロモーター及びエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、内容がこの目的のために参照により本明細書に組み込まれるＱｕｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９－６８，１９８６を参照）、並びにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などの必要なプロセッシング情報部位を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーター又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。好適なプロモーターは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、段階特異的プロモーター及び／又は改変可能プロモーター若しくは調節可能プロモーターであり得る。有用なプロモーターとしては、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト即初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、及び当該技術分野で公知のプロモーター－エンハンサーの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。

対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に利用される一方、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションが他の細胞宿主に使用され得る。（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、注入及びマイクロインジェクション、バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）法、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２に対する融合体（Ｅｌｌｉｏｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ ８８：２２３，１９９７）、ＤＮＡの薬剤増強取り込み、及びエクスビボ遺伝子導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期にわたる高収量の産生のために、安定的発現が望ましい場合が多い。

例えば、抗ＢＴＣ結合部分及び／又はＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子を安定して発現する細胞株は、ウイルス複製起点又は内在性発現エレメント及び選択可能マーカー遺伝子を含有する本開示の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターを導入した後、細胞は、濃縮培地中で１～２日間にわたり増殖させてから、選択培地に切り替えられ得る。選択可能マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与し、その存在により細胞の増殖を可能とし、これにより、導入された配列を選択培地中で順調に発現させることである。耐性で安定的にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適する組織培養法を使用して増殖させることができる。本開示は、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分及び／又は抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされた分子を産生するためのプロセスを更に提供し、本明細書に記載されるような抗ＢＴＣ結合部分又は抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされた分子を産生することができる宿主細胞が、１つ以上の抗ＢＴＣ結合部分及び／又は抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされた分子の産生のために適切な条件下で培養される。このプロセスは、本開示の抗ＢＴＣ結合部分及び／又は抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされた分子を単離することを更に含み得る。

本開示の抗ＢＴＣ結合部分及び／又はＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子をコード化する核酸配列を含有する発現ベクターは、遺伝子を眼に送達させるために使用することができる。本開示のある特定の態様では、発現ベクターは、抗体をコード化し、本開示の１つ以上の抗ＢＴＣ結合部分に連結され、眼への送達に好適である。本開示の他の態様では、治療的結合部分及び抗ＢＴＣ結合部分は、眼への送達に好適な１つ以上の発現ベクター中にコード化されている。遺伝子産物を眼に送達するための方法は、当該技術分野において既知である。

ｉｘ．抗体産生
ポリペプチド及び抗体並びにその断片は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む様々な技術によって産生することができる。

本開示のキメラ又はヒト化抗体は、全体を通して記載されるように、調製されるネズミモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のマウスハイブリドーマから得られ、且つ標準的な分子生物学的手法を使用して非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作され得る。例えば、キメラ抗体を作製するために、ネズミ可変領域を、当該技術分野において既知の方法を使用して、ヒト定常領域に連結することができる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．による米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。ヒト化抗体を作製するために、ネズミＣＤＲ領域を、当該技術分野において既知の方法を使用して、ヒトフレームワーク中に挿入することができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５２２５５３９号明細書、及びＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５５３０１０１号明細書；同第５５８５０８９号明細書；同第５６９３７６２号明細書、及び同第６１８０３７０号明細書を参照されたい。

ある特定の態様では、本開示の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦに対するそのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウス又はトランスクロモソミックマウスを使用しても作製され得る。これらのトランスジェニックマウス及びトランスクロモソミックマウスは、本明細書中でそれぞれＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスと称されるマウスを含み、本明細書中では「ヒトＩｇマウス」と一括して称される。別の態様では、本開示のヒト抗体は、導入遺伝子及びトランスクロモソーム上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖トランスクロモソームを保有するマウスを使用して産生され得る。本明細書で「ＫＭマウス」と称されるそのようなマウスは、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．によるＰＣＴ公開国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに詳細に記載されている。

更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系が、当技術分野において利用可能であり、本開示の抗体を産生するために使用され得る。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称される代替のトランスジェニック系が使用され得る。そのようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，９３９，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，１５０，５８４号明細書、及び同第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。

更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスクロモソミック動物系は、当技術分野で利用可能であり、本開示の抗体を産生するために使用され得る。例えば、「ＴＣマウス」と称される、ヒト重鎖トランスクロモソーム及びヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を保有するマウスを使用することができ；そのようなマウスは、内容がこの目的のために参照により本明細書に組み込まれるＴｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７２２－７２７により記載されている。更に、当技術分野では、ヒト重鎖及び軽鎖トランスクロモソームを保有する雌ウシも記載されており（Ｋｕｒｏｉｗａ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：８８９－８９４）、本開示の抗体を産生するために使用され得る。

本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用しても作製され得る。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されているか、又は下の実施例において記載される。例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；及び同第５，５７１，６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，４２７，９０８号明細書及び同第５，５８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，９６９，１０８号明細書及び６，１７２，１９７号明細書；並びにＧｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書及び６，５９３，０８１号明細書を参照されたい。

本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化時にヒト抗体反応が引き起こされ得るようにヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを使用しても調製され得る。そのようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，４７６，９９６号明細書及び同第５，６９８，７６７号明細書に記載されている。

標準的な分子生物学技術を使用して変更された抗ＢＴＣ結合部分及び／又は抗ＶＥＧＦ結合部分の配列を調製し、発現することができる。変更された配列によってコード化される変更された抗ＢＴＣ結合部分又は抗ＶＥＧＦ結合部分は、変更された抗ＢＴＣ結合部分又は抗ＶＥＧＦ結合部分の機能的特性のうちの１つ、その一部又はその全てを保持するものである。

抗ＢＴＣ結合部分又は抗ＶＥＧＦ結合部分を操作する方法のある特定の態様では、抗ＢＴＣ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体コード配列の全て又は一部に沿って変異をランダムに又は選択的に導入することができ、得られた改変された抗ＢＴＣ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体は、本明細書に記載されるような結合活性及び／又は他の機能特性についてスクリーニングすることができる。変異法は、当該技術分野において説明されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ国際公開第０２／０９２７８０号パンフレットは、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、又はこれらの組み合わせを使用して、抗体の突然変異を創出し、スクリーニングするための方法について記載している。或いは、Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．によるＰＣＴ国際公開第０３／０７４６７９号パンフレットは、コンピュータによるスクリーニング法を使用して、抗体の生理化学的特性を最適化する方法について記載している。

本開示のある特定の態様では、抗体は、脱アミド化の部位を除去するように操作することができる。脱アミド化は、ペプチド内又はタンパク質内の構造的変化及び機能的変化を引き起こすことが公知である。脱アミド化は、生物学的活性の低下のほか、タンパク質医薬品の薬物動態及び抗原性の改変も結果としてもたらし得る（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｍａｒ １；７７（５）：１４３２－９）。本開示のある特定の他の態様では、抗体及び抗ＢＴＣ抗体又はその機能的断片は、プロテアーゼ切断の部位を付加又は除去するように操作することができる。

ラマ種（ラマ・パコス（Ｌａｍａ ｐａｃｃｏｓ）、ラマ・グラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）及びラマ・ビクーニャ（Ｌａｍａ ｖｉｃｕｇｎａ））などの新世界メンバーを含むラクダ及びヒトコブラクダ（カメルス・バクトリアヌス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）及びカメルス・ドロマデリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍａｄｅｒｉｕｓ））ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性及びヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然に見出されるとおりの哺乳動物のこのファミリー由来のある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する抗体に関する２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する典型的な四本鎖の４要素からなる構造とは構造的に異なる。ＰＣＴ／欧州特許第９３／０２２１４号明細書（１９９４年３月３日に公開された国際公開第９４／０４６７８号パンフレット）を参照されたい。

ＶＨＨとして同定される小さい単一可変ドメインであるラクダ科抗体の領域は、標的に対する高い親和性を有する小さいタンパク質を得るための遺伝子操作によって得ることができ、「ラクダ科ナノボディ」として知られる低分子量抗体由来タンパク質をもたらす。１９９８年６月２日に出願された米国特許第５，７５９，８０８号明細書を参照されたく；また、Ｓｔｉｊｌｅｍａｎｓ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１２５６－１２６１；Ｄｕｍｏｕｌｉｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｎａｔｕｒｅ ４２４：７８３－７８８；Ｐｌｅｓｃｈｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．ｅｔａｌ．２００３ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１４：４４０－４４８；Ｃｏｒｔｅｚ－Ｒｅｔａｍｏｚｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．２００２ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８９：４５６－６２；及びＬａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９８ ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３５１２－３５２０を参照されたい。ラクダ科抗体及び抗原結合断片の操作されたライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト起源の他の抗体と同様に、ラクダ科抗体のアミノ酸配列を組換えにより改変して、ヒト配列により厳密に似ている配列を得ることができる、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」され得る。

ラクダ科ナノボディは、ヒトＩｇＧ分子のもののおよそ１０分の１の分子量を有し、このタンパク質は、わずか数ナノメートルの物理的直径を有する。サイズが小さいことの１つの意義は、ラクダ科ナノボディの、大きい抗体タンパク質では機能的に見えない抗原部位に結合する能力であり、すなわち、ラクダ科ナノボディは、従来の免疫学的手法では検出できない抗原を検出するための試薬として且つ可能性がある治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の意義は、ラクダ科ナノボディが、標的タンパク質の溝又は狭い間隙中の特定の部位への結合の結果として阻害することができ、したがって、従来の抗体のものより従来の低分子量薬物の機能により厳密に似ている能力で機能できることである。

低分子量及び小型サイズは、ラクダ科ナノボディが極めて熱安定性であり、極端なｐＨ及びタンパク質消化に安定であり、且つ低い抗原性であることをさらにもたらす。別の結果は、ラクダ科ナノボディが循環系から組織に容易に移動することである。ナノボディは、血液脳関門を通過する薬物輸送を更に容易にすることができる。２００４年８月１９日に公開された米国特許出願第２００４０１６１７３８号明細書を参照されたい。更にこれらの分子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞において十分に発現することができ、二重特異性抗体又はバクテリオファージとの融合タンパク質として発現され、機能的である。

したがって、本開示の特徴は、例えば、ＢＴＣに対する高親和性を有するラクダ科抗体又はナノボディである（すなわち、抗ＢＴＣ結合部分が、ラクダ科抗体又はナノボディの形式である場合）。本明細書のある特定の態様では、ラクダ科抗体又はナノボディは、ラクダ科動物において天然に産生され、すなわち、他の抗体についての本明細書に記載の技術を使用して、ＢＴＣ又はそのペプチド断片による免疫化後のラクダ科によって産生される。或いは、ラクダ科ナノボディは、適切な標的を用いたパニング手法を使用して、適切に変異したラクダ科ナノボディタンパク質を表示するファージのライブラリから操作される（すなわち、例えば、選択によって産生される）。操作されたナノボディは、遺伝子工学によって更にカスタマイズされ得る。ラクダ科ナノボディは、例えば、治療標的に特異的であり、本明細書に記載されるような抗ＢＴＣ結合部分に連結することができる。特定の態様では、ラクダ科抗体又はナノボディは、例えば、ＰＣＴ／欧州特許第９３／０２２１４号明細書に記載されるようなナノボディ又は単一ドメイン抗体フレームワーク配列への本開示のヒト抗体の重鎖又は軽鎖のＣＤＲ配列の移植によって得られる。

ｘ．医薬組成物
本開示は、有効量の、本明細書に記載されるような抗ＢＴＣ抗体若しくは抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。本開示はまた、有効量の、本明細書に記載されるような（例えば、表１及び３に記載されるもの）抗ＢＴＣ抗体若しくはその抗原結合断片又は多重特異性結合分子を含む医薬組成物も提供する。

治療薬及び診断用薬の医薬組成物は、生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤を、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション、又は懸濁液の形態で混合することによって調製することができる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：ｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ； Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。

ある特定の態様では、表１による抗ＢＴＣ結合部分は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、若しくは担体と共に、又は別々に製剤化することができる。本開示はまた、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、若しくは担体と共に、又は別々に製剤化された抗ＢＴＣ結合部分を含む組成物も提供する。

ある特定の態様では、本開示は、１）抗ＢＴＣ結合部分と、２）抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、若しくはその抗原結合断片に連結された抗ＢＴＣ抗体、若しくはその抗原結合断片を含む組成物を提供する。組成物は、凍結乾燥された投与形態であり得、注射用に水で再構成することができる。組成物は、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１２ｍｇ、少なくとも１４ｍｇ、少なくとも１６ｍｇ、少なくとも１８ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも２２ｍｇ、少なくとも２４ｍｇ、少なくとも２６ｍｇ、少なくとも２８ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４０ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、又は少なくとも５０ｍｇの二重特異性抗体（例えば、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む）を含むことができる。組成物は、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも３５ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも４５ｍＭ、又は少なくとも５０ ヒスチジン、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも２１０ｍＭ、少なくとも２２０ｍＭ、少なくとも２３０ｍＭ、少なくとも２４０ｍＭ、若しくは少なくとも２５０ｍＭのスクロース、及び／又は少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、若しくは少なくとも０．５％のポリソルベート２０を更に含むことができる。

本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と共に製剤化することができる。組成物は、例えば、眼科的状態、若しくは障害と関連する状態若しくは障害を治療又は予防するのに好適である１つ以上の他の治療薬を更に含有することができる。薬学的に許容される担体は、組成物を増強若しくは安定化させるか、又は組成物の調製を容易にするために使用することができる。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。

本開示の分子はまた、当該技術分野において既知の様々な方法のうちの１つ以上を使用して、１つ以上の投与経路を介して投与することができる。当業者は理解するであろうとおり、投与経路及び／又は方法は、所望の結果に応じて変わり得る。抗体のために選択される投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊椎又は他の非経口投与経路、例えば、注射又は注入によるものが挙げられる。非経口投与は、経腸及び局所投与以外の、通常、注射による投与方法を表すことができ、限定なしに、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。或いは、本開示の組成物は、局所、上皮、又は粘膜投与経路などの非経口ではない経路を介して投与することができ、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸、舌下、又は局所投与である。

ある特定の態様では、医薬組成物は全身的に投与され、そのＢＴＣに対する親和性に基づいて目的の組織に局在化することを可能にする。組成物が、眼への直接投与に好適であることが好ましく、より具体的には、組成物は硝子内投与及び／又は網膜下投与に好適であり得る。薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体は、眼への投与（例えば、注射によるか又は結膜下投与）に、より具体的には、硝子内投与及び／又は網膜下投与に好適でなければならない。

組成物は、無菌であり且つ流動性がなければならない。適切な流動性は、例えば、界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール又はソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。

本開示の医薬組成物は、当該技術分野において周知であり、日常的に実施されている方法に従い調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，２０ｔｈ ｅｄ．，２０００；及びＳｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。典型的には、本開示の医薬組成物中では、分子の治療的に有効な用量又は治療的に効果的な用量が利用される。

抗ＢＴＣ又は抗ＶＥＧＦ結合部分にコンジュゲートされた分子は、当業者に既知である従来の方法により、薬学的に許容される剤形に製剤化される。投与計画は、所望される最適応答（例えば治療応答）をもたらすように調整される。例えば、単回ボーラスが投与され得、数回の分割用量が時間をかけて投与され得、又は治療状況の切迫性が示すところに従い用量を比例的に減量若しくは増量され得る。特に、投与の簡便さ及び投薬量の均一性のため、非経口組成物を投薬量単位形態で製剤化することが有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療対象の単位用量として適した物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。

組成物は、無菌であり且つ流動性がなければならない。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール又はソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。

ある特定の態様では、本開示の分子又はその断片は、インビボでの適切な分布を確実にするために製剤化され得る。

本開示は、抗ＢＴＣ抗体若しくはその抗原結合断片及び／又は多重特異性結合分子、例えば、抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子を含む医薬組成物を含むキットを提供する。

一態様では、キットは、使用説明書を更に含み、これは投与量、投与の経路、投与計画、及び全体の治療を提供し得る。別の態様では、本開示の分子を投与するための手段を更に含み、例えば、自動注射器、注射器、バイアル、プレフィルドシリンジ、及び／又はプレフィルドペンがそうである。

これらのキットは、ＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦによって媒介される病的障害、例えば、ＤＭＥを有する対象を治療するための追加の治療薬を含有することができる。一態様では、追加の治療薬としては、Ｂｅｏｖｕ／ブロルシズマブ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ／ラニビズマブ、Ａｖａｓｔｉｎ／ベビシズマブ、Ｅｙｌｅａ／アフリベルセプト、ペガプタニブ、パゾパニブ、ソラフィニブ、スニチニブ、及び／又はラパマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。

ｘｉ．診断的使用及び治療的使用
本分子は、多くの診断的用途及び治療的用途を有する。例えば、それらは、固定化マトリックスに結合する酵素及び分子のその他の部分上の特異的エピトープに結合するアームを有して、酵素免疫測定法に使用することができる。抗体様分子を使用する酵素免疫測定法は、Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４０：１－１１）によって論議されている。多重特異性結合分子はまた、様々な疾患、例えば、膵臓癌、乳癌、子宮内膜腺癌、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、胃癌、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、新生血管加齢黄斑変性、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、母斑症に関連する異常血管増殖、中心性漿液性脈絡網膜症、及び急性多発性小板状色素上皮症の診断に使用することができる。

本分子は、インビトロ及びインビボでの診断的及び治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、培養物中の細胞に、例えば、インビトロ若しくはインビボで、又は対象において、例えば、インビボで、様々な障害を治療し、予防し、又は診断するために投与することができる。

一態様では、本開示の分子は、生体サンプル中のＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦの存在を検出するために有用である。本明細書で使用される「検出する」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。ある特定の態様では、生体サンプルは、細胞又は組織を含む。ある特定の態様では、そのような組織は、正常な組織、及び／又は他の組織に対してより高いレベルでＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦを発現する癌性組織を含む。

一態様では、本開示は、生体サンプル中のＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦの存在を検出する方法を提供する。特定の態様では、本方法は、生体サンプルを、抗体の抗原への結合を許容する条件下で本開示の多重特異性分子と接触させることと、抗体と抗原との間で複合体が形成されているかどうかを検出することと、を含む。生体サンプルとしては、尿又は血液サンプルを挙げることができるが、これらに限定されない。

また、ＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦの発現と関連する障害を診断する方法も含まれる。ある特定の態様では、本方法は、試験細胞を、本開示の多重特異性分子と接触させることと、本開示の多重特異性分子の結合を検出することによって、試験細胞中のＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦの発現のレベルを（定量的又は定性的のいずれかで）決定することと、試験細胞中のＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦの発現レベルを、対象細胞（例えば、試験細胞又は非ウイルス感染細胞と同じ組織に由来する正常な細胞）におけるＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦの発現のレベルと比較することと、を含み、対象細胞と比較して試験細胞中のＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦの発現レベルがより高いと、ＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦと関連する障害の存在を示す。ある特定の態様では、試験細胞は、ＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦによって媒介される病的障害を有することが疑われる個体から得られる。

本明細書に記載の分子は、医薬品として使用することができる。以下に（例えば、実施例１３に）提供されるように、抗ＢＴＣ抗体と抗ＶＥＧＦ抗体との組み合わせ治療は、驚くべきことに、対象動物と比べて動物モデルにおいて網膜漏出の７７％の低減をもたらした。

特に、本開示の抗ＢＴＣ抗体若しくはその抗原結合断片及び／又は多重特異性結合分子は、膵臓癌、乳癌、子宮内膜腺癌、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、及び胃癌を治療するために使用することができる。別の態様では、本開示の抗ＢＴＣ抗体若しくはその抗原結合断片及び／又は多重特異性結合分子は、対象における眼科的状態若しくは障害、例えば、網膜血管疾患に関連する状態若しくは障害を治療するために使用することができる。

本開示は、有効量の本開示の分子を治療を必要とする対象に投与することによる、ＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦによって媒介される病的障害を治療する方法を提供する。ＢＴＣ及び／又はＶＥＧＦによって媒介される病的障害としては、異常なＢＴＣ及び／若しくはＶＥＧＦレベルを有するか、又はそれによって特徴付けられる状態、並びに／又は標的細胞若しくは組織、例えば、網膜細胞中のＢＴＣ及び／若しくはＶＥＧＦ誘発活性を低減又は抑制することによって治療することができる疾患若しくは状態を含む。一態様では、本開示は、増加したＢＴＣ及び／若しくはＶＥＧＦレベル及び／又は活性と関連する疾患若しくは障害を治療する方法を提供する。一態様では、疾患若しくは障害は、網膜疾患若しくは障害、例えば、ＤＭＥである。

糖尿病を有する患者は、多くの場合、網膜（ＤＲ又は糖尿病性網膜症）、黄斑（ＤＭＥ）、水晶体（白内障）、及び視神経（緑内障）を含む眼の様々な部分を冒す眼科的合併症に直面する。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の患者におけるＤＭＥの有病率は、地域によって異なる。有病率は、ヨーロッパにおける１１％から一部のアフリカの国々での７．５％までの範囲である。世界中で３１００万人を超える人々が罹患している。１４人の糖尿病を有するヒトのうち、およそ１人がある程度のＤＭＥを有する。Ｔ１Ｄを有するヒトの推定で２０％、及びＴ２Ｄを有するヒトの２５％がＤＭＥを発症すると予想され得る。ＤＭＥは、先進国の労働年齢人口における失明の主な原因である。

ＤＭＥはＤＲのサブタイプであり、進行性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）の患者で最も頻繁に発症するが、疾患のどの段階でも発症する可能性がある。これは、網膜下の新しい血管の進行性の成長によって引き起こされ、体液及び脂質を漏出し、黄斑の膨張をもたらし、これが視界の著しいぼやけをもたらし、ＤＲからの失明のリスクに寄与する。ＤＭＥは、視界のかすみ、像の歪み、並びに色覚及び暗転の変化を含む著しい視覚障害をもたらす（Ｙａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ３５：５５６－５６４，２０１２；Ｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１６：２０９－２２）。ＤＭＥは、糖尿病性網膜症における視力低下（Ｔ１Ｄにおいて２０％及びＴ２Ｄにおいて４０％）の主な原因である。ＤＲ／ＤＭＥの病態生理学は、様々な生化学的経路、炎症性メディエーター、及び血管新生因子の間の相互作用を考えると複雑である。

ＶＥＧＦ阻害剤は、中心窩を含むびまん性ＤＭＥの第１選択治療である。抗ＶＥＧＦ剤は黄斑浮腫を低減し、血管新生を阻害し、視力を改善するが、全てのＤＭＥ患者が長期にわたる視力の大幅な改善を経験するか、又は治療に反応したりするわけではなく、疾患の病態における他のメディエーターの役割を示している。

本開示は、有効量の、本開示の分子、例えば、抗ＢＴＣ抗体若しくはその抗原結合断片又は抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子を、治療を必要とする対象に投与することによって、眼科的障害、例えば、ＤＭＥを治療する方法を提供する。本開示はまた、治療有効量の、本開示の分子、例えば、抗ＢＴＣ抗体若しくはその抗原結合断片又は抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子を、治療を必要とする対象に投与することによって、眼科的障害、例えば、ＤＭＥの進行を予防する方法も提供する。

本開示は、有効量の本開示の分子を、治療を必要とする対象に投与することによって、糖尿病性網膜症（ＤＲ）又は増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）を治療する方法を更に提供する。

本開示は、有効量の本開示の分子を、治療を必要とする対象に投与することによって、加齢黄斑変性（ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ）を治療する方法を更に提供する。

なお更に、本開示は、有効量の本開示の分子を、治療を必要とする対象に投与することによって、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、及びＣＲＶＯ又はＢＲＶＯに続発する黄斑浮腫、血管性浮腫、多巣性脈絡膜炎、病的近視における脈絡膜新生血管、及び／又は未熟児網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、網膜血管透過性亢進を含む、及び／又はｎＡＭＤ（新生血管ＡＭＤ）と関連するＣＮＶ、網膜虚血関連する後遺症を含む網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）を治療するための方法を提供する。

網膜疾患、例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＰＤＲ、又はＤＲ、及びＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤの治療及び／又は予防は、視覚機能及び／又は網膜解剖学的構造の臨床的に関連する測定を使用して、眼科医又は医療専門家によって決定することができる。網膜血管疾患と関連する状態又は障害の治療は、視覚機能及び／又は網膜解剖学的構造の改善又は保存をもたらすか、又はそれをもたらすことが企図される任意の行為（例えば、本明細書に記載のＢＴＣ抗体若しくはその抗原結合断片及び／又は多重特異性結合分子の投与）を意味する。加えて、網膜血管疾患に関連する状態又は障害に関するような予防は、視覚機能、網膜解剖学的構造における悪化を予防若しくは遅らせる、及び／又は当該悪化のリスクがある患者において、本明細書で定義されるような網膜血管疾患パラメータにおける悪化を予防若しくは遅らせる任意の行為（例えば、本明細書に記載のＢＴＣ抗体若しくはその抗原結合断片及び／又は多重特異性結合分子の投与）を意味する。

視覚機能には、例えば、視力、低照度での視力、視野、中心視野、周辺視野、コントラスト感受性、暗順応、光ストレス回復、色識別、読み取り速度、補助装置（例えば、大きい書体、拡大装置、望遠鏡）への依存、顔認識、自動車の操作の習熟度、日常生活の１つ以上の活動を実行する能力及び／又は視覚機能に関連する患者が報告した満足度が含まれ得る。

本開示は、有効量の本開示の分子を、改善又は予防を必要とする対象に投与することによって、視覚機能を改善するか、又は視覚機能の更なる低下を予防する方法を更に提供する。

視覚機能の例示的な尺度としては、スネレン視力、ＥＴＤＲＳ視力、低輝度視力、アムスラーグリッド、ゴールドマン視野、ハンフリー視野、マイクロペリメトリー、ペリーロブソンチャート、スキルカード、石原カラープレート、ファーンスワースＤ１５又はＤ１００カラーテスト、標準網膜電図、多焦点網膜電図、読む速度の有効性が認められた試験、顔認識、運転シミュレーション及び患者が報告した満足度が挙げられる。したがって、血管疾患及び／又は黄斑浮腫の治療は、ＥＴＤＲＳスケールで２本以上の線（又は１０文字）の獲得又は視認喪失がないことよって達成されると言うことができる。加えて、血管疾患及び／又は黄斑浮腫の治療は、対象が読み取り速度（１分当たりの単語数）において、少なくとも１０％の増加又は１０％の減少の欠如を示す場合に始まると言うことができる。更に、血管疾患及び／又は黄斑浮腫の治療は、対象が、石原テストで正しく特定されたプレート又はファーンスワーステストで正しく並べられたディスクの割合において、少なくとも２０％の増加又は２０％の減少の欠如を示す場合に始まると言うことができる。更に、網膜血管疾患及び／又は黄斑浮腫の治療は、対象が、例えば、暗順応の以前に特定された程度に対して、時間の少なくとも１０％の減少、又は１０％以上の増加の欠如を有する場合に始まるということができる。加えて、網膜血管疾患及び／又は黄斑浮腫の治療は、対象が、例えば、資格を有する医療専門家（すなわち、眼科医）によって決定される視覚として表される視覚暗点の総面積における少なくとも１０％の減少、又は１０％以上の増加の欠如を示す場合に始まるということができる。

治療又は予防され得る網膜解剖学的構造の望ましくない態様としては、例えば、微細動脈瘤、黄斑浮腫、綿花状白斑、網膜内細小血管異常（ＩＲＭＡ）、キャプラリードロップアウト、白血球付着、網膜虚血、視神経乳頭の血管新生、眼底後極部の血管新生、虹彩血管新生、網膜内出血、硝子体出血、黄斑部瘢痕、網膜下線維症、及び網膜線維症、静脈怒張、血管蛇行、血管漏出が挙げられる。したがって、例えば、黄斑浮腫の治療は、光コヒーレンストモグラフィーによって測定されるような中心領域網膜厚における２０％以上の低下によって決定することができる。

網膜組織を評価する例示的な手段としては、眼底検査、眼底撮影、蛍光眼底血管造影、インドシアニングリーン蛍光造影、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）、スペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー、走査レーザー検眼鏡、共焦点顕微鏡、補償光学、眼底自己蛍光、生検、剖検及び免疫組織化学が挙げられる。したがって、血管疾患及び／又は黄斑浮腫は、フルオレセイン血管造影法によって決定されるような、漏出面積における１０％の低下時に対象において治療されると言うことができる。本開示の治療薬で治療される対象には、インスリンの全ての型及び降圧薬などの真性糖尿病と関連する状態を治療する既知の方法と共に、他の治療薬も投与することができる。

黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、血管性浮腫、多巣性脈絡膜炎、病的近視における脈絡膜新生血管、及び／又は未熟児網膜症などの眼疾患の治療及び／又は予防は、全体を通して記載される尺度のいずれかによって視覚機能及び／又は網膜解剖学的構造の臨床的に関連する測定を使用して、眼科医又は医療専門家によって決定することができる。本明細書に記載の尺度は、本明細書のありとあらゆる眼疾患には適用できないが、当業者であれば、所与の眼疾患を治療するために使用することができる視覚機能、及び／又は網膜解剖学的構造の臨床的に関連する測定を認識するであろう。

本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片が、別の薬剤と共に投与される場合、これら２つはいずれかの順番で逐次的に、又は同時に投与することができる。いくつかの態様では、本開示の抗ＢＴＣ抗体又はその抗原結合断片は、第２の薬剤（例えば、Ｂｅｏｖｕ／ブロルシズマブ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ／ラニビズマブ、Ａｖａｓｔｉｎ／ベビシズマブ、Ｅｙｌｅａ／アフリベルセプト、ペガプタニブ、パゾパニブ、ソラフィニブ、スニチニブ、及びラパマイシン）による療法も受けている対象に投与される。組み合わせ療法計画は相加的であってもよく、又はそれは相乗効果を生み出してもよい（例えば、２つの薬剤の組み合わせ使用で、予想されたものよりも網膜症の重症度における低減があること）。

更になお、本開示は、有効量の、抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートした治療用分子を治療を必要とする対象に投与することによって、障害（例えば、眼障害）を治療する方法に関する。分子は、眼において１００μＭ以下のＫＤで、ＢＴＣに結合する抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされることが企図される。例えば、抗ＢＴＣ結合部分は、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、４μＭ、３μＭ、２μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．１μＭ、０．０５μＭ、０．０１μＭ、又は０．００５μＭ以下のＫＤでＢＴＣに結合することができる。一態様では、この分子は、１００．０μＭ以下のＫＤでＢＴＣに結合する抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされている。一態様では、この分子は、１０μＭ以下のＫＤでＢＴＣに結合する抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされている。一態様では、抗ＢＴＣ結合部分にコンジュゲートされる分子は、５．０μＭ以下のＫＤでＢＴＣに結合する抗ＢＴＣ結合部分を含む。一態様では、抗ＢＴＣ抗体又はその機能的断片にコンジュゲートされている分子は、１．０μＭ以下のＫＤでＢＴＣに結合する抗ＢＴＣ結合部分を含む。更なる態様では、前述の方法は、投与のステップの前に、そのような状態又は障害を有する対象を診断するステップを更に含む。

ｘｉｉ．投薬
治療剤のための投与計画の選択は、実体の血清又は組織代謝回転率、徴候又は症状のレベル、実体の免疫原性、及び生体マトリックス中の標的細胞の到達性を含むいくつかの要因に依存する。ある特定の態様では、投与計画は、許容できる副作用レベルと一致する患者に送達される治療剤の量を最大にする。

投与量及び投与の頻度は、治療が予防的であるか治療的であるかによって変化し得る。本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分及び／又はＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子の投与は、投与量及び投薬頻度の臨床的に意味のある改善、例えば、投薬の減少及び／又は投薬頻度の減少をもたらす。投与量及び投薬頻度における臨床的に意味のある改善を達成することは、組成物の初回投与量に非常に依存し得る。

本明細書に記載のＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子の組成物は、複数回にわたり投与され得る。１回投与の間の間隔は、毎週又は毎月であり得る。間隔はまた、例えば、視力又は疾患の活動性に基づいて、患者の再治療の必要性が示すように不規則になることもある。加えて、代替的な投与間隔は、医師によって決定することができ、毎月投与されるか、又は有効であるために必要に応じて投与することができる。

一態様では、本明細書に記載のＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子、例えば、ＮＶＳ１１の、眼疾患、例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯの治療における有効性は、例えば、中心領域網膜厚ＥＴＤＲＳのスペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ－ＯＣＴ）で測定されるような中心網膜厚（ＣＲＴ、μｍ単位）の低下に基づく。別の態様では、本明細書に記載のＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子、例えば、ＮＶＳ１１の、眼疾患、例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯの治療における有効性は、例えば、論文で測定されるような最良矯正視力（ＢＣＶＡ）における改善に基づいている。

投与量及び投与の頻度は、例えば、治療が予防的であるか、治療的であるか、及び投与される分子の半減期によって影響されるかどうかに非常に依存する場合がある。本明細書に記載の分子の投与は、用量及び投薬頻度の臨床的に意味のある改善をもたらす。例えば、分子は、コンジュゲートされていない分子と比べてより低い頻度で投与され得る。投与量及び投薬頻度における臨床的に意味のある改善を達成することは、組成物の初回投与量に非常に依存し得る。

特定の患者のための有効量は、治療される状態、患者の全体的な健康状態、投与の方法経路及び用量、並びに副作用の重症度などの因子に依存して変化し得る（例えば、Ｍａｙｎａｒｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照されたい）。

本明細書には、眼疾患、例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、新生血管ＡＭＤ、又はＲＶＯを予防又は治療する方法であって、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子を、約０．２５～７．５ｍｇ／眼又は約７．５～１５ｍｇ／眼の範囲の用量で、例えば、０．２５ｍｇ／眼、０．７５ｍｇ／眼、２．５ｍｇ／眼、若しくは７．５ｍｇ／眼の用量で；又は８ｍｇ／眼、８．５ｍｇ／眼、９ｍｇ／眼、９．５ｍｇ／眼、１０ｍｇ／眼、１０．５ｍｇ／眼、１１ｍｇ／眼、１１．５ｍｇ／眼、１２ｍｇ／眼、１２．５ｍｇ／眼、１３ｍｇ／眼、１３．５ｍｇ／眼、１４ｍｇ／眼、１４．５ｍｇ／眼、若しくは１５ｍｇ／眼の用量で硝子体内投与することを含む方法が記載される。例示的な治療計画は、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、又は必要に応じて（ＰＲＮ）硝子体内投与することを伴う。一態様では、７．５ｍｇ／眼が、投与可能な最大用量である。別の態様では、７．５ｍｇ／眼が、安全な投与可能な最大用量である。

一態様では、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子は、０．２５ｍｇ／眼、０．３ｍｇ／眼、０．３５ｍｇ／眼、０．４ｍｇ／眼、０．４５ｍｇ／眼、０．５ｍｇ／眼、０．５５ｍｇ／眼、０．６ｍｇ／眼、０．６５ｍｇ／眼、０．７ｍｇ／眼、０．７５ｍｇ／眼、０．８ｍｇ／眼、０．８５ｍｇ／眼、０．９ｍｇ／眼、０．９５ｍｇ／眼、１．０ｍｇ／眼、１．１ｍｇ／眼、１．２ｍｇ／眼、１．３ｍｇ／眼、１．４ｍｇ／眼、１．５ｍｇ／眼、１．６ｍｇ／眼、１．７ｍｇ／眼、１．８ｍｇ／眼、１．９ｍｇ／眼、２．０ｍｇ／眼、２．１ｍｇ／眼、２．２ｍｇ／眼、２．３ｍｇ／眼、２．４ｍｇ／眼、２．５ｍｇ／眼、２．６ｍｇ／眼、２．７ｍｇ／眼、２．８ｍｇ／眼、２．９ｍｇ／眼、３．０ｍｇ／眼、３．１ｍｇ／眼、３．２ｍｇ／眼、３．３ｍｇ／眼、３．４ｍｇ／眼、３．５ｍｇ／眼、３．６ｍｇ／眼、３．７ｍｇ／眼、３．８ｍｇ／眼、３．９ｍｇ／眼、４．０ｍｇ／眼、４．１ｍｇ／眼、４．２ｍｇ／眼、４．３ｍｇ／眼、４．４ｍｇ／眼、４．５ｍｇ／眼、４．６ｍｇ／眼、４．７ｍｇ／眼、４．８ｍｇ／眼、４．９ｍｇ／眼、５．０ｍｇ／眼、５．１ｍｇ／眼、５．２ｍｇ／眼、５．３ｍｇ／眼、５．４ｍｇ／眼、５．５ｍｇ／眼、５．６ｍｇ／眼、５．７ｍｇ／眼、５．８ｍｇ／眼、５．９ｍｇ／眼、６．０ｍｇ／眼、６．１ｍｇ／眼、６．２ｍｇ／眼、６．３ｍｇ／眼、６．４ｍｇ／眼、６．５ｍｇ／眼、６．６ｍｇ／眼、６．７ｍｇ／眼、６．８ｍｇ／眼、６．９ｍｇ／眼、７．０ｍｇ／眼、７．１ｍｇ／眼、７．２ｍｇ／眼、７．３ｍｇ／眼、７．４ｍｇ／眼、又は７．５ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与することができる。

別の態様では、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子は、０．２５～０．７５ｍｇ／眼、０．３～０．７５ｍｇ／眼、０．３５～０．７５ｍｇ／眼、０．４～０．７５ｍｇ／眼、０．４５～０．７５ｍｇ／眼、０．５～０．７５ｍｇ／眼、０．５５～０．７５ｍｇ／眼、０．６～０．７５ｍｇ／眼、０．６５～０．７５ｍｇ／眼、０．７～０．７５ｍｇ／眼、０．２５～０．７ｍｇ／眼、０．２５～０．６５ｍｇ／眼、０．２５～０．６ｍｇ／眼、０．２５～０．５５ｍｇ／眼、０．２５～０．５ｍｇ／眼、０．２５～０．４５ｍｇ／眼、０．２５～０．４ｍｇ／眼、０．２５～０．３５ｍｇ／眼、０．２５～０．３ｍｇ／眼、０．３～０．７ｍｇ／眼、０．３５～０．６５ｍｇ／眼、０．４～０．６ｍｇ／眼、０．４５～０．５５ｍｇ／眼、０．３５～０．４５ｍｇ／眼、０．４５～０．５５ｍｇ／眼、又は０．５５～０．６５ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与することができる。

別の態様では、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子は、０．７５～２．５ｍｇ／眼、０．８～２．５ｍｇ／眼、０．８５～２．５ｍｇ／眼、０．９～２．５ｍｇ／眼、０．９５～２．５ｍｇ／眼、１～２．５ｍｇ／眼、１．２５～２．５ｍｇ／眼、１．５～２．５ｍｇ／眼、１．７５～２．５ｍｇ／眼、２～２．５ｍｇ／眼、２．２５～２．５ｍｇ／眼、０．７５～２．２５ｍｇ／眼、０．７５～２ｍｇ／眼、０．７５～１．７５ｍｇ／眼、０．７５～１．５ｍｇ／眼、０．７５～１．２５ｍｇ／眼、０．７５～１ｍｇ／眼、０．８～２．２５ｍｇ／眼、０．８５～２ｍｇ／眼、０．９～１．７５ｍｇ／眼、０．９５～１．５ｍｇ／眼、１～１．２５ｍｇ／眼、０．８～０．９ｍｇ／眼、０．９～１ｍｇ／眼、１～１．２５ｍｇ／眼、１．２５～１．５ｍｇ／眼、１．５～１．７５ｍｇ／眼、１．７５～２ｍｇ／眼、２～２．２５ｍｇ／眼、又は２．２５～２．５ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与することができる。

一態様では、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子は、２．５～７．５ｍｇ／眼、２．７５～７．５ｍｇ／眼、３～７．５ｍｇ／眼、３．２５～７．５ｍｇ／眼、３．５～７．５ｍｇ／眼、３．７５～７．５ｍｇ／眼、４～７．５ｍｇ／眼、４．２５～７．５ｍｇ／眼、４．５～７．５ｍｇ／眼、４．７５～７．５ｍｇ／眼、５～７．５ｍｇ／眼、５．２５～７．５ｍｇ／眼、５．５～７．５ｍｇ／眼、５．７５～７．５ｍｇ／眼、６～７．５ｍｇ／眼、６．２５～７．５ｍｇ／眼、６．５～７．５ｍｇ／眼、６．７５～７．５ｍｇ／眼、７～７．５ｍｇ／眼、７．２５～７．５ｍｇ／眼、２．５～７．２５ｍｇ／眼、２．５～７ｍｇ／眼、２．５～６．７５ｍｇ／眼、２．５～６．５ｍｇ／眼、２．５～６．２５ｍｇ／眼、２．５～６ｍｇ／眼、２．５～５．７５ｍｇ／眼、２．５～５．５ｍｇ／眼、２．５～５．２５ｍｇ／眼、２．５～５ｍｇ／眼、２．５～４．７５ｍｇ／眼、２．５～４．５ｍｇ／眼、２．５～４．２５ｍｇ／眼、２．５～４ｍｇ／眼、２．５～３．７５ｍｇ／眼、２．５～３．５ｍｇ／眼、２．５～３．２５ｍｇ／眼、２．５～３ｍｇ／眼、２．５～２．７５ｍｇ／眼、２．７５～７．２５ｍｇ／眼、３～７ｍｇ／眼、３．２５～６．７５ｍｇ／眼、３．５～６．５ｍｇ／眼、３．７５～６．２５ｍｇ／眼、４～６ｍｇ／眼、４．２５～５．７５ｍｇ／眼、４．５～５．５ｍｇ／眼、４．７５～５．２５ｍｇ／眼、２．７５～３ｍｇ／眼、３～３．２５ｍｇ／眼、３．２５～３．５ｍｇ／眼、３．５～３．７５ｍｇ／眼、３．７５～４ｍｇ／眼、４～４．２５ｍｇ／眼、４．２５～４．５ｍｇ／眼、４．５～４．７５ｍｇ／眼、４．７５～５ｍｇ／眼、５～５．２５ｍｇ／眼、５．２５～５．５ｍｇ／眼、５．５～５．７５ｍｇ／眼、５．７５～６ｍｇ／眼、６～６．２５ｍｇ／眼、６．２５～６．５ｍｇ／眼、６．５～６．７５ｍｇ／眼、６．７５～７ｍｇ／眼、７～７．２５ｍｇ／眼、又は７．２５～７．５ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与することができる。

一態様では、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子は、７．５～１５ｍｇ／眼、８～１５ｍｇ／眼、８．５～１５ｍｇ／眼、９～１５ｍｇ／眼、９．５～１５ｍｇ／眼、１０～１５ｍｇ／眼、１０．５～１５ｍｇ／眼、１１～１５ｍｇ／眼、１１．５～１５ｍｇ／眼、１２～１５ｍｇ／眼、１２．５～１５ｍｇ／眼、１３～１５ｍｇ／眼、１３．５～１５ｍｇ／眼、１４～１５ｍｇ／眼、１４．５～１５ｍｇ／眼、７．５～１４．５ｍｇ／眼、７．５～１４ｍｇ／眼、７．５～１３．５ｍｇ／眼、７．５～１３ｍｇ／眼、７．５～１２．５ｍｇ／眼、７．５～１２ｍｇ／眼、７．５～１１．５ｍｇ／眼、７．５～１１ｍｇ／眼、７．５～１０．５ｍｇ／眼、７．５～１０ｍｇ／眼、７．５～９．５ｍｇ／眼、７．５～９ｍｇ／眼、７．５～８．５ｍｇ／眼、７．５～８ｍｇ／眼、８～１４．５ｍｇ／眼、８．５～１４ｍｇ／眼、９～１３．５ｍｇ／眼、９．５～１３ｍｇ／眼、１０～１２．５ｍｇ／眼、１０．５～１２ｍｇ／眼、１１～１１．５ｍｇ／眼、８～８．５ｍｇ／眼、８．５～９ｍｇ／眼、９～９．５ｍｇ／眼、９．５～１０ｍｇ／眼、１０～１０．５ｍｇ／眼、１０．５～１１ｍｇ／眼、１１～１１．５ｍｇ／眼、１１．５～１２ｍｇ／眼、１２～１２．５ｍｇ／眼、１２．５～１３ｍｇ／眼、１３～１３．５ｍｇ／眼、１３．５～１４ｍｇ／眼、１４～１４．５ｍｇ／眼、又は１４．５～１５ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与することができる。

ある特定の態様では、本明細書に提供される方法（例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯを予防又は治療するための方法）で使用するための、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子（例えば、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ１１のＬＣＤＲ及びＨＣＤＲを含む抗体などの表３に記載されるような）は、０．２５ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与によって投与される。

別の態様では、本明細書に提供される方法（例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯを予防又は治療するための方法）で使用するための、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子（例えば、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ１１のＬＣＤＲ及びＨＣＤＲを含む抗体などの表３に記載されるような）は、０．７５ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与によって投与される。

別の態様では、本明細書に提供される方法（例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯを予防又は治療するための方法）で使用するための、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子（例えば、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ１１のＬＣＤＲ及びＨＣＤＲを含む抗体などの表３に記載されるような）は、１ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与によって投与される。

別の態様では、本明細書に提供される方法（例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯを予防又は治療するための方法）で使用するための、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子（例えば、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ１１のＬＣＤＲ及びＨＣＤＲを含む抗体などの表３に記載されるような）は、１．５ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与によって投与される。

別の態様では、本明細書に提供される方法（例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯを予防又は治療するための方法）で使用するための、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子（例えば、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ１１のＬＣＤＲ及びＨＣＤＲを含む抗体などの表３に記載されるような）は、２ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与によって投与される。

別の態様では、本明細書に提供される方法（例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯを予防又は治療するための方法）で使用するための、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子（例えば、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ１１のＬＣＤＲ及びＨＣＤＲを含む抗体などの表３に記載されるような）は、２．５ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与によって投与される。

別の態様では、本明細書に提供される方法（例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯを予防又は治療するための方法）で使用するための、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子（例えば、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ１１のＬＣＤＲ及びＨＣＤＲを含む抗体などの表３に記載されるような）は、３ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与によって投与される。

別の態様では、本明細書に提供される方法（例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯを予防又は治療するための方法）で使用するための、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子（例えば、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ１１のＬＣＤＲ及びＨＣＤＲを含む抗体などの表３に記載されるような）は、５ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与によって投与される。

別の態様では、本明細書に提供される方法（例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯを予防又は治療するための方法）で使用するための、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子（例えば、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ１１のＬＣＤＲ及びＨＣＤＲを含む抗体などの表３に記載されるような）は、７．５ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与によって投与される。

別の態様では、本明細書に提供される方法（例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯを予防又は治療するための方法）で使用するための、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子（例えば、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ１１のＬＣＤＲ及びＨＣＤＲを含む抗体などの表３に記載されるような）は、１０ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与によって投与される。

別の態様では、本明細書に提供される方法（例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、例えば、新生血管ＡＭＤ、及び／又はＲＶＯを予防又は治療するための方法）で使用するための、本明細書に記載の抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子（例えば、ＮＶＳ１１又はＮＶＳ１１のＬＣＤＲ及びＨＣＤＲを含む抗体などの表３に記載されるような）は、１５ｍｇ／眼の用量で、例えば、硝子体内投与によって投与される。

本明細書には、眼疾患、例えば、黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、新生血管ＡＭＤ、又はＲＶＯを予防又は治療する方法であって、本明細書に記載の抗ＢＴＣ抗体、例えば、ＮＶＳ１を約０．１２５～３．７５ｍｇ／眼又は３．７５～７．５ｍｇ／眼の範囲の投与量で、例えば、０．１２５ｍｇ／眼、０．３７５ｍｇ／眼、１．２５ｍｇ／眼、若しくは３．７５ｍｇ／眼の用量で；又は４ｍｇ／眼、４．２５ｍｇ／眼、４．５ｍｇ／眼、４．７５ｍｇ／眼、５ｍｇ／眼、５．２５ｍｇ／眼、５．５ｍｇ／眼、５．７５ｍｇ／眼、６ｍｇ／眼、６．２５ｍｇ／眼、６．５ｍｇ／眼、６．７５ｍｇ／眼、７ｍｇ／眼、７．２５ｍｇ／眼、若しくは７．５ｍｇ／眼の用量で硝子体内投与することを含む方法が記載される。例示的な治療計画は、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、又は必要に応じて（ＰＲＮ）硝子体内投与することを伴う。

本開示の様々な（列挙された）態様が、本明細書に記載されている。各態様に規定された特徴を他の特定の特徴と組み合わせることにより本開示のさらなる態様を提供し得ることは、分かるであろう。ある態様が前の態様に「従って」と記述されている場合、前の態様は、そのサブ態様を含む。本明細書の全体を通して引用される任意の特許、特許出願、及び参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。文脈によって別段の要求がない限り、本明細書で使用される単数用語は複数を含むものとし、複数用語は単数を含むものとする。

本開示は、以下の実施例によって更に例示され、実施例は、更なる限定として解釈されるべきではない。

実施例１．親和性成熟ＢＴＣ抗体のスクリーニング
抗ＢＴＣ Ｆａｂを、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ’ＨｕＣＡＬ（登録商標）（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙ）技術を使用してインビトロで単離し、精製されたヒト及びマウスベータセルリン抗原を使用して、特異的抗ＢＴＣ結合抗体を特定した。

完全ヒトファージディスプレイライブラリを使用して、本明細書に記載のベータセルリン結合抗体を生成した。ビオチン化及び非ビオチン化ヒト並びにカニクイザルベータセルリンを、溶液及び固相パニングで使用した。標準パニング並びにＲａｐＭＡＴアプローチ（Ｐｒａｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １（４）：５７１－５８３）を実施した。二次スクリーニング及びＲａｐＭＡＴパニング後に、クローンを配列分析用に選択し、４つの抗体のセットを、ＦａｂＣｙｓ形式への変換、生殖細胞系列化、ｐＩ最適化、及び脱アミド化部位の除去のために選択した。ＦａｂＣｙｓの生成を、独自のＲａｐＣＬＯＮＥ（登録商標）法を用いて達成した。ＲａｐＣＬＯＮＥ（登録商標）は、便宜上及び大量のＦａｂクローンのＩｇＧ及びＦａｂＣｙｓ形式への効率的な変換のために２段階の方法として実施した。第１のクローニングステップでは、真核細胞発現カセットをＢｓｉＷＩ／ＭｆｅＩ（Ｋプールの場合）又はＨｐａＩ／ＭｆｅＩ（λプールの場合）消化及びその後のライゲーションを介して、発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×１１（ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）の場合）中に導入した。この後第２のクローニングステップが続き、ここでは発現カセットを含有するＦａｂプールを、ＥｃｏＲＶ／ＢｌｐＩ（κ及びλプール）を使用して消化し、その後哺乳動物細胞中の発現のために、ｐＭｏｒｐｈ（登録商標）４＿ＩｇＧ１ｆ又はｐＭｏｒｐｈ（登録商標）４＿ｈ＿ＦａｂＣｙｓアクセプターベクター中にクローニングした。このプロジェクトでは、ＲａｐＣＬＯＮＥ（登録商標）をユニークな配列決定され、特性評価されたＦａｂのみに適用した。したがって、全てのクローンは、ＲａｐＣＬＯＮＥ（登録商標）後に回収した。

以下のセクションは、親和性成熟ＢＴＣ抗体のスクリーニングの更なる詳細を提供する。

ａ）ベータセルリンに対する固相パニング
ＨｕＣＡＬ（登録商標）ファージミドライブラリ（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６，５７－８６，２０００）をファージ表面上にＦａｂを表示するために、ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術と共に使用した（Ｌｏｈｎｉｎｇ，２００１ 国際公開第０１／０５９５０号パンフレット）。

９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートを、３００μｌの抗原（可溶性処理された）ベータセルリン種で、４℃でｏ／ｎ（一晩）コーティングした。コーティングされたウェルをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）／５％粉乳でブロッキングした。各パニングについては、約４×１０^１３ＨｕＣＡＬ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ファージ抗体を等容量のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／５％粉乳／５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）でブロッキングした。ファージブロッキング中に、追加のブロッキング試薬をＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート上にコーティングし、ブロッキングされたファージ調製物をコーティングされた試薬上で予備洗浄し、抗原のタグに対する抗体の選択を回避した。ブロッキング手順の後に、３００μｌのプレブロッキングされたファージミックスを、各抗原がコーティングされ、ブロッキングされたウェルに添加し、マイクロタイタープレート振盪機上で、ＲＴ（室温）にて２ｈ（時間）インキュベートした。その後、特異的に結合していないファージを、最初にＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、次いで、ＰＢＳを使用して数回の洗浄ステップによって洗い流した。特異的に結合したファージの溶出については、ウェル毎に１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（塩酸）ｐＨ８中の２５ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）３００μｌを、ＲＴで１０分間添加した。ＤＴＴ溶出液を１４ｍｌの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＴＧ１中に移し、それを０．６～０．８のＯＤ（光学密度）_６００まで増殖させた。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））ＴＧ１とＤＴＴ溶出液とのミックスを、ファージ感染のために、３７℃（摂氏）の水浴中で４５ｍｉｎ（分）間インキュベートした。細菌ペレットを２×ＹＴ酵母抽出物トリプトン）培地中に再懸濁させ、ＬＢ／Ｃａｍ（クロラムフェニコール）寒天プレート上に播種し、３０℃でｏ／ｎインキュベートした。コロニーをプレートからこすり取り、ファージレスキュー、選択されたクローンのポリクローナル増幅、及びファージ産生に使用した。精製されたファージを用いて、次のパニングラウンドを開始した。

固相パニングの第２及び第３ラウンドを、より厳密な洗浄条件を除いて、第１ラウンドのプロトコルに従って実施した。

ｂ）ベータセルリンに対する溶液パニング
溶液パニングの必要前提条件は、抗原のビオチン化及びビオチン化抗原の保持された活性の確認であった。溶液パニング中に、Ｆａｂディスプレイファージ及びビオチン化抗原を溶液中でインキュベートし、ファージによる抗原の接触性を促進した。

ｃ）ストレプトアビジン結合磁気ビーズを用いた溶液パニングプロトコル
ファージプールごとに、４ｍｇのストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ中でブロッキングした。並行して、各パニングについて、約４×１０^１３ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ－抗体を等容量の２×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でブロッキングした。ビーズ結合ファージの除去については、ブロッキングされたファージ粒子の予備吸着を、それぞれ１ｍｇのブロッキングされたストレプトアビジンビーズを使用して２回実施した。ビオチンに対する抗体の選択を回避するために、サブコード及び選択ラウンド当たり１ｍｇのストレプトアビジンビーズを、ファージの予備吸着に使用した無関係なビオチン化抗原でコーティングした。ファージブロッキング中に、非ビオチン化ブロッキング試薬をブロッキングバッファに添加し、タグ（例えば、無関係なＦＬＡＧ＿６×Ｈｉｓ抗原）に対する抗体の選択を回避した。続いて、ビオチン化ベータセルリン種（例えば、１００ｎＭ）を、予備吸着され、ブロッキングされたファージ粒子に添加し、ローター上でＲＴにて１～２時間インキュベートした。ファージ－抗原複合体を、２ｍｇのブロッキングされたストレプトアビジンビーズを使用して捕捉し、ストレプトアビジンビーズに結合したファージ粒子を、磁気分離器で回収した。特異的に結合しなかったファージを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及びＰＢＳを使用する数回の洗浄ステップによって洗い流した。ストレプトアビジンビーズからの特異的に結合したファージの溶出液については、ウェル当たり１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８中の２５ｍＭのＤＴＴの２００μｌをＲＴで１０分間添加した。次いで、ＤＴＴ溶出液を１４ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１中に移し、これを０．６～０．８のＯＤ_６００まで増殖させた。ＴＧ１とＤＴＴ溶出液とのミックスを、ファージ感染のために、３７℃の水浴中で４５分間インキュベートした。細菌ペレットを２×ＹＴ培地中に再懸濁させ、ＬＢ／Ｃａｍ寒天プレート上に播種し、３０℃でｏ／ｎインキュベートした。コロニーをプレートからこすり取り、ファージレスキュー、選択されたコロニーのポリクローナル増幅、及びファージ産生に使用した。精製されたファージを用いて、次のパニングラウンドを開始した。溶液パニングの第２及び第３ラウンドを、抗原の減少量及びより厳密な洗浄条件を除いて、第１ラウンドのプロトコルに従って実施した。１つの戦略では、オフレート選択（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６，８８９－８９６，１９９２）をパニングの第３ラウンドで実施した。

ｄ）ＥＬＩＳＡ（結合、効力）及びＦＡＣＳスクリーニングのための細菌溶解物を含有するＦａｂのスクリーニング
５μｌの各ｏ／ｎ培養物を、ウェル当たり４０μｌの２×ＹＴ培地（３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃａｍ）；０．１％のグルコース）を予め充填した滅菌３８４ウェルマイクロタイタープレートに移した。培養物がわずかに濁るまで、プレートを３７℃でインキュベートした。これらの発現プレートに、１０μｌの２×ＹＴ培地（３４μｇ／ｍｌのＣａｍ及び２．５～５ｍＭのＩＰＴＧ））をウェルごとに添加した。プレートをガス透過性テープで密封し、２２℃でｏ／ｎインキュベートした。発現プレートの各ウェルに、１５μｌのＢＥＬバッファ（２．５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、４ｍＭのＥＤＴＡ、１０Ｕ／μｌのベンゾナーゼ）を添加し、プレートを１時間インキュベートした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物を含有するＦａｂを、スクリーニングの目的のために使用した。この方法は、ＦＡＣＳスクリーニングのために僅かに変更された。

ｅ）ＨＵＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｆａｂ断片のサブクローニング
可溶性Ｆａｂの迅速な発現を容易とするため、選択されたＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージのインサートをコード化するＦａｂを、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）３０ディスプレイベクターからｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×１１発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×１１＿ＦＨへとサブクローニングした。サブクローニングは、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ／ＢｍｔＩを介した三重消化によって実施した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１－Ｆ^－の形質転換後、単一クローン発現及びＨｕＣＡＬ（登録商標）－Ｆａｂ断片を含有するペリプラズム抽出物の調製を、以前に記載されたように実施した（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，３８１９４－３８２０５，２００３）。

ｆ）マスタープレートの生成
クロラムフェニコール耐性単一クローンを、６０μｌの２×ＹＴ－ＣＧ（３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃａｍ）；０．１％のグルコース）培地で予め充填された滅菌３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに拾い上げ、３７℃でｏ／ｎで増殖させた。翌朝、３０％のグリセロールを含有する滅菌２×ＹＴ培地１００μｌを、マスタープレートの各ウェルに添加し、プレートをアルミ箔で密封して、－８０℃で保存した。

以下の２つのセクションは、それぞれ３８４ウェル形式及び９６ウェル形式でのＦａｂ発現大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの溶解物の調製を記載する。これらの発現プレートは、ＥＬＩＳＡ及び／又はＦＡＣＳスクリーニングアプローチのために後に使用した。

ｇ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＨｉｓタグ付きＦａｂ断片の発現及び精製（ｍｇスケール）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１ Ｆ細胞中でのｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×１１＿Ｆａｂ＿ＦＨ及びｐＹＢｅｘ１０（登録商標）＿Ｆａｂ＿ＦＨによってコード化されたＦａｂ断片の発現を、０．１％のグルコース及び３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した５００ｍｌの２×ＹＴ培地を使用する振盪フラスコ培養で行った。培養物をＯＤ_６００が０．５の値に達するまで、３０℃（ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×１１＿Ｆａｂ＿ＦＨ）又は２２℃（ｐＹＢｅｘ１０（登録商標）＿Ｆａｂ＿ＦＨ）で振盪した。ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド）を、０．７５ｍＭ（ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×１１＿Ｆａｂ＿ＦＨ）又は０．５ｍＭ（ｐＹＢｅｘ１０（登録商標）＿Ｆａｂ＿ＦＨ）の最終濃度で添加し、更なる培養を、３０℃（ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×１１＿Ｆａｂ＿ＦＨ）又は２２℃（ｐＹＢｅｘ１０（登録商標）＿Ｆａｂ＿ＦＨ）で２０時間行うことによってＦａｂ発現を誘導した。細胞を採取し、リゾチームを使用して破壊させた。Ｈｉｓ_６タグ付きＦａｂ断片をＩＭＡＣ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して単離し、イミダゾールを使用して溶出させた。１×ダルベッコのＰＢＳ（ｐＨ７．２）へのバッファ交換を、ＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。サンプルを滅菌濾過（０．２μｍ）した。タンパク質濃度を、紫外分光光度法によって決定した。サンプルの純度は、１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥの変性、非還元で分析された。Ｆａｂ調製物の均質性を、校正標準を用いたサイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰ－ＳＥＣ）により、ネイティブ状態で決定した。

ｈ）哺乳動物ＩｇＧ及びＦａｂＣｙｓ形式への変換
ＲａｐＣＬＯＮＥ（登録商標）を、便宜上及び大量のＦａｂクローンのＦａｂＣｙｓ形式への効率的な変換のために２段階の方法として実施した。最初のクローニングステップにおいて、真核細胞発現カセットを、ＢｓｉＷＩ／ＭｆｅＩ（κプールの場合）又はＨｐａＩ／ＭｆｅＩ（λプールの場合）消化及びその後のライゲーションを介して、発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×１１中に導入した。この後第２のクローニングステップが続き、ここでは発現カセットを含有するＦａｂプールを、ＥｃｏＲＶ／ＢｌｐＩ（κ及びλプール）を使用して消化し、その後哺乳動物細胞中の発現のために、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）４＿ＦａｂＣｙｓアクセプターベクター中にクローニングした。

ｉ）ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）４ベクター系を使用するヒトＦａｂＣｙｓの発現及び精製
真核生物のＨＫＢ１１細胞は、ＦａｂＣｙｓの重鎖と軽鎖の両方をコード化するｐＭＯＲＰＨ（登録商標）４又はｐＹＭｅｘ発現ベクターＤＮＡでトランスフェクトされた。細胞培養物の上清をトランスフェクション後３日目に採取し、ＦａｂＣｙｓの精製のために、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にかけた。特に明記しない限り、１×ダルベッコのＰＢＳ（ｐＨ７．２、インビトロゲン）へのバッファ交換を実施し、サンプルを滅菌濾過（０．２μｍの孔径）した。ＦａｂＣｙｓの純度を、ＣＥ－ＳＤＳ（ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を使用して、変性、還元、及び非還元条件下で分析した。タンパク質濃度を紫外分光光度法によって決定し、ＨＰ－ＳＥＣを実施してネイティブ状態でタンパク質調製物を分析した。

親抗ＢＴＣ Ｆａｂを生成した。親和性成熟（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９６：５７－８６）後に、４つの抗体のセットを、ジスルフィド架橋Ｆａｂ形式への変換のために引き続いて選択した。得られたジスルフィド架橋Ｆａｂを、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、及びＮＶＳ４として表示する。

ＮＶＳ１～ＮＶＳ４の様々な種からのＢＴＣタンパク質に対する結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで測定した。結果は、以下の表６に提供される通りである。

表５は、ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、及びＮＶＳ４の各々についての親及び親和性成熟バリアントの配列を列挙する。

ｊ）競合ＥＬＩＳＡを介したエピトープビニング
エピトープビニングについては、Ｆａｂ Ａを一定量でＭａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングし、溶液中のＦａｂ Ｂの増加量との競合について試験した。陽性対照として、コーティングされたＦａｂを溶液中でそれ自体との競合について分析した。試験した全てのＦａｂを、ビオチン化ヒトＢＴＣと１０倍モル過剰で溶液中でＲＴにて１時間インキュベートした。次いで、抗原／抗体複合体をコーティングされた抗体に添加し、ビオチン化抗原を介した結合複合体の検出を行った。一般的に、高Ｆａｂ濃度でのシグナルは、コーティングされたＦａｂが溶液中で試験されるＦａｂとは異なる抗原上のアクセス可能なエピトープに結合することができる場合のみ（すなわち、非競合的抗体）得ることができる。対照的に、競合的抗体、エピトープと部分的に重複する抗体、又は立体障害によってエピトープをブロッキングする抗体については、高Ｆａｂ濃度での結合シグナルは、対照と対比して著しく減少する。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートのそれぞれのウェルを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度で２０μｌ／ウェルのＦａｂ Ａでコーティングし、４℃で一晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、９０μｌの５％ＭＰＢＳＴウェルでＲＴにて２時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。抗原／抗体予備インキュベーションについては、抗ＢＴＣ抗体（Ｆａｂ Ｂ）を１：３のステップで滴定した（２５μｇ／ｍｌの最終濃度で開始し、０．６μｇ／ｍｌの最終濃度のビオチン化ＢＴＣと共にＲＴで１時間インキュベートした）。２０μｌ／ウェルの予備インキュベートしたＢＴＣ／抗体複合体を、ブロッキングされ、洗浄されたＭａｘｉｓｏｒｐプレートに添加し、穏やかに振盪しながらＲＴで２０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１％のＢＳＡ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ中に１：５０００で希釈した２０μｌ／ウェルのストレプトアビジン－ＡＰ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｔａｒ６ｂ）と共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、２０μｌのＡｔｔｏＰｈｏｓ溶液（ｄｄＨ２Ｏで１：１０で希釈）を添加し、プレートをＴｅｃａｎリーダーで測定した。

ｋ）ＥＬＩＳＡベースのエピトープビニング
ファミリー当たり１つの親和性成熟バリアントを、競合ＥＬＩＳＡで他の代表物に対して試験した。親和性成熟は、主にＨＣＤＲ３中の配列を変化させることによって実施した。各試験候補物質（ＴＣ）は、異なる親ファミリーに由来したが、例外として、ＴＣ１２はＮＶＳ３と同じファミリーに由来し、ＴＣ１５とＴＣ１６はＮＶＳ２と同じファミリーに由来し、ＴＣ２３はＮＶＳ４と同じファミリーに由来する。ＴＣ１～ＴＣ８及びＴＣ１０～ＴＣ３０は、全体を通して記載されるように、ＨｕＣＡＬ又はＹｌａｎｔｈｉａのいずれかから特定された親和性成熟候補物質を表す。

以下の表７に示すように、１つの主要なビンＥ及び１つの小さなビンＢ（ＴＣ１１による唯一の標的）を明確に特定した。

以下の表８に示すように、２つの主要なビン（ビンＡ及びビンＥ）並びに３つの小さいビン（ビンＢ、Ｃ、Ｄ）を特定した。

ｌ）ＮＶＳ１～ＮＶＳ４の特性評価
４つの親和性成熟候補物質のＮＶＳ１～ＮＶＳ４を、以下の実施例に提供されるようなアッセイで特性評価（例えば、効力及び親和性）に供した。結果は、以下の表９に提供する通りである。

実施例２．抗ＢＴＣ抗体の結晶学的エピトープ
ａ）ヒトベータセルリン／Ｆａｂ複合体のＸ線結晶学的構造決定
抗体ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、及びＮＶＳ４の４つのＦａｂ断片に結合したヒトＢＴＣ（配列番号１５７）の結晶構造を決定した。以下に詳述するように、Ｆａｂ断片を発現させ、精製した。不溶性の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたＢＴＣの成熟形態をリフォールディングし、精製した。精製されたＢＴＣ及びＦａｂタンパク質を混合し、得られた複合体を精製し、結晶化させた。エピトープを定義するために、Ｘ線結晶構造解析を使用して、Ｆａｂ断片に結合したＢＴＣの原子分解能構造を決定した。

ｂ）タンパク質産生
結晶学用に産生されたＢＴＣ及びＦａｂ（ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、及びＮＶＳ４）の配列を表１に示す。ＢＴＣの発現構築物は、ヒトタンパク質プロベータセルリン（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ３５０７０、配列番号１５６）の残基３２～１１１（下線付き）と共に、組換え発現ベクターからのＮ－末端及びＣ－末端残基（小文字で示す、配列番号１５７）を含む。Ｎ－末端開始コドンは、成熟ＢＴＣ配列の開始残基の前にアミノ酸ＭＥＴの付加をもたらした。成熟したＢＴＣ配列のＣ－末端を、ヘキサ－ヒスチジン精製タグと融合させた。Ｆａｂ（ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、及びＮＶＳ）については、重鎖及び軽鎖の配列を以下の表１０に示す。

ＢＴＣを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）ＳＴＡＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で発現させた。１ｍＭのＩＰＴＧによる３７℃での４時間の誘導後に、細胞を採取し、溶解させた。不溶性ペレットを、５０ｍＭの２Ｍ尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５ｍＭのＤＴＴ、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で２回洗浄し、続いて、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で１回洗浄した。洗浄した封入体を、８Ｍの尿素、５０ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ８．０、０．３ＭのＮａＣｌ中に溶解し、続いて、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清に、同じバッファ中で平衡化させたＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を添加し、混合物を４℃で１時間回転させた。樹脂を重力流カラム中で回収し、平衡バッファで洗浄し、続いて、２５ｍＭのイミダゾールを含有する同じバッファで洗浄した。３００ｍＭのイミダゾールを含有する同じバッファを用いて、タンパク質を溶出させた。この溶出液に０．１Ｍの還元型グルタチオンを添加し、次いで、室温で２時間インキュベートし、その後、０．５ｍＭの酸化型グルタチオンを添加した。次いで、タンパク質溶液を、３５００Ｄａのｍｗｃｏを用いて、５Ｍの尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、０．５ｍＭの酸化型グルタチオンに対して、カバーを外して室温で約４時間透析した。次に、透析チューブを２．５Ｍの尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、０．５ｍＭの酸化型グルタチオンの８Ｌ中に移動させ、一晩透析した。次いで、透析チューブを１Ｍの尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、０．５ｍＭの酸化型グルタチオンの８Ｌ中に移動させ、約４時間透析した。５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭの酸化型グルタチオン中に最後に移動させて、これを一晩透析した。透析液を０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、目に見える沈殿物を除去した。リフォールディングしたベータセルリンタンパク質を濃縮させ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。単量体ＢＴＣｈｉｓを含有する分画をプールした。

精製したＢＴＣを、精製したＦａｂと２：１のモル比で混合することによって、ＢＴＣ／Ｆａｂ複合体を調製した。複合体を室温で１時間インキュベートし、次いで、濃縮して、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。ピーク分画を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＬＣＭＳによって分析した。ＢＴＣ／Ｆａｂ複合体を含有する分画をプールした。

ｃ）結晶化及び構造決定
データ収集のためのＢＴＣ／ＮＶＳ１結晶を、２０℃でのシッティングドロップ蒸気拡散法によって成長させた。ＢＴＣ／ＮＶＳ１複合体を、７ｍｇ／ｍｌまで濃縮させた。０．５μｌの複合体を、２７％のＰＥＧ４０００、０．１７Ｍの硫酸アンモニウム、５％のグリセロールを含有する０．５μｌのリザーバ溶液と混合して、同じリザーバ溶液１０００μｌに対してドロップを平衡化することによって、結晶を成長させた。データ収集前に、２９％のＰＥＧ４０００、１２％のエチレングリコール、１０％のグリセロール、０．１７Ｍの硫酸アンモニウムの数μｌを、結晶含有ドロップに添加し、次いで、結晶を液体窒素中で急速冷却させた。

データ収集のためのＢＴＣ／ＮＶＳ２結晶を、４℃でのシッティングドロップ蒸気拡散法によって成長させた。ＢＴＣ／ＮＶＳ２複合体を、約２５ｍｇ／ｍｌまで濃縮させた。１５０ｎｌの複合体を、５％のＰＥＧ１０００、４０％のエタノール、０．１Ｍのリン酸／クエン酸、ｐＨ４．２を含有する１５０ｎｌのリザーバ溶液と混合して、４０μｌの同じリザーバ溶液に対してドロップを平衡化することによって、結晶を成長させた。データ収集のために、結晶を液体窒素中で急速冷却させた。

データ収集のためのＢＴＣ／ＮＶＳ３結晶を、４℃でのシッティングドロップ蒸気拡散法によって成長させた。ＢＴＣ／ＮＶＳ３複合体を、約１２ｍｇ／ｍｌまで濃縮させた。１５０ｎｌの複合体を、３０％のＰＥＧ４００、０．１Ｍの酢酸ナトリウム三水和物、ｐＨ４．５、０．２Ｍの酢酸カルシウム水和物を含有する１５０ｎｌのリザーバ溶液と混合して、４０μｌの同じリザーバ溶液に対してドロップを平衡化することによって、結晶を成長させた。データ収集のために、結晶を液体窒素中で急速冷却させた。

データ収集のためのＢＴＣ／ＮＶＳ４結晶を、２０℃でのシッティングドロップ蒸気拡散法によって成長させた。ＢＴＣ／ＮＶＳ４複合体を、約１３ｍｇ／ｍｌまで濃縮させた。１５０ｎｌの複合体を、０．２Ｍの塩化マグネシウム六水和物、０．１ＭのＴｒｉｓ塩酸塩、ｐＨ８．５、２０％のＰＥＧ８０００を含有する１５０ｎｌのリザーバ溶液と混合して、４０μｌの同じリザーバ溶液に対してドロップを平衡化することによって、結晶を成長させた。データ収集の前に、２２％のＰＥＧ８０００、１２％のエチレングリコール、１０％のグリセロール、０．１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．５、０．２Ｍの塩化マグネシウムの数μｌをドロップに添加し、次いで、結晶を液体窒素中で急速冷却させた。

回折データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡ）でビームライン１７－ＩＤで収集した。データを処理し、Ａｕｔｏｐｒｏｃ（バージョン１．１．７．Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ，ＬＴＤ）を使用してスケーリングした。解像度限界、空間群、及び格子乗数を表２に要約する。複合体の構造を、社内Ｆａｂ構造を探索モデルとして使用して、ＰＨＥＮＩＸ（ｖ．１．１２＿２８２９，Ａｄａｍｓ ｅｔ．ａｌ．，（２０１０）Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６：２１３－２２１）を用いた分子置換によって解明した。ＢＴＣ構造を、ＣＯＯＴ（ｖ．０．８．８）（Ｅｍｓｌｅｙ＆Ｃｏｗｔａｎ（２００４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６０：２１２６－２１３２）を使用して、部分的に精密化されたＦａｂモデル中に直接組み込んだ。最終的なモデルに繰り返し組み込み、ＣＯＯＴ及びＰＨＥＮＩＸを使用して精密化した。単位格子の非対称単位でのＢＴＣ／Ｆａｂモデルのコピー数、Ｒ_ｗｏｒｋ及びＲ_ｆｒｅｅ値、結合長及び結合角の二乗平均平方根（ｒ．ｍ．ｓ）偏差値を表１１に要約する。

構造的エピトープは、Ｆａｂ中の任意の原子の５Å以内に原子を含有するＢＴＣの残基として定義された。これらの残基は、ＣＣＰ４プログラムスイート（ｖ．７．０．０４５ Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６７：２３５－２４２）のＡＣＴプログラムによって特定した。複合体の複数のコピーが非対称単位中に存在する場合、全てのコピーで共通である抗体接触残基のみが構造的エピトープ残基と見なされる。Ｆａｂ複合体ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、及びＮＶＳ４の構造中で特定されたエピトープ残基及び対応する接触Ｆａｂ残基を、それぞれ表１２、１３、１４、及び１５に列挙する（鎖Ｈは重鎖であり、Ｌは軽鎖である）。

ｄ）ＢＴＣエピトープ構造
ＢＴＣ構造は、３本鎖シート及び２本鎖シート内に５本のベータ鎖を有するＥＧＦフォールドである。構造は、３つのジスルフィド結合によって安定化される。観測したＢＴＣ構造は、結晶構造の全てで良好に保存されている。構造は、以前に報告されたＮＭＲ構造（ｐｄｂ：１ＩＰＯ，Ｍｉｕｒａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ ２９４ １０４０－１０４６）と同様であるが、但し、２つのＣ－末端ベータ鎖の大幅なシフトがあった。図１及び２に例示するように、Ｆａｂのエピトープ及び全体的な配向の両方が複合体間で変化している。

ヒトＢＴＣに結合したＦａｂ ＮＶＳ２の結晶構造を用いて、ＢＴＣ上の構造的エピトープを特定した。表１２に詳説されるように、相互作用表面が、いくつかの連続的及び不連続（すなわち、非隣接）配列：すなわち、残基（４０～４３、４５～４６、５８～６１、７２～７３、７５～７６）によって形成される。これらの残基は、Ｆａｂ ＮＶＳ２によって認識される三次元立体構造エピトープを形成する（図１Ａ及び２Ａ）。

ヒトＢＴＣに結合したＦａｂ ＮＶＳ３の結晶構造を用いて、ＢＴＣ上の構造的エピトープを特定した。表１３に詳説されるように、相互作用表面が、いくつかの連続的及び不連続（すなわち、非隣接）配列：すなわち、残基（３４～４２、５１、５３～５４、５６）によって形成される。これらの残基は、Ｆａｂ ＮＶＳ３によって認識される三次元立体構造エピトープを形成する（図１Ｂ及び２Ｂ）。

ヒトＢＴＣに結合したＦａｂ ＮＶＳ１の結晶構造を用いて、ＢＴＣ上の構造的エピトープを特定した。表１４に詳説されるように、相互作用表面が、いくつかの連続的及び不連続（すなわち、非隣接）配列：すなわち、残基（３８～４３、４５～４６、５４、５９～７１、７３）によって形成される。これらの残基は、Ｆａｂ ＮＶＳ１によって認識される三次元立体構造エピトープを形成する（図１Ｃ及び２Ｃ）。

ヒトＢＴＣに結合したＦａｂ ＮＶＳ４の結晶構造を用いて、ＢＴＣ上の構造的エピトープを特定した。表１５に詳説されるように、相互作用表面が、いくつかの連続的及び不連続（すなわち、非隣接）配列：すなわち、残基（３７～４３、４５～４６、５４、５７，５９～６１、７２～７３、７５）によって形成される。これらの残基は、Ｆａｂ ＮＶＳ４によって認識される三次元立体構造エピトープを形成する（図１Ｄ及び２Ｄ）。

ヒトＢＴＣとＦａｂ ＮＶＳ２との間の相互作用。ＢＴＣ残基は、配列番号１５７に基づいて番号付けされる。Ｆａｂ残基は、それらの線形アミノ酸配列（配列番号３６及び４７）に基づいて番号付けされる。ＢＴＣ残基は、Ｆａｂ ＮＶＳ２中の原子の５Å範囲内に少なくとも１つの原子を有することが示され、潜在的な水媒介相互作用を説明する。これらの相互作用は、非対称単位中の複合体の２つのコピー間で共通している。

ヒトＢＴＣとＦａｂ ＮＶＳ３との間の相互作用。ＢＴＣ残基は、配列番号１５７に基づいて番号付けされる。Ｆａｂ残基は、それらの線形アミノ酸配列（配列番号５６及び６７）に基づいて番号付けされる。ＢＴＣ残基は、Ｆａｂ ＮＶＳ３中の原子の５Å範囲内に少なくとも１つの原子を有することが示され、潜在的な水媒介相互作用を説明する。

ヒトＢＴＣとＮＶＳ１ Ｆａｂとの間の相互作用。ＢＴＣ残基は、配列番号１５７に基づいて番号付けされる。Ｆａｂ残基は、それらの線形アミノ酸配列（配列番号１２及び２３）に基づいて番号付けされる。ＢＴＣ残基は、Ｆａｂ ＮＶＳ１中の原子の５Å範囲内に少なくとも１つの原子を有することが示され、潜在的な水媒介相互作用を説明する。これらの相互作用は、非対称単位中の複合体の１２コピー間で共通している。

ヒトＢＴＣとＮＶＳ４ Ｆａｂとの間の相互作用。ＢＴＣ残基は、配列番号１５７に基づいて番号付けされる。Ｆａｂ残基は、それらの線形アミノ酸配列（配列番号８０及び９０）に基づいて番号付けされる。ＢＴＣ残基は、ＮＶＳ４ Ｆａｂ中の原子の５Å範囲内に少なくとも１つの原子を有することが示され、潜在的な水媒介相互作用を説明する。これらの相互作用は、非対称単位中の複合体の４コピー間で共通している。

実施例３：抗ＢＴＣ／抗ＶＥＧＦ二重特異性Ｆａｂの生成
二重特異性分子の抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ部分は、参照によりその全体が組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２００１４９５８号明細書に以前に開示され、５７８ｍｉｎｉｍａｘＴ８４Ｎ＿Ｖ８９Ｌ又はタンパク質番号：１００８として特定された抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ（１００８ ｓｃＦｖ）に由来した。１００８ ｓｃＦｖをそのＦａｂバージョンに変換するために、１００８ ｓｃＦｖのアミノ酸配列を公開されたヒトＩｇＧフレームワーク配列とアライメントさせ、カッパフレームワークと高い相同性を有することを決定した。

その結果、１）ヒト免疫グロブリンカッパ鎖定常領域配列（配列番号１５９）を１００８ ｓｃＦｖのＶＬのＣ－末端に添加し、及び２）重鎖（ＣＨ１ドメイン）配列（配列番号１６０）のヒト免疫グロブリン第１定常Ｉｇドメインを、１００８ ｓｃＦｖのＶＨのＣ－末端端部に添加することによって１００８ ｓｃＦｖを変換した。

二重特異性分子について２つの配向が生成された（図３）。配向１では、抗ＢＴＣ Ｆａｂは分子のＮ－末端にあったが、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂは分子のＣ－末端にあった。配向２では、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂは分子のＮ－末端にあったが、抗ＢＴＣ Ｆａｂは分子のＣ－末端にあった。２つのＦａｂの重鎖は、（ＧＳＧＧＧ）_３（配列番号１１８）リンカーによって結合されており、２つの軽鎖は、（ＧＳＧＧＧ）_３（配列番号１１８）リンカーによって結合されている。

抗ＢＴＣ及び抗ＶＥＧＦの軽鎖及び重鎖のアミノ酸をコード化するヌクレオチドを、Ｇｅｎｅｗｉｚ、ＬＬＣによって合成し、ｐＵＣ５７ベクター中に送達させた。発現ベクター中にクローニングするために、４μｇのプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩを用いて３７℃で一晩消化させた。消化されたプラスミドを、１％のアガロースゲル上で、１００ボルトで４０分間泳動させた。目的の消化されたＤＮＡ断片のサイズに相当するバンドをゲル抽出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８７０４）を使用して、製造元のプロトコルに従ってＤＮＡを回収した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化された抗ＢＴＣ／抗ＶＥＧＦ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化されたｐＲＳ５ａ発現ベクター中に、ＬＩＧＡＦＡＳＴ（商標）Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｍ８２２５）を使用して、製造元のプロトコルに従ってクローニングした。ライゲーション産物を、ＯｎｅＳｈｏｔ ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ４０４０－１０）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＬＢ－寒天プレート上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。４つのコロニーを拾い上げ、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＬＢ培地中、３７℃で一晩増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を用いて、これらの細菌培養物からのＤＮＡを、製造元のプロトコルに従って抽出した。抽出したＤＮＡを配列決定のために送り、正しいライゲーション産物をスクリーニングし、選択した。正しいクローンの確認時に、ＤＮＡをＯｎｅＳｈｏｔ ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に再形質転換し、単一のコロニーを拾い上げて増殖させ、ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ５７０１０）を使用して、製造元のプロトコルに従ってＤＮＡをスケールアップし、一過性ＨＥＫ２９３タンパク質発現のために十分なＤＮＡを得た。

０．５×１０^６ＨＥＫ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞／ｍＬを播種し、１日後に３Ｌの三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３１２５２）中の１ＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３３８０１８）中でトランスフェクションし、それにより細胞は、トランスフェクション当日に約１×１０^６細胞／ｍＬ及び＞９５％の生存率に達した。１本の管中の１Ｌのトランスフェクション培養物に対して、２ｍＬの１ｍｇ／ｍｌのポリエチレンイミン溶液（ＰＥＩ）を２３ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙＩｅ２９３発現培地に添加し、２５ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地を含有する別の管に、０．５ｍｇの軽鎖及び０．５ｍｇの重鎖発現ベクターＤＮＡを添加した。両方の管を５～１０分間インキュベートした。プラスミドＤＮＡを含有する管を、０．２２μｍの膜Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＧＰ００５２５）を通して濾過し、潜在的な汚染を防止した。次いで、このＤＮＡ混合物を、ＰＥＩを含有する他の管に添加し、室温で２０～３０分間インキュベートした。インキュベーション後、トランスフェクション混合物を１×１０^６細胞／ｍＬの培養物に添加し、１２５ｒｐｍで振盪しながら、５～１０％のＣＯ_２を用いて３７℃で５日間培養した。培養物を採取し、遠心分離し、上清を０．２２μｍの膜Ｓｔｅｒｉｃｕｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＧＵ１１ＲＥ）を通して濾過し、その後、標準的な親和性樹脂、例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅのＡＴＫＡシステムを使用して精製した。

採取した、抗ＢＴＣ／抗ＶＥＧＦ二重特異性Ｆａｂを含有する培養物を、ＧＥのＡＴＫＡシステムを使用して、５ｍＬの事前充填されたＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１親和性カラム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４９４３２０００５）上で流すことによって精製した。装填が完了したら、２０～５０カラムボリューム（ＣＶ）のＰＢＳ、ｐＨ７．４の洗浄バッファを樹脂上に流し、非特異的結合成分を除去し、続いて、１６～２０ＣＶの低ｐＨ溶出勾配の１００ｍＭのクエン酸バッファ、ｐＨ３．０（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｑ２４４５）を流した。二重特異性Ｆａｂを含有する溶出分画を、マルチモーダルクロマトグラフィ樹脂、５ｍＬの事前充填されたＨｉＴｒａｐ ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２８４０５８４６）を使用して、純度を高めるために更に精製した。ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅカラムは、凝集体、宿主細胞タンパク質、核酸、及びウイルスを除去することができるマルチモーダル機能性を備えた強力なアニオン交換体である。前に溶出したタンパク質溶液のｐＨを、１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｔ１０９５）を用いて、その等電点（ｐＩ）より上昇させ、タンパク質が樹脂に結合するための正味の負電荷を得た。カラムに装填させたら、カラムをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、１００ｍＭのクエン酸バッファ、ｐＨ３．０の勾配で溶出させた。溶出された分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分析し、高純度を有する分画を選択した。１０ｋＤ分子量カットオフＶｉｖａｓｐｉｎ２０タンパク質濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号ＶＳ２００１）を使用して、プールされた分画を濃縮もし、同時にＰＢＳ、ｐＨ７．４にバッファ交換した。最終的に、タンパク質の追加の特性評価を行い、２８０ｎｍでのＵＶ吸収を使用して濃度を決定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって純度を決定し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって凝集並びに純度を決定し、ＬＣ／ＭＳによって正確な分子量を確認し、Ｅｎｄｏｓａｆｅシステムを使用してＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬＡＬカートリッジを介してエンドトキシンレベルを決定した。

実施例４：マウスにおける長期のＢＴＣ発現が、血管拡張及び血管漏出を引き起こし、網膜浮腫をもたらす
動物モデル及び試験デザイン。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から取得した雌Ｃ５７／Ｂｌ６Ｊマウスマウス（８～１０週齢）でインビボ試験を実施した。マウスの網膜におけるＢＴＣ過剰発現の影響を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下でＢＴＣを発現する自己相補性アデノ随伴ウイルス、血清型２（ｓｃＡＡＶ２）を（網膜下、ｓ．ｒ．）注射することによって調査した。１匹の動物の両眼に同じ用量のｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＢＴＣを注射し、２つの異なる用量を試験した。対照の眼（ナイーブ、製剤バッファ又はｎｕｌｌ ｓｃＡＡＶ２を注射した）及び試験の眼を、送達後４～６週で画像撮影した（カラー眼底写真撮影、眼底蛍光血管造影法（ＦＦＡ）、走査型レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）、及び光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ））。実施した試験の各々についての詳細を、以下の表１６に記載する。

網膜下注射又はイメージングのための動物の準備。ネズミの眼を、シクロペントレート（１％、局所）及びフェニレフリン（有効性に依存して２．５％又は１０％、局所）で拡張させた。角膜を、プロパラカイン（０．５％、局所）で脱感作させた。マウスはまた、鎮静のためにケタミン／キシラジンカクテル（それぞれ、１００～１５０ｍｇ／ｋｇ及び５～１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受けた。

ｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＢＴＣの網膜下送達。麻酔をかけた動物を外科用顕微鏡下に置いた。１０μＬのハミルトン注射器に取り付けられた鈍端針を、強膜の小さな切開部を通して挿入した。針を水晶体の後方、耳側網膜に向かって、抵抗が感じられるまで送られた。１μＬのｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＢＴＣ（２００μｇ／ｍＬのフルオレセインナトリウムを含有する）を、網膜下腔にゆっくりと注入した。２用量を試験した：１×１０^８ウイルスゲノム（ｖｇ）／眼又は５×１０^８ｖｇ／眼。前に散大した瞳孔を通してフルオレセイン含有ブレブを可視化することによって、注射の成功を確認した。網膜下腔から硝子体への著しい出血又はベクター溶液の漏出を伴う眼は、更なる試験から除外した。処置後に、０．３％のトブラシン眼軟膏を眼に適用し、マウスを麻酔から回復させた後、収容室のそのケージに戻した。動物の健康状態を、引用したプロトコルに記載されるように監視した。

眼底写真撮影及び眼底蛍光血管造影法（ＦＦＡ）。麻酔をかけたマウスを加熱ステージ上に置いた。画像撮影した眼（通常は右の眼、ＯＤ）を眼用潤滑剤Ｇｅｎｔｅａｌ又は同等品）で湿った状態に保ち、網膜をＭｉｃｒｏｎ ＩＩＩシステム（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）で写真撮影し、ＦＦＦＡを試験１でのみ実施した。手順は眼底写真撮影と同じであり、唯一の違いはフルオレセイン（１００ｍｇ／ｋｇ）を麻酔前に注射（ｉ．ｐ．）したことであった。蛍光染料の注射後２～３分でマウスを画像撮影した。各画像撮影した眼から１～３枚の写真を取得した。

走査型レーザー検眼鏡イメージング（ＳＬＯ）。マウスに麻酔をかけて、その瞳孔を記載したように散大させた。水分を、ヒプロメロース潤滑剤点眼薬で維持した。２．９ｍｇ／ｍＬのインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の１５ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｍＬのフルオレセインナトリウム溶液の５０ｍｇ／ｋｇをマウスにｉ．ｐ．注射し、血管をラベルし、網膜漏出を評価した。染料注射から３分後に、ケタミン／キシラジンカクテル（１００～１５０／５～１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で引き続いてマウスに麻酔をかけた。プロパラカイン（０．５％）も局所角膜麻酔薬として適用した。

ＢＴＣ誘発網膜血管透過性変化を、フルオレセイン及びＳＬＯベースの蛍光血管造影システムのＩＣＧチャネルを使用して評価した。ＩＣＧは血漿タンパク質に結合し、血管中に留まる高分子量構造を作成するため、血管構造のマップを取得することを可能にする。引き続いて、網膜血管透過性を、ＢＴＣ注射後に網膜血管から漏出することが知られている低分子量のフルオレセインナトリウム染料の注射を介して評価した。

エクスポートされた画像は、視神経を中心とした５５度のレンズで取得された最大４０の登録済みＳＬＯ画像の平均であった。

光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）。試験２では初めて、ＯＣＴ画像をＳＬＯ画像と併せて撮影し、画像化の準備を同じように行った。ＳＬＯイメージングは試験１では取得されなかったため、動物の準備は、全体を通して記載されるものと同じであった。ＯＣＴ画像を、スペクトルドメインＯＣＴシステム（Ｅｎｖｉｓｕ Ｒ２２００，Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）を使用して取得した。容積スキャンは視神経を中心とし、１．７×１．７ｍｍの視野に分散した４００×４００のａ－スキャンで構成されていた。水平及び垂直１．８ｍｍの線形ｂ－スキャン。視神経と交差するｂ－スキャンの収集も取得した。これらは、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）のスクリプトを使用して、位置合わせ及び処理された各場所での約１０のｂ－スキャンの平均から構成された。

ＯＣＴ画像からの網膜厚の定量化。網膜厚定量化は、試験１でのみ実施した。形態計測的分析を、神経線維層及びブルッフ膜の輪郭を手動で描くことによって、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）において抽出された画像（視神経を除く）に対して実施した。定量化は、網膜の広い領域からのデータによって不明瞭になり得る焦点の変化を捉えるために、走査全体に対して取得された値、並びに網膜の最も厚い１０％の測定値から構成された。

統計的分析 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、形態計測的データをプロットし、統計的分析を実施した。厚さの変化を比較する場合、Ｔｕｋｅｙの事後検定を用いた一元配置分散分析を使用して、群間の比較を行い、それぞれが独立したデータポイントとして扱われた。エラーバーを、特に明記しない限り、Ｐ＜０．０５の有意性で標準誤差として報告される。

結果－眼底写真撮影及びＦＦＡ。試験＃１。マウスにｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＢＴＣを注射し（ｓ．ｒ．）、４週間後に画像撮影した。眼底写真撮影（図４、左パネル）は、網膜血管蛇行、血管漏出、及び網膜剥離の可能性を示した。網膜出血の可能性も観察された。ＦＦＡによって可視化されると（図４、右パネル）、網膜血管蛇行及び血管漏出は明らかであった。

結果－走査型レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）。ＳＬＯ画像は、試験＃２でだけ取得された。ｎｕｌｌ ＡＡＶ２を注射した対照マウスから得られた画像は正常であって、血管漏出を明らかにしなかった。ｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＢＴＣを注射した網膜は、血管蛇行及び血管漏出の増加を示した。一部の眼では、ＯＣＴによって検出された網膜剥離は、網膜血管から高品質のＳＬＯ画像の取得を妨げた。対照ベクター（ｓｃＡＡＶ２－Ｎｕｌｌ、５×１０^８ｖｇ／眼）を注射した（ｓ．ｒ．）マウスの代表的なＳＬＯ画像を、図５Ａに示す。明確に規定された血管が、血管漏出なしに観察されている。対照的に、ｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＢＴＣを注射した（ｓ．ｒ．）マウスは、蛇行した血管及びフルオレセイン漏出を示した（図５Ｂ）。

実施例５．抗体の膜結合ＢＴＣへの結合を強化するＦＡＣＳ結合アッセイ
表面にＢＴＣを発現しなかった最初の２９３Ｆ細胞、及び細胞表面上でＢＴＣを発現した安定な細胞２９３Ｆ－ｈＢＴＣを、コンフルエントな単層が形成されるまでプレーティングした。細胞を洗浄後、細胞をＶｅｒｓｅｎｅを使用して３７℃で解離させた。細胞をＦＡＣＳｂａｆｆａで洗浄し、細胞を１×１０^６細胞／ｍｌで使用して、９６ウェルプレート中に１００μｌでプレーティングした。次いで、５０ｎＭで開始する抗体の連続希釈液１００μｌを使用した。細胞をインキュベートし、洗浄し、次いで、二次抗ヒトＦａｂ－ＦＩＴＣ抗体で処理した。抗体は、ＢＴＣを発現する細胞にだけ結合した。その後、細胞を洗浄し、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメトリーで分析した。全てのデータ分析は、Ｆｌｏｗ Ｊｏソフトウェアを使用して実行した。

図６Ａ～６Ｄは、二重特異性Ｆａｂ－Ｆａｂ（ＮＶＳ１１、ＮＶＳ１２、及びＮＶＳ１３）とそれらの対応する抗ＢＴＣ Ｆａｂ（ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、及びＮＶＳ３）の両方が、膜結合ＢＴＣへの同等の結合を示したことを示している。図６Ａでは、検出用に抗ヒトＦａｂ抗体を使用して、ＮＶＳ１１の膜結合ＢＴＣへの結合を評価するために、フローサイトメトリーを使用した。ＮＶＳ１１は、２９３Ｆ細胞上で過剰発現した膜結合ＢＴＣに、９３±４２ｐＭ（９．０±４．０ｎｇ／ｍＬ）の平均ＥＣ５０で結合する。

ＢＴＣ又はＶＥＧＦのいずれかをコーティングし、次いで、ＮＶＳ１１の滴定を追加し、続いて、第２の標的、ビオチン化ＢＴＣ又はビオチン化ＶＥＧＦのいずれかで検出することによって、サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を実施した。図６Ｅ及び６Ｆに示すように、両方の形式において、ＮＶＳ１１はＢＴＣ及びＶＥＧＦの両方に同時に結合することができる。単一Ｆａｂ、ＮＶＳ１又はＮＶＳ８のいずれも、ＢＴＣとＶＥＧＦの両方に同時に結合することができなかった。

ＶＥＧＦのＮＶＳ１１中和をＥＬＩＳＡによって決定した。様々な濃度のＮＶＳ１１をビオチン化ヒトＶＥＧＦと予備インキュベートし、ＶＥＧＦＲ２－Ｆｃコーティングプレートに添加した。図６Ｇに示すように、ＶＥＧＦＲ２に結合したＶＥＧＦ－ビオチンを、ストレプトアビジン－ＨＲＰで検出した。ＮＶＳ１１は、ヒトＶＥＧＦのヒトＶＥＧＦＲ２－Ｆｃへの結合を、１３００±２００ｐＭ（１２７±１９ｎｇ／ｍＬ）の平均ＩＣ５０値で阻害した。

実施例６．Ｂｉａｃｏｒｅ Ｋ_Ｄの決定
最初に、ＢＴＣ又はＶＥＧＦのＮＶＳ１１への結合の親和性測定に使用される表面プラズモン共鳴を、チップ上で捉えた。ＮＶＳ１１は、ヒト及びカニクイザルＢＴＣに、それぞれ５．８及び７．２ｐＭのＫ_Ｄで結合し、ヒトＶＥＧＦ－Ａに１８．６ｐＭのＫ_Ｄで結合する。ヒト及びカニクイザルアイソフォームＶＥＧＦ－Ａ１９８、－１６５、－１２１、並びに１１１の配列は、１００％同一である。したがって、カニクイザルＶＥＧＦ－Ａに対する親和性は、ヒトＶＥＧＦ－Ａに対するものと同一である。結合速度定数及び解離速度定数並びに親和性を、以下の表１７に列挙する。

ヒトＶＥＧＦについての平均値を、５つの個々の実験から算出する。ヒト及びカニクイザルＢＴＣについての平均値を、７つの個々の実験から算出する。

Ｆａｂが二重特異性形態で提示される場合にＢＴＣ又はＶＥＧＦへの結合が影響を受けるかどうかを評価するために、親和性の決定をＢｉａｃｏｒｅを使用して行った。反応速度定数を、以下に記載されるように、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＳＰＲを介して決定した。Ｆａｂに対する反応速度及びＢＴＣに対する二重特異性を決定するために、抗Ｆａｂ捕捉法を利用した。市販の抗Ｆａｂ補足ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ＧＥから提供されたアミンカップリングプロトコルを使用してチップ表面上に固定化した。この固定化された抗体は、単一Ｆａｂ及び二重特異性形態を捕捉した。目的は、２０のＲ_ｍａｘを達成するためのＦａｂの量を捕捉することであった。次いで、ＢＴＣは、分析物としてＦａｂ上を流れた。ＢＴＣ濃度は５ｎＭで開始し、７つの濃度に１：２で連続希釈した。６０μｌ／分で１分間流れる１：１０の５ｍＭ ＮａＯＨを有する最終的に１％のリン酸を使用して、各濃縮サイクルの終わりに再生を実施した。

二重参照減算を完了して、最終データを生成した。パラメータＲ_ｍａｘをローカルに設定して、生データを１：１バインディングモデルにフィッティングさせた。

以下の表１８は、親和性がＦａｂとその対応する二重特異性形態との間で、ＢＴＣ及びＶＥＧＦで同等であることを示す。

実施例７．ＢＴＣのＥｒｂＢ１又はＥｒｂＢ４への結合をブロッキングするための抗体の中和効力
Ｆａｂ及び二重特異性抗体のＢＴＣのその受容体ＥｒｂＢ１又はＥｒｂＢ４への結合の中和における効力を評価するために、以下のアッセイを実施した。ＨＫＢ１１を過剰発現するＥｒｂＢ１細胞又はＥｒｂＢ４細胞のいずれかを、１×１０^５細胞／ウェルでプレーティングした。１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、ＦＡＣＳバッファで細胞を１回洗浄し、上清を除去した。次に、Ｆａｂサンプル希釈液及びＢＴＣを、ＦＡＣＳバッファ中で調製した。ヒトＢＴＣ－ａｖｉｔａｇ－ビオチンを、１５ｎＭの一定濃度に希釈した。試験Ｆａｂサンプルを、４０ｎＭの開始濃度で調製し、１：２の連続希釈で９点について滴定した。ビオチン－ＢＴＣ及び試験Ｆａｂサンプルの両方を、室温で３０分間インキュベートした。次いで、予備インキュベートしたサンプルを、ウェル当たり１００μｌで二通り細胞プレートに添加し、氷上で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＦＡＣＳバッファ中で１回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを、ＦＡＣＳバッファ中に１００μｌ／ウェルの希釈された二次抗体ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（１：２０００）と共に懸濁させた後、次いで、細胞を氷上で６０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファで１回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために、１２０μｌのＦＡＣＳバッファ中に再懸濁させた。

測定を、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメトリー機で実施した。データを、Ｆｌｏｗ Ｊｏソフトウェアを使用して分析した。分析された生細胞集団を、前方及び後方散乱においてゲーティングした（ＦＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－Ａドットプロット）。ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８のみでインキュベートしたサンプルで得られた対照ヒストグラム上でインターバルゲートを確立し、続いて、膜結合受容体ＥｒｂＢ１又はＥｒｂＢ４及びビオチン－ＢＴＣを、担持する細胞の陽性結合事象のパーセントを決定した。蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）の値もまた、生細胞集団について導出した。次いで、ＭＦＩ値を用いて試験サンプルの阻害率を算出し、続いて、非線形回帰（曲線フィット）モデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３でプロットし、ＩＣ５０値を生成した。

図７は、２ｎＭのＢＴＣのＥｒｂＢ１への結合の阻害を示し、図８は、２ｎＭのＢＴＣのＥｒｂＢ４への結合の阻害を示す。図７及び８は、二重特異性Ｆａｂ－Ｆａｂ及びそれらの対応する抗ＢＴＣ Ｆａｂの両方が、ＢＴＣのＥｒｂＢ１又はＥｒｂＢ４のいずれかに対する阻害に関して同等の効力を示したことを示している。

フローサイトメトリー細胞効力アッセイを、細胞表面上でヒトＥｒｂＢ１又はＥｒｂＢ４を過剰発現するＨＫＢ１１細胞を使用して行った。ＮＶＳ１１を、様々な濃度で１５ｎＭの可溶性ヒトＢＴＣ－ａｖｉｔａｇ－ビオチンと予備インキュベートして、ＮＶＳ１１のＢＴＣへの結合を評価した。図８Ｅ及び８Ｆに示すように、ＮＶＳ１１は、可溶性ＢＴＣがヒトＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４に結合することを、ＥｒｂＢ１については２．９＋０．３ｎＭ（２７９＋２９ｎｇ／ｍｌ）の平均ＩＣ５０で、及びＥｒｂＢ４については４．６＋２．７ｎＭ（４４３＋２６０ｎｇ／ｍｌ）の平均ＩＣ５０でブロッキングした。

図８Ｇに示すように、リン酸化ＥＧＦＲを検出するために、特異的抗体を使用するＥＬＩＳＡ形式は、可溶性ＢＴＣのＮＶＳ１又はＮＶＳ１１との予備インキュベーションが、ヒト卵巣癌細胞株ＮＣＩ／ＡＤＲ－ＲＥＳで内在的に発現されるＢＴＣ誘発ＥＧＦＲのリン酸化を防止することを確認した。

実施例８．ＶＥＧＦ－ＡのＶＥＧＦＲ２への結合をブロッキングするための抗体の中和効力
ＶＥＧＦ－Ａは、ＶＥＧＦＲ２を通しての結合及び活性化によって血管新生及び血管透過性を調節する。ＶＥＧＦ－Ａの過剰発現は、ＤＲ及びＡＭＤなどの眼状態における微小血管の透過性及び血管新生の増加に関与している。以下の実験の目的は、ＶＥＧＦ－ＡのＶＥＧＦＲ２への結合の中和における抗体の効力を試験することであった。

ＶＥＧＦ－Ｒ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ＃３５７－ＫＤ／ＣＦ）を、３８４ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート上で、１×ＰＢＳ中４ｕｇ／ｍｌで、２０μｌ／ウェルで、４℃にて一晩コーティングした。次いで、プレートを、１×ＴＢＳＴを使用して３回洗浄した。プレートを、２％のＢＳＡ希釈液（０．１％のＴｗｅｅｎ ２０／０．１％のＴｉｒｔｏｎＸ１００）中で一晩ブロッキングした。ブロッキング後、プレートをＴＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、サンプル混合物を２０μｌ／ウェルで添加した。サンプル混合物は、４００ｐＭでの最終固定濃度のＶＥＧＦ－ビオチン（社内製）及び２０ｎＭで開始する抗体の１５点１：２連続希釈物からなった。サンプル混合物を、プレートに添加する前に１時間予備インキュベートし、次いで、プレート上で室温にて更に１時間インキュベートした。その後、プレートをＴＢＳＴを使用して３回洗浄し、１：５０００で希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰの２０μｌ／ウェルを添加し、１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴ中で３回洗浄し、次いで、２０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を添加した。ＴＭＢは酸化されると、青色を生じる色原体である。ＴＭＢを抗体を含まないサンプル中でシグナルが飽和されるまで１０分間インキュベートし、次いで、１０μｌ／ウェルの２Ｎ硫酸を添加したところ、青色が黄色に変化し、これにより最大吸光度を４５０ｎｍで有することになる。

図９Ａ～Ｃは、二重特異性Ｆａｂ－Ｆａｂ及びそれらの対応する抗ＶＥＧＦ Ｆａｂの両方が、ＶＥＧＦ－ＡのＶＥＧＦＲ２に対する阻害について同等の効力を示したことを示している。

実施例９．アルファスクリーンアッセイを使用するＢＴＣ誘発リン酸化－ＥＲＫ１／２活性化をブロッキングするための抗体の中和効力
ＢＴＣは受容体ＥｒｂＢ１又はＥｒｂＢ４に結合することができ、これは次いで、他のＥｒｂＢ受容体とホモ二量体又はヘテロ二量体を形成することができる。二量体化の際に、受容体はリン酸基転移して、ＭＡＰＫ／ＥＲＫを通してシグナル伝達することができる。Ａ４３１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５５５）は、ＥｒｂＢ１の高発現を有し、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４のいくらかの発現を有するヒト類表皮癌細胞株である。これらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の組織培養インキュベータ内で、増殖培地中１７，５００細胞／ウェルで３８４ウェルプレートにプレーティングした。２４時間後に培地を除去し、０．０５％のＢＳＡを補充した３０μｌの無血清培地ＤＭＥＭに置き換え、次いで、細胞を５時間血清飢餓状態にした。次に、無血清培地中でサンプル希釈液を調製した。ヒトＢＴＣを４ｎＭの濃度に希釈した。試験サンプルを８０ｎＭの開始濃度で調製し、９点の１：２希釈について滴定した。対照サンプルは、無血清培地及び４ｎＭのＢＴＣに加えて、０ｎＭの試験サンプルであった。ＢＴＣ及び試験サンプルの両方を、１：１の混合物で室温にて３０分間予備インキュベートした。１０μｌの混合物を、細胞を含む各ウェルに添加し、３７℃で５分間処理した。処理を即座に取り除き、次いで、３０μｌの１×ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｕｌｔｒａ溶解バッファを各ウェルに添加し、穏やかに振盪しながら室温で１０分間プレートをインキュベートした。

リン酸化ＥＲＫ１／２レベルの定量化を、ＡｐｈａＬＩＳＡ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｕｌｔｒａ ｐＥＲＫキットを使用して評価した。アッセイを３８４ウェル白Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅｓにおいて、製造業者の説明書に従って実施した。１０μｌのサンプルを、５μｌのアクセプターミックス及び５μｌのドナーミックスと暗所で室温にて、少なくとも２時間インキュベートした。次いで、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ設定を使用して、Ｅｎｖｉｓｉｏｎシステムを用いてプレートを読み取った。阻害率のデータ分析を、エクセルファイル上で算出した。ＩＣ５０値を、非線形回帰（曲線フィット）モデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３で生成した。

各アッセイプレートからの未処理（Ａ０）及びリガンドＢＴＣ処理対照（Ａ１００）の生データを使用して、式：％阻害＝（１－（Ａ－Ａ０）／（Ａ１００－Ａ０））＊１００）に基づいて、試験薬剤（Ａ）の阻害の％を算出した。この式において、試験薬剤の％阻害は、未処理対照（０％）と処理対照（１００％）との間で線形スケーリングされた。

図１０Ａ～Ｄは、二重特異性Ｆａｂ－Ｆａｂ及びそれらの対応する抗ＢＴＣ Ｆａｂの両方が、ｐＥＲＫ活性化の阻害に対して同等の効力を示したことを示している。

実施例１０．ＢＴＣ誘発リン酸化ＨＥＲ３活性化のブロッキングのための抗体の中和効力
ＢＴＣは受容体ＥｒｂＢ１又はＥｒｂＢ４に結合することができ、これは次いで、他のＥｒｂＢ受容体とホモ二量体又はヘテロ二量体を形成することができる。二量体化の際に、受容体はリン酸基転移して、ＭＡＰＫ／ＥＲＫを通してシグナル伝達することができる。ＮＣＩ／ＡＤＲ－ＲＥＳ細胞（ＮＣＩ）は、卵巣癌細胞株である。これらの細胞は、４つのＥｒｂＢ受容体の全てを発現する。ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）は触媒的に非活性であり、他の受容体をトランス活性化することができない。それは、他の受容体によるトランス活性化を受ける。

ｐＨＥＲ３アッセイにおいて、２０ｎＭの濃度で開始するＦａｂの連続希釈を１：２で行った。これをＦａｂ－ＢＴＣ複合体を形成するために、５ｎＭの可溶性ヒトＢＴＣと予備インキュベートした。細胞を４８ウェル組織培養プレート中に播種し、２４時間インキュベートし、抗体－ＢＴＣ複合体の添加の前に５時間血清飢餓させた。培養基はＲＰＭＩ中の１０％のＦＢＳであって、血清飢餓条件はＯｐｔｉｍｅｍ培地であった。次いで、ＢＴＣ－抗体複合体を、５時間血清飢餓させた４８ウェル組織培養プレートに添加し、複合体－細胞を８分間処理した。処理後、上清を除去し、細胞を冷１×ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、細胞を溶解し、ＥｒｂＢ３のリン酸化をＭＳＤによって評価した。ＭＳＤ法は、最初に総ＨＥＲ３捕捉抗体を２μｇ／ｍｌで、ウェル当たり１０μｌにて室温で２時間プレーティングすることからなった。次いで、プレートを１×ＴＢＳＴで１回洗浄し、次いで、５％のＢＳＡ（１×ＴＢＳＴ）中で２時間ブロッキングした。次いで、プレートを洗浄し、試験溶解物を１０ｕｌ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄して、１：１０００で希釈された検出抗体の抗ｐＨＥＲ３抗体を１０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを１回洗浄し、ウサギｓｕｌｆｏｔａｇ抗体を１：５０００の希釈で１０μｌ／ウェルにて添加した。プレートを洗浄し、ＭＳＤ Ｒｅａｄバッファを添加し、ＭＳＤ機器でプレートを読み取った。

図１１Ａ～Ｄは、５ｎＭのＢＴＣがＡＤＲ－ＲＥＳ細胞中でＥｒｂＢ３のリン酸化を誘導することを示している。二重特異性Ｆａｂ－Ｆａｂ及びそれらの対応する抗ＢＴＣ Ｆａｂの両方は、ＥｒｂＢ３リン酸化の阻害に対して同等の効力を示した。

実施例１１．リン酸化ＨＥＲ３活性化の膜結合ＢＴＣ誘発をジャクスタクリンの方法でブロッキングするための抗体の中和効力
ＢＴＣは、可溶性又は前駆体膜貫通形態で存在することができるＥＧＦファミリーのメンバーである。その膜貫通形態は、メタロプロテイナーゼＡＤＡＭ１０によってタンパク質分解的切断を受ける。可溶性及び膜貫通形態の両方は、ＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４を通して結合し、シグナル伝達することができる。以下の実験の目的は、膜結合ＢＴＣのＥｒｂＢ受容体を含有するＮＣＩ／ＡＤＲ－ＲＥＳ（ＮＣＩ）細胞に対する結合及び活性化の阻害における二重特異性Ｆａｂ－Ｆａｂの効力を、その抗ＢＴＣ単一Ｆａｂと比較して評価することである。

表面結合ＢＴＣのその受容体への中和を、ＥｒｂＢ受容体を発現するＮＣＩ／ＡＤＲ－ＲＥＳ細胞及び膜結合ＢＴＣを発現する安定な細胞株２９３Ｆ－ヒトＢＴＣを使用して行った。２０ｎＭの濃度で開始するＦａｂの連続希釈を１：２で行った。次に、複合体形成を可能にするために、Ｆａｂ希釈液と２９３－ＢＴＣ細胞とを予備インキュベートした。次いで、この複合体をＡＤＲ／ＲＥＳ細胞に添加し、３７Ｃで１０分間インキュベートした。処理後、上清を除去し、細胞を冷１×ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、細胞を溶解し、ＥｒｂＢ３のリン酸化をＭＳＤによって評価した。ＭＳＤ法は、最初に総ＨＥＲ３捕捉抗体を２μｇ／ｍｌで、ウェル当たり１０μｌにて室温で２時間プレーティングすることからなった。次いで、プレートを１×ＴＢＳＴで１回洗浄し、次いで、５％のＢＳＡ（１×ＴＢＳＴ）中で２時間ブロッキングした。次いで、プレートを洗浄し、試験溶解物を１０ｕｌ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、１：１０００で希釈された検出抗体の抗ｐＨＥＲ３抗体を１０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを１回洗浄し、ウサギｓｕｌｆｏｔａｇ抗体を１：５０００の希釈で１０μｌ／ウェルにて添加した。プレートを洗浄し、ＭＳＤ Ｒｅａｄバッファを添加し、ＭＳＤ機器でプレートを読み取った。

図１２Ａ～Ｄは、二重特異性Ｆａｂ－Ｆａｂ及びそれらの対応する抗ＢＴＣ Ｆａｂが、膜結合ＢＴＣのＥｒｂＢ受容体を含有するＮＣＩ／ＡＤＲ－ＲＥＳ細胞に対する阻害について、同等の効力を示したことを示している。

実施例１２．ＲＰＥ完全性を使用するインビトロモデルにおけるＢＴＣ誘発透過性の阻害
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の接合帯形成は、外側血管網膜関門（ＢＲＢ）を形成し、これは、脈絡膜から網膜下腔への溶質及び栄養素の移動を調節する。それは、脈絡膜から網膜への体液の漏出を防止する。以下のアッセイでは、抗体の効力を、ＲＰＥ細胞のＢＴＣ誘発透過性を中和するためのそれらの能力について試験した。

ヒトｉＰＳ細胞から分化したＲＰＥ細胞は、ＥｒｂＢ１受容体の高発現を有している。ＲＰＥ細胞のＢＴＣによる処理は、細胞単層の抵抗シグナルにおける降下によって測定されるように、透過性を誘導することができた。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ３８４ウェルＥプレート（＃５８６７６８１００１）を、細胞の添加の前に、抵抗シグナル測定（細胞指数）を採取することによって初期化した。ＲＰＥ細胞を、増殖培地（Ｌｏｎｚａ ＃１９５４０６、２％のＦＢＳ、１×抗－抗＃１５２４００６２、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ ＃ＰＨＧ６０１５）中に１０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、組織培養インキュベータ内で３７℃、５％のＣＯ_２で培養した。２～３日ごとに増殖培地を交換しながら２～３週間培養することによって、細胞を分化させた。実験を開始する前に、細胞を基底培地（Ｌｏｎｚａ ＃１９５４０６）中で一晩培養させた。各ウェルにおける抵抗シグナルを、処理前に１に正規化した。新鮮な基底培地中のＢＴＣ及びＢＴＣ／抗体複合体［５ｎＭ／４２．５ｎＭ］処理物をＲＰＥ細胞に毎日添加し、抵抗を１０分ごとに測定した。正規化抵抗シグナルを、経時的にプロットした。

図１３Ａは、二重特異性Ｆａｂ－Ｆａｂ及びその対応する抗ＢＴＣ Ｆａｂの両方が、インビトロでＲＰＥ細胞のＢＴＣ誘発透過性の阻害について同等の効力を示したことを示している。

内側ＢＲＢ完全性については、ＨＲＥＣを接合帯の形成まで培養した。ＶＥＧＦ処理はＨＲＥＣ抵抗を減少させたが、ＢＴＣは減少させなかった。図１３Ｂに示すように、ＶＥＧＦと予備インキュベートされたＮＶＳ１１は、ＨＲＥＣ細胞のＶＥＧＦ誘発透過性を阻害した。

実施例１３．糖尿病ラットにおける単剤治療と比較して、抗ＢＴＣ及び抗ＶＥＧＦ組み合わせ両方は網膜漏出を低減する
この実施例は、ラットにおいて高血糖症を誘導するために、膵臓毒素ＳＴＺ（ストレプトゾトシン）の使用を記載する。高血糖症の誘導から６週間ごとに、これらの動物において網膜漏出が増加する。２つの抗体：抗ＶＥＧＦ抗体（４Ｇ３）及び抗ＢＴＣ抗体（ＬＺＲ２３０）を、それらの網膜漏出を低減するための能力について試験した。

ビオチン化マウスＶＥＧＦを、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＨｕＣＡＬ Ｇｏｌｄでパニングすることによって４Ｇ３を特定した。Ｆａｂはまた、ヒトＶＥＧＦと結合して中和することも見出され、ヒト／マウスの交差反応性により、様々なマウスモデルにおいてそれを有用なものにした。４Ｇ３は、ヒト及びマウスＩｇＧ１並びにマウスＩｇＧ２ａとして再フォーマットされたＶＨ５／Ｖｌ３抗体である。マウスＩｇＧ１をラットＳＴＺモデルで使用した。４Ｇ３は一次単離物であり、親和性成熟されていない。

ＬＺＲ２３０は、抗ＢＴＣ Ｆａｂの完全長ＩｇＧバージョンである（配列番号１８０及び１８１；又は「ＴＣ１６」）。

抗ＢＴＣ（ＬＺＲ２３０）又は抗ＶＥＧＦ（４Ｇ３）抗体のいずれかの３ｍｇ／ｋｇの全身投与から２週間で、ＩｇＧ対照高血糖症動物と比較して網膜漏出を阻害する。抗ＢＴＣを抗ＶＥＧＦと３ｍｇ／ｋｇで組み合わせることは、網膜漏出における更なる低減をもたらす。

Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットを、８～１０週齢で、又は＞２００グラムの体重で選択した。６５ｍｇ／ｋｇ（ｉｐ）ＳＴＺの単回注射によって、インスリン産生膵臓ベータ細胞を破壊することによって、高血糖症を誘発させた。動物は糖尿病と見なされ、ＳＴＺ注射から７日後に、糖レベルが＞２５０ｍｇ／ｄＬの場合に試験に含まれた。ＳＴＺは、ｐＨ４．５での０．１Ｍのクエン酸ナトリウムバッファ中で調製する。対照動物には、ｐＨ４．５での０．１Ｍのクエン酸ナトリウムバッファを注射した。

網膜漏出を評価するために、ラットにＦＩＴＣ－デキストラン（４．４ｋＤａ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中５０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｋｇ体重）を、尾静脈を介してＩＶ注射した。２５分後、ラットをＣＯ_２で安楽死させた。血液サンプルを、ＥＤＴＡコーティングチューブ中に心臓穿刺を介して採取した（０．５～１ｍＬ）。次に、２０ｍＬのＰＢＳを、左心室を通して全身血管に循環させた。このステップは、ＦＩＴＣ－デキストランを含有する血液の除去を容易にし、したがって、血管から網膜組織に漏出したＦＩＴＣ－デキストランの定量化を可能にした。

眼を摘出し、ドライアイス上で急速冷凍させて、その後－８０℃で保存した。網膜を各眼から切開し、秤量して、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ１５０μＬ中でホモジナイズした。尾静脈注射の変動を考慮するために、血漿中のＦＩＴＣ－デキストランレベルを計算に組み入れ、網膜組織中のＦＩＴＣ－デキストランのレベル（μｇ／ｇ組織）を決定した。分光光度計の励起波長は４８３ｎｍであって、発光波長は５３８ｎｍであった。希釈を補正した後、眼組織へのＦＩＴＣ－デキストラン漏出の量を、以下の方程式を使用して算出した：

ＢＴＣ及びＶＥＧＦの網膜漏出における役割の評価のために、抗ＢＴＣ（ＬＺＲ２３０）及び／又は抗ＶＥＧＦ（４Ｇ３）抗体を、実験の終了前２週間にわたって５日間ＩＰ注射した。対照動物は、６ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧを受けた。抗ＢＴＣ（ＬＺＲ２３０）及び抗ＶＥＧＦ（４Ｇ３）は、３ｍｇ／ｋｇで単独又は組み合わせて注射した。

結果。４つの個々の実験は、高血糖症ラットにおける網膜漏出への３ｍｇ／ｋｇの抗ＢＴＣ（ＬＺＲ２３０）、３ｍｇ／ｋｇの抗ＶＥＧＦ（４Ｇ３）、及び３ｍｇ／ｋｇの抗ＢＴＣ（ＬＺＲ２３０）＋３ｍｇ／ｋｇの抗ＶＥＧＦ（４Ｇ３）の効果を、ＩｇＧ対照と比較して評価した。４つの試験の全てにおいて、網膜漏出は、高血糖症動物において、対照と比較して有意に増加した。４つの試験のうち２つでは、抗ＢＴＣ（ＬＺＲ２３０）単独又は抗ＶＥＧＦ（４Ｇ３）単独は、網膜漏出を有意に低減させた。４つの試験の全てにおいて、抗ＢＴＣ（ＬＺＲ２３０）と抗ＶＥＧＦ（４Ｇ３）との組み合わせ治療は、ＩｇＧ対照と比較すると、網膜漏出を有意に阻害した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、データをプロットし、統計的分析を実施する。各眼を、独立したデータポイントとして処理した。ＳＴＺ対照（ＩｇＧ）に対する比較を、ダネットの（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ）多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行った。特に明記しない限り、Ｐ＜０．０５で有意であった。ＳＴＺによる高血糖症の誘導は、正常血糖の動物と比較して、網膜漏出における有意な増加をもたらした。抗ＶＥＧＦ（４Ｇ３）による処置は、網膜漏出における３２％の低減をもたらした。抗ＢＴＣ（ＬＺＲ２３０）による処置は、網膜漏出における４１％の低減をもたらした。抗ＢＴＣ（ＬＺＲ２３０）と抗ＶＥＧＦ（４Ｇ３）との組み合わせは、驚くべきことに、網膜漏出における７７％の低減をもたらした。

図１４は、高血糖症による網膜漏出が、ＢＴＣ及びＶＥＧＦの両方によって促進され、ＢＴＣ及びＶＥＧＦの両方を臨床的に標的化することが、ＶＥＧＦ単独を標的化するよりも大きな有効性をもたらすことを示している。

実施例１４．ＢＴＣ又はＶＥＧＦチャレンジにおける抗ＢＴＣ／抗ＶＥＧＦ二重特異性Ｆａｂの有効性
方法及び動物モデル。体重約１．６～２．２ｋｇの雄ダッチベルテッドウサギにおいて、インビボ試験を実施した。

硝子体内注射又はイメージングのための動物の準備。ウサギの眼を、局所１％シクロペントレート及びフェニレフリン（有効性に依存して２．５又は１０％濃度で使用される）で拡張させ、角膜を局所０．５％プロパラカインで麻酔した。次いで、ウサギに、ケタミン（１７．５～３５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（２．５～５ｍｇ／ｋｇ）を含有するカクテルをｉ．ｍ．注射した。

ウサギにおける硝子体内試験物質注射。手術顕微鏡による直接的可視化の下で、５０μＬの試験物質を、縁部から硝子体の中央部に向かって約２ｍｍ頭上に挿入した３０ゲージの針を用いて硝子体内に注射した。注射中のいかなる注射に関連する合併症（出血、網膜剥離、水晶体損傷、又は体液の逆流）も記録し、次いで、処置を他眼で繰り返した。ＶＥＧＦ注射が、その後に２週間未満で行われる試験では、０．３％のトブラマイシンを含有する軟膏を、処置の後に両眼に適用した。ＶＥＧＦ注射が、試験物質注射後２週間を超えて行われる場合、０．３％のトブラマイシン及び０．１％のデキサメタゾンを含有する軟膏を、処置後に両眼に適用した。

ウサギにおける硝子体内ＶＥＧＦ／ＢＴＣ注射。網膜血管変化又は形態学的変化を、それぞれ、生理食塩水中４００ｎｇのヒトＶＥＧＦ－Ａ（１６５アイソフォーム）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＡＦ－１００－２０）を含有する５０μＬの硝子体内（ＩＶＴ）注射を使用して、又は生理食塩水中０．７５μｇのヒトＢＴＣを含有する５０μＬの硝子体内（ＩＶＴ）注射を使用して誘導させた。０．３％のトブラマイシンを含有する軟膏（デキサメタゾンを含まない）を処置後に両眼に適用したこと以外は、処置は前のセクションで概説されたものと同じであった。

ＢＴＣチャレンジにおける抗ＢＴＣ／抗ＶＥＧＦ二重特異性Ｆａｂの有効性
光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）によって評価される網膜厚画像取得及び定量化。ウサギ網膜のＯＣＴ画像を、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ＳＰＥＣＴＲＡＬＩＳ（登録商標）ＯＣＴシステム（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して収集した。ＯＣＴ収集は、７つの高解像度のｂ－スキャンで構成され、ｂ－スキャンごとに平均化された３０フレーム（３０×１０度）が含まれていた。スキャンは、視神経頭より下の中央に配置され、スキャンの長軸が髄線に対して垂直に整列するまで、垂直方向に回転した。記載されている場所は、ｍ－錐体及び網膜神経節細胞の高密度を有することが知られているウサギの視覚筋を包含する（Ｊｕｌｉｕｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。機器は、各網膜についてのＯＣＴスキャン領域を自動的に登録し、そのため、フォローアップ画像が同じ場所で収集される。

ＯＣＴ画像からの網膜厚の定量化。画像を、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇソフトウェアから．ｔｉｆフォーマットでエクスポートした。カスタム書き込みアルゴリズムを、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）で作成し、ＯＣＴ画像を．ｔｉｆファイルから切り取り、抽出した。形態計測的分析を、網膜層の手動セグメンテーションによって、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）において、抽出したＯＣＴ画像で実施した。線を、網膜内膜、ブルッフ膜、及び脈絡膜と強膜の境界面に沿ってトレースした。これらの線の近位差を用いて、網膜厚と脈絡膜厚の値を求めた（網膜厚には、ＲＰＥが含まれる）。ＯＣＴ画像のエッジは、神経頭の小さな部分を捕捉したり、又は画像関連のアーチファクトを有していることがよくあり、そのため、各画像の外側２５％を切り取るためのコードが作成され、中央の５０％は分析用にエクスポートされる。値を、最終的出力のために、ピクセルからμｍに変換した。ＢＴＣのＩＶＴ注射が網膜及びＲＰＥの肥厚の両方を誘導するが、本明細書に記載される試験では、網膜肥厚のみが測定及び定量化された。

有効性試験。試験物質を、注射前ベースラインＯＣＴの収集直後の０日目に注射した。別のＯＣＴ画像を、その後、網膜／ＲＰＥ肥厚を誘導するためのＢＴＣの注射直前の７日目に収集した。最終的ＯＣＴを１４日目に収集した。網膜厚における変化（１４日目と０日目との間の差）を測定し、群間で比較した。治療群と生理食塩水（陰性対照）群との間の網膜厚における平均変化の差を用いることによって、各治療群について阻害率を算出した。

ＶＥＧＦチャレンジにおける抗ＢＴＣ／抗ＶＥＧＦ二重特異性Ｆａｂの有効性
画像収集。ＶＥＧＦ誘発網膜血管透過性の変化を、査型レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）ベースの蛍光血管造影法を用いて評価した。血管構造をラベルする（ＦＩＴＣコンジュゲートデキストラン）か、又は血管透過性を決定する（フルオレセイン）かのいずれかのために選択された２つの蛍光染料について画像を収集した。６モードＳＰＥＣＴＲＡＬＩＳ（登録商標）システム（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）からのフルオレセインチャネルを画像収集に使用した。画像収集の約５分前に、ＦＩＴＣコンジュゲート２０００ｋＤａデキストランの溶液１ｍＬのｉ．ｖ．注射を、耳翼辺縁静脈に送達させた。この高分子量の染料は血管中にそのまま残り、したがって、血管構造のマップの取得を可能にする。使用されたＦＩＴＣ－デキストランの濃度（３５～７０ｍｇ／ｍＬ）を、高品質画像を生成するために必要な蛍光シグナルに基づいて、ロットごとに経験的に選択された（Ｓｉｇｍａ、ＦＤ２０００ｓ）。両眼のラベルされた網膜血管系の画像を、次のステップの前に収集した。続いて、ＶＥＧＦ注射（１０％のフルオレセインナトリウム溶液）後に血管から漏出することが知られている低分子量の染料０．３ｍＬの注射を介して、網膜血管透過性を評価した。染料を、耳翼辺縁静脈にｉ．ｖ．で送達させ、一方の眼について、注射後約３分で画像を収集し、他眼については、注射後約４～６分で画像を収集した。エクスポートされた画像を、視神経に隣接する鼻髄線上で３０度レンズを使用して、取得した最大４０の登録済みＳＬＯ画像の平均であった。

網膜血管透過性の定量化。画像分析をマスクされたランダム化データで実施した。ＶＥＧＦの４８時間後のＦＩＴＣ－デキストラン画像を、同じ眼から同日に撮影された対応するフルオレセイン画像と併せて処理することによって、血管透過性を定量化した。画像処理は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）で開発されたソフトウェアルーチンを使用して達成した。画像を最初に互いに対して登録した。次いで、視神経を含む領域と髄線の外側の領域とを分析のための画質が、不十分な局所的領域と共に共同登録した画像から切り取った。次いで、正規化され、共同登録された画像を、ピクセル単位で互いに差し引いた。ＦＩＴＣ－デキストラン画像がラベルされた血管のみを含み、フルオレセイン画像が血管内の信号並びに浸出染料を含んでいたため、ＦＩＴＣ－デキストラン画像をフルオレセイン画像から差し引くと、浸出されたフルオレセインのみを含有する画像を得た。計算された画像から得られた単位面積当たりのフルオレセイン強度を、その眼についでの「フルオレセイン漏出」として報告した。阻害が存在しない群についての平均フルオレセイン漏出値は、典型的には、０．３～０．５の範囲である。フルオレセイン漏出の顕著な阻害は、より０に近い値をもたらす。

有効性試験。抗ＶＥＧＦ試験物質から生じる有効性を、試験物質のＩＶＴ注射が実施される日（０日目）に対する単一の時点（Ｎ日目）に評価する。漏出は、数日後（Ｎ－２日目）に送達されたＩＶＴ ＶＥＧＦで誘導される。試験物質の注射とＶＥＧＦ注射との間の間隔は、試験の必要性に依存して変化する。しかしながら、フルオレセイン漏出評価のイメージングは、試験期間とは無関係に、ＶＥＧＦ注射後の２日目に常に行う。

統計的分析。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ＵＳＡ）を用いてデータをプロットし、統計的分析を実施する。各眼を、独立したデータポイントとして処理した。特に明記しない限り、エラーバーは標準誤差である。特に明記しない限り、Ｐ＜０．０５で有意であった。網膜厚を、全ての時点で中心線スキャンについて測定した（７つのスキャンのうち４つ）。０日目（試験物質のＩＶＴ前のベースライン）から１４日目（試験物質注射後１４日及びＢＴＣ注射後７日）までの網膜厚における変化を、抗体及び生理食塩水（陰性対照）について測定した。対象のデータポイントが、全ての時点で利用可能でなかった場合、その対象を分析から除外した。平均フルオレセイン漏出又は網膜肥厚、対照に対する阻害（％）の計算及び統計的分析を、個々の眼を構成する群で実施する。比較を、ダネットの多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって陰性対照に対して行う。

図１５Ａは、ベースライン（左）、４００ｎｇのＶＥＧＦの処置後２日（中央）、及び７５０ｎｇのＢＴＣ後７日（右）で収集されたウサギの眼からの代表的なＯＣＴ画像を示す。７５０ｎｇのＢＴＣは、７日目で有意な網膜肥厚（４８ミクロン）を誘導し、４００ｎｇのＶＥＧＦは、注射後２日目で最小の網膜肥厚（９ミクロン）を誘導した。同じ眼からの底部の網膜部分は、病状を示している。硝子体内ＢＴＣは、ウサギにおいて網膜下浮腫及びＲＰＥ変化を誘導するが、ＶＥＧＦは誘導しない。インビボでＢＴＣ作用をブロッキングするＮＶＳ１の効力を評価するために、ＢＴＣのＩＶＴ注射の前の７日目にＮＶＳ１をＩＶＴ注射した。網膜厚の変化をＢＴＣ注射後７日目に評価した。ＮＶＳ１は、ＢＴＣチャレンジされた眼において、網膜肥厚を有意に阻害した（６１μｇ／眼（１．５ｍｌのウサギ硝子体中約４０μｇ／ｍｌ）のＮＶＳ１１で８５～８７％、ｐ＜０．０００１、ｎ＝２；６．１μｇ／眼のＮＶＳ１１で３０％、ｐ＜０．０１、ｎ＝１の試験）（図１５Ｂ）。

図１６は、各治療群（ＢＴＣ単独、ＮＶＳ１～３の２用量並びに３０μｇ、６．１のモル当量用量、及び６１μｇのＮＶＳ１１）についての各眼の網膜厚値の変化（１４日目と０日目との間の総厚さ）を示す。ＮＶＳ１１及びＮＶＳ１の両方の用量は、用量依存的様式で網膜肥厚を有意に低減させた。二重特異性分子ＮＶＳ１１を受容する眼で観察された網膜肥厚における低減は、ＮＶＳ１の等モル用量によって達成されたものと同等であった。

図１７は、各治療群（ＢＴＣ単独、ＮＶＳ２～３の２用量並びに３０μｇ、６．１のモル当量用量、及び６１μｇのＮＶＳ１２）についての各眼の網膜厚の変化（１４日目と０日目との間の総厚さ）を示す。ＢＴＣ誘発網膜肥厚は、二重特異性分子ＮＶＳ１２によって用量依存的様式で有意に阻害された。二重特異性の群で見られた低減は、対応する抗ＢＴＣ処置群で観察されたものと同等であった。

図１８Ａは、異なる治療群（それぞれ、ＢＴＣ単独、ＮＶＳ１１、ＮＶＳ１２の３０μｇのモル当量用量、並びにそれらの対応する分子ＮＶＳ１及びＮＶＳ２）についての各ウサギ眼の網膜厚の変化（１４日目と０日目との間）を示す。両方の二重特異性抗体、７０μｇのＮＶＳ１２及び６１μｇのＮＶＳ１１は、ウサギ眼におけるＢＴＣ誘発網膜肥厚を有意に阻害し、これは、それらの対応する分子のおよそ等モル用量、それぞれ３０μｇのＮＶＳ１及びＮＶＳ２と同等であった。

０．７５μｇ／眼のヒトＢＴＣのＩＶＴ注射は、７日後に網膜厚を約３６μｍ増加させた（ＲＤ－２０１７－００３２６、ｐ＜０．０００１）。組織学的検査は、ＢＴＣ誘発ＲＰＥ変化が、肥大、液胞化、色素変化、網膜襞、及び網膜下浮腫を含むことを明らかにした（図１８Ｂ、（パネルＡの生理食塩水を注射したウサギ対パネルＢのＢＴＣを注射したウサギとの比較））。ＢＴＣ誘発組織学的変化は、６１μｇのＮＶＳ１１を投与されたウサギでは予防された（図１８ＢのパネルＣ）。図１８ＢのＢ～Ｄに示したウサギ網膜の組織学的検査は、図１５Ｂに示したウサギのＯＣＴ画像に相当する。図１８Ｂ：Ａ）生理食塩水、Ｂ）ＢＴＣ、Ｃ）ＢＴＣ＋６１μｇのＮＶＳ１１、Ｄ）ＢＴＣ＋３０μｇのＮＶＳ１（陽性対照）で、ＩＶＴ注射されたウサギからの網膜組織学的検査のパネルである。ＲＰＥ層は、各パネルで、太い赤色の水平矢印で示されている。ＢＴＣ誘発ＲＰＥ変化は、細い赤色矢印で表示される。

フルオレセイン血管造影法によって明らかなように、ＩＶＴヒトＶＥＧＦ－Ａ注射（４００ｎｇ／眼）は、網膜血管漏出を誘導する（図１８Ｃ）。インビボでＶＥＧＦ作用をブロッキングするＮＶＳ１１の効力を評価するために、４００ｎｇ／眼のＩＶＴ ＶＥＧＦ－Ａのチャレンジの前１４日目に、ウサギをＮＶＳ１１でＩＶＴ注射した。網膜漏出の変化を、ＶＥＧＦチャレンジ後２日目に評価した。ＮＶＳ１１はフルオレセイン漏出を８０％低減する（ｐ＜０．０００１）対応する抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ（ＮＶＳ８）の等モル用量と同様に、ＶＥＧＦ誘発網膜血管漏出を効果的に低減した（７９％の低減、ｐ＜０．０００１、ｎ＝２の試験）（図１８Ｄ）。

図１９は、４００ｎｇのＶＥＧＦのＩＶＴ送達後２日目（左）及び７５０ｎｇのＢＴＣ後７日目（右）に得られた代表的なフルオレセイン血管造影画像を示す。ＶＥＧＦ注射は、ウサギの網膜血管漏出を引き起こすが、ＢＴＣは引き起こさない。

図２０は、異なる治療群（ＶＥＧＦ単独、又は等モル用量のＮＶＳ１１、ＮＶＳ１２、及びＮＶＳ８で処置された）からの個々の眼からのフルオレセイン漏出（ｔ＝３～５分）値を示す。ＩＶＴ投与は、次の通りである：０日目：二重特異性（３０．５ｕｇ／眼）及び単一Ｆａｂ（１５ｕｇ／眼）；１４日目：ＶＥＧＦ（０．４μｇ／眼）；１６日目：走査型レーザー検眼鏡によるイメージングを、ＶＥＧＦ注射によって誘導されたフルオレセイン漏出を評価するために行った。２つの画像を、１つの眼ごとに撮影した。フルオレセイン血管造影法（ＦＡ）は、画像撮影するために使用される技術であった。ＦＤ（フルオレセイン注射前に撮影された画像を指す）－ＦＩＴＣ デキストランラベル画像は、血管の構造を提供し、ＦＡは漏出を決定するために、フルオレセイン注射後に行われた。終末薬とは、眼の薬物レベルを決定するためにＰＫ収集を指す。網膜血管漏出は、二重特異性分子及びそれらの対応する抗ＶＥＧＦ分子、ＮＶＳ８の両方によって有意に阻害された。この結果は、２つの試験で確認された。

図２１は、生理食塩水、３０．５μｇのＮＶＳ１１、３０．５μｇのＮＶＳ１２、及び１５μｇのＮＶＳ８を注射した個々の眼のフルオレセイン漏出（ｔ＝３～５分）を示す。３つ全てのＦａｂは、フルオレセイン漏出の減少を示すが、２つの二重特異性ＮＶＳ１１及びＮＶＳ１２は、ＮＶＳ８、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂよりもいっそうの減少を示す。

図２２は、生理食塩水、５０μｇ及び５００μｇのＬｕｃｅｎｔｉｓ（ラニビズマブ；抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ）又は５０μｇのＮＶＳ１（抗ＢＴＣ Ｆａｂ）で処置した個々の眼からの総網膜厚値の変化を示す。５０μｇのＮＶＳ１は、ＢＴＣ誘発網膜肥厚を有意に阻害したが、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂの両方の用量は、ＢＴＣ誘発網膜肥厚を阻害することができなかった。この結果は、２つの試験で確認された。

実施例１５．インビトロＰＤモデル：ウサギにおけるＢＴＣ誘発網膜肥厚
ウサギにおけるＢＴＣの硝子体内（ＩＶＴ）注射は、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）によって検出されるように、網膜肥厚をもたらす。この試験でテストされた抗体は次を含んだ：ＮＶＳ１、ＮＶＳ１に対する親（「ＰＮＶＳ１」；配列番号１６８及び１６９）、Ｍｏｒ３２０７陰性対照。簡単に言うと、０日目にＢＴＣ及び／又は化合物のＩＶＴ注射の前に、ベースラインＯＣＴ測定値を決定した。

試験は、ウサギの６群を含んだ：１）０．７５μｇのｒｈＢＴＣ／眼（ｎ＝４）；２）５００μｇのＮＶＳ１／眼（ｎ＝３）；３）０．７５μｇのｒｈＢＴＣ＋５００μｇのＮＶＳ１／眼（ｎ＝４）；４）５００μｇのＰＮＶＳ１（ｎ＝３）；５）０．７５μｇのｒｈＢＴＣ＋５００μｇのＰＮＶＳ１／眼（ｎ＝４）；６）０．７５μｇのｒｈＢＴＣ＋５００μｇのＭｏｒ３２０７／眼（ｎ＝４）。

７日目にＯＣＴ分析を実施し、その後安楽死させて眼組織を組織学的分析及びＰＫ分析用に収集した。ＢＴＣと予備インキュベートしたＮＶＳ１又はＰＮＶＳ１を注射したウサギは、ＢＴＣ単独と比較して、有意に少ないＢＴＣ誘発網膜肥厚を示した（両方ともｐ＜０．００１）。平均網膜厚は、ＮＶＳ１又はＰＮＶＳ１単独の注射後にベースライン値と同様であった。ＢＴＣと予備インキュベートしたＭｏｒ３２０７を注射したウサギは、ＢＴＣ単独と比較して、有意に多い網膜肥厚を示した（ｐ＜０．０１）。網膜厚変化は、ＩＶＴ注射前の各動物の網膜厚に対するものである。

図２３は、ＮＶＳ１及びＰＮＶＳ１の両方が未処置対照及び陰性対照と比べて、ウサギの網膜厚を有意に低減させたことを示している。群は、ダネットの事後検定を伴う一元配置分散分析によって比較した（Ｐ＜０．０５＝有意）。

本開示を詳細に記載してきたが、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載された本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、変更形態、変形形態及び均等の態様が可能であることが明らかであろう。更に、本開示における全ての実施例は、非限定的な実施例として提供されていることが理解されるべきである

実施例１６．ヒトでの試験
最大２４人のＤＭＥ、ＲＶＯ、及び／又は新生血管ＡＭＤを有する参加者において、単回硝子体内（ＩＶＴ）投与後の本明細書に記載される抗ＢＴＣ／抗ＶＥＧＦ多重特異性抗体、例えば、ＮＶＳ１１～ＮＶＳ１４の安全性及び忍容性を評価するためにヒトでの試験を行う。本試験への組み入れに適格な参加者は、以下の基準の全てを満たす：
１）参加者は、フォーカルタイプ若しくはびまん性ＤＭＥ、新生血管ＡＭＤ、又はＲＶＯを含む少なくとも片方の眼に黄斑浮腫を有すること；
２）スクリーニング及びベースライン時での試験対象の眼の早期治療糖尿病性網膜症研究（ＥＴＤＲＳ）レタースコアが、６０レターよりも悪い（２０／６３）が、２４レターよりも良く（２０／３２０）；試験対象ではない眼のＥＴＤＲＳスコアが、スクリーニング及びベースライン時に、≧６０レターであること；
３）網膜動脈及び静脈の直径を測定するのに十分な透明度の眼底写真を可能にする十分な透明性のある透光体及び適切な瞳孔拡張があること；
４）バイタルサインが、スクリーニング及びベースライン（注射前）時に座位で正常な範囲内にあり：口腔体温が、３５．０～３７．５℃であり；収縮期血圧が９０～１６０ｍｍＨｇであり；拡張期血圧が５０～１００ｍｍＨｇであり；脈拍数が４０～９０ｂｐｍであることである。

この試験の主な除外基準には、試験対象の眼における増殖性糖尿病性網膜症が含まれる。次のことが、例外として許可されている：
ａ．硝子体出血を伴わない１ディスクエリア未満の新生血管房があること；及び
ｂ．病巣の周囲部の網膜領域が、１日目の少なくとも６ヶ月前までに３０レーザー熱焼より少ない光凝固術による処置を受けていること。

その他の除外基準としては、下記が含まれる：
ａ．スクリーニング時に、≧１２のヘモグロビンＡ１Ｃを有する１型又は２型糖尿病を有する患者であること；
ｂ．他の眼の病状及び全身的病状を有すること。

これは、非盲検試験である。被験者、治験依頼者、又は治験責任医師のいずれも、治療割り当て又は用量レベルに対して隠されない。この試験には、最大合計で２４人の参加者が登録され、必要に応じて、最大耐用量レベルで日本人にルーツを持つ参加者の追加が可能である。サンプルサイズ（Ｎ）は、安全性及び薬物動態（ＰＫ）を特性化するために、ヒト試験において初めての実現可能性の考慮及び標準的な慣行に基づいている。

合計で４つのコホートが登録され、追加の任意選択の６人の参加者のより少ないか又は中間のコホートを伴った。一態様では、試験の用量漸増デザインは、以下のコホートを含む：
ａ．コホート１：０．２５ｍｇ／眼、Ｎ＝３；
ｂ．コホート２：０．７５ｍｇ／眼、Ｎ＝３；
ｃ．コホート３：２．５ｍｇ／眼、Ｎ＝６；
ｄ．コホート４：７．５ｍｇ／眼、Ｎ＝６；及び
ｅ．コホート５：中間投与量での任意選択のコホート。

一態様では、本明細書に記載の抗ＢＴＣ／抗ＶＥＧＦ多重特異性抗体、例えば、ＮＶＳ１１～ＮＶＳ１４の１回用量を試験対象の眼でベースライン／１日目で硝子体内投与する。フォローアップ期間は、６０日目／試験終了時（ＥＯＳ）まで続く。

上で提供したように、一態様では、０．２５、０．７５、２．５、及び７．５ｍｇ／眼の４つの用量レベル／コホートを試験する。一態様では、ＩＶＴ投与量は、５０μＬの容量で送達される。

より高用量への漸増の前に、全ての安全性及び忍容性データの見直しを実施する。用量漸増のための時点は１５日目で選択され、このときコホート１では全ての３人の参加者が、コホート２では３人の参加者のうち２人が、コホート３及び４では６人の参加者のうち４人が１５日目に到達している。用量漸増の見直し時での１５日目までのフォローアップを含めて、以下のデータセットを評価する：バイタルサイン（体重、血圧、及び脈拍数）、ＥＣＧ、安全性検査値、視力、ＩＯＰ、有害事象、網膜厚変化、及びフルオレセイン血管造影法。

試験の用量漸増中に著しい有害事象又は安全性の懸念がある場合、次の計画された用量レベルに対する以下の変更が考えられる：現在の用量と先行する用量との間の中間の用量の投与；現在又は前のより低い用量のための追加の参加者の動員；及び／又はいかなる更なる用量漸増も終了すること。

この試験の主要アウトカム指標は、眼の有害事象及び眼以外の有害事象の数を決定することを含む（１日目～６０日目）。評価には、眼科検査、医療検査、及び安全性検査値を見直すことによって、１回のＩＶＴ投与の２ヶ月にわたる安全性及び忍容性が含まれる。主要アウトカム指標についてのエンドポイントは、以下が含まれる：
ａ．器官別大分類及び／又は基本語にカテゴリー別に要約された、治療下で発現した有害事象（ＡＥ）（新たに又はベースラインから悪化した）の発生による眼の安全性及び眼以外の安全性の特性評価；及び
ｂ．次のベースラインと比較した以下の変化の測定：バイタルサイン、ＥＣＧ、安全性検査値、ＩＯＰ、ＢＣＶＡ、及びＳＤ－ＯＣＴによって測定されるような黄斑厚さ。

この試験の副次的アウトカム指標には、１回ＩＶＴ投与後の本明細書に記載の抗ＢＴＣ／抗ＶＥＧＦ多重特異性抗体（例えば、ＮＶＳ１１～ＮＶＳ１４）のＰＫプロファイルが含まれ、このエンドポイントには、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｔ１／２、ＡＵＣｌａｓｔ、及びＡＵＣｉｎｆ（これらの全ては、１日目、２日目、５日目、１５日目、２９日目、４３日目、及び６０日目の時間枠内である）が挙げられるが、これらに限定されないＰＫパラメータによって説明されるような全抗体の血清濃度が含まれる。

列挙された実施形態
１．ベータセルリン（ＢＴＣ）に特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。

２．ＢＴＣのＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ４、又はその両方への結合をブロッキングする、実施形態１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

３．ＢＴＣ誘発リン酸化－ＥＲＫ１／２活性化をブロッキングする、実施形態１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

４．ＢＴＣ誘発リン酸化－ＨＥＲ３活性化をブロッキングする、実施形態１～３のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

５．ＢＴＣに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、５ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する、単離された抗体又はその抗原結合断片。

６．配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＢＴＣに結合する、実施形態１～５のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

７．Ｇ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、Ｖ５６、Ａ５７、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６からなる群から選択される配列番号１５７の少なくとも１つの残基に結合する、実施形態６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

８．配列番号１５７のＲ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、及びＲ７３に結合する、実施形態１～７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

９．それぞれ配列番号１、２、及び３に記載されるような重鎖可変領域相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖可変領域相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖可変領域相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号１４、１５、及び１６に記載されるような軽鎖可変領域相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖可変領域相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖可変領域相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）とを含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

１０．それぞれ配列番号４、２、及び３に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号１４、１５、及び１６に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

１１．ＨＣＤＲ１がコンセンサス配列ＸＹＡＩＳを含み、及び／又はＨＣＤＲ２がコンセンサス配列ＧＩＸＰＸＸＧＸＸＸＹＡＱＫＦＱＧを含み、Ｘが任意のアミノ酸であり、異なる位置において同じでなくてもよい、実施形態１～９のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

１２．配列番号１６８の重鎖配列及び配列番号１６９の軽鎖配列を含むか、又は配列番号１７０の重鎖配列及び配列番号１７１の軽鎖配列を含む、実施形態１１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

１３．それぞれ配列番号５、６、及び３に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号１７、１８、及び１９に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

１４．それぞれ配列番号７、８、及び９に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号２０、１８、及び１６に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

１５．それぞれ配列番号１０及び２１に対して、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、実施形態９～１４のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

１６．アミノ酸配列における違いが、相補性決定領域内にはない、実施形態１５に記載の抗体又はその抗原結合断片。

１７．アミノ酸配列における違いが、保存的置換である、実施形態１５に記載の抗体又はその抗原結合断片。

１８．それぞれ配列番号１０及び２１に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１５に記載の抗体又はその抗原結合断片。

１９．ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号１１及び２２に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態１８に記載の抗体又はその抗原結合断片。

２０．それぞれ配列番号１２及び２３に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

２１．重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号１３及び２４に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸によってコード化される、実施形態２０に記載の抗体又はその抗原結合断片。

２２．１）配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ中に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、２）配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＬ中に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む、実施形態９～２１のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

２３．ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、
ａ．それぞれ配列番号１、２、３、１４、１５、及び１６、
ｂ．それぞれ配列番号４、２、３、１４、１５、及び１６、
ｃ．それぞれ配列番号５、６、３、１７、１８、及び１９、又は
ｄ．それぞれ配列番号７、８、９、２０、１８、及び１６を含む、実施形態２２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

２４．ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ａ．ＨＣＤＲ１が配列番号１、４、５、及び７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号２、６、及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号３及び９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、且つ
ｂ．ＬＣＤＲ１が配列番号１４、１７、及び２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１５及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号１６及び１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

２５．それぞれ配列番号１０及び２１のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態２４に記載の抗体又はその抗原結合断片。

２６．それぞれ配列番号１２及び２３に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、実施形態２５に記載の抗体又はその抗原結合断片。

２７．ＢＴＣに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、それぞれ配列番号１０及び２１のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、単離された抗体又はその抗原結合断片。

２８．配列番号１５７のＰ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６に結合する、実施形態１～７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

２９．それぞれ配列番号２５、２６、及び２７に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３８、３９、及び４０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～７及び２８のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

３０．それぞれ配列番号２８、２６、及び２７に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３８、３９、及び４０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～７及び２８のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

３１．それぞれ配列番号２９、３０、及び２７に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４１、４２、及び４３に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～７及び２８のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

３２．それぞれ配列番号３１、３２、及び３３に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４４、４２、及び４０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～７及び２８のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

３３．それぞれ配列番号３４及び４５に対して、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

３４．アミノ酸配列における違いが、相補性決定領域内にはない、実施形態３３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

３５．アミノ酸配列における違いが、保存的置換である、実施形態３３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

３６．それぞれ配列番号３４及び４５に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態３３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

３７．ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号３５及び４６に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態３６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

３８．それぞれ配列番号３６及び４７に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、実施形態２８～３７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

３９．重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号３７及び４８に対して、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸によってコード化される、実施形態３８に記載の抗体又はその抗原結合断片。

４０．１）配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ中に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、２）配列番号４５のアミノ酸配列を有するＶＬ中に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む、実施形態２８～３９のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

４１．ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、
ａ．それぞれ配列番号２５、２６、２７、３８、３９、及び４０、
ｂ．それぞれ配列番号２８、２６、２７、３８、３９、及び４０、
ｃ．それぞれ配列番号２９、３０、２７、４１、４２、及び４３、又は
ｄ．それぞれ配列番号３１、３２、３３、４４、４２、及び４０を含む、実施形態４０に記載の抗体又はその抗原結合断片。

４２．ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ａ．ＨＣＤＲ１が配列番号２５、２８、２９、及び３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号２６、３０、及び３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号２７及び３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、且つ
ｂ．ＬＣＤＲ１が配列番号３８、４１、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号３９及び４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号４０及び４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～７及び２８のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

４３．それぞれ配列番号３４及び４５のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態４２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

４４．それぞれ配列番号３６及び４７に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、実施形態４３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

４５．ＢＴＣに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、それぞれ配列番号３４及び４５のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、単離された抗体又はその抗原結合断片。

４６．配列番号１５７のＧ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、及びＶ５６に結合する、実施形態１～７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

４７．それぞれ配列番号２５、４９、及び５０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号５８、５９、及び６０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～７及び４６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

４８．それぞれ配列番号２８、４９、及び５０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号５８、５９、及び６０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～７及び４６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

４９．ＨＣＤＲ１がコンセンサス配列ＸＸＡＭＸを含み、及び／又はＨＣＤＲ２がコンセンサス配列ＸＸＸＸ／－ＸＸＸＸＴＸＹＸＤＳＶＫＧ、Ｘが任意のアミノ酸配列であり、異なる位置で同じでなくてもよく、Ｘ／－が任意のアミノ酸又は欠失である、実施形態１～７及び４６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

５０．配列番号１９０の重鎖配列及び配列番号１９１の軽鎖配列を含む、実施形態４９に記載の抗体又はその抗原結合断片。

５１．それぞれ配列番号２９、５１、及び５０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号６１、６２、及び６３に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～７及び４６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

５２．それぞれ配列番号３１、５２、及び５３に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号６４、６２、及び６０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～７及び４６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

５３．それぞれ配列番号５４及び６５に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態４６～５２のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

５４．アミノ酸配列における違いが、相補性決定領域内にはない、実施形態５３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

５５．アミノ酸配列における違いが、保存的置換である、実施形態５３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

５６．それぞれ配列番号５４及び６５に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態５３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

５７．ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号５５及び６６に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態５６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

５８．それぞれ配列番号５６及び６７に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、実施形態４６～５７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

５９．重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号５７及び６８に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコード化される、実施形態５８に記載の抗体又はその抗原結合断片。

６０．１）配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＨ中に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、２）配列番号６５のアミノ酸配列を有するＶＬ中に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む、実施形態４６～５９のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

６１．ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、
ａ．それぞれ配列番号２５、４９、５０、５８、５９、及び６０、
ｂ．それぞれ配列番号２８、４９、５０、５８、５９、及び６０、
ｃ．それぞれ配列番号２９、５１、５０、６１、６２、及び６３、又は
ｄ．それぞれ配列番号３１、５２、５３、６４、６２、及び６０を含む、実施形態６０に記載の抗体又はその抗原結合断片。

６２．ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ａ．ＨＣＤＲ１が配列番号２５、２８、２９、及び３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号４９、５１、及び５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号５０及び５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、且つ
ｂ．ＬＣＤＲ１が配列番号５８、６１、及び６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号５９及び６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号６０及び６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～７及び４６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

６３．それぞれ配列番号５４及び６５のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態６２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

６４．それぞれ配列番号５６及び６７に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、実施形態６３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

６５．ＢＴＣに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、それぞれ配列番号５４及び６５のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、単離された抗体又はその抗原結合断片。

６６．配列番号１５７のＳ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ａ５７、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、及びＥ７５に結合する、実施形態１～７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

６７．それぞれ配列番号６９、７０、及び７１に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号８２、８３、及び８４に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～７及び６６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

６８．それぞれ配列番号７２、７０、及び７１に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号８２、８３、及び８４に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～７及び６６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

６９．ＨＣＤＲ２がコンセンサス配列ＸＩＸＸＸＸＸＸＸＸＹＡＤＳＶＫＧを含み、及び／又はＬＣＤＲ３がコンセンサス配列ＱＱＹＤＸＸＸＴを含み、Ｘが任意のアミノ酸であり、異なる位置で同じでなくてもよい、実施形態１～７及び６６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

７０．
ａ．それぞれ配列番号１９４及び１９５、
ｂ．それぞれ配列番号１９６及び１９７、
ｃ．それぞれ配列番号１９８及び１９９、
ｄ．それぞれ配列番号２００及び２０１、
ｅ．それぞれ配列番号２０２及び２０３、
ｆ．それぞれ配列番号２０４及び２０５、及び
ｇ．それぞれ配列番号２０６及び２０７
からなる群から選択される重鎖及び軽鎖配列を含む、実施形態６９に記載の抗体又はその抗原結合断片。

７１．それぞれ配列番号７３、７４、及び７１に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号８５、１８、及び８６に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～７及び６６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

７２．それぞれ配列番号７５、７６、及び７７に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号８７、１８、及び８４に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１～７及び６６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

７３．それぞれ配列番号７８及び８８に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態６６～７２のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

７４．アミノ酸配列における違いが、相補性決定領域内にはない、実施形態７３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

７５．アミノ酸配列における違いが、保存的置換である、実施形態７３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

７６．それぞれ配列番号７８及び８８に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態７３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

７７．ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号７９及び８９に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態７６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

７８．それぞれ配列番号８０及び９０に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、実施形態６６～７７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

７９．重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号８１及び９１に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコード化される、実施形態７８に記載の抗体又はその抗原結合断片。

８０．１）配列番号７８のアミノ酸配列を有するＶＨ中に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、２）配列番号８８のアミノ酸配列を有するＶＬ中に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、を含む、実施形態６６～７９のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

８１．ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、
ａ．それぞれ配列番号６９、７０、７１、８２、８３、及び８４、
ｂ．それぞれ配列番号７２、７０、７１、８２、８３、及び８４、
ｃ．それぞれ配列番号７３、７４、７１、８５、１８、及び８６、又は
ｄ．それぞれ配列番号７５、７６、７７、８７、１８、及び８４を含む、実施形態８０に記載の抗体又はその抗原結合断片。

８２．ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ａ．ＨＣＤＲ１が配列番号６９、７２、７３、及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号７０、７４、及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号７１及び７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、且つ
ｂ．ＬＣＤＲ１が配列番号８２、８５、及び８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号８３及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号８４及び８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～７及び６６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

８３．それぞれ配列番号７８及び８８のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態８２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

８４．それぞれ配列番号８０及び９０に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、実施形態８３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

８５．ＢＴＣに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、それぞれ配列番号７８及び８８のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、単離された抗体又はその抗原結合断片。

８６．単離された抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される形式である、実施形態１～８５のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

８７．Ｆａｂである、実施形態８６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

８８．ｓｃＦｖである、実施形態８６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

８９．単離された抗体である、実施形態８６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

９０．単離された抗体が、モノクローナルヒト抗体である、実施形態８９に記載の抗体又はその抗原結合断片。

９１．単離された抗体が、モノクローナルヒト化抗体である、実施形態８９に記載の抗体又はその抗原結合断片。

９２．Ｆａｂが、Ｆｃ領域を含む、実施形態１～９０のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。

９３．Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＤに由来するＦｃ領域からなる群から選択される、実施形態９２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

９４．Ｆｃ領域が、配列番号１５９に記載されるようなヒト免疫グロブリンカッパ鎖定常領域配列を含む、実施形態９２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

９５．Ｆｃ領域が、配列番号１６０に記載されるようなヒト免疫グロブリンの重鎖の第１の定常Ｉｇドメイン（ＣＨ１ドメイン）を含む、実施形態９２に記載の抗体又はその抗原結合。

９６．ＢＴＣへの結合及びＢＴＣ媒介シグナル伝達の低減に対して、実施形態１～９５のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片と競合することができる、単離された抗体又はその抗原結合断片。

９７．それぞれ配列番号１６８及び１６９、それぞれ配列番号１７０及び１７１、それぞれ配列番号１７２及び１７３、それぞれ配列番号１７４及び１７５、それぞれ配列番号１７６及び１７７、それぞれ配列番号１７８及び１７９、それぞれ配列番号１８０及び１８１、それぞれ配列番号１８２及び１８３、それぞれ配列番号１８４及び１８５、それぞれ配列番号１８６及び１８７、又はそれぞれ配列番号１８８及び１８９に記載されるような重鎖及び軽鎖を含む、実施形態９６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

９８．実施形態１～９７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片をコード化するヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。

９９．実施形態９８に記載のポリヌクレオチドを含む、発現カセット。

１００．実施形態９９に記載の発現カセットを含む、ベクター。

１０１．実施形態９８に記載のポリヌクレオチド又は実施形態１００に記載のベクターを含む、宿主細胞。

１０２．抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、実施形態１０１に記載の宿主細胞を、抗体又はその抗原結合断片の発現に好適な条件下で培養することを含む、方法。

１０３．抗体又はその抗原結合断片を精製することを更に含む、実施形態１０２に記載の方法。

１０４．有効量の、実施形態１～９７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、医薬組成物。

１０５．薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体を更に含む、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

１０６．治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、有効量の、実施形態１～９５のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片、若しくは実施形態１０４又は１０５に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

１０７．対象が、膵臓癌、乳癌、子宮内膜腺癌、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、及び胃癌からなる群から選択される疾患を有する、実施形態１０６に記載の方法。

１０８．抗体又はその抗原結合断片若しくは医薬組成物が、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、及び上皮投与からなる群から選択される経路を介して投与される、実施形態１０７に記載の方法。

１０９．対象が、眼科的障害を有する、実施形態１０６に記載の方法。

１１０．眼科的障害が、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、新生血管加齢黄斑変性、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、母斑症に関連する異常血管増殖、中心性漿液性脈絡網膜症、及び急性多発性小板状色素上皮症からなる群から選択される、実施形態１０９に記載の方法。

１１１．眼科的障害が、糖尿病性黄斑浮腫である、実施形態１１０に記載の方法。

１１２．投与することが、網膜下注射を介する、実施形態１０９～１１１のいずれか１つに記載の方法。

１１３．投与することが、硝子体内注射を介する、実施形態１０９～１１１のいずれか１つに記載の方法。

１１４．医薬組成物が、抗ＶＥＧＦアンタゴニストを更に含む、実施形態１０９～１１３のいずれか１つに記載の方法。

１１５．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、ラニビズマブである、実施形態１１４に記載の方法。

１１６．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、ベバシズマブである、実施形態１１４に記載の方法。

１１７．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、アフリベルセプトである、実施形態１１４に記載の方法。

１１８．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、ブロルシズマブである、実施形態１１４に記載の方法。

１１９．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、ペガプタニブである、実施形態１１４に記載の方法。

１２０．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、それぞれ配列番号１０３及び１１４に記載されるような重鎖及び軽鎖を含む、実施形態１１４に記載の方法。

１２１．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、配列番号１０４及び１１５に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態１２０に記載の方法。

１２２．対象に抗ＶＥＧＦアンタゴニストを投与することを更に含む、実施形態１０９～１１３のいずれか１つに記載の方法。

１２３．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、ラニビズマブである、実施形態１２２に記載の方法。

１２４．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、ベバシズマブである、実施形態１２２に記載の方法。

１２５．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、アフリベルセプトである、実施形態１２２に記載の方法。

１２６．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、ブロルシズマブである、実施形態１２２に記載の方法。

１２７．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、ペガプタニブである、実施形態１２２に記載の方法。

１２８．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、配列番号１０３及び１１４に記載されるような重鎖及び軽鎖を含む、実施形態１２２に記載の方法。

１２９．抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、配列番号１０４及び１１５に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態１２８に記載の方法。

１３０．実施形態１～９７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片若しくは実施形態１０４又は１０５に記載の医薬組成物を含む、キット。

１３１．使用説明書を更に含む、実施形態１３０に記載のキット。

１３２．注射器を更に含む、実施形態１３１に記載のキット。

１３３．１）抗ＢＴＣ結合部分と、２）抗ＶＥＧＦ結合部分と、を含む、多重特異性結合分子。

１３４．抗ＢＴＣ結合部分が、配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＢＴＣに結合する、実施形態１３３に記載の多重特異性結合分子。

１３５．抗ＢＴＣ結合部分が、Ｇ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、Ｖ５６、Ａ５７、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６からなる群から選択される配列番号１５７の少なくとも１つの残基に結合する、実施形態１３４に記載の多重特異性結合分子。

１３６．抗ＢＴＣ結合部分が、配列番号１５７のＲ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、及びＲ７３に結合する、実施形態１３５に記載の多重特異性結合分子。

１３７．抗ＢＴＣ結合部分が、配列番号１５７のＰ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６に結合する、実施形態１３５に記載の多重特異性結合分子。

１３８．抗ＢＴＣ結合部分が、配列番号１５７のＧ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、及びＶ５６に結合する、実施形態１３５に記載の多重特異性結合分子。

１３９．抗ＢＴＣ結合部分が、配列番号１５７のＳ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ａ５７、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、及びＥ７５に結合する、実施形態１３５に記載の多重特異性結合分子。

１４０．抗ＢＴＣ結合部分が、実施形態１～９５のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片である、実施形態１３３に記載の多重特異性結合分子。

１４１．抗ＶＥＧＦ結合部分が、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片である、実施形態１３３に記載の多重特異性結合分子。

１４２．抗ＢＴＣ結合部分及び抗ＶＥＧＦ結合部分が、単離された抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなるリストから選択される形式である、実施形態１３３～１４１のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子。

１４３．抗ＢＴＣ結合部分が、抗ＢＴＣ Ｆａｂであり、抗ＶＥＧＦ結合部分が、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂである、実施形態１４２に記載の多重特異性結合分子。

１４４．抗ＢＴＣ Ｆａｂが、重鎖（ＨＡ）及び軽鎖（ＬＡ）を含み、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂが、重鎖（ＨＢ）及び軽鎖（ＬＢ）を含む、実施形態１４３に記載の多重特異性結合分子。

１４５．ＨＡ及びＨＢが、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＨＡ－リンカー１－ＨＢ－Ｃの形式で連結されており、ＬＡ及びＬＢが、Ｎ－末端からＣ－に向かって：Ｎ－ＬＡ－リンカー２－ＬＢ－Ｃの形式で連結されている、実施形態１４４に記載の多重特異性結合分子。

１４６．ＨＡ及びＨＢが、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＨＢ－リンカー１－ＨＡ－Ｃの形式で連結されており、ＬＡ及びＬＢが、Ｎ－末端からＣ－に向かって：Ｎ－ＬＢ－リンカー２－ＬＡ－Ｃの形式で連結されている、実施形態１４４に記載の多重特異性結合分子。

１４７．リンカー１及びリンカー２が、配列番号１１８のアミノ配列を含む、実施形態１４５又は１４６に記載の多重特異性結合分子。

１４８．リンカー１及びリンカー２が、配列番号１１９の核酸配列によってコード化される、実施形態１４７に記載の多重特異性結合分子。

１４９．リンカー１及びリンカー２が、配列番号１６１～１６７からなる群から選択されるアミノ配列を含む、実施形態１４５又は１４６に記載の多重特異性結合分子。

１５０．抗ＢＴＣ結合部分が、
ａ．それぞれ配列番号１、２、３、１４、１５、及び１６、
ｂ．それぞれ配列番号４、２、３、１４、１５、及び１６、
ｃ．それぞれ配列番号５、６、３、１７、１８、及び１９、又は
ｄ．それぞれ配列番号７、８、９、２０、１８、及び１６に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１３３～１４９のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子。

１５１．抗ＢＴＣ結合部分が、それぞれ配列番号１０及び２１のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１５０に記載の多重特異性結合分子。

１５２．ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号１１６及び１２２の核酸配列によってコード化される、実施形態１５１に記載の多重特異性結合分子。

１５３．抗ＢＴＣ結合部分が、
ａ．それぞれ配列番号２５、２６、２７、３８、３９、及び４０、
ｂ．それぞれ配列番号２８、２６、２７、３８、３９、及び４０、
ｃ．それぞれ配列番号２９、３０、２７、４１、４２、及び４３、又は
ｄ．それぞれ配列番号３１、３２、３３、４４、４２、及び４０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１３３～１４８のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子。

１５４．抗ＢＴＣ結合部分が、それぞれ配列番号３４及び４５のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１５３に記載の多重特異性結合分子。

１５５．ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号１２７及び１３２の核酸配列によってコード化される、実施形態１５３に記載の多重特異性結合分子。

１５６．抗ＢＴＣ結合部分が、
ａ．それぞれ配列番号２５、４９、５０、５８、５９、及び６０、
ｂ．それぞれ配列番号２８、４９、５０、５８、５９、及び６０、
ｃ．それぞれ配列番号２９、５１、５０、６１、６２、及び６３、又は
ｄ．それぞれ配列番号３１、５２、５３、６４、６２、及び６０に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１３３～１４８のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子。

１５７．抗ＢＴＣ結合部分が、それぞれ配列番号５４及び６５のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１５６に記載の多重特異性結合分子。

１５８．ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号１３７及び１４２の核酸配列によってコード化される、実施形態１５７に記載の多重特異性結合分子。

１５９．抗ＢＴＣ結合部分が、
ａ．それぞれ配列番号６９、７０、７１、８２、８３、及び８４、
ｂ．それぞれ配列番号７２、７０、７１、８２、８３、及び８４、
ｃ．それぞれ配列番号７３、７４、７１、８５、１８、及び８６、又は
ｄ．それぞれ配列番号７５、７６、７７、８７、１８、及び８４に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１３３～１４８のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子。

１６０．抗ＢＴＣ結合部分が、それぞれ配列番号７８及び８８のアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１５９に記載の多重特異性結合分子。

１６１．ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号１４７及び１５１の核酸配列によってコード化される、実施形態１６０に記載の多重特異性結合分子。

１６２．抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号９２、９３、及び９４に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１３３～１６１のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子。

１６３．抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号９５、９３、及び９４に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１３３～１６１のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子。

１６４．抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号９６、９７、及び９４に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号１０８、１０９、及び１１０に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１３３～１６１のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子。

１６５．抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号９８、９９、及び１００に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号１１１、１０９、及び１０７に記載されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、実施形態１３３～１６１のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子。

１６６．抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号１０１及び１１２に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１３３～１６５のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子。

１６７．アミノ酸配列における違いが、相補性決定領域内にはない、実施形態１６６に記載の多重特異性結合分子。

１６８．アミノ酸配列における違いが、保存的置換である、実施形態１６６に記載の多重特異性結合分子。

１６９．抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号１０１及び１１２に記載されるようなアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１６６に記載の多重特異性結合分子。

１７０．抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号１０２及び１１３に記載されるような核酸配列によってコード化されるＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１６９に記載の多重特異性結合分子。

１７１．抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号１１７及び１２３に記載されるような核酸配列によってコード化されるＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１６９に記載の多重特異性結合分子。

１７２．抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号１２８及び１３３に記載されるような核酸配列によってコード化されるＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１６９に記載の多重特異性結合分子。

１７３．抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号１３８及び１４３に記載されるような核酸配列によってコード化されるＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１６９に記載の多重特異性結合分子。

１７４．抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号１４８及び１５２に記載されるような核酸配列によってコード化されるＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１６９に記載の多重特異性結合分子。

１７５．抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号１０３及び１１４に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、実施形態１３３～１７４のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子。

１７６．重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号１０４及び１１５に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸によってコード化される、実施形態１７５に記載の多重特異性結合分子。

１７７．抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子であって、抗ＢＴＣ結合部分が、ＢＴＣに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＡ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＡ）を含み、抗ＶＥＧＦ結合部分が、ＶＥＧＦに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＢ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＢ）を含み、
ａ．ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号１０及び２１に記載されるようなアミノ酸配列を含み、且つ
ｂ．ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１０１及び１１２に記載されるようなアミノ酸配列を含む、多重特異性結合分子。

１７８．抗ＢＴＣ結合部分が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ａ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＡ）を更に含み、抗ＶＥＧＦ結合部分が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ｂ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＢ）を更に含む、実施形態１７７に記載の多重特異性結合分子。

１７９．Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＡ－ＣＨ１Ａ－リンカー－ＶＨＢ－ＣＨ１Ｂ－Ｃ及びＮ－ＶＬＡ－ＣＫＡ－リンカー－ＶＬＢ－ＣＫＢ－Ｃのような形式である、実施形態１７８に記載の多重特異性結合分子。

１８０．ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖を含み、重鎖が配列番号１２０に記載される通りである、実施形態１７９に記載の多重特異性結合分子。

１８１．重鎖が、配列番号１２１に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態１８０に記載の多重特異性結合分子。

１８２．ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖を含み、軽鎖が配列番号１２５に記載される通りである、実施形態１７９に記載の多重特異性結合分子。

１８３．軽鎖が、配列番号１２６に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態１８２に記載の多重特異性結合分子。

１８４．抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子であって、抗ＢＴＣ結合部分が、ＢＴＣに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＡ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＡ）を含み、抗ＶＥＧＦ結合部分が、ＶＥＧＦに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＢ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＢ）を含み、
ａ．ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号３４及び４５に記載されるようなアミノ酸配列を含み、且つ
ｂ．ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１０１及び１１２に記載されるようなアミノ酸配列を含む、多重特異性結合分子。

１８５．抗ＢＴＣ結合部分が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ａ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＡ）を更に含み、抗ＶＥＧＦ結合部分が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ｂ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＢ）を更に含む、実施形態１８４に記載の多重特異性結合分子。

１８６．Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＡ－ＣＨ１Ａ－リンカー－ＶＨＢ－ＣＨ１Ｂ－Ｃ及びＮ－ＶＬＡ－ＣＫＡ－リンカー－ＶＬＢ－ＣＫＢ－Ｃのような形式である、実施形態１８５に記載の多重特異性結合分子。

１８７．ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖を含み、重鎖が配列番号１３０に記載される通りである、実施形態１８６に記載の多重特異性結合分子。

１８８．重鎖が、配列番号１３１に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態１８７に記載の多重特異性結合分子。

１８９．ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖を含み、軽鎖が配列番号１３５に記載される通りである、実施形態１８６に記載の多重特異性結合分子。

１９０．軽鎖が、配列番号１３６に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態１８９に記載の多重特異性結合分子。

１９１．抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子であって、抗ＢＴＣ結合部分が、ＢＴＣに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＡ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＡ）を含み、抗ＶＥＧＦ結合部分が、ＶＥＧＦに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＢ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＢ）を含み、
ａ．ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号５４及び６５に記載されるようなアミノ酸配列を含み、且つ
ｂ．ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１０１及び１１２に記載されるようなアミノ酸配列を含む、多重特異性結合分子。

１９２．抗ＢＴＣ結合部分が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ａ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＡ）を更に含み、抗ＶＥＧＦ結合部分が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ｂ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＢ）を更に含む、実施形態１９１に記載の多重特異性結合分子。

１９３．Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＡ－ＣＨ１Ａ－リンカー－ＶＨＢ－ＣＨ１Ｂ－Ｃ及びＮ－ＶＬＡ－ＣＫＡ－リンカー－ＶＬＢ－ＣＫＢ－Ｃのような形式である、実施形態１９２に記載の多重特異性結合分子。

１９４．ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖を含み、重鎖が配列番号１４０に記載される通りである、実施形態１９３に記載の多重特異性結合分子。

１９５．重鎖が、配列番号１４１に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態１９４に記載の多重特異性結合分子。

１９６．ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖を含み、軽鎖が配列番号１４５に記載される通りである、実施形態１９３に記載の多重特異性結合分子。

１９７．軽鎖が、配列番号１４６に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態１９６に記載の多重特異性結合分子。

１９８．抗ＢＴＣ結合部分と抗ＶＥＧＦ結合部分とを含む多重特異性結合分子であって、抗ＢＴＣ結合部分が、ＢＴＣに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＡ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＡ）を含み、抗ＶＥＧＦ結合部分が、ＶＥＧＦに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＢ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＢ）を含み、
ａ．ＶＨＡ及びＶＬＡが、それぞれ配列番号７８及び８８に記載されるようなアミノ酸配列を含み、且つ
ｂ．ＶＨＢ及びＶＬＢが、それぞれ配列番号１０１及び１１２に記載されるようなアミノ酸配列を含む、多重特異性結合分子。

１９９．抗ＢＴＣ結合部分が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ａ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＡ）を更に含み、抗ＶＥＧＦ結合部分が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１Ｂ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＫＢ）を更に含む、実施形態１９８に記載の多重特異性結合分子。

２００．Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＡ－ＣＨ１Ａ－リンカー－ＶＨＢ－ＣＨ１Ｂ－Ｃ及びＮ－ＶＬＡ－ＣＫＡ－リンカー－ＶＬＢ－ＣＫＢ－Ｃのような形式である、実施形態１９９に記載の多重特異性結合分子。

２０１．ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖を含み、重鎖が配列番号１４９に記載される通りである、実施形態２００に記載の多重特異性結合分子。

２０２．重鎖が、配列番号１５０に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態２０１に記載の多重特異性結合分子。

２０３．ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖を含み、軽鎖が配列番号１５４に記載される通りである、実施形態２００に記載の多重特異性結合分子。

２０４．軽鎖が、配列番号１５５に記載されるような核酸配列によってコード化される、実施形態２０３に記載の多重特異性結合分子。

２０５．第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性結合分子であって、第１のポリペプチド鎖が配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号１２５を含む、多重特異性結合分子。

２０６．第１のポリペプチド鎖が配列番号１２１の核酸配列によってコード化され、第２のポリペプチド鎖が配列番号１２６の核酸配列によってコード化される、実施形態２０５に記載の多重特異性結合分子。

２０７．第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性結合分子であって、第１のポリペプチド鎖が配列番号１３０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号１３５を含む、多重特異性結合分子。

２０８．第１のポリペプチド鎖が配列番号１３１の核酸配列によってコード化され、第２のポリペプチド鎖が配列番号１３６の核酸配列によってコード化される、実施形態２０７に記載の多重特異性結合分子。

２０９．第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性結合分子であって、第１のポリペプチド鎖が配列番号１４０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号１４５を含む、多重特異性結合分子。

２１０．第１のポリペプチド鎖が配列番号１４１の核酸配列によってコード化され、第２のポリペプチド鎖が配列番号１４６の核酸配列によってコード化される、実施形態２０９に記載の多重特異性結合分子。

２１１．第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性結合分子であって、第１のポリペプチド鎖が配列番号１４９のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号１５４を含む、多重特異性結合分子。

２１２．第１のポリペプチド鎖が配列番号１５０の核酸配列によってコード化され、第２のポリペプチド鎖が配列番号１５５の核酸配列によってコード化される、実施形態２１１に記載の多重特異性結合分子。

２１３．実施形態１３３～２１２のいずれか１つに記載の多重特異性結合をコード化するヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。

２１４．実施形態２１３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現カセット。

２１５．実施形態２１４に記載の発現カセットを含む、ベクター。

２１６．実施形態２１３に記載のポリヌクレオチド又は実施形態２１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。

２１７．多重特異性結合分子を産生する方法であって、実施形態２１６に記載の宿主細胞を、多重特異性結合分子又はその断片の発現に好適な条件下で培養することを含む、方法。

２１８．多重特異性結合分子を精製することを更に含む、実施形態２１７に記載の方法。

２１９．有効量の、実施形態１３３～２１２のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子を含む、医薬組成物。

２２０．薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体を更に含む、実施形態２１９に記載の医薬組成物。

２２１．１つ以上の治療薬を更に含む、実施形態２２０に記載の医薬組成物。

２２２．眼科的障害の治療を必要とする対象において眼科的障害を治療する方法であって、有効量の、実施形態１３３～２１２のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子又は実施形態２１９若しくは２２０に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。

２２３．多重特異性結合分子又は医薬組成物が、対象に硝子体内投与される、実施形態２２２に記載の方法。

２２４．多重特異性結合分子又は医薬組成物が、網膜下注射を介して投与される、実施形態２２２に記載の方法。

２２５．眼科的障害が、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、新生血管加齢黄斑変性、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、及び母斑症に関連する異常血管増殖からなる群から選択される、実施形態２２２～２２４のいずれか１つに記載の方法。

２２６．眼科的障害が、糖尿病性黄斑浮腫である、実施形態２２２に記載の方法。

２２７．治療有効量の、実施形態１３３～２１２のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子を対象に投与することを含む方法であって、多重特異性結合分子が、対象における網膜漏出及び／又は網膜肥厚を対照の対象に対して低減する、方法。

２２８．実施形態１３３～２０４のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子又は実施形態２１９若しくは２２０に記載の医薬組成物を含む、キット。

２２９．使用説明書を更に含む、実施形態２２８に記載のキット。

２３０．注射器を更に含む、実施形態２２９に記載のキット。

２３１．黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、新生血管ＡＭＤ、又はＲＶＯの予防又は治療を必要とする対象においてそれらを予防又は治療する方法であって、実施形態１３３～２１２のいずれか１つに記載の多重特異性結合分子を、約０．２５ｍｇ／眼～７．５ｍｇ／眼の範囲の用量で対象に硝子体内投与することを含む、方法。

２３２．用量が、約０．２５ｍｇ／眼、０．７５ｍｇ／眼、２．５ｍｇ／眼、又は７．５ｍｇ／眼である、実施形態２３１に記載の方法。

２３３．用量が、０．２５ｍｇ／眼である、実施形態２３１に記載の方法。

２３４．用量が、０．７５ｍｇ／眼である、実施形態２３１に記載の方法。

２３５．用量が、１ｍｇ／眼である、実施形態２３１に記載の方法。

２３６．用量が、２．５ｍｇ／眼である、実施形態２３１に記載の方法。

２３７．用量が、３ｍｇ／眼である、実施形態２３１に記載の方法。

２３８．用量が、５ｍｇ／眼である、実施形態２３１に記載の方法。

２３９．用量が、７．５ｍｇ／眼である、実施形態２３１に記載の方法。

２４０．用量が、０．２５ｍｇ／眼、０．３ｍｇ／眼、０．３５ｍｇ／眼、０．４ｍｇ／眼、０．４５ｍｇ／眼、０．５ｍｇ／眼、０．５５ｍｇ／眼、０．６ｍｇ／眼、０．６５ｍｇ／眼、０．７ｍｇ／眼、０．７５ｍｇ／眼、０．８ｍｇ／眼、０．８５ｍｇ／眼、０．９ｍｇ／眼、０．９５ｍｇ／眼、１．０ｍｇ／眼、１．１ｍｇ／眼、１．２ｍｇ／眼、１．３ｍｇ／眼、１．４ｍｇ／眼、１．５ｍｇ／眼、１．６ｍｇ／眼、１．７ｍｇ／眼、１．８ｍｇ／眼、１．９ｍｇ／眼、２．０ｍｇ／眼、２．１ｍｇ／眼、２．２ｍｇ／眼、２．３ｍｇ／眼、２．４ｍｇ／眼、２．５ｍｇ／眼、２．６ｍｇ／眼、２．７ｍｇ／眼、２．８ｍｇ／眼、２．９ｍｇ／眼、３．０ｍｇ／眼、３．１ｍｇ／眼、３．２ｍｇ／眼、３．３ｍｇ／眼、３．４ｍｇ／眼、３．５ｍｇ／眼、３．６ｍｇ／眼、３．７ｍｇ／眼、３．８ｍｇ／眼、３．９ｍｇ／眼、４．０ｍｇ／眼、４．１ｍｇ／眼、４．２ｍｇ／眼、４．３ｍｇ／眼、４．４ｍｇ／眼、４．５ｍｇ／眼、４．６ｍｇ／眼、４．７ｍｇ／眼、４．８ｍｇ／眼、４．９ｍｇ／眼、５．０ｍｇ／眼、５．１ｍｇ／眼、５．２ｍｇ／眼、５．３ｍｇ／眼、５．４ｍｇ／眼、５．５ｍｇ／眼、５．６ｍｇ／眼、５．７ｍｇ／眼、５．８ｍｇ／眼、５．９ｍｇ／眼、６．０ｍｇ／眼、６．１ｍｇ／眼、６．２ｍｇ／眼、６．３ｍｇ／眼、６．４ｍｇ／眼、６．５ｍｇ／眼、６．６ｍｇ／眼、６．７ｍｇ／眼、６．８ｍｇ／眼、６．９ｍｇ／眼、７．０ｍｇ／眼、７．１ｍｇ／眼、７．２ｍｇ／眼、７．３ｍｇ／眼、７．４ｍｇ／眼、又は７．５ｍｇ／眼である、実施形態２３１に記載の方法。

２４１．多重特異性結合分子が、１）それぞれ配列番号１０及び２１のアミノ酸配列を含む抗ＢＴＣ結合部分と、２）それぞれ配列番号１０１及び１１２のアミノ酸配列を含む抗ＶＥＧＦ結合部分と、を含む、実施形態２３１～２４０のいずれか１つに記載の方法。

２４２．投与が、１ヶ月に１回である、実施形態２３１～２４１のいずれか１つに記載の方法。

Claims (30)

1. ベータセルリン（ＢＴＣ）に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片が、５ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する、前記抗体又はその抗原結合断片。
2. ａ．Ｇ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、Ｖ５６、Ａ５７、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６からなる群から選択される配列番号１５７の少なくとも１つの残基に結合するか、
   ｂ．配列番号１５７のＲ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、及びＲ７３に結合するか、
   ｃ．配列番号１５７のＰ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｅ５８、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、Ｅ７５、及びＲ７６に結合するか、
   ｄ．配列番号１５７のＧ３４、Ｈ３５、Ｆ３６、Ｓ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｒ５１、Ｒ５３、Ｆ５４、及びＶ５６に結合するか、又は
   ｅ．配列番号１５７のＳ３７、Ｒ３８、Ｃ３９、Ｐ４０、Ｋ４１、Ｑ４２、Ｙ４３、Ｈ４５、Ｙ４６、Ｆ５４、Ａ５７、Ｑ５９、Ｔ６０、Ｐ６１、Ａ７２、Ｒ７３、及びＥ７５に結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
3. 重鎖可変領域相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖可変領域相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖可変領域相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）と、軽鎖可変領域相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖可変領域相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖可変領域相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）と、を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、
   ａ．それぞれ配列番号１、２、３、１４、１５、及び１６、それぞれ配列番号４、２、３、１４、１５、及び１６、それぞれ配列番号５、６、３、１７、１８、及び１９、それぞれ配列番号７、８、９、２０、１８、及び１６に記載される通りであるか、
   ｂ．それぞれ配列番号２５、２６、２７、３８、３９、及び４０、それぞれ配列番号２８、２６、２７、３８、３９、及び４０、それぞれ配列番号２９、３０、２７、４１、４２、及び４３、若しくはそれぞれ配列番号３１、３２、３３、４４、４２、及び４０に記載される通りであるか、
   ｃ．それぞれ配列番号２５、４９、５０、５８、５９、及び６０、それぞれ配列番号２８、４９、５０、５８、５９、及び６０、それぞれ配列番号２９、５１、５０、６１、６２、及び６３、若しくはそれぞれ配列番号３１、５２、５３、６４、６２、及び６０に記載される通りであるか、又は
   ｄ．それぞれ配列番号６９、７０、７１、８２、８３、及び８４、それぞれ配列番号７２、７０、７１、８２、８３、及び８４、それぞれ配列番号７３、７４、７１、８５、１８、及び８６、若しくはそれぞれ配列番号７５、７６、７７、８７、１８、及び８４に記載される通りである、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
4. ａ．それぞれ配列番号１０及び２１に対して、
   ｂ．それぞれ配列番号３４及び４５に対して、
   ｃ．それぞれ配列番号５４及び６５に対して、又は
   ｄ．それぞれ配列番号７８及び８８に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
5. ａ．それぞれ配列番号１２及び２３に記載されるような、
   ｂ．それぞれ配列番号３６及び４７に記載されるような、
   ｃ．それぞれ配列番号５６及び６７に記載されるような、又は
   ｄ．それぞれ配列番号８０及び９０に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコード化するヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
7. 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現カセット又はベクター。
8. 請求項６に記載のポリヌクレオチド若しくは請求項７に記載の発現カセット又はベクターを含む、宿主細胞。
9. 有効量の、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、医薬組成物。
10. 眼科的障害を有する対象の治療をそれを必要とする対象において行う方法であって、有効量の、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片若しくは請求項９に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記眼科的障害が、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、母斑症に関連する異常血管増殖、中心性漿液性脈絡網膜症、及び急性多発性小板状色素上皮症からなる群から選択される、前記方法。
11. 前記医薬組成物が、抗血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを更に含み、又は前記方法が、前記対象に抗ＶＥＧＦアンタゴニストを投与することを更に含み、前記抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト、ブロルシズマブ、及びペガプタニブからなる群から選択され、又は前記抗ＶＥＧＦアンタゴニストが、それぞれ配列番号１０３及び１１４に記載されるような重鎖及び軽鎖を含む、請求項１０に記載の方法。
12. １）抗ＢＴＣ結合部分と、２）抗ＶＥＧＦ結合部分と、を含む、多重特異性結合分子。
13. 前記抗ＶＥＧＦ結合部分が、単離された抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される形式の抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片である、請求項１２に記載の多重特異性結合分子。
14. 前記抗ＢＴＣ結合部分が抗ＢＴＣ Ｆａｂであり、前記抗ＶＥＧＦ結合部分が抗ＶＥＧＦ Ｆａｂであり、前記抗ＢＴＣ Ｆａｂが、重鎖（ＨＡ）及び軽鎖（ＬＡ）を含み、前記抗ＶＥＧＦ Ｆａｂが、重鎖（ＨＢ）及び軽鎖（ＬＢ）を含む、請求項１３に記載の多重特異性結合分子。
15. 前記ＨＡと前記ＨＢとが、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＨＡ－リンカー１－ＨＢ－Ｃの形式で連結されており、前記ＬＡと前記ＬＢとが、Ｎ－末端からＣ－に向かって：Ｎ－ＬＡ－リンカー２－ＬＢ－Ｃの形式で連結されている、請求項１４に記載の多重特異性結合分子。
16. 前記抗ＢＴＣ結合部分が、
    ａ．それぞれ配列番号１、２、３、１４、１５、及び１６、それぞれ配列番号４、２、３、１４、１５、及び１６、それぞれ配列番号５、６、３、１７、１８、及び１９、それぞれ配列番号７、８、９、２０、１８、及び１６に記載されるような、
    ｂ．それぞれ配列番号２５、２６、２７、３８、３９、及び４０、それぞれ配列番号２８、２６、２７、３８、３９、及び４０、それぞれ配列番号２９、３０、２７、４１、４２、及び４３、若しくはそれぞれ配列番号３１、３２、３３、４４、４２、及び４０に記載されるような、
    ｃ．それぞれ配列番号２５、４９、５０、５８、５９、及び６０、それぞれ配列番号２８、４９、５０、５８、５９、及び６０、それぞれ配列番号２９、５１、５０、６１、６２、及び６３、若しくはそれぞれ配列番号３１、５２、５３、６４、６２、及び６０に記載されるような、又は
    ｄ．それぞれ配列番号６９、７０、７１、８２、８３、及び８４、それぞれ配列番号７２、７０、７１、８２、８３、及び８４、それぞれ配列番号７３、７４、７１、８５、１８、及び８６、若しくはそれぞれ配列番号７５、７６、７７、８７、１８、及び８４に記載されるような、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
17. 前記抗ＢＴＣ結合部分が、
    ａ．それぞれ配列番号１０及び２１に対して、
    ｂ．それぞれ配列番号３４及び４５に対して、
    ｃ．それぞれ配列番号５４及び６５に対して、又は
    ｄ．それぞれ配列番号７８及び８８に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
18. 前記抗ＢＴＣ結合部分が、
    ａ．それぞれ配列番号１２及び２３に記載されるような、
    ｂ．それぞれ配列番号３６及び４７に記載されるような、
    ｃ．それぞれ配列番号５６及び６７に記載されるような、又は
    ｄ．それぞれ配列番号８０及び９０に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
19. 前記抗ＶＥＧＦ結合部分が、
    ａ．それぞれ配列番号９２、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７に記載されるような、
    ｂ．それぞれ配列番号９５、９３、９４、１０５、１０６、及び１０７に記載されるような、
    ｃ．それぞれ配列番号９６、９７、９４、１０８、１０９、及び１１０に記載されるような、又は
    ｄ．それぞれ配列番号９８、９９、１００、１１１、１０９、及び１０７に記載されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
20. 前記抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号１０１及び１１２に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
21. 前記抗ＶＥＧＦ結合部分が、
    ａ．それぞれ配列番号１０２及び１１３に記載されるような、
    ｂ．それぞれ配列番号１１７及び１２３に記載されるような、
    ｃ．それぞれ配列番号１２８及び１３３に記載されるような、
    ｄ．それぞれ配列番号１３８及び１４３に記載されるような、又は
    ｅ．それぞれ配列番号１４８及び１５２に記載されるような核酸配列によってコード化されるＶＨ及びＶＬを含む、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
22. 前記抗ＶＥＧＦ結合部分が、それぞれ配列番号１０３及び１１４に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を含み、又は前記重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号１０４及び１１５に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコード化される、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
23. 前記抗ＢＴＣ結合部分が、ＢＴＣに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＡ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＡ）を含み、前記抗ＶＥＧＦ結合部分が、ＶＥＧＦに結合する可変重鎖ドメイン（ＶＨＢ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬＢ）を含み、前記多重特異性結合分子が、Ｎ－末端からＣ－末端に向かって：Ｎ－ＶＨＡ－ＣＨ１Ａ－リンカー－ＶＨＢ－ＣＨ１Ｂ－Ｃ及びＮ－ＶＬＡ－ＣＫＡ－リンカー－ＶＬＢ－ＣＫＢ－Ｃのような形式であり、これが前記ＶＨＡ、ＣＨ１Ａ、リンカー、ＶＨＢ、及びＣＨ１Ｂを含む重鎖を含み、これが前記ＶＬＡ、ＣＫＡ、リンカー、ＶＬＢ、及びＣＫＢを含む軽鎖を含み、前記重鎖及び前記軽鎖が、
    ａ．それぞれ配列番号１２０及び１２５に記載される通りであるか、
    ｂ．それぞれ配列番号１３０及び１３５に記載される通りであるか、
    ｃ．それぞれ配列番号１４０及び１４５に記載される通りであるか、又は
    ｄ．それぞれ配列番号１４９及び１５４に記載される通りである、請求項１２～２２のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
24. 請求項１２～２３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子をコード化するヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
25. 請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現カセット又はベクター。
26. 有効量の、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子を含む、医薬組成物。
27. 眼科的障害の治療を必要とする対象において眼科的障害を治療する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子又は請求項２６に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記眼科的障害が、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、及び母斑症に関連する異常血管増殖からなる群から選択される、前記方法。
28. 請求項１２～２３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子又は請求項２６に記載の医薬組成物を含む、キット。
29. 黄斑浮腫、ＤＭＥ、ＡＭＤ、新生血管ＡＭＤ、又はＲＶＯの予防又は治療を必要とする対象においてそれらを予防又は治療する方法であって、前記対象に、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子を、約０．２５ｍｇ／眼、０．７５ｍｇ／眼、２．５ｍｇ／眼、又は７．５ｍｇ／眼の用量で硝子体内投与することを含む、方法。
30. 前記用量が、０．２５ｍｇ／眼、０．３ｍｇ／眼、０．３５ｍｇ／眼、０．４ｍｇ／眼、０．４５ｍｇ／眼、０．５ｍｇ／眼、０．５５ｍｇ／眼、０．６ｍｇ／眼、０．６５ｍｇ／眼、０．７ｍｇ／眼、０．７５ｍｇ／眼、０．８ｍｇ／眼、０．８５ｍｇ／眼、０．９ｍｇ／眼、０．９５ｍｇ／眼、１．０ｍｇ／眼、１．１ｍｇ／眼、１．２ｍｇ／眼、１．３ｍｇ／眼、１．４ｍｇ／眼、１．５ｍｇ／眼、１．６ｍｇ／眼、１．７ｍｇ／眼、１．８ｍｇ／眼、１．９ｍｇ／眼、２．０ｍｇ／眼、２．１ｍｇ／眼、２．２ｍｇ／眼、２．３ｍｇ／眼、２．４ｍｇ／眼、２．５ｍｇ／眼、２．６ｍｇ／眼、２．７ｍｇ／眼、２．８ｍｇ／眼、２．９ｍｇ／眼、３．０ｍｇ／眼、３．１ｍｇ／眼、３．２ｍｇ／眼、３．３ｍｇ／眼、３．４ｍｇ／眼、３．５ｍｇ／眼、３．６ｍｇ／眼、３．７ｍｇ／眼、３．８ｍｇ／眼、３．９ｍｇ／眼、４．０ｍｇ／眼、４．１ｍｇ／眼、４．２ｍｇ／眼、４．３ｍｇ／眼、４．４ｍｇ／眼、４．５ｍｇ／眼、４．６ｍｇ／眼、４．７ｍｇ／眼、４．８ｍｇ／眼、４．９ｍｇ／眼、５．０ｍｇ／眼、５．１ｍｇ／眼、５．２ｍｇ／眼、５．３ｍｇ／眼、５．４ｍｇ／眼、５．５ｍｇ／眼、５．６ｍｇ／眼、５．７ｍｇ／眼、５．８ｍｇ／眼、５．９ｍｇ／眼、６．０ｍｇ／眼、６．１ｍｇ／眼、６．２ｍｇ／眼、６．３ｍｇ／眼、６．４ｍｇ／眼、６．５ｍｇ／眼、６．６ｍｇ／眼、６．７ｍｇ／眼、６．８ｍｇ／眼、６．９ｍｇ／眼、７．０ｍｇ／眼、７．１ｍｇ／眼、７．２ｍｇ／眼、７．３ｍｇ／眼、７．４ｍｇ／眼、又は７．５ｍｇ／眼である、請求項２９に記載の方法。